PT737208E - Anticorpos monoclonais específicos para phf-tau, hibridomas que os segregam, reconhecimento de antigénios por estes anticorpos e suas aplicações - Google Patents

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DESCRIÇÃO "ANTICORPOS MONOCLONAIS ESPECÍFICOS PARA PHF-TAU, HIBRIDOMAS QUE OS SEGREGAM, RECONHECIMENTO DE ANTIGÉNIOS POR ESTES ANTICORPOS E SUAS APLICAÇÕES" Área da invenção A invenção relaciona-se com novos anticorpos monoclonais específicos para a PHF-tau, com os hibridomas que segregam estes anticorpos monoclonais e com o padrão de reconhecimento de antigénio destes anticorpos monoclonais e com as suas aplicações. A invenção relaciona-se também com um processo para diagnosticar doenças cerebrais que envolve anticorpos monoclonais da invenção, mais particularmente em amostras de fluido céfalo-raquidiano (CSF). A invenção relaciona-se também com uma região da molécula tau modificável in vivo pelo processo de fosforilação, a qual se constata estar associada à doença de Alzheimer ou a outros tipos de demência e a qual é especificamente reconhecida pelos anticorpos monoclonais da invenção.

Antecedentes da invenção A doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum da demência de aparecimento no adulto. Presentemente, não se encontra disponível qualquer ensaio bioquímico para diagnóstico ante-mortem da AD. A doença é, deste modo, clinicamente diagnosticada com base na exclusão de outras formas de demência. 0 diagnóstico pode ser confirmado neuropatologicamente através da demonstração de grandes quantidades de placas nevríticas (senis) e feixes 2 neurofibrilares (NFT) em regiões particulares do cérebro (McKhann et al, 1984).

Os feixes neurofibrilares são constituídos por filamentos helicoidais emparelhados (PHFs). A evidência imunocitoquímica sugere que a proteína tau associada a microtúbulos é um componente proteico maioritário dos PHF e NFT (Brion et al., 1985b; Delacourte e Defossez, 1986;

Grundke-Iqbal et al., 1986; Kosik et al., 1986; Wood et al., 1986) . A prova definitiva que o domínio de ligação à tubulina da tau está fortemente associado ao núcleo dos PHFs foi obtida através da sequenciação de aminoácidos (Kondo et al., 1988). No entanto foi sugerido que os péptidos tau podem representar apenas uma pequena fracção do componente principal do PHF (Wischik et al., 1988). A proteína tau existe em isoformas diferentes, das quais 4 até 6 estão presentes no cérebro do adulto mas apenas 1 isoforma é detectada no cérebro fetal. A diversidade das isoformas é gerada a partir de um único gene no cromossoma humano 17 por excisão-união alternativa de ARNm (Andreadis et al., 1992). A caracterí stica mais impressionante da proteína tau, como deduzida a partir da clonagem molecular, é um trecho de 31 ou 32 aminoácidos, que ocorre na extremidade carboxilo da molécula, a qual se pode repetir 3 ou 4 vezes. Uma diversidade adicional é criada através de inserções de 29 ou 58 aminoácidos de comprimento na extremidade NH2 da molécula tau (Goedert et al., 1989). Por razões de simplicidade, todas as numerações neste pedido de patente referem-se à variante tau htau40 contendo todos os exões (441 aminoácidos de comprimento) segundo Goedert et al (1989). 3

Em circunstâncias normais, a tau promove a associação de microtúbulos e a estabilidade no compartimento axonal dos neurónios. 0 domínio de ligação aos microtúbulos na tau está localizado na região de repetição da tau (255-381) (Lewis et al, 1990) e é modulado por regiões adjacentes: a extremidade carboxilo (382-414) e a região rica em prolina (143-254) (Drubin & Kirschner, 1991). A estabilidade e enfaixamento dos é mediada por um fecho hidrófobo curto na extremidade carboxilo da tau (Lewis et al, 1989). A associação e estabilidade são reguladas por excisão-união alternativa de ARNm e fosforilação.

Em circunstâncias normais, o cérebro do adulto contém 2 a 3 mol de fosfato por mole de tau (Selden e Pollard, 1983; Ksiezak-Reding et al, 1992) presentes, entre outras, na serina 404 (Poulter et al, 1993), enguanto outros resultados demonstram gue a fosforilação de sítios diferentes na tau normal segue perfis de desenvolvimento diferentes (Lee et al, 1991; Bramblett et al, 1993; Goedert et al, 1993a) . As variantes anormais da tau de 60, 64 e 68 kDa foram detectadas exclusivamente em áreas cerebrais que apresentam alterações neurofibrilares e placas senis (Delacourte et al. 1990). O comportamento electroforético anormal da tau é devido à fosforilação uma vez que o tratamento destas moléculas tau com fosfatase alcalina altera a sua massa molecular para o da tau normal (Goedert et al., 1992; Flament et al., 1990b, Greenberg & Davies, 1990). Presentemente foram detectados sítios de fosforilação anormal na PHF-tau nas posições 46, 231, 235, 263 e 396 (Iqbal et al., 1989; Lee et al., 1991; Hasegawa et al., 1992) . Em quatro destes sítios, o resíduo fosforilado é seguido de um resíduo de prolina, o que 4 indica que está envolvida uma cinase dirigida por prolina em algumas das fosforilaçãos anormais da tau. Além destes sítios encontram-se presentes mais dez na htau40, dois dos quais estão anormalmente fosforilados, como indicado pela reactividade do anticorpo (Mab tau2: Watanabe et al., 1992; Mab AT8: Biernat et al., 1992, Goedert et al., 1993). A fosforilação anormal da tau na doença de Alzheimer é devida a uma mudança no equilíbrio fosfatase/cinase. Existem várias cinases que podem fosforilar a tau in vitro: cdc2-cinases (Vulliet et al, 1992; Ledesma et al, 1992), MAP cinases (Drewes et al, 1992, Roder e Ingram, 1991), glicogénio sintase-cinases (Mandelkow et al, 1992) e TPKI e TPKII (Ishiguro et al, 1992). As fosfatases estão menos bem estudadas na doença de Alzheimer e, até à data, apenas uma fosfatase foi capaz de desfosforilar in vitro os sítios anormalmente fosforilados, nomeadamente a proteína fosfatase 2AX (Goedert et al, 1992).

Até à data, a detecção de PHF-tau nos extractos cerebrais, quer através de anticorpos (Mab Alz50: Ghanbari et al., 1990; Mab Ab423: Harrington et al., 1991) ou através da alteração do peso molecular (Flament et al., 1990, Delacourte et al., 1993), ou, de outro modo, pelo ensaio funcional (Bramblett et al. 1992) tem sido muito útil para discriminar a demência com propriedades citoesqueléticas alteradas dos indivíduos geriátricos normais ou de doentes com outros tipos de demência. No entanto, a detecção de PHF-tau no CSF permaneceu impossível, até mesmo utilizando anticorpos dirigidos para um dos sítios anormalmente fosforilados tais como serina 202 (Goedert et al., 1993). Isto pode ser atribuído a uma 5 ou mais das razões seguintes: 1) a concentração baixa de PHF-tau no CSF, 2) utilização não homogénea de sítios de fosforilação entre todos os sítios potenciais de fosforilação, 3) diferenças na sensibilidade da fosfatase destes sítios e 4) constante de afinidade demasiado baixa dos anticorpos utilizados. 0 objectivo da presente invenção é, deste modo, proporcionar anticorpos monoclonais que permitam a detecção fiável e sensível de tau anormalmente fosforilada no fluido céfalo-raquidiano. A invenção também tem por objectivo proporcionar os hibridomas que segregam os anticorpos monoclonais supramencionados.

Além disso, a invenção tem por objectivo proporcionar os determinantes antigénicos da proteína tau anormalmente fosforilada presente em tecidos cerebrais homogeneizados ou em fluidos orgânicos tal como o fluido céfalo-raquidiano, que são reconhecidos pelos referidos anticorpos monoclonais.

Finalmente, a invenção tem por objectivo proporcionar um processo para a detecção ou diagnóstico in vitro de doenças cerebrais que envolvem proteínas tau anormalmente fosforiladas.

Sumário da invenção A invenção relaciona-se com um anticorpo monoclonal segregado pelo hibridoma depositado na ECACC em 7 de Julho 6 de 1993, sob o n° 93070774, e com o referido hibridoma depositado. A invenção relaciona-se ainda com um processo para o diagnóstico in vitro de um doente que se suspeita sofrer da doença de Alzheimer compreendendo: -(a) detecção do nivel de PHF-tau numa amostra de CSF obtida do referido doente por ligação imunológica a anticorpos monoclonais capazes de reconhecer especificamente, num péptido tau fosforilado, uma sequência de aminoácidos Pro-Lis-Tre-Pro-Pro (SEQ ID No:3), estando a referida Tre(181) fosforilada, ou anticorpos monoclonais segregados pelo hibridoma depositado da reivindicação 2, -(b) comparação do nivel obtido em (a) com o nivel de PHF-tau presente em amostras de CSF obtidas a partir de controlos, em que uma concentração mais elevada de tau anormalmente fosforilada no referido doente indica o diagnóstico de doença de Alzheimer.

Descrição pormenorizada da invenção A presente invenção relaciona-se, mais particularmente, com um anticorpo monoclonal que forma um complexo imunológico com um determinante antigénico fosforilado de um antigénio pertencente à tau anormalmente fosforilada (PHF-tau) residente na região que atravessa as posições 143-254 com a sequência de aminoácidos seguinte: 7

! !|nh5“ 143: Lys 1 !ly 111 àsp Gly Lys Thr 150 Lys lie Ala Thr Íro Arg N|| Ala A~ci §|r©· li!! llib Gly Gin ÉÉ- Giy Gin Ala ASn §U.a Thr 170 Arg iiliiéi Pro Ma iiiír· Pro Pro- Ala iifro 180: Lys Thr Pro Pro Sèr S|§ tsiíl Glu Pro Pro l|o ly® Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr !||r Ser 200 Pro Í3|jl Ser Pro |ly Thr Pro Giy: Ser Arcf i:|il|Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Alá Val Val 230 Arg o u & u Et Pro Lys Ser Pro; Sér Ser Ala 240 Lys Ser Arg Leu Gin Thr Ml m Pr;Íi val Pro 250 Met Pro Asp teu Lys COOU (SEQ ID NO 1) e sendo o referido anticorpo monoclonal caracterizado pelo facto de ser capaz de detectar especificamente a proteína tau anormalmente fosforilada (PHF-tau) no fluido céfalo- raquidiano (CSF).

