PT89325B

PT89325B - Processo para a preparacao de um hidrolisado de proteinas de lacto-soro e de um alimento hipoalergenico

Info

Publication number: PT89325B
Application number: PT89325A
Authority: PT
Inventors: Rolf Jost; Niklaus Meister; Julio Cesar Monti
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1987-12-23
Filing date: 1988-12-22
Publication date: 1993-08-31
Also published as: ZA889280B; PH26140A; DE3877733T2; ES2053690T3; AU2659688A; US5039532A; MX169602B; AU613684B2; JPH0677504B2; PT89325A; EP0321603A1; JPH022319A; CA1334064C; DE3877733D1

Description

DESCRIÇÃO

A presente invenção tem por objecto a preparação de produtos alimentares com alergenicidade reduzida.

É sabido que os fenómenos de alergia ao leite de vaca e aos leites adaptados às necessidades das crianças gue o contêm são devidos ao facto das proteínas do leite de vaca de origem lacto-sórica diferirem das proteínas do leite maternal e poderem constituir alergéneos. Entre estes, os principais alergéneos reconhecidos são na maior parte alfalactalbumina (aLA) e a betalactoglobulina (bLG), e em menor importância as imunoglobuminas (em particular IgC) e a soroalbumina (BSA).

Tentou-se eliminar a sua alergenicidade trans- 1 formando-as em péptidos por hidrólise.

De acordo com a patente dos Estados Unidos n²4 293 571, prepara-se um hidrolisado de proteínas por hidrólise pancreática, coagulam-se as proteínas não hidrolisadas por meio de um tratamento térmico, em seguida submete-se o hidrolisado a uma ultra-filtração de forma a eliminar as proteínas residuais coaguladas e os macropéptidos que poderiam constituir os alergénios.

Propôs-se igualmente, por exemplo de acordo com Blatt e coli., Anal. Biochem. 22 : 161-165 ou o pedido de patente europeia N² 22 019, efectuar-se a hidrólise das proteínas lacto-sóricas directamente numa instalação de ultra-filtração e recolher os péptidos à medida que eles se formavam. Num tal reactor de membrana, as proteínas não hidrolisadas permanecem na parte retida que é reciclada para o compartimento de hidrólise para serem de novo hidrolisadas. Parece que, mesmo nestas condições, não é praticamente possível hidrolisar completamente todas as proteínas do lacto-soro. A soroalbumina por exemplo acumula-se num reactor de hidrólise. As diferentes espécies de imunoglobuminas resistem igualmente à hidrólise pelos enzimas pancreáticos e não se decompoem senão parcialmente. Os grandes fragmentos ou macropéptidos obtidos por hidrólise da imunoglobumina do colostro bovino (IgC) pela tripsina ou pela papaina mantêm o essencial da alergenicidade do IgC.

Em resumo, admite-se que não é suficiente degraa aLA e a bLG, porque a BSA e a IgC constituem alergéneos para o homem e foram descritos como tal. Com os processos de separação física conhecidos, perdem-se as proteínas menos importantes de alto valor nutricial.

A invenção tem por objectivo proporcionar um processo para a preparação de um hidrolisado de proteínas de leite animal praticamente isento de alergéneos de origem pro-

teíca, no qual se hidrolisa enzimaticamente um produto lacto-sórico.

Assim o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo facto de se tratar termicamente o hidrolisado enzimático em solução aquosa a 80-100° C durante 3 a 10 min a um valor de pH de 6 a 8, e arrefecer-se o hidrolisado a 40-60° C, e em seguida submeter-se a uma segunda hidrólise com um enzima protéolitico de modo a hidrolisar as proteínas menos importantes que permanecem intactas após a primeira hidrólise, e em seguida desactivar-se o enzima termicamente .

Uma vantagem determinante do processo de acordo com a invenção é o de não ser necessário recorrer á eliminação de proteínas residuais de alto valor nutricial por separação física.

O hidrolisado obtido é particularmente destinado à alimentação de crianças com riscos de alergia ou de alergia adquirida.

