PT2304040T - Produção de alcenos por descarboxilação enzimática de ácidos 3-hidroxi-alcanoicos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PRODUÇÃO DE ALCENOS POR DESCARBOXILAÇÃO ENZIMÁTICA DE ÁCIDOS 3-HIDROXI-ALCANOICOS"

Introdução A presente invenção descreve um processo de geração de alcenos por via biológica. A mesma refere-se mais particularmente a um processo de produção de alcenos terminais (nomeadamente de propileno, de etileno, de 1-butileno, de isobutileno ou de isoamileno), a partir de moléculas do tipo 3-hidroxi-alcanoato.

Antecedentes da invenção

Da petroquímica, são atualmente derivados um grande número de compostos químicos. Os alcenos (tais como o etileno, o propileno, os diferentes butenos, ou ainda os pentenos, por exemplo) são utilizados na indústria dos plásticos, por exemplo, para realizar o polipropileno ou o polietileno, bem como noutros domínios da indústria química e dos combustíveis. 0 etileno, o alceno mais simples, tem um papel central na química orgânica industrial: é o composto orgânico mais produzido no mundo. Este permite, nomeadamente, gerar o polietileno, um plástico de primeira linha. Por reação (de oxidação, de halogenação) , pode-se também transformar o etileno em inúmeros produtos úteis à indústria. 0 propileno tem um papel de importância comparável: deriva-se por polimerização um material plástico, o polipropileno. As características técnicas deste produto, em termos de resistência, de densidade, de solidez, de deformabilidade, de transparência não têm equivalentes. 0 mercado mundial do polipropileno desenvolve-se constantemente desde sua invenção, em 1954. 0 butileno existe em quatro formas, das quais uma, o isobutileno, entra na composição do metil-terc-butil-éter- (ΜΤΒΕ), um aditivo antidetonante para os combustíveis automóveis. 0 isobutileno pode igualmente ser utilizado para gerar o iso-octeno, que se pode em seguida reduzir em iso-octano (2,2,4-trimetil-pentano); a razão combustão/explosão muito elevada do iso-octano torna-o o melhor combustível para os motores referidos como "a gasolina". 0 amileno, o hexeno e o hepteno existem de inúmeras formas, de acordo com a posição e a configuração da cadeia dupla. Estes produtos experimentam aplicações industriais reais, mas de menor importância que o etileno, o propileno ou os butenos.

Todos estes alcenos são atualmente produzidos por craqueamento catalítico dos produtos petrolíferos (ou por um derivado do processo Fisher-Tropsch no caso do hexeno, a partir de carvão ou de gás) . 0 seu custo é, portanto, naturalmente indexado sobre o do petróleo. Além disso, o craqueamento catalítico apresenta por vezes dificuldades técnicas importantes, que se traduzem em complexidade do processo e em custo de produção.

Independentemente das considerações anteriores, a bioprodução de materiais plásticos ("bioplásticos") experimenta um desenvolvimento importante. A motivação vem de considerações económicas ligadas ao custo do petróleo, e de considerações ambientais globais (produtos neutros em carbono) ou local (gestão dos resíduos). A principal família de bioplásticos é aquela dos poli-hidroxialcanoatos (PHA). Tratam-se de polímeros obtidos por condensação de moléculas que compreendem, simultaneamente, um grupo ácido e um grupo álcool. A condensação ocorre por esterificação do ácido no álcool do monómero seguinte. Esta ligação éster não é tão estável quanto a ligação direta carbono-carbono que se encontra nos polímeros de plástico convencionais, o que explica a biodegradabilidade, de algumas semanas a alguns meses, dos PHA.

Na família dos PHA, pode-se nomeadamente citar o poli-3-hidroxi-butirato (PHB), um polímero do 3-hidroxi-butirato, ou o poli-hidroxi-butirato-valerato (PHBV) , um polímero que alterna o 3-hidroxi-butirato e o 3-hidroxi-valerato. 0 PHB é produzido naturalmente por estirpes bacterianas particulares, tais como Alcaligenes eutrophus ou Bacillus megaterium. As bactérias de laboratório, tais como Escherichia coli, tendo integrado as vias de sínteses que conduzem ao PHB ou aos PHA em geral, foram construídas. 0 composto ou seu polímero pode representar, em determinadas condições de laboratório, até 80% da massa da bactéria. (Wong MS et al, Biotech. Bioeng 2008). As tentativas de produção industrial do PHB foram conduzidas nos anos 1980, mas o custo de fabrico por fermentação era considerado então como demasiado elevado. Os projetos de produção direta destes compostos em plantas geneticamente modificadas (tendo integrado as enzimas-chave da via de síntese de PHB das bactérias produtoras) estão em curso. Estes poderiam estar associados a melhores custos de exploração. A geração, por via biológica, de alcanos ou outras moléculas orgânicas utilizáveis como combustíveis ou como precursores de resinas sintéticas impõe-se no contexto de uma exploração industrial durável, em harmonia com os ciclos geoquímicos. A primeira geração de biocombustíveis consistiu na produção fermentativa de etanol, os processos de fermentação e de destilação já ocorrem na indústria agroalimentar. A produção de biocombustíveis de segunda geração está numa fase exploratória, cobrindo, nomeadamente, a produção de álcoois de cadeias longas (butanol e pentanol), de terpenos, de alcanos lineares e de ácidos gordos. Duas revisões recentes fazem um quadro geral das pesquisas neste domínio: Ladygina N et al., Process Biochemistry 2006 41:1001, e Wackett LP Current Opinion em Chemical Biology, 2008, 21:187.

Na família química dos alcenos, o isopreno (2-metil-1,3-butadieno) é o motivo terpénico que conduz por polimerização à borracha. Outros terpenos poderiam ser desenvolvidos, por via química, biológica ou mista, em produtos utilizáveis como biocombustíveis ou para fabricar plásticos. As publicações recentes mostram que a via do mevalonato (um intermediário-chave na biossíntese dos esteroides em inúmeros organismos), poderia ser utilizada de modo a produzir eficazmente produtos da família dos terpenos com rendimentos industriais (Withers ST et al., Appl. Environ Microbiol, 2007 73:6277). A produção de alcenos terminais (etileno mono- ou bissubstituído na posição 2, H2C=C(R1) (R2) foi aparentemente menos explorada: a produção de isobutileno a partir de isovalerato pela levedura Rhodotorula minuta foi detetada (Fujii T. et al, Appl. Environ. Microbiol. 1988 54:583), mas a eficácia desta conversão, inferior a 1 milionésimo por minuto, ou cerca de 1 para 1000 por dia, está longe de permitir uma aplicação industrial. O mecanismo reacional foi elucidado em Fukuda H et al., BBRC, 1994 201:2:516: o mesmo envolve uma enzima da família dos citocromos P450 que efetua uma reação de descarboxilação do isovalerato, por redução de um grupo oxoferril Fev=0. Em nenhum momento a reação envolve a hidroxilação do isovalerato. O isovalerato é também um composto intermediário do catabolismo da leucina. A biossíntese massiva de isobutileno, por essa via, parece muito desfavorável, já que deveria sintetizar e degradar uma molécula de leucina para formar uma molécula de isobutileno. Finalmente, a enzima que catalisa a reação emprega um hemo como cofator, prestando-se mal à expressão recombinante nas bactérias e à melhoria dos parâmetros enzimáticos. Por todos estes motivos, parece pouco provável que esta via da técnica anterior possa servir de base a uma implantação industrial. Outros microrganismos foram mencionados como marginalmente capazes de gerar naturalmente o isobutileno a partir de isovalerato. Os rendimentos obtidos são ainda mais baixos que aqueles obtidos que utilizam Rhodotorula minuta (Fukuda H. et al, Agric. Biol. Chem. 1984 48:1679).

