PT88813B - Metodo para a purificacao de proteina - Google Patents
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Description
SCHERING CORPORATION
MÉTODO PARA A PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA
de factores de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) usando uma resina de permuta catiónica é t-ambem divulgada.
de permuta iónica é , inerente suave, custo exalável. No entanto, para a separaçao de im ecialmente proteinas de
A cromatografia uma técnica cromatografica convencional baixo, grande capacidade e facilmente e até agora nao tem sido uma técnica útil purezas estreitamente relacionadas, esp rDNA.
Um exemplo de tais proteinas de rDNA e o GM-CSF humano recombinante. DNAs complementares (cDNAs) para GM-CSF, factores que suportam o crescimento e desenvolvimento de granulocitos e macro-fagos no sangue, foram recentemente clonados e sequenciados por uma serie de laboratórios. Ainda, GM-CSF nao recombinante foi purificado a partir de sobrenadantes de cultura da linha celular Mo (descrito na Patente U.S. 4 438 832) e os primeiros dezasseis aminoácidos do extremo N foram sequenciados, Gasson et al., Science, Vol226 paga 1339-1342 (1984). Entre os GM-CSFã humanos observou-se heterogeneidade da sequência de nucleotideos e da sequência de aminjo ácidos. Por exemplo, ao nivel dos aminoacidos observou-se tanto treonina como isoleucina na posição 100 relativamente à alanina N-terminal, sugerindo que podem existir várias formas alélicas ou polimorficas nas populações humanas.
Existe uma variedade de métodos para a preparaçao de novo e clonagem de cDNAs, tais como cDNAs de GM-CSF e para a construção de bibliotecas de cDNA. Como exemplo extrai-se mRNA total a partir de células (e.g. uma fonte de células T humanas nao transformadas), produtoras de polipeptideos apresentando a actividade pretendida. Os cDNAs de cadeia
transcriçao reversa iniciada com iniciador para fazer o primeiro complemento de cadaisequência de mRNA e depois por iniciação da sintese de uma segunda cadeia. Subsequentemente, os cDNAs podem ser clonados ligando-os a vectores de plasmideo ou de bacteriofagos adequados através de caudas homopoliméricas complementares ou de extremos coesivos criados com segmen. tos adaptadores contendo os sitios de restrição adequadosse depois transformaçao de um hospedeiro adequado. Pode ser usada uma larga gama de sistemas de expressão (i.e., combinações hospedeiro-vector de expressão) para produzir as proteínas purificadas pelo processo deste invento. Os tipos possíveis de células hospedeiras incluem, mas nao estão limitados a bac_ térias, leveduras, insectos mamiferos e similares.
Têm sido divulgados vários métodos para a extração de GM-CSF a partir de células hospedeiras e subsequente purificação no entanto, GM-CSF nem sempre é adequadamente purificado com bom rendimento e com retenção de actividade biológica.
Sumário do Invento presente invento e dirigido a um método para a separaçao de uma proteína bruta numa fracçao de proteína relativamente pura e numa fracçao de proteína impura, caracterizada por se pôr em contacto a proteína bruta com uma resina de permuta iónica a um pH tal que a proteína pura e as
impurezas fiquem com cargas opostas, pelo cue uma das fracções é selectivamente ligada à resina de permuta iónica. A resina de permuta ionica e uma resina de permuta ionica forte e a fracçao de proteina pura fica preferencialmente ligada a resina de permuta iónica. De preferência elui-se a fracçao ligada à resina de permuta iónica.
pH da proteina bruta é preferencialmente ajustado a um pH dentro da gama de pontos isoeléctricos das fracções de proteina a serem separadas de modo a haver uma diferença de carga aumentada entre as fracções.
presente invento também é dirigido a um método para a determinação do pH a que se separa uma proteina bruta numa fracçao de proteina relativamente pura e numa fracçao de proteina impura caracterizado pela determinação dos pontos isoeléctricos da proteina pura a ser recuperada e das impurezas a serem removidas e determinação do pH dentro da ga_ ma de pontos isoeléètricos tal que a proteina pura e as impurezas fiquem com cargas opostas e de modo a existir uma diferença amplificada entre as referidas cargas. Os pontos isoelec_ tricôs das fracções proteicas sao preferencialmente determinados por simulaçao de computador ou por geis de focagem isoelec_ trica.
método acima descrito é útil para a purificação de proteina de rDNA, particularmente factor de estimulação de colónias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF), ma. is particularmente para a purificação de GS-CSF através da sua separaçao de Δ4 GM-CSF.