Na presente descrição, o termo alergéneo significa proteína ou macropéptido susceptível de desencadear as reacções alérgicas em indivíduos, principalmente crianças ou bebés sensíveis. Considera-se que um hidrolisado ou um alimento contendo um tal hidrolisado é hipoalergénico quando não se pode detectar a presença de proteínas ou de grandes fragmentos ou macropéptidos de peso molecular superior a cerca de 10.000 pelos processos analíticos habituais, por exemplo por cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC), por electroforese de zona em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ou, quando os processos não permitem pôr em evidência os antígeneos proteicos ou macropeptídicos, pelos procesos imunológicos, por exemplo, por dupla imunodifusão (ID).

Para realizar o presente processo, pode-se

partir de qualquer hidrolisado enzimático de uma matéria prima lacto-sórica contendo proteínas de lacto-soro. Essa matéria prima pode ser um lacto-soro da indústria dos queijos, nomeadamente um lacto-soro doce como por exemplo o resultante de uma coagulaçao da caseína por pressão, um lacto-soro ácido proveniente da coagulação da caseína por um ácido ou fermentos acidificantes ou ainda um lacto-soro misto resultante de uma coagulação ácida e de pressão.

Esta matéria-prima pode ser um lacto-soro desmineralizado por permuta iónica e/ou electrodiálise. Pode ser um concentrado de proteínas de lacto-soro mais ou menos sem lactose, obtido por exemplo por ultrafiltração seguida se for o caso de uma diálise. A matéria-prima pode ainda ser uma combinação das matérias-primas anteriores e lactose. Pode apresentar-se na forma de uma solução aquosa, verdadeira ou coloidal, ou num pó. Neste último caso, dissolve-se o pó em água, de preferência desmineralizada, de forma a obter-se uma solução aquosa. A matéria-prima sofre uma hidrólise enzimática, pelos enzimas proteolíticos em mistura ou purificados, activos nos domínios básico e neutro, por exemplo a tripsina, quimotripsina ou a pancreatina de forma conhecida.

Pode-se praticar a hidrólise preliminar durante um tempo relativamente curto, de preferência de 5 a 35 min, por exemplo 10 min com uma pequena quantidade de enzima, por exemplo 10% da quantidade total utilizada na hidrólise, o que permite economizar o enzima. A hidrólise é assim parcial. Esta hidrólise pode ter lugar num reactor ou como variante num tubo.

No caso em que o substrato destinado a ser hidrolisado teria tendência para coagular no tratamento térmico, pode-se prever e adicionar um agente quelante como por exemplo o citrato de cálcio ou de magnésio, como indicado por exemplo na patente dos Estados Unidos N² 4 748 034.

De acordo com a invenção, o hidrolisado sofre um tratamento térmico, a 80-100° C durante 3 a 10 min a um valor de pH de 6 a 8. Bem entendido, a duração e a temperatura estão ligadas entre si, correspondendo o limite inferior da temperatura ao limite superior da duração e inversamente. Nos permutadores de calor industriais, verificou-se serem suficientes uma temperatura de cerca de 90° C e um tempo de residência de cerca de 5 min para realizar a desnaturação das proteínas menos importantes. Parece com efeito que esta desnaturação torna as proteínas acessíveis à degradação enzimática posterior. Convém mencionar que o tratamento térmico desactiva o enzima.

Arrefece-se em seguida o enzima a 40-60° C, de preferência a cerca de 55° C que constitui a temperatura óptima para a actividade hidrolítica e ajusta-se o pH de preferência a cerca de 7,5 por adição de uma solução aquosa de uma base.

As condiçoes da segunda hidrólise podem variar. Num primeiro modo de realização, conduz-se de maneira descontínua, por cargas numa cuba de reacção termoestatizada. Após ter adicionado o enzima proteolítico escolhido entre a tripsina, quimotripsina, pancreatina, mistura-se a tripsina e a quimotripsina em solução aquosa, e realiza-se a hidrólise durante 60 a 180 min.

Num segundo modo de realização, que é o preferido, a segunda hidrólise tem lugar em contínuo num tubo que constitui o reactor em regime turbulento, durante 1 a 60 min, de preferência durante 2 a 20 min. Nesta variante, de acordo com o seu comprimento, o tubo fornece o tempo de reacção necessário tendo em conta o caudal do produto a hidrolisar. Em consequência, o enzima deve ser bombeado em contínuo à entrada do tubo de espera. O regime de forte turbulência que daí resulta provoca um contacto rápido e intenso entre o enzima e o substrato.

