PT972075E - Métodos para avaliar o estado cardiovascular e composições para a sua utilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODOS PARA AVALIAR O ESTADO CARDIOVASCULAR E COMPOSIÇÕES PARA A SUA UTILIZAÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a polimorfismos genéticos úteis para avaliar o estado cardiovascular em humanos.

Antecedentes da Invenção 0 sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS) desempenha um papel importante na fisiologia cardiovascular em mamíferos. Especificamente, o RAAS regula a homeostase sal-água e a manutenção do tónus vascular. A estimulação ou a inibição deste sistema, respectivamente, aumenta ou diminui a pressão sanguínea e as perturbações neste sistema podem estar envolvidas na etiologia de, por exemplo, hipertensão, acidente vascular cerebral e enfarte do miocárdio. 0 sistema RAAS pode, igualmente, ter outras funções, tais como, e. g., controlo do crescimento celular. 0 sistema renina-angiotensina inclui, pelo menos, renina, enzima conversora da angiotensina (ACE), angiotensinogénio (AGT), receptor da angiotensina II de tipo 1 (ATI) e receptor da angiotensina II de tipo 2 (AT2). 0 AGT é o substrato específico da renina, uma protease do aspartilo. O gene do AGT humano contém cinco exões e quatro 1 intrões que se estendem por 13 Kb (Gaillard et ai., DNA 8:87-99, 1989; Fukamizu et al., J. Biol. Chem. 265:7576-7582, 1990). O primeiro exão (37 pb) codifica para a região 5' não traduzida do ARNm. O segundo exão codifica para o péptido sinal e para os primeiros 252 aminoácidos da proteína madura. Os exões 3 e 4 são mais curtos e codificam, respectivamente, para 90 e 48 aminoácidos. O exão 5 contém uma sequência codificante curta (62 aminoácidos) e a região 3' não traduzida. O AGT do plasma é sintetizado, principalmente, no fígado e a sua expressão é regulada positivamente por estrogénios, glucocorticóides, hormonas da tiróide e angiotensina II (Ang II) (Clauser et al., Am. J. Hypertension 2:403-410, 1989). A quebra do segmento amino-terminal do AGT pela renina, liberta uma pró-hormona decapeptídica, angiotensina-I, a qual é, adicionalmente, processada no octapéptido activo, angiotensina II, pela carboxipeptidase de dipeptidilo, designada enzima conversora da angiotensina (ACE). A quebra do AGT pela renina é o passo limitante da velocidade, na activação do sistema renina-angiotensina. Várias observações epidemiológicas indicam um papel possível do AGT, na regulação da pressão sanguínea. Foi observada uma correlação altamente significativa entre a concentração do AGT no plasma e a pressão sanguínea, em estudos epidemiológicos (Walker et al., J. Hypertension 1:287-291, 1979). De um modo interessante, foram identificados vários dimorfismos alélicos no gene do AGT. A frequência de, pelo menos, dois destes (174M e 235T) foi parcialmente caracterizada e, em determinadas populações, demonstraram encontrar-se significativamente aumentadas em indivíduos hipertensos (Jeunemaitre et al., Cell 71:169-180, 1992). Para além disso, 2 foi sugerido que um polimorfismo especifico, ο 235T, esteja directamente envolvido na aterosclerose coronária (Ishigami et al., Circulation 91:9514, 1995). Para além disso, a presença de A ou G na posição 1218 na região reguladora do AGT foi correlacionada com diferenças na capacidade de transcrição in vitro deste gene (Inuoe et. al., J. Clin. Invest. 99:1786, 1997. Para além disso, o documento WO 94/08048 discute a associação de variantes moleculares do gene do AGT com a hipertensão. O gene da ACE humana é, igualmente, um candidato como marcador para a hipertensão e para o enfarte do miocárdio. Os inibidores da ACE constituem uma abordagem terapêutica importante e eficaz no controlo da hipertensão humana (Sassaho et al. Am. J. Med. 83:227-235, 1987) . No plasma e na superfície das células endoteliais, a ACE converte a molécula da angiotensina I inactiva (Ang I) em angiotensina II activa (Ang II) (Bottari et al., Front. Neuroendocrinology 14:123-171, 1993) . Um outro substrato da ACE é a bradicinina, um vasodilatador potente e inibidor da proliferação de células do músculo liso, o qual é inactivado pela ACE (Ehilers et al., Biochemistry 28: 5311-5318, 1989; Erdos, E.G., Hypertension 16:363-370, 1990; Johnston, C.I. Drugs (supl. 1) 39:21-31, 1990) .

Os níveis da ACE são muito estáveis dentro de indivíduos, mas diferem muito entre indivíduos. Foi sugerido que os níveis da ACE plasmática sejam geneticamente determinados como consequência de polimorfismos dialélicos, situados dentro ou na proximidade do gene da ACE. Antes da presente invenção, não foi demonstrada qualquer associação definitiva entre polimorfismos e hipertensão ou pressão sanguínea. No entanto, foi identificado um maior risco de enfarte do miocárdio, num grupo de indivíduos 3 com um polimorfismo da ACE, designado como ACE-DD (Cambien et al., Nature 359: 641-644, 1992) e foi identificado um risco 12 vezes superior de enfarte do miocárdio, num subgrupo de doentes que têm uma combinação do polimorfismo ACE-DD da ACE e um dos polimorfismos do AGT (235T) descrito acima (Kamitani et al., Hypertension 24:381, 1994). Recentemente, foram identificados e caracterizados seis polimorfismos da ACE (Villard et al., Am. J. Human Genet. 58:1268-1278, 1996). 0 documento WO 93/00360 divulga um método para detectar polimorfismos no gene da ACE através de uma técnica de amplificação em cadeia.

As acções vasoconstrictoras, promotoras do crescimento

celular e conservadoras de sais da Ang II, são mediadas através da ligação a e activação dos receptores da angiotensina, dos quais, pelo menos, dois tipos foram clonados (ATI e AT2). O receptor da Ang II de tipo 1 (ATi) , uma proteína com sete domínios transmembranares, ligada à proteína G, encontra-se amplamente distribuída no organismo e medeia quase todos os efeitos conhecidos da Ang II (Fyhrquist et al., J. Hum. Hypertension 5:519-524, 1995).

Foram identificados vários polimorfismos no gene do receptor ATi. Os estudos iniciais sugerem que, pelo menos, um destes seja mais frequente em indivíduos hipertensos (AT1166C) (Bonnardeaux et al., Hypertension 24:63-69, 1994). Este polimorfismo, combinado com o polimorfismo ACE-DD, demonstrou correlacionar-se significativamente com o risco de enfarte do miocárdio (Tiret et al., Lancet 344:910-913, 1994). O documento WO 96/05324 divulga um método e um kit para a detecção da predisposição ao enfarte do miocárdio, pela detecção de uma inserção/eliminação no gene da ACE e de um polimorfismo na posição 1166 do gene do ATI. 4 A elevada morbilidade e mortalidade associada com a doença cardiovascular demonstram uma necessidade na técnica de métodos e composições que permitam a determinação e/ou a previsão do regime terapêutico que irá resultar num efeito mais positivo do tratamento, num doente sofrendo de doença cardiovascular. Isto inclui a identificação de indivíduos que são mais ou menos susceptíveis a regimes terapêuticos particulares, incluindo, e. g., fármacos particulares que são convencionalmente utilizados para tratar a doença cardiovascular. Existe, igualmente, uma necessidade na técnica de métodos e composições que permitam a identificação de indivíduos que têm uma predisposição à doença cardiovascular, tal como, e. g., enfarte do miocárdio, hipertensão, aterosclerose e acidente vascular cerebral, para facilitar uma intervenção precoce e a prevenção da doença.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona métodos para avaliar o estado cardiovascular num indivíduo humano, como definido nas reivindicações. 0 estado cardiovascular é o estado fisiológico do sistema cardiovascular, como se reflecte em um ou mais marcadores do estado. Os marcadores do estado incluem, sem limitação, parâmetros clínicos, tais como, e. g., pressão sanguínea ou perfil eletrocardiográfico, assim como diagnósticos do estado cardiovascular realizados por profissionais médicos experientes, tais como, e. g., enfarte agudo do miocárdio, enfarte silencioso do miocárdio, acidente vascular cerebral e aterosclerose. São, igualmente, incluídas, na avaliação do estado cardiovascular, modificações ao longo do tempo dos 5 marcadores do estado. Os métodos da invenção são realizados pelos passos de : (i) determinação da sequência de uma ou mais posições polimórficas dentro de um ou mais dos genes codificando a enzima conversora da angiotensina (ACE), angiotensinogénio (AGT) e o receptor da angiotensina II de tipo 1 (ATI) no indivíduo, para estabelecer um padrão polimórfico para o indivíduo; e (ii) comparação do padrão polimórfico estabelecido em (i) e os padrões polimórficos para indivíduos que apresentam marcadores pré-determinados do estado cardiovascular. 0 padrão polimórfico para o indivíduo é, de um modo preferido, altamente semelhante e, de um modo mais preferido, idêntico ao padrão polimórfico de indivíduos que apresentam marcadores do estado particulares, síndromes cardiovasculares e/ou padrões particulares de resposta a intervenções terapêuticas.

Por exemplo, pode ser utilizada uma comparação entre o padrão polimórfico de um indivíduo e os padrões polimórficos de indivíduos apresentando respostas diferentes a uma intervenção terapêutica particular, para prever a capacidade de resposta do indivíduo a essa intervenção. De uma forma semelhante, os métodos da invenção podem ser utilizados para prever a predisposição a diferentes síndromes cardiovasculares. A invenção proporciona, igualmente, ácidos nucleicos isolados codificando a ACE, AGT e ATI, num indivíduo, compreendendo, cada um dos quais, pelo menos, uma posição polimórfica, como definida nas reivindicações. Em formas de 6 realização preferidas, a posição polimórfica, quer isolada, quer em combinação com outras posições polimórficas nas sequências da ACE, AGT ou ATI humanos ou em um ou mais outros genes humanos, é preditiva de um nivel particular de resposta a um determinado tratamento e/ou indica uma predisposição a uma ou mais sindromes clinicas associadas com a doença cardiovascular.

Os ácidos nucleicos isolados, de acordo com a invenção (os quais são descritos utilizando a numeração indicada na Tabela 1 abaixo), são: (i) Ácidos nucleicos codificando a ACE, tendo uma ou mais posições polimórficas na posição da região regulador, numerada 5106; nas posições na região codificante, numeradas como 375, 582, 731, 1060, 2741, 3132, 3387, 3503 e 3906; e na posição 1451, como numerada na entrada X621855 do Genbank, em que as sequências nas posições polimórficas na região reguladora da ACE, são uma ou mais de 5106T; e/ou as sequências nas posições polimórficas na região codificante são um ou mais de 375C, 582T, 731G, 1060A, 2741T, 3132T, 3387C, 3503G e 3906A. A invenção abrange, igualmente, um ácido nucleico codificando uma eliminação dos nucleótidos 1451-1783, como numerados na entrada X62855 do Genbank. (ii) Ácidos nucleicos codificando o AGT, tendo uma ou mais posições polimórficas nas posições na região reguladora, numeradas 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072 e 1204; nas posições na região codificante numeradas, como 273, 912, 997, 1116 e 1174; e na posição 49, como numerada na entrada M24688 do Genbank, em que as sequências nas posições polimórficas na região reguladora do AGT, são uma 7 ou mais de 412T, 1072A; as sequências na posição polimórfica na região codificante são uma ou mais de 273T, 997C e a sequência na posição 49 na entrada M24688 do Genbank é A ou G. (iii) Ácidos nucleicos codificando o ATI, tendo uma ou mais posições polimórficas em posições na região reguladora, numeradas 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 e 2415; e na posição na região codificante, numerada como 449, em que as sequências nas posições polimórficas na região reguladora do Atl, são um ou mais de 1427T, 1756Ά, 1853G, 2046C, 2354C, 2355C e 2415G; e/ou as sequências nas posições polimórficas na região codificante são 449C. A invenção abrange, igualmente, bibliotecas de sequências de ácido nucleico isoladas, como definidas nas reivindicações, em que cada sequência na biblioteca compreende uma ou mais posições polimórficas nos genes codificando a ACE, AGT ou ATI humanos. São, igualmente, proporcionadas sondas de ácido nucleico, como definidas nas reivindicações, que hibridam especificamente com as posições polimórficas identificadas; péptidos e polipéptidos compreendendo posições polimórficas; e anticorpos específicos para polimorfismos, i. e., anticorpos específicos para uma sequência que se ligam diferencialmente a variantes polimórficas dos polipéptidos da ACE, AGT ou ATI, como definido nas reivindicações e que, de um modo preferido, podem ser utilizados para identificar variantes polimórficas particulares.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona kits, como definidos nas reivindicações, para a determinação de padrões polimórficos nos genes da ACE, AGT, e/ou ATI de um indivíduo. Os 8 kits compreendem um meio para detectar sequências polimórficas, incluindo, sem limitação, sondas oligonucleotidicas que hibridam com as posições polimórficas ou adjacentes e anticorpos específicos para polimorfismos.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona alvos ácido nucleico e polipeptídicos, como definidos nas reivindicações, para utilização em métodos de rastreio para identificar candidatos a fármacos cardiovasculares. Os alvos ácido nucleico podem ser, e. g., ADN ou ARN e têm, de um modo preferido, pelo menos, cerca de, 10 e, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de, 15 resíduos de comprimento e compreendem uma ou mais posições polimórficas. Os péptidos alvo têm, pelo menos, cerca de, 5 aminoácidos de comprimento e podem ser do mesmo tamanho ou maiores do que os polipéptidos da ACE, AGT ou ATI completos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições: 1. Um "polimorfismo", como aqui utilizado, representa uma variação na sequência de um gene num indivíduo. Uma "posição polimórfica" é uma posição nucleotídica pré-determinada dentro da sequência de um gene ou uma posição de aminoácido pré-determinada na sequência de um polipéptido, nos quais se encontra localizado um polimorfismo. Um indivíduo "homozigótico" para um polimorfismo particular é aquele, no qual ambas as cópias do gene contêm a mesma sequência na posição polimórfica. Um indivíduo "heterozigótico" para um polimorfismo particular é aquele, no qual as duas cópias do gene contêm sequências diferentes na posição polimórfica. 2. Um "padrão de polimorfismo", como aqui utilizado, representa um conjunto de um ou mais polimorfismos, que podem ser contidos na sequência de um único gene ou de uma pluralidade de genes. Um padrão de polimorfismo pode compreender polimorfismos de aminoácidos ou de nucleótidos. 3. "Ácido nucleico" ou "polinucleótido", como aqui utilizado, refere-se a polímeros contendo purinas e pirimidinas de qualquer comprimento, quer polirribonucleótidos, quer polidesoxirribonucleótidos, querpolirribo-polidesoxirribonucleótidos mistos. Os ácidos nucleicos incluem, sem limitação, moléculas de cadeia dupla e simples, i. e., híbridos de ADN-ADN, ADN-ARN e ARN-ARN, assim como "ácidos nucleicos proteína" (PNA) formados pela conjugação de bases com uma estrutura base de aminoácido. Isto inclui, igualmente, ácidos nucleicos contendo bases modificadas. 4. Um ácido nucleico ou polipéptido "isolado", como aqui utilizado, refere-se a um ácido nucleico ou polipéptido que é removido do seu ambiente original (por exemplo, o seu ambiente natural se este for de ocorrência natural). Um ácido nucleico ou polipéptido isolado contém menos de, cerca de, 50%, de um modo preferido, menos de, cerca de, 75% e, de um modo muito preferido, menos de, cerca de, 90% dos componentes celulares com os quais este se encontrava originalmente associado. 10 5. Uma sequência de ácido nucleico ou polipeptídica que é "derivada" de uma sequência designada, refere-se a uma sequência que corresponde a uma região da sequência designada. Para sequências de ácido nucleico, isto abrange sequências que são homólogas ou complementares à sequência. 6. Uma "sonda" refere-se a um ácido nucleico ou a um oligonucleótido que forma uma estrutura híbrida com uma sequência num ácido nucleico alvo, devido à complementaridade de, pelo menos, uma sequência na sonda com uma sequência no ácido nucleico alvo. 7. Os ácidos nucleicos são "hibridáveis" entre si quando, pelo menos, uma cadeia de ácido nucleico pode emparelhar com outra cadeia de ácido nucleico, sob condições de restringência definidas. A restringência da hibridação é determinada, e. g., por a) a temperatura na qual a hibridação e/ou a lavagem são realizadas e b) a força iónica e polaridade (e. g., formamida) das soluções de hibridação e de lavagem, assim como por outros parâmetros. A hibridação requer que dois ácidos nucleicos contenham sequências substancialmente complementares; dependendo da restringência da hibridação, no entanto, podem ser tolerados emparelhamentos incorrectos. A restringência adequada para a hibridação de ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementaridade, variáveis bem conhecidas na técnica. Por exemplo, "restringência elevada", como aqui utilizado, refere-se à hibridação e/ou lavagem a 68 °C em 0,2 X SSC, a 42 °C em formamida 50%, 4 X SSC ou sob condições que permitam níveis de hibridação equivalentes aos observados sob qualquer destas duas condições. 11 8. Um "gene" para uma proteína particular, como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de ácido nucleico contígua, correspondente a uma sequência presente num genoma, a qual compreende (i) uma "região codificante," a qual compreende exões (i. e., sequências codificando uma sequência polipeptídica ou "sequências codificantes de proteínas"), intrões e sequências na junção entre exões e intrões; e (ii) sequências reguladoras, as quais flanqueiam a região codificante tanto nos terminais 5' como 3'. Por exemplo, o "gene da ACE", como aqui utilizado, abrange as regiões reguladoras e codificantes do gene humano codificando a enzima conversora da angiotensina. De um modo semelhante o "gene do AGT" abrange regiões reguladoras e codificantes do gene humano codificando o angiotensinogénio e o "gene do ATI" abrange regiões reguladoras e codificantes do gene humano codificando o receptor da angiotensina II de tipo I. Tipicamente, as sequências reguladoras de acordo com a invenção encontram- -se localizadas 5' (i. e., a montante) do segmento da região codificante. As sequências de referência, obtidas do Genbank, as quais foram utilizadas na realização da presente invenção são apresentadas na Tabela 1. 12

Tabela 1

Abreviatura Sequência Modelo Comparada Numeração de acordo com a entrada da sequência no GenBank Região Reguladora do AGT X15323 (SEQ ID N°. 1) X15323 (SEQ ID N°. 1) Região Codificante do AGT M24686 (exão2) (SEQ ID N°. 2) M24687 (exão 3) (SEQ ID N°. 3) M24688 (exão4) (SEQ ID N°. 4) M24689 (exão 5) (SEQ ID N°. 5) As sequências codificantes de proteínas do exão 2-5 foram processadas em conjunto, como descrito nas entradas do GenBank. 0 Nucleóide 1 é atribuído ao primeiro nucleótido do codão iniciador de metionina. Região Reguladora da ACE X94359 (SEQ ID N°. 6) X94359 (SEQ ID N°. 6) Região Codificante da ACE J04144 (SEQ ID N°. 7) X62855 (intrão 16) (SEQ ID N°. 8) J04144 (SEQ ID N°. 7) 0 nucleóide 1 é atribuído ao primeiro nucleótido do codão iniciador de metionina. X62855 (SEQ ID N°. 8) Região Reguladora do ATI U07144 (SEQ ID N°. 9) U07144 (SEQ ID N°. 9) Região Codificante do ATI S80239 (exão 3) (SEQ ID N°. 10) S77410 (exão 5) (SEQ ID N°. 11) A sequência codificante da proteína de S80239 (SEQ ID N°. 10) foi processada para a posição 288 da entrada S77410 (SEQ ID N°. 11). 0 nucleóide 1 é atribuído ao primeiro nucleótido do codão iniciador de metionina na entrada S80239 (SEQ ID N°. 10). 13 0 presente requerente verificou, surpreendentemente e inesperadamente, a existência de polimorfismos genéticos dentro dos genes humanos que codificam a ACE, AGT e ATI, os quais, isoladamente ou em combinação, podem ser utilizados para avaliar o estado cardiovascular. De acordo com a invenção, o padrão polimórfico das sequências da ACE, do AGT e/ou do ATI num indivíduo, pode predizer a capacidade de resposta do indivíduo a intervenções terapêuticas particulares e servir como um indicador da predisposição a várias formas da doença cardiovascular. A invenção proporciona métodos para avaliar o estado cardiovascular, pela detecção de padrões polimórficos num indivíduo. A presente invenção proporciona, igualmente, ácidos nucleicos isolados derivados dos genes da ACE, AGT e ATI, os quais compreendem estes polimorfismos, incluindo sondas que hibridam especificamente com posições polimórficas; polipéptidos e péptidos isolados compreendendo resíduos polimórficos; e anticorpos que reconhecem, especificamente, polipéptidos da ACE, AGT ou ATI, contendo um ou mais aminoácidos polimórficos. Métodos para a Avaliação do Estado Cardiovascular A presente invenção proporciona métodos de diagnóstico para a avaliação do estado cardiovascular num indivíduo humano. 0 estado cardiovascular, como aqui utilizado, refere-se ao estado fisiológico do sistema cardiovascular de um indivíduo, como reflectido em um ou mais marcadores ou indicadores. Os marcadores do estado incluem, sem limitação, medições clínicas, tais como, e. g., pressão sanguínea, perfil eletrocardiográfico e análise diferenciada do fluxo sanguíneo. Os marcadores do estado, de acordo com a invenção, incluem diagnósticos de uma ou mais síndromes cardiovasculares, tais como, e. g., hipertensão, 14 enfarte agudo do miocárdio, enfarte silencioso do miocárdio, acidente vascular cerebral e aterosclerose. Deverá ser entendido que um diagnóstico de uma síndrome cardiovascular realizada por um profissional médico abrange medições clinicas e avaliação médica. Os marcadores do estado, de acordo com a invenção, são avaliados utilizando métodos convencionais bem conhecidos na técnica. São, igualmente, incluídas na avaliação do estado cardiovascular, modificações quantitativas ou qualitativas em marcadores do estado ao longo do tempo, tais como os que podem ser utilizados, e. g., na determinação da resposta de um indivíduo a um regime terapêutico particular.