Estes mesmos trabalhos levaram em conta, igualmente, a produção natural de propileno: inúmeros microrganismos podem produzir o propileno, com um rendimento ali ainda extremamente baixo. A produção de etileno pelas plantas é descrita há muito tempo (Meigh et al, 1960 Nature 186:902). A metionina constitui o precursor do etileno, seguindo a via metabólica elucidada (Adams e Yang, PNAS 1979 76:170). Uma conversão, a partir do 2-oxoglutarato, foi igualmente relatada (Ladygina N et al., Process Biochemistry 2006 41:1001). Já que uma única molécula de etileno necessita da produção prévia de uma cadeia de quatro ou cinco átomos de carbono, o balançosmaterial e energético de todas estas vias são desfavoráveis e não constituem bom augúrio na sua aplicação industrial para a bioprodução de alcenos.

Anteriormente à caracterização das etapas enzimáticas que, nas plantas, convertem em metileno o seu verdadeiro precursor metabólico, a S-adenosil-metionina (SAM), através da formação do 1-amino-ciclopropano-l-carboxilato (ACC) (Adams e Yang, PNAS 1979 76:170), várias outras hipóteses foram propostas na literatura cientifica para explicar a produção de etileno, entre as quais a descarboxilação do acrilato (H2C=CH-C02H), o qual teria origem na desidratação do 3-hidroxi-propionato. Vários artigos especulam explicitamente sobre a via metabólica que converteria em etileno, através do acrilato, o 3-hidroxi-propionato, para interpretar as experiências de rastreamento radioativo do etileno que fornece substratos marcados com 14C às preparações de tecidos vegetais, a beta-alanina-2-14C aos extratos de cotilédone de feijão (Stinson e Spencer, Plant

Physiol., 1969, 44:1217; Thompson e Spencer, Nature 1966, 210:5036), e o propionato-2-14C, aos homogenatos de polpa de banana. (Shimokawa e Kasai, Agr. Biol. Chem. 1970 34:11:1640). Todas estas especulações sobre a implicação de 3-hidroxipropionato e de acrilato na produção metabólica de etileno, que não conduziram à caracterização de atividades enzimáticas, desapareceram da literatura cientifica logo que o papel da metionina, da SAM e do ACC foi constatado (Hanson e Kende, Plant Physiology 1976 57:528; Adams e

Yang, PNAS 1979 76:170).

Portanto, não existe atualmente, em que se se tem conhecimento, de um processo eficaz para produzir por síntese microbiológica dos alcenos terminais tais como o etileno, o propileno, o 1-butileno, o isobutileno, o 1-amileno ou o isoamileno. Tal processo permitiria evitar de o facto consumir os produtos petrolíferos, e reduzir os custos de produção de material plástico e de combustível. Finalmente, poderia, eventualmente, ter um efeito global importante sobre o ambiente, de modo a permitir armazenar o carbono na forma sólida.

Sumário da invenção A presente invenção descreve um processo que permite realizar a síntese de compostos alcenos por via biológica. A invenção resulta da conceção de uma via de síntese inovadora de compostos alceno terminais, baseada na conversão de 3-hidroxi-alcanoatos da fórmula

HO-CO-CH2-C (R1) (R2)-OH em que R1 e R2 são escolhidos, independentemente, entre um átomo de hidrogénio, um resíduo metil e um resíduo etil. A invenção é igualmente baseada na demonstração de que esta conversão pode ser realizada por via biológica, que utiliza uma enzima do tipo mevalonato difosfato descarboxilase ou variantes desta. A invenção pode ser implantada in vitro, nos sistemas acelulares, ou com a utilização dos microrganismos. A invenção visa igualmente a produção dos alcenos, a partir de uma fonte de carbono, e nomeadamente um hidrato de carbono (nomeadamente, a glicose), um poliol (nomeadamente o glicerol) , um polímero biodegradável (nomeadamente o amido, a celulose, o poli-3-hidroxi-alcanoato); a fonte de carbono que é convertida por um microrganismo num intermediário metabólico da família dos 3-hidroxi-alcanoatos, que será em seguida convertido em alceno terminal.

Mais precisamente, um objetivo de invenção reside num processo de produção de um alceno terminal, caracterizado por compreender uma etapa de conversão de um 3-hidroxi-alcanoato por uma enzima que apresenta uma atividade de mevalonato difosfato descarboxilase, em que o 3-hidroxi-alcanoato é um composto da fórmula HO-CO-CH2-C (R1) (R2)-OH ou 0”-C0-CH2-C (R1) (R2)-OH em que R1 e R2 são escolhidos, independentemente, entre um átomo de hidrogénio, um resíduo metilo e um resíduo etilo, e em que a conversão é feita na presença de um cossubstrato, o referido cossubstrato que é o ATP, um rNTP, um dNTP ou uma mistura de várias destas moléculas, um polifosfato ou o pirofosfato.

Em consequência, a presente invenção refere-se à utilização de compostos 3-hidroxi-alcanoato, a título de composto precursor ou substrato, para a produção de compostos alcenos terminais.

Nas formas de realização particulares da invenção: - converte-se o 3-hidroxi-propionato em metileno; ou - converte-se o 3-hidroxi-butirato em propileno; ou - converte-se o 3-hidroxi-valerato em 1-butileno; ou - converte-se o 3-hidroxi-3-metil-butirato (ou 3-hidroxi-isovalerato) em isobutileno; ou - converte-se o 3-hidroxi-3-metil-valerato em isoamileno. A invenção refere-se ainda à utilização de uma enzima mevalonato difosfato descarboxilase, ou de um microrganismo que produz uma mevalonato difosfato descarboxilase, para a produção de compostos alcenos terminais a partir de 3- hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima. A invenção refere-se igualmente a uma composição que compreende um microrganismo que produz uma mevalonato difosfato descarboxilase, um meio de cultura adequado e um composto 3-hidroxi-alcanoato, conforme definido acima. A enzima que tem uma atividade de mevalonato difosfato descarboxilase pode ser uma enzima que compreende toda ou parte da sequência SEQ ID NO: 6 ou uma enzima que apresenta uma homologia de sequência de, pelo menos, 15% com esta. A invenção refere-se também à utilização de uma enzima que tem uma atividade de mevalonato difosfato descarboxilase e compreende toda ou parte da sequência SEQ ID NO: 6, ou de uma enzima que apresenta uma homologia de sequência de, pelo menos, 15% com esta, para produzir um alceno terminal, conforme definido acima.

Também é descrito um processo de produção de uma enzima que tem uma atividade de mevalonato difosfato descarboxilase e compreende toda ou parte da sequência SEQ ID NO: 6 ou de uma enzima que apresenta uma homologia de sequência de, pelo menos, 15% com esta, o processo que compreende a cultura de um microrganismo que compreende um ácido nucleico recombinante que codifica a referida sequência nas condições que permitem a expressão desta sequência.