Os anticorpos monoclonais da invenção foram seleccionados de uma gama de anticorpos monoclonais obtidos por imunização directa com PHF-tau, extraídos de tecido cerebral humano proveniente de doentes de Alzheimer. Mais particularmente os anticorpos monoclonais da invenção são caracterizados pelo facto de eles se ligarem especificamente à tau anormalmente fosforilada natural. Análises adicionais dos determinantes antigénicos mostraram que os anticorpos monoclonais da invenção são orientados para determinantes antigénicos fosforilados confinados a uma região particular da molécula tau, nomeadamente a região entre 143 e 254 incluindo vários sítios potenciais 8 de fosforilação tais como T153 e S235 utilizados pelas cinases dirigidas para as SP e TP. Os anticorpos monoclonais da invenção são ainda caracterizados pelo facto de reconhecerem determinantes antigénicos gue são diferentes do determinante antigénico do anticorpo monoclonal AT8 como definido em Goedert et al. (1993) e por comparação com os anticorpos AT8 permitem detectar PHF-tau em CSF. Eles reconhecem preferencialmente PHF-tau em secções de cérebro, imunotransferências ou ELISA e eles são surpreendentemente capazes de detectar PHF-tau no CSF, guer sozinhos ou associados a outros anticorpos específicos para o PHF-tau.

Em conclusão, os anticorpos monoclonais da invenção são caracterizados pelo facto de se ligarem especificamente à tau anormalmente fosforilada natural em gue o estado de fosforilação está confinado a uma região particular das moléculas tau como especificado acima, ou de se ligarem à tau não fosforilada recombinante após tratamento com cinases dirigidas para a prolina, as guais podem provocar a fosforilação, entre outros, de sítios de Ser-Pro ou Tre-Pro na região como especificada. As cinases dirigidas para a prolina tais como as MAP cinases (Sturgill et al., 1991), cdc2 cinases (Labbé et al., 1991) e glicogénio sintase cinases (Vandenheede et al., 1980) podem ser purificadas a partir de vários tecidos ou podem estar presentes em extractos cerebrais. A fosforilação da tau por estas cinases é eliminada ou fortemente diminuída quando uma ou mais das seguintes serinas/treoninas estão mutadas para um aminoácido tal como Ala: T153, T175, T181, S199, S202, T205, T212, T217, T231 ou S235. Consequentemente, o determinante antigénico destes anticorpos pode ser 9 caracterizado via essa tau mutante, ou via a tau não fosforilada tal como a tau recombinante expressada procarioticamente e os seus homólogos fosforilados, ou via péptidos sintéticos com a mesma sequência de aminoácidos como parte da região especificada acima da proteína tau 40 humana, sendo os referidos péptidos capazes de serem fosforilados pelas referidas cinases ou sendo incapazes de serem fosforilados após síntese dos péptidos. Os determinantes antigénicos referidos na presente invenção são assim definidos como a região rica em prolina da tau entre as posições 143 e 254 e a qual pode estar anormalmente fosforilada na treonina 153 (T153), T175, TI 81, SI 99, S202, T205, T212, T217, T231 e S235 ou uma combinação destes sítios incluídos no determinante antigénico destes anticorpos, referidos ainda como "determinantes antigénicos de PHF-tau". A expressão "que detecta especificamente a proteína tau anormalmente fosforilada" corresponde ao facto dos anticorpos monoclonais da invenção detectarem a tau anormalmente fosforilada no CSF sem reactividade cruzada com a tau normal presente no CSF. A expressão "forma um complexo imunológico com" significa que o anticorpo monoclonal da invenção se liga ao antigénio supramencionado em condições como mencionadas numa das seguintes técnicas:

Imunomicroscopia óptica

Fixa-se amostras de tecido cerebral, e.g. de doentes com Alzheimer obtidas durante a cirurgia ou autópsia, por 10 imersão formalina a 4% ou fixador de Bouin e embebe-se em parafina para seccionamento. Aplica-se os anticorpos monoclonais da invenção em conjunto com uma técnica que visualize os complexos imunes formados tal como a técnica do complexo de avidina-peroxidase biotinilada (Hsu et al., 1981) utilizando tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina para desenvolvimento da cor. As secções são contra-reveladas com revelador de hematoxilina de Harris.

Imunomicroscopia electrónica em secções de tecido

Fixa-se amostras de tecido cerebral obtidas e.g. de doentes com Alzheimer durante a cirurgia ou autópsia em fixador de Bouin ou formalina tamponada a 10% antes de se cortar em secções sem embeber (Vibratome). Utiliza-se o anticorpo monoclonal da invenção para imunorrevelar pelo método do imunoouro indirecto após o que se fixa as secções, embebe-se e secciona-se por microscopia electrónica, tudo de acordo com protocolos correntes conhecidos dos especialistas na técnica (Brion et al., 1985a).

Procedimentos de imunotransferência

Para imunotransferência, prepara-se fracções enriquecidas em PHF-tau como descrito (Greenberg e Davies, 1990). Tipicamente, obteve-se tecido post mortem, constituído principalmente por matéria cinzenta, a partir do córtex frontal e temporal de doentes com Alzheimer confirmada histologicamente. Homogeneizou-se esta amostra de matéria cinzenta de cérebro com Alzheimer (5-10 g) com 10 volumes de tampão H frio (Tris 10 mM/ EGTA 1 mM/NaCl 0,8 11 Μ/10% de sacarose, pH 7,4) num homogeneizador de Teflon/vidro Potter S (Braun, Alemanha). Após centrifugação do homogenato num rotor 60 Ti MSE a 27.000 χ g durante 20 min a 4 °C, retirou-se o sedimento e ajustou-se o sobrenadante a 1% (peso/vol) de N-laurosilsarcosina e 1% (vol/vol) de 2-mercaptoetanol e incubou-se ao mesmo tempo que era agitado com um movimento rotatório num misturador (Swelab, Suécia) durante 2,5 horas a 37 °C. Centrifugou-se a mistura sobrenadante a 108.000 χ g durante 35 min a 20 °C. Lavou-se suavemente o sedimento contendo a PHF-tau com PBS e suspendeu-se finalmente em 1 ml do mesmo tampão. A electroforese com SDS-poliacrilamida é realizada em condições redutoras em geles a 12% (Laemmli, 1970) . Após electroforese, as proteínas são fixadas e reveladas com azul brilhante de Coomassie, ou são transferidas (Towbin et al., 1979) para folhas de nitrocelulose (Hybond-C, Amersham) ou para filtros Immobilon (Millipore).

Após transferência, os filtros são enxaguados em PBS contendo 0,05% (v/v) de Tween 20 (Tween-PBS) e depois incubados durante 1 h em Tween-PBS contendo 5% (p/v) de leite em pó desnatado e 10% (v/v) de soro de vitelo recém-nascido (tampão de bloqueio). Em seguida, trata-se os filtros dum dia para o outro a 4 °C com um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção apropriadamente diluído em tampão de bloqueio.

Lava-se em seguida os filtros três vezes em Tween-PBS e trata-se durante 1,5 h à temperatura ambiente com IgG anti-ratinho de coelho marcada com peroxidase de rábano-silvestre (Dakopatts, Dinamarca) diluída a 1/3000 em tampão 12 de bloqueio. Após três lavagens em Tween-PBS, aplica-se complexo de estreptavidina-peroxidase de rábano-silvestre biotinilada (Amersham), diluída a 1/250 em tampão de bloqueio, durante 1,5 h à temperatura ambiente. Subsequentemente, lava-se os filtros três vezes em Tween-PBS e uma vez em PBS. Incuba-se em seguida os filtros em PBS contendo 0,05% (p/v) de diaminobenzidina e 0,03% (v/v) de peróxido de hidrogénio até se desenvolver uma revelação de base.

Deverá ficar claro que a formação de um complexo imunológico entre os anticorpos monoclonais e o antigénio não se restringe às condições exactas descritas acima, originando todas as técnicas que respeitam as propriedades imunoquímicas da ligação do anticorpo e do antigénio a formação semelhante de um complexo imunológico. A presente invenção relaciona-se mais particularmente com um anticorpo monoclonal como definido acima, caracterizado pelo facto de formar um complexo imunológico: quer com um determinante antigénico fosforilado localizado dentro da sequência definida acima (SEQ ID NO D , ou com qualquer outro péptido fosforilado que seja capaz de formar um complexo imunológico com um anticorpo monoclonal, o qual é ele próprio capaz de formar um complexo com um determinante antigénico fosforilado localizado na região da proteína tau humana como se mostra na SEQ ID NO 1.

Os AT180 e AT270 são produzidos por hibridomas depositados na ECACC (European Collection of Animal Cell 13

Cultures, Vaccine Research e Production Laboratory, Public Health e Laboratory Service (PHLS), Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, GB-Salisbury, Wiltshire SP4 OJG) , em 22 de Dezembro de 1992, sob o n° 92122204 ou em 7 de Julho de 1993 sob o n° 93070774.

Os anticorpos monoclonais supramencionados são obtidos por um processo que envolve a obtenção e isolamento de hibridomas que segregam estes anticorpos monoclonais.

Os anticorpos monoclonais preferidos da invenção permitem a detecção de pelo menos 1, 5, 10 ou 20 pg/ml de tau fosforilada como determinada num ELISA utilizando estes anticorpos monoclonais na fase de revestimento e incubando-os com CSF fortificado com quantidades diferentes de tau fosforilada e não fosforilada sem amplificação. A tau fosforilada é preparada incubando tau não fosforilada recombinante com um extracto de cérebro de ratazana capaz de fosforilar os aminoácidos Ser e Tre nas posições correspondentes aos sítios de fosforilação anormal da tau (Goedert et al., 1993), como se encontra em extractos de tau de tecido cerebral proveniente de doentes que morreram com doença de Alzheimer.

