PT98205B

PT98205B - Processo para a preparacao de novos derivados beta-lactamicos

Info

Publication number: PT98205B
Application number: PT98205A
Authority: PT
Inventors: Svend Gunnar Kaasgaard; Ulla Veitland
Original assignee: Gist Brocades Bv
Priority date: 1990-07-04
Filing date: 1991-07-04
Publication date: 1998-12-31
Also published as: JP3115593B2; PT98205A; ES2258260T3; JPH05507623A; CA2086250C; FI925988L; ZA915142B; DE69133509T2; EP0537255A1; AU8208691A; SK381392A3; RU2136759C1; US5525483A; NO930006L; NO307710B1; WO1992001061A1; CZ381392A3; KR100222606B1; EP0537255B1; ATE317912T1

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS

DERIVADOS

-LACTÂMICOS

Âmbito Técnico

A presente invenção refere-se a um processo para a pre paração de derivados de -lactama por acilação enzimática de um composto original amino--lactama com um agente de acilação. 0 composto amino-lactama pode ser o ácido 6-amino-penicilãnico (6-APA), o ãcido 7-amino-desacetoxicefalosporânico (7-ADCA), o ãcido 7-amino-cefalosporânico (7-ACA) ou o 7-amino-3-cloro-3-cefem-4-carboxilato e como agente de acilação poderá usar-se um derivado do composto D-fenil-glicina ou do composto D-p-hidroxi-fenil-glicina.

Técnica Anterior

Actualmente, as p-lactamas semi-sintéticas, tal como a Ampicilina, a Amoxicilina, o Cefacloro, a Cefalexina, o Cefadro xilo e a Cefaioglicina, são preparadas industrialmente utilizando métodos químicos, nomeadamente fazendo reagir um composto amino-j3-lactama, tal como o ãcido 6-amino-penicilânico, normal mente, protegendo o seu grupo carboxílico, com um derivado acti vo de cadeia lateral, seguido da eliminação do grupo protector por hidrólise. Por exemplo, por razões de rendimento, é impor tante utilizar um composto amino-lactama, por exemplo, o com

-2posto 6-APA, numa forma pura e anidra, de preferência num grau de pureza superior a 97%. Pode preparar-se, por exemplo, a Am picilina (ácido 6-D-O^-amino-fenil-acetamido-penicilânico) fa-

zendo reagir o composto 6-APA, possuindo um grupo carboxílico protegido adequado, com cloreto ãcido de D-fenil-glicina, segui do da eliminação do grupo protector por hidrólise. Normalmente estas reacções implicam fases dispendiosas, tais como condições abaixo dos zero graus Celsius e a utilização de dissolventes co mo o cloreto de metileno e de reagentes de sililação.

A produção enzimática de Ampicilina, a partir da forma pura do composto 6-APA e de um derivado de D-fenilglicina (tal como um éster de alquilo inferior) tornou-se conhecida através do pedido de patente da Alemanha Federal, publicado com o NQ 2 163 792, da patente austríaca NQ 243 986, do pedido de patente holandesa NQ 70-09138, do pedido de patente da Alemanha Federal, publicado com o NQ 2 621 618 e do pedido de patente europeia publicado com o NQ 339 751. Nos processos anteriormen te descritos pelos especialistas, foram geralmente utilizados menos de 50 mM do derivado D-fenil-glicina e menos de 25 mM do composto 6-APA, tendo sido de 88% o maior rendimento registado (pedido de patente de invenção europeia publicado com o NQ 339 751) .

Normalmente produz-se o composto amino--lactama, tal como o compsoto 6-APA, através da hidrólise enzimática de uma penicilina fermentada (por exemplo, penicilina V ou penicilina G), seguida da eliminação da cadeia lateral libertada (ãcido fenoxiacético, etc. ). Apesar das impurezas resultantes da fer mentação, a solução impura obtida contém normalmente o composto amino- p-lactama numa concentração de 150-200 mM. Para se obter uma solução pura dos compostos 6-APA ou 7-ADCA a solução

bruta pode ser purificada e cristalizada (no caso do composto 7-ADCA, a penicilina fermentada deverá passar por um outro pro ceso antes da hidrólise).