Também é descrito um microrganismo que compreende um ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima que tem uma atividade de descarboxilase e compreende toda ou parte da sequência SEQ ID NO: 6 ou uma enzima que apresenta uma homologia de sequência de, pelo menos, 15% com esta. Definições

Por "3-hidroxi-alcanoato", entende-se as moléculas que compreendem, como motivo comum, o 3-hidroxi-propionato (Figura 1) , e, eventualmente, uma ou duas substituições alquilos no carbono 3. Estes residuos ou radicais alquilos podem ser lineares ou ramificados. No presente pedido, os termos "alquilo" e "alquilo" têm o mesmo significado e são intercambiáveis. Do mesmo modo, os termos "resíduo" e "radical" têm o mesmo significado e são intercambiáveis. Os resíduos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo são exemplos destes resíduos alquilos. 0 carbono 3 torna-se um centro quiral se as duas substituições alquilos forem diferentes. A presente definição engloba as duas formas quirais, mesmo se umas das duas formas, por exemplo, a forma R, for a principal forma produzida naturalmente. Exemplos de 3-hidroxi-alcanoatos são exibidos na Figura 3. Eventualmente, as substituições alquilos podem ser acrescentadas no carbono 2, que é então ele mesmo suscetível também de se tornar quiral (se os dois substituintes forem diferentes) . Indiferentemente, as configurações dos substratos 3-hidroxi alcanoatos, na presente invenção, abrangem o conjunto dos estereoisómeros. Os 3-hidroxi-alcanoatos correspondem, seja ao 3-hidroxi-propionato, seja a variantes ou derivados do 3-hidroxi-propionato, nos quais um dos dois ou os dois átomos de hidrogénio portados pelo carbono 3 são substituídos por um motivo composto apenas de átomos de carbono e de hidrogénio, o número de carbono destes substituintes varia de 1 a 5, de preferência de 1 a 3, tal como o metilo, o etilo, o propilo, o isopropilo, o butilo ou isobutilo. 0 sufixo "oato" pode significar aqui, indiferentemente, seja o ião carboxilato (C00-) seja o ácido carboxílico (COOH). Este não é utilizado para designar um éster.

Os 3-hidroxi-alcanoatos utilizados no processo, de acordo com a invenção, são compostos de fórmula seguinte: HO-CO-CHs-C (R1) (R2)-OH ou O-CO-CH2-C (R1) (R2)-OH, em que R1 e R2 são escolhidos, independentemente, entre um átomo de hidrogénio, um resíduo metilo e um resíduo etilo.

Por "alcenos terminais", entende-se, no sentido da presente invenção, as moléculas compostas apenas de carbono e de hidrogénio (hidrocarbonetos insaturados de fórmula

CnH2n), que compreende o etileno e as moléculas orgânicas que derivam do etileno por mono- ou bissubstituição dos dois átomos de hidrogénio ligados ao carbono 2 por radicais alquilos, lineares ou ramificados. Os alcenos terminais respondem à fórmula H2C=C(R1) (R2) em que R1 e R2 são escolhidos, independentemente, entre um átomo de hidrogénio e um radical alquilo, linear ou ramificado, que têm, por exemplo, de 1 a 4 átomos de carbono, ou de 1 a 3 átomos de carbono. Pelo menos um dos dois substituintes do carbono 2 do alceno pode ser um radical alquilo linear ou ramificado. Os alcenos terminais compreendem os compostos ramificados isoalcenos, como, por exemplo, o isobutileno. Um alceno terminal, que é o produto de um processo, de acordo com a invenção, é um composto de fórmula H2C=C(R1) (R2) , em que R1 e R2 são escolhidos, independentemente, entre um átomo de hidrogénio, um resíduo metilo e um resíduo etilo. Exemplos preferidos de compostos alcenos terminais, de acordo com a invenção, são nomeadamente, o etileno, o propileno, o isobutileno e o isoamileno (Figura 4), ou ainda o 1-butileno e o 1-amileno. "Fonte de carbono" designa aqui qualquer composto de carbono utilizável como substrato para os organismos, de acordo com a invenção. Este termo engloba a glicose ou qualquer outra hexose, a xilose ou qualquer outra pentose, os polióis como o glicerol, o sorbitol ou o manitol, ou ainda os polímeros tais como o amido, a celulose ou a hemicelulose, ou ainda os poli-3-hidroxi-alcanoatos como o poli-3-hidroxi-butirato. Pode tratar-se de qualquer substrato que permita o crescimento de microrganismos, como o formato, por exemplo. Pode igualmente tratar-se de CO2, no caso em que o organismo é suscetível de realizar a fotossíntese.

Por "recombinante", designa-se aqui a modificação genética artificial de um organismo, seja por adição, subtração ou modificação de um gene cromossómico ou extracromossómico ou de um motivo de regulação tal como um promotor, seja por fusão de organismos, seja por adição de um vetor de qualquer natureza, por exemplo, plasmidico. A "expressão recombinante" designa a produção de uma proteína que implica uma modificação genética, de preferência para produzir uma proteína de origem estranha ou heteróloga frente a seu hospedeiro, isto é, que não surgem naturalmente no hospedeiro de produção, ou para produzir uma proteína endógena modificada ou mutada.

Por "superexpressão", ou "superexprimindo", designa-se aqui a expressão recombinante de uma proteína, de preferência proveniente de um organismo diferente daquele no qual a mesma é expressa, aumentada de 10%, pelo menos, e de preferência de 20%, 50%, 100%, 500% ou eventualmente mais em relação à expressão natural da referida proteína. Entra igualmente, no âmbito desta definição, o caso em que não há expressão natural da referida proteína.

Um "cossubstrato" é um produto acrescentado à reação enzimática, de modo a melhorar determinados parâmetros, e em primeiro lugar a sua atividade, o referido produto e o substrato principal que são consumidos em quantidades iguais. O cossubstrato deve, portanto, ser acrescentado à reação em concentração, comparável àquela do substrato principal. De acordo com a enzima, a presença de um cossubstrato pode ser necessária à reação enzimática.

Um "cofator" é um produto acrescentado à reação enzimática, de modo a melhorar determinados parâmetros e, em primeiro lugar, a sua atividade, o referido produto, não sendo consumido durante a reação, e necessitando, portanto, de ser acrescentado apenas em concentração baixa, proporcional à quantidade de enzima, esta concentração é, portanto, denominada "catalítica".

Uma "parte" de uma sequência de aminoácidos designa um fragmento que compreende, pelo menos, 10, de preferência, pelo menos 20, 30, 40 ou 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da referida sequência.

Por "homologia", entende-se a existência de uma semelhança entre duas sequências, tal como é medida pela percentagem de identidade entre as referidas duas sequências.