Um processo para se obter os hibridomas da invenção envolve: partir de células do baço de um animal, e.g. ratinho ou ratazana, previamente imunizado in vivo ou a partir de células do baço de tais animais previamente imunizados in vitro com um antigénio o qual é preferencialmente a tau anormalmente fosforilada (PHF-tau), ou um péptido tau humano fosforilado ou tau anormalmente 14 fosforilada purificada por imunoafinidade, como se descreve a seguir, reconhecido pelos anticorpos monoclonais da invenção; fundir as referidas células imunizadas com células de mieloma em condições de formação de hibridomas; e seleccionar os hibridomas que segreguem os anticorpos monoclonais que são capazes de reconhecer especificamente um determinante antigénico fosforilado da tau anormalmente fosforilada (PHF-tau) no fluido céfalo-raquidiano (CSF). 0 péptido tau humano fosforilado refere-se a um péptido compreendendo na sua sequência de aminoácidos uma sequência fosforilada contida na região que atravessa os aminoácidos 143 até 254 da tau humana e em que o referido péptido é caracterizado pelo facto de poder formar um complexo imunológico com os anticorpos da invenção. 0 antigénio da invenção está vantajosamente compreendido no cérebro, no fluido céfalo-raquidiano ou no soro de um doente com doença de Alzheimer, sindrome de Down, doença de Pick, panencefalite esclerosante subaguda (SSPE) ou outras doenças neurológicas nas quais esteja implicada a proteína tau anormalmente fosforilada; este antigénio provoca uma reacção imunológica com o anticorpo monoclonal da invenção.

Mais particularmente, a presente invenção relaciona-se também com os anticorpos monoclonais como definidos acima, obtidos por um processo como definido acima, caracterizado por envolver: 15 partir de células de um ratinho previamente imunizado com tau anormalmente fosforilada (PHF-tau) extraída e purificada de uma amostra de cérebro humano de um paciente que sofra da doença de Alzheimer (como se descreve na secção de exemplos), ou um péptido tau humano fosforilado, ou tau anormalmente fosforilada purificada por imunoafinidade capaz de reagir com os anticorpos monoclonais da invenção, fundir as referidas células imunizadas com células de mieloma em condições de formação de hibridoma, seleccionar os hibridomas que segregam anticorpos monoclonais que reconhecem especificamente a PHF-tau e que são capazes de detectar especificamente a PHF-tau no CSF (como se ilustra em pormenor na secção de exemplos).

Um processo para produzir os anticorpos monoclonais da invenção envolve: cultivar os hibridomas seleccionados, como indicado acima, num meio de cultura apropriado; e recuperar os anticorpos monoclonais segregados pelo referido hibridoma seleccionado; ou alternativamente - implantar o hibridoma seleccionado no peritoneu de um ratinho e, quando tiverem sido produzidas ascites no animal; recuperar os anticorpos monoclonais então gerados a partir das referidas ascites.

Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser preparados por técnicas in vitro convencionais tal como a cultura de células imobilizadas utilizando e.g. fibras ocas ou microcápsulas ou tal como a cultura de células em 16 suspensão homogénea utilizando e.g. reactores de agitaçao pneumática ou biorreactores de agitação. A invenção relaciona-se também com um péptido que é capaz de formar um complexo imunológico com qualquer um dos anticorpos monoclonais da invenção, encontrando-se o referido péptido na forma fosforilada, e, - em que a sequência do referido péptido compreende ou é constituída por partes fosforiladas da sequência como se mostra na SEQ ID NO 1, ou, - em que a sequência do referido péptido compreende ou é constituída pela sequência de qualquer péptido que seja capaz de formar um complexo imunológico com qualquer um dos anticorpos monoclonais de acordo com a invenção.

Os referidos péptidos fosforilados são preferencialmente desde 6 até 100 aminoácidos de comprimento. Os péptidos de acordo com esta forma de realização da invenção podem ser preparados por síntese química clássica. A síntese pode ser realizada em solução homogénea ou em fase sólida de acordo com qualquer uma das técnicas bem conhecidas na matéria.

Os péptidos fosforilados são preparados segundo qualquer técnica conhecida na matéria, (f.i. de Bont et al., 1990a; de Bont et al., 1990b; Perich, 1991; Otvos et al., 1989) A presente invenção relaciona-se com um péptido fosforilado, como definido acima, constituído por ou compreendendo na sua sequência de aminoácidos a sequência seguinte: 17

Val-Arg-Tre-Pro-Pro (aminoácidos 229-233; numeração da tau 40 humana, SEQ ID NO 2), em que a referida Tre(231) está fosforilada e em que o referido péptido é caracterizado pelo facto de ser capaz de formar um complexo imunológico com o anticorpo monoclonal AT180 produzido pelo hibridoma depositado na ECACC em 22 de Dezembro de 1992 sob o n° 92122204.

De acordo com uma forma de realização preferida, a presente invenção relaciona-se com um péptido fosforilado, como definido acima, constituído por ou compreendendo na sua sequência de aminoácidos a sequência seguinte: Pro-Lis-Tre-Pro-Pro (aminoácidos 179-183; numeração da tau 40 humana; SEQ ID NO 3), em que a referida Tre(181) está fosforilada e em que o referido péptido é caracterizado pelo facto de ser capaz de formar um complexo imunológico com o anticorpo monoclonal AT270 produzido pelo hibridoma depositado na ECACC em 7 de Julho de 1993 sob o n° 93070774. A presente invenção relaciona-se com um péptido fosforilado, como definido acima, o qual é capaz de gerar um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 4 após imunização.

Os péptidos utilizados para imunização estão preferencialmente na forma na qual eles são unidos a uma molécula portadora para conseguir uma resposta imunogénica boa. Estas moléculas portadoras são bem conhecidas na técnica e são acopladas ao péptido através de grupos de ligação, os quais também estão compreendidos na técnica. 18 A invenção relaciona-se também com um processo para a detecção post-mortem ou diagnóstico in vitro de uma doença cerebral/neurológica envolvendo a PHF-tau, tal como a doença de Alzheimer, o qual compreende pelo menos os passos seguintes: - fazer contactar um anticorpo monoclonal da invenção com um preparado de NFT ou um homogenato cerebral extraído com detergente isolado de um doente que tivesse doença de Alzheimer ou qualquer outra doença envolvendo a proteína tau anormalmente fosforilada (PHF-tau) em condições adequadas para produzir um complexo antigénio-anticorpo; detectar a ligação imunológica do referido anticorpo ao referido homogenato cerebral e, provavelmente, separar o referido complexo e recuperar o antigénio procurado numa forma purificada. A recuperação do antigénio procurado pode ser efectuada lavando, em primeiro lugar, o complexo anticorpo imobilizado-antigénio então formado; tratando este complexo com uma solução (e.g. tiocianato de potássio 3 M, cloreto de magnésio 2,5 M, citrato-ácido cítrico 0,2 M, pH 3,5 ou ácido acético 0,1 M) capaz de originar a dissociação do complexo antigénio-anticorpo; e; recuperar o antigénio numa forma purificada. A invenção também se relaciona com um processo para a detecção ou diagnóstico in vitro de doença cerebral/neurológica envolvendo a proteína tau anormalmente fosforilada, tal como na doença de Alzheimer, o qual inclui: 19 colocar em contacto uma amostra de CSF, mais preferencialmente CSF não concentrado, ou uma amostra de soro de um doente que se suspeite sofrer de doença cerebral envolvendo a PHF-tau, mais particularmente doença de Alzheimer, ou proteinas ou polipéptidos resultantes de um procedimento de extracção a partir de tecido cerebrais, fluido céfalo-raquidiano ou soro conhecido do especialista na técnica (Ibqal et al., 1984; Greenberq & Davies, 1990) em condições in vitro com um anticorpo monoclonal da invenção, em que as referidas condições são adequadas para produzir um complexo antigénio-anticorpo; e, detectar a ligação imunológica do referido anticorpo à referida amostra de extracto cerebral, fluido céfalo-raquidiano ou soro, ou proteinas ou polipéptidos.

Vantajosamente, os anticorpos monoclonais da invenção estão num estado imobilizado num suporte adequado tal como uma resina. Alternativamente, o presente processo pode ser posto em prática utilizando qualquer outro formato de imunoensaio conhecido do especialista na técnica. O processo para a detecção do antigénio pode ser realizado, por exemplo, do seguinte modo: colocar em contacto o referido complexo antigénio-anticorpo formado pelo antigénio e pelos anticorpos da invenção com: - um segundo anticorpo * o qual pode ser um anticorpo monoclonal que reconhece um determinante antigénico da proteína tau anormalmente fosforilada ou um determinante antigénico de qualquer péptido tau fosforilado portador de um determinante antigénico, sendo os referidos 20 determinantes antigénicos diferentes do da invenção, ou * o qual pode ser um anticorpo policlonal que reconhece a tau anormalmente fosforilada ou um anticorpo policlonal que reconhece um péptido portador de um determinante antigénico de PHF-tau, sendo o referido anticorpo policlonal capaz de formar um complexo imunológico com determinantes antigénicos que são diferentes do determinante antigénico da invenção, sendo o referido anticorpo policlonal preferencialmente purificado por cromatografia de imunoafinidade utilizando proteína tau imobilizada; um marcador para marcação ou acoplamento específico com o referido segundo anticorpo, sendo o referido marcador qualquer marcador possível conhecido do especialista na técnica; as soluções tampão apropriadas para realizar a reacção imunológica entre o anticorpo monoclonal da invenção e uma amostra de ensaio por um lado, e o segundo anticorpo ligado e o marcador por outro. A detecção do anticorpo monoclonal imunologicamente ligado pode ser conseguida por tecnologia convencional compreendida na técnica. Vantajosamente, o próprio segundo anticorpo é portador de um marcador ou de um grupo para acoplamento directo ou indirecto com um marcador.

Os anticorpos monoclonais da invenção também permitem o diagnóstico da doença de Alzheimer (AD) e de qualquer doença que envolva a formação da tau anormalmente fosforilada na região de 143 até 254 com base no CSF (isto é, para detectar formas modificadas da tau no CSF) . O 21 problema aqui associado é que este antiqénio está presente numa quantidade muito pequena no CSF, pelo que o ensaio de detecção tem de ser muito sensível. Este problema de sensibilidade pode ser ainda ultrapassado (i) utilizando uma combinação dos anticorpos monoclonais da invenção, ou (ii) uma combinação de um anticorpo monoclonal da invenção com quaisquer outros anticorpos monoclonais da tau normal e/ou anormalmente fosforilada conhecidos na técnica e/ou (iii) utilizando um anticorpo monoclonal ou uma combinação de anticorpos monoclonais da invenção associados a uma técnica de amplificação tal como a técnica de amplificação catalisada de deposição de repórter (CARD, Bobrow et al., 1989), viabilizando um ELISA específico para a PHF-tau com uma alta sensibilidade.