Num método particularmente preferido, a proteina e purificada por pôr sequênciadamente em contacto
k. uma resina de permuta anionica tal como uma resina com aminas quaternárias de preferência ligada a um suporte de dextram com ligações cruzadas, celulose, agarose ou acrílico;
B. uma resina de permuta catiónica de preferência tendo uma função sulfonato ligada a um suporte de dextram com ligações cruzadas, celulose, agarose ou acrilico; e
C. uma filtraçao em gel significa ter preferencia almente uma gama de fraccionamento de cerca de 5000 a cerca de 100 000 daltons para proteinas.
Descrição Detalhada presente invento relaciona-se com uma separaçao cromatografica de permuta iónica de alta resolti çao para a purificação de proteinas brutas, particularmente proteinas de rDNA brutas. Nesta técnica, a cromatografia é efectuada perto dos pontos isoeléctricos da proteina pura que se pensa recuperar e das impurezas que se pretende remover, de preferência a um pH em que se verifique uma diferença am-sl plificada (e.g. o máximo) entre as cargas da proteina pura e impurezas e ao qual as moléculas fiquem com carga oposta (po7-
nas perto do ponto isoeléctrico pode ser usada para seleccionar as condiçoes adequadas de cromatografia de permuta ionica resultando na ligaçao selectiva a resina de permuta iónica qua. se na ausência de cargas. Por conveniência, esta técnica é aqui referida como cromatografia de Ponto Isoeléctrico Delta (DIP).
As impurezas de rDNA estreitamente relacionadas com uma proteína de rDNA pretendida sao difíceis de remover da proteína bruta por cromatografia de filtraçao em gel, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de interacçao hidrofobica, cromatografia liquida de alta resolução em fase reversa, cromatografia de afinidade com quelataçao de metais assim como outros tipos convencionais de cromatografia. Estas impurezas estreitamente relacionadas sao geralmente proteínas com um peso molecular e uma distribuição de carga perto do produto proteico com interesse geralmente sem um (ou mais) aminoácidos carregados. Sao exemplos de impurezas produtos de degradaçao proteolitica formados por corte de um extremo peptidico que seja acessível a proteólise assim como a interacçao cromatografica. Tais impurezas sao consideradas inseparáveis por cromatografia de permuta iónica convencional.
A técnica de cromatografia DIP difere da cromatografia de permuta iónica convencional numa série de pontos. DIP é efectuada a um pH em que as proteínas a serem separadas possuem muito pouca carga eléctrica. Isto é conseguido aplicando a resina de permuta iónica a um pH que diste apenas fracções de unidades de pH do ponto isoeléctrico (pi) da proteína pretendida e das suas impurezas estreitamente relacionadas. Isto contrasta com a cromatografia de permuta iónica convencional que e efectuada a pH em que as proteínas de interesse possuam cargas eléctricas fortes e em que a aplicaçao
seja efectuada a um pH que diste 1-2 unidades do pi, uma ordem de grandeza superior â cromatografia DIP.
pH a que é efectuado DIP e previsto por simulações de computador de densidade de carga vs. pH para a proteina e impurezas relacionadas ou por técnicas analíticas tais como o uso de géis de focagem isoeléctrica. Na cromatogra fia de permuta iónica convencional, o pH de aplicaçao é determinado por alteraçao da carga global da proteina e as condições de aplicaçao sao optimizadas empiricamente. Para determinar as condiçoes de eluição é necessária experimentação empirica maçadora.
Ao contráriocda cromatografia de permu. ta iónica convencional onde nao se faz qualquer tentativa para polarizar as impurezas relativamente a proteina pretendida, na cromatografia DIP o pH de aplicaçao é seleccionado de modo a que fique entre o pi da impureza estreitamente relacionada e o da proteina pretendida e portanto a proteina pretendida atinge uma carga electrica oposta à impureza polarizada.Para a cromatografia DIP é imposto um ambiente de força iónica elq vada para reduzir interacçoes proteina-proteina durante a apli. caçao e usa-se um permutador ionico forte. Na tecnologia de permuta iónica convencional, para se obter uma resolução máxima sao preferidas resinas de permuta iónica fraca com condiçoes de aplicaçao de forças iónicas mais baixas. A baixa interacçao proteina-proteina durante a aplicaçaoiem cromatografia DIP resulta em ligaçao altamente selectiva e resolução extremamente fina durante a fase de aplicaçao e separaçao adicional é conseguida durante eluição com gradientes normais. Na cromatografia de permuta iónica convencional ocorre ligaçao nao selectiva durante a aplicaçao e portanto durante a aplicaçao so se consegue separaçao de grupos; a maior parte da separaçao é conseguida durante a fase de eluiçao, sob fortes inter. acçoes proteina-proteina resultando das elevadas densidades de proteina ligadas localmente na matrix sólida.