Os compostos químicos são frequentemente conhecidos por vários nomes, oficiais ou de utilização. Aqui, os nomes habituais das moléculas foram preferidos. Assim: - "etileno" é utilizado para designar o eteno - "propileno" é utilizado para designar o propeno - "butileno" é utilizado para designar o buteno - "isobutileno" é utilizado para designar o 2-metil-propeno ou isobuteno - "amileno" é utilizado para designar o penteno - "isoamileno" é utilizado para designar o 2-metil-but-l-eno ou isopenteno - "propionato" é utilizado para designar o ácido propanoico ou o ião propanoato - "butirato" é utilizado para designar o ácido butanoico ou o ião butanoato - "valerato" é utilizado para designar o ácido pentanoico ou o ião pentanoato

Descrição detalhada da invenção A invenção descreve nomeadamente um processo de produção de alcenos terminais que compreende uma etapa de descarboxilação enzimática de compostos 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima. A invenção resulta igualmente da utilização de descarboxilases do tipo mevalonato difosfato descarboxilase para catalisar esta reação, e de substratos tais como o 3-hidroxi-butirato, o 3-hidroxi-valerato, o 3-hidroxi-3-metil-butirato (ou 3-hidroxi-isovalerato) e o 3-hidroxi-propionato. A invenção descreve a utilização de cofatores, como o etil difosfato, o propil difosfato, o metil difosfato, os análogos destas moléculas e o pirofosfato. A invenção descreve ainda a utilização de cossubstratos, tal como o ATP ou outros compostos que incluem uma ligação fosfo-anidrido, conforme definido acima. A invenção também diz respeito à utilização de fontes de carbono, tais como a glicose, para produzir diretamente os alcenos terminais a partir de células inteiras, a via de síntese que passa por 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima. A invenção também diz respeito aos microrganismos ou às plantas, naturais ou modificados, que produzem de forma endógena um 3-hidroxi-alcanoato, conforme definido acima, e que exprimem também uma mevalonato difosfato descarboxilase que transforma os referidos 3-hidroxi-alcanoatos em alcenos terminais. Os compostos alcenos produzidos, nomeadamente o propileno, o etileno e o isobutileno, são moléculas chaves na indústria dos plásticos e dos combustíveis, e seu fabrico industrial, por via biológica a partir de recursos renováveis, constitui uma inovação importante. A invenção resulta, assim, da conceção de uma via de síntese inovadora de compostos do tipo alceno terminal, baseada na conversão de compostos do tipo 3-hidroxi-alcanoato, conforme definido acima. A invenção demonstra que esta conversão pode ser realizada por via biológica, que utiliza uma enzima do tipo mevalonato difosfato descarboxilase que permite transformar um 3-hidroxi-alcanoato, conforme definido acima, em alceno terminal. Conforme ilustrado na Figura 2, esta conversão é feita através de um intermediário reacional de estrutura 3-fosfo-hidroxi-alcanoato. A etapa de conversão, de acordo com a invenção, pode ser realizada in vitro, na presença de uma enzima isolada (ou de um sistema enzimático que compreende, adicionalmente, um ou vários cofatores) ou em cultura, na presença de um microrganismo que produz a enzima.

Conforme descrito aqui no exemplo 5, uma relação sinal/ruído de fundo (medida na ausência de enzima) da taxa de conversão de um fator de cerca de 100, pode ser observada em determinadas condições. A afinidade, frente ao 3-hidroxi-isovalerato (HIV), foi medida da ordem de 40 mM. Não era evidente que tal atividade enzimática, muito significativa, poderia ser obtida: com efeito, é bem conhecido dos bioquímicos, que consideram a teoria e a prática da enzimologia, que os sítios ativos das enzimas contêm elementos estruturais que permitem o reconhecimento, a ligação e a conversão química de determinados substratos específicos. A literatura científica está repleta de dados experimentais que indicam que as modificações de tamanho ou de carga elétrica, mesmo menores, são critérios de exclusão para os substratos. Especificamente, nenhuma predição científica podia permitir prever que as MDP-descarboxilases poderiam utilizar moléculas do tipo 3-hidroxi-alcanoato, como substrato em geral, e em particular o 3-hidroxi-isovalerato, este diferindo do mevalonato-difosfato, não apenas pelo tamanho (MW de 118 contra 308 para o mevalonato difosfato), mas igualmente pelas cargas elétricas do grupo difosfato presente no substrato natural, o mevalonato-difosfato .

Numa forma particular, um cofator é acrescentado à reação de modo a realizar uma complementação estérica ou eletrónica na garganta catalítica. O cofator é vantajosamente escolhido entre o ião pirofosfato, o metil-difosfato, o etil-difosfato ou o propil-difosfato. Mais geralmente, o cofator é um composto que contém o motivo fosfoanidrido, de fórmula geral R-O-PO2H-O-PO3H2 em que R é nomeadamente um átomo de hidrogénio, um resíduo alquilo, linear, ramificado ou cíclico, de preferência de 1 a 10 ou de 1 a 5 átomos de carbono, ou qualquer outro radical orgânico monovalente. Os motivos análogos correspondentes aos monoésteres do metileno difosfonato, de fórmula geral R-O-PO2H-CH2-PO3H2, nos quais o fosfoanidrido é substituído por uma ponte metileno que apresenta a vantagem de não se hidrolisar, fazem igualmente parte da invenção. A conversão é feita na presença de um cossubstrato, o referido cossubstrato é o ATP, um rNTP, um dNTP ou uma mistura de várias dessas moléculas, um polifosfato ou o pirofosfato. 0 cossubstrato está geralmente presente no hospedeiro. No entanto, numa outra forma particular, um cossubstrato pode ser acrescentado à reação, escolhido entre o ATP, um rNTP, um dNTP, uma mistura de vários rNTP ou dNTP, um polifosfato, e de preferência o pirofosfato.

Numa forma de implantação particular da invenção, utiliza-se um microrganismo que produz a mevalonato difosfato descarboxilase. Numa forma de realização preferida, o microrganismo é recombinante no sentido em que produz uma mevalonato difosfato descarboxilase, heteróloga em relação ao hospedeiro de produção. 0 processo pode, assim, ser realizado diretamente no meio de cultura, sem que seja necessário separar ou purificar o sistema enzimático. De maneira particularmente vantajosa, utiliza-se um microrganismo que tem a propriedade natural ou artificial de produzir um ou vários 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima, de forma endógena, e exprime ou superexprimee também uma mevalonato difosfato descarboxilase, natural ou modificada, a fim de produzir alcenos terminais diretamente a partir de uma fonte de carbono presente em solução.

Os microrganismos implantados na invenção podem ser os procariotas ou os eucariotas, e nomeadamente as bactérias, leveduras, células vegetais, fungos e bolores, células animais. Numa forma particular, os microrganismos são as bactérias, nomeadamente de estirpe Alcaligenes eutrophus ou Bacillus megaterium.

Numa outra forma particular, os microrganismos são as bactérias recombinantes de estirpe Escherichia coli que foram modificadas de modo a produzir de forma endógena um ou os 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima, e converter estes em alcenos terminais.

Numa outra forma particular, os microrganismos são as leveduras recombinantes, que produzem os 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima, e converter estes em alcenos terminais.

Numa outra forma particular, utiliza-se um microrganismo produtor de um ou vários 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima, por um lado, e uma mevalonato difosfato descarboxilase, eventualmente expressa por um segundo microrganismo, por outro lado. Eventualmente, cultiva-se e utiliza-se concomitantemente os dois microrganismos no processo, de acordo com a invenção.

Numa outra forma particular, as plantas inteiras que exprimem uma mevalonato difosfato descarboxilase, eventualmente modificadas por transgénese, são utilizadas para produzir alcenos terminais a partir de 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima, sejam estes produzidos de maneira endógena ou fornecidos de maneira exógena.

Numa outra forma particular de implantação, utiliza-se um microrganismo fotossintético que tem a propriedade natural ou artificial de produzir um ou vários 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima de forma endógena, e superexprime também uma mevalonato difosfato descarboxilase, natural ou modificada, a fim de produzir alcenos terminais diretamente, a partir de CO2 presente em solução. De preferência, o microrganismo é uma bactéria fotossintética, ou uma microalga.