Os prováveis inconvenientes dos métodos enzimãticos co nhecidos para a produção de Ampicilina, Amoxicilina e Cefalexina (nenhum deles até agora utilizado industrialmente) poderão ser os elevados custos (baixos rendimentos) e os investimentos efectuados para a unidade de operações necessária quan do o composto amino- J^-lactama ê isolado, purificado e seco an tes de ser utilizado como matéria-prima para efectuar a reacção que produzirá uma j^-lactama de semisíntese. Para além disso, as concentrações do composto de partida 6-APA são muito baixas (geralmente inferiores a 50 mM), tornando deste modo mais difícil e dispendioso o isolamento da Ampicilina formada.

Da mesma forma, ê desejável um maior rendimento na formação en zimática de Ampicilina.

Descreve-se em Agric. Biol. Chem. 44,1980, p. 821 e seg. um processo de síntese enzimãtica de amoxicilina que con siste numa reacção contendo em média 2,5% (volume/volume) ou maior quantidade do composto 2-propanol e 5% (volume/volume) de outros álcoois. Quando se utiliza um dos álcoois mencionados ou 2,5% do composto 2-propanol, a concentração inicial dos materiais de partida, o éster metílico de D-(p-hidroxi-fenil)-glicina e o ãcido 6-amino-penicilânico, é muito baixa, isto é, 100 e 50 mM respectivamente. Quando se utiliza 5% do composto 2-propanol, a concentração inicial dos materiais de partida, o éster metílico de D- -(£-hidroxi-fenil)-glicina e o ãcido 6-amino-penicilânico, é de 460 e 230 mM, respectivamente. Ficou estipulado neste documento que a adição de uma quantidade

V.

superior a 100 mM do éster metílico de D- -hidroxi-fenil)-glicina e de uma quantidade superior a 50 mM de ãcido 6-amino-penicilânico diminui, de uma maneira marcante, a taxa de conversão do ãcido 6-amino-penicilânico em amoxicilina. Podemos pois concluir que essa publicação apresenta um meio para se aumentar a concentração do composto amino--lactama assim como do agente de acilação na mistura reaccional.

Após a data do registo do pedido de patente da presente invenção, entre 18 e 21 de Setembro de 1990, foi publicado um cartaz durante uma reunião da OTAN. Este cartaz estava relacionado com a preparação de cafalosporinas e, de acordo com o referido cartaz, podiam obter-se efeitos positivos na reacção trabalhando a baixas temperaturas. A maior concentração de agente de acilação utilizada neste trabalho foi de 355 mM de éster metílico de D-^-fenil-glicina não havendo qualquer indicação no referido cartaz que levasse a crer que pudesse ha ver alguma vantagem no uso de uma maior concentração do agente de acilação.

Descrição da Presente Invenção

De um modo surpreendente descobriu-se agora que o ren dimento na preparação enzimática dos derivados das ^-lactamas pode ser melhorado levando a efeito a reacçâo com grandes concentrações do agente de acilação.

De acordo com a presente invenção, deverá considerar-se que os termos amino-jS-lactama, agente de acilação e deri_ vados de ^-lactama abrangem respectivamente os dois materiais de partida e o produto resultante associado ao processo descri

L/· to na presente invenção. A partir desta altura, o processo da presente invenção poderá ser ilustrado pelo esquema de reacção que se segue:

amino- -lactama + agente de acilação —> derivado de ^-lactama derivado de ^-lactama possui uma actividade antibiô tica substancialmente superior ã do composto amino- -lactama. De acordo com a presente invenção o composto amino- |3 -lactama possui um grupo amino livre que é acilado pela reacção. 0 agen te de acilação poderá encontrar-se sob a forma de um ãcido Li vre ou sob uma forma activa, tal como as amidas ou os ésteres. De acordo com a presente invenção, deverá considerar-se que o termo núcleo de ^-lactama abrange da mesma forma os compostos de amino- -lactama e os derivados de ^-lactama. A partir daqui estabeleceu-se que a concentração do núcleo de j3-lactama consistia, portanto, na concentração do composto amino--lacta ma mais a concentração do derivado de J3-lactama.

Considera-se uma característica importante do processo descrito da presente invenção que a concentração do agente de acilação mais a concentração do derivado de ^-lactama, na mi}5 tura reaccional, seja superior a 400mM. Uma das formas de se obter esta concentração na mistura reaccional consiste em adicionar-se, lote a lote, o agente de acilação â mistura reaccio nal numa quantidade suficiente que permita uma concentração in_i ciai do agente de acilação na mistura reaccional superior a cer ca de 400 mM.