Os resultados obtidos com os anticorpos monoclonais da invenção indicam que estão presentes níveis elevados de PHF-tau na AD, os quais podem contudo também surqir noutras doenças neurológicas onde ocorra fosforilação anormal da tau na região da tau compreendida pelos aminoácidos 143 até 254.

De acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção relaciona-se com um estojo para o diagnóstico in vitro de uma das doenças seguintes: doença de Alzheimer, síndrome de Down, doença de Pick e outros distúrbios neurológicos nos quais está implicada a proteína tau anormalmente fosforilada ou filamentos helicoidais emparelhados, caracterizado pelo estojo compreender: pelo menos um anticorpo monoclonal da invenção depositado numa microplaca; 22 uma preparação que contém a amostra (CSF, soro ou as proteínas extraídas daquele) para ser diagnosticada in vitro, um segundo anticorpo * o qual pode ser um anticorpo monoclonal que reconhece um determinante antigénico da proteína tau anormalmente fosforilada ou um determinante antigénico de qualquer péptido tau fosforilado portador de um determinante antigénico, sendo os referidos determinantes antigénicos diferentes do da invenção, ou * o qual pode ser um anticorpo policlonal que reconhece a tau anormalmente fosforilada ou um anticorpo policlonal que reconhece um péptido portador de um determinante antigénico da PHF-tau, sendo o referido anticorpo policlonal capaz de formar um complexo imunológico com determinantes antigénicos que são diferentes do determinante antigénico da invenção, sendo o referido anticorpo policlonal preferencialmente purificado por cromatografia de imunoafinidade, utilizando a proteína tau imobilizada; um marcador para a marcação ou acoplamento com o referido segundo anticorpo; - soluções tampão apropriadas para realizar a reacção imunológica entre o anticorpo monoclonal da invenção e uma amostra de ensaio por um lado, e o segundo anticorpo ligado e o marcador por outro lado, eventualmente, um péptido portador de um determinante antigénico da PHF-tau constituído pela região que atravessa os aminoácidos 143 até 254 para efeitos correntes, ou para efeitos de competição em relação ao antigénio que é procurado. 23

Uma forma de realização preferida da presente invenção para a detecção ou diagnóstico in vitro de doença cerebral/neurológica que envolve a proteína tau anormalmente fosforilada, tal como a doença de Alzheimer, relaciona-se com um método ou um estojo como definido acima, o qual compreende uma mistura (combinação) de anticorpos monoclonais utilizados na invenção ou uma combinação de pelo menos um anticorpo monoclonal utilizado na invenção com outros anticorpos capazes de reconhecer especificamente uma região da PHF-tau situada na região que atravessa as posições 143-254 da tau 40 humana (SEQ ID NO 1), sendo os referidos anticorpos monoclonais preferencialmente seleccionados de: * (D O anticorpo monoclonal ATI 80 produzido pelo hibridoma depositado na ECACC em 22 de Dezembro de 1992 sob o n° 92122204; * (2) o anticorpo monoclonal AT270 produzido pelo hibridoma depositado na ECACC em 7 de Julho de 1993 sob o n° 93070774; * (3) o anticorpo monoclonal AT 8 produzido pelo hibridoma depositado na ECACC em 8 de Outubro de 1991 sob o n° 91100806; e em que a referida mistura é preferencialmente seleccionada da lista seguinte: *uma mistura de anticorpos monoclonais compreendendo os anticorpos monoclonais (1) e (2), *uma mistura dos anticorpos monoclonais compreendendo os anticorpos monoclonais (2) e (3), compreendendo *uma mistura dos anticorpos monoclonais os anticorpos monoclonais (1), (2) e (3); 24 sendo o referido método ou estojo ainda caracterizado por conter ou utilizar: uma preparação contendo a amostra a ser diagnosticada in vitro; um segundo anticorpo * o qual pode ser um anticorpo monoclonal que reconhece um determinante antigénico da proteína tau anormalmente fosforilada ou um determinante antigénico de qualquer péptido tau fosforilado portador de um determinante antigénico, sendo os referidos determinantes antigénicos diferentes do da invenção, ou * o qual pode ser um anticorpo policlonal que reconhece a tau anormalmente fosforilada ou um anticorpo policlonal que reconhece um péptido portador de um determinante antigénico da PHF-tau, sendo o referido anticorpo policlonal capaz de formar um complexo imunológico com determinantes antigénicos que são diferentes do determinante antigénico da invenção, sendo o referido anticorpo policlonal preferencialmente purificado por cromatografia de imunoafinidade utilizando proteína tau imobilizada; um marcador para a marcação ou acoplamento específico com o referido segundo anticorpo; soluções tampão apropriadas para realizar a reacção imunológica entre o anticorpo monoclonal da invenção e a amostra de ensaio por um lado, e o segundo anticorpo ligado e o marcador por outro, eventualmente, um péptido portador de um determinante antigénico da PHF-tau para efeitos correntes ou para efeitos de competição em relação ao antigénio que está a ser procurado. 25

Ainda de acordo com outra forma de realização preferida, a presente invenção relaciona-se com um método ou estojo para detectar ou diagnosticar in vitro uma doença cerebral/neurológica que envolve a proteína tau anormalmente fosforilada, tal como a doença de Alzheimer, o qual envolve um formato de detecção ELISA em sanduíche compreendendo o revestimento e detecção de anticorpos, consistindo os referidos anticorpos de revestimento de pelo menos um anticorpo monoclonal utilizado na invenção, e consistindo os referidos anticorpos de detecção de pelo menos um anticorpo monoclonal que seja capaz de detectar a tau humana normal e/ou anormalmente fosforilada no qual o determinante antigénico é diferente de qualquer um dos determinantes antigénicos dos anticorpos monoclonais da invenção. Um tal formato de ELISA em sanduíche preferido está proficuamente ilustrado na secção de exemplos da presente invenção.

LEGENDAS DOS QUADROS E FIGURAS

Quadro 1

Detecção de PHF-tau e tau normal utilizando anticorpos monoclonais AT180 e AT270 específicos para a PHF-tau. Incubou-se microplacas revestidas com quantidades de saturação de um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a PHF-tau com CSF fortificado com quantidades diferentes de tau não fosforilada e fosforilada, sendo a última preparada incubando tau recombinante não fosforilada com um extracto de cérebro de ratazana que é capaz de fosforilar os aminoácidos Ser e Tre 26 em posições correspondentes aos sítios de fosforilação anormal da tau (Goedert et al., 1993). 0 antigénio ligado foi detectado como se descreve na secção de exemplos.

Quadro 2

Analisou-se amostras de CSF de doentes com AD, doentes de controlo e doentes que sofrem de vários distúrbios neurológicos que não a AD em ELISA utilizando combinações diferentes de anticorpos de captura como se descreve (exemplo III). Todos os valores são exprimidos em unidades mOD à excepção da determinação da tau total a qual foi efectuada utilizando o Innotest htau (Innogenetics, Bélgica) e os quais são exprimidos em pg/ml de CSF.

As condições experimentais diferentes utilizadas para cada conjunto de condições permitem apenas uma comparação intra-colunas.

Quadro 3

Analisou-se amostras de CSF de doentes de controlo, doentes com AD e doentes que sofrem de vários distúrbios neurológicos que não a AD (OND) utilizando o Innotest htau (Innogenetics, Bélgica). Das classes etárias de doentes AD e doentes OND seleccionou-se aqueles com valores elevados de tau total para ensaio posterior utilizando ELISA específico para a PHF-tau no qual se utilizou AT8, AT180 e AT270 como anticorpos de captura e AT120 e HT7 como anticorpos de detecção como se descreve (Exemplo IV) . Os resultados são exprimidos em pg/ml de tau no CSF para a tau 27 total (Innotest htau) e como unidades de mOD para o ELISA específico para a PHF-tau.

Figura 1

Detecção de PHF-tau e tau normal utilizando o anticorpo monoclonal AT180. Incubou-se microplacas revestidas com quantidades de saturação de anticorpo monoclonal AT180 que reconhece especificamente a PHF-tau com CSF fortificado com quantidades diferentes de tau não fosforilado ou fosforilado, sendo o último preparado incubando tau recombinante não fosforilada com um extracto de cérebro de ratazana que é capaz de fosforilar os aminoácidos Ser e Tre em posições correspondentes aos sítios de fosforilação anormal da tau (Goedert et al., 1993). 0 antigénio ligado foi detectado como se descreve na secção de exemplos.

Figura 2

Detecção de PHF-tau e normal tau utilizando o anticorpo monoclonal AT270. Incubou-se microplacas revestidas com quantidades de saturação de anticorpo monoclonal AT270 que reconhece especificamente a PHF-tau com CSF fortificado com quantidades diferentes de tau não fosforilado ou fosforilado, sendo o último preparado incubando tau recombinante não fosforilada com um extracto de cérebro de ratazana que é capaz de fosforilar os aminoácidos Ser e Tre nas posições correspondentes aos sítios de fosforilação anormal da tau (Goedert et al., 1993). 0 antigénio ligado foi detectado como se descreve na secção de exemplos. 28

Figura 3

Fosforilação da tau natural e da tau recombinante mutante (expressada a partir do clone de tau 24 humana; Goedert e lakes, 1990) com a actividade proteína cinase do cérebro de ratazana. Imunotransferências com anti-soro anti-tau 134 e anticorpos monoclonais AT8 e AT180. Pistas 1. tau 24; 2, tau 24 com extracto cerebral; 3, T231 A tau 24; 4, T231 A tau 24 com extracto cerebral, 5, S235 A tau 24; 6, S235 A tau 24 com extracto cerebral.