As plantas e os microrganismos descritos acima representam outros objetivos da presente invenção, bem como a sua utilização para a produção de compostos alcenos terminais.

Conforme será descrito na sequência, o processo da invenção pode ser conduzido em microaerofilia.

Além disso, numa forma de realização preferencial, o processo é realizado na presença de um sistema de recolha gasosa dos alcenos terminais de desgaseificação da reação. A descarboxilase utilizada num processo da invenção é uma representante da superfamilia filogenética da mevalonato-difosfato (MDP) descarboxilase (nomenclatura enzimática EC 4.1.1.33), isto é, uma enzima, natural ou artificial, especificada por um gene nativo ou sintético, eventualmente com capacidade para catalisar a reação apresentada na Figura 2. Conforme ilustrado na Figura 2, o processo da invenção é feito através de um intermediário reacional 3-fosfo-hidroxi-alcanoato, e a enzima implantada apresenta uma atividade de descarboxilase e uma atividade fosforilase. A MDP descarboxilase é uma enzima envolvida na biossintese do colesterol. Esta enzima foi isolada a partir de organismos diversos, tais como os animais, os fungos, as leveduras e determinadas bactérias. A mesma poderia igualmente ser expressa por determinadas plantas (Lalitha et al, 1985). Inúmeros genes que especificam esta enzima foram clonados e sequenciados. Estas enzimas são geralmente compostas por 300 a 400 aminoácidos, e envolvem o ATP como cossubstrato, que é transformado durante a reação em ADP e em fosfato inorgânico. O grupo fosfato é transferido da molécula de ATP para o álcool terciário do mevalonato difosfato pela libertação do ADP. 0 intermediário reacional fosforilado no grupo 3-hidroxil sofre em seguida uma eliminação do grupo fosfato, libertando, no caso fisiológico, o isopentenil-pirofosfato (Figura 2). A estrutura tridimensional de várias enzimas desta família foi determinada. Relativamente poucos trabalhos foram conduzidos, até ao momento, sobre as enzimas desta família, que foram estudadas apenas no âmbito da descrição precisa da via de biossintese do colesterol. Em contrapartida, nenhum estudo, em que se tenha conhecimento, foi ainda conduzido para desviar esta enzima de sua função natural e fazer um catalisador industrial. Vários exemplos de MDP descarboxilases provenientes de diferentes organismos são dados nas sequências SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 16.

Assim, numa forma de realização preferida, a enzima implantada é uma descarboxilase, que compreende de preferência uma sequência de aminoácidos escolhida entre SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, ou uma sequência que apresenta, pelo menos, 15% de homologia de sequência com uma destas e conserva uma atividade de descarboxilase. As enzimas preferenciais incluem, vantajosamente, pelo menos 50% de homologia de sequência, de preferência, pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda com máxima preferência, pelo menos 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% de homologia de sequência com uma das sequências primárias SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e 16. O grau de homologia de sequência pode ser determinado por diferentes métodos e por meio de softwares conhecidos do perito na especialidade, como, por exemplo, de acordo com o método CLUSTAL ou os softwares BLAST ou derivados, ou com a utilização de um algoritmo de comparação de sequências tal como aquele de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 1970 48:443) ou de Smith e Waterman (J. Mol. Biol. 1981 147 :195) .

Uma descarboxilase preferida da invenção é representada pela enzima de sequência SEQ ID NO: 6, bem como qualquer enzima que apresenta uma homologia de sequência significativa com esta. As enzimas preferidas incluem, vantajosamente, pelo menos 50% de homologia de sequência, de preferência, pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda com a máxima preferência, pelo menos 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% de homologia de sequência com a sequência primária SEQ ID NO: 6. Esta enzima foi clonada a partir de Picrophilus torridus e produzida por via recombinante no âmbito da presente invenção. Conforme ilustrado nos exemplos, esta enzima é particularmente eficaz para produzir os compostos alcenos terminais, de acordo com a presente invenção. Nomeadamente, um objetivo da invenção reside na utilização de uma enzima descarboxilase que compreende toda ou parte de SEQ ID NO: 6 ou de uma enzima que apresenta uma homologia de sequência significativa, e, de preferência, de pelo menos 15% com SEQ ID NO:6, para a produção de compostos alcenos terminais a partir de 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima. Por homologia de sequência significativa, entende-se uma homologia de sequência detetável que utiliza os algoritmos anteriormente citados, e, de preferência, uma homologia de sequência superior a 15%. Os organismos filogeneticamente mais próximos de Picrophilus torridus, tais como Ferroplasma acidarmanus, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium e Picrophilus oshimae, são suscetíveis de produzir as MDP descarboxilases mais próximas daquela da SEQ ID NO 6. A homologia de sequência frente à SEQ ID NO 6 da MDP descarboxilase de Thermoplasma acidophilum (número de acesso Q9HIN1) é, assim, de 38%; aquela de Thermoplasma volcanium (Q97BY2) é homóloga à SEQ ID NO 6 a 42%, aproximadamente. A utilização destas MDP descarboxilases é, sobretudo, pretendida na presente invenção.

Outras enzimas do tipo mevalonato difosfato descarboxilase, naturais ou sintéticas, podem ser selecionadas por a sua capacidade de produzir alcenos terminais, de acordo com a invenção. Assim, um teste de seleção compreende a colocação em contacto da enzima purificada, ou de um microrganismo que produz a enzima, com o substrato da reação e a medida da produção do composto alceno terminal. Exemplos de tais testes são fornecidos na parte experimental, que expõe testes em mais de 60 enzimas diferentes. A enzima implantada pode ser qualquer mevalonato difosfato descarboxilase natural ou produzida ou otimizada de maneira artificial. Em particular, utilizou-se, vantajosamente, uma mevalonato difosfato descarboxilase que apresenta uma atividade otimizada frente a um ou vários 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima. A enzima pode ser produzida ou selecionada, a partir de uma mevalonato difosfato descarboxilase de referência (natural ou a mesma já sintética ou otimizada), por técnicas de engenharia das proteínas, tais como a mutagénese aleatória, a mutagénese massiva, a mutagénese dirigida, o embaralhamento de ADN, o embaralhamento sintético, a evolução in vivo ou a síntese completa de genes. A este respeito, é igualmente descrito um processo de preparação de uma enzima que tem uma atividade de mevalonato difosfato descarboxilase frente a um substrato 3-hidroxi-alcanoato, conforme definido acima, o processo que compreende uma etapa de tratamento de uma fonte de enzima e a seleção de uma enzima que tem propriedades aumentadas frente ao referido substrato, por comparação à enzima não tratada. A enzima utilizada na invenção pode, assim, ser natural ou sintética, e produzida por via química, biológica ou genética. Esta pode igualmente ser modificada quimicamente, por exemplo, para melhorar sua a atividade, a sua resistência, a sua especificidade, a sua purificação ou para a imobilizar sobre suporte. A invenção é caracterizada pela utilização de uma mevalonato difosfato descarboxilase, em particular de uma MDP descarboxilase natural ou modificada, para converter 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima em alcenos terminais. 0 substrato natural da MDP descarboxilase é o mevalonato difosfato, que não entra na definição dos 3-hidroxi-alcanoatos. A reação genérica realizada pela MDP carboxilase, que utiliza diversos 3-hidroxi-alcanoatos é representada na Figura 2B. É concebido que estas reações conduzem diretamente, e numa única etapa, a alcenos terminais.