Seja qual for a forma da realizaçao da segunda hidrólise, o produto da hidrólise sofre um tratamento térmico que provoca a desactivação do enzima. Este consiste em préaquecer o hidrolisado a uma temperatura superior ou igual a 75° C e de o manter a esta temperatura de preferência a 75-85° C durante cerca de 5 min, de forma a favorecer uma auto digestão do enzima e este tratamento é seguido com vantagem por uma esterilização, de preferência a temperatura ultra elevada, por exemplo 125-135° C durante 2-3 min, por injecção de vapor ou num permutador de calor.

hidrolisado pode ser em seguida seco por exemplo por pulverização ou por liofilização tendo em vista uma utilização posterior ou ser ainda tratado posteriormente. Neste último caso, a desactivação do enzima pode ser efectuada durante o tratamento térmico.

hidrolisado preparado de acordo com o proceso da invenção pode ser incorporado em numerosas preparações alimentares para uso dietético, nomeadamente em dietética infantil ou de convalescentes, ou em alimentos facilmente absorvíveis para a utilização de pessoas que sofram de alergias .

A invenção refere igualmente um processo para a preparação de um alimento hipoalergénico, caracterizado por se adicionarem ao hidrolisado hidratos de carbono, sais minerais e matérias gordas no estado liquido contendo, se for caso disso, vitaminas lipossolúveis, e adicionar-se, se for caso disso, uma solução aquosa contendo vitaminas hidrossolúveis e oligo-elementos, e em seguida secar-se.

Pode-se secar por liofilização, ou de preferência por pulverização.

Como variante, pode-se desactivar o enzima por esterilização a temperatura ultra elevada, e depois condi-

cionar-se o produto no estado liquido em vez de o secar.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção. Nestes, as partes e percentagens são, salvo indicação em contrário, expressas em valor em peso.

Nestes exemplos, as análises pelos métodos a seguir mencionados sao destinados a mostrar a ausência de proteínas ou de macropéptidos residuais após a segunda hidrólise:

1970, Nature indicadas a seguir:

I/SDS-PAGES; de acordo com Laemmli, U. K. específicas

227:680 e seguintes, nas condições

Parâmetro

Gel de concentração

Gel de separaçao

5,4

2,6

13,3

2,6

Dodecilsulfato de sodio (SDS,%), completado a 100% por adição de água destilada

0,1

0,1 pH

6,8

8,8

Dimensões das camadas de gel sobre as placas (mm)

02

X 0,5

Amostra (ug, calculada em azoto total Nt)

Intensidade da corrente (mA/placa)

Revelador: azul brilhante de coomassie G-250

Solução tampão de electrolorese : 0,025 M Tris, 0,19

M glicina, 0,1% SDS

Preparaçao das amostras: dispersam-se as amostras numa solução tampão aquosa contendo 1% de SDS e de ditiotreitol como agente redutor. Aquece-se rapidamente até 100° C Procede-se em seguida à alquilação por iodoacetamida em solução aquosa 2M de tampão Tris de pH 8 (18 mg em 0,1 ml de solução tampão). Em certos casos, coloca-se voluntariamente a redução e alquilação de modo a mostrar as proteínas no estado de nao reduzidas.

Sensibilidade: o método detecta cerca de 0,1 ug de proteínas BSA, aLA e bLG. O limite de deteção das cadeias H e L dos IgG e dos IgG intactos (não reduzidos) é mais elevada por causa do carácter difuso das bandas.

II/ID, de acordo com Outcherlony, o, Acta. Pathol. Microbiol. Scand. 26 : 507, nas condições experimentais específicas a seguir mencionadas:

Parametro

Solução aquosa de água

Géis de ágar

Diâmetro dos orifícios (mm)

Coloração dos géis lavados

Descoloração

Condiçoes

1,5% (peso/volume), ágar de tipo I de Calbiochem, em solução salina de tampão fosfato, pH 7,2 um filme fixador (produto LKB No 1850-102) coomassie brilhante azul R-250 numa solução etanol/água/ ácido acético (45/45/10, % volume/volume) <f fl Π

Método: a amostra não diluída é constituída por uma solução fisiológica salina de 100 mg/ml. Procede-se a diluições sucessivas de 2:1 e enchem-se os orifícios sucessivos, dum lado com a amostra, e de outro lado com ossoros específicos do coelho, respectivamente anti-bLG, anti-aLA, anti-BSA e anti-IgG, a uma concentração de 1/16 avos

da concentração inicial da amostra. A detecçao da proteína correspondente â reacção de precipitação antigéneo-anticorpo. Nota-se o primeiro título (expresso em fracção da concentração inicial) correspondente a uma ausência de reacção.