Figura 4

Fosforilação da tau natural e da tau recombinante mutante (expressada a partir do clone de tau 24 humana) com a actividade proteína cinase do cérebro de ratazana. Imunotransferências com anti-soro anti-tau 134 e anticorpos monoclonais AT8 e AT270. Pistas 1, tau 24; 2, tau 24 com extracto cerebral; 3, T175 A tau 24; 4, T175 A tau 24 com extracto cerebral; 5, T181 A tau 24; 6, T181A tau 24 com extracto cerebral. 29

EXEMPLOS Exemplo I

Preparação dos anticorpos monoclonais AT180 e AT270 utilizando PHF-tau como antigénio 1. Preparação do antigénio para imunização A PHF-tau foi parcialmente purificada através de uma modificação do método de Greenberg e Davies (1990). Obteve-se tecido post-mortem, constituído principalmente de matéria cinzenta do córtex frontal e temporal, de doentes com Alzheimer histologicamente confirmada. Homogeneizou-se esta matéria cinzenta de cérebro com Alzheimer (5-10 g) com 10 volumes de tampão H frio (Tris 10 mM/EGTA 1 mM/NaCl 0,8 M/10% de sacarose, pH 7,4) num homogeneizador de

Teflon/vidro Potter S (Braun, Alemanha). Após centrifugação do homogenato num rotor 60 Ti MSE a 27.000 x g durante 20 min a 4 °C, retirou-se o sedimento e ajustou-se o sobrenadante até 1% (peso/vol) de N-laurosilsarcosina e 1% (vol/vol) de 2-mercaptoetanol e incubou-se ao mesmo tempo que se manteve em agitação rotativa num misturador (Swelab, Suécia) durante 2,5 horas a 37 °C. Centrifugou-se a mistura sobrenadante a 108.000 x g durante 35 min a 20 °C. Lavou-se suavemente o sedimento contendo PHF-tau com PBS e suspendeu-se finalmente em 1 ml do mesmo tampão.

Avaliou-se a preparação de antigénio através de uma electroforese em gel de poliacrilamida com 10% de dodecilsulfato de sódio, seguida de transferência de Western utilizando anti-soro policlonal de coelho anti-tau normal humana (Mercken et al., 1992a). 30 2. Protocolo de imunização e procedimento de fusão

Preparou-se ratinhos Balb/c por via subcutânea com 100 μρ de preparado de PHF-tau em adjuvante completo de Freund e reforçou-se subsequentemente 3 vezes por via intraperitoneal em intervalos de 3 semanas com 100 μρ do mesmo antipénio em adjuvante incompleto de Freund. Nos 3o e 2o dias anteriores à infusão, os ratinhos foram reforçados com 100 μρ de PHF-tau em soro fisiolópico.

Fundiu-se células do baço de ratinhos com células de mieloma SP2/0, utilizando um procedimento modificado de Kõhler e Milstein (1975), com PEG 4000.

Suspendeu-se as células da experiência de fusão a uma densidade de 4,5 x 104 células de baço/poço em placas de 96 poços onde foram pré-aplicadas células de macrófapos peritoneais de ratinho como uma camada alimentadora. Após 12 dias de crescimento continuo rastreou-se estas células para a produção de anticorpo anti-PHF-tau por meio de um ELISA em sanduíche como se pormenoriza a sepuir. O crescimento do hibridoma foi efectuado em meio de Eaple modificado por Dulbecco (DMEM) fortificado com 20% de soro fetal de vitelo, piruvato de sódio (1 mM), L-plutamina (2 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 mp/ml) e aminoácidos não essenciais. Todos os produtos foram adquiridos de Gibco, (Paisley, U.K.). As células foram incubadas numa incubadora de CC>2-ar humidificado. 31 3. ELISA em sanduíche para rastreio do anticorpo anti-PHF-tau 0 ELISA de rastreio utilizado para a detecção de anticorpos monoclonais anti-PHF-tau foi um sistema ELISA em sanduíche com anticorpos policlonais de coelho anti-tau humana purificados por afinidade (Mercken et al., 1992a) na fase do revestimento. Para este fim utilizou-se tau humana normal purificada, preparada como descrito em Mercken et al. (1992a), para a preparação de uma coluna de imunoafinidade utilizando imobilização covalente em Sepharose activada com brometo de cianogénio (Pharmacia, LKB Suécia). A fracção anti-tau ligada por afinidade foi eluída desta coluna com uma solução tamponada com ácido cítrico 0,1 M a pH 2,5. Após neutralização, juntou-se as fracções possuindo anti-tau e revestiu-se dum dia para o outro (1 pg/ml) a 4 °C em placas microtítulo de ligação elevada (Nunc, Gibco, Paisley, UK) em tampão de revestimento (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, NaN3 10 mM, pH 8,5) . Depois de cobrir durante 30 min com 125 μΐ de caseína saturada a 10% em PBS para reduzir a ligação não específica, incubou-se as placas com 100 μΐ de uma preparação de PHF-tau apropriadamente diluída e incubou-se durante 60 min a 37 °C. Lavou-se as placas 3 vezes com PBS-Tween 20 a 0,05% (v/v); adicionou-se 1 00 μΐ de sobrenadante do hibridoma e prosseguiu-se a incubação durante lha 37 °C. Depois de lavar, detectou-se os anticorpos monoclonais ligados com soro de coelho anti-ratinho conjugado com peroxidase (Dakopatts, Glostrup, Dinamarca). Todos os reagentes foram diluídos em PBS com caseína a 10%. Após a lavagem final, adicionou-se 100 μΐ de 3,5,3',5'- 32 tetrametilbenzidina 0,42 mM, H202 a 0, 003% v/v em ácido cítrico 100 mM, hidrogenofosfato dissódico 100 mM, pH 4,3, como substrato da peroxidase. Parou-se a reacção com 50 μΐ de uma solução de H2SC>4 2 M. Leu-se a absorvância num Titertek Multiscan (Flow Laboratories, Eflab, Oy, Finlândia) a 450 nm. A partir de uma tal experiência de fusão, utilizando o procedimento de rastreio como se descreveu na secção 3 acima, recuperou-se 28 culturas positivas (isto é, culturas que segregam anticorpos monoclonais anti-PHF-tau) de um total de 1440 culturas. Estas culturas positivas foram designadas arbitrariamente de ATI até AT28 (algumas destas culturas de hibridoma, isto é, ATI até AT14 foram descritas por Mercken et al., 1992b). Uma vez que neste ciclo inicial de rastreio as culturas positivas eram principalmente constituídas por clones mistos, como observado por inspecção visual dos poços (habitualmente entre 1 e 4 clones por poço), todas as culturas de hibridomas foram ainda subclonadas por diluição restritiva, uma técnica bem conhecida dos especialistas na matéria, resultando finalmente em clones de hibridoma puros que segregam anticorpos com um ideótipo homogéneo. Alguns destes clones de hibridoma puros foram adicionalmente avaliados relativamente aos seus padrões de reactividade sobre a tau normal e a PHF-tau num ELISA como se descreve no Exemplo II e à localização dos seus determinantes antigénicos por meio de análise por transferência de Western utilizando mutantes da tau como se descreve no Exemplo II. O último procedimento foi realizado do seguinte modo: Aplicou-se tau humana normal e PHF-tau purificadas em geles 33 de poliacrilamida com SDS a 10% e correu-se em condições de desnaturação segundo Laemmli (1970).

Após SDS-PAGE, realizou-se a transferência para nitrocelulose (Hybond-C, Amersham, Brussels, Bélgica) em NaHC03 10 mM, Na2C03 3 mM, pH 9, 9 durante 120 min a 55 V com arrefecimento. Após a transferência, equilibrou-se a nitrocelulose com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), e bloqueou-se os sítios de ligação à proteína com tampão de transferência (PBS fortificado com 5% p/v de leite em pó desnatado e 10% v/v de soro de vitelo recém-nascido) . Incubou-se as proteínas transferidas dum dia para o outro a 4 °C com o anticorpo do respectivo hibridoma. Após três lavagens com PBS-Tween 20 a 0,05% (v/v), utilizou-se imunoglobulinas de coelho anti-ratinho marcadas com peroxidase de rábano silvestre (Dakopatts, Glostrup, Dinamarca) a uma diluição de 1/3000 e incubou-se durante 90 min à temperatura ambiente. Diluiu-se todos os anti-soros em tampão de transferência. Lavou-se então as transferências três vezes em PBS/Tween e desenvolveu-se com solução de substrato (PBS, 0,05% p/v de 3,3'-diaminobenzidina, 0,03% v/v de H2O2) após o que se parou a reacção em H20.

Como um resultado destas análises, constatou-se que 8 dos 28 hibridomas (incluindo AT180 e AT270) eram verdadeiramente específicos para a PHF-tau. Estes anticorpos monoclonais específicos para a PHF-tau foram finalmente avaliados para a sua capacidade de detecção da PHF-tau no fluido céfalo-raquidiano utilizando um ELISA (como se ilustra no Exemplo IV). Como se ilustra nos exemplos seguintes, encontrou-se dois anticorpos 34 monoclonais, referidos como AT270 e AT180, que permitiram a detecção especifica de pelo menos 10 pg/ml de tau fosforilada como determinada em CSF fortificado com quantidades diferentes de tau fosforilada e não fosforilada sem aplicar técnicas de amplificação (a tau fosforilada foi preparada incubando tau recombinante não fosforilada com um extracto cerebral de ratazana que é capaz de fosforilar os aminoácidos Ser e Tre nas posições correspondentes aos sítios de fosforilação anormal da tau como descrito em Goedert et ai., 1993) . Além do mais, o anticorpo monoclonal AT27 0 foi capaz de detectar a PHF-tau em CSF nao concentrado (ver mais à frente) . Um ensaio com base na utilização de ATI80 permitiu detectar PHF- -tau em CSF concentrado 5 vezes, enquanto ο AT8 nao foi capaz de detectar a PHF-tau em CSF concentrado 10 vezes. Com base nestes critérios, seleccionou-se os hibridomas AT180 e AT270 para caracterização posterior dos seus determinantes antigénicos e depositou-se na ECACC sob os números 92122104 e 93070774. 4. Determinação da classe e subclasse do anticorpo A classe e subclasse do anticorpo foram determinadas por Inno-LIA (Innogenetics, Ghent, Bélgica). Os anticorpos AT180 e AT270 pareceram ser IgGl, dos subtipos kapa.

EXEMPLO II

Caracterização de anticorpos específicos para a PHF-tau e dos seus determinantes antigénicos

1. Discriminação da Tau anormalmente fosforilada da tau normal em ELISA 35 A preparação da tau normal purificada por afinidade é descrita em Mercken et al. (1992b) e a da PHF-tau é essencialmente como descrita em Greenberg e Davies (1990); Mercken et al. (1992a). A pureza dos padrões de tau normal e PHF-tau foi determinada por SDS-PAGE. As amostras também foram analisadas num analisador de aminoácidos 420 A/H (Applied Biosystem B.V., Maarssen, Países Baixos) de acordo com as instruções do fabricante. A tau normal e a PHF-tau apresentaram ambos as composições de aminoácidos esperadas. A concentração exacta da proteína da tau normal e da PHF-tau purificadas por afinidade foi determinada utilizando um péptido como padrão interno.