Através do processo exposto na presente invenção torna-se possível e vantajosa a utilização de uma solução impura do composto amino--lactama, por exemplo do composto 6-APA ou do composto 7-ADCA, sem se efectuar a sua diluição. Durante as fa

ses de purificação e/ou isolamento, a perda do composto amino-^-lactama pode ser desse modo evitada e os investimentos no equipamento de purificação por exemplo, para a ampicilina, a amoxicilina e a cefalexina, são minimizados em relação ao equi. pamento de purificação anteriormente usado para proceder ao isolamento do composto 6-APA que pode agora ser utilizado no isolamento da ampicilina, da amoxicilina e da cefalexina.

De um modo vantajoso, de acordo com a presente invenção, pode obter-se um elevado rendimento sem haver necessidade de baixas temperaturas e de dissolventes orgânicos, tal como o cloreto de metileno. Deste modo, pode obter-se ampicilina com um rendimento de 96% a 20°C.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona um processo para se efectuar a reacção enzimática de um composto de amino- ^-lactama, por exemplo, ãcido 6— amino-peniciiânico (6-APA), ãcido 7-amino-desacetoxi-cefalosporânico (7-ADCA), ácido 7-amino-cefalosporânico (7-AAC) ou 7-amino-3-cloro-3-ce fem-4-carboxilato, com um agente de acilação, por exemplo, um derivado do composto D-fenil-glicina ou do composto D-p-hidroxi-fenil-glicina.

Por um lado, este processo caracteriza-se pela concen tração de uma quantidade compreendida entre cerca de 50 a cerca de 750 mM do composto amino-P-lactama inicialmente utilizado na mistura reaccional, de preferência numa concentração superior a 100 mM, sendo preferível uma concentração superior a cerca de 150 mM, ou ainda de um modo preferencial a referida concentração encontrar-se-ã a um nível superior a cerca de 200 mM. Por outro lado, este processo caracteriza-se pelo fac to de a concentração inicialmente utilizada do composto amino-Ί- ^-lactama, como material de partida na mistura reaccional , poder atingir uma concentração compreendida entre cerca de 50 e cerca de 750 mM, de preferência superior a cerca de 100 mM, sendo preferível uma concentração superior a cerca de 150 mM, ou ainda de um modo preferencial que a referida concentração seja superior a cerca de 200 mM. Este processo caracteriza-se ainda pelo facto de a quantidade inicialmente utilizada do agente de acilação na mistura reaccional, por exemplo, o derivado do composto D-fenil-glicina ou do composto D-p-hidroxi-fenil-glicina, ser superior ao grau de solubilidade do agen te anteriormente mencionado (de preferência, pelo menos 50% acima da referida solubildiade); ou a quantidade inicialmente utilizada do agente de acilação na mistura reaccional ser cerca de metade da solubilidade do agente de acilação anteriormen te mencionado em conjunto com a quantidade incialmente utiliza da do composto amino--lactama na mistura reaccional (de preferência acima da solubildiade do agente de acilação na mistura de reacção + a quantidade inicialmente utilizada do composto amino-^-lactama). Outro aspecto da presente invenção refe re-se a um processo através do qual a concentração do agente de acilação em conjunto com a concentração do derivado de -lacta ma na mistura reaccional ser superior a cerca de 450 mM, de pre ferência superior a 500 mM, sendo preferível que a referida concentração seja superior a 650 mM ou ainda com maior preferência encontra-se situada acima de cerca de 700 mM. De acordo com um outro aspecto a presente invenção refere-se a um processo caracterizado pelo facto de a concentração inicialmente utilizada do agente de acilação na mistura de reacção atingir um valor superior a 450 mM, de preferência superior a cerca de

-L/.

500 mM, sendo preferível que a referida concentração atinja um valor superior a cerca de 650 mM ou ainda com maior preferência um valor superior a cerca de 700 mM.

As vantagens da presente invenção são, inter alia, as que se seguem;

1) Suprime-se o uso de um dissolvente orgânico como o cloreto de metileno, evitando-se deste modo os riscos de poluição.

2) Evita-se a utilização de agentes de sililação.

3) Evita-se que a operação de extracção tenha de ser realizada a baixas temperaturas, tais como 0°C.

4) A elevada concentração de reagentes constitui uma van tagem para a subsequente purificação.