Sensibilidade do método: o limite de concentração de detecção de aLA e de bLG é de cerca de 20 pg/ml (volume da amostra 10 pl), a de BSA e IgG é próxima de 40 pg/ml.

III/HPLC: de acordo com Diosady, L.L. e col. 1980, Milchwissenschaft 35 : 671. e Bican, P. e col., 1982, Milchwissenchaft 37 : 592.

ausência do pico análise em coluna TSK 3000-SW confirma a BSA e IgG após a segunda hidrólise proteínas intactas nas condições a para por comparaçao com as seguir mencionadas:

Solvente:

solução tampão, 0,05 M Tris-HC1, 4 M guanidínio, pH 6,8

Amostra:

mg de hidrolisado ou de proteína (testemunha)

280 nm, caudal 1 ml/min

Temperatura da coluna:

20°C

Condição de gradiente isocrático.

Exemplo 1

Dispersam-se 24 g de pó de lacto-soro ácido desmineralizado (DWP) em agua desmineralizada com agitação e aquece-se lentamente até à dissolução. A solução obtida tem um volume de 80 ml e um teor em matérias secas de 30%.

pó de lacto-soro desmineralizado utilizado

tem a composição seguinte:

%

Proteinas (N x 6,38)11,9

Matérias gordas0,8

Lactose81

Cinzas2,8

Humidade3,5

Coloca-se a solução num reactor de dupla parede termoestatizado a 55° C. Aumenta-se o pH da solução até 8 por adição de uma dispersão aquosa de Ca(0H)2 a 20% (peso/volume).

Adicionam-se em seguida 30 mg de tripsina porcina de força igual a 1500 unidades/mg (farmacopeia dos Estados Unidos, USP). Observa-se uma diminuição rápida do pH (devida à iniciação da hidrólise) que é terminada a pH 7,5 utilizando uma solução aquosa de KOH 1N e mantem-se o valor do pH neste valor com estabilizador de pH por compensação automática com auxílio de uma solução aquosa de KOH 1N. A reacção prossegue durante 4 horas a 55° C, após o que já não se observa reacção detectável por titulação.

Separa-se o hidrolisado em quatro porções iguais:

1a: Adiciona-se a 20 ml de hidrolisado uma solução aquosa contendo 6 mg de inibidor de tripsina de soja (STI) de maneira a bloquear a acção da tripsina, e em seguida seca-se a solução por liofilização.

1b: Aquecem-se 20 ml do hidrolisado a 70°c durante 1 min e mantem-se esta temperatura durante 5 min.

durante 2,5 min, e mantem-se esta temperatura durante 5 min.

1d: Aquece-se o resto do hidrolisado durante 4 min a 90°C e mantem-se esta temperatura durante 5 min.

Arrefecem-se rapidamente os hidrolisados 1b, 1c e 1d a 55°C, depois introduzem-se separadamente em reactores. Em cada reactor, adicionam-se 30 mg da tripsina anterior, depois deixa-se a reacção prosseguir durante 1 hora a 55°C a pH 7,5, após o que já não se observa reacção detectável por titulação. Adicionam-se então 6 mg de STI a cada um dos hidrolisados e secam-se separadamente por liofilização. Os hidrolisados obtidos são designados respectivamente por 1e, 1 f e 1 g.