Revestiu-se anticorpos monoclonais PHF-tau provenientes dos hibridomas AT180 ou AT270 e purificados de meio condicionado sem soro por cromatografia em coluna sobre Proteína G dum dia para o outro a 4 °C em placas microtítulo de elevada ligação (Nunc, Gibco, Paisley, UK) em tampão de revestimento a 3 μρ/ιηΐ (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, NaN3 10 mM, pH 8,5) . Depois de cobrir durante 30 min com 150 μΐ de caseína saturada a 10% em PBS para reduzir a ligação não específica, incubou-se as placas com 100 μΐ de padrões de tau ou PHF-tau apropriadamente diluídos e incubou-se durante 60 min a 37 °C. Lavou-se as placas 5 vezes com PBS-Tween 20 a 0,05% (v/v) e adicionou-se 100 μΐ de dois anticorpos biotinilados (AT120 e HT7, Vandermeeren et al., 1993; Mercken, Ph. D. thesis) a uma concentração final de 0,2 μρ/ιηΐ e incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente. Depois de lavar adicionou-se estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano silvestre (Jackson, Innogenetics, Bélgica) a uma diluição de 1/10000 durante 30 36 min à temperatura ambiente. Após uma lavagem final com PBS/Tween 20, adicionou-se 100 μΐ de 3, 5, 3' , 5' -tetrametilbenzidina 0,42 mM, H2O2 a 0,003% (vol/vol) em ácido cítrico 100 mM, Na2HPC>4 100 mM, pH 4,3 como substrato da peroxidase durante 30 min à temperatura ambiente. Parou-se a reacção com 5 0 μΐ de uma solução de H2SO4 2 M. Leu-se a absorvância num Titertek Multiscan (Flow Laboratories, Eflab Oy, Finlândia) a 450 nm. É mostrada a especificidade da AT180 e AT270 para a PHF-tau (Quadro 1, Figuras 1 e 2) de onde se pode constatar que até mesmo a 1 μρ de tau normal não está presente nenhuma reactividade. 2. Mapeamento do determinante antigénico de anticorpos seleccionados específicos para a PHF-tau via mutantes tau recombinantes

Subclonou-se um clone de ADNc completo (tau 24 humana; htau24) correspondente a uma isoforma de quatro repetições da tau e com um sítio Ndel no contexto do codão iniciador (Goedert e Jakes, 1990) no sítio EcoRI de M13mpl8. Utilizou-se mutagénese dirigida para um sítio para alterar os codões que representam os aminoácidos seguintes para uma Ala: T153, T175, T181, T199, T205, T212, T217, T231, S235, referido ainda como mutantes T153A etc.. Foram também avaliadas construções que contêm combinações destes sítios. Após clivagem com Ndel e EcoRI os fragmentos resultantes foram subclonados a jusante do promotor da ARN polimerase T7 no plasmídeo de expressão pRK172 (Mc Leod et al., 1987) e transformou-se os plasmídeos recombinantes em células de E. coli BL21 (DE3) (Studier et al., 1990). Multiplicou-se as 37 culturas bacterianas, purificou-se as proteínas induzidas e tau como se descreve (Goedert e Jakes, 1990) . A actividade proteína cinase cerebral foi preparada homogeneizando cérebro de ratazana adulta (1 g/2,5 ml) em ácido ocadaico 10 mM, PMSF 1 mM, 20 μg/ml de leupeptina, 20 μρ/ιηΐ de aprotinina e 20 μρ/ιηΐ de pepestatina e centrifugou-se a 40.000 rpm durante 1 h a 4 °C. O sobrenadante foi utilizado directamente para fosforilação (Goedert et al., 1993). As incubações (0,05 ml) foram realizadas a 37 °C e incluíam HEPES 40 mM, pH 7,2, ATP 2 mM, MgCl2 2 mM, proteína tau (1 μΜ) , extracto cerebral de ratazana (1 μΐ) , EGTA 5 mM, DTT 2 mM, ácido ocadaico 1 μΜ, PMSF 1 mM, 20 μg/ml de aprotinina e 20 μg/ml de pepestatina. Iniciou-se as reacções através da adição de extracto cerebral, incubou-se durante 24 h e utilizou-se alíquotas para SDS-PAGE. Os controlos foram incubados nas mesmas condições, excepto que se omitiu o extracto cerebral.

Resultados O clone de htau24 normal ou os mutantes de htau24 foram fosforilados por um extracto cerebral de ratazana contendo proteína cinase (Goedert et al, 1993), analisados em SDS-PAGE e analisados por imunotransferência utilizando AT180, AT270 ou um anti-soro da tau, 134, que é independente da fosforilação (Goedert et al, 1989). Os AT270 e AT180 não revelam a proteína tau natural ou mutante antes da fosforilação pelo extracto cerebral. No entanto, após 24 h de incubação com extracto cerebral, ο AT270 38 reconheceu a tau natural, mas não a tau T181A (Fig. 3) . Isto estabelece que a revelação pelo AT270 requer, no mínimo, que a T181 esteja fosforilada. 0 anticorpo monoclonal AT180 reconheceu igualmente a tau natural fosforilada mas falhou em reconhecer o mutante T231A fosforilado, o que indica que o determinante antigénico do AT180 precisa da fosforilação da T231 fosforilação para efeitos de reconhecimento (Fig. 4). A revelação extremamente fraca do mutante S235A é devida ao facto de alguns factores no extracto cerebral serem restritivos neste tipo de ensaio e consequentemente o sítio S235 não estava sempre totalmente convertido no seu estado fosforilado, como foi confirmado utilizando proteínas cinases recombinantes activadas como agentes de fosforilação (dados não apresentados). Quando a tau recombinante foi tratada com MAP cinase recombinante activada sozinha ou GSK3 cinase sozinha o determinante antigénico do AT180 não pôde ser produzido, enquanto a mesma experiência realizada com uma mistura de MAP cinase e GSK3 cinase permitiu uma fosforilação correcta e imunorreactividade com ο AT180.

EXEMPLO III

Utilização de combinações diferentes dos anticorpos de PHF- tau para detectar PHF-tau em CSF não concentrado. Nós mostramos anteriormente que um ensaio para detectar a tau anormalmente fosforilada com base na utilização única do anticorpo AT8 como detector não é capaz de detectar o determinante antigénico do AT8 em CSF não concentrado nem em CSF concentrado (Vandermeeren et al, 1993). Experiências em curso com os AT180 e AT270 mostram 39 que o determinante antigénico do AT270 presente na tau anormalmente fosforilada pode ser detectado na maior parte das amostras de CSF de Alzheimer não concentrado, ao passo que o determinante antigénico do AT180 detecta apenas a tau anormalmente fosforilada nas amostras de CSF que possuam níveis elevados de tau total e, deste modo, não detectam PHF-tau em todas as amostras de CSF de Alzheimer. Nós utilizamos posteriormente AT270 sozinho ou em combinações diferentes com outros anticorpos (AT8, AT180) . As combinações de anticorpos foram utilizadas como anticorpos de revestimento ligados à fase sólida para pesquisar a presença de PHF-tau no CSF de doentes que sofressem de distúrbios neurológicos diferentes nos quais tivesse sido descrita a presença de tau anormalmente fosforilada, tal como a doença de Pick, doença de Creutzfeld-Jacob doença de e Parkinson (ver Quadro 2).

Um ensaio preferido específico para a PHF-tau pode ser o seguinte: revestimento dos três anticorpos monoclonais, AT8, AT180, AT270 a uma concentração final de 5 μρ/ιηΐ em Tris 10 mM pH 8,6, NaCl 10 mM, NaAz 10 mM dum dia para o outro a 4 °C em placas microtítulo de elevada ligação (Nunc, GIBCO, Paisley, U.K.). Depois de revestir durante 1 h com 150 μΐ de caseína saturada a 10% em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) para reduzir a ligação não específica, incubou-se as placas com 100 μΐ de um padrão de tau recombinante fosforilada apropriadamente diluído ou com amostras de CSF não concentradas, fortificados com 5 % de Tween 20, dum dia para o outro à temperatura ambiente. Lavou-se as placas cinco vezes com PBS/Tween 20 a 0,05% (vol/vol) e adicionou-se 100 μΐ de dois anticorpos biotinilados (AT120 e HT7; Vandermeeren et al., 1993; 40

Mercken, Ph.D. thesis) a uma concentração final de 0,2 μg/ml e incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente. Depois de lavar, adicionou-se estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano-silvestre (Jackson, Innogenetics, Bélgica) a uma diluição de 1/10000 durante 30 min à temperatura ambiente. Após uma lavagem final com PBS/Tween 20, adicionou-se 100 μΐ de 3,5,3',5'-tetrametilbenzidina a 0,42 mM, H2O2 a 0,003% (vol/vol) em ácido cítrico 100 mM, Na2HP04 100 mM, pH 4,3 como substrato da peroxidase durante 30 min à temperatura ambiente. Parou-se a reacção com 50 μΐ de uma solução de H2S04 2 M. Leu-se a absorvância num Titertek Multiscan (Flow Laboratories, Eflab Oy, Finlândia) a 450 nm.

EXEMPLO IV

Detecção de PHF-tau em amostras de fluido céfalo-raquidiano com os anticorpos seleccionados específicos para a PHF-tau

Amostras de fluido céfalo-raquidiano

Colheu-se amostras ante mortem de CSF de doentes no departamento de Neurologia do Hospital da Universidade de Antuérpia. Todas as amostras foram obtidas por punção lombar realizada em rotina para efeitos de diagnóstico. Congelou-se as amostras de CSF e manteve-se a -70 °C até serem utilizadas. Retirou-se amostras de doentes com Alzheimer, de doentes sem complicações neurológicas e de doentes com vários distúrbios neurológicos. Analisou-se as amostras para a concentração total de tau utilizando o Innotest htau (Innogenetics, Bélgica) e conservou-se as amostras com valores de tau total elevados para análise 41 posterior para a presença de PHF-tau com o ensaio preferido para o PHF-tau como se especificou no Exemplo III.