5) A elevada pureza do derivado de -lactama resultante ê muito superior aos disponíveis comercialmente.

6) O teor de subprodutos na mistura reaccional é muito reduzido.

7) Em comparação com os processos de síntese química, efectuam-se menos fases.

Descrição Pormenorizada da Presente Invenção

Alguns derivados de -lactama que poderão ser produzi dos utilizando o processo descrito na presente invenção são, por exemplo, ampicilina, amoxicilina, cefacloro, cefalexina e cefadroxilo.

Pode utilizar-se como agentes de acilação um derivado dos compostos D-fenil-glicina ou de D-£-hidroxi-fenil-glicina assim como um éster alquilico inferior (metilico, etílico, n-pro

-9C/ pílico ou isopropílico) ou uma amida não substituída no grupo -CONH2. De preferência deverá utilizar-se a amida. Pode uti lizar-se o derivado sob a forma de um sal por exemplo, como um cloreto ou um sulfato. Pode ainda adicionar-se o agente de acilação sob uma forma activa, podendo a forma activa ser formada in situ.

No processo descrito na presente invenção pdoerá ser utilizada qualquer enzima que catalize a reacção em questão.

Tais enzimas são conhecidas desde aproximadamente 1966. Pode utilizar-se, por exemplo, os enzimas penicilina-amidase ou penicilina-acilase com prazo de validade previamente estabelecido, classificadas como E.C. 3.5.1.11. Alguns enzimas microbia nos são conhecidos por possuirem esta actividade, por exemplo, os derivados de Acetobacter, Xanthomonas, Mycoplana , Protaminobacter, Aeromonas (pedido de patente de invenção da Alemanha Federal), publicado com o NQ 2 163 792), Pseudomonas (Patente de invenção austríaca NQ 243986), Flavobacteriuiti (pedido de pa tente de invenção holandesa NQ 70-09138), Aphanoclaium, Cephalosporium (pedido de patente de inveção da Alemanha Federal pu blicado com o NQ 2 621 618), Acetobacter pausteurianum, Bacillus megaterium, Xanthomonas citrii (pedido de patente de inven ção europeia publicado com o NQ 339751), Kluyvera citrophila (Agri. Biol. Chem. 37, 1973, p. 2797-2804) e Escherichia coli (pedido de patente de invenção da Alemanha Federal publicado com o NQ 2930794). Encontra-se disponível comercialmente o enzima Escherichia coli. Também se pode utilizar como enzima uma ampicilina-hidrolase, acilase ou amidase. Sobre o mesmo a_s sunto pronunciamram-se inter alia, Hakko to Kogyo 38; 1980;

216 et seq., cujo conteúdo aqui se incorpora como referência.

Utiliza-se o enzima, de preferência, sob uma forma sus ceptivel de ser novamente utilizada, por exemplo, sob uma forma capturada ou imobilizada. Pode realizar-se a imobilização através de qualquer um dos métodos conhecidos. 0 enzima Esche richia coli imobilizado, apresentada com o nome comercial de Enzygel é comercializada pela Boehringer Mannheim GmbH ale mã.

Normalmente leva-se a efeito o processo descrito na pre sente invenção em ura sistema que contenha água. Se tal for con siderado desejável, pode adicionar-se um dissolvente orgânico.

A solubilidade do agente de acilação, tal como a dos derivados de D-fenil-glicina ou D-£-hidroxi-fenil-glicina, varia consoante a identidade do derivado e a composição do meio reaccional. Num sistema aquoso, tal como o utilizado nos exem pios, a solubilidade do cloreto da amida D-fenil-glicina atinge aproximadamente 450 mM. No entanto, o grau de solubilidade depende directamente dos componentes do sal utilizado assim como do valor do pH e da temperatura da solução. Em alguns aspectos do processo descrito na presente invenção a mistura reaccional inicialmente utilizada consiste em uma mistura semi-liquida con tendo um agente de acilação e/ou o composto p-lactama não dissolvidos, os quais se irão dissolver em parte ou na totalidade durante o decorrer da reacção. Durante a reacção o composto p -lactama formado pode precipitar assim como os produtos hidro lisados do agente de acilação, como por exemplo D-fenil-glicina e D-£-hidroxi-fenil-glicina. Por este motivo, na maioria dos casos a mistura reaccional consistirá em uma mistura pastosa ao longo de toda a fase de reacção.