A simulaçao de computadores da densidade de carga vs. pH pode ser conduzida usando software comercial e um computador adequado (e.g. mainframe, microcomputador ou computador pessoal). Por exemplo pode-se usar um computador VAX (Digital Corp.) com um software package por exemplo Polypeptide Analysis System da Intellegentics, Inc., reproduções de 1981, 1982, 1983, 1984, 1985, e 1986. Usando este software a sequência de aminoácidos primaria e a entrada e distribuição de densidade de carga pode ser obtida a diferentes pHs. Como alternativa, pi pode ser determinado usando electroforese em gel de isoelectrofocagem (IEF) de acordo com processos bem conhecidos dos técnicos especializados.
A cromatografia DIP pode ser aplicada a proteínas, especialmente proteínas recombinantes, que tenham pontos isoeléctricos numa gama de pH em que a proteina nao desnatura. Os pontos isoeléctricos de muitas proteínas sao co. nhecidos. Por exemplo, ver o artigo de revisão extensiva de Righetti, et.al., Isoelectric Points and Molecular Weights of Proteins - A New Table, em J. Chrom., 220 (1981), pag.115-194 (Chromatografhy Reviews). Sao exemplos de proteínas terapeuticamente importantes que apresentam alotropismo do ponto isoeléctrico e para as quais a cromatografia DIP pode ser adequada, GM-CSF, interferoes de leucócitos e linf oblastoide., hor. mona de crescimento, superoxido dismutase e eritropoietina. Outras proteínas incluem antitromhina III, laetogénio, plasminogénio, prolactina, urocinase e proteina de ligaçao à vitami.
Um exemplo da aplicaçao de cromatografia DIP e o processo que se segue para a purificação de GM-CSF recombinante humano. Um aspecto particularmente difícil da purificação de GM-CSF e a remoção de um produto de degradaçao de GM-CSF sem quatro aminoácidos N-terminais e conhecido como Delta 4 (Δ4). GM-CSF é geralmente purificado por uma combinação de permuta aniónica numa coluna de aminoetilo quaternário, filtraçao em gel e cromatografia de fase reversa, processo este que nao é eficaz na remoção das impurezas Δ4.
A cromatografia DIP, no entanto, foi satisfatória na remoção das impurezas Δ4. Primeiro, numa simulação por computador da proteina GM-CSF intacta foi comparado com a simulaçao por computador da impureza Δ4 e determinou-se que o pi de GM-CSF é 5,24 e o pi da impureza Δ4 é 4,98. A seguir, determinou-se sem pH de trabalho dentro desta gama a que (a) GM-CSF atingiu uma carga oposta à carga da impureza Δ4 e (b) a grandeza relativa da diferença entre as cargas é suficientemente amplificada para permitir separaçao. Uma diferença minima de carga de 1 carga/molecula (1 c/mol) entre o GM-CSF intacto e a impureza Δ4 existe ao longo de uma larga gama de pH (i.e., a pH 0,5, as cargas respectivas sao +16 e +15 e a pH 11,5, as cargas sao -11,1 e -12). No entanto, conforme previsto pelo modelo de computador, perto de pH5 a diferença de carga entre GM-CSF intacto e a impureza Δ4 é amplificada (i.e., a diferença de carga relativa é aumentada) e as moléculas sao polarizadas: a pH5, GM-CSF tem +0,9c/mol, enquan to que a impureza Δ4 possui apenas -0,lc/mol. Portanto asi duas condiçoes necassárias para DIP estão satisfeitas: polarização da carga e amplificaçao.
Para aumentar mais a separaçao de GM-CSF intacto das restantes impurezas de baixo pi das células
hospedeiras E.coli e dos factores destabilizadores proteoliticos, empregou-se uma força iónica elevada durante a aplicaçao. Esta diminui as interacçoes electroestáticas entre as moléculas. Nestas condiçoes de força iónica elevada, um permutador cationico forte a pH5, e.g., uma coluna de, por exemplo, sulfonato funeionalmente ligado a um suporte de dextram com ligações cru. zadas, celulose, agarose ou supcrte acrilico (e.g., S. Sepharose fabricado por Pharmacia, Inc. Piscataway, NY) é portanto preferido .
uso de tal coluna de resina de permuta catiónica permitiu conseguir a remoção num so passo da impureza Δ4 indesejável, várias impurezas de baixo pi, uma impureza de 20K de E.coli nao removida anteriormente por outros processos e um factor proteolitico, estabilizando assim o produto final. A realizaçao da cromatografia de permuta catiónica aumenta a pureza do GM-CSF de aproximadamente 50% para cerca de 90%, com rendimento de 70-80%. Quando seguido de um passo de filtraçao em gel, a pureza do GM-CSF é aumentado para cerca de 99%.
Segue-se uma descrição geral de um processo para 0 isolamento e purificação de GM-CSF. A cromatografia de permuta anionica de preferência numa coluna de aminoeti. lo quaternário, é um passo convencional na purificação de GM-CSF e é efectuada para remover impurezas de pi elevado do sobrenadante após a morte das células hospedeiras. 0 passo de filtraçao em gel, também convencional, é efectuado para remover impurezas de alto e baixo peso molecular. Se bem que o que se segue descreva um processo em que a fracçao de proteina purificada fica ligada à resina de permuta iónica forte, também se pode considerar que em certas realizações do invento a frac. çao de proteina impura possa ficar ligada à resina de permuta
iónica forte. De modo semelhante, se bem que a descrição e o exemplo sejam dirigidos na passagem continua da proteína bruta através de uma coluna de resina de permuta iónica, também podem ser considerados outros métodos de contacto, tais como con. tacto em bloco.
Comentários gerais: As operaçoes sao realizadas a 2-15°C a menos que de outro modo seja indicado.
A concentração de proteína é determinada em cada uma das fases por um ensaio de coloraçao com Coomassie Blue. Se nao se conseguir o grau esperado de purificação em qualquer um dos passos cromatográficos, as fracções eluidas podem ser cromatografadas de novo na mesma coluna ou, como alternativa, recicladas através de um passo prévio ou de uma série prévia de passos. Este reprocessamento pode ser feito nas fracções laterais elujL das de um bloco ou de um conjunto de blocos. Em qualquer um dos passos a concentração pode ser conseguida por precipitação com sulfato de amónio, precipitação isoeléctrica e/ou ultrafi/ traçao. As soluçoes tampao sao feitas com água desionizada (Dl), água de osmose reversa (RO) ou água para injecção (WFI).
Fase I: Cromatográfia em coluna de aminas quaternarias pH do extracto bruto de GM-CSF é ajus tado a 5-7,5 com tampao como seja 1M Bis-tris (bis/ 2-hidroxietil7imino-tris-/ hidroximetil/metano) e/ou 4NHC1. A solução é então clarificada por centrifugação e/ou filtraçao. A conduc tividade é ajustada a menos de 10 milisiemens/centimetro (mS/· /cm) por diluição com água ou adiçao de uma solução salina como seja 4N NaCl. 0 global é aplicado a uma coluna de aminas
quaternárias (i.e., função de amina quaternária ligada a um suporte dextran com ligações cruzadas, celulose, agarose ou acrílico, como seja Q-Sepharose, fabricado por Pharmacia, Inc.) nao aplicando mais de 50 gramas de proteina por litro de gel.
A eluição é efectuada com um gradiente na gama de 0-0,4M NaCl ou outro sal adequado num tampao como seja 20mM Bis-tris. As fracções adequadas sao combinadas para posterior processamento.
Fase II: Cromatografia em coluna de sulfonato
As fracções combinadas sao ajustadas a pH5 que esta dentro da gama de pontos isoelectricos das fracçoes proteicas conforme determinado por cromatografia DIP, com um ácido como seja ácido acético 1M ou 4N HC1 ou uma base como seja 6N NaOH. A conductividade ê ajustada a 13 mS/cm com um tampao tal como ácido acético 0,01M ajustado a pH5 com NaOH.
A solução é filtrada através de um filtro de 0,2 microns e apli cada numa coluna de sulfonato (i.e., uma função sulfonato ligada a um suporte de dextran com ligações cruzadas, celulose, agarose ou acrílico, como seja S-Sepharose) nao aplicando mais do que 20 gramas de proteina por litro de material da coluna.