Resultados

Utilizando este ensaio e as amostras de CSF como descritos, obteve-se os resultados resumidos no Quadro 3. Destes, torna-se óbvio que os níveis médios de PHF-tau permanecem muito baixos para os doentes de controlo e doentes OND (controlos: 381 mOD; OND, degenerativo: 423 mOD; OND, inflamatório: 392 mOD; OND, vascular: 340 mOD) , enquanto a média para doentes com Alzheimer é de 814 unidades mOD. Além disso, como se pode ver no Quadro 3, valores elevados de tau total no grupo OND não são sempre reflectidos por um aumento paralelo na PHF-tau enquanto nos doentes AD níveis elevados de tau total originam sempre a concentrações aumentadas de PHF-tau. Consequentemente, a evidência acumulada do grupo de controlo, dos grupos etários OND e dos doentes AD apontam fortemente para a especificidade diagnóstica do ensaio de PHF-tau para a AD e síndromes relacionados com a AD (tais como, demência do enfarte múltiplo, demência mista da doença de Parkinson e demência não especificada). 42

Quadro 1 tau pg/ml ATI80 não fosforilada ATI 8 0 Fosforilada AT27 0 não fosforilada AT 2 7 0 Fosforilada 2000 95 449 98 2653 500 92 179 94 1044 100 94 125 96 158 25 85 105 92 113 5 90 106 87 86 1 87 97 90 83 0,2 85 95 91 89 0 89 94 92 94

Quadro 2 N° Diagnóstico tau AT 2 7 0 ATI 8 0, 270 AT 8,270 AT 8,180, 270 em pg/ml em mOD em mOD em mOD em mOD 3 AD (inicio precoce) 56,5 185 613 126 916 5 AD 62 132 410 105 636 6 AD 71 107 310 87 678 38 AD 68,7 257 685 169 1251 73 AD 27,7 84 96 44 570 88 AD 25,3 124 261 68 705 276 AD 43 106 325 76 612 281 AD 4 6 184 406 100 199 874 AD 51 128 353 88 777 61 Controlo 17,3 53 80 87 1435 Hidrocefalia 18 62 38 53 297 401 Controlo 20,1 77 73 53 242 PNP 20,8 109 169 77 276 1424 Controlo 21 96 79 61 304 85 Controlo 22 54 52 43 83 153 Linfoma do SNC 22,2 55 111 47 301 1337 Hidrocefalia 29 45 68 47 124 43 N° Diagnóstico tau AT 2 7 0 ATI 8 0, 270 AT 8,270 AT 8,180, 270 em pg/ml em mOD em mOD em mOD em mOD 1337 Hidrocefalia 29 43 75 45 124 1381 NPH 32 78 156 75 366 1470 NPH 33 77 152 60 148 641 Controlo 35 6 4 135 67 515 349 Meningite 35, 6 76 95 68 367 109 Doença de Pick 40,5 89 131 60 398 1467 Pseudotumor 44 111 149 6 4 373 193 GBS 44, 1 158 238 107 295 114 Atrofia do cerebelo 51,5 90 97 56 203 130 Oftalmoplegia externa 53, 6 102 99 60 229 131 Sangramento meníngeo 66,7 65 82 49 338 214 CJD 92 82 204 70 387 53 PD 57 249 682 137 836 150 Controlo 79 284 848 207 1557 137 Doença de Pick 77,4 423 987 220 1571

Quadro 3

Doentes com Alzheimer N° Sexo Idade Diagnóstico tau (pg/ml) PHF-tau (em mOD) 304 F AD (= Alz21) 86 517 3 F 9 AD (inicio precoce) 56,5 916 874 F 42 AD 51 777 113 F 44 AD 42,6 627 1085 M 4 6 AD 543 3049 265 F 47 AD (?) 62 441 161 F 57 AD, Creutzfeld-Jacob (?) 33, 8 682 326 F 58 AD 34 394 1499 F 60 AD 147 1425 44 Ν° Sexo Idade Diagnóstico tau (pg/ml) PHF-tau (em mOD) 220 Μ 60 AD 126 1614 6 Μ 61 AD 71 678 718 Μ 62 AD 53 588 335 F 63 AD, provável 83 656 720 Μ 6 4 AD 170 1573 174 F β 4 AD 66 609 338 F 6 4 AD 51,2 593 262 F 65 AD 221 2224 254 F 66 AD 80,2 923 73 Μ 67 AD 27,7 570 209 Μ 67 AD 74,4 1341 722 Μ 67 AD 71 433 383 Μ 67 AD 32,5 691 38 Μ 67 AD 68,7 1251 1259 F 68 AD (?) 65 698 723 Μ 69 AD 54 614 721 Μ 70 AD 99 947 17 F 70 AD 37 582 1 F 72 AD + MS 33 222 229 Μ 73 AD 70, 9 1043 278 F 75 AD 54 1069 719 Μ 75 AD 70 884 88 F 76 AD 25,3 705 132 F 76 AD 51, 9 1187 65 F 77 AD 80,1 1284 287 Μ 78 AD (?) 58 423 737 F 78 AD 43 330 71 F 78 AD 53, 9 741 28 Μ 78 AD 48,7 476 760 F 78 AD 36 299 5 Μ 81 AD 62 636 281 F 81 AD 4 6 199 13 F 81 AD 13 179 289 Μ 83 AD 29 502 45 N° Sexo Idade Diagnóstico tau (pg/ml) PHF-tau (em mOD) 96 F 84 Steele-Richardson (?), AD (?) 41 295 223 M 84 AD 52 487 185 F 85 AD 59 724 276 F 85 AD 43 612 39 F 86 AD 150 2205 343 F 86 AD (?) 44 413 14 F 86 AD 57 825 606 F 86 AD 43 680 724 M 88 AD 31 487

Doentes de controlo N° Sexo Idade Diagnóstico tau PHF-tau 145 F 40 31, 9 363 F 68 39 436 F 72 84 718 709 F 56 29 259 1508 M 6 4 21 155 1100 M 71 31 313 1424 M 6 4 21 304 F 66 35 515 F 77 43,5 447 544 M 69 17 304

Outros Distúrbios Neurológicos, tipos Degenerativos N° Sexo Idade Diagnóstico tau PHF-tau 196 F 71 Parkinson + demência 84 421 167 M 61 atrofia do cerebelo 14 433 75 M 71 demência induzida pelo álcool 26 763 53 F 69 demência mista, Parkinson 55 589 53 F 85 Parkinson, demência mista 59,3 1083 137 F 57 doença de Pick 77,4 1571 946 F 75 atrofia cortical, periventricular 57 814 46 N° Sexo Idade Diagnóstico tau PHF-tau 713 F 48 FLD 39 341 186 M 66 ALS 21,2 208 344 F 68 demência de Parkinson 28 205 22 F 65 Steele Richardson 13 203 114 M 51 atrofia do cerebelo 51,5 203 334 M 57 Parkinson, discinesia 22 218 1527 M 61 Parkinson + sífilis 17 277 772 F 70 Steele-Richardson 26 244 169 F 27 Demência (?) 37,5 337 794 F 61 Steele-Richardson 24 149 214 F 59 Creutzfeld-Jacob 292 387 109 M 63 doença de Pick; ALS 40,5 398 33 M 63 doença de Pick 61 395 230 F 66 Parkinson 21,1 157

Outros doenças neurodegenerativas, tipos inflamatórios N° Sexo Idade Diagnóstico tau PHF-tau 668 F 79 encefalite 16 282 673 F 72 encefalite 16 281 710 F 28 MS 14 186 405 M 29 Guillain-Barré (GBS) 47, 6 278 1396 M 67 ALS 150 289 1261 M 28 CIDP 24 293 193 M 68 GBS 44, 1 295 279 F 70 M. S . 17 113 314 F 69 GBS 34 292 716 M 54 ALS 15 220 1477 M 67 ALS 150 797 717 M 53 ALS 18 158 163 M 71 Meningite 150 1891 93 M 85 polineuropatia 61, 9 764 327 F 66 ALS 20 127 708 F 33 Neurocisticercose 20 249 149 M 56 Sífilis 4 176 1493 M 22 SSPE 18 236 207 M 50 Guillain-Barré 70,3 4 66 47 Ν° Sexo Idade Diagnóstico tau PHF-tau 706 F 75 GBS 21 309 6 4 Μ 58 MS 40,7 512 1447 F 58 ALS 38 340 360 Μ 54 doença de Lyme 34,7 515 532 Μ 6 4 TBC 28 470 7 Μ 17 SSPE 48, 1 403 363 F 47 encefalite 35, 9 424 133 Μ 24 MS 37,1 397 208 Μ 68 polineuropatia 28,8 325 398 Μ 58 meningoencefalite 117,8 367 715 F 63 ALS 40 333 Outros doenças neurológicas, tipos vasculares Ν° Sexo Idade Diagnóstico tau PHF-tau 131 F 59 sangramento meningeo 66,7 338 219 F 58 sindrome pseudobulbar 39, 6 231 101 M 55 enfarte 52,8 352 228 M 22 enfarte cerebral isquémico 150 392 294 F 71 CVA, diabetes, epilepsia 54 347 409 M 65 patologia vascular múktipla 208 222 1492 M 47 enfarte, occipital 69 213 712 F 44 Apoplexia-novo começo 14 309 21 M 70 angiopatia congofilica 15 322 457 M 68 enfarte 24 280 42 M 78 demência de enfarte múltiplo 38, 9 614 320 M 76 diabetes, MID 27 318 714 M 82 MID 29 286 98 F 68 TIA 34, 9 577 23 F 82 demência 31 303 48

Outros doenças neurológicas, não definidas N° Sexo Idade Diagnóstico tau PHF-tau 115 M 68 degeneração subaguda 14 561 419 M 1 hidrocefalia 150 2765 275 M 66 PNP 19 448 226 F 54 dor progressiva 18 445 111 M 67 Polineuropatia 64,2 549 91 F 81 PNP 31,2 355 1467 M 43 Pseudotumor 44 373 153 F 62 linfoma do SNC 22,2 301 1435 M 65 trauma hidrocefaleico 18 297 150 F 82 distúrbio mental 79 1557 274 M 78 medulopatia cervical 69 160 1454 M 73 hidrocefalia 30 124 268 M 63 PNP, álcool 23 500 711 F 31 Pseudotumor no cérebro 16 234 170 M 66 T emp. E 24,2 632 195 F 6 4 E. diálise 14 239 242 M 72 polineuropatia 20,8 276 330 M 69 pyr? ? 14 246 1478 M 43 Pseudotumor 42 337 1364 M 65 estenose 32 475 152 F 66 medular 33 450 438 M 71 polineuropatia 34 205 1087 F 65 estenose 24 1086 251 F 77 trauma por contusão cerebral 14 209 1576 F 70 sindrome de Korsakoff 82 863 312 M 72 meta adeno ?? 37 471 1442 F 70 distúrbio da atitude 39 615 49