Os resultados da análise por electroforese (SDS-PAGE) e por dupla imunodifusao (ID) relativos aos títulos de albumina de soro de bovino (BSA) e de imunoglobulina G (IgG) são indicadas na tabela 1 a seguir:

Tabela 1

BSA IgG

Amostras	por SDS-PAGE	por ID	por ID
1 a	+ + +	1 /32	1 /64
1b	+ + +	1 /32	1 /1 6
1 c	+ + +	1 /8	1 /1
1d	+ + +	1 /8	0
1 e	+ + +	1/32	1 /32
1 f	+	1/8	1 /1
ig	0	0	0

Continuação da Tabela 1

Legenda: + + +: 1 ^ig em 10 ug Nt + : ^0,1 ^ug em 10 ug Nt

0: não detectável, <0,1 ug em 10 ug Nt

Resultados:

Enquanto os títulos por ID são:

aLA: 1/256 - 1/512 bLG: 1/512 - 1/1024

BSA: 1/8-1/32 e

IgG: 1/8 - 1/64 para uma solução aquosa de 100 mg/ml de pó de lacto-soro desmineralizado utilizado, SDS-PAGE e ID não permite detectar a presença de alfalactalbumina (aLa) e de betalactoglobulina (bLG) em nenhuma das amostras.

A hidrólise não é suficiente para fazer desaparecer os alergéneos constituídos pelas proteínas BSA e IgG (1a) .

Mesmo se o hidrolisado for tratado termicamente, isso não é suficiente para eliminar a BSA (1b, 1c, Id).

Para se obter um hidrolisado com baixa alergenecidade, é necesário efectuar um tratamento térmico adequado, seguido de uma segunda hidrólise (If, 1g).

Exemplo 2

Dispersam-se 150 g de concentrado de proteínas de lacto-soro obtidas por centrifugação de leite doce (WPC) em 1 1 de água desmineralizada a 50°C num reactor de dupla parede termoestatizado a 50°C.

O concentrado de proteínas de lacto-soro utilzado tem a composição seguinte:

Proteínas (N x 6,38)77,2

Matérias gordas8

Lactose3

Cinzas7,3

Humidade4,5

Aumenta-se o pH inicial de 6,6 para 7,9 por adição de uma dispersão aquosa de Ca(OH)₂ a 20% (peso/volume). Regula-se o estabilizador de pH a 7,3 por compensação automática com uma solução aquosa de KOH 2N.

Adicionam-se 7,5 g de tripsina pancreática com a força de 3 unidades Anson (AU)/g de forma a iniciar a hidrólise e continua-se a reacção durante 4 h a 50°C. Aquece-se em seguida o hidrolisado a 90°C por injecção de vapor e mantem-se durante 5 min a esta temperatura. Após arrefecimento a 55°C restabelece-se o pH a 7,3 por compensação automática com uma solução aquosa de KOH 2N. Introduzem-se em seguida 2 g de tripsina porcina (com a força de 6 AU/g) de forma a iniciar a segunda hidrólise que se mantém durante 2 h com compensação automática do pH. Trata-se em seguida termicamente o hidrolisado durante 10 min a 90°C, em seguida arrefece-se e seca-se por liofilização.

Para seguir a hidrólise, retiram-se amostras de 1ml em diferentes fases da hidrólise, adicionam-se de cada vez 6 mg de STI, congelam-se rapidamente e secam-se por liofilização.

Os resultados da análise por ID são indicados na tabela 2 seguinte.

Tabela 2

Amostra	Fase de hidrólise /duração (min)	Tratamento térmico após a 13 fase temperatura (°C)/duração (min)	Tratamento térmico após a 2^â fase temperatura C) /duração (min)
2a	1 3/25	-	—
2b	1 3/70	-	-
2c	1^/180	-	-
2d	1^â/240	-	-
2e	13/240	90/5	-
2f	1^â/240+ 23/60	90/5	—
2g	13/240+ 23/60	90/5	90/1 0

Amostra	Título ID¹	para
	aLA	BLG	BSA	IgG
2a	1 /1 6	1 /8	1 /32	1 /64
2b	1/2	1/2	1 /32	1 /32
2c	1 /1	1/1	1 /32	1 /32
2d	1 /1	1 /1	1 /32	1 /32
2e	1/1	1/1	1 /4	1 /1
2f	0	0	0	0
2g	0	0	0	0
Controle	=
WPC de
partida	1/1048	1/1048	1 /64	1 /1 2

Continuação da Tabela 2

Legenda:

- Ausência de tratamento térmico

1:Concentração inicial antes da diluição, mg/ de matérias secas/ml

Resultados:

Da tabela 2 anterior conclui-se que apenas a dupla hidrólise com tratamento térmico intermediário permite eliminar a antigenicidade do hidrolisado.