Os métodos são realizados pelos passos de : (i) determinação da sequência de uma ou mais posições polimórficas dentro de um ou mais dos genes codificando a enzima conversora da angiotensina (ACE), angiotensinogénio (AGT) ou receptor da angiotensina II de tipo 1 (ATI) no indivíduo, para estabelecer um padrão polimórfico para o indivíduo; e (ii) comparação do padrão polimórfico estabelecido em (i) com os padrões polimórficos de humanos apresentando diferentes marcadores do estado cardiovascular. O padrão polimórfico do indivíduo é, de um modo preferido, altamente semelhante e, de um modo muito preferido, idêntico ao padrão polimórfico de indivíduos que apresentam marcadores do estado particulares, síndromes cardiovasculares, e/ou padrões de resposta particulares a intervenções terapêuticas. Os padrões polimórficos podem, igualmente, incluir posições polimórficas em outros genes, as quais são apresentadas, em combinação com uma ou mais posições 15 polimórficas no ACE, AGT ou ATI, para serem correlacionadas com a presença de marcadores do estado particulares.

Numa forma de realização, o método envolve a comparação do padrão polimórfico de um indivíduo com os padrões polimórficos de indivíduos que demonstraram responder positivamente ou negativamente a um regime terapêutico particular. O regime terapêutico, como aqui utilizado, refere-se a tratamentos que visam a eliminação ou a melhoria de sintomas e eventos associados com a doença cardiovascular. Esses tratamentos incluem, sem limitação, uma ou mais de, alteração da dieta, estilo de vida e regime de exercício; técnicas cirúrgicas invasivas e não-invasivas, tais como aterectomia, angioplastia e cirurgia de desvio coronário; e intervenções farmacêuticas, tais como administração de inibidores da ACE, antagonistas do receptor da angiotensina II, diuréticos, antagonistas do alfa-adrenorreceptor, glicósidos cardíacos, inibidores da fosfodiesterase, antagonistas do beta-adrenorreceptor, bloqueadores do canal de cálcio, inibidores da redutase de HMG-CoA, bloqueadores do receptor da imidazolina, bloqueadores do receptor da endotelina e nitritos orgânicos. São, igualmente, abrangidas as intervenções com agentes farmacêuticos ainda não conhecidos, cuja actividade se correlacione com padrões polimórficos particulares, associados com a doença cardiovascular. 0 presente requerente verificou que os padrões polimórficos particulares se correlacionam com a capacidade de resposta de um indivíduo aos inibidores da ACE (ver, e. g., Exemplo 3, abaixo). É contemplado, por exemplo, que os doentes que são candidatos a um regime terapêutico particular sejam submetidos a rastreio para padrões polimórficos que se correlacionem com a capacidade de resposta a esse regime particular. 16

Numa forma de realização preferida, é determinada a presença ou ausência de um padrão polimórfico que compreende ACE 2193 A/G, AGR 1072 G/G e ATI 1167 A/A (ver abaixo), num indivíduo, para identificar a capacidade de resposta de um indivíduo aos inibidores da ACE .

Numa outra forma de realização, o método envolve a comparação do padrão polimórfico de um indivíduo com padrões polimórficos de indivíduos que apresentam ou apresentaram um ou mais marcadores de doença cardiovascular, tais como, e. g., pressão sanguínea elevada, perfil eletrocardiográfico anormal, enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral ou aterosclerose (ver, e. g., Exemplo 2, abaixo).

Na realização dos métodos da invenção, o padrão polimórfico de um indivíduo pode ser estabelecido, obtendo ADN do indivíduo e determinando a sequência em posições polimórficas pré-determinadas na ACE, AGT e ATI, tais como as descritas acima. O ADN pode ser obtido a partir de qualquer fonte celular. Os exemplos não limitantes de fontes celulares, disponíveis na prática clínica, incluem células sanguíneas, células bucais, células cervicovaginais, células epiteliais da urina, células fetais ou quaisquer células presentes em tecidos obtidos por biópsia. As células podem ser, igualmente, obtidas a partir de fluidos corporais, incluindo, sem limitação, sangue, saliva, suor, urina, fluido cerebroespinal, fezes e exudados de tecidos no local de infecção ou de inflamação. O ADN é extraído a partir da fonte celular ou do fluido corporal, utilizando qualquer dos vários métodos que são padrão na técnica. Deverá ser entendido 17 que o método particular, utilizado para extrair ADN, irá depender da natureza da fonte. A determinação da sequência do ADN extraído, em posições polimórficas nos genes da ACE, AGT, e/ou ATI é realizada por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo mas não limitado à sequenciação directa, hibridação com oligonucleótidos específicos para um alelo, PCR específico para um alelo, PCR com ligase, quebra HOT, electroforese em gel de gadiente desnaturante (DDGE) e polimorfismo conformacional de cadeia simples (SSCP). A sequenciação directa pode ser realizada por qualquer método, incluindo, sem limitação, sequenciação química, utilizando o método de Maxam-Gilbert; por sequenciação enzimática, utilizando o método de Sanger; sequenciação por espectrometria de massa; e sequenciação utilizando uma tecnologia baseada em chips. Ver, e. g., Little et al., Genet. Anal. 6:151, 1996. De um modo preferido, o ADN de um indivíduo é, inicialmente, submetido a amplificação por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores de amplificação específicos.

Numa forma de realização alternativa, o tecido da biópsia é obtido a partir de um indivíduo. Os anticorpos que são capazes de distinguir entre formas polimórficas diferentes da ACE, AGT, e/ou ATI são, então, aplicados a amostras do tecido para determinar a presença ou a ausência de uma forma polimórfica especificada pelo anticorpo. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, de um modo preferido, monoclonais. A medição da ligação específica de anticorpos a células pode ser realizada por qualquer método conhecido, e. g. , citometria de fluxo quantitativa ou imunoensaio ligado a enzima ou ligado a fluorescência. A presença ou a ausência de um polimorfismo ou 18 padrão polimórfico particular e a sua distribuição alélica (í. e., homozigotia vs. heterozigotia) são determinadas, por comparação dos valores obtidos a partir de um doente, com normas estabelecidas a partir de populações de doentes que apresentam padrões polimórficos conhecidos.

Numa forma de realização alternativa, o ARN é isolado a partir do tecido da biópsia, utilizando métodos padrão, bem conhecidos dos comuns especialistas na técnica, tais como extracção com tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio (Chomocyznski et ai., 1987, Anal. Biochem., 162:156.) 0 ARN isolado é, então, submetido a transcrição reversa acoplada à amplificação pela reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR), utilizando iniciadores oligonucleotídicos específicos. As condições do emparelhamento do iniciadores são escolhidas de forma a assegurar transcrição reversa e amplificação específicas; Deste modo, o aspecto de um produto de amplificação constitui um diagnóstico da presença de alelos particulares. Numa outra forma de realização, o ARN é submetido a transcrição reversa e amplificado, após o que, as sequências amplificadas são identificadas por, e. g., sequenciação directa.

Na realização da presente invenção, a distribuição de padrões polimórficos, num número elevado de indivíduos apresentando marcadores particulares do estado cardiovascular, é determinada por qualquer dos métodos descritos acima e é comparada com a distribuição de padrões polimórficos em doentes que foram classificados em termos de idade, origem étnica, e/ou quaisquer outros parâmetros estatística ou medicamente relevantes, que apresentam, quantitativamente ou qualitativamente, diferentes marcadores do estado. As correlações são realizadas utilizando qualquer método conhecido 19 na técnica, incluindo regressão logística nominal ou análise de regressão dos mínimos quadrados padrão. Desta forma, é possível estabelecer correlações estatisticamente significativas entre padrões polimórficos particulares e estados cardiovasculares particulares. É adicionalmente, possível estabelecer correlações estatisticamente significativas entre padrões polimórficos particulares e modificações no estado cardiovascular tais como, as resultantes, e. g., de regimes de tratamento particulares. Desta forma, é possível correlacionar padrões polimórficos com a capacidade de resposta a tratamentos particulares.

Posições Polimórficas em Genes Codificantes da ACE, AGT e

ATI

As posições polimórficas dos genes codificantes da ACE, AGT e ATI, que são abrangidas pela invenção, são identificadas pela determinação da sequência de ADN da totalidade ou de parte dos genes da ACE, AGT, e/ou ATI numa multiplicidade de indivíduos, numa população. A determinação da sequência de ADN pode ser realizada utilizando qualquer método convencional, incluindo, e. g., sequenciação química ou enzimática.

As posições polimórficas da invenção incluem, sem limitação, as listadas abaixo, cuja numeração corresponde às sequências do Genbank listadas na Tabela 1. (i) ACE: posições na região reguladora (designada como ACR) , numeradas 5106, 5349 e 5496; as posições na região codificante (designada como ACE), numeradas 375, 582, 731, 1060, 1215, 2193, 2328, 2741, 3132, 3387, 3503 e 3906; e a posição 1451, como numerada na entrada X62855 do Genbank. 20 (ii) AGT: posições na região reguladora (designada como AGR) , numeradas 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072, 1204 e 1218; as posições na região codificante (designada como AGT), numeradas 273, 620, 803, 912, 997, 1116 e 1174; e a posição 49 como numerada na entrada M24688 do Genbank. (iii) ATI: posições na região reguladora (designada como ATR), numeradas 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 e 2415; e as posições na região codificante (designada como ATI), numeradas 449, 678, 1167 e 1271.

Em formas de realização preferidas, a sequência, em cada uma das posições polimórficas acima é uma de: (i) Região Reguladora da ACE: 5106C, 5106T, 5349A, 5349T, 5496T e 5496C; (ii) Região Codificante da ACE: 375A, 375C, 582C, 582T, 731A, 731G, 1060G, 1060A, 1215C, 1215T, 2193G, 2193A, 2328A, 2328G, 2741G, 2741T, 3132C, 3132T, 3387T, 3387C, 3503G, 3503C, 3906G e 3906A; e uma eliminação dos nucleótidos 1451-1783, como numerados na entrada X62855 do Genbank; (iii) Região Reguladora do AGT: 395T, 395A, 412C, 412T, 432G, 432A, 449T, 449C, 692C, 692T, 839G, 839A, 1007G, 1007A, 1072G, 1072A, 1204C, 1204A, 1218A, 1218G; (iv) Região Codificante do AGT: 273C, 273T, 620C, 620T, 803T, 803C, 912C, 912T, 997G, 997C, 1116G, 1116A, 1174C e 1174A; e A ou G na posição 49 na entrada M24688 do Genbank; 21

(v) Região Reguladora do ATI: 1427A, 1427T, 1756T, 1756A

1853T, 1853G, 2046T, 2046C, 2354A, 2354C, 2355G, 2355C 2415A e 2415G; e (vi) Região Codificante do ATI: 449G, 449C, 678T, 678C, 1167A, 1167G, 1271A e 1271C.

Um indivíduo pode ser homozigótico ou heterozigótico para uma posição polimórfica particular (ver, e. g.r Tabela 6, abaixo).

Os exemplos não limitantes de padrões polimórficos compreendendo um ou mais polimorfismos nos genes da ACE, AGT, e/ou ATI, de acordo com a invenção, incluem os seguintes, os quais foram correlacionados com uma incidência aumentada de sinais clínicos da doença cardiovascular:

ACR 5349 A/T, AGR 1218 A; ACR 5496 C, AGR 1204 A/C; ACR 5496 C/T , AGR 1218 A, AGT 62 0 C/T; ACE 2193 A, AGR 1204 C, ACE 2328 G; ACE 2193 A, , AGR 1204 A/C; ACE 3387 T, AGR 1218 A; ACE 3387 T, AGT 620 C/T; AGR 1204 A/C, ATI 678 C/T; AGR 1204 A/C, ATI 1271 A/C; ACE 1215 C, AGR 1204 A/C; AGR 1204 A/C, ATI 1167 A, ACE 3906 A/G; AGR 1204 A, AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGR 395 A/T; AGR 1204 A/C, AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A, AGR 395 T; AGR 1204 A/C, AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A/G, AGR 395 T; AGR 1204 A, ATI 678 C, ATI 1167 A, AGR 395 A/T; AGR 1204 A/C, ATI 678 C/T, ATI 1167 A, AGR 395 T; AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A, AGR 395 T; AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A/G, AGR 395 T; AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGR 395 A/T; AGT 620 C, ATI 678 A, ATI 1167 A, AGT 395 A/T; AGT 620 C/T, ATI 678 C/T; ATI 1167 A, AGT 395 T; ACE 2193 A, AGR 1218 A, 22 AGT 8 03 A; ACE 2193 A, AGT 62 0 C/T; ACE 232 8 G, AGT 62 0 C/T; ACE 3387 T, AGR 1204 A/C; ACE 2193 A, ACE 2328 G, AGR 1204 C; e ACE 2193 A/G, AGR 1072 G/G, ATI 1167 A/A. Ácidos Nucleicos Polimórficos Isolados, Sondas e Vectores A presente invenção proporciona ácidos nucleicos isolados, compreendendo as posições polimórficas descritas acima para os genes da ACE, AGT e ATI humanos; vectores compreendendo os ácidos nucleicos; e células hospedeiras transformadas compreendendo os vectores. A invenção proporciona, igualmente, sondas que são úteis para detectar estes polimorfismos.

Na realização da presente invenção, são utilizadas muitas técnicas convencionais em biologia molecular, microbiologia e ADN recombinante. Essas técnicas são bem conhecidas e são completamente explicadas em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II, 1985 (D.N.

Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.);

Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames e Higgins); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1997, (John Wiley and Sons); e Methods in Enzymology Vol. 154 e Vol. 155 (respectivamente, Wu e Grossman e Wu eds). A inserção de ácidos nucleicos (tipicamente ADNs), compreendendo as sequências da presente invenção, num vector é, facilmente, realizada quando os terminais de tanto os ADNs como do vector compreendem locais de restrição compatíveis. Se isto não puder ser realizado, poderá ser necessário modificar os 23 terminais dos ADNs e/ou do vector, pela digestão de projecções de ADN em cadeia simples, produzidas por quebra com endonuclease de restrição, de forma a produzir extremidades rombas ou alcançar o mesmo resultado, pelo preenchimento dos terminais em cadeia simples com uma polimerase de ADN adequada.

Alternativamente, pode ser produzido qualquer local pretendido, e. g., pela ligação de sequências nucleotidicas (adaptadores) aos terminais. Esses adaptadores podem compreender sequências oligonucleotidicas especificas que definem locais de restrição pretendidos. Os locais de restrição podem ser, igualmente, produzidos pela utilização da reacção em cadeia da polimerase (PCR) . Ver, e. g., Saiki et al., 1988, Science 239:48. 0 vector quebrado e os fragmentos de ADN podem ser, igualmente, modificados, se necessário, por extensão homopolimérica.

Os ácidos nucleicos podem ser isolados, directamente, a partir de células ou podem ser sintetizados quimicamente, utilizando métodos conhecidos. Alternativamente, pode ser utilizado o método de reacção em cadeia da polimerase (PCR) para produzir os ácidos nucleicos da invenção, utilizando, quer cadeias sintetizadas quimicamente, quer material genómico como padrões. Os iniciadores utilizados para a PCR podem ser sintetizados, utilizando a informação de sequência aqui fornecida e podem ser, adicionalmente, concebidos para introduzir novos locais de restrição adequados para, se pretendido, facilitar a incorporação num determinado vector, para expressão recombinante.

Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser flanqueados por sequências génicas da ACE, AGT ou ATI nativas ou 24 podem encontrar-se associadas com sequências heterólogas, incluindo promotores, intensificadores, elementos de resposta, sequências sinal, sequências de poliadenilação, intrões, regiões não codificantes 5'- e 3'- e semelhantes. Os ácidos nucleicos podem ser, igualmente, modificados de várias formas conhecidas na técnica. Os exemplos não limitantes dessas modificações incluem metilação, "coberturas", substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotidicas, tais como, por exemplo, as que apresentam ligações sem carga (e. g., fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações com carga (e. g., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.) . Os ácidos nucleicos podem conter uma ou mais partes adicionais ligadas covalentemente, tais como, por exemplo, proteínas (e. g., nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos sinal, poli-L-lisina, etc.), intercalantes (e. g., acridina, psoraleno, etc.), quelantes (e. g., metais, metais radioactivos, ferro, metais oxidativos, etc.) e alquilantes. São, igualmente, incluídos PNAs. 0 ácido nucleico pode ser derivatizado pela formação de uma ligação metilo ou etilfosfotriéster ou fosforamidato de alquilo. Para além disso, as sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser, igualmente, modificadas com uma marcação capaz de proporcionar um sinal detectável, quer directamente, quer indirectamente. As marcações características incluem radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina e semelhantes. A invenção também proporciona, vectores de ácido nucleico, compreendendo as sequências génicas divulgadas, derivadas da ACE, AGT e ATI ou seus derivados ou fragmentos. Foi descrito um grande número de vectores, incluindo vectores plasmídicos e fúngicos, para replicação e/ou expressão em vários hospedeiros 25 eucariotas e procariotas e podem ser utilizados em terapia génica, assim como em clonagem simples ou na expressão de proteínas. Os exemplos não limitantes de vectores adequados incluem, sem limitação, plasmídeos pUC, plasmídeos pET (Novagen, Inc., Madison, WI) ou pRSET ou pREP (Invitrogen, San Diego, CA) e muitas células hospedeiras adequadas, utilizando métodos aqui divulgados ou referidos ou, de outra forma, conhecidos dos especialistas na técnica relevante. A escolha do vector/hospedeiro em particular não é decisiva para a realização da invenção.