A eluição e efectuada com uma solução de um sal tal como NaCl com um gradiente de concentração até 0,5M num tampao como seja tampao ácido acético 20mM, 0,13M NaCl, pH5,0. As fracções adequadas sao combinadas para posterior processamento. Tipicamente este passo de cromatografia e tipicamente repetido.
'λ ί> c
Fase III: Precipitação com sulfonato de amonio
Adicionou-se sulfato de amonio as fracçoes comhinadas de S-Sepharose para uma concentração final de 50% a 60% de saturaçao. 0 precipitado foi colhido por centrifugação. 0 precipitado pode ser guardado no frio.
Fase IV: Cromatografia de filtraçao em gel precipitado de sulfato de amónio é dissolvido num tampao como seja lOmM fosfato de sódio, 50mM ácido cítrico, pH6 contendo até 0,35M de um sal tal como cloreto de sódio. A solução é centrifugada e filtrada através de um filtro da gama de 0,2 micron antes da aplicaçao numa coluna de filtraçao em gel tendo uma gama de fraccionamento de cerca de 5000 a cerca de 100 000 daltons para proteínas, e.g., Sepha. cryl S-200 HR (fabricado por Pharmacia Inc.), pré-equilibrada com o mesmo tampao. A aplicaçao nao é superior a 3,5 gramas de proteína por litro de gel. A coluna é eluida com o mesmo tampao e combinadas as fracçoes adequadas. As fracçoes sao dia. lizadas contra um tampao como seja lOmM fosfato, 2mM citrato, pH7,2. Como alternativa toda a fase IV pode ser efectuada neste último tampao.
Fase V: GM-CSF purificado
As fracções combinadas sao filtradas através de um filtro de 0,2 micron ou com um poro de tamanho inferior e guardados a -20°C ou abaixo.
Nas referências que se seguem estão descritos os processos de electroforeses em geis de IEF típicos :
1. ELECTROPHORETIC TECHNIQUES, Academic Press, (1983) Ed:G.F Simpson & M. Whittaker
Recent Developments in Isoelectric-focusing
J.S. Fawcett, p.57
2. ISOELECTRIC-FOCUSING: Theory, Methodology and Application P.G. Rigfetti, Elsevier Biomedical Press, (1983) p.148
3. APPLICATION 0F SEPARATOR ISOELECTRIC-FOCUSING WITHIN pH RANGE 4-6, P. GUI, Electrophoresls 6: 282 (1985).
4. RAPID STAINING 0F PROTEINS IN ULTRATHIN ISOELECTRIC FOCUSING IN POLYACRYLAMIDE GEL,
M.D. Frey, Electrophoresis 3/ 27-32 (1982)
5. ULTRA THIN LAYER ISOELECTRIC-FOCUSING OF ENZYMES IN LIVER SAMPLES OF WAGTAILS,
M. Germeiner, Electróphoresis 3_: 146 (1982)
Segue-se um exemplo ilustrando processos para a purificação de GM-CSF baseado na técnica DIP.
EXEMPLO 1
PURIFICAÇÃO DE GM-CSF
Passo 1: Cromatografia em colunas de aminas quaternárias pH de 180L de extracto bruto de GM-CSF foi ajustado a pH6,0 com 3,6L de tampao IM Bis-tris (pH 6,0) e com 2,0L de 4N HC1. A solução foi clarificada por centrifugação usando uma centrifuga Sharples a uma velocidade de alimentaçao de 0,75L/min. 0 sobrenadante foi diluido aproxima damente 1,55 vezes com água desionizada fria para atingir uma conductividade final de 5,5 mS/cm. Uma coluna de 12L de Q-Sepharose foi equilibrada com 10 volumes da coluna de tampao 20mM Bis-tris a pH6,0 e 43,6L de extracto foi aplicado a colu na colocando 20 mg de proteina por ml de resina. A coluna (25 cm de diâmetro) foi lavada com 120L de tampao de equilíbrio um fluxo de 250 ml/min. Estabeleceu-se um gradiente linear entre 78L de tampao 20mM Bis-tris contendo 0,03M NaCl a pH6,0 e 78L de tampao 20mM Bis-tris a pH6,0 contendo 0,32M NaCl. As
fracções (de 1,2L cada) foram combinadas com base na electroforese em gel (SDS-PAGE) e a proteina reunida (4,9L) foi cromatografada no Passo 2.