Numa primeira forma de realização, utiliza-se a enzima nativa ou recombinante, purificada ou não, para transformar um 3-hidroxi-alcanoato, conforme definido acima, em alceno terminal. Para esse efeito, incuba-se a preparação de enzima na presença do substrato em condições físico-químicas que permitem à enzima ser ativa, e deixa-se a incubação ser feita durante um tempo suficiente. Ao fim da incubação, mede-se eventualmente a presença do alceno terminal que utiliza qualquer sistema de deteção conhecido do perito na especialidade, como a cromatografia em fase gasosa ou os testes colorimétricos que permitem medir o aparecimento do produto alceno, de fosfato livre, ou ainda que permitem medir o desaparecimento do substrato 3-hidroxi-alcanoato ou do ATP.

Numa forma de realização preferida, os cofatores são acrescentados de modo a imitar ao máximo a reação natural. Com efeito, os 3-hidroxi-alcanoatos têm uma estrutura correspondente geralmente a um fragmento do MDP, e um espaço importante da garganta catalítica é deixado vazio no momento da associação enzima/substrato. 0 enchimento deste espaço por um cofator que substitui a parte ausente no substrato tem como fundamento imitar de modo mais próximo a molécula de MDP. Não se encontrando modificado pela reação, o cofator deverá, portanto, ser acrescentado à reação apenas em quantidades catalíticas. No caso em que o substrato da reação é o 3-hidroxi-propionato, o cofator complementar será o propil-dif osfato. No caso em que o substrato é o 3-hidroxi-butirato ou o 3-hidroxi-3-metil-butirato, o cofator complementar será o etil-difosfato. No caso em que o substrato é o 3-hidroxi-valerato ou o 3-hidroxi-3-metil-valerato, o cofator complementar será o metil-difosfato. Estas diferentes moléculas são apresentadas na Figura 5. Incidentalmente, poderá ocorrer que o cofator complementar de uma reação tenha um efeito positivo na reação de um outro substrato. Geralmente, o cofator pode ser qualquer molécula que compreende um fosfoanidrido, e tem, portanto, como fórmula global R-PO2H-O-PO3H2', em que R é nomeadamente H, um resíduo alquilo, linear, ramificado ou cíclico, ou qualquer outro radical orgânico monovalente. Os motivos análogos correspondentes aos monoésteres do metileno difosfonato, de fórmula geral R-O-PO2H-CH2-PO3H2', nos quais o f osf oanidrido é substituído por uma ponte metileno, que apresenta a vantagem de não se hidrolisar, podem igualmente constituir o cofator. Mais geralmente, os cofatores podem ser os análogos monofosfatos, ou mesmo sem fosfato, das moléculas anteriores, ou ainda qualquer outra molécula suscetível de melhorar o rendimento da reação que efetua uma complementação estérica ou eletrónica no sítio catalítico da enzima. Numa forma de realização particular, um cossubstrato é acrescentado à reação. 0 referido cossubstrato pode ser seja o ATP, isto é, o cossubstrato natural da MDP descarboxilase, seja qualquer rNTP (ribonucleósido trifosfato) ou dNTP (desoxirribonucleósido trifosfato) ou qualquer mistura de rNTP ou dNTP, ou ainda o pirofosfato, ou um outro polifosfato.

Numa forma preferida da realização, utiliza-se para transformar um 3-hidroxi-alcanoato, conforme definido acima, em alceno terminal uma enzima que apresenta uma homologia de sequência de pelo menos 15%, e de preferência de pelo menos 30%, 50%, e ainda com máxima preferência de pelo menos 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% com uma das enzimas correspondente às sequências SEQ ID NO:l a 16. Nomeadamente, a enzima pode ter sido modificada por engenharia a partir de uma das enzimas SEQ ID NO:l a 16, ou de qualquer outra mevalonato difosfato descarboxilase, identificada a partir de outras origens. Tal enzima pode ter perdido sua atividade MDP descarboxilase, nomeadamente por engenharia do gene em laboratório, mas também no momento da evolução natural (pode-se, então, falar de vestígio de MDP descarboxilase) e conservado ou aumentado a sua atividade numa ou várias moléculas do tipo 3-hidroxi-alcanoato, conforme definido acima. A geração de variantes destas enzimas, mais reativas em relação aos referidos substratos, permite melhorar o rendimento da reação, de acordo com a invenção. Assim, a reatividade da MDP descarboxilase do tipo selvagem frente aos 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima, não é necessariamente ideal. Todas as abordagens conhecidas do perito na especialidade para realizar e selecionar tais variantes, tais como a mutagénese aleatória, a mutagénese dirigida, a mutagénese massiva, a mistura de genes (embaralhamento de ADN) ou a evolução in vivo podem ser utilizadas. É igualmente descrito a utilização de uma enzima totalmente artificial, obtida por conceção e realização de um gene sintético que especifica uma enzima inédita no propósito de converter um 3-hidroxi-alcanoato, conforme definido acima em alceno terminal, que utiliza ou não os dados conhecidos das MDP descarboxilases para o conceber.

Outro objetivo da invenção refere-se à utilização de uma enzima que tem uma atividade de descarboxilase e compreende toda ou parte da sequência SEQ ID NO: 6, ou de uma enzima que apresenta uma homologia de sequência, tal como descrito acima, para produzir um alceno terminal. Numa variante, a sequência pode compreender adicionalmente resíduos suplementares, como, por exemplo, uma etiqueta Histidineen N-terminal. Também é descrito um processo de produção de uma enzima que tem uma atividade de descarboxilase e compreende toda ou parte da sequência SEQ ID NO: 6, ou de uma enzima que apresenta uma homologia de sequência tal como descrito acima, o processo compreendendo a cultura de um microrganismo que compreende um ácido nucleico recombinante que codifica a referida sequência nas condições que permitem a expressão desta sequência. Neste contexto, é descrito, além do ácido nucleico nativo (SEQ ID NO: 19), um ácido nucleico que apresenta uma sequência otimizada para a expressão da enzima SEQ ID NO: 6 em bactérias, nomeadamente em E. coli (SEQ ID NO: 17) . Este ácido nucleico, bem como qualquer ácido nucleico otimizado (isto é, que permite uma expressão melhorada de 30%, pelo menos em relação à sequência selvagem) pode ser utilizado no presente pedido. O presente pedido descreve também um microrganismo que um ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima que tem uma atividade de descarboxilase e compreende toda ou parte da sequência SEQ ID NO: 6, ou de uma enzima que apresenta uma homologia de sequência, tal como descrito acima. O microrganismo é, de preferência, uma bactéria, uma levedura ou um fungo. O presente pedido descreve igualmente qualquer planta ou animal não humano que compreende um ácido nucleico recombinante que codifica uma mevalonato difosfato descarboxilase.

Numa forma de realização, a MDP descarboxilase é utilizada numa forma purificada para transformar os 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima, em alcenos terminais. Contudo, os custos associados a esse processo são elevados, os custos de produção e de purificação da enzima e dos substratos sendo importantes.