As células hospedeiras adequadas podem ser transformadas/transfectadas/infectadas como adequado, atrvés de qualquer método adequado, incluindo electroporação, incorporação de ADN mediado por CaCl2, infecção fúngica ou virai, microinjecção, microprojécteis ou outros métodos estabelecidos. As células hospedeiras adequadas incluem bactérias, arqueobactérias, fungos, em especial, leveduras e células vegetais e animais, em especial, células de mamífero. Foi isolado Um grande número de regiões reguladoras da iniciação e terminação da transcrição e demonstraram ser eficazes na transcrição e na tradução de proteínas heterólogas, em vários hospedeiros. São conhecidos na técnica, exemplos destas regiões, métodos de isolamento, forma de manipulação, etc. Sob condições de expressão adequadas, as células hospedeiras podem ser utilizadas como uma fonte de péptidos e polipéptidos derivados da ACE, AGT ou ATI, produzidos recombinantemente.

Podem ser, igualmente, introduzidos ácidos nucleicos codificando sequências génicas derivadas da ACE, AGT ou ATI, em células, através de eventos de recombinação. Por exemplo, essa sequência pode ser introduzida numa célula e, deste modo, 26 efectuar recombinação homóloga no local de um gene endógeno ou de uma sequência com identidade substancial com o gene. Podem ser, igualmente, utilizados outros métodos baseados em recombinação, tais como, recombinações não-homólogas ou eliminação de genes endógenos por recombinação homóloga.

Os ácidos nucleicos da presente invenção encontram utilização como sondas para a detecção de polimorfismos genéticos e como moldes para a produção recombinante de péptidos ou polipéptidos derivados da ACE, AGT ou ATI, normais ou variantes.

As sondas de acordo com a presente invenção compreendem, sem limitação, ácidos nucleicos isolados com, cerca de, 10-100 pb, de um modo preferido, 15-75 pb e, de um modo muito preferido, 17-25 pb de comprimento, os quais hibridam, sob condições de restringência elevada, com uma ou mais das sequências polimórficas, derivadas dos genes da ACE, AGT ou ATI, aqui divulgadas ou com uma sequência imediatamente adjacente a uma posição polimórfica. Para além disso, em algumas formas de realização, pode ser utilizada uma sequência génica completa como sonda. Numa série de formas de realização, as sondas abrangem as posições polimórficas nos genes da ACE, AGT ou ATI divulgadas acima. Numa outra série de formas de realização, as sondas correspondem a sequências imediatamente adjacentes a posições polimórficas. 27

Polipéptidos da ACE, AGT e ATI Polimórficos e Anticorpos Específicos para o Polimorfismo A presente invenção abrange péptidos e polipéptidos isolados, codificando a ACE, AGT e ATI, compreendendo posições polimórficas divulgadas acima. Numa forma de realização preferida, os péptidos e os polipéptidos são alvos de rastreio úteis para identificar fármacos cardiovasculares. Noutras formas de realização preferidas, os péptidos e os polipéptidos são capazes de promover anticorpos num animal hospedeiro adequado, que reagem, especificamente, com um polipéptido compreendendo a posição polimórfica e que o distinguem de outros polipéptidos que têm uma sequência diferente naquela posição.

Os polipéptidos, de acordo com a invenção, têm, de um modo preferido, pelo menos, cinco ou mais resíduos de comprimento, de um modo preferido, pelo menos, quinze resíduos. São descritos abaixo, métodos para obter estes polipéptidos. São utilizadas muitas técnicas convencionais em bioquímica de proteínas e imunologia. Essas técnicas são bem conhecidas e explicadas em Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, 1987 (Mayer e Waler, eds; Academic Press, Londres); Scopes, 1987, Protein Purification: Principies and Practice, Segunda Edição (Springer-Verlag, N.I.) e Handbook of Experimental Immunology, 1986, Volumes I-IV (Weir e Blackwell eds.).

Podem ser utilizados ácidos nucleicos compreendendo sequências codificantes de proteínas, para controlar a expressão recombinante de polipéptidos derivados da ACE, AGT ou ATI, em células intactas ou em sistemas de tradução acelulares. 0 código genético conhecido, adaptado, se pretendido, para uma expressão 28 mais eficiente num determinado organismo hospedeiro, pode ser utilizado para sintetizar oligonucleótidos codificando as sequências de aminoácido pretendidas. Os polipéptidos podem ser isolados a partir de células humanas ou a partir de organismos ou células heterólogos (incluindo, mas não limitados a, células bacterianas, fúngicas, de insecto, vegetais e de mamífero), nos quais foi introduzida e expressa uma sequência codificando uma proteína adequada. Para além disso, os polipéptidos podem ser parte de proteínas de fusão recombinantes.

Os péptidos e os polipéptidos podem ser sintetizados quimicamente por processos automatizados, comercialmente disponíveis, incluindo, sem limitação, síntese em fase sólida exclusiva, métodos em fase sólida parcial, condensação de fragmentos ou síntese em solução clássica. Os polipéptidos são, de um modo preferido, preparados por síntese de péptidos em fase sólida, como descrito por Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149.

Os métodos de purificação de polipéptidos são bem conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, electroforese em gel em disco preparativa, focagem isoeléctrica, HPLC, HPLC de fase reversa, filtração em gel, permuta iónica e cromatografia de partição e distribuição contracorrente. Para alguns objectivos, é preferido produzir o polipéptido num sistema recombinante, no qual a proteína contém uma sequência marcadora adicional que facilita a purificação, tal como, mas não limitada a, uma sequência de poli-histidina. 0 polipéptido pode, então, ser purificado a partir de um lisado bruto da célula hospedeira, por cromatografia numa matriz de fase sólida adequada. Alternativamente, podem ser utilizados anticorpos produzidos contra a ACE, AGT ou ATI ou contra péptidos derivados destes, 29 como reagentes de purificação. São possíveis outros métodos de purificação A presente invenção abrange, igualmente, derivados e homólogos dos polipéptidos. Para alguns objectivos, as seguências de ácido nucleico, codificando os péptidos, podem ser alteradas por substituições, adições ou eliminações, gue fornecem moléculas funcionalmente equivalentes, i. e., variantes conservadoras de função. Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro da sequência podem ser substituídos por outro aminoácido com propriedades semelhantes, tais como, por exemplo, aminoácidos carregados positivamente (arginina, lisina e histidina); aminoácidos carregados negativamente (aspartato e glutamato); aminoácidos neutros polares; e aminoácidos não-polares.

Os polipéptidos isolados podem ser modificados, por exemplo, por fosforilação, sulfatação, acilação ou outras modificações das proteínas. Estes podem ser, igualmente, modificados com uma marcação, capaz de proporcionar um sinal detectável, quer directamente, quer indirectamente, incluindo, mas não limitado a, radioisótopos e compostos fluorescentes. A presente invenção abrange, igualmente, anticorpos que reconhecem, especificamente, as posições polimórficas da invenção e distinguem um péptido ou um polipéptido contendo um polimorfismo particular de um que contenha uma sequência diferente nessa posição. Esses anticorpos específicos para a posição polimórfica, de acordo com a presente invenção incluem anticorpos policlonais e monoclonais. Os anticorpos podem ser promovidos num hospedeiro animal por imunização com componentes imunogénicos derivados da ACE, AGT ou ATI ou podem ser formados 30 por imunização in vitro de células imunitárias. Os componentes imunogénicos utilizados para promover os anticorpos podem ser isolados a partir de células humanas ou produzidos em sistemas recombinantes. Os anticorpos podem ser, igualmente, produzidos em sistemas recombinantes, programados com o ADN adequado codificando anticorpo. Alternativamente, os anticorpos podem ser construídos pela reconstituição bioquímica de cadeias pesadas e leves purificadas. Os anticorpos incluem anticorpos híbridos (i. e., contendo dois conjuntos de combinações de cadeia pesada/cadeia leve, reconhecendo, cada uma delas, um antigénio diferente), anticorpos quiméricos (i. e., nos quais as cadeias pesadas, as cadeias leves ou ambas, são proteínas de fusão) e anticorpos univalentes (í. e., compreendidos por um complexo cadeia pesada/cadeia leve, ligado à região constante de uma segunda cadeia pesada). São, igualmente, incluídos fragmentos de Fab, incluindo fragmentos de anticorpos Fab' e F(ab)2· Os métodos de produção da totalidade dos tipos de anticorpos acima e derivados são bem conhecidos na técnica e são discutidos abaixo com maior detalhe. Por exemplo, em Mayer e Walker, 1987, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, (Academic Press, Londres), são divulgadas técnicas para produzir e processar anti-soros policlonais. A metodologia geral para preparar anticorpos monoclonais através de hibridomas é bem conhecida. Podem ser criadas linhas celulares imortais, produtoras de anticorpos, por fusão celular e, igualmente, por outras técnicas, tais como transformação directa de linfócitos B com ADN oncogénico ou por transfecção com o vírus de Epstein-Barr. Ver, e. g., Schreier et ai., 1980, Hybridoma Techniques; Patentes U.S. N° 4341761; 4399121; 4427783; 4444887; 4466917; 4472500; 4491632; e 4493890. Os painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra epitopos derivados da ACE, AGT ou 31 ATI podem ser submetidos a rastreio para várias propriedades; i. e., para isotipo, afinidade de epitopo, etc.

Os anticorpos desta invenção podem ser purificados por métodos padrão, incluindo, mas não limitados a, electroforese preparativa em gel em disco, focagem isoeléctrica, HPLC, HPLC de fase reversa, filtração em gel, permuta iónica e cromatografia de partição e distribuição contracorrente. Em, e. g., The Art of Antihody Purification, 1989, Amicon Division, W.R. Grace & Co são divulgados métodos de purificação de anticorpos. Em Protein Purification: Principies and Practice, R.K. Scopes, Ed., 1987, Springer-Verlag, Nova Iorque, NI, são descritos métodos gerais de purificação de proteínas.

Os métodos para a determinação a capacidade imunogénica das sequências divulgadas e as caracteristicas dos anticorpos resultantes específicos para uma sequência e das células imunitárias são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos promovidos em resposta a um péptido compreendendo uma sequência polimórfica particular podem ser testados para a sua capacidade para reconhecer, especificamente, essa sequência polimórfica, í. e., ligarem-se diferencialmente a um péptido ou a polipéptido, compreendendendo a sequência polimórfica e, deste modo, distingui-lo de um péptido ou polipéptido semelhante que contenha uma sequência diferente na mesma posição. Métodos de Diagnóstico e Kits A presente invenção proporciona kits para a determinação da sequência em posições polimórficas dentro dos genes da ACE, AGT e ATI num indivíduo. Os kits compreendem um meio para determinar 32 a sequência em uma ou mais posições polimórficas e podem incluir, opcionalmente, dados para análise de padrões polimórficos. Os meios para a determinação da sequência podem compreender reaqentes baseados em ácidos nucleicos e imunológicos adequados (ver abaixo). De um modo preferido, os kits compreendem, igualmente, tampões adequados, reagentes de controlo, quando apropriado, e instruções para determinar a sequência numa posição polimórfica. Os kits podem, igualmente, compreender dados para correlacionar padrões polimórficos particulares com regimes de tratamento desejáveis ou outros indicadores. Métodos de diagnóstico e kits baseados em ácidos nucleicos: A invenção proporciona métodos baseados em ácidos nucleicos para a detecção de padrões polimórficos numa amostra biológica. A sequência das posições polimórficas particulares, nos genes codificando a ACE, AGT, e/ou ATI, é determinada, utilizando qualquer meio adequado conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, hibridação com sondas especificas para o polimorfismo e sequenciação directa. A presente invenção proporciona, igualmente, kits adequados para aplicações de diagnóstico baseados em ácidos nucleicos. Numa forma de realização, os kits de diagnóstico incluem os seguintes componentes: (i) ADN sonda: o ADN sonda pode ser pré-marcado; alternativamente, o ADN sonda pode não ser marcado e os ingredientes para a marcação podem ser incluídos no kit, em contentores separados; e 33 (ii) Reagentes de hibridação: o kit pode, igualmente, conter outros reagentes e materiais adequadamente embalados, necessários para o protocolo de hibridação particular, incluindo matrizes de fase sólida, se aplicável, e padrões.

Numa outra forma de realização, os kits de diagnóstico incluem: (i) Iniciadores para a determinação da sequência: os iniciadores de sequenciação podem ser pré-marcados ou conter uma parte de purificação por afinidade ou de ligação; e (ii) Reagentes para a determinação da sequência: o conjunto pode, igualmente, conter outros reagentes e materiais adequadamente embalados, necessários para o protocolo de sequenciação particular. Numa forma de realização preferida, o conjunto compreende um painel de iniciadores de sequenciação, cujas sequências correspondem a sequências adjacentes às seguintes posições polimórficas: ACE 2193 A/G, AGR 1072 G/G, ATI 1167 A/A; assim como meios para a detecção da presença de cada sequência polimórfica. Métodos de diagnóstico e kits baseados em Anticorpos: A invenção proporciona, igualmente, métodos baseados em anticorpos para a detecção de padrões polimórficos numa amostra biológica. Os métodos compreendem os passos de : (i) fazer contactar uma amostra com uma ou mais preparações de anticorpo, 34 em que cada uma das preparações de anticorpo é específica para uma forma polimórfica particular da ACE, AGT ou ATI, sob condições nas quais se pode formar um complexo antigénio-anticorpo estável, entre o anticorpo e os componentes antigénicos na amostra; e (ii) a detecção de qualquer complexo antigénio-anticorpo, formado no passo (i) , utilizando qualquer meio adequado conhecido na técnica, em que a detecção de um complexo, indica a presença na amostra da forma polimórfica particular.

Tipicamente, os imunoensaios utilizam um anticorpo marcado ou um componente antigénico marcado (e. g., que compete com o antigénio na amostra para a ligação ao anticorpo). As marcações adequadas incluem, sem limitação, moléculas baseadas em enzimas, fluorescentes, quimioluminescentes, radioactivas ou coradas,. São, igualmente, conhecidos ensaios que amplificam os sinais da sonda, tais como, por exemplo, os que utilizam biotina e avidina e imunoensaios marcados com enzima, tais como, ensaios ELISA. A presente invenção proporciona, igualmente, kits adequados para aplicações em diagnóstico baseados em anticorpos. Os kits de diagnóstico incluem, tipicamente, um ou mais dos seguintes componentes: (i) Anticorpos específicos para polimorfismos: os anticorpos podem ser pré-marcados; alternativamente, o anticorpo pode não estar marcado e os ingredientes para a marcação podem ser incluídos no kit, em contentores separados ou ser proporcionado um anticorpo secundário, marcado; e 35 (ii) Componentes da reacção: o conjunto pode, igualmente, conter outros reagentes e materiais adequadamente embalados, necessários para o protocolo do imunoensaio particular, incluindo matrizes de fase sólida, se aplicável, e padrões.

Os kits referidos acima podem incluir instruções para realizar o teste. Para além disso, em formas de realização preferidas, os kits de diagnóstico são adaptáveis a operação de elevada capacidade de processamento e/ou automatizada.

Alvos dos Fármacos e Métodos de Rastreio

De acordo com a presente invenção, as sequências nucleotidicas derivadas de genes codificando a ACE, AGT e ATI e sequências peptídicas derivadas de polipéptidos da ACE, AGT e ATI, em particular os que contêm uma ou mais sequências polimórficas, compreendem alvos úteis para identificar fármacos cardiovasculares, i. e., compostos que são eficazes no tratamento de um ou mais sintomas clínicos da doença cardiovascular.

Os alvos dos fármacos incluem, sem limitação, (i) ácidos nucleicos isolados a partir de derivados dos genes codificando a ACE, AGT e ATI e (ii) péptidos isolados e polipéptidos derivados de polipéptidos da ACE, do AGT edo ATI, compreendendo, cada um, uma ou mais posições polimórficas. 36 Métodos de rastreio in vitro:

Numa série de formas de realização, um ácido nucleico isolado compreendendo uma ou mais posições polimórficas é testado in vitro para a sua capacidade de ligação a compostos de teste numa forma especifica para uma sequência. Os métodos compreendem: (i) proporcionar um primeiro ácido nucleico contendo uma sequência particular numa posição polimórfica e um segundo ácido nucleico, cuja sequência é idêntica à do primeiro, excepto numa sequência diferente, na mesma posição polimórfica; (ii) fazer contactar os ácidos nucleicos com uma multiplicidade de compostos de teste, sob condições adequadas à ligação; e (iii) identificar os compostos que se ligam selectivamente à primeira ou a segunda sequência de ácido nucleico.

Ligação selectiva, como aqui utilizado, refere-se a qualquer diferença mensurável em qualquer parâmetro de ligação, tal como, e. g., afinidade de ligação, capacidade de ligação, etc.

Numa outra série de formas de realização, um péptido isolado ou polipéptido, compreendendo uma ou mais posições polimórficas, é testado in vitro para a sua capacidade de ligação a compostos de teste, de uma forma especifica para uma sequência. Os métodos de rastreio envolvem: 37 i) proporcionar um primeiro péptido ou polipéptido contendo uma sequência particular numa posição polimórfica e um segundo péptido ou polipéptido, cuja sequência é idêntica ao primeiro, excepto numa sequência diferente, na mesma posição polimórfica; (ii) fazer contactar os polipéptidos com uma multiplicidade de compostos de teste, sob condições adequadas para a ligação; e (iii) identificar os compostos que se ligam selectivamente a uma das sequências de ácido nucleico.

Em formas de realização preferidas, são utilizados protocolos de rastreio com elevada capacidade de processamento para inspeccionar um grande número de compostos de teste, para a sua capacidade de ligação aos genes ou péptidos divulgados acima, de uma forma especifica para uma sequência.

Os compostos de teste são submetidos a rastreio a partir de grandes bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Actualmente, são utilizados numerosos meios na síntese aleatória e dirigida de compostos baseados em sacáridos, péptidos e ácidos nucleicos. Encontram-se comercialmente disponíveis bibliotecas de compostos sintéticos, de Maybridge Chemical Co (Trevillet, Cornwall, RU), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) e Microsource (New Milford, CT) . Encontra-se disponível de Aldrich (Milwaukee, WI), uma biblioteca de compostos químicos raros. Alternativamente, encontram-se disponíveis bibliotecas de compostos naturais, sob a forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais de, e. g., Pan Laboratories (Bothell, WA) ou MycoSearch (NC) ou são 38 facilmente produzíveis. Adicionalmente, as bibliotecas e os compostos, naturais e produzidos sinteticamente, são facilmente modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais. Métodos de rastreio in vivo:

As células intactas ou os animais completos que expressam as variantes polimórficas dos genes codificando a ACE, AGT, e/ou ATI podem ser utilizados nos métodos de rastreio para identificar candidatos a fármacos cardiovasculares.

Numa série de formas de realização, é estabelecida uma linha celular permanente a partir de um indivíduo apresentando um padrão polimórfico particular. Alternativamente, as células (incluindo, sem limitação, células de mamífero, insecto, levedura ou bacterianas) são programadas para expressar um gene compreendendo uma ou mais sequências polimórficas, pela introdução de ADN adequado. A identificação de compostos candidatos pode ser realizada, utilizando qualquer ensaio adequado, incluindo, sem limitação, (i) ensaios que medem a ligação selectiva, de compostos de teste, a variantes polimórficas particulares da ACE, AGT ou ATI; (ii) ensaios que medem a capacidade de um composto de teste modificar (í. e., inibir ou intensificar) uma actividade ou função mensurável da ACE, AGT ou ATI; e (iii) ensaios que medem a capacidade de um composto para modificar (i. e., inibir ou intensificar) a actividade de transcrição de sequências derivadas de regiões do promotor (í. e., reguladoras) dos genes da ACE, AGT ou ATI. 39

Numa outra série de formas de realização, são criados animais transgénicos, nos quais (i) um ou mais genes da ACE, AGT ou ATI humanos, tendo sequências diferentes em posições polimórficas particulares são inseridos, de forma estável, no genoma do animal transgénico; e/ou (ii) os genes da ACE, AGT, e/ou ATI endógeno são inactivados e substituídos por genes da ACE, AGT, e/ou ATI humanos, tendo sequências diferentes em posições polimórficas particulares. Ver, e. g., Coffman, Semin. Nephrol. 17:404, 1997; Esther et ai., Lab. Invest. 74:953, 1996; Murakami et ai., Blood Press. Suppl. 2:36, 1996. Esses animais podem ser tratados com compostos candidatos e serem monitorizados para um ou mais marcadores clínicos do estado cardiovascular. O seguinte pretende ser exemplos não limitativos da invenção.