Passo 2: Cromatografia em coluna de sulfonato
As fracções combinadas (4,9L) do Passo 1 foram ajustadas a pH5 com 49 ml de ácido acético 1M (pH 5,0) e a conductividade ajustada a 15 mS/cm com 2L de ácido acético 0,01M ajustado a pH5 com NaOH. A solução foi filtrada através de um filtro de 0,2 micron e depois aplicada uma coluna de 0,8L de S-Sepharose previamente equilibrada com 20mM acido acético contendo 0,13M NaCl a pH5 aplicando a uma velocidade de 4,7 mg/ml de material da coluna. A coluna foi lavada com 2,4L de tampao de equilíbrio, depois eluida com um gradiente linear estabelecido entre 5,6L de ácido acético 20mM a pH5 contendo 0,13M NaCl e 5,6L de ácido acético 20mM a pH5 contendo 0,15M NaCl. As fracções foram combinadas com base em electroforese em gel. Este passo de cromatografia foi repetido.
Passo 3: Precipitação com sulfato de amónio
Adicionou-se sulfato de amónio às fracçoes combinadas do Passo 2 (240L), dando uma concentração de 35g/l (55% de saturaçao). A solução foi mantida a 4°C sem mistura durante 2 horas, depois foi centrifugada a 4500 rpm duran. te 30 min a 4°C para se obter o precipitado.
Passo 4: Cromatografia de filtraçao em gel sedimento de sulfato de amónio foi dissolvido em 36 ml de tampao fosfato de sódio 18mM, ácido cítrico 2mM, pH7,2. A solução foi centrifugada a 4500 rpm durante 30 min., e o sobrenadante filtrado através de um filtro de 0,2 microns. 0 filtrado foi aplicado numa coluna de 1,8L de Sephacryl S-200HR previamente equilibrada com tampao fosfato-citrato pH7,2 aplicando com úm fluxo de 0,21mg/ml de gel. A coluna foi eluida com 1,9L do mesmo tampao a pH 7,2, As frac© çoes foram combinadas com base no ensaio de proteína.
Passo 5: Filtraçao
As fracçoes combinadas do Passo 4 foram filtradas através de um filtro de 0,2 micron e guardadas a -20°C.
Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES1~.— Método para a separaçao de uma proteína bruta numa fracçao de proteína relativamente pura e numa fracçao de proteína impura caracterizado por se pôr a proteína bruta em contacto com uma resina de permuta ióniea a um pH tal que a proteína pura e as impurezas têm carga oposta, pelo que uma das referidas fracções é selectivamente ligada á resina de permuta ióniea.dicaçao 1, uma resina
- 2-.- Método de acordo com a reivin caracterizado por a resina de permuta ionica ser de permuta ióniea forte.uma das reivindicações 1 ou proteína relativamente pura nica.
- 3â.- Método de acordo com qualquer 2, caracterizado por a fracçao de ser ligada a resina de permuta ióuma das reivindicações da à resina de permuta
- 4ã.- Método de acordo com qualquer 1 a 3, caracterizado por a fracçao liga ióniea ser subsequente eluida.uma das reivindicações na bruta ser ajustado tricôs das fracções de
- 5-.- Método de acordo com qualquer 1 a 4, caracterizado por o pH da protei um pH dentro da gama de pontos isoelec proteina a serem separadas de tal forma que existe uma diferença de cargas amplificada entre as fracçoes.
- 6-.- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por os pontos isoelectricos das fracçoes de proteina serem determinados por simulação em computador ou usando geis de focagem isoeléctrica.Ί-.- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado ainda por a diferen ça de carga amplificada entre as fracçoes ser determinada por:A. determinação dos pontos isoelectricos da proteina pura e da impura; eB. selecçao de um pH entre a gama de pontos isoelectri. cos a que a proteina e a impura tem carga oposta e em que exis. te uma diferença de carga amplificada entre as fracçoes.
- 8ã.- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado ainda por a protejí na ser proteina de rDNA.
- 9-.- Método de qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado por a fracçao de proteina relativamente pura compreender factor de estimulação de colóni. as de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferao de leucócitos, interferao linfoblastóide, hormona de crescimento, superoxido dismutase, eritropoietina, antitrombina III, lactogénio, plastiminogenio, prolactina, urocinase ou proteina de ligaçao21 -S:\'ϋ· f- Ζ.a vitamina Β12.
- 10-.- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado ainda por a proteína pura ser GM-CSF.
- 11-.— Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado ainda pela ligaçao de impurezas de ponto isoelectrico elevado numa resina de permuta aniónica e remoção das impurezas de alto e baixo peso molecular numa coluna de filtraçao em gel.
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