PT904070E - Utilizacao de buckminsterfullereno para o tratamento de danos neurotoxicos - Google Patents

Description

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Descrição “Utilização de buckminsterfullereno para o tratamento de danos neurotóxicos” A presente invenção refere-se a derivados carboxilados de fórmula geral C6o(C(COOH)2)n em que o substituinte Côo é buckminsterfullereno e o símbolo n representa um número entre 1 e 4. O buckminsterfullereno, Cóo, é uma estrutura de carbono, qual bola de futebol, cujas faces são anéis alternados de 5 e 6 átomos de carbono; as 30 ligações duplas de carbono reagem facilmente com radicais que contêm oxigénio (Science 259, 1183-1185, 1991) e por isso pode actuar como abluente de radicais livres. No entanto, o C<so natural, apenas é solúvel num número limitado de solventes, tais como o tolueno ou o benzeno. Os compostos úteis, de acordo com a presente invenção, são os carboxifullerenos solúveis em água, isto é, um buckminsterfullereno que tenha sido monotransformado ou multitransformado com ácido malónico, ou as amidas, os ésteres e os sais de ácido malónico farmaceuticamente aceitáveis, em que o grupo metileno do ácido malónico esteja ligado a dois átomos de carbono do poliedro de fullereno. Assim, os compostos úteis de acordo com a presente invenção são os que satisfaçam à fórmula geral C6o(C(COOH)2)n e as amidas, os ésteres e os sais correspondentes, em que o símbolo n representa um número inteiro compreendido entre 1 e 4. Na figura 1 estão ilustrados exemplos de dois isómeros de Côo (C(COOH)2)n em que é n=3. Estes compostos foram designados por “03 a” e “R-3b” e são os ácidos que correspondem aos ésteres etílicos descritos como compostos 3a e 3b em Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 437-438, 1994. Os compostos 2 úteis de acordo com a presente invenção são os de fórmula C6o(C(COOH)2)3 e as suas amidas, seus ésteres e seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. A preferência máxima vai para o próprio ácido de fórmula C6o(C(COOH)2)3, em especial o isómero 0-3a.

Descobriu-se smpreendentemente que são agentes neuroprotectores e abluentes de radicais livres biológicos e por tal razão inibem os danos neuronais mediados pelos receptores e a morte neuronal apoptótica induzida pelas perdas de soro. O glutamato, que é o principal neurotransmissor excitatório no sistema nervoso central, é necessário para muitas funções neurológicas normais, incluindo a aprendizagem e a memória. No entanto, a hiperactivação do receptores do glutamato, e os consequentes danos neuronais excitotóxicos, tem sido implicada na patogénese de perdas neuronais no sistema nervoso central (SNC) a seguir a diversas ocorrências agressivas agudas, incluindo hipoxia/isquémia (Science 226, 850-852, 1984; Trends Pharmacol. Sei., Π, 379-387; Ann. Neurol. 19, 105-111, 1986; Science 247, 571-574, 1990); traumas (Ann. Neurol. 23, 623-626, 1988); epilepsia (Neurosci., 12, 557-567, 1984) e em determinadas doenças neurodegenerativas (Science 227, 1496-1498,1985; Neuron 1,623-634,1988; Trends Phaimac. Sei. Π, 379-387,1990; Neurol. 40, 32-37, 1990; Ann. Neurol. 31, 119-130, 1992). O ‘stress’ oxidativo, provocado por espécies oxigenadas reactivas, constitui outro mecanismo danificador implicado em muitas dessas doenças agudas e crónicas (Stroke 9, 445--447, 1978; Proq. Brain Res. 63, 227-235, 1985; J. Neurosurq. 64, 803-807, 1986; Cerebrovas. Brain Mezab. Rev. J., 165-211, 1989; Free Radie. Biol. Med. 6, 289-301, 1989; J. Neurochem. 59, 1609-1623, 1992). As espécies oxigenadas reactivas, (v.g. o radical superóxido) vão provocar lesões oxidativas nos componentes celulares, tais como a peroxi-dação dos lípidos da membrana celular, a inactivação das proteínas de transporte e a inibição da produção de energia pelos mitocondrios. 3

Estes dois fenómenos, excitotoxicidade do glutamato e ‘stress’ oxidativo, podem estar interligados; a formação de espécies oxigenadas reactivas pode ocorrer como consequência directa da hiperestimulação do receptor do glutamato (Soc. Neurosd. Abs. 18, 756, 1992; Nature 364, 535-537, 1993) e intervir consequentemente num componente da neurotoxicidade do glutamato (Neuron. JL, 623-634, 1988; Science 262, 689-694, 1993). Por sua vez, é possível reduzir a excitotoxicidade por meio de abluentes de radicais livres, incluindo as substâncias CuZn--superóxido-dismutase ou -catalase (J. Neurochem. 49, 1222-1228,1987; Acta Neurochirurgica φ 51, 245-247, 1990), os 21-amino-esteróides (“lazaróides”) (Neuron 5, 121-126, 1990), vitaminas (J. Neurochem. 49, 1222-1228, 1987; os 21-aminoesteróides, ditos “lazaróides”, o análogo da vitamina E designado por ‘trolox’ (Barin Res. 639, 102-108, 1994), os agentes neutralizadores do momento iónico total, tais como o composto fenilbutíl-N-nitrona (Brain Res. 574, 193-197, 1992) e o análogo de ubiquinona designado por idebenona (Neurosci. Lett. 178, 193-196, 1994), que reduzem a quantidade de espécies oxigenadas reactivas.