Exemplo 1: Métodos para Identificação de Posições

Polimórficas em Genes Humanos Codificando a ACE, AGT e ATI

Os estudos seguintes foram realizados para identificar resíduos polimórficos dentro dos genes codificando a ACE, AGT e ATI humanos.

Foram obtidas amostras de ADN a partir de 277 indivíduos. Os indivíduos eram Caucasianos do sexo masculino nascidos em Uppsala, Suécia, entre 1920 e 1924. Os indivíduos foram seleccionados para a população de teste, com base no seu historial médico, i. e., estes eram quer, (i) saudáveis, sem qualquer sintoma de doença cardiovascular (100); ou (ii) sofreram um enfarte agudo do miocárdio (68), enfarte silencioso 40 do miocárdio (34), acidente vascular cerebral (18), acidente vascular cerebral e enfarte agudo do miocárdio (19) ou pressão sanguínea elevada aos 50 anos de idade (39) . As amostras de ADN foram obtidas a partir de cada indivíduo. A análise das sequências de ADN foi realizada por : (i) amplificação dos fragmentos curtos de cada um dos genes da ACE, AGT e ATI, utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) e (ii) sequenciação dos fragmentos amplificados. As sequências obtidas a partir de cada indivíduo foram, seguidamente, comparadas com as sequências genómicas conhecidas da ACE, AGT e ATI (ver Tabela 1) . (i) Amplificação: as reacções de PCR utilizaram os iniciadores apresentados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2

Nome Sequência Modificação *) Nucleótidos Numeração de acordo com * *) ACE/79RB 5'-TGCGTGCTTCAGAAGTCC-3' B 158-175 i + 2 0: 1-175 ACE/82RB 5'-CCAGGG AGGTG AAG AAATC-3' B 35-53 e20, SEQ ID N°. 7 ACE/84FT 5'-AGCC AGGCAGTAATG ACCT-3' T 1-19 i-19: 1-218 ACE/94FB 5'-GCCCACTGTTCCCTTATG-3' B 1-1&- i-21: 1-76 ACE/95RB 5"-TGCCCTGACTGACAGAGC-3' B 105-122 i+23: 1-122 ACE/96RT 5'-GCCCTGGTGTGCCTGT-3' T 1-16 i-22: 1-65 ACE/107F 5'-TGCCTGGATATGTGTTGC-3' - 1-18 i-15: 1-225 ACE/107FB 5'-TGCCTGGATATGTGTTGC-3' B 1-18 i-15: 1-225 ACE/108RB 5'-GCCCTCGCCTCTCACT-3' B 23-38 i-h 16: 1-38 ACE/111RT 5'-TCCCCTCTCCCTGTACCT-3' T 17-34 i + 15: 1-34 ACE/114RB 5'-GTGCTGGGGTAGGGTAGA-3' B 101-118 i + 7: 1-118 ACE/118FT 5'-TCCCCCTGACCTGGCT-3' T 221-236 i-7: 1-253 ACE/119FB 5'-GGGGCACCGTGATGTT-3' B 1-16 i-4: 1-120 ACE/119FT 5'-GGGGCACCGTGATGTT-3' T 1-16 i-4: 1-120 ACE/120RB 5'-GCCAGAGCCTTTGGTTT-3' B 230-246 i + 5: 1-246 ACE/122FB 5'-TGGAAGAGCCGACTTACAG-3' B 1-19 i-5: 1-78 ACE/123RB 5'-TCCCAGAGGCAAAGAGG-3' B 225-241 i+4: 1-241 41 (continuação)

Nome Sequência Modificação *) Nucleótidos Numeração de acordo com * *) ACE/130F 5'-GTTTCTACTGCGGCTTCAT-3' - 1-19 i-8:1-131 ACE/130FB 5'-GTTTCTACTGCGGCTTCAT-3' B 1-19 i-8: 1-131 ACE/134RB 5'-TCCTGGAAGAGGGAGTTTC-3' B 148-166 i + 9: 1-166 ACE/145F 5'-GCAGGAT GAGAGCAACAAC-3' - 1-18 i-7:1-253 ACE/146F 5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3' - 1-24 ’ i-17: 1-454 ACE/147R 5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3' - 1-25 el7, SEQ ID N°. 7 ACE/170RT 5'-CTTCCGTGGGACTCATGT-3' T 23-40 i + 5: 1-246 ACE/171RT 5'-TGCACCGTGAGGCTCTA-3' T 136-152 i + 8: 1-152 ACE/173F 5'-GCCGAATAGGAGGAAGCA-3' MT 1-10, 1-9 i-2: 1-10, e2 ACE/174R 5' -CCCACCCCATCTCCAAGAA-3' - 166-184 i-2:1-184 ACE/175FB 5'-GCC-3' MT, B 1-3 i-2: 1-10 ACE/176RT 5'-TCCCTGATGGGCTGCTCTC-3' T 65-83 i-2:1-184 ACE/177FT 5'-CAAGGCCCTCAACCAACTC-3' T 1-19 i-24:1-50 ACE/178RB 5'-TTCCCACAAAAGCTCCAGTG-3' B 71-90 i + 24: 1-108 ACE/179R 5'-GGCTCAAAATGGCAAGTGTT-3' - 89-108 i + 24: 1-108 ACE/180FT 5'-GGGCC ATGTCCTTCTG ACTC-3' T 1-20 i-25: 1-45 ACE/181RB 5'-CAGCCTGGAGGGGTTAAGA-3' B 33-51 i+25: 1-51 ACE/182R 5'-CCCTTCTGAGCGAGCTGAGT-3' 1-6,1-14 i —26: 1-6, e2 6, SEQ ID N ° . 7 ACE/183F 5'-GGCCATGTTGAGCTACTTCAA-3' - 83-103 e25, SEQ ID N°. 7 ACE/184FB 5'-CCTCCAGCCTTGGGTCTTAA-3' B 19-38 i + 25: 1-38 ACE/185RT 5'-TTCCCATCCCAGTCTCTGGT-3' T 269-288 e26, SEQ ID N°. 7 ACE/188RT 5'-GGCAGCCTGGTTGATGAGT-3' T 116-134 el7, SEQ ID N°. 7 ACE/192FB 5'-ATTCCAGCTCTGAAATTCTCTGA-3' B 1-23 i-17:1-85 ACP/3FT 5'-GAGCCCCTCCAGCACCTC-3' T 499-5017 SEQ ID N°. 6 ACP/4RB 5*-ACCCGAGCCTGCCCACC-3' B 5302-5318 SEQ ID N°. 6 ACP/5FT 5'-GGTCGGGCTGGGAAGATC-3' T 5232-5249 SEQ ID N°. 6 ACP/6RB 5'-TCGGCTCTGCCCCTTCTC-3' B 557 6-5593 SEQ ID N°, 6 + sequência adicional a jusante jj ACP/7FT 5'-GCCCTTTCTCCAGCTTCCTCT-3' T 5361-5381 SEQ ID N°. 6 ACP/8RB 5'-CGGCGGCAGCAGCAACA-3' B 5666-5682 SEQ ID N°, 6 + sequência adicional a jusante ACP/11FB 5'-GAGCCCCTCCAGCACCTC-3' B 499-5017 SEQ IDNo. 6 ACP/12RT 5'-ACCCGAGCCTGCCCACC-3' T 5302-5318 SEQ ID N°. 6 ACP/13FB 5'-GGTCGGGCTGGGAAGATC-3' B 5232-5249 SEQ ID N°. 6 ACP/14RT 5'-TCGGCTCTGCCCCTTCTC-3' T 557 6-5593 SEQ ID N°, 6 + sequência adicional a jusante ACP/15FB 5'-GCCCTTTCTCCAGCTTCCTCT-3' B 5361-5381 SEQ ID N°. 6 ACP/16RT 5'-CGGCGGCAGCAGCAAC A-3' T 5666-5682 SEQ ID N°, 6 + sequência adicional 42 (continuação)

Nome Sequência Modificação *) Nucleótidos Numeração com * *) de acordo a jusante ANG/1FT 5' -ATGGCACTTAAAGGTCAGTTAAT-3' T 336-358 SEQ ID N ° . 2 ANG/2RB 5' -TACGGAAGCCCAAGAAGTT-3' B 726-745 SEQ ID N ° . 2 ANG/5FT 5' -CTCCCC AACGGCTGTCTT-3' T 797-814 SEQ ID N ° . 2 ANG/6RB 5' -AGCAGCAACAT CCAGTTCTGT - 3 ' B 1119-1139 SEQ ID N ° . 2 ANG/7FT 5' -TCCCACGCTCTCTGGACTT-3' T 1099-1117 SEQ ID N ° . 2 ANG/8RB 5' - CT GAT CT CAGC TACACAT GGATACTA-3 ' B 1290-1315 SEQ ID N ° . 2 ANG/15FT 5* -CCTGTCTTGGGTGACTCTTC-3' T 7-26 SEQ ID N ° . 3 ANG/17FB 5' -TTCTGGGCTAAATGGTGACA-3' B 285-304 SEQ ID N ° . 2 ANG/18RT 5' -CTTGTCTTCGGTGTC AAGTTT-3' T 675-695 SEQ ID N ° . 2 ANG/19FB 5' -GGGAGCCTTGGACCACAC-3' B 839-856 SEQ ID N ° . 2 ANG/20RT 5' -AGCCTGC ATG AACGTGTCAA-3' T 1147-1167 SEQ ID N ° . 2 ANG/21FB 5' -TGGTGGGCGTGTTCACA-3' B 1018-1034 SEQ ID N ° . 2 ANG/22RT 5' -GCCAGAGCCAGCAGAGA-3' T 1264-1280 SEQ ID N ° . 2 ANG/29RB 5' -CCACATTCCAGGGGAGAC-3' B 335-352 SEQ ID N ° . 3 ANG/30FB 5' -CCTGTCTTGGGTGACTCTTC-3' B 7-26 SEQ ID N ° . 3 ANG/32RT 5' -CCACATTCCAGGGGAGAC-3' T 334-352 SEQ ID N ° . 3 ANP/1FT 5' -GTCCCTTCAGTGCCCTAATAC-3' T 314-334 SEQ ID N ° . 1 ANP/2RB 5' -AC AGCCAGATTG AAAGAC AC A-3' B 593-613 SEQ ID N ° . 1 ANP/3FT 5' -AACCCTTTTACTGGTC ATGTG A-3' T 492-513 SEQ ID N ° . 1 ANP/4RB 5' -CGCTCATGGGATGTGTGAC-3' B 747-765 SEQ ID N ° . 1 ANP/5FT 5' -TGTTTTCCCCAGTGTCTATTAGA-3' T 686-708 SEQ ID N ° . 1 ANP/6RB 5' - GCAGGGT CGAGT TACACAT T T - 3' B 982-1003 SEQ ID N ° . 1 ANP/7FT 5' -CCTCAGGCTGTCACACACCTA-3' T 909-929 SEQ ID N ° . 1 ANP/8RB 5' -CGGCTTACCTTCTGCTGTAGT-3' B 1246-1266 SEQ ID N ° . 1 ANP/9FB 5' -CTCCTTGAACCTGCTTGTGTT-3' B 273-293 SEQ ID N ° . 1 ANP/10RT 5' -GCATTGAAAGATGTGCTGTTCT-3' T 548-569 SEQ ID N ° . 1 ANP/11FB 5' -TAACGACTACAAAAGCAAGTCTTAC-3' B 446-469 SEQ ID N ° . 1 ANP/12RT 5' -AGAGGGCAGGGGAGAGTCT-3' T 805-823 SEQ ID N ° . 1 ANP/13FB 5' - GGCAGCAGGGT CAGAAGT - 3' B 766-783 SEQ ID N ° . 1 ANP/14RT 5' -GCT GGAGAGGAGGGT TACAT-3' T 1127-1146 SEQ ID N ° . 1 ANP/15FB 5' -TGCAAACTTCGGTAAATGTGT-3' B 970-990 SEQ ID N ° . 1 ANP/16RT 5' -CAGAACAACGGCAGCTTCT-3' T 1224-1242 SEQ ID N ° . 1 AT1/5FT 5' -ACTGGCTGACTTATGCTTTTTACT-3' T 547-570 SEQ ID N ° . 11 AT1/6RB 5' -GGGTT GAAT T T T GGCACT CATA-3 ' B 884-905 SEQ ID N ° . 11 AT1/7FT 5' -GCCAGTTTGCCAGCTATAAT-3' T 809-828 SEQ ID N ° . 11 AT1/8RB 5' -T GAT GCCTAGTTGAAT CAATACA-3' B 1123-1145 SEQ ID N ° . 11 AT1/9FT 5' - GAAGGCT TAT GAAAT T CAGAAGA-3 ' T 1003-1025 SEQ ID N ° . 11 AT1/1ORB 5' - AAAGT CGGT T C AGT CCACAT AA-3 ' B 1535-1556 SEQ ID N ° . 11 AT1/16FB 5' -AAACAGCTTGGTGGTGATAGTC-3' B 469-490 SEQ ID N ° . 11 AT 1/17 RT 5' -GCAGGTGACTTTGGCTACAA-3' T 762-781 SEQ ID N ° . 11 AT1/18 FB 5' -CCTGTACGCTAGTGTGTTTCT ACT-3' B 667-690 SEQ ID N ° . 11 AT1/19RT 5' -AGGAAACAGGAAACCCAGTATAT - 3' T 932-955 SEQ ID N ° . 11 43 (continuação)

Nome Sequência Modificação *) Nucleótidos Numeração de acordo com * *) AT1/22FB 5'-CTGGATTCCCCACCAAATAT-3' B 1090-1109 SEQ ID N°. 11 AT1/23RT 5'-TGCTCCTTCTTTCACAAAATTAC-3' T 1438-1460 SEQ ID N°. 11 ATP/1FT 5'-CTTCCGTTATTATGTGTGATATTAGT-3' T 1244-1269 SEQ ID B0. 9 ATP/2RB 5'-GCATGTACCTAAAAAGTCCTGTC-3' B 1566-1588 SEQ ID B0. 9 ATP/5FT 5' -ATTGGCATATCCATCACCTTAA- 3' T 1628-1649 SEQ ID r. 9 ATP/6RB 5'-GATCTCCCAACTCATGCTATGA-3' B 1961-1982 SEQ ID B0. 9 ATP/7FT 5'-ATTGGATTCAATTTGCCTACAT-3' T 1846-1867 SEQ ID B0. 9 ATP/8RB 5'-TTTGGTAATACAGTTGTGGATCATA-3' B 2159-2184 SEQ ID B0. 9 ATP/9FT 5'-TGCAACTTGGGTAGCATGTC-3' T 2077-2096 SEQ ID B0. 9 ATP/10RB 5'-AGTCGTCCCGTGTCAACTATC-3' B 2370-2390 SEQ ID B0. 9 ATP/11FB 5'-CGTTGTCTTCCGTTATTATGTGT-3' B 1238-1260 SEQ ID B0. 9 ATP/12RT 5'-TTATTGCATGTACCTAAAAAGTGTA-3' T 1455-1479 SEQ ID B0. 9 ATP/15FB 5'-GCAT T CATATAAAGAT CAAAT CAGT-3' B 1600-1624 SEQ ID B0. 9 ATP/16RT 5'-CACCCTGATAACAAAACCAGATA-3' T 1929-1951 SEQ ID B0. 9 ATP/17FB 5'-CTTTCTGGC ATC AACCTCACT-3' B 1794-1814 SEQ ID B0. 9 ATP/18RT 5'-ACTTTTAAGGACGAATTAGAGAACT-3' T 2214-2238 SEQ ID B0. 9 ATP/19FB 5'-GTCCACCCTTGAATTTCATAAC-3' B 2115-2136 SEQ ID B0. 9 ATP/20RT 5'-CCCAACCTCCTCCCTCTC-3' T 2396-2413 SEQ ID B0. 9 ATP/21FT 5'-GCTCGCTCTCCCTCACGAC-3' T 2310-2328 SEQ ID B0. 9 ATP/22RB 5'-TCCAGCCGCTCCCCATC-3' B 2657-2673 SEQ ID N". 9 ATP/23FB 5'-GCTCGCTCTCCCTCACGAC-3' B 2310-2328 SEQ ID N°. 9 ATP/24RT 5'-TCCAGCCGCTCCCCATC-3' T 2657-2673 SEQ ID N°. 9 ATR/1F 5'-GCCCCTCAGATAATGTAAGCTC-3' - 1353-1374 SEQ ID N°. 11 ATR/2R 5'-AACCGGCACGAAAACTTTACT-3' - 1834-1854 SEQ ID N°. 11 ATR/3aF 5'-GCACTTCACTACCAAATGAGCA-3' - 1476-1500 SEQ ID N°. 11 ATR/4cF 5'-GCACTTCACTACCAAATGAGCC-3' - 1476-1500 SEQ ID N°. 11

Quando indicado, os iniciadores foram modificados de uma das seguintes formas: (i) uma molécula de biotina foi conjugada com o terminal 5' da sequência indicada (B) ; (ii) uma sequência de nucleótidos derivada de M13, 5'-CAGGAAACAGCTATGACT-3', foi adicionada ao terminal 5' da sequência indicada (MT); ou (iii) a sequência 5'-AGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' foi adicionada no terminal 5' da sequência indicada (T = Cauda). Os nucleótidos foram numerados de acordo com os N°s de ID de SEQ listados na Tabela 1, onde indicado. Quando as sequências envolvidas não se encontravam publicamente disponíveis, a numeração foi como nos 44 exemplos seguintes: a designação "i-4: 1-200" indica gue a seguência do iniciador está localizada dentro da seguência que se estende 200 pb a montante e incluindo o nucleótido imediatamente a montante do primeiro nucleótido codificante do exao 4. De um modo semelhante, a designação "i+4: 1-200" indica que a sequência de iniciador está localizada dentro da sequência que se estende do nucleótido que está localizado imediatamente a jusante do último nucleótido codificante do exão 4, 200 pb a jusante. Em cada caso, a localização especifica da sequência do iniciador é indicada na Tabela 2 na coluna designada "Nucleótidos". Os componentes de reacção utilizados na PCR são descritos na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3

Condição Componentes Volume A Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dTTP = 1:1:1:1), (Pharmacia Biotech) 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, 3 pL Polimerase de ADN AmpliTaq®(Perkin Elmer) (5U/mL) 0,15 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN 1 pL Água purificada por O/R q.s. Tot.50 pL B Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dITP:dTTP = 2:2:1:1:2), (Pharmacia Biotech) 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 3 pL Polimerase de ADN AmpliTaq® (5U/mL) 0,15 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL 45 (continuação)

Condição Componentes Volume Solução de ADN 1 pL Água purificada por 0/R q.s. Tot.50 pL C Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dITP:dTTP = 4:4:1:3:4), (Pharmacia Biotech) 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 3 pL Polimerase de ADN AmpliTaq® (5U/mL) 0,15 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN 1 pL Água purificada por 0/R q.s. Tot 50 pL D Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dITP:dTTP = 6:6:1:5:6), (Pharmacia Biotech) 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 3 pL Polimerase de ADN AmpliTaq® (5U/mL) 0,15 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN 1 pL Água purificada por 0/R q.s. Tot.50 pL E Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dITP:dTTP = 4:4:1:3:4), (Pharmacia Biotech) 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 2,5 pL DMSO 2,5 pL Polimerase de ADN AmpliTaqGold® (5U/mL) 0,5 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN 1 pL • Água purificada por 0/R q.s. Tot 50 pL F Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dTTP = 4 pL 46 (continuação)

Condição Componentes Volume 1:1:1:1) (Pharmacia Biotech Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 2 pL Polimerase de ADN AmpliTaq® (5U/mL) 0,5 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN 1 pL Água purificada por 0/R q.s. Tot 50 pL G Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dTTP = 1:1:1:1) (Pharmacia Biotech 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 2 pL Polimerase de ADN AmpliTaq® (5U/mL) 0,5 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN I pL Água purificada por 0/R q.s. Tot.50 pL H Ultrapure dNTP Set 2,5 mM (dATP:dCTP:dGTP:dITP:dTTP = 4:4:1:3:4), (Pharmacia Biotech) 4 pL Tampão II para PCR lOx, (Perkin Elmer) 5 pL Solução de MgCl2 2,5 mM, (Perkin Elmer) 4 pL Polimerase de ADN AmpliTaqGold® (5U/mL) 0,5 pL Iniciador 1 1 pL Iniciador 2 1 pL Solução de ADN 1 pL Água purificada por 0/R q.s. Tot.50 pL

As condições de reacção utilizadas para PCR são descritas na Tabela 4 abaixo. 47

Tabela 4 (continuação) Método de PCR Temperatura*) Tempo*) Temperatura**) Tempo Temperatura Tempo N° de ciclos***) 25 94 15 s 55 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 27 94 15 s 55 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 36 94 2 min 1 94 15 s 58 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 38 94 2 min 1 94 15 s 60 30 s 72 45 s 15 72 5 min 1 22 OO 40 94 2 min 1 94 15 s 60 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 54 96 5 min 1 96 30 s 61 30 s 72 45 s 15 72 5 min 1 22 OO 56 96 5 min 1 96 30 s 61 30 s 72 45 s 35 72 5 min 1 22 OO 64 95 2 min 95 15 s 59 30 s 72 45 s 40 48 (continuação) Método de PCR Temperatura*) Tempo*) Temperatura**) Tempo Temperatura Tempo N° de ciclos***) 72 5 min 1 22 OC 70 95 5 min 95 15 s 59 30 s 72 45 s 50 72 5 min 1 22 OC Todas as temperaturas são fornecidas em graus Celsius. *) indica as temperaturas iniciais ( °C) por defeito, e os tempos do programa. **) indica a temperatura ( °C) do programa por defeito. ***) indica o número de ciclos do programa por defeito, referindo-se à secção do programa da PCR em que são utilizadas três temperaturas diferentes.

Tabela 5 (continuação)

Fragmento Iniciador 1 Iniciador 2 Método de PCR Modificações do método de PCR Condições da reacção de PCR ANPflF ANP/1FT ANP/2RB 64 A ANPf 2F ANP/3FT ANP/4RB 64 B ANPf3F ANP/5FT ANP/6RB 64 temp empar.: 48 °C A ANPf4F ANP/7FT ANP/8RB 64 temp empar.: 59 °C D ANPf5R ANP/9FB ANP/10RT 64 A ANPf6R ANP/11FB ANP/12RT 64 B ANPf7R ANP/13FB ANP/14RT 64 A ANPf8R ANP/15FB ANP/16RT 64 C

Quaisquer diferenças são Tabela 5, abaixo. Os fragmentos amplificados no que respeita aos iniciadores utilizadas na amplificação.

indicadas em "Modificações" na são descritos na Tabela 5 abaixo e às condições de reacção de PCR 49 (continuação)

Fragmento Iniciador 1 Iniciador 2 Método de PCR Modificações do método de PCR Condições da reacção de PCR ANGe2flF ANG/1FT ANG/2RB 64 C ANGe2 f3F ANG/5FT ANG/6RB 64 c ANGe2f4F ANG/7FT ANG/8RB 64 A ANGe2 f5R ANG/17FB ANG/18RT 64 A ANGe2 f7R ANG/19FB ANG/20RT 64 A ANGe2 f8R ANG/21FB ANG/22RT 64 A ANGe3F ANG/15FT ANG/29RB 64 temp empar.: 57 °C F ANGe3R ANG/30FB ANG/32RT 64 temp empar.: 57 °C, 45 ciclos A ACPf2F ACP/3FT ACP/4RB 70 temp empar.: 62 °C E ACPf3F ACP/5FT ACP/6RB 70 temp empar.: 58 °C E ACPf 4F ACP/7FT ACP/8RB 70 E ACPf6R ACP/11FB ACP/12RT 70 temp empar.: 62 °C E ACPf 7R ACP/13FB ACP/14RT 70 temp empar.: 58 °C E ACPf8R ACP/15FB ACP/16RT 70 E ACEe2R PCR1 ACE/173F ACE/174R 38 A ACEe2R PCR2 ACE/175FB ACE/176RT 40 A ACEe4F PCR1 ACE/119FB ACE/120RB 27 A ACEe4F PCR2 ACE/119FT ACE/123RB 25 A ACEe5R PCR1 ACE/119FB ACE/120RB 27 A ACEe5R PCR2 ACE/122FB ACE/170RT 25 A ACEe7F PCR1 ACE/145F ACE/114RB 27 A ACEe7F PCR2 ACE/118FT ACE/114RB 25 A ACEe8R PCR1 ACE/130F ACE/134RB 27 A ACEe8R PCR2 ACE/130FB ACE/171RT 25 A ACEelõR PCR1 ACE/107F ACE/108RB 27 A ACEel5R PCR2 ACE/107FB ACE/111RT 25 A ACEel7R ACE/192FB ACE/188RT 40 temp empar.: 63 °C, 40 ciclos A ACEel9F PCR1 ACE/84FT ACE/79RB 27 A ACEel9F PCR2 ACE/84FT ACE/82RB 25 A ACEe21R PCR1 ACE/94FB ACE/95RB 27 A ACEe21R PCR2 ACE/94FB ACE/96RT 25 A ACEe24R PCR1 ACE/177FT ACE/179R 38 A ACEe24F PCR2 ACE/177FT ACE/178RB 40 A ACEe25F PCR1 ACE/180FT ACE/182R 38 A ACEe25F PCR2 ACE/180FT ACE/181RB 40 A 50 (continuação)

Fragmento Iniciador 1 Iniciador 2 Método de PCR Modificações do método de PCR Condições da reacção de PCR ACEe26R PCR1 ACE/183F ACE/185RT 54 A ACEe26R PCR2 ACE/184FB ACE/185RT 56 A ACEDI ACE/146F ACE/147R 36 A ATPflF ATP/1FT ATP/2RB 64 A ATPf3F ATP/5FT ATP/6RB 64 temp empar.: 58 °C A ATPf4F ATP/7FT ATP/8RB 64 temp empar.: 48 °C A ATPf5F ATP/9FT ATP/10RB 64 temp empar.: 58 °C A ATPf6R ATP/11FB ATP/12RT 64 temp empar.: 48 °C A ATPf8R ATP/15FB ATP/16RT 64 temp empar.: 55 °C G ATPf9R ATP/17FB ATP/18RT 64 temp empar.: 54 °C A ATPflOR ATP/19FB ATP/20RT 64 A ATPfllF ATP/21FT ATP/22RB 64 desnaturação inicial: 95 °C, 12 min. H ATPf12R ATP/23FB ATP/24RT 64 desnaturação inicial: 95 °C, 12 min. H ATle5f2F AT1/5FT AT1/6RB 64 A ATleõf3F AT1/7FT AT1/8RB 64 A ATle5f4F AT1/9FT AT1/10RB 64 C ATle5f6R AT1/16FB AT1/17RT 64 A ATle5f7R AT1/18FB AT1/19RT 64 C ATleõf9R AT1/22FB AT1/23RT 64 A ATl-spec. 1 ATR/1F ATR/3aF ATR/2R 40 temp empar.: 63 °C A ATl-spec. 2 ATR/1F ATR/2R ATR/4cF 40 temp empar.: 63 °C A

Todos os produtos de PCR (excepto os fragmentos ACEDI, ATl-spec. 1 e ATl-spec. 2) foram submetidos a sequenciação em fase sólida, de acordo com o protocolo comercialmente disponível de Pharmacia Biotech. As reacções de sequenciação são realizadas com um iniciador de sequenciação tendo uma sequência complementar à sequência "Cauda" anteriormente descrita na Tabela 2. A sequência nucleotídica do iniciador de sequenciação 51 foi 5'-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' e o iniciador foi marcado com fluorescência com uma molécula Cy-5- no nucleótido 5'. As posições contendo uma variação genética foram identificadas por determinação da sequência nucleotídica, utilizando o sistema ALFexpress™ comercialmente disponível de Pharmacia Biotech. A detecção do fragmento ACEDI foi realizada por análise dos tamanhos dos fragmentos amplificados, por electroforese em gel, em que a presença de um produto de PCR mais curto (192 pares de bases) indicou o alelo D e um produto PCR mais longo (479 pares de bases) indicou o alelo I. A presença de ambas as bandas

indicou um heterozigótico para os dois alelos. A detecção da reacção específica para um alelo da posição AT1-1271 foi realizada pela realização separada de duas reacções de PCR paralelas sobre a mesma amostra e pela comparação dos tamanhos dos fragmentos amplificados. Deve estar sempre presente um produto de PCR com 501 pares de bases, como um controlo, em ambas as separações paralelas, enquanto que a presença de um produto de PCR com 37 8 pares de bases na reacção designada como ATl-spec. 1, indicou a presença de um A nesta posição. A presença de um produto de PCR com 378 pares de bases na reacção designada como ATl-spec. 2, indicou um C nesta posição. Se estava presente, em ambas as reacções, o produto de PCR mais curto, o indivíduo é um heterozigótico para A e C.

Resultados: A análise descrita acima resultou na identificação de posições polimórficas dentro de segmentos reguladores e e codificantes/intrão dos genes humanos codificando a ACE, AGT e ATI. As posições polimórficas, os nucleótidos variantes 52 encontrados em cada uma das posições e o fragmento de PCR no qual o polimorfismo foi identificado são apresentadas na Tabela 6 abaixo. São, igualmente, apresentadas as frequências de cada genótipo numa população de 90 indivíduos, expressas como a percentagem da população de estudo que tem aquele genótipo. São, igualmente, indicados os polimorfismos que resultaram em aminoácidos alternativos na ACE, no AGT ou no ATI. Como aqui utilizado, abaixo, as designações "AGR", "ACR" e "ATR" referem-se, respectivamente, às regiões reguladoras dos genes do AGT, da ACE e do ATI humanos; e as designações "AGT", "ACE" e "ATI", referem-se às regiões codificante dos genes da AGT, ACE e ATI.

Tabela 6 (continuação)

Gene Posição Genótipo descrito Variação Genética Frequência (percentagem) Alteração nos aminoácidos Fragmento Referência (se existente) AGR 395 T TT-TA-AA 88-11-1 Nenhuma ANPflF ANPf5R AGR 412 C CC-CT 99-1 Nenhuma ANPflF ANPf5R Gene Posição Genótipo descrito Variação Genética Frequência (percentagem) Alteração nos aminoácidos Fragmento Referência (se existente) AGR 432 G GG-GA 81-19 Nenhuma ANPflF ANPf5R AGR 449 C TT-TC 92-8 Nenhuma ANPflF ANPf5R AGR 692 C CC-CT 81-19 Nenhuma ANPÍ2F ANPf6R AGR 839 G GG-GA 93-7 Nenhuma ANPf3F ANPf7R AGR 1007 G GG-GA 81-19 Nenhuma ANPÍ4F ANPf7R AGR 1072 G GG-GA 89-11 Nenhuma ANPÍ4F ANPf7R AGR 1204 C CC-CA-AA 67-33 Nenhuma ANPÍ4F “ 53 (continuação)

Gene Posição Genótipo descrito Variação Genética Frequência (percentagem) Alteração nos aminoácidos Fragmento Referência (se existente) ANPf8R AGR 1218 A AA-AG-GG 14-55-31 Nenhuma AN P f 4 F ANPf8R Inuoe, I et. al. J. C. I. (1997) 99: 1786-1789. AGT 273 C CC-CT 99-1 Nenhuma ANGe2f1F ANGe2 f5R AGT 620 C CC-CT 80-20 Thr-Met ANGe2 f3F ANGe2 f7R JeunmaitreX, et al. Cell (1992) 71: 69-180 AGT 803 T TT-TC-CC 35-52-13 Met-Thr ANGe2f4F ANGe2f8R JeunmaitreX, et al. Cell (1992) 71: 69-180 AGT 912 c CC-CT 99-1 Nenhuma ANGe3F ANGe3R AGT 997 G cc 100 Glu-Gin - AGT 1116 G GG-GA-AA 87-12-1 Nenhuma ANGe3F ANGe3R AGT i3 49 Numeração de acordo com a SEQ ID N° 4 A AA-AG 80-20 None ANGe3F ANGe3R AGT 1174 c CC-CA 99-1 Leu-Met ANGe4F ANGe4R Gene Posição Genótipo descrito Variação Genética Frequência (percentagem) Alteração nos aminoácidos Fragmento Referência (se existente) ACR 5106 C CC-CT 98-2 Nenhuma ACPf2F ACPf6R ACR 5349 A AA-AT-TT 35-46-19 Nenhuma ACPDF ACPf7R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACR 5496 T TT-TC-CC 35-46-19 Nenhuma ACPf4F ACPf8R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 54 (continuação)

Gene Posição Genótipo descrito Variação Genética Frequência (percentagem) Alteração nos aminoácidos Fragmento Referência (se existente) 1268-1278 ACE 375 A CC 100 Nenhuma ACEe2R - ACE 582 C CC-CT 94-6 Nenhuma ACEe4F - ACE 731 A AA-AG 96-4 Tyr-Cys ACEe5R - ACE 1060 G GG-GA 97-3 Gly-Arg ACEe7F - ACE 1215 C CC-CT-TT 35-42-23 Nenhuma ACEe8R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACE 2193 G GG-GA-AA 20-57-23 Nenhuma ACEel5R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACE 1451 DD-DI-II 29-54-20 None ACEDI Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACE 2328 A AA-AG-GG 20-57-23 Nenhuma ACEel7R Villard, E. et al. Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1268-1278 ACE 2741 G TT 100 Gly-Val ACEel9F - ACE 3132 C CC-CT 99-1 Nenhuma ACEe2IR - ACE 3387 T TT-TC-CC 20-57-23 Nenhuma ACEe24F - ACE 3503 c GG 100 Ala-Gly ACEe25F - ACE 3906 G GG-GA 91-9 Nenhuma ACEe26R - ATR 1427 A AA-AT-TT 77-22-1 Nenhuma ANPf1F ANPf6R ATR 1756 T TT-TA-AA 75-24-1 Nenhuma ANPf3F ANPf8R ATR 1853 T TT-TG-GG 82-11-1 Nenhuma ANPf3F ANPf8R ATR 2046 T CC-CT-TT 46-46-8 Nenhuma AN P f 4 F ANPf9R 55 (continuação)

Gene Posição Genótipo descrito Variação Genética Frequência (percentagem) Alteração nos aminoácidos Fragmento Referência (se existente) ATR 2354 A AA-AC-CC 73-26-1 Nenhuma AN P f 5 F ANPf10R ATR 2355 G GG-GC-CC 73-26-1 Nenhuma AN P f 5 F ANPf10R ATR 2415 A AA-AG 75-24-1 Nenhuma ANPf11F ANPf12R ATI 449 G GG-GC 99-1 Ser-Thr AT 1e 5 f 2 F ATle5f6R ATI 678 T CC-CT-TT 31-48-21 Nenhuma ATle5f3F ATle5f7R Rolfs A, et. al. Eur. Heart. J. (1994) 15: Suppl. D, 108-112. ATI 1167 A AA-AG 92-8 Nenhuma ATle5f4F ATle5f9R Rolfs A, et. al. Eur. Heart. J. (1994) 15: Suppl. D, 108-112. ATI 1271 A AA-AC-CC 50-40-10 Nenhuma ATl-spec Bonnardeaux, A. et al. Hypertension (1994) 24: 63-69.

Foi, depois analisado um subconjunto destas posições polimórficas, em 187 indivíduos adicionais. A tabela 7 apresenta as posições polimórficas, a sequência nestas posições e as frequências do genótipo para cada posição, numa população de 277, como descrito no Exemplo 1, acima. 56

Tabela 7

Gene Posição Variação genética Frequência (percentagem) AGR 395 TT-TA-AA 87-12-7 AGR 432 GG-GA-AA 78-21-1 AGR 449 TT-TC-CC 94-5-1 AGR 692 CC-CT-TT 78-21-1 AGR 839 GG-GA 96-4 AGR 1007 GG-GA-AA 78-21-1 AGR 1072 GG-GA 76-24 AGR 1204 CC-CA-AA 3-27-70 AGR 1218 AA-AG-GG 16-50-34 AGT 620 CC-CT-TT 75-23-2 AGT 803 TT-TC-CC 34-50-16 AGT 1116 GG-GA-AA 83-15-2 ACR 5349 AA-AT-TT 37-44-19 ACR 5496 TT-TC-CC 38-43-19 ACE 1060 GG-GA 96-4 ACE 1215 CC-CT-TT 34-46-20 ACE 2193 GG-GA-AA 22-53-25 ACE 2328 AA-AG-GG 23-52-25 ACE 3387 TT-TC-CC 24-53-23 ACE 3906 GG-GA-AA 86-13-1 ATR 1427 AA-AT-TT 72-26-2 ATR 1756 TT-TA-AA 72-25-3 ATR 1853 TT-TG-GG 73-25-2 ATR 2046 CC-CT-TT 47-41-12 ATR 2354 AA-AC-CC 72-26-2 ATR 2355 GG-GC-CC 71-27-2 57 (continuação)

Gene Posição Variação genética Frequência (percentagem) ATR 2415 AA-AG-GG 73-25-2 ATI 678 CC-CT-TT 26-51-23 ATI 1167 AA-AG 88-12 ATI 1271 AA-AC-CC 55-36-9

Exemplo 2: Correlação entre os padrões Polimórficos e a Doença Cardiovascular

As posições polimórficas identificadas como no Exemplo 1 foram correlacionadas com os seguintes marcadores do estado cardiovascular, presentes na população de estudo: enfarte do miocárdio (MI); acidente vascular cerebral; e pressão sanguínea elevada. São apresentados abaixo os padrões polimórficos, i. e., combinações de sequências em posições polimórficas particulares, que apresentam uma correlação estatisticamente significativa com um ou mais destes marcadores. ACR 5349 A/T, AGR 1218 A Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 7 3 5 17 % dentro do grupo 3 co LO 8,1 12,8 58 ACR 5496 C, AGR 1204 A/C Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 2 7 3 2 13 % dentro do grupo 2 5, 8 8,1 5,1 ACR 5496 C/T, AGR 1218 A, AGT 620 C/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 4 13 1 3 21 % dentro do grupo 4 10, 8 2,7 7,7 ACE 2193 A, AGR 1204 C, ACE 2328 G Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 0 11 3 3 16 % dentro do grupo 0 9,2 8,1 7,7 59 ACE 2193 A, AGR 1204 A/C Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 1 0 1 3 % dentro do grupo 1 0, 8 0 2, 6 ACE 3387 T, AGR 1218 A Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 2 4 1 3 10 % dentro do grupo 2 3,3 2,7 7,7 ACE 3387 T, AGT 620 C/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 10 3 2 15 % dentro do grupo 1 8,3 8,1 5,1 60 AGR 1204 A/C ATI 678 C/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 5 23 5 6 37 % dentro do grupo 5 19,2 13,5 15,4 AGR 1204 A/C, ATI 1271 A/C Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 17 3 4 26 % dentro do grupo 3 14,2 8,1 10,3 ACE 1215 C, AGR 1204 A/C Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 13 5 6 25 % dentro do grupo 3 10, 8 13,5 15,4 61 AGR 1204 A/C, ATI 1167 A, ACE 3906 A/G Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 0 5 1 0 6 % dentro do grupo 0 4,2 2,7 0 AGR 1204 A, AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGR 395 A/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 4 5 3 11 % dentro do grupo 1 3,3 13,5 7,7 AGR 1204 A/C, AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A, AGR 395 T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 13 3 2 20 % dentro do grupo 3 10, 8 8,1 5,1 62 AGR 1204 A/C, AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A/G, AGR 395 T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 0 2 0 1 3 % dentro do grupo 0 1,7 0 2, 6