β

Pode obter-se um composto amino-lactama, por exemplo,

-11o composto 6-ΑΡΑ ou ο composto 7-ADCA, utilizado no processo descrito nesta invenção, através de hidrólise enzimática de penicilinas ou de cefalosporinas fermentadas (por exemplo, penicilina V, penicilina G ou cefalosporina C) ou dos seus anãlo gos que englobem o mesmo anel (por exemplo, V-ADC e G-ADC) ou dos seus derivados, seguida, se desejável, da remoção do teor do produto intermédio (ãcido fenoxiacético, etc.). De um modo vantajoso, pode utilizar-se directamente a solução bruta sem ter de se efectuar a sua purificação ou diluição.

Na maioria dos casos, a temperatura da reacção do processo descrito na presente invenção pode variar entre cerca de

0°C e cerca de 35°C, de preferência entre cerca de 10°C e cero < ~ ~ ca de 30 C. Por conveniência da operaçao podem preferir-se tem peraturas estabelecidas numa escala entre 20°C e 30°C. O valor apropriado do pH depende do tipo e da pureza do enzima. Quando se utiliza o enzima Escherichia coli, o valor do pH situa-se normalmente numa escala entre cerca de 5,5 e 7,5, de preferência numa escala entre cerca de 6,1 e cerca de 7. Para se efec tuar a preparação da amoxicilina é preferível um valor de pH que se situe numa escala entre cerca de 5,5 e cerca de 6,4. Deverá ser realizado o controlo do valor do pH. Os tempos de reacção adequados variam entre alguns minutos e algumas horas, preferencialmente entre cerca de 1/2 hora e cerca de 8 horas . As concentrações adequadas de enzimas poderão variar entre cer ca de 1 U/ml e cerca de 100 U/ml (1 U = uma unidade de enzima activa, tal como se pode verificar de seguida..

Utilizando o processo de acordo com o descrito na presente invenção, podem ser obtidos rendimentos extraordinariamente elevados. Estes elevados rendimentos são obtidos quando

utilizados os preceitos descritos na presente invenção e se efec tua convenienternente a selecção de concentração do agente de aci lação, da proporção entre a concentração do agente de acilação e do composto de amino-lactama inicialmente utilizado, do valor do pH e do enzima.

Pode efectuar-se a recuperação e a purificação do produto a partir de métodos conhecidos de per si, por exemplo, por cristalização.

Definições e Métodos de Análise

Actividade Enzimãtica

Para se definir a actividade da penicilina-G-acilase utiliza-se a seguinte terminologia: uma unidade (U) corresponde a uma quantidade de enzima que hidrolisa, por minuto, 1 yimo le de penicilina G, em condições normalizadas (5% de penicilina G, tampão de fosfato de sódio 0,2 M, a um valor de pH de 8,0, a uma teperatura de 28°C).

Análise dos componentes da reacção por CLEP

Coluna: RP LC-18, (250 x 4,6 mm; 5 um)

Eluente A: Tampao fosfato 25 mM, valor do pH 6,5

Eluente B: acetonitrilo

Gradiente:

Tempo, eluente B, minutos

0-10

1-20

- 20

-13u

Débito: 1 ml/min. Detecçâo: 215 nm.

Tempos de retenção em minutos: 4,1 (D-PG); 6,3 (7-ADCA); 8,1 (6-AAP); 9,1 (D-PGA); 13,4 (Cefalexina); 13,9 (Ampicilina) (D-MPG) .

Análise da Amoxicilina por CLEP

Coluna: RP LC-18, 5 jim, (250 x 4,6 nm)

Dissolvente: 5% de acetonitrilo em tampão fosfato 25 mM, valor do pH: 6,5. Débito: 1 ml/min; detecçâo UV a 215 nm.

Tempos de retenção em minutos: 2,5 (D-p-hidroxi-fenil-glicina);

3,3 (HPGA); 5,4 (6-APA); 13,2 (Amoxicilina).

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar a presen te invenção sem no entanto pretenderem limitar o âmbito da mesma.

Exemplo 1

Síntese enzimática da ampicilina

Ajustou-se para 6,4 o valor do pH de uma solução de 6-APA 100 mM e de D-PGA, na concentração indicada no quadro 1, equilibrou-se para uma temperatura de 20°C e adicionou-se 345 U de enzima so_ lúvel da Escherichia coli, fornecida por Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung GmbH, Braunschweig, Alemanha (volume total: 20 ml).

Levou-se a efeito a síntese a uma temperatura de 25°C e nas condições de pH estabelecidas. Os rendimentos máximos, ten do por base a análise CLEP, encontram-se indicados no quadro 1.

-14Quadro 1

D-PGA (mM)	rendimento máximo	tempo de reacção
	da Ampicilina, %	horas
270	74	9
750	98	24

Exemplo 2

Síntese enzimática da cefalexina

Tal como descrito no exemplo 1, utilizou-se apenas 7-ADCA 100 mM em vez do composto 6-APA. Obtém-se a cefalexina nestas condições e os rendimentos máximos obtidos em diferentes concentrações de D-PGA.HC1 são os que se podem observar no quadro 2.

Quadro 2

D-PGA.HC1 (mM)

300

700 rendimento máximo de cefalexina, %

Exemplo 3

Dependência do pH

Ajustou-se uma mistura do composto 6-APA 250 mM e de sulfato de D-PGA mM para um valor de pH equivalente ao indicado no quadro 3 e levou-se a efeito a sintese enzimática a uma temperatura de 20°C e nas condições de pH estabelecidas; volume total de 20 ml e 700 U de enzima solúvel de Escherichia coli.

Quadro 3

valor	rendimento máximo	tempo de
do pH	%	reacção, horas
3	60	48
6,4	94	21
7,0	93	3

Exemplo 4

Dependência da temperatura

Tomando como material de partida uma mistura dos compo_s tos 6-APA 180 mM e de D-PGA 700 mM a um valor do pH de 6,4 e 600 U de enzima solúvel da Escherichia coli (volume total: 20 ml) e prosseguindo a síntese em temperaturas tais como as indicadas no quadro 4, os rendimentos máximos de ampicilina que se obtive ram são os que se podem observar no quadro 4.

Quadro 4

Temperatura,	rendimento máximo	tempo de
°c	Q. O	reacção, horas
10	95	72
20	96	22
35	60	4

Exemplo 5

Este exemplo foi realizado de acordo com os procedimentos apresentados no exemplo 1 utilizando D-MPG em substituição de D-PGA. Os rendimentos máximos de ampicilina que se obtiveram são os que se podem observar no quadro 5.

Quadro 5

D-MPG, Ampicilina formada, tempo de reacçâo, mM % horas

270 74 12

700 86 25

Exemplo 6

Purificou-se parcialmente a penicilina V a partir do cal. do de fermentação por filtração, extraiu-se com acetato de butilo e efectuou-se uma nova solução aquosa o que originou uma solução a 10% (peso/volume); hidrolisou-se com a penicilina V

MR

Semacylase (penicilina V acilase imobilizada da Novo Nordisk A/S) a um valor de pH de 7,0. Eliminou-se o ãcido fenoxiacético por extracção e adicionou-se ã solução resultante do composto 6-APA (150 mM), contendo pequenas quantidades de bio-produtos de degradação da penicilina V e de 6-APA, 45 U/ml de enzima solúvel da Escherichia coli e D-PGA (para se obter uma concentração final de 700 mM). Ajustou-se o valor do pH para 6,4 e prosseguiu-se a reacçâo a uma temperatura de 25°C, mantendo constante o va lor do pH. Formou-se nestas condições um total de 135 mmoles de ampicilina (90%) por cada litro de mistura reaccional.

-17L/Exemplo 7

Utilização da penicilina-G-acílase imobilizada da Boehringer

Mannheim

Preparou-se uma suspensão de 500 mg de enzima imobiliza da em 10 ml de ãgua. Misturou-se a solução enzimãtica com uma solução dos compostos 6-APA e D-PGA para se obter um volume to tal de 25 ml. A mistura resultante continha 230 mM do composto 6-APA e 920 mM de D-PGA possuía um valor de pH 6,4 e foi equi. librada à temperatura ambiente. Prosseguiu-se a síntese da reacção durante 22 horas em condições de pH previamente estabe lecidas apôs as quais se converteu 91% do composto 6-APA em Ampicilina.

Exemplo 8

Síntese enzimãtica da Amoxicilina

Ajustou-se uma mistura aquosa de 968 mg do composto 6-APA e de 3718 mg de HPGA para um valor de pH 6,2, a uma temperatura de 15°C e adicionou-se 1656 U de penicilina-G -acilase solúvel da E. coli, até perfazer um volume final de 29,8 ml. Prosseguiu-se a síntese a uma temperatura constante utilizando ãcido sulfúrico 2 M de modo a manter-se o valor de pH a 6,2. Após 27,3 horas a mistura reaccional continha 136,6 mM de amoxi_ cilina, o que correspondia a um rendimento de 91% com base no consumo do composto 6-APA.

Síntese enzimática da amoxicilina

Exemplo 9

Adicionou-se a uma mistura aquosa dos compostos 6-APA e HPGA (concentração final de 200 mM e 750 mM, respectivamente) , 1656 U de penicilina-G-acilase solúvel da E. coli, a um valor pH 6,0 e a uma temperatura de 30°C. Após ter reagido du rante 9 horas, mantendo a temperatura e o valor do pH constantes, utilizando de ácido sulfúrico 2M para a titulação, produziu-se 190 mM de amoxicilina (rendimento de 95%) com base na análise por CLEP).

Exemplo 10

Síntese enzimática da amoxicilina

Tomando como material de partida 150 mM do composto

6-APA, 600 mM de HPGA, 1656 U de penicilina-G-acilase solúvel da E. coli, produziu-se passadas 8 horas 140 mM de amoxicilina (93%) tendo a reacção sido levada a efeito a um valor de pH de □,7 e a uma temperatura de 35°C.

Exemplo 11

Síntese enzimática de amoxicilina

Nas mesmas condições descritas no exemplo 9, utilizando 200 mM do composto 6-APA e 450 mM de HPGA obteve-se como re sultado a conversão de 91% do composto 6-APA em amoxicilina, passadas 9 horas.

-19Abreviaturas

A abreviatura 6-APA refere-se ao ãcido 6-amino-penici lânico, a abreviatura 7-ADCA refere-se ao ácido 7-amino-desacetoxi-cefalosporânico, a abreviatura D-PGA refere-se a D-fe nil-glicinamida, a abreviatura D-PGM refere-se ao éster metilico de D-fenil-glicina, a abreviatura V-DCA refere-se ao áci, do 7-fenoxi-acetamido-desacetoxi-cefalosporãnico, a abreviatura G-DCA refere-se ao ácido 7-fenil-acetamido-desacetoxi-cefalop porãnico e a abreviatura HPGA refere-se a D-p-hidroxi-fenil-glicinamida.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. - Processo para a preparação de derivados jv-iactâmicos mediante reacção enzimática da amino--lactama inicial com um agente de acilação correspondente, caracterizado pelo facto de a concentração de o agente de acilação com a concentração do derivado de j^-lactaria na mistura reaccional ser superior a cerca de 400mM, com a condição da mistura reaccional conter cerca de 5% (volume/volume) de 2-butanol quando o derivado da ^-lacta ma é a amoxicilina e o agente de acilação é o éster metílico de D- -(p-hidroxifenil)glicina.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a concentração inicial do agente de acilação na mistura reaccional ser acima de 400mM, aproximadamente.
3. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a mistura reaccional conter uma quantidade inferior a cerca de 2,5%, de preferência menos de 2% (volu me/volume) de 2-butanol.
4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 3, caracterizado.pelo facto de a amino-^B-lactama inicial ser o ãcido 6-amino-penicilãnico.
5, - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 4, caracterizado pelo facto de a amino- jB-lactama inicial ser o ácido amino-desacetoxi-cefalasporânico.
6, - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de a amino--lactama inicial ser o ãcido 7-amino-cefalasporânico.
7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 6, caracterizado pelo facto de a amino- -lactama ini ciai ser o amino-3-cloro-3-cefem-4-carboxilato.
8, - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi.

cações anteriores, caracterizado pelo facto de o agente de acilação ser D-fenilglicina ou um seu derivado.
9.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 7, caracterizado pelo facto de o agente de acilação ser D-p-hidroxifenilglicina ou um seu derivado.
10.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4 e 8, caracterizado pelo facto de o derivado

-lactâmico resultante ser ampicilina.
11.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4 e 3, caracterizado pelo facto de o derivado -lactâmico resultante ser amoxicilina.
12.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1,2,3,7 ou 8, caracterizado pelo facto de o derivado -lactâmico resultante ser cefaclor.
13.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1,2,3,5 ou 8, caracterizado pelo facto de o derivado -lactâmico resultante ser cefalexina.
14.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1,2,3,5 ou 9, caracterizado pelo facto de o derivado -lactâmico resultante ser cefadroxil.