Numa outra forma de realização, a MDP descarboxilase está presente na reação na forma de um extrato não purificado, ou ainda na forma de bactérias não lisadas, a fim de economizar os custos de purificação da proteína. Contudo, os custos associados a este processo são ainda bastante elevados, por causa dos custos de produção e de purificação dos substratos.

Numa outra forma de realização da invenção, o processo implanta um microrganismo vivo ou uma planta viva que produz a enzima que permite realizar a conversão. A invenção é, assim, igualmente caracterizada pela modificação por manipulação genética de uma estirpe bacteriana produtora de um ou de vários 3-hidroxi-alcanoatos, conforme definido acima, por exemplo, Alcaligenes eutrophus ou Bacillus megaterium, ou ainda uma estirpe de E. coli modificada em laboratório de modo a produzir o ou os referidos produtos), de forma que a referida estirpe bacteriana superexprima a descarboxilase, a referida enzima que é, de preferência, proveniente de um organismo diferente do microrganismo hospedeiro, e que possa gerar diretamente um ou vários alcenos terminais. A modificação genética pode consistir numa integração cromossómica de um gene da descarboxilase, a expressão da enzima por um plasmideo que contém um promotor a montante da sequência de codificação da enzima, o promotor e a sequência de codificação sendo, de preferência, provenientes de organismos diferentes, ou de qualquer outro meio conhecido do perito na especialidade. Em alternativa, outras bactérias ou leveduras podem apresentar vantagens particulares e serem mantidas. Assim, uma levedura tal como Saccharomyces cerevisiae, uma bactéria estremófila, tal como Thermus thermophilus, ou bactérias anaeróbias da família das Clostridiae, por exemplo, microalgas, bactérias fotossintéticas podem ser utilizadas. De modo a produzir idealmente o, ou os, 3-hidroxi-alcanoatos, que serão em seguida convertidos em alcenos terminais, as estirpes podem igualmente ter sido modificadas por manipulação genética, isto é, por recombinação in vitro ou por evolução dirigida in vivo.

De acordo com uma forma de realização possível, um processo da invenção é caracterizado pela transformação de uma fonte de carbono, tal como a glicose, em 3-hidroxi-alcanoato, e depois pela transformação do referido produto primário em produto secundário, isto é, em alceno terminal.

As diferentes etapas do referido processo são explicitadas na Figura 6.

Numa forma de realização particular, a invenção é caracterizada pela transformação de poli-hidroxialcanoatos em 3-hidroxi-alcanoato, conforme definido acima, que utiliza uma enzima ou um processo fisico-quimica adaptado, e depois pela transformação do referido produto primário em produto secundário, isto é, em alceno terminal. Eventualmente, o poli-hidroxialcanoato foi produzido por uma planta que tinha sido modificada no nivel das suas vias metabólicas, de modo a produzir altos rendimentos de poli-hidroxialcanoato .

Numa forma de realização particular, a invenção consiste no processo integrado de produção dos produtos a partir de CO2 atmosférico, ou artificialmente acrescentado ao meio de cultura. 0 processo da invenção é realizado num organismo com capacidade para efetuar a fotossintese, tal como as microalgas, por exemplo.

Nestas formas de realização, o processo da invenção é ainda caracterizado pelo modo de recuperação dos produtos, que desgaseificam da cultura. Os alcenos terminais curtos, e nomeadamente o etileno, o propileno, os isómeros do buteno, assumem com efeito um estado gasoso à temperatura ambiente e à pressão atmosférica. 0 processo da invenção não requer, portanto, extração do produto a partir do meio liquido da cultura, etapa que constitui ainda uma fonte de custos importante ao nivel industrial. A evacuação e a armazenagem dos hidrocarbonetos gasosos, e a sua eventual separação física e conversão química posteriores, podem ser operadas seguindo qualquer processo conhecido do perito na especialidade.

Numa forma de realização particular, a invenção compreende igualmente a deteção do alceno (propileno, de etileno e de isobutileno, nomeadamente) presente na fase gasosa do processo. A presença dos compostos visados num ambiente de ar ou de um outro gás, mesmo em baixas quantidades, pode ser feita com a utilização de diversas tecnologias, e utilizando nomeadamente sistemas de cromatografia em fase gasosa e a deteção nos infravermelhos, por ionização de chama, ou por acoplamento com um espetrómetro de massa.

Numa forma de realização particular, os alcenos terminais obtidos são condensados, e depois eventualmente reduzidos, com a utilização de técnicas conhecidas do perito na especialidade, a fim de produzir alcenos de cadeia mais longa, ou alcanos de cadeia mais longa. Em particular, o isobutileno pode ser utilizado para sintetizar o iso-octano: os processos catalíticos para conduzir corretamente esta reação já são amplamente descritos.

Numa forma de realização particular, o processo implica a cultura dos microrganismos em condições de cultura habituais (30 a 37 °C sob 1 atmosfera, num fermentador que permite o crescimento aeróbio das bactérias) ou não habituais (temperatura mais elevada para corresponder às condições de cultura de um organismo termófilo, por exemplo).

Numa forma de realização particular, os microrganismos são cultivados em microaerofilia, a quantidade de ar injetada, sendo limitante a fim de minimizar a concentração de dioxigénio residual nos efluentes gasosos carregados de hidrocarbonetos alcénicos.

Outros aspetos e vantagens da invenção serão descritos nos exemplos que seguem, que devem ser considerados como ilustrativos e não limitantes.

Legenda das Figuras

Figura 1: Motivo 3-hidroxi-propionato

Figura 2: Descarboxilação do mevalonato difosfato pela MDP-descarboxilase - atividade genérica

Figura 3: Exemplos de 3-hidroxi-alcanoatos.

Figura 4: Utilização da MDP descarboxilase para gerar alcenos terminais

Figura 5: Cofatores utilizáveis para a reação a fim de realizar a complementação estrutural no sitio catalítico

Figura 6: Processo integrado de produção de um alceno a partir de glicose

Figura 7: Cromatograma realizado nas reações enzimáticas conduzidas nas condições n° 1 do exemplo 4.

Figura 8: SDS-PAGE das etapas de superexpressão e purificação da enzima SEQ ID NO 6. 1. Marcadores 2. Cultura antes da indução 3. Lisato 4. Fração não absorvida na coluna 5. Fração de lavagem da coluna 6. Enzima purificada, Mw=36,8 kDa

Figura 9: Cromatograma de uma análise da reação de conversão de HIV em IBN por CPG/MS. 1 e 2: Controlos negativos correspondentes ao ruído de fundo observado sem enzima 3 e 4: Reações na presença da enzima SEQ ID NO: 6.

Figura 10: Razão da produção de IBN na presença e ausência de ATP.

Figura 11: Razão da produção de IBN na presença e ausência de Mg2+.

Figura 12: Atividade enzimática em função da temperatura. Razão: guantidade de IBN formada na presença de enzima em relação ao ruído de fundo.

Figura 13: Produção do IBN em função da concentração do substrato HIV.

Figura 14: Medida da reação otimizada e comparação com ruído de fundo. Medida por cromatografia gasosa acoplada a um detetor de ionização de chama.