Os abluentes de radicais livres são neuroprotectores em modelos criados in vitro e também in vivo, respeitantes a lesões traumáticas ou hipóxicas/isquémicas do SNC. Os ^ antagonistas dos receptores de N-metil-D-aspartato e AMPA-caínato são neuroprotectores no caso dos danos por perdas de oxigénio-glicose em modelos in vitro (Neuron 1, 623-634, 1988; J. Neurosci., 13, 3510-3524, 1993) e reduzem as perdas de tecido cerebral em modelos de isquémia realizados com animais (Science 226, 850-852, 1984; Science 247, 571-574, 1990). Os abluentes de radicais livres também conferem protecção contra a morte neuronal excitotóxica em modelos realizados in vitro (J. Neurochem. 49, 1222-1228, 187; Neuron, 5, 121-126, 1990) e reduzem as lesões isquémicas em modelos in vivo (Amer. J. Physiol. 256, H589-593; Stroke 21, 1312-1317, 1990; Stroke 22, 896-901, 1991; Free Rad. Biol. Med. 12, 7>5 4 29-33, 1992). Os animais transgénicos que hiperexprimem a enzima abluente de radicais livres, CuZn-superóxido-dismutase (SOD) são resistentes à toxicidade do glutamato (Acta Neurochirurgia 51, 245-247, 1990) e às lesões cerebrais isquémicas (Ann. Neurol. 29, 482--486; Proc. Natl. Acad. Sei., USA 88, 11158-62, 1991). A morte celular programada, ou apoptose, também contribui para a morte das células em determinados estados patológicos do foro neurológico. Por exemplo, a apoptose intervém na degeneração neuronal retardada, alguns dias após a reperfiisão isquémica (J. Neurochem. 61, 1973-1976, 1994; Neuroreport 5, 493-496, 1994) e pode ser um factor de morte das células neuronais em determinadas doenças neurodegenerativas (Neurosci. Lett. 170, 191-194, 1994). O ‘stress’ oxidativo, devido a espécies oxigenadas com radicais livres, pode ser uma das agressões eventualmente desencadeadoras da apoptose (Nature 356, 397-400, 1992; Neurotoxicol. 15, 81-91, 1994; J. Natl. Câncer Inst. 86, 1286-1295, 1994), pelo que os abluentes de radicais livres também podem eventualmente ser capazes de limitar a morte celular programada (J. Neurochem. 62, 376-379, 1994; Neurosci. Abs. 20, 432, 1994). Pressupõe-se que a substâncias Bcl-2 actue num circuito de abluição de radicais livres para mediar os seus efeitos citoprotectores contra a apoptose (Cell. 75, 241-251, 1993). A presente invenção tem como objecto principal proporcionar a utilização de derivados carboxilados de C6o(C(COOH)2)n, em que o substituinte C<» é um radical buckminsterfullereno e o símbolo n representa um número inteiro compreendido entre 1 e 4, para a preparação de um medicamento para o tratamento ou para a profilaxia de doenças provocadas por radicais livres, em especial quando o radicais livres são libertados em consequência da neurotoxicidade do glutamato. O tratamento dos danos neurotóxicos, no âmbito do contexto que lhe é atribuído na presente invenção, significa que terá lugar uma redução da intensidade das lesões causadas

5 aos neurónios centrais na vizinhança de um neurónio central que tenha libertado glutamato em consequência do facto de ter sido danificado por um fenómeno neurotóxico. Os fenómenos neurotóxicos compreendem as lesões neurológicas agudas, tais como hipoxia/isquémia, por exemplo, as que ocorrem durante os colapsos, hipoglicémias, epilepsia ou traumas. Os fenómenos neurotóxicos também podem ser lesões neuronais crónicas provocadas por doenças neuro-degenerativas, tais como a doença de Huntington, a doença de Alzheimer, a esclerose lateral amiotrófica (”ELA”) e os efeitos neurodegenerativos da SEDA.

Constitui outro objecto da presente invenção proporcionar a utibzação de buckminster-fullerenos para a preparação de um medicamento para inibir as lesões neurotóxicas em pacientes em que tais lesões tenham sido provocadas pelo metabolismo da libertação do ácido araquidónico pelos neurónios, devido à estimulação dos receptores de NMDA do referidos neurónios por acção do glutamato. O ácido araquidónico (“AA”) é libertado nos neurónios devido a um influxo excessivo de Ca2+ para dentro das células neuronais, o que é causado pela estimulação dos receptores de NMDA por acção do glutamato (tendo o glutamato sido libertado pelos próprios neurónios que tenham sido danificados pelo fenómeno neurotóxico). O influxo excessivo de Ca2" activa a fosfolipase A2, que é uma enzima dependente do cálcio, que decompõe as membranas celulares, libertando 0 AA. O metabolismo do AA, por acção das lipoxigenases e das cicloxi-genases endógenas, leva à produção dos radicais livres oxigenados que desencadeiam a degradação peroxidativa das membranas lipídicas neuronais (Acta Physiol. Scand. 492, 121-128, 1980; Proq. Brain Res. 63, 227-232, 1985), daí resultando a lesão ou a morte dos neurónios. Assim sendo, de acordo com a presente invenção, a redução de radicais livres que contenham oxigénio, mediante a administração de uma composição que contenha um carboxifullereno

6 abluente de radicais livres, aqui descrito, constitui o mecanismo alternativo que determina a inibição da neurotoxicidade induzida pelo glutamato. O objectivo preferencial da presente invenção consiste na utilização dos compostos referidos supra para a preparação de um medicamento para tratar colapsos. De acordo com a presente invenção, define-se um colapso como sendo um fenómeno neurotóxico agudo que ocorre no cérebro de um paciente, tendo esse fenómeno neurotóxico lugar devido a uma perda de fluxo sanguíneo para os neurónios do cérebro.

Os compostos carboxifullerenos aqui descritos são administrados por via sistémica, sob a forma de um medicamento que contém o composto activo e um veículo farmaceuticamente aceitável, compatível com o referido composto. Para a preparação de tal medicamento é possível utilizar qualquer veículo convencional, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Sempre que um fármaco é administrado por via oral, isso ocorre geralmente a intervalos regulares.

Os compostos com utilidade para fins terapêuticos, de acordo com a presente invenção, podem ser administrados por qualquer via convencional para a administração de fármacos. Como exemplos refere-se as vias intravenosa, intramuscular, subcutânea, intratecal, intra-peritonial, tópica e também oral. De preferência, o método da presente invenção é praticado através das vias de administração oral ou intravenosa. O medicamento pode ser preparado segundo uma qualquer forma convencional, incluindo uma forma sólida para administração oral, por exemplo, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos e não só. O medicamento pode ser esterilizado e/ou pode conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sais para fazer variar a pressão osmótica e/ou tampões. 7

As preparações típicas para administração intravenosa podem ser soluções aquosas estéreis, incluindo as soluções aquosas tamponadas. Os veículos intravenosos compreendem as substâncias de reposição de fluidos, nutrientes e electrólitos. Tais preparações também podem conter agentes conservantes e outros aditivos, tais como antibióticos e antioxidantes. Os medicamentos contidos em grandes ampolas para administração por via i.v. podem conter um carboxifullereno, aqui descrito, até à concentração de 10 mg/mL (10 000 mg/litro). Os medicamentos para administração por via i.v. por gotejamento contêm um carboxifullereno, aqui descrito, numa concentração compreendida preferencialmente entre cerca de 50 mg/litro e cerca de 500 mg/litro.

De acordo com a presente invenção, os carboxifullerenos aqui descritos são úteis quando administrados por meios orais farmaceuticamente aceitáveis. Estes medicamentos contêm o referido composto associado a um veículo compatível e aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. É possível utilizar qualquer veículo convencional. São admissíveis todas as formas convencionais de dosagem por via oral, tais como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos e não só. O veículo pode ser um material orgânico ou inorgânico inerte conveniente para administração oral. Os veículos convenientes são seleccionados entre água, gelatina, goma-arábica, lactose, amido, estearato de magnésio, talco, óleos vegetais, polietileno-glicóis, geleias de petróleo e não só. Além disso, o medicamento pode conter outros agentes activos sob o ponto de vista farmacêutico. Como aditivos complementares refere-se os seleccionados entre agentes aromatizantes, conservantes, estabilizadores, agentes emulsionantes, tampões e quejandos, que podem ser acrescentados em conformidade com as práticas geralmente aceites de formulação de composições farmacêuticas. 7£f 8

Segundo uma forma preferida de dosagem oral, são utilizados comprimidos, cápsulas de gelatina dura ou mole, metil-celulose ou qualquer outro material conveniente que se dissolva facilmente no tracto digestivo. As doses orais previstas no âmbito da presente invenção irão variar consoante as necessidades de cada paciente, conforme determinado pelo médico assistente. As formas preferidas de dosagem oral são as cápsulas ou os comprimidos que contenham entre 50 mg e 500 mg de um carboxifullereno útil, em conformidade com a presente invenção.

Ao levar à prática a presente invenção, administra-se a um adulto, em geral diariamente, um composto útil, de acordo com a invenção, de preferência pelas vias oral ou intravenosa, numa quantidade compreendida entre cerca de 1,5 mg/kg e cerca de 1500 mg/kg por dia, em doses singulares ou divididas, e de preferência compreendidas entre cerca de 10 mg/kg e cerca de 60 mg/kg por dia, sendo o doseamento exacto determinado em função das carências de cada paciente. Em geral, a terapia decorre ao longo de um período de cerca de 3 meses. Em alternativa, o método da presente invenção pode ser praticado profilacticamente durante um período indefinido em pacientes para os quais haja um risco elevado de virem a ser vítimas de fenómenos neurotóxicos agudos, tais como um colapso. Para o tratamento de uma ocorrência neurotóxica aguda, o paciente deve ser tratado, de acordo com o método da invenção, tão cedo quanto possível após o diagnóstico da ocorrência neurotóxica aguda, de preferência nas 12 horas subsequentes e mais preferencialmente nas 6 horas imediatas, logo após o início do fenómeno neurotóxico.

As figuras 1 a 11 ilustram a invenção mais minuciosamente. A figura 1 ilustra estruturas de hexacarboxifúllereno, C6o(C(COOH)2)3, nas formas dos seus isómeros 0-3a e R-3b.

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A figura 2 representa o espectro do éster malónico de C6o(C(COOH)2)3 purificado (enantiómero 0-3a), obtido por espectroscopia de RMN do protão. A figura 3 mostra o espectro do éster malónico de C6o(C(COOH)2)3 purificado (enantiómero 0-3a), obtido por éspectrometria de massa por bombardeamento atómico rápido. A figura 4 mostra os espectros de ressonância paramagnética do electrão que demonstram a actividade abluente de radicais livres, típica do espectro do éster malónico de C6o(C(COOH)2)3 purificado (enantiómero 0-3a), em presença de H202 (A: caso não tratado; B: caso tratado com o enantiómero 0-3a) e em presença do radical superóxido 02‘ (C: caso não tratado; D: caso tratado com o enantiómero 0-3a; E: caso tratado com o enantiómero R-3b). As setas apontam para um sinal espúrio gerado com um contaminante na cavidade de RPE. A figura 5 traduz a neurotoxicidade produzida pela exposição de neurónios, criados em cultura, ao composto NMDA, sem tratamento e com três concentrações de CeoíCXCXXMÍ)^. A figura 6 traduz a neurotoxicidade produzida pela exposição de neurónios, criados em cultura, ao composto AMPA, sem tratamento e com quatro concentrações de CôoÍQCOOH)^.

A figura 7 corresponde à acumulação do indicador iónico 45Ca2+, estimulada pelo composto NMDA 6111 neurónios criados em cultura com e sem a co-aplicação de Cõo^COOHEA A figura 8 traduz a morte apoptótica de células neuronais, produzida em culturas deficientes em células gliais por falta de soro, sem tratamento e com duas concentrações de C60(C(COOH)2)3. A figura 9 ilustra os espectros de RPE que permitem comparar a actividade abluente de radicais livres correspondente a dois isómeros de C6o(C(COOH)2)3. A figura 10 ilustra uma comparação de dois isómeros de C60(C(COOH)2)3, em tennos de protecção de neurónios contra lesões produzidas pela morte neuronal induzida pelos

10 compostos NMDA (A) e AMPA (B). Ilustra ainda os espectros de RPE de lípidos (os ácidos 5- ou 16- doxil-cetosteáricos) marcados ionicamente (C), incorporados nos lípidos do cérebro do rato, mais qualquer um dos dois isómeros de C6o(C(COOH)2)3. A figura 11 traduz as curvas de sobrevivência de murganhos FALS tratados com mini-bombas osmóticas intraperitoniais que continham um soluto salino ou carboxifullereno, à razão de 15 mg/kg/dia.

Os dados aqui apresentados demonstram que os carboxifúllerenos descritos constituem uma classe nova de antioxidantes com capacidade para realizarem a abluição de inúmeros radicais livres oxigenados e demonstram também que estes compostos possuem invulgares capacidades neuroprotectoras, amplas è poderosas, atenuando a morte neuronal, devida à excitotoxicidade do glutamato, e a apoptose.

Exemplos

Soluções O meio de reserva que serviu de fonte (MF) foi o meio essencial mínimo de Eagle com glicose 25 mM sem L-glutamina. O meio para revestimento foi o MF enriquecido com L-glutamina (2 mM), 5% de soro fetal de vitelo e 5% de soro de cavalo. O meio de crescimento continha o MF, 10% de soro de cavalo e L-glutamina 2 mM. A rápida exposição ao composto NMDA foi efectuada em solução salina equilibrada e tamponada com HEPES a pH 7,0 (SSETH, o mesmo que HEBSS), contendo NaCl 116 mM, KC1 5,4 mM, MgSC>4 0,8 mM, NaP04 1,8 mM, HEPES 12 mM, NaHC03 25 mM, D-glicose 5,5 mM e L-glicina 10 M. 11 A solução salina equilibrada (SSE, o mesmo que BSS) era constituída por NaCl 116 mM, KC15,4 mM, MgS04 0,8 mM, NaP04 1,8 mM, NaHC03 26,2 mM e D-glicose 5,5 mM. O isómero original de C6o(C(COOH)2)3 foi o isómero 0-3a que é o produto principal da síntese. Preparou-se uma reserva deste composto sob a forma de uma solução 25 mM em água. Estas soluções de reserva foram utilizadas nas 72 horas subsequentes à sua preparação e foram guardadas à temperatura de -20°C e ao abrigo a luz.

Dissolveu-se em tolueno o composto C® para se preparar uma solução de reserva 50 mM.

Culturas de Células Corticais

Procedeu-se à preparação de culturas neurocorticais de murganho, sob a forma de co--culturas de neurónios-astrócitos (aproximadamente 50% de astrócitos) (Rose et al, 1992) ou sob a forma de culturas neuronais (< 2% de astrócitos). Foram utilizados embriões de murganho (com 15 dias de gestação) que foram retirados de fêmeas de murganho grávidas, da estirpe Swiss-Webster, devidamente anestesiadas, tendo os neocórtices sido dissecados e separados das restantes estruturas cerebrais. Após uma rápida incubação em tripsina efectuou-se o desmembramento das células por trituração e depois diluiu-se a suspensão celular em meio de revestimento que foi aplicado sobre placas de cultura de tipo ‘Plastek’ de 24 cavidades previamente preparadas, recobertas com poh-D-hsina/laminina (para as culturas neuronais), ou aplicado sobre um leito existente de astrócitos (para as co-culturas). Decorridos 1-2 dias in vitro, efectuou-se uma substituição parcial com meio condicionado com células ghais, para as culturas neuronais “puras”, e acrescentou-se citosina-arabinosido (3μΜ) imediatamente a seguir à alimentação para inibir a proliferação gliai. As culturas mistas acrescentou-se, duas vezes por semana, meio de crescimento até aos 11-12 dias in vitro, altura em que se

acrescentou MF isento de soro e contendo L-glutamina 2 mM. Salvo quando especificado de outra forma, as células foram utilizadas ao fim de 14-16 dias in vitro.'

Exemplo 1 Síntese e propriedades dos carboxifullerenos (ácidos 2.2-fulleromalónicos)

Acrescentou-se 1 g de éster dietil-2,2-fulleromalónico C<so (1,39 mmol) a 1000 mL de tolueno recentemente destilado e agitou-se durante alguns minutos para se obter uma solução límpida cor-de-violeta. À solução agitada acrescentou-se gota a gota 0,474 mL (2,78 mmol) de bromomalonato de dietilo. A adição de 0,526 mL (3,475 mmol) de DBU (1,8-diazobi-ciclo[5,4,0]-undeca-7-ona) à solução de fullereno fez com que a cor mudasse de violeta para vermelho escuro. Depois de se ter agitado de um dia para o outro ao ar e à temperatura ambiente, filtrou-se a solução para se remover os sais de amónio e evaporou-se o solvente in vácuo. Dissolveu-se o resíduo num pequeno volume de clorofórmio e verteu-se na parte de cima de uma coluna de gel de sílica (o material de acondicionamento era um gel de croma-tografia intermitente da Merk, de malha 70-230 ou de malha 230-400). Efectuou-se a eluição dos fullerenos utilizando um gradiente a variar desde tolueno/hexano (1:1) até tolueno (100%). A eluição inicial proporcionou cinco fracções: fullereno que não reagiu, monoaductos, bisaductos, trisaductos e poliaductos. Removeu-se o solvente de cada fracção in vácuo e repetiu-se o procedimento de cromatografia do resíduo sólido, até ficar puro. Cada uma das fracções que continham os bisaductos e os trisaductos deu origem a dois produtos principais ao ser efectuada nova separação. Ácidos 2,2-fulleromalónicos. Sob uma atmosfera de azoto dissolveu-se em 50 mL de tolueno as amostras que continham os isómeros singulares dos aductos ésteres (100 mg).

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Acrescentou-se então um excesso molar de NaH a 20:1. Depois de se ter agitado durante 2 a 3 horas a 100°C acrescentou-se gota a gota 1 mL de metanol à solução quente, produzindo uma vigorosa libertação de gás. Ocorreu simultaneamente a precipitação quantitativa de sal sódico. Recolheu-se o sal por centrifugação e secou-se in vácuo. O composto seco foi então lavado com H2SO4 2 M e depois com água. Secou-se o produto, representando o derivado de ácido malónico do éster correspondente, in vácuo de um dia para o outro para se obter um fino pó castanho.

Submeteu-se a espectroscopia de massa uma amostra que continha o enantiómero 0-3a do éster de fullereno com trisaductos; depois realizou-se a hidrólise deste éster e acidificou-se para proporcionar 0 composto carboxifullereno final, C6o(C(COOH)2)3. A RMN do protão e os espectros de massa (respectivamente nas figuras 2 e 3) do éster Qo purificado indicam que amostra contém um isómero singular de éster 2,2-fulleromalónico (O-enantiómero com massa = 1194-1195) com uma pequena quantidade de C6o (massa = 720) com origem eventualmente na fragmentação do aducto. Os resultados obtidos com 0 composto original, o enantiómero 0-3a, são aqui descritos. Estudos mais recentes, efectuados com 0 outro enantiómero, o R-3b, indicam que também é um neuroprotector eficaz.

As soluções de carboxifullereno eram castanhas e translúcidas. No entanto, uma solução concentrada (50 mM) através de filtros de ‘nylon’ com poros de 0,45 pm não deixou nenhum resíduo sobre os filtros, significando que era uma solução genuína. Experiências de contraprova permitiram confirmar que os compostos não interferiam com 0 ensaio colorimétrico de LDH. As soluções de carboxifullerenos com concentrações até 25 mM não conseguiram alterar 0 pH das soluções experimentais. 14

Exemplo 2

Toxicidade excitatória dos aminoácidos e aplicação de fúllerenóis

Por meio de espectroscopia de ressonância paramagnética do electrão comprovou-se que os compostos C<5o(C(COOH)2)n constituem poderosos abluentes de radicais livres, capazes de eliminar simultaneamente os radicais hidroxilo e superóxido. A figura 4 mostra os espectros A-E, obtidos por RPE, que demonstram a actividade abluente de radicais livres manifestada pelos compostos C6o(C(COOH)2)3. Os espectros A e B mostram respectivamente o radical hidroxilo (aducto iónico: DMPO-OH) gerado por H2O2 durante um período de 15 minutos e a eliminação deste sinal do radical OH quando 0 isómero 0-3a 150 M foi incluído conjuntamente com 0 composto H2O2. O radical superóxido (02(~) também foi eficientemente abluído pelos compostos C6o(C(COOH)2)n. O radical 02(', que forma 0 aducto iónico DMPO-OOH, foi gerado por incubação de xantina-oxidase com xantina (espectro C). A co-incubação com 40 M de isómero 0-3a ou com 40 M de isómero R-3b eliminou 0 sinal do radical superóxido (espectros D e E respectivamente). A análise por RPE, efectuada sobre os outros compostos C6o(C(COOH)2)„ solúveis em água, com n= 1 ou 2, confirmou que também eram abluentes eficazes de radicais livres (dados não apresentados). O composto hexacarboxilado, C6o(C(COOH)2)3, que é solúvel em água pelo menos até à concentração de 50 mM, protegeu os neurónios corticais contra as lesões excitotóxicas produzidas por exposição ao composto N-metil- D-aspartato (NMDA) e ao ácido amino-3--hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propiónico (AMPA). Os derivados de fullereno dicarboxilados e tetracarboxilados foram menos solúveis em solução aquosa e revelarem ser neuroprotectores menos eficazes do que o derivado hexacarboxilado, apesar de possuírem actividade neuro-protectora. 15 O carboxifullereno (3-300 Μ) foi co-aplicado a co-culturas de neurónios-astrócitos, descritas supra, com o composto NMDA para avaliação da neuroprotecção. Efectuou-se uma rápida exposição a composto NMDA na presença de carboxifullereno por tripla substituição do meio com SSETH, seguindo-se a adição de NMDA em concentrações entre 50 μΜ e 500 μΜ mais carboxifullereno durante 10 minutos. Removeu-se o composto NMDA e o carboxifullereno mediante uma quadrupla substituição do meio por MF, tendo as culturas sido colocadas numa incubadora humidificada em atmosfera contendo 5% de CO2 e à temperatura de 37°C durante 245 horas, momento em que se efectuou a avaliação dos danos neurotóxicos.

Normalmente utiliza-se uma exposição prolongada (24 horas) ao composto AMPA em concentrações compreendidas entre 5 - 100 M para induzir danos neuronais corticais. Num outro conjunto de experiências co-aplicou-se carboxifullereno (3-300 M) às co-culturas de neurónios-astrócitos descritas supra, com 0 composto AMPA, para avaliação da neuroprotecção. Depois de 0 meio ter sido trocado duas vezes por MF, acrescentou-se o composto AMPA e o carboxifullereno e recolocou-se as culturas novamente na incubadora a 37°C. Conjuntamente com 0 composto AMPA e com 0 carboxifullereno incluiu-se o antagonista do receptor de NMDA, a substância MK-801 (10 M), para eliminar a activação secundária dos receptores de NMDA por libertação do glutamato endógeno.

Avaliou-se a morte neuronal decorridas 24 horas após a administração de NMDA ou AMPA por microscopia de contraste de fase a 200-400 X e por m edição do efluxo de lactato--desidrogenase (LDH) a partir das células moribundas, dentro do meio do banho (Koh e Choi, 1987). A quantificação da morte celular foi confirmada em determinadas experiências por contrastação com o corante azul-de-tripano ou com o corante iodeto de propídio e por contagem do número de células.

Os resultados obtidos com C6o(C(COOH)2)3 estão ilustrados nas figuras 5 e 6. O composto C6o(C(COOH)2)3 demonstrou uma robusta neuroprotecção contra os danos neuronais excitotóxicos induzidos pelos compostos NMDA (figura 5) e AMPA (figura 6). O composto C6o(C(COOH)2)3 (300 M) reduziu a morte neuronal induzida pelo NMDA pelo menos em 60% em todas as experiências efectuadas até ao momento presente e proporcionou uma protecção quase completa em algumas experiências. Subtraiu-se a quantidade de LDH presente nas contraprovas lavadas para se obter o sinal específico para a toxicidade do NMDA. Os dados estão apresentados em termos de percentagem de células mortas produzidas apenas pelo composto NMDA: esta exposição aniquilou 51 (9%), 44 (6%) e 88 (14%) dos número total de neurónios por cultura. Estes resultados são valores médios ±D.P.* = p<0,05) em presença de NMDA, em conformidade com o teste ‘ANOVA’ a que se seguiu o teste de Student-Newman-Keuls para comparações múltiplas. Os dados agrupados a partir destas três experiências (figura 5) demonstraram uma redução de 75% da morte celular neuronal. O composto C6o(C(COOH)2)3 reduziu a morte celular neuronal induzida pelo AMPA em mais de 80%, para uma concentração de 100 M (figura 6). Conjuntamente com o composto AMPA incluiu-se a substância MK-801 (10 M) para eliminar a activação secundária dos receptores de NMDA, por acção do glutamato endógeno libertado. Os valores obtidos são médias ± D.P. para n=3-4/experiência, tendo sido reunidos os dados obtidos em quatro experiências. Os dados estão apresentados sob a forma de percentagem do número de células mortas apenas com AMPA/MK-801, representando 40-70% da totalidade de neurónios/cultura. * = p<0,05 em presença de AMPA, determinado por meio do teste ‘ANOVA’ a que se seguiu o teste de Student-Newman-Keuls para comparações múltiplas. 17

As experiências aqui descritas são, tanto quanto é do nosso conhecimento, a primeira utilização destes compostos enquanto agentes citoprotectores ou enquanto agentes antioxidantes.

Exemplo 3

Experiências com o marcador iónico Ca2"

Para se verificar que a protecção contra as lesões celulares neuronais induzidas pelo composto NMDA não era devida a uma redução no influxo do cálcio induzido pelo NMDA, foram realizados estudos com o marcador iónico Ca2+. Efectuou-se a lavagem das culturas duas vezes com SSETH, tendo sido depois expostas ao composto NMDA (300 M), por si só ou conjuntamente com o composto Côo(C(COOH)2)3, em SSETH contendo o marcador iónico Ca2+ (0,5 Ci/cavidade de cultura; NEN, Boston, MA). A exposição terminou ao fim de 10 minutos, substituindo o meio quatro vezes com SSETH não marcado, a que se seguiu a citólise por adição de 0,2% de dodecil-sulfato de sódio (DSS). As células permaneceram em DSS durante 2 horas e depois transferiu-se o Usado para frascos de cintilação. Juntou-se a cada frasco o produto de outras lavagens de cada cavidade de cultura com DSS, efectuando-se subsequentemente a contagem.

Os resultados apresentados na figura 7 demonstram que os carboxifullerenos não são antagonistas dos receptores de NMDA. A acumulação de 45Ca2+ não foi afectada pela co--aphcação do composto C6o(C(COOH)2)3 numa concentração até 300 M conjuntamente com o composto NMDA. Subtraiu-se o 45Ca2+ basal a todas as condições observadas para se obter o aumento específico de 45Ca2" para activação do receptor de NMDA (média ± D.P. para n = 4). 18

Exemplo 4

Morte neuronal apoptótica por falta de soro

Os neurónios corticais em culturas com falta de células gliais sofrem morte celular apoptótica decorridas 24-48 horas após a remoção do soro, conforme caracterizado pelas mudanças morfológicas, tais como a contracção das células do corpo, a fragmentação dos processos neuronais e a condensação da cromatina pelo método de contrastação ‘Hoechst 33258’ (Dugan et al, 1995). A morte neuronal apoptótica devida à falta de soro também foi atenuada pela co-aplicação de hexacarboxifullereno. Comprovou-se que esta lesão tinha particularidades típicas da apoptose, incluindo a fragmentação do ADN, a acumulação de cromatina, a contracção celular, a formação de corpos apoptóticos e a protecção por inibidores de síntese macromolecular. Os neurónios corticais em culturas que continham menos de 1% de astrócitos foram privados de soro por substituição do meio de crescimento, que continha soro, por uma solução salina equilibrada e enriquecida com aminoácidos (com excepção da glutamina). As substâncias de contraprova lavadas foram recolocadas no meio que continha 2% de soro fetal de bovino e 2% de soro de cavalo em SSE. Decorridas 24 e 48 horas foram obtidas fotografias das células utilizando para tal um microscópio invertido da Nikon, equipado com um sistema óptico de contraste de fase com uma amplificação de 100-400 X.

Além disso, determinou-se a morte das células neuronais decorridas 48 horas após a remoção do soro, mediante a contagem das células que já não eram capazes de excluir o corante azul-de-tripano. Conforme se observa na figura 8, a morte das células neuronais, determinada ao fim de 48 horas após o início da falta de soro, mediante a contagem das células que já não eram capazes de excluir o corante azul-de-tripano, permitiu concluir que havia uma redução significativa na morte neuronal. As células tratadas com o composto C6o(C(COOH)2)3 na

concentração 10 M revelaram a existência de uma redução de 50% na morte neuronal. Nas culturas de contraprova lavadas, mantidas no meio que continha o soro, não houve praticamente morte celular. Os valores são médias ±D.P. para n=3-4/experiências. Esta situação é representativa de três experiências. * = p<0,05 com falta de soro, conforme determinado pelo teste ‘ANOVA’ a que se seguiu o teste de Student-Newman-Keuls para comparações múltiplas.

Exemplo 5 A localização polar dos grupos carboxilo em Gg melhora a eficácia neuroprotectora

Foram sintetizados dois regioisómeros de C6o(C(COOH)2)3, isto é, 0-3a e R-3b, e purificados em conformidade com o método de Lamparth e Hirsch (Lamparth e Hirsch, (1990)). A pureza destes compostos foi confirmada por análises espectrais de RMN e de UV/luz visível. No composto 0-3a, todas as pontes de metano estão em posições equatoriais, umas relativamente às outras (e,e,e) e a molécula possui simetria em C3 conforme demonstrado por espectroscopia de ressonância magnética de H e de C. O composto R-3b possui pontes de metano que se situam numa cintura ao longo do equador, em tomo do eixo triplo da estrutura Côo nas posições trans-3 (transo, trans-3, trans-3), e possui simetria em D3. As estruturas 3-D representadas na figura 1 ilustram a distribuição polar dos grupos carboxilo no composto 0-3a e a distribuição equatorial dos grupos carboxilo no composto R-3b. A figura 9 mostra que estes dois isómeros, sob 0 ponto de vista químico, demonstraram possuir capacidades idênticas para abluir os radicais livres *OH e 02*”, conforme inferido a partir dos espectros de neutralização do momento total/RPE. A figura 9 ilustra os espectros de RPE dos radicais *OH (a partir de H202 100 μΜ em Fe2+, pela reacção de Fenton) e 02*“ (a partir de xantina + xantina-oxidase), utilizando como agente de neutralização do momento

20 total o composto 5,5-dimetil- 1-pirrolina-N-óxido 100 mM (DMPO). Radical hidroxilo (espectros das esquerda): *OH na presença de DMPO por si só (parte superior), na presença do composto O--3a 4 μΜ (pare do meio), ou na presença do composto R-3b 4 μΜ (parte de baixo). Radical superóxido (direita): 02*~ em DMPO por si só (parte de cima), na presença do composto 0-3a 400 μΜ (parte do meio), na presença do composto R-3b (400 M (parte de baixo). A seta indica um sinal espúria devido a um radical desconhecido que contaminou a cavidade. A amostra foi analisada numa célula de quartzo plano (60 x 10 x 0,25 mm) num espectrómetro de RPE de modelo ‘Bruker 200’ a trabalhar na banda X. Foram feitas as seguintes regulações: potência = 1,6 mW, modulação = 1 G, modulação de campo = 100 Hz, R.G. = 3,2x1o3.

Os resultados da RPE demonstraram que qualquer dos isómeros 0-3a e R-3b constitui um abluente extremamente poderoso do radical *OH para concentrações 100 a 1000 vezes inferiores às indicadas para a maior parte dos outros abluentes de radicais livres. A capacidade de abluição do carboxifúllereno, no que diz respeito ao radical ΌΗ, é 10 vezes maior do que a sua potência para os radicais 02

Embora os isómeros 0-3a e R-3b sejam antioxidantes equipotentes, conforme comprovado por análise por RPE, verificou-se que o composto 0-3a era biologicamente mais eficaz do que o composto R-3b contra lesões em que intervieram os receptores de NMDA e de AMPA. Estes resultados estão ilustrados na figura 10. A figura 10 demonstra que o composto 0-3a permitiu obter uma protecção ligeiramente melhor contra as lesões produzidas por aplicação do composto NMDA (A), mas proporcionou uma protecção bastante melhor contra a morte neuronaí induzida pelo composto AMPA (B). Os valores são apresentados sob a forma de média ± D.P. para n = 8-12 para todas as condições. * = p<0,05 comparativamente com o caso de lesões não tratadas, utilizando para tal o teste ‘ANOVA’ a que se seguiu o teste de 21

Student-Newman-Keuls para comparações múltiplas. ** = p<0,05, sendo os resultados obtidos com o composto R-3b diferentes dos obtidos com o composto 0-3a. A figura 10 também ilustra os espectros de RPE para lípidos marcados ionicamente (C) (ácidos 5- ou 16-doxil--cetosteáricos) incorporados nos lípidos do cérebro de murganhos, mais qualquer um dos compostos 0-3a ou R-3b. Os marcadores tónicos foram acrescentados aos lípidos extraídos do cérebro de murganhos adultos, à razão de 1:100. Os ajustamentos para a RPE foram idênticos aos indicados nas legendas da figura 9. Os dois isómeros produziram um desvio no parâmetro de ordem (S) do grupo 5-doxilo, mas o composto 0-3a produziu um alteração maior em S (quadro 1). O composto 0-3a também alterou o sinal de estado líquido gerado pelo ácido 16-doxil-cetosteárico muito mais do que o composto R-3b, indicando isso que o composto 0-3a aumentou a desorganização ou a fluidez, dos lípidos (quadro 1). Ambos os resultados sugerem que o composto 0-3a penetra na bicamada lipídica muito mais do que o composto R-3b.

Para além da sua maior actividade em termos de protecção dos neurónios contra as lesões em que intervêm os receptores de NMDA e de AMPA, o composto 0-3 a proporcionou uma maior protecção, comparativamente com o composto R-3b, contra tais danos em culturas de células endoteliais e nos hepatócitos. Esta diferença ficou a dever-se aparentemente à capacidade do isómero 0-3 a para penetrar nas membranas muito mais do que o composto R-3b. A polaridade do composto 0-3a permite-lhe penetrar na membrana celular mais facilmente. Esta capacidade para se intercalar nas membranas leva a admitir que o composto 0-3 a possa conferir às membranas celulares melhor protecção do que o composto R-3b contra a peroxidação dos lípidos. Assim sendo, a localização dos grupos funcionais (polar ou perimétrica) é importante para a eficácia protectora dos derivados de Côq. 22

Quadro 1 - Parâmetros membranares obtidos em experiências de marcação iónica/RPE

Composto Parâmetro de ordem3 Período de correlacãob Factor de repartição das fases lipídica/aauosac 0-3a 0,84 ±0,01 5,7 ± 0,5 ns 1,0 ±0,2 R-3b 0,86 4,5 0,6 Contraprova 0,88 5,1 0,8 a parâmetro de ordem, S = a(T/’-T/)/(T/-Tx) em que o símbolo T/ é separação hiperfina medida para a orientação paralela no marcador iónico do ácido 5-doxil-esteárico/fosfolípidos e o símbolo T/ é a separação para a orientação perpendicular. Admitiu-se que era a = 1 e T/T^ = 25 G, b Período de correlação, τς = 6,5 x IO'10 w0[(ho/h-i)-l], em que o símbolo w0éa largura da linha de campo médio em Gauss e os símbolos ho e h.i identificam respectivamente as alturas máximas das linhas de campo médio e de campo intenso na primeira adsorção derivada, medida para o ácido 5-doxil-esteárico c Factor de repartição entre fases lipídica/aquosa, f = hL/hA em que os símbolos hL e hA indicam respectivamente as alturas máximas das fases lipídica e aquosa medidas para o ácido 16--doxil-esteárico. Para efeitos de uma comparação válida utilizou-se 1/2 da altura total hA.

Exemplo 6

Efeito dos carboxifullerenos sobre a sobrevivência, no modelo transgénico de esclerose lateral amiotrófica (ELA)

Um em cada 10 000 indivíduos desenvolve ELA, que é a causa de morte mais vulgar devida a uma doença nos neurónios motores. A forma familiar da doença (FELA) é

23 normalmente autossómica dominante, constituindo entre 10% e 15% dos casos. Em 1993, um surto crítico permitiu identificar mutações no gene de Cu,Zn-SOD {sodt) em determinadas famílias com FELA (Rosen et ai, 1993) e um trabalho subsequente levou a formular a hipótese de que a ELA pode ser devida a uma maior produção de espécies oxigenadas reactivas (EOR) pelo mutante SOD1 em certas formas de FELA.

Gumey e seus colaboradores criaram murganhos portadores da mutação pontual G^A observada em famílias padecentes de FELA (Gumey et al, 1994), tendo a linhagem G1 de murganhos transgénicos G93A demonstrado muitas das particularidades da FELA dos seres humanos. A linhagem Gl, com 18 cópias e quatro vezes a actividade do SOD dos animais de fenótipo natural, desenvolve um processo de morte dos neurónios motores por volta dos 34 meses de idade, com fraqueza das patas traseiras, vivacidade natural comprometida e emagrecimento ao longo dos seus flancos. Os murganhos afectados morreram antes das 5 semanas de idade (Gumey et al, 1994).

Utilizou-se o composto Cóo(C(COOH)2)3 para tratar ratos que padeciam de FELA (estirpe GI de Gumey), com a finalidade de se determinar a sua capacidade para tratar a FELA. Às 10 semanas de idade, implantou-se nos animais intraperitonialmente minibombas osmóticas de Alzet (28° dia, 6 (1/dia, 15 mg/kg/dia) que continham o produto Côo(C(COOH)2)3 (uma mistura de isómeros constituída por mais de 90% do isómero 0-3 a) ou então um soluto salino. As bombas foram substituídas às 14 semanas de idade. Realizou-se um registo de imagem em fita magnética relativo às deslocações dos animais em campo aberto e efectuou-se uma classificação utilizando para tal a escala de Bresnahan para lesões da medula espinal (Basso et ai, 1995). Conforme descrito por Gumey e seus colaboradores, estes animais desenvolveram sintomas motores aproximadamente aos 90 dias de idade e encontravam-se moribundos entre o 125° dia e o 145° dia de idade. 24 A figura 11 mostra as curvas de sobrevivência de murganhos que padeciam de FELA e que foram tratados com as minibombas osmóticas implantadas intraperitonialmente que continham soluto salino ou carboxifullereno, à razão de 15 mg/kg/dia.. Os resultados obtidos demonstram que o grupo tratado com C6o(C(COOH)2)3 revelou um atraso de 8 ± 2,2 dias em relação à data da morte, sendo p = 0,041 conforme confirmado pelo teste ‘t\ Os murganhos que padeciam de FELA e que foram tratados com C6o(C(COOH)2)3 também demonstraram a existência de um atraso relativamente ao inicio do aparecimento dos sintomas. O aumento de 8 dias no período de sobrevivência tem significância estatística (p = 0,041), conforme comprovado pelo teste ‘t\ Não houve nenhuma diferença em termos de sobrevivência no caso dos murganhos que padeciam de FELA e aos quais não foram aplicadas nenhumas bombas (123 dias, n = 4) ou naqueles que foram tratados com bombas carregadas com soluto salino (125 dias, n = 6). Além disso, os animais de fenótipo natural (n = 6) tratados durante 2 meses com carboxifullereno (15 mg/kg/dia) não apresentaram nenhuns efeitos adversos em termos comportamentais ou em termos de saúde - tais animais revelaram ser tão activos quanto os outros animais não tratados e os seus pesos eram idênticos (para os animais do mesmo sexo)

Claims (3)

1 Reivindicações 1. Utilização de derivados carboxilados de fórmula geral C6o(C(COOH)2)„ I, em que o substituinte Côo é um radical buckminsterfullereno e o símbolo n representa um número compreendido entre 1 e 4, e também dos seus sais, ésteres e amidas farmaceuticamente aceitáveis, para a preparação de medicamentos para controlar ou tratar doenças provocadas por espécies oxigenadas de radicais livres, libertadas pelos neurónios devido à estimulação dos receptores de NMDA por acção do glutamato.

2. Utilização dos compostos de fórmula geral I de acordo com a reivindicação 1, em que as doenças em causa são os danos neurotóxicos, tais como os fenómenos neurológicos agudos de tipo hipoxia/isquémia, que podem ocorrer durante colapsos, situações de hipoglicémia, epilepsia ou doenças neurodegenerativas, por exemplo, a doença de Huntington, a doença de Alzheimer, a esclerose lateral amiotrófica (ELA) e os efeitos neurodegenerativos da SIDA.

3. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que na fórmula gerallén = 3.