Sumário dos três padrões polimórficos anteriores (os quais envolvem as mesmas posições polimórficas):

Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 4 19 8 6 34 % dentro do grupo 4 15, 8 21, 6 15,4 AGR 1204 A, ATI 678 C, ATI 1167 A, AGR 395 A/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 2 2 1 5 % dentro do grupo 1 1,7 5,4 2, 6 63 AGR 1204 A/C, ATI 678 C/T, ATI 1167 A, AGR 395 T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 18 5 4 28 % dentro do grupo 3 15, 0 13,5 10,3

Sumário dos dois padrões polimórficos anteriores:

Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 4 20 7 5 33 % dentro do grupo 4 16, 7 18, 9 12,8 64 AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A, AGR 395 T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 2 8 1 2 13 % dentro do grupo 2 6,7 2,7 5,1 AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A/G, AGR 395 T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 0 2 0 1 3 % dentro do grupo 0 1,7 0 2, 6 AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGR 395 A/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 4 5 3 11 % dentro do grupo 1 3,3 13,5 7,7 65

Sumário dos três padrões polimórficos anteriores:

Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 14 6 6 27 % dentro do grupo 3 11,7 16, 2 15,4 AGT 620 C, ATI 678 A, ATI 1167 A, AGR 395 A/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 2 2 1 5 % dentro do grupo 1 1,7 5,4 2, 6 AGT 620 C/T, ATI 678 C/T; ATI 1167 A, AGR 395 T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 3 15 4 4 24 % dentro do grupo 3 12,5 10,8 10,3 66

Sumário dos dois padrões polimórficos anteriores:

Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 4 17 6 5 29 % dentro do grupo 4 14,2 16, 2 12, 9 ACE 2193 A, AGR 1218 A, AGT 803 A Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 2 5 1 3 11 % dentro do grupo 2 4,2 2,7 7,7 67 ACE 2193 A, AGT 620 C/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 11 3 2 16 % dentro do grupo 1 9,2 8,1 5,1 ACE 2328 G, AGT 620 C/T Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 1 11 3 2 16 % dentro do grupo 1 9,2 8,1 5,1 ACE 3387 T, AGR 1204 A/C Saudável (100) MI (120) Acidente vascular cerebral (37) PS Elevada (39) Total (n) # de eventos 0 10 3 3 15 % dentro do grupo 0 8,3 8,1 7,7 68

Exemplo 3: Correlação Entre vim Padrão Polimófico Especifico e a Resposta ao Tratamento

Foi realizado o seguinte estudo, para definir padrões polimórficos nos genes da ACE, AGT, e/ou ATI humanos que prevejam a eficácia de tratamentos para a doença cardiovascular.

Foram estudados dois grupos de doentes hipertensos, 41 no primeiro grupo e 20 no segundo grupo. Os grupos foram analisados independentemente e em combinação.

Cada um dos doentes desta população foi tratado com um dos seguintes cinco inibidores da ACE: Captopril, Trandolapril, Lisinopril, Fosinopril ou Enalapril. Foi quantificado o efeito dos fármacos sobre a pressão sanguínea arterial média. A pressão sanguínea arterial média foi definida como 2/3 da pressão sanguínea diastólica + 1/3 da pressão sanguínea sistólica. Os indivíduos, foram, igualmente, classificados como "respondentes elevados," i. e., os que apresentam uma redução superior a 16 mm de Hg durante o tratamento com um fármaco inibidor da ACE e "respondentes baixos," i. e., os que não apresentam uma redução superior a 16 mm de Hg.

Um padrão polimórfico particular, ACE 2193 A/G, AGR 1072 G/G, ATI 1167 A/A, o qual se encontrava presente em 51% da primeira população de estudo, discriminou entre respondentes elevados e respondentes baixos. No segundo grupo de 20 doentes, o modelo foi menos prevalecente (25%), mas foi evidente a correlação com a pressão sanguínea abaixada. Os indivíduos que apresentavam este padrão polimórfico (designado "1", abaixo), evidenciaram uma maior redução na pressão sanguínea do que os 69 que não apresentavam este padrão polimórfico (designado "0" abaixo).

Padrão Observações Alteração Média S .D. Polimórfico da P.S. (mm Hg) 0 36 \—1 \—1 1 8,6 1 25 \—1 oo \—1 1 9,7

Para além disso, a distribuição dos respondentes elevados e dos respondentes baixos (como definidos acima) foi como se segue:

Padrão polimórfico % de respondentes baixos % de respondentes elevados 0 80,1 19, 4 1 24,0 76, 0

No seu conjunto, os resultados dos dois grupos indicam que a presença deste padrão polimórfico está em correlação com uma redução incremental de 6,4-7,3 mm de Hg, em relação a indivíduos que não apresentam este padrão polimórfico. A prevalência deste padrão polimórfico foi de 41% nesta população hipertensa. Isto sugere que o teste para este padrão polimórfico em doentes hipertensos, seguido da prescrição de inibidores da ACE, apenas aos doentes que apresentam este padrão polimórfico, possa aumentar a taxa de resposta de 43% (numa população hipertensa em geral), para 76%, na população hipertensa seleccionada, de acordo com os métodos da invenção. 70

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Meadowland Business Partners AB <120> Métodos para Avaliar o Estado cardiovascular e Composições para a Sua Utilização <130> 72254/09 <140> EP 98908252.4 <141> 1998-04-01 <160> 11 <170> Patentln versão 3.0

<210> 1 <211> 1278 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 ccagacaagt gatttttgag gagtccctat ctataggaac aaagtaatta aaaaaatgta 60 tttcagaatt tacaggccca tgtgagatat gattttttta aatgaagatt tagagtaatg 120 ggtaaaaaag aggtatttgt gtgtttgttg attgttcagt cagtgaatgt acagcttctg 180 cctcatatcc aggcaccatc tcttcctgct ctttgttgtt aaatgttcca ttcctgggta 240 atttcatgtc tgccatcgtg gatatgccgt ggctccttga acctgcttgt gttgaagcag 300 gatcttcctt uctgtccctt cagtgcccta ataccatgta tttaaggctg gacacatcac 360 cactcccaac ctgcctcacc cactgcgtca cttgtgatca ctggcttctg gcgactctca 420 ccaaggtctc tgtcatgccc tgttataacg actacaaaag caagtcttac ctataggaaa 480 ataagaatta taaccctttt actggtcatg tgaaacttac catttgcaat ttgtacagca 540 71 taaacacaga acagcacatc tttcaatgcc tgcatcctga aggcattttg tttgtgtctt 600 tcaatctggc tgtgctattg ttggtgttta acagtctccc cagctacact ggaaacttcc 660 agaaggcact tttcacttgc ttgtgtgttt tccccagtgt ctattagagg cctttgcaca 720 gggtaggctc tttggagcag ctgaaggtca cacatcccat gagcgggcag cagggtcaga 780 agtggcccGG gtgttgccta agcaagactc tcccctgccc tctgccctct gcacctccgg 840 cctgcatgtc. cctgtggcct cttgggggta catctcccgg ggctgggtca gaaggcctgg 900 gtggttggcc tcaggctgtc acacacctag ggagatgctc ccgtttctgg gaaccttggc 960 cccgactcct gcaaácttcg gtaaatgtgt aactcgaccc tgcaccggct cactctgttc 1020 agcagtgaaa ctctgcatcg atcactaaga cttcctggaa gaggtcccag cgtgagtgtc 1080 gcttctggca tctgtccttc tggccagcct gtggtctggc caagtgatgt aaccctcctc 1140 tccagcctgt gcacaggcag cctgggaaca gctccatccc cacccctcag ctataaatag 1200 ggcctcgtga cccggccagg ggaagaagct gccgLtgttc tgggtactac agcagaaggt 1260 aagccggggg ccccctca 1278

<210> 2 <211> 1347 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 gtccatctcc tcatctcctc ttctcataag gacacaggtc atattagatc agggctcacc 60 ctcatggcct cattttaact taatcatctc tttaaagatc ctgtctccaa ataatggtca 120 cattctaggt cctggggttt aggacttcaa cacgggcatt atggccgttg gggaggtagg 180 acataattca gctgatattg tgcattttgc acttggatca tgtagatatt ttccatggag 240 ctttgaatcc atttcttctt ttttttgtag acatgaatga tttattctgg gctaaatggt 300 gacaggaata ttgagacaac gaaagatctg gttagatggc acttaaaggt cagttaataa 360 ccacctttca ccctttgcaa aatgatattt caggtatgcg gaagcgagca ccccagtctg 420 agatggctcc tgccggtgtg agcctgaggg ccaccatcct ctgcctcctg gcctgggctg 480 gccõggctgc aggtgaccgg gtgtacatac accccttcca cctcgtcatc ca caatgaga 540 gtacctgtga gcagctggca aaggccaatg ccgggaagcc caaagacccc accttcatac 600 72 ctgctccaat tcaggccaag acatcccctg tggatgaaaa ggccctacag gaccagctgg 660 tgctagtcgc tgcaaaactt gacaccgaag acaagttgag ggccgcaatg gtcgggatgc 720 tggccaactt cttgggcttc cgtatatatg gcatgcacag tgagctatgg ggcgtggtcc 780 atggggccac cgtcctctcc ccaacggctg tctttggcac cctggcctct ctctatctgg 840 gagccttgga ccacacagct gacaggctac aggcaatcct gggtgttcct tggaaggaca 900 agaactgcac ctcccggctg gatgcgcaca aggtcctgtc tgccctgcag gctgtacagg 960 gcctgctagt ggcccagggc agggctgata gccaggccca gctgctgctg tccacggtgg 1020 tgggcgtgtt cacagcccca ggcctgcacc tgaagcagcc gtttgtgcag ggcctggctc 1080 tctatacccc tgtggtcctc ccacgctctc tggacttcac agaactggat gttgctgctg 1140 agaagattga caggttcatg caggctgtga caggatggaa gactggctgc tccctgatgg 1200 gagccagtgt ggacagcacc ctggctttca acacctacgt ccacttccaa ggtaaggcaa 1260 acctctctgc caggccttgg tggctctggc agatgggcag cctaggactt ggggcag agtatccatg tgtagctgag atcagccagt 1320 1347 <210> 3

<211> 377 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 cctgcccctg tcttgggtga ctcttccctc cctgtctcct gtctgatttc agggaagatg 60 aagggcttct ccctgctggc cgagccccag gagttctggg tggacaacag cacctcagtg 120 tctgttccca tgctctctgg catgggcacc ttccagcact ggagtgacat ccaggacaac 180 ttctcggtga ctgaagtgcc cttcactgag agcgcctgcc tgctgctgat ccagcctcac 240 tatgcctctg acctggacaa ggtggagggt ctcactttcc agcaaaactc cctcaactgg 300 atgaagaaac tgtctccccg gtagagccct cccggtctcc cctggaatgt gggagccaca 360 ctctcctgac ccaggct 73

<210> 4 <211> 273 <212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 4 cctctgggag agccctcact gtgtggcctg gagccttcct aactgtgcat catctcccca 60 ggaccatcca cctgaccatg ccccaactgg tgctgcaagg atcttatgac ctgcaggacc 120 tgctcgccca ggctgagctg cccgccattc tgcacaccga gctgaacctg caaaaattga 180 gcaatgaccg catcagggtg ggggaggtat ttaccttcct tgcctacctg gtccattgca 240 caggtgagca tgattaagga aaagagctat ggt 273

<210> 5 <211> 945 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 agcccaccgc cggccctcta gccctcacga ccctgggtca cccatgcgcc ctcagaatga 60 tcctgatcct gatgtctggt cctttgcagg tgctgaacag catttttttt gagcttgaag 120 cggatgagag agagcccaca gagtctaccc aacagcttaa caagcctgag gtcttggagg 160 tgaccctgaa ccgcccattc ctgtttgctg tgtatgatca aagcgccact gccctgcact 240 tcctgggccg cgtggccaac ccgctgagca cagcatgagg ccagggcccc agaacacagt 300 gcctggcaag gcctctgccc ctggcctttg aggcaaaggc cagcagcaga taacaacccc 360 ggacaaatca gcgatgtgtc acccccagtc tcccaccttt tcttctaatg agtcgacttt 420 gagctggaaa gcagccgttt ccccrtggtc taagtgtgct gcatggagtg agcagtagaa 480 gcctgcagcg gcacaaatgc acctcccagt ttgctgggtt tattttagag aatgggggtg 540 gggaggcaag aaccagtgtt tagcgcggga ctactgttcc aaaaagaatt ccaaccgacc 600 agettgtttg tgaaacaaaa aagtgttccc ttttcaagtt gagaacaaaa attgggtttt 660 aaaattaaag tatacatttt tgcattgcct tcggtttgta tttagtgtct tgaatgtaag 720 aacatgacct ccgtgtagtg tctgtaatac cttagttttt tccacagatg cttgtgattt 780 ttgaacaata cgtgaaagat gcaagcacct gaatttctgt ttgaatgcgg aacaatagct 840 ggttatttct cccttgtgtt agtaataaac gtcttgccac actaagcctc caaatttact 900 ctttattaga cgccaacaga tgtatacatt cagccagata gactg 945

<210> 6 <211> 5590 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 cagcgttgta caaccatcac tactaatgtc agaacatttc actaccccta aaagaaaccc 60 cataccacag attccgatgc cgccgggagc cctgtcatgc catgtcacat atattatagt 120 atatatatgc ccagccatgg tcaacccacc gtgttctttg acatcaccat caacagcaag 180 cccttgggcc acgtctcctt caagctgttt gcagacaagt ttccaaagac ggcagaaaac 240 tttcctgctc tgagcactgg agagaaaggg tttggttata agagttcctg ctttcacaga 300 attattccag ggtttatgtg tcagggtggt gacttcacac accataatgg cactggtgtc 360 aagtccatct atggggagaa atttgatgat gagaacttca ttctgaagca tacaggtcct 420 ggcatctttt ccatggcaaa tgctggaccc aacacaaatg gttcccagtt ttgcaactgc 480 actgccaaga ctgcgtggtt ggatggcatg catgtggtcc ttggccaagt gaaagaaggc 540 atggatattg cggaggctat ggagcgcttt gggtccagga afcggcaagac cagcaagaag600 attaccattg ccgactgtgg acaactctac taagtttgac ttgtgtttta tcttaaccac 660 cagatcattc cttttgtagc tcaggagagc accctccacc tcatttgctc accgtagcct 720 ctaatctttg tgccatctct cagttccctt tgggttccat gtttgcctta ttctcctcca 780 tgcctagctg gatttcagag ttaagtttat gattatgaga taaaaactaa ataacaattg 840 caaaaaaata aaataaaaag aaagaagagg ctgggagcgg tggctcactc ctctaatccc 900 agcactttgg gaggccgagg tgggcctacc aaaggtcagg agatcgagac caccctggct - 960 aacacggtga aatcccatgt ctactaaaaa tacaaaaaaa attagccagg cgtcgtggcg 1020 tgcctgcggt cccagctact cggaaggctg aggcagagga atggcgtgaa cccaggaggt 1080 ggagcttgca gtgagccgag atcgcaccac tgcactccag cctgggcaac agagcaagac 1140 tctatctcaa aaaaaaaaaa aaaaaaagac ggaaaaggca ttatatattt gtgaagacat 1200 ggacagaaat gtgtcctgat tgtggtgcca caaagcactg agcctactag aagacgtcag 1260 75 1320 caaaagatcc cctgaaaagt gactccaagc cattcactgc aagggatggt tacacagatg cagaatacag aaggtcaata gtagcttaat gctacatcac agcttaacac tacatcatcc 1380 acctcacttc atctcacccc atcgtatcgt gtcactgtgc tcaccatcac aagaacaggg 1440 aggatagcac aggaagatat tctgacagag aaagagagag accacattta cataactttt 1500 attacagtat attgttataa ttgttctatt ttattattag ttattgctaa tctcttactg 1560 cacctaattt ataaattaaa ccttgttafct ggtatgtatg tataggaaaa aatatagtgt 1620 atatagggct tggtactttc ttcaatttca ggcatccatt gagagtcttg gaatgtaccc 1680 actgaggata agggggggtt gctgtacata ctttgcaaat atcttctctc atcccatggg 1740 ttgtcttttc attttctttc tttttttttt tgagacggag ttttgctctt gttgcccagg 1800 ctggagtgca gtggcacaat ctcggctcac cacaatctct gcctcccggg ttcaagcgat 1860 tctcetgcct cagcctcecg agtagctggg attacaggaa tgaaccacca cgcctggcta 1920 atttttgtat ttttagtaga gaLggggttt ctccatatgg ccagcctggt ctcgaactcc 1980 cgacctcagg cgatctaccc acctcggcct cccaaagtgc tgggattaca ggtgtgagcc 2040 actgtgcctg gccgtctttt cattttcttg atggtgtcat tgaagcacaa aagttttaaa 2100 ttttgatgaa gaccaattta tctgtttttt ctttcatcac ttatgctttt ggtgtcatat 2160 ctaagaaacc attgactaat ccaaggtcac aaaagattta ttgcctatgt tttcttctaa 2220 aagttttatg attttagttc ttaaatcaag gtctattrta agtcttttgt tttgtttttt 2280 gttttttgtt ttgggacagg gtcttactct gtcacccagg ctggagtgca gaggcacatc 2340 atggctcact gcagcctcaa cctcttggcc tcaagcaatc ctcccacttc agcctcccaa 2400 ggagctggta ttatagacat gcgcaaccat gcccagctaa tttttttgta gagatagggt 2460 ttcaccatat tgcccagact ggtctcaaac tcctaagctc cagtgatccg cccacctcag 2520 cttcccaaag ttctgggatt atagcatgag ccactgcacc cagccccaaa ttttgtatat 2580 ggtattagaa aggggtccaa cttcattctt ttacatgtgg aaatccaatt gccccagcac 2640 catttgttaa aaatáttttc tttcccattt aattgtccta gtgttcttgt caaaaacaat 2700 tgaacataat tgtatgggtt catttctgga ctctcaattc tattccattg ttgagcatat 2760 ttttaagggc tgtttttctc tcctgtggta actggtgacc tgtacttcct ggaagagaga 2820 tgaaaagatt cccaagccaa ctgagttacc tcacgtgggt caggtctctg tggctctctg 2880 cactggccta ttcataatga tatcctcctg caggatttga gccttctcct ttgttgtgac 2940 ggcagccgag gaggtggctg actgcccaga cagccttatc tctttcctac ctttcaaggt 3000 tattgtaaat accaaattag attgtttata cacaagaatt tagcaçtaaa gcactataca 3060 76 aatgtaagct atttatttct atttatcctt ctccttcatg aataagaccc taaaaataga 3120 agatattttt aatttttact cactgggctc aaggttgcag tgtctgtatt attgcaaatt 3180 ccaaattaat gaagtctggc tcttcttata ttattcctgc aaaaggctgt gtgctacccc 3240 ccggagtgtg aatacgagtg tgggtctttc ctctttcctc tgcacccttc cttcgatgag 3300 gttttgccct ggctaggcac catgctaaac tctgagaaaa ccacagagaa caagcagacg 3360 ccatccctgc cctccagtaa catacaattt agtgatgaag ctggggattt aacaagccat 3420 tctaataaag cgttacagtg agggaggtgc agggtgatgc ctccagcagc cctggtgtca 3480 gctgctccag gtccagggga agacttccat tatcttccaa cctgtcggaa gtggaggcgg 3540 aggctgttta ttcgtgacac agtccctaac ccagggtcta tagacattgt ggaaatgcct 3600 tggagtcaga cgggagaatg aaccagcaga agcaatgccc gccctcacct cctgaagagg 3660 gttctcagga actctttgga ggcgaggccc agtctggctg agggcctctg gatacaggtt 3720 aggcctcagg ctcttctcct ctctactcat ctctcctccc ttggcccctc cttcagaggc 3780 tgacagagcc ccactctcat ctcttcccca cccaagcctc tttccacaga aagactgctt 3840 cctcccagga gacagcagct catttgcaca cagacaccca cagccctcaa agcctggaag 3900 gccaagctgt taggacccct gagagcaggg tggctcctgg gaggagagcc caggccacca 3960 eettgccctc cctgcccctg gccttcgatg gggctgctct gatcacaaac gtccaccaac 4020 gtagccggcc cagaagtgca cccatgtcct ctggtatcca ctggctctcc aagccaaact 4080 gggcagggag gagttgtgag ggaaaactgc aggtcaggag ggaggctggc aaagcgggcc 4140 agggccaggc ctgaccccag ctctcctctc ccggccccac tgccggccag tgtttaacaa 4200 ggccctgcct tctccctcta gtgctaggga cagccacctt cttcc frtcc ccaccgcccc 4260 ctctcccctg caacacgtca tctgacaagt cagtgcgatc tcactggagg tgcatctcac 4320 aggaacgcgg ggtcaeagcc tcctgcacac actccatgct gcacagcaag gtgcacgtgt 4380 cctcagagcc ccagacacat cccccactca cccagaagcc caagtgattc ccaacagccc 4440 ccagcagcct aatgggttgg ggtcttggga gcagctgtcc ctggctcctt ccctgatccc 4500 accgcccagc ctcaccccac ggttcctcca ttgccccacc tcccactgcg ccgccgggcc 4560 tctgccaggg tcaaggggct tcccccctct ggcagcagac gccatggtgc cgaggtggcc 4620 tccacaaccg ccctgtgcgc caataggaca agactgtcct ccctccccca cacttgtcac 4680 rttgaggçac acgtggatga gacaggaaaa cacaggggag tgtggagacc tgaggtgact 4740 rggagcaagc ctctcaacct gageggcaat ttcttcatct gtaaaatgag ggggttgttc 4800 rcatctctga ggctttgtgt cgctctcaaa gcctgctagc ctcgggttct aggactctgt 4860 tgggatcgtg tgtgatgttt tctgctgagc gactggcagc ctgtgtcctc ggggggaaag 4920 77 aggcaggcgc tccaaagctc ctgcgctctg tggctccccc tccctcgcag ccccaagccc 4980 caggtgtgcc ggccgccctg agcccctcca gcacctcccg gaggcgcctg caagacacct 5040 aaggtccccg cctccctcct ctcccccccg ccacacccct acccccggca ggcgacgtcc 5100 ccgcccctcg accatggcct ggtgaagaag ccggccaggc ccgatcagcc ccatccccgc 5160 cgcacgagcg gcgcctgcgg acagctcctg gggccceggc cttgtcactc cggaggcggg 5220 aggctccggg gggtcgggct gggaagatcg agccggaggc cgctaggctc ccaggccccg 5280 gccgaggctg cgcggccgca cggtgggcag gctcgggtgt tccggcaaac tgccgggtcc 5340 ccatcttcaa aagagaggag gccctttctc cagcttcctc tgcgggagcc cgacccagcc 5400 ccatcccgcc acccccgggc tgcacctcgg cccctccccg gcccgcgccc ctgcccgggg 5460 cgggccagga acctcggccc gcgccgctgg ggactttgga gcggaggagg aagcgcggcg 5520 gggcgggggc gggggtgtgt cgggttttat aacccgcagg gcggccgcgg cgcaggagaa 5580 ggggcagagc 5590

<210> 7 <211> 4020 <212> ADN <213> Homo sapíens <400> 7 gccgagcacc gcgcaccgcg tcatgggggc cgcctcgggc cgcegggggc cggggctgct 60 gctgccgctg ccgctgctgt tgctgctgcc gccgcagccc gccctggcgt tggaccccgg 120 gctgcagcccggcaactttt ctgctgacga ggccggggcg cagctcttcg cgcagagcta 180 caactccagc gccgaacagg tgctgttcca gagcgtggcc gccagctggg cgcacgacac 240 caacatcacc gcggagaatg caaggcgcca ggaggaagca gccctgctca gccaggagtt 300 tgcggaggcc tggggccaga aggccaagga gctgtatgaa ccgatctggc agaacttcac 360 ggacccgcag ctgcgcagga tcatcggagc tgtgcgaacc ctgggctctg ccaacctgcc 420 cctggctaag cggcagcagt acaacgccct gctaagcaac atgagcagga tctactccac 480 cgccaaggtc tgcctcccca acaagactgc cacctgctgg tccctggacc cagatctcac 540 caacatcctg gcttcctcgc gaagctacgc catgctcctg tttgcctggg agggctggca 600 caacgctgcg ggcatcccgc tgaaaccgct gtacgaggat ttcactgccc tcagcaatga 660 agcctacaag caggacggct tcacagacac gggggcctac tggcgctcctggtacaactc 720 78 780 ccccaccttc gaggacgatc tggaacacct ctaccaacag ctagagcccc tctacctgaa cctccatgcc ttcgtccgcc gcgcactgca tcgccgatac ggagacagat acatcaacct 840 caggggaccc atccctgctc atctgctggg agacatgtgg gcccagagct gggaaaacat 900 ctacgacatg gtggtgcctt tcccagacaa gcccaacctc gatgtcacca gtactatgct 960 gcagcagggc tggaacgcca cgcacatgtt ccgggtggca gaggagttct tcacctccct 1020 ggagctctcc cccatgcctc ccgagttctg ggaagggtcg atgctggaga agccggccga 1080 cgggcgggaa gtggtgtgcc acgcctcggc ttgggacttc tacaacagga aagacttcag 1140 gatcaagcag tgcacacggg tcacgatgga ccagctctcc acagtgcacc atgagatggg 1200 ccatatacag tactacctgc agtacaagga tctgcccgtc tccctgcgtc ggggggccaa 1260 ccccggcttc catgaggcca ttggggacgt gctggcgctc tcggtctcca ctcctgaaca 1320 tctgcacaaa atcggcctgc tggaccgtgt caccaatgac acggaaagtg acatcaatta 1380 cttgctaaaa atggcactgg aaaaaattgc cttcctgccc tttggctact tggtggacca 1440 gtggcgctgg ggggtcttta gtgggcgtac ccccccttcc cgctacaact tcgactggtg 1500 gtatcttcga aecaagtatc aggggatctg tcctcctgtt acccgaaacg aaacccactt 1560 tgatgctgga gctaagtttc atgttccaaa tgtgacacca tacatcaggt actttgtgag 1620 ttttgtcctgcagttccagt tccatgaagc cctgtgcaag gaggcaggct atgagggccc 1680 actgcaccag tgtgacatct accggtccac caaggcaggg gccaagctcc ggaaggtgct 1740 gcaggctggc tcctceaggc cctggcagga ggtgctgaag gacatggtcg gcttagatgc 1800 cctggatgcc cagccgctgc tcaagtactt ccagccagcc acccagtggc tgcaggagca 1860 gaaccagcag aacggcgagg tcctgggctg gcccgagtac cagtggcacc cgccgttgcc 1920 tgacaactac ccggagggca tagacctggt gactgatgag gctgaggcca gcaagtttgt 1980 ggaggaatat gaccggacat cccaggtggt gtggaacgag tatgccgagg ccaactggaa 2040 etacaacaec aacatcacca cagagaccag caagattctg ctgcagaaga acatgcaaat 2100 agccaaccac accctgaagt acggcaccca ggccaggaag tttgatgtga accagttgca 2160 gaacaccact atcaagcgga tcataaagaa ggttcaggac ctagaacggg cagcgctgcc 2220 tgcccaggag ctggaggagt acaacaagat cctgttggat atggaaacca cctacagcgt 2280 ggccactgtg tgccacccga atggcagctg cctgcagctc gagccagatc tgacgaatgt 2340 gatggccaca tcccggaaat atgaagacct gttatgggca tgggagggct ggcgagacaa 2400 ggcggggaga gccatcctcc agttttaccc gaaatacgtg gaactcatca accaggctgc 2460 ccggctcaat ggctatgtag atgcagggga ctcgtggagg tctatgtacg agacaccatc 2520 cctggagcaa gacctggagc ggctcttcca ggagctgcag ccactctacc tcaacctgca 2580 tgcctacgtg cgccgggccc tgcaccgtca ctacggggcc cagcacatca acctggaggg 2640 gcccattcct gctcacctgc tggggaacat gtgggcgcag acctggtcca acatctatga 2700 : 79 cttggtggtg cccttccctt cagccccctc gatggacacc acagaggcta tgctaaagca 2760 gggctggacg cccaggagga tgtttaagga ggctgatgat ttcttcacct ccctggggct 2820 gctgcccgtg cctcctgagt tctggaacaa gtcgatgctg gagaagccaa ccgacgggcg 2880 ggaggtggtc tgccacgcct eggcctggga cttctacaac ggcaaggact tccggatcaa 2940 gcagtgcacc accgtgaact tggaggacct ggtggtggcc caccacgaaa tgggccacat 3000 ccagtatttc atgcagtaca aagacttacc tgtggccttg agggagggtg ccaaccccgg 3060 cttccatgag gccattgggg acgtgctagc cctctcagtg tctacgccca agcacctgca 3120 cagtctcaac ctgctgagca gtgagggtgg cagcgacgag catgacatca actttctgat 3180 gaagatggcc cttgacaaga tcgcctttat ccccttcagc tacctcgtcg atcagtggcg 3240 ctggagggta tttgatggaa gcatçaccaa ggagaactat aaccaggagt ggtggagcct 3300 caggctgaag taccagggcc tctgcccccc agtgcccagg actcaaggtg actttgaccc 3360 aggggccaag ttccacattc cttctagcgt gccttacatc aggtactttg tcagcttcat 3420 catccagttc cagttccacg aggcactgtg ccaggcagct ggccacacgg gccccctgca 3480 caagtgtgac atctaccagt ccaaggaggc cgggcagcgc ctggcgaccg ccatgaagct 3540 gggcttcagt aggccgtggc cggaagccat gcagctgatc acgggccagc ccaacatgag 3600 cgcctcggcc acgttgagct acttcaagcc gctgctggac tggctccgca cggagaacga 3660 gctgcatggg gagaagctgg gctggccgca gtacaactgg acgccgaact ccgctcgctc 3720 agaagggccc ctcccagaca gcggccgcgt cagcttcctg ggcctggacc tggatgcgca 3780 gcaggcccgc gtgggccagt ggctgctgct cttcctgggc atcgccctgc tggtagccac 3840 cctgggcctc agccagcggc tcttcagcat ccgccaccgc agcctccacc ggcactccca 3900 cgggccccag ttcggctccg aggtggagct gagacactcc tgaggtgacc cggctgggtc 3960 ggccctgccc aagggcctcc caccagagac tgggatggga acactggtgg gcagctgagg 4 020

<210> 8 <211> 1856 <212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 8 gtgagagctc atgtgcaggc tgagtgagag gcgagggctg ggactggcat ggggcccggg 60 ggtgctgggt gagagcacag agttgggctc ccctcgctct tggggtcagc gtgcccagga 120 aatgcccttt cttgttttcc acgagggggg cttctctgcc cactgagagc cggcacctac 180 ttcataccat gccccgatca gctgcccctc cctcagaacc gccctctgct taagggtgtc 240 cactctctcc tgtcctctct gcatgccgcc. cctcagagcagcgggatctc aaagttatat 300 80 ttcatgggct tggactccaa atggggggaa ctcggggaca ctagctcccc ccggcctcct 360 ttcgtgaccc tgcccttgac ttcctcacct tctctgtctt tcctgagccc ctctcccagc 420 atgtgactga taaggaaatt gagtcacaca gcccctgaaa gcgccagact agaacctgag 480 cctctgattc ctctcacttc cctcccctac cctgccactt cctactggat agaagtagac 540 agctcttgac tgtcctcttt tctccccact ggctggtcct tcttagcccc agcccgtttg 600 aaagagctca cccccgacac aaggacccgc acacagatac ctcccagctc cctctcaacc 660 caccctttcc agggttggag aacttgaggc ataaacattc ttccatgagg aatctccacc 720 cagaaatggg tctttctggc ccccagccca gctcccacat tagaacaatg acaaatagaa 780 ggggaaatgg aaaataaaca ggagaaacgg ttttcccagg acagggtttg gcctacaagt 840 tgtggatgtg ggtacccatg ccaagtgtga ggggaggctg gccgggtgtg gtggctcatg 900 ctctaatccc agcactttgg gaggccaagg tgagtagatc acttgaggcc gggagtttga 960 gaccagcctg gccaácatgg tgaaacccca tctgtactaa aaatacaaaa gttagctggg 1020 cgtggtggta gatgcctgta gtcccagcta cttgggaggc tgaggcatga gaatcgcttg 1080 agcccagcca gggcaataca gcaagacccc gtctctacaa ataaaataca aaaaattagt 1140 tggatgtggt ggtgcatgcc tgtagtccta gctgctaggg aggctgagat ggaaggattg 1200 cttgagcctg ggaggtcaag gctgcagtga gccgagatgg cgccactgca ctccagcctg 1260 ggcaacagag tgagaccctg tctcagaaag aaaaaaaaaa aaaaaggaga ggagagagac 1320 tcaagcacgc ccctcacagg actgctgagg ccctgcaggt gtctgcagca tgtgcccagg 1380 ccggggactc tgtaagccac tgctggagac cactcccatc ctttctccca tttctctaga 1440 cctgctgcct atacagtcac tttttttttt tttttgagac ggagtctcgc tctgtcgccc 1500 aggctggagt gcagtggcgg gatctcggct cactgcaacg tccgcctccc gggttcacgc 1560 cattctcctg cctcagcctc ccaagtagct gggaccacag cgcccgccac tacgcccggc1620 taattttttg tatttttagt agagacgggg tttcaccgtt ttagccggga tggtctcgat 1680 ctcctgacct cgtgatccgc ccgcctcggc ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgat 1740 acagtcactt ttatgtggtt tcgccaattt tattccagct ctgaaattct ctgagctccc 1800 cttacaagca gaggtgagct aagggctgga gctcaagcca ttcaaccccc taccag 1856

<210> 9 <211> 2720 <212> ADN <213> Homo sapiens 81 <4 Ο Ο> 9 aagcttgctg gggttttgat agagattttç tttaacctgt agatcatttg aagattaatg 60 ccattgtaac gatattaaat ctttcaatcc aagaacatgg aatgtcattc catttattta 120 ggtctacctt atttcaacaa ttctttttgt ttgttttcag actacaagtt ttagatcctt 180 ttgttaaatt tatttcttag ggtttttttt gttttgtttt gttttgttgg ttggttggtt 240 tgttttgaga tggagtctca ctctgtcacc caggctggag tgcagtggca caatctcagc 300 * tcacagcaac ctctacctcc tggg-tcaag cgattattct gcctcagcct cctcctcctg 360 agtagctgga actacaggca tgcaccacca cgcctggcct tttttttttt tttttctttt 420 gcatttttag tagagacagg gtttcacgat gttggccagc ctggtctcga atccctgacc 480 ttgtgattca cceacctcgg cctcccaaag tgctgagatt acaggagtga gccactacac 540 eaggteattt cttgatattt ttactetttt gatctatagt aagtaaaatt gtttttatct 600 ttgaattttt aaatttttaa cacacjttcaa atcagtgtgt ctgatttcat ctccttctct 660 aacaaaccag ggtgccagaa ctgcttcagt ttctctgcct tctctttgtc tatgatgact 720 aatgtatgaa ggtatctgct gcatcaaact ttaaacttca cattatcctt atttctcttg 780 accttgacag atctggcatc ttttcacctg gtcgtaagca gaaagtcctt gatctcctta 840 actttttgag gcatggcagc atgtgaggca gggagaggac acagacccac acagcaagtg 900 gtgagaagcc aacagtggaa ttgttttctt aattccattt gttgattgtt tattgctagt 960 gtatagaaat acaactgatt tttgtatatt gatettgtat tctaaaaact tgctcaactt 1020 gtttcttagt tctaatagtt aattaattga ttccttaggg ctttttaata caagatcatg 1080 tcatctacaa utagaaattg ttttactttc tttctaatct ggatgccatt tatctttttt 1140 tcttgtecaa ttgccctcac tagaaccttt agtac aaagt taaatagaaa tgggaagact 1200 agacattttg tcttgttcct gatcttagac ataaaaacgt tgtcttccgt tattatgtgt 1260 gatattagtt aagttaagtt tttcataaat aaacttcaca gtttgaggaa gttcctattc 1320 ctaatttgtt gagtgttagc atgaaaaagt gttgaatttt gtccaagagt ttttaaaaat 1380 ttttttaaac aatcatgtag qctttqtcca tttcttactt ctttaaattt attttatttg 1440 atacacaata gatgtacact ttttaggtac atgcaataat ttaatgcccc tcactataaa 1500 ttcggagctg cctcctcgcc gatgattcca gcgcctgaca gccaggaccc caggcagcag 1560 cgagtgacag gactttttag gtacatgcaa taatttaatg cattcatata aagatcaaat 1620 cagtgcaatt ggcatatcca tcaccttaaa tatttgtctt tttcttcatg ctagaaacat 1680 tcaagttatt ttctcctagc tactctgaaa tatacaatag attactgtaa actacagtca 1740 ccctactcac ctatctaaca ttaattgatt tttggtaaac taatctaatc ttgctttctg 1800 gcatcaacct cacttgacca tggtgtatag tccctttcat atgttattgg attcaatttg 1860 cctacatttt gttgagaatt tttatctata ctcttaagaa atattgatct gtagtctcgt 1920 82 gatgtcttta tctggttttg ttatcagggt gatactggcc tcatagcatg agttgggaga 1980 tcatccttac tcttctattt tttggaagag tttgtgaaga attgatatta tttcttcttt 2040 aaatatttat tgggttttta aaatacattt ttaaaatgca acttgggtag catgtccaat 2100 aggaacaaat gagtgtccac ccttgaattt cataaccctc ggaattaatc catgtaatct 2160 atgatccaca actgtattac caaagttcga gttactcata ggaaagagaa agaagttctc 2220 taattcgtcc ttaaaagttt tccaagttca gaaaaaaaaa atgttgaaga acacgaactc 2280 ccgcaggaaa tgatactcct gtacccccag ctcgctctcc ctcacgaccc ctcgctaggc 2340 ggggttcggg accaggtgaa cgctgatctg atagttgaca cgggacgact gtggcatcat 2400 ccttgctgcc gtcaatatec cgagagggag gaggttgggc cgggagggtc tccggggcgg 2460 ggcggaggag gagggaatgc aaaacagagc ctcgtccccg gaacccaaga agcagcaacg 2520 cccctcacta taaattcgga gctgcctcct cgccaatgat tccagcgcct gacagccagg 2580 accccaggca gcagegagtg acaggacgtc tggaccggcg cgccgctagc agctctgccg 2640 ggccgcggcg gtgatcgatg gggagcggct ggagcggacc cagcgagtga gggcgcacag 2700 ccgggacgcc gaggcggcgg 2720

<210> 10 <211> 480 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 10 gaattctcag agctggcgaa acagtctggt ccaagcagcc tctcagcagt gcctttcagc 60 ctcccctctc tgagtctttc caccccttgc tggtacttta gfcttcttcca cttctagcac 120 cacgtgtagt ttcccaattt ctcttaccca aatttgctca cagggaaaaa aataaattaa 180 attagccatt tacaccacag tgtgaactta ataacaccaa caaaagttcc aaagctctag 240 ggtctcatag cacctccaga tccatgatct cattcggtgt ttccaacaat gttttgcacc 300 aaactggaca catgcttgct acttcatcat cctcatcgtg aacattatta ttattatcat 360 cattttccag atgaagaaaa tgaatcacaa gtcaactgac agtccaaagg ctccacagct 420 cagaggaggt aaatcatgtg cttaattcag aacttttggc tcccatcact atgctcttcc 480 83 <210> 11 <211> 2685

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 accccaggca gcagcgagtg acaggacgtc tggaccggcg cgccgctagc agctctgccg 60 ggccgcggcg gtgatcgatg gggagcggct ggagcggacc cagcgagtga gggcgcacag 120 ccgggacgcc gaggcggcgg gcgggagacc cgcaccagcg cagccggccc tcggcgggac 180 gtgacgcagc gcccggggcg cgggtttgat atttgacaaa ttgatctaaa atggctgggt 240 ttttatctga ataactcact gatgccatcc cagaaagtcg gcaccaggtg tatttgatat 3ÒÕ agtgtttgca acaaattega cccaggtgat caaaatgatt ctcaactctt ctactgaaga 360 tggtattaaa agaatccaag atgattgtcc caaagctgga aggcataatt acatatttgt 420 catgattcct actttataca gtatcatctt tgtggtggga atatttggaa acagcttggt 480 ggtgatagtc atttactttt atatgaagct gaagactgtg gccagtgttt ttcttttgaa 540 tttagcactg gctgacttat gctttttact gactttgcca ctatgggctg tctacacagc 600 tatggaatac cgctggccct ttggçaatta cctatgtaag attgcttcag ccagcgtcag 660 tttcaacctg tacgctagtg tgtttctact cacgtgtctc agcattgatc gatacctggc 720 tattgttcac ccaatgaagt cccgccttcg acgcacaatg cttgtagcca aagtcacctg 780 catcatcatt tggctgctgg caggcttggc cagtttgcca gctataatcc atcgaaatgt 840 atttttcatt gagaacacca atattacagt ttgtgctttc cattatgagt cccaaaattc 900 aacccttccg atagggctgg gcctgaccaa aaatatactg ggtttcctgt ttccttttct 960 gatcattctt acaagttata ctcttatttg gaaggcccta aagaaggctt atgaaattca 1020 gaagaacaaa ccaagaaatg atgatatttt taagataatt atggcaattg tgcttttctt 1080 tttcttttcc tggattcccc accaaatatt cacttttctg gatgtattga ttcaactagg 1140 catcatacgt gactgtagaa ttgcagatat tgtggacacg gccatgccta tcaccatttg 1200 tatagcttat tttaacaatt gcctgaatcc tcttttttat ggctttctgg ggaaaaaatt 1260 taaaagatat tttctccagc ttctaaaata tattccccca aaagccaaat cccactcaaa 1320 cctttcaaca aaaatgagca cgctttccta ccgcccctca gataatgtaa gctcatccac 1380 caagaagcct gcaccatgtt ttgaggttga gtgacatgtt cgaaacctgt ccataaagta 1440 attttgtgaa agaaggagca agagaacatt cctctgcagc acttcactac caaatgagca 1500 ttagctactt ttcagaattg aaggagaaaa tgcattatgt ggactgaacc gacttttcta 1560 aagctctgaa caaaagcttt tctttccttt tgcaacaaga caaagcaaag ccacattttg 1620 cattagacag atgacggctg ctcgaagaac aatgtcagaa actcgatgaa tgtgttgatt tgagaaattt tactgacaga aatgcaatct ccctagcctg cttttgtcct gttatttttt atttccacat aaaggtattt agaatatatt aaatcgttag aggagcaaca ggagatgaga gttccagatt gttctgtcca gtttccaaag ggcagtaaag ttttcgtgcc ggttttcagc tattagcaac tgtgçtacac ttgcacctgg tactgcacat tttgtacaaa gatatgctaa gcagtagtcg tcaagttgca gatctttttg tgaaattcaa cctgtgtctt ataggtttac actgccaaaa caatgcccgt aagatggctt atttgtataa tggtgttact aaagtcacat ataaaagtta aactacttgt aaaggtgctg cactggtccc aagtagtagt gtcctcctag tatattagtt tgatttaata tctgagaagt gtatatagtt tgtggtaaaaagattatata tcataaagta tgccttcctg tttaaaaaaa gtatatattc tacacatata tatatatgta tatctatatc tctaaactgc tgttaattga ttaaaatctg gcaaagtt

Lisboa, 9 de Novembro de 2006 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2268 85

Claims (25)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para avaliação da capacidade de resposta a um regime de tratamento cardiovascular num indivíduo humano, em que o método compreende a comparação de um padrão polimórfico, estabelecido numa ou mais posições polimórficas, dentro de um ou mais dos genes da ACE, AGT ou ATI, do referido indivíduo, com um padrão polimórfico das mesmas posições polimórficas, de humanos que têm uma resposta conhecida ao regime de tratamento cardiovascular, em que são comparadas a identidade ou a semelhança dos respectivos padrões polimórficos, para determinar se o referido indivíduo apresenta ou não , um padrão polimórfico correlacionado com a capacidade de resposta ao referido regime de tratamento.
2. 2. Método, como definido na reivindicação 1, em que o referido regime de tratamento é uma alteração da dieta, do estilo de vida e/ou do exercício; uma técnica cirúrgica invasiva ou não-invasiva; ou uma intervenção farmacêutica.
3. 3. Método, como definido na reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o referido regime de tratamento diz respeito ao enfarte do miocárdio, hipertensão, aterosclerose ou acidente vascular cerebral.
4. 4. Método, como definido na reivindicação 1, em que o referido regime de tratamento é uma intervenção farmacêutica.
5. 5. Método, como definido na reivindicação 4, em que o referido regime de tratamento compreende a administração de um fármaco cardiovascular, seleccionado do grupo consistindo de inibidores da ACE, antagonistas do receptor da 1 diuréticos, angiotensina II, diuréticos, antagonistas do alfa-adrenorreceptor, glicósidos cardíacos, inibidores da fosfodiésterase, antagonistas do beta-adrenorreceptor, bloqueadores do canal de cálcio, inibidores da redutase de HMG-CoA, bloqueadores do receptor da imidizolina, bloqueadores do receptor da endotelina e nitritos orgânicos.
6. 6. Método, como definido na reivindicação 5, em que as referidas posições polimórficas compreendem ACE 2193, como numerada no N° de acesso J04144 do GenBank, AGT 1072, como numerada no N° de acesso X15323 do GenBank e ATI 1167, como numerada, quando a sequência codificante da proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank.
7. 7. Método, como definido na reivindicação 6, em que o referido padrão polimórfico compreende ACE 2193 A/G, AGT 1072 G/A e ATI 1167 A/G.
8. 8. Método, como definido na reivindicação 1, em que o referido regime de tratamento consiste na administração de um inibidor da ACE, em que o método compreende a comparação do padrão polimórfico estabelecido pela determinação da sequência (a) do gene da ACE na posição 2193 da região codificante, como numerada no N° de acesso J04144 do GenBank; (b) do gene do AGT na posição 1072 da região reguladora, como numerada no N° de acesso X15323do GenBank; e (c) do gene do ATI na posição 1167 da região codificante, como numerada, quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank, com os 2 mesmos padrões polimórficos de humanos que apresentam respostas diferentes ao referido inibidor da ACE.
9. 9. Método, como definido na reivindicação 8, em que o referido padrão polimórfico compreende ACE 2193 A/G, AGT 1072 G/A, ATI 1167 A/G.
10. 10. Método, como definido na reivindicação 1, em que a referida posição polimórfica é seleccionada do grupo consistindo das posições da região reguladora da ACE numeradas como 5106, 5349 e 5496, como numeradas no N° de acesso X94359 do GenBank; nas posições da região codificante da ACE, numeradas como 375, 582, 731, 1060, 1215, 2193, 2328, 2741, 3132, 3387, 3503 e 3906, como numeradas no N° de acesso J04144do GenBank; posição 1451 do gene da ACE, como numerada no N° de acesso X62855do GenBank; as posições na região reguladora do AGT, numeradas como 395, 412, 432, 449, 692, 839, 1007, 1072, 1204 e 1218, como numeradas no N° de acesso X15323 do GenBank; as posições da região codificante do AGT, numeradas como 273, 620, 912, 997, 1116 e 1174, como numeradas quando as sequências codificantes de proteína com os N°s de acesso M24686, M24687, M24688, M24689 do GenBank são processadas em conjunto; a posição 49 do gene AGT, como numerada no N° de acesso M24688 do GenBank; as posições da região reguladora do ATI, numeradas como 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 e 2415, como numeradas no N° de acesso U07144 do GenBank; as posições da região codificante do ATI, numeradas como 449, 678, 1167 e 1271, como numeradas quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank; e combinações de qualquer das anteriores. 3
11. 11. Método, como definido na reivindicação 10, em que os referidos padrões polimórficos são seleccionados do grupo consistindo de: ACE 5349 A/T, AGT 1218 A; ACE 5496 C, AGT 1204 A/C; ACE 5496 C/T, AGT 1218 A, AGT 620 C/T; ACE 2193 A, AGT 1204 C, ACE 2328 G; ACE 2193 A, AGT 1204 A/C; ACE 3387 T, AGT 1218 A; ACE 3387 T, AGT 620 C/T; AGT 1204 A/C, ATI 678 C/T; AGT 1204 A/C, ATI 1271 A/C; ACE 1215 C, AGT 1204 A/C; AGT 1204 A/C, ATI 1167 A, ACE 3906 A/G; AGT 1204 A, AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A, AGT 395 A/T; AGT 1204 A/C, AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A, AGT 395 T; AGT 1204 A/C, AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A/G, AGT 395 T; AGT 1204 A, ATI 678 C, ATI 1167 A, AGT 395 A/T; AGT 1204 A/C, ATI 678 C/T, ATI 1167 A, AGT 395 T; AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A, AGT 395 T; AGT 620 C/T, ATI 1271 A/C, ATI 1167 A/G, AGT 395 T; AGT 620 C, ATI 1271 A, ATI 1167 A; AGT 395 A/T; AGT 620 C, ATI 678 A, ATI 1167 A, AGT 395 A/T; AGT 620 C/T, ATI 678 C/T; ATI 1167 A, AGT 395 T; ACE 2193 A, AGT 1218 A, ACE 2193 A, AGT 620 C/T; ACE 2328 G, AGT 620 C/T; ACE 3387 T, AGT 1204 A/C; ACE 2193 A, ACE 2328 G, AGT 1204 C; e ACE 2193 A/G, AGT 1072 G/A, ATI 1167 A/G.
12. 12. Ácido nucleico isolado correspondendo, homologamente ou complementarmente ao gene humano codificando a enzima conversora da angiotensina (ACE), em que o referido ácido nucleico compreende uma posição polimórfica e, em que a sequência na referida posição polimórfica encontra-se na região reguladora e é 5106T, como numerada no N° de acesso X94359 do GenBank; e/ou a sequência na referida posição polimórfica encontra-se na região codificante e é seleccionada do grupo consistindo de 375C, 582T, 731G, 1060A, 2741T, 3132T, 3387C, 3503G e 3906A, como numeradas 4 no N° de acesso J04144 do GenBank; e combinações de qualquer das anteriores.
13. 13. Sonda com 10 a 100 Pares de bases de comprimento, as quais hibridam, sob condições de restringência elevada, com uma posição polimórfica ou com uma sequência imediatamente adjacente a uma posição polimórfica, como definida na reivindicação 12.
14. 14. Ácido nucleico isoladamente, correspondendo homologamente ou complementarmente ao gene humano codificando o angiotensinogénio (AGT), em que o referido ácido nucleico compreende uma posição polimórfica e em que a referida sequência da posição polimórfica se encontra na região reguladora e é seleccionada do grupo de 412T e 1072A, como numeradas no N° de acesso X15323 do GenBank; e/ou a referida sequência da posição polimórfica encontra-se na região codificante e é seleccionada do grupo consistindo de 273T e 997C, como numeradas quando as sequências codificantes de proteínas com os N°s de acesso M24686, M24687, M24688, M24689 do GenBank são processadas em conjunto e G na posição 49 do N° de acesso M24688 do GenBank; e combinações de qualquer das anteriores.
15. 15. Sonda com 10 a 100 pares de bases de comprimento, a qual híbrida, sob condições de restringência elevada, com uma posição polimórfica ou com uma sequência imediatamente adjacente a uma posição polimórfica, como definido na reivindicação 14.
16. 16. Ácido nucleico isolado, correspondendo homologamente ou complementarmente ao gene humano codificante do receptor da 5 angiotensina II de tipo I (ATI), em que o referido ácido nucleico compreende uma posição polimórfica em que a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região reguladora e é seleccionada do grupo consistindo de 1427T, 1756A, 1853G, 2046C, 2354C, 2355C e 2415G, como numeradas no N° de acesso U07144 do GenBank; e/ou a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região codificante/intrão e é 449C, como numerada quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank.
17. 17. Sonda com 10 a 100 pares de bases de comprimento, a qual híbrida, sob condições de restringência elevada, com uma posição polimórfica ou com uma sequência imediatamente adjacente a uma posição polimórfica, como definido na reivindicação 16.
18. 18. Biblioteca de ácidos nucleicos, compreendendo, cada um dos quais, uma ou mais posições polimórficas dentro do gene da ACE humana, em que a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região reguladora e é seleccionada do grupo consistindo de 5106T, 5349T e 5496C, como numeradas no N° de acesso X94359 do GenBank; e/ou a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região codificante e é seleccionada do grupo consistindo de 375C, 582T, 731G, 1060A, 1215T, 2193A, 2328G, 2741T, 3132T, 3387C, 3503G e 3906A, como numeradas no N° de acesso J04144 do GenBank e uma eliminação dos nucleótidos 1451-1783, como numerados no N° de acesso X62855 do GenBank. 6
19. 19. Biblioteca de ácidos nucleicos, compreendendo, cada um dos quais, uma ou mais posições polimórficas dentro do gene do AGT humano, em que a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região reguladora e é seleccionada do grupo consistindo de 395A, 412T, 432A, 449T, 692T, 839A, 1007A, 1072A, 1204A, 1218G, como numeradas no N° de acesso X15323 do GenBank; e/ou a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região codificante e é seleccionada do grupo consistindo de 273T, 620T, 912T, 997C, 1116A, 1174A, como numeradas quando as sequências codificantes de proteínas com os N°s de acesso M24686, M24687, M24688, M24689 do GenBank são processadas em conjunto e G na posição 49 do N° de acesso M24688 do GenBank.
20. 20. Biblioteca de ácidos nucleicos, compreendendo, cada um dos quais, uma ou mais posições polimórficas dentro do gene do ATI humano, em que a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região reguladora e é seleccionada do grupo consistindo de 1427T, 1756A, 1853G, 2046C, 2354C, 2355C e 2415G, como numeradas no N° de acesso U07144 do GenBank; e/ou a sequência na referida posição polimórfica se encontra na região codificante e é seleccionada do grupo consistindo de 449C, 678C, 1167G e 1271C, como numeradas quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank.
21. 21. Biblioteca de alvos para fármacos cardiovasculares, compreendendo, cada um dos referidos alvos, um péptido isolado derivado do polipéptido da ACE, compreendendo uma 7 ou mais posições polimórficas na sequência do polipéptido da ACE, em que as referidas posições polimórficas são codificadas por nucleótidos seleccionados do grupo consistindo em posições nucleotidicas na região codificante da ACE, tendo a sequência 731G, 1060A, 2741T e 3503G, como numeradas no N° de acesso J04144 do GenBank.
22. 22. Biblioteca de alvos para fármacos cardiovasculares, compreendendo, cada um dos referidos alvos, um péptido isolado derivado do polipéptido do AGT, compreendendo uma ou mais posições polimórficas no polipéptido do AGT, em que as referidas posições polimórficas são codificadas por nucleótidos seleccionados do grupo consistindo de posições nucleotidicas tendo a sequência 620T, 997C e 1174A, como numeradas quando a proteína codificando as sequências com os N°s de acesso M24686, M24687, M24688, M24689 do GenBank são processadas em conjunto.
23. 23. Alvo para fármacos cardiovasculares, compreendendo, o referido alvo, um péptido isolado derivado do polipéptido do ATI, compreendendo uma ou mais posições polimórficas no polipéptido do ATI, em que a referida posição polimórfica é codificada por um nucleótido tendo a sequência 449C, como numerada quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank.
24. 24. Kit para avaliar a capacidade de resposta de um indivíduo a um regime de tratamento para uma síndrome cardiovascular, compreendendo, o referido kit (i) iniciadores determinadores da sequência e (ii) reagentes determinadores da sequência, em que os referidos iniciadores são seleccionados do grupo consistindo de iniciadores que hibridam com posições polimórficas nos genes da ACE, AGT ou ATI humanos; e os iniciadores que hibridam imediatamente adjacente a posições polimórficas nos genes da ACE, AGT ou ATI humanos, em que as posições polimórficas são predictivas da capacidade de resposta de um indivíduo a um regime de tratamento cardiovascular de uma sindrome cardiovascular, em que as referidas posições polimórficas são seleccionadas do grupo consistindo de posições na região reguladora da ACE, numeradas como 5106, como numeradas no N° de acesso X94359 do GenBank; posições na região codificante da ACE, numeradas como 375, 582, 731, 1060, 2741, 3132, 3387, 3503 e 3906, como numeradas no N° de acesso J04144 do GenBank; posição 1451 no gene da ACE, como numerada no N° de acesso X62855 do GenBank; posições na região reguladora do AGT, numeradas como 412 e 1072, como numeradas no N° de acesso X15323 do GenBank; posições na região codificante da AGT, numeradas como 273 e 912, como numerada quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso 577410 do GenBank; posição 49 do gene da AGT, como numerada no N° de acesso M24688 do GenBank; posições na região reguladora do ATI, numeradas como 1427, 1756, 1853, 2046, 2354, 2355 e 2415, como numeradas no N° de acesso U07144 do GenBank; posições na região codificante do ATI, numeradas como 449, como numeradas quando a proteína codificando a sequência com o N° de acesso S80239 do GenBank foi 9 processada, para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank; e combinações de qualquer das anteriores.
25. 25. Kit para avaliar o estado cardiovascular, compreendendo o referido kit um ou mais anticorpos específicos para uma posição polimórfica dentro de polipéptidos da ACE, AGT ou ATI humanos, em que as referidas posições polimórficas são codificadas por um nucleótido seleccionado do grupo consistindo de posições nucleotídicas da região codificante da ACE, tendo a sequência 731G, 1060A, 2741T e 3503G, como numeradas no N° de acesso J04144 do GenBank; posições nucleotídicas da região codificante do AGT, tendo as sequências 620T, 997C e 1174A, como numeradas quando as sequências codificantes de proteína com os N°s de acesso M24686, M24687, M24688, M24689 do GenBank, são processadas em conjunto; posições na região codificante do ATI tendo a sequência 449C, como numerada quando a sequência codificante de proteína com o N° de acesso S80239 do GenBank foi processada para a posição 288 do N° de acesso S77410 do GenBank; e combinações de qualquer das anteriores. Lisboa, 9 de Novembro de 2006 10