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Innogenetics sa. (B) RUA: Industriepark-Zwijnaarde 7, box 4 (C) CIDADE: Ghent (E) PAÍS: Bélgica (F) CÓDIGO POSTAL: B-9052 (G) TELEFONE: 00 32 9 241 07 11 (H) TELEFAX: 00 32 9 241 07 99 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Anticorpos monoclonais específicos para o PHF-tau, hibridomas que os segregam, reconhecimento de antigénios por estes anticorpos e suas aplicações (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 3 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 112 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 61 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Lys aiy Ala Asp Gly Lys Thr Lys ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Alá 1 5 10 15 Pro Pro Gly Gin Lys Gly Gin Ala Asrs Ala Thr Arg IU Pro Ala Lys 20 25 30 Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys 35 40 45 Ser Gly ASp Arg ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro 50 55 60 Sly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu 65 70 75 80 Prô Lys Lys Vai Ala Vai Vai Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser 65 90 95 Ala Lys Ser Arg Leu Gin Thr Alá Pro Vai Pro Met Pro Asp Leu Lys 100 105 110 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Vai Arg Tre Pro Pro 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 62 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Pro Lis Tre Pro Pro 1 5

Lisboa, 31 de Outubro de 2006

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES Anticorpo monoclonal segregado pelo hibridoma depositado na ECACC em 7 de Julho de 1993 sob o n° 93070774. Hibridoma como depositado na ECACC em 7 de Julho de 1993 sob o n° 93070774. Processo para produzir anticorpos monoclonais de acordo com a reivindicação 1 o qual envolve: cultivar os hibridomas seleccionados de acordo com a reivindicação 2 num meio de cultura apropriado; e recuperar os anticorpos monoclonais segregados pelos referidos hibridomas seleccionados; ou alternativamente implantar os hibridomas seleccionados da reivindicação 2, no peritoneu de um ratinho e, quando tiverem sido produzidas ascites pelo animal, recuperar os anticorpos monoclonais então formados a partir das referidas ascites. Processo para a detecção ou diagnóstico post-mortem de doença cerebral/neurológica envolvendo a proteína PHF-tau, tal como a doença de Alzheimer, o qual compreende pelo menos os passos seguintes: - fazer contactar um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, com uma preparação de feixes neurofibrilares (NFT) ou um homogenato cerebral extraído com detergente isolado de um doente que sofria de doença de Alzheimer ou de 2 qualquer outra doença envolvendo tau anormalmente fosforilada (PHF-tau) em condições adequadas para produzir um complexo antigénio-anticorpo; e detectar a ligação imunológica do referido anticorpo ao referido homogenato cerebral, e eventualmente, separar o antigénio do referido complexo e recuperar o antigénio procurado numa forma purificada.
2. 5. Processo para a detecção ou diagnóstico in vitro de doença cerebral envolvendo a proteína tau anormalmente fosforilada, tal como doença de Alzheimer, o qual inclui: colocar em contacto uma amostra de CSF, preferencialmente CSF não concentrado, ou de soro de um doente suspeito de sofrer de um distúrbio neurológico envolvendo a PHF-tau, mais particularmente doença de Alzheimer, ou proteínas ou polipéptidos extraídos daqueles, em condições in vitro com um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, com as referidas condições adequadas para produzir um complexo antigénio-anticorpo; e, detectar a ligação imunológica do referido anticorpo à referida amostra de fluido céfalo-raquidiano, ou de soro, ou de extracto deste.
3. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que os referidos anticorpos monoclonais estão imobilizados num suporte adequado tal como resina. 3
4. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 até 6 compreendendo ainda: colocar em contacto o referido complexo antigénio-anticorpo formado pelo antigénio e pelos anticorpos de acordo com a reivindicação 1 com: um segundo anticorpo * o qual pode ser um anticorpo monoclonal que reconhece um determinante antigénico da proteína tau anormalmente fosforilada ou * o qual pode ser um anticorpo policlonal que reconhece a tau anormalmente fosforilada ou um anticorpo policlonal que reconhece um péptido portador de um determinante antigénico de PHF-tau, sendo o referido anticorpo policlonal capaz de formar um complexo imunológico com determinantes antigénicos que são diferentes do determinante antigénico da invenção, sendo o referido anticorpo policlonal preferencialmente purificado por cromatografia de imunoafinidade utilizando proteína tau imobilizada; um marcador para marcação ou acoplamento específico com o referido segundo anticorpo; as soluções tampão apropriadas para realizar a reacção imunológica entre o anticorpo monoclonal da invenção e uma amostra de ensaio por um lado, e o segundo anticorpo ligado e o marcador por outro. 4
5. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a referida amostra é colocada em contacto com uma combinação de anticorpos monoclonais constituída por anticorpos monoclonais de acordo com a reivindicação 1 e um ou mais anticorpos monoclonais seleccionados do grupo constituído por: o anticorpo monoclonal AT180 produzido pelo hibridoma depositado na ECACC em 22 de Dezembro de 1992 sob o n° 92122204; o anticorpo monoclonal AT8 produzido pelo hibridoma depositado na ECACC em 8 de Outubro de 1991 sob o n° 91100806.
6. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8 em que é utilizada pelo menos uma das combinações seguintes de anticorpos monoclonais: uma mistura compreendendo pelo menos um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 e um anticorpo monoclonal AT180 produzido pelo hibridoma depositado na ECACC em 22 de Dezembro de 1992 sob o n° 92122204; uma mistura compreendendo pelo menos um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 e pelo menos um outro anticorpo monoclonal que reconheça a tau ou a PHF-tau.
7. 10. Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado ainda por envolver um formato de detecção em sanduíche compreendendo anticorpos de revestimento e detecção, consistindo os referidos anticorpos de revestimento de pelo menos um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 e consistindo os referidos anticorpos de detecção de 5 pelo menos um anticorpo monoclonal que seja capaz de detectar a tau humana normal e/ou anormalmente fosforilada cujo determinante antigénico é diferente do determinante antigénico de qualquer um dos anticorpos monoclonais de acordo com a reivindicação 1.
8. 11. Estojo para o diagnóstico in vitro de uma das doenças seguintes: doença de Alzheimer, síndrome de Down, doença de Pick e outros distúrbios neurológicos nos quais estejam implicados a proteína tau anormalmente fosforilada ou filamentos helicoidais emparelhados, caracterizado pelo estojo compreender: pelo menos um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 depositado numa microplaca; uma preparação que contém a amostra (CSF, soro ou as proteínas extraídas daquele) para ser diagnosticada in vitro, um segundo anticorpo * o qual pode ser um anticorpo monoclonal que reconhece um determinante antigénico da proteína tau anormalmente fosforilada ou um determinante antigénico de qualquer péptido tau fosforilado portador de um determinante antigénico de PHF-tau, sendo os referidos determinantes antigénicos diferentes do da invenção, ou * o qual pode ser um anticorpo policlonal que reconhece a tau anormalmente fosforilada ou um anticorpo policlonal que reconhece um péptido portador de um determinante antigénico da PHF-tau, sendo o referido 6 anticorpo policlonal capaz de formar um complexo imunológico com determinantes antigénicos que são diferentes do determinante antigénico da invenção, sendo o referido anticorpo policlonal preferencialmente purificado por cromatografia de imunoafinidade, utilizando a proteína tau imobilizada; - um marcador para a marcação ou acoplamento com o referido segundo anticorpo; soluções tampão apropriadas para realizar a reacção imunológica entre o anticorpo monoclonal da invenção e uma amostra de ensaio por um lado, e o segundo anticorpo ligado e o marcador por outro lado, eventualmente, um péptido portador de um determinante antigénico da PHF-tau compreendido na região como definida pela SEQ ID NO 1 para efeitos correntes, ou para efeitos de competição em relação ao antigénio que é procurado.
9. 12. Estojo de acordo com a reivindicação 11, para a detecção ou diagnóstico in vitro de doença cerebral/neurológica envolvendo a proteína tau anormalmente fosforilada, tal como doença de Alzheimer, compreendendo pelo menos uma das combinações seguintes de anticorpos monoclonais: uma mistura compreendendo pelo menos um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 e um anticorpo monoclonal AT180 produzido pelo hibridoma depositado na ECACC em 22 de Dezembro de 1992 sob o n° 92122204; 7 uma mistura compreendendo pelo menos um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 e pelo menos um outro anticorpo monoclonal que reconheça a tau ou PHF-tau.
10. 13. Estojo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado ainda por envolver um formato de detecção em sanduíche compreendendo anticorpos de revestimento e detecção, consistindo os referidos anticorpos de revestimento de pelo menos um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 e consistindo os referidos anticorpos de detecção de pelo menos um anticorpo monoclonal que seja capaz de detectar a tau humana normal e/ou anormalmente fosforilada cujo determinante antigénico é diferente do determinante antigénico de qualquer um dos anticorpos monoclonais de acordo com a reivindicação 1.
11. 14. Processo para o diagnóstico in vitro de um doente suspeito de sofrer da doença de Alzheimer compreendendo: (a) detecção do nível de PHF-tau numa amostra de CSF obtida do referido doente por ligação imunológica de anticorpos monoclonais capazes de reconhecer especificamente, num péptido tau fosforilado, uma sequência de aminoácidos Pro- Lis-Tre-Pro-Pro (SEQ ID NO 3), estando a referida Tre(181) fosforilada, ou anticorpos monoclonais de acordo com a reivindicação 1; - (b) comparação do nível obtido em (a) com o nível de PHF-tau presente em amostras de CSF obtidas a partir de controlos, em que uma concentração mais 8 elevada de tau anormalmente fosforilada no referido doente aponta para o diagnóstico de doença de Alzheimer.
12. 15. Processo de acordo com a reivindicação 14 em que os referidos anticorpos monoclonais são ainda combinados com: anticorpos monoclonais AT180 produzidos pelo hibridoma depositado na ECACC em 22 de Dezembro de 1992 sob o n° 92122204; e/ou anticorpos monoclonais AT8 produzidos pelo hibridoma depositado na ECACC em 8 de Outubro de 1991 sob o n° 91100806. Lisboa, 31 de Outubro de 2006