P
15.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a concentração da amino-p-lactama na mistura reaccional se situar entre 50 e 750mM, aproximadamente, incluindo a quantidade de amino-]í)-lacta ma não dissolvida.
16.- Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações anteriores,, caracterizado pelo facto de a concentração inicial da amino-p»-lactama na mistura reaccional se encontrar entre 50 e 750mM/.· aproximadamente, incluindo a quantidade de amino-Ό-lactama não dissolvida.
17.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a mistura reaccional conter uma concentração de amino-$-lactama acima de lOOmM, aproximadamente.
18.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a mistura reaccional conter uma concentração de amina-lactama acima de 150mM, aproximadamente.
19.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a mistura reaccional conter uma concentração de amino-p-lactama acima de 200mM, aproximadamente.
20. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações anteriores, caracterizado pelo facto de a concentração do agente de acilação mais a concentração do derivado de -amino-p-lactama da mistura reaccional ser acima de 450mM, aproximadamente e, portanto, de se preparar de preferência amoxicilina.
21. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto a mistura reaccional conter uma concentração inicial do agente de acilação, acima de 450mM, aproximadamente e de se preparar de preferência amoxici lina.
22.- Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de a concentração do agente de acilação mais a concentração do derivado de p-lactama ser acima de 500mM, aproximadamente.
23. - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo facto de a concentração do agente de acilação mais a concentração do derivado p-lactãmico ser acima de 650mM, aproximadamente e de se preparar, de preferência, ampicilina.
24. - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo facto de a concentração do agente de acilação mais a concentração do derivado j3-lactâmico ser acima de 700mM, aproximadamente.
25. - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo facto de a concentração inicial do agente de acilação ser acima de 700mM, aproximadamente.
26. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se realizar a reacção a uma temperatura entre cerca de 0° e 35°C, de preferência acima de 10°, aproximadamente.
27. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se realizar a reacção a um valor ccmpreendido entre mais de 5, aproximadamente, e cerca de 7.
28. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se preparar a jâ -lactama inicial por meio de hidrólise de penicilina V, penici lina G, ãcido fenoxi-acetamido-desacetoxicefalosporânico (V-DCA), ãcido 7-fenilacetamido-desacetoxi-cefalosporânico (G-DCA) ou cefalosporina C ou um seu derivado e de se remover, eventualmente, a cadeia lateral libertada por hidrólise.
29, - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a mistura reaccional conter uma quantidade inicial de agente de acilação supeΊ rior à da solubilidade do agente citado nessa mistura.
30.- Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo facto de a mistura reaccional conter uma quantidade inicial de agente de acilação superior pelo menos a 50% da solubilidade desse agente na mistura reaccional.
31.- Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações anteriores, caracterizado pelo facto de a quantidade inicial do agente de acilação na mistura reaccional ser acima de metade da solubilidade desse agente mais a quantidade inicial da amino- β -lactama na mistura reaccional.
32.- Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo facto de a quantidade do agente de acilação na mistura reaccionam ser acima da solubilidade desse agen te na mistura reaccional mais a quantidade inicial da amino- ^-lac tama na mistura reaccional.
33.- Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações anteriores, caracterizado pelo facto de o agente de acilação ser uma amida ou um éster com 1 a 3 átomos de carbono no grupo éster, de preferência uma amida, de especial preferência uma amida insubstituída no grupo -CON^-
34.- Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações anteriores, caracterizado pelo facto de se utilizar uma enzima derivada de Echirichia coli, Acebacter pasteurianum, Xanthomonas citris, Kluvera citrophila ou Bacillus megaterium.
35. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se utilizar uma enzima que pode ser classificada como EC. 3.5.1.11.
36. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se utilizar uma enzima apta para hidrolisar penicilina G.
37. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de.utilizar uma enzima capaz de hidrolisar ampicilina.
38. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se utilizar material biológico re-utilizável com actividade enzimática.
39. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se realizar a reacção enzimática em um sistema aquoso, se apropriado, conjuntamente com um dissolvente orgânico.
40.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de permitir um rendi mento de pelo menos 90% (mole/mole) do derivado p-lac.tâmico resul^ tante, relativamente ao número total de núcleos de -lactama, de preferência, pelo menos 95% de rendimento (mole/mole).