A análise por SDS-PAGE mostra por outro lado que não pode ser detectada qualquer banda correspondente à BSA para as amostras 2f e 2g.

Exemplo 3

Dispersam-se 254,6 Kg de DWP, 91,3 Kg de WPC e 101,4 Kg de lactose de qualidade alimentar em 800 Kg de água desmineralizada a 60°C.

A lactose utilizada tinha a composição seguin-

te:
	%
Proteínas (N x 6,38)	0,5
Matérias gordas	-
Lactose	94,5
Cinzas	0,1
Humidade	4,9

Coloca-se a dispersão anterior num reactor de dupla parede termoestatizado a 55°C. A dispersão tem um teor em matérias secas de 30,1% e um pH de 6,4. Aumenta-se o pH por adição de uma dispersão aquosa de Ca(OH)₂ a 20% até 7,8. Adiciona-se em seguida 1 Kg de tripsina porcina (força de 6 AU/g, relação de actividade tripsina:quimotripsina de 15:1 - 20:1 em USP, farmacopeia norte-americana), dispersa-se numa solução aquosa 0,01 M de HC1 a 5-10°C, de forma a iniciar a hidrólise. Para-se em segida a queda rápida do pH e mantem-se este a 7,3 com um estabilizador de pH por compensação automática com o auxílio de uma solução aquosa de KOH 2N.

Continua-se a hidrólise a 55°C e a pH 7,3 durante 3 h, após o que se aumenta o pH a 7,6 por regulação do aparelho estabilizador do pH para o novo valor. Faz-se em seguida passar o hidrolisado através de um permutador de calor de placas de forma a aquecer rapidamente a 90°C, depois para um tubo de espera (caudal 7,5 Ι/min., volume do tubo 40 1, tempo de residência 5 min), em seguida para um segundo permutador de calor de placas onde é arrefecido para 55°C.

Envia-se em seguida o hidrolisado a um caudal de 7,5 1/min por intermédio de uma válvula em T para um tubo de espera de diâmetro 0,025 m e de volume 150 1, a que corresponde um tempo de residência de 20 min em todo o comprimento. Envia-se igualmente por bomba 1 Kg de tripsina (dispersão igual à anterior) na corrente de hidrolisado a um caudal de 6 1/h por intermédio da válvula em T à entrada do tubo de espera. O tubo de espera está dividido em secçõesque permitem tempos de residência progressivos de 40 s a 20 min. Retira-se uma amostra de hidrolisado de alguns ml no início do tubo (sem tempo de residência), em seguida para cada tempo de residência, tratam-se imediatamente as amostras com a quantidade adequada de STI e congelam-se.

Após pré-aquecimento a 80°C com um tempo de residência de 5 min, envia-se por bombagem o resto do hidrolisado (que teve um tempo de residência de 20 min) para um esterilizador a temperatura ultra-elevada onde é levado a 125°C durante 2 min de forma a desactivar o enzima e a esterilizar o hidrolisado. Após ter arrefecido, seca-se o hidrolisado por pulverização.

O pó obtido tem a composição seguinte:

%

Peptidos

Lactose

Cinzas

Matérias gordas

Humidade

O grau de hidrólise, azoto x 100/azoto total (Nt) é de 18% e o Nt é de 3,56%.

A análise por SDS-PAGE confirma a ausência de bandas proteicas com cargas de produto de 139 pg (5 pg Nt) e de 500 pg (18 pg Nt). Em particular, não se observa qualquer banda correspondente ã BSA, às cadeias H e L de IgG a aLA ou a bLG. Observa-se uma banda colorida difusa devida aos grandes peptidos próximo da extremidade anódica do gel.

Por ID, não se observa qualquer linha de precipitação com os soros anti-BSA, anti-IgG, anti-bLG e anti-aLA a partir de uma amostra de 100 mg de matérias secas/ml antes da diluição.

A tabela 3 a seguir apresentada mostra a influência do tempo de residência durante a segunda hidrólise, no BSA em particular.

Tabela 3

Títulos ID¹

Amostra	Tempo de espera (s)	BSA	IgG	bLG	BSA por SDS- PAGE (Carga 500 pg)
3 a		1 /8	1 /2	1 /4	+ + +

(controle sem

2^â Hidrólise)

3b	40	1 /4	1/1	Ί-
3c	1 20	1 /1	0	Ο
3d	360	1/1 ou 0	0	0
3e	720	1/1 ou 0	0	0
3f	1 080	1/1 ou 0	0	0
3g	1 080	0	0	0

(com tratamento térmico final 125°C/2 min)

Legenda:1: A concentração inicial antes da diluição é de 100 mg de matérias secas/ml.

Resultados:

SDS-PAGE: Observa-se uma diminuição rápida da intensidade da banda BSA após apenas 40 s. Após 2 min, a banda já não é detectável na prática. Por comparação com as diluições sucessivas de BSA puro, o limite de sensibilidade do método é atingido para cargas de 50 ng (nanograma). Pode-

-se dizer que a concentração final de BSA no hidrolisado após 20 min de residência é 0,01%, em matérias secas, em relação a uma concentração inicial estimada em 1,8-2,2%.

ID: Obtem-se um título de 0 ou 1 após 6 min de residência. Observa-se que a hidrólise das proteínas que permanecem intactas após a primeira hidrólise tem lugar de forma relativamente rápida.

Exemplo 4

Procede-se como no exemplo 3, com a excepção de a quantidade de enzima adicionado durante a segunda hidrólise ser de metade, (o que representa 75% da quantidade total de enzima utilizado no exemplo 3, 1^â e 2^â hidrólise). A análise de BSA por ID revela um título de 0 a 1 após 10 min de residência. Por consequência, a quantidade de enzima utilizada pode ser diminuída se o tempo de residência da segunda hidrólise aumentar.

Exemplo 5

Procede-se como no exemplo 3, com a excepção de o tempo da primeira hidrólise ser de 2 h e de a segunda hidrólise ter lugar num reactor durante 2 h a pH constante de 7,3. As análise de BSA por SDS-PAGE e ID mostram o desaparecimento da proteína no hidrolisado.

Exemplo 6

Utiliza-se o mesmo material do exemplo 3 na mesma quantidade no que diz respeito ao DWP, WPP e água e coloca-se a dispersão num reactor de dupla parede termoestatizado a 55°C, θ em seguida adicionam-se 200 g de tripsina.

Conduz-se a hidrólise durante 10 min compensando a queda do pH com a adiçaõ de KOH 2N.

Faz-se em seguida passar o hidrolisado num permutador de calor de placas que se aquece a 90°C durante 5 min e em seguida arrefece-se a 55°C.

Coloca-se em seguida o produto parcialmente hidrolisado e tratado termicamente no reactor termoestatizado a 55°C e adicionam-se 1,8 Kg de tripsina dispersa numa solução aquosa de HC1 0,01 M. Compensa-se a descida do pH por adição de KOH 2N.

Após 3 h de hidrólise, procede-se à desactivação e à autodigestao do enzima aquecendo o hidrolisado a 80°C durante 5 min. Esteriliza-se em seguida a 125°C durante 2 min.

Exemplo 7

Procede-se como no exemplo 6, com a excepção de se realizar a primeira hidrólise num tubo de espera durante 10 min. O tratamento térmico tem em seguida lugar no permutador de calor a 90°C durante 5 min. A segunda hidrólise tem lugar no reactor como no exemplo 6 e a sequência das operações efectua-se como no exemplo 6.

Exemplo 8

Procede-se como no exemplo 3 até ao fim da segunda hidrólise. Adiciona-se em seguida ao hidrolisado uma quantidade equivalente de uma solução de maltodextrina e de amido com 50% de matérias secas à qual se juntaram anteriormente sais minerais dissolvidos em água desmineralizada a 60°C numa cuba termoestatizada. Aquece-se em seguida a mistura a 75°C por meio de um permutador de calor de placas, em seguida adicionam-se matérias gordas constituídas por óleo de palma, óleo de noz de coco, óleo de cartamo, lecitina e vitaminas lipossolúveis, tendo sido as matérias gordas previamente fundidas a 65°C e representando 10% da mistura

anterior. Após pré-aquecimento a 80°C com um tempo de residência de 5 min, esteriliza-se em seguida o liquido obtido a 125°C durante 2 min por injecção directa de vapor, arrefece-se a 70°C por expansão num vaso de expansão, homogeneiza-se em 2 fases, em primeiro lugar a 200 bar e em seguida a 50 bar, arrefece-se a 1 0°C com o auxilio de um permutador de calor de placas, e em seguida numa cuba de armazenagem intermédia, adiciona-se uma solução de ácido cítrico a 10% em água desmineralizada, vitaminas hidrossolúveis, oligoelementos e taurina. Finalmente, aquece-se a mistura a 75°C, homogeneiza-se numa passagem a 165-170 bar, e seca-se por pulverização.

O pó tem a composição seguinte:

%

Péptidos	12,5
Matérias	gordas	26
Hidratos	de carbono	56,2
em que	Lactose	39,3
	Maltodextrina	10,8
	Amido	6,1
Minerais		2,3
Vitaminas oligo-elementos	traços
Humidade		3

Exemplo 9

Procede-se como no exemplo 8 com a excepção de após a segunda homogeneização se esterilizar o liquido a 125°C durante 2 min, arrefecer-se a 10°C e introduzir-se assepticamente em recipientes.

O liquido tem a composição seguinte:

%

Peptidos	1 ,6
Matérias gordas	3,4
Hidratos de carbono	7,4
em que Lactose	5,2
Maltodextrina	1,4
Amido	0,8
Minerais	0,3
Vitaminas e oligoelementos	traços
Água	79,9

REIVINDACAÇÕES

Claims

REIVINDACAÇÕES _ 1 a _

Processo para a preparação de um hidrolisado de proteínas de leite animal praticamente isento de alergéneos de origem proteica, no qual se hidrolisa enzimaticamente um produto lacto-sórico, caracterizado por o hidrolisado enzimático ser termicamente tratado em solução aquosa, a 80-100°C durante 3 a 10 minutos num pH de 6 a 8, por o hidrolisado ser arrefecido para 40-60°C, por ser seguidamente submetido a uma segunda hidrólise com um enzima proteolítico de maneira a hidrolisar as proteínas menores que se mantêm intactas depois da primeira hidrólise, e por seguidamente o enzima ser inactivado termicamente.

- 2- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o produto lacto-sórico aplicado ser escolhido de entre lacto-soro, lacto-soro desmineralizado, concentrados de lacto-soro desmineralizado e as suas misturas, com lactose se for caso disso.

Processo de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por ser utilizado um enzima proteolítico escolhido entre a tripsina, a quimotripsina, uma mistura de tripsina e quimotripsina e a pancreatina.

Processo de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por a hidrólise enzimática ser efectuada por cargas num reactor durante 60 a 180 minutos.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a hidrólise enzimática ser efectuada em contínuo num tubo em regime de turbulência durante 1 a 60 minutos, de preferência durante 2 a 20 minutos.

- 63 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o enzima ser inactivado por meio de aquecimento prévio do hidrolisado a uma temperatura de 75 a 85°C e mantendo-o a esta temperatura durante aproximadamente 5 minutos, esterilizando-o em seguida.

Processo para a preparação de um alimento hipoalergénico, caracterízado por serem adicionados, ao hidrolisado obtido de acordo com a reivindicação 1, hidratos de carbono, sais minerais e matérias gordas em estado liquido que, se for caso disso, contêm vitaminas hipossolúveis, por se lhe adicionar, quando necesário, uma solução aquosa que contêm vitaminas hidrossolúveis e oligoelementos, e por se secar em seguida.

Processo de acordo com a reivindicação 7 no qual o hidrolisado aplicado contêm o enzima não inactivado, caracterizado por o enzima ser inactivado termicamente no decurso da preparação do alimento.

Proceso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o enzima ser inactivado por meio de aquecimento prévio a 75-85°C durante aproximadamente 5 minutos, em seguida por meio de esterilização a ultra-alta temperatura e por o produto ser acondicionado no estado liquido de maneira asséptica em vez de o secar.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado como pedido de Patente Europeia em 23 de Dezembro de 1987, sob o n⁹ 87 119 104.5.