Figura 15: Melhoria do nível de expressão por otimização da sequência nucleotídica que codifica SEQ ID NO: 6. Faixa M: marcadores de peso molecular

Faixas 1, 2, 3: sequência nucleotidica nativa (1) Lisato celular, fração solúvel depositada na coluna de purificação (2) Fração de lisato não retida pela coluna de purificação (3) Fração eluida: 10 yg de enzima purificada Faixas 4, 5, 6: Sequência nucleotidica otimizada (4) Lisato celular, fração solúvel depositada na coluna de purificação (5) Fração de lisato não retida pela coluna de purificação (6) Fração eluida: 10 yg de enzima purificada

Exemplos

Exemplo 1: clonagem e expressão de várias MDP descarboxllases. O gene que codifica para a MDP descarboxilase de Saccharomyces cerevisiae é gerado por síntese a partir de oligonucleótidos sobrepostos, e depois inserido num plasmídeo pET (Novagen) que permite a expressão em bactérias. 0 referido plasmídeo é, em seguida, transformado por eletroporação nas bactérias de estirpe BL21 (Invitrogen) . As bactérias são espalhadas sobre uma placa de Petri que contém a ampicilina, e colocadas para incubar a 37 °C. No dia seguinte, uma colónia bacteriana é selecionada aleatoriamente, e utilizada para inocular uma cultura de 50 mL de meio LB que contém a ampicilina. A cultura é incubada durante 24 horas sob agitação. Ao fim das 24 horas, a cultura é centrifugada, as bactérias são lisadas por sonicação, e um extrato proteico total é realizado. Uma alíquota do extrato é depositada sobre um gel de eletroforese, ao mesmo tempo que um extrato proteico proveniente de bactérias da mesma estirpe, mas não transformadas, e de um marcador de peso molecular. Observa-se na faixa correspondente à estirpe bacteriana transformada uma banda única a 30 kD, aproximadamente, correspondente ao tamanho esperado para a proteína, esta banda não existe na faixa correspondente às bactérias não transformadas.

Exemplo 2: medida da atividade dos extratos proteicos para o 3-hidroxi-3-metil-butirato. 0 3-hidroxi-3-metil-butirato (encomendado junto à Sigma, referência 55453 sob o nome de β-hydroxyisovaleric acid) , e suspenso à concentração de 10 g/L. O mevalonato-difosfato é sintetizado a partir de mevalonolactona e outros reagentes (Sigma), de acordo com a técnica clássica, e é ressuspensa à concentração de 10 g/L.

Prepara-se seis frascos de cromatografia. Em todos os frascos, introduz-se 50 pL de tampão que contém 50 mM de Bistris/HCl, 1 mM de ditiotreitol, 10 mM de MgCl2, 5 mM de ATP.

Nos frascos 1 e 4, não se acrescenta 5 pL de água (nenhum substrato).

Nos frascos 2 e 5, acrescenta-se 5 pL da preparação de mevalonato difosfato (controlo positivo)

Nos frascos 3 e 6, acrescenta-se 5 pL da preparação de 3-hidroxi-3-metil-butirato (HIV)

Nos frascos 1, 2 e 3, acrescenta-se, em seguida, 5 pL de água (nenhuma enzima)

Nos frascos 4, 5 e 6, acrescenta-se 5 pL da preparação enzimática descrita no exemplo 1.

Selam-se os frascos com a utilização de uma tampa de septo e um alicate para selar. Incubam-se todos os frascos a 37 °C durante 4 horas por 3 dias.

Ao fim desta incubação, recolhe-se uma amostra do gás presente em cada frasco com a utilização de uma seringa a gás, e mede-se a concentração do CO2 nestas amostras com a utilização da cromatografia em fase gasosa. Percebe-se que a concentração de CO2 é muito significativa no frasco 5, e que uma concentração de CO2, mais baixa, é igualmente observável no frasco 6, o que reflete uma reação significativa da preparação enzimática sobre o 3-hidroxi-3-metil-butirato.

Mede-se, em seguida, a presença de isobutileno na amostra de gás correspondente ao frasco 6, com a utilização de um sistema de cromatografia gasosa acoplada a um detetor de infravermelhos ou de ionização de chama.

Exemplo 3: otimização das condições de reação com utilização de um cofator.

Efetua-se a mesma reação que aquela descrita no frasco 6, do exemplo anterior, mas utilizando, numa das amostras, o etil-difosfato como cofator, sintetizado por encomenda.

Neste exemplo, dispõe-se de três frascos. 0 primeiro contém os tampões, o ATP, o extrato enzimático nas quantidades descritas no exemplo anterior. 0 segundo contém os mesmos elementos, com, além disso, o 3-hidroxi-3-metil-butirato nas quantidades descritas no exemplo anterior. 0 terceiro frasco contém, além do 3-hidroxi-3-metil-butirato, 10 yL de etil-difosfato a 10 mg/L.

Mede-se, como no exemplo anterior, a formação do isobutileno com a utilização de uma aparelhagem de cromatografia gasosa acoplada à da deteção por infravermelhos ou de ionização de chama. Percebe-se que, quando o etil-difosfato está presente, a quantidade de isobutileno produzida por unidade de tempo é claramente superior.

Exemplo 4. Crlvagem de uma coleção de enzimas

Uma coleção de sessenta e três genes de codificação para as enzimas da família da MDP descarboxilase foi obtida e testada para a sua atividade no substrato HIV.

Clonagem, culturas bacterianas e expressão das proteínas.

Os genes correspondentes à família difosfato mevalonato (MDP) descarboxilases EC 4.1.1.33 foram clonados no vetor pET 25b (Novagen) para os genes de origem eucariota e pET 22b (Novagen) para os genes de origem procariota com 6 resíduos His adicionados em N-terminal, logo após o codão metionina iniciador. As células competentes E. coli BL21 (DE3) (Novagen) foram transformadas com os vetores por chogue térmico. As células foram cultivadas no meio TB gue contém 0,5 M de sorbitol, 5 mM de betaina, 100 yg/mL de ampicilina a 30 °C, sob agitação (160 rpm) até uma DO (600 nm) compreendida entre 0,8 e 1. O isopropil-B-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) foi, em seguida, acrescentado à concentração final 1 mM e a expressão das proteínas foi prosseguida a 20 °C durante a noite (cerca de 16 h) . As células foram recolhidas por centrifugação a 4 °C, 10.000 rpm, 20 minutos e os sedimentos congelados a -80 °C.

Lise das células 1,6 g de células foram descongelados sobre gelo; as células foram ressuspensas em 5 mL de 50 mM de Na2HP04 gue contém 300 mM de NaCl, 5 mM de MgC12, 1 mM de DTT pH 8. 20 yL de lysonase (Novagen) foram adicionados e depois uma incubação de 10 min à temperatura ambiente foi conduzida, e seguida de um retorno de 20 min sobre gelo. A lise das células bacterianas foi completada por sonicação num banho-maria a ultrassom, 3 vezes por 5 minutos, a 0 °C com uma homogeneização das amostras entre os pulsos. Os extratos bacterianos foram em seguida clarificados por centrifugação a 4 °C, 10.000 rpm, 20 minutos.

Purificação e concentração das proteínas (kit PROTINO)

Os lisatos bacterianos clarificados foram depositados na coluna PROTINO-lOOO Ni-IDA (Macherey-Nagel) de modo a permitir a absorção das proteínas gue portam uma etiqueta de 6 histidinas consecutivas (His tag) . As colunas foram lavadas e as enzimas de interesse foram eluídas com 4 mL de 50 mM de Na2HP04 que contém 300 mM de NaCl, 5 mM de MgC12, 1 mM de DTT, 250 mM de imidazole pH 8. Os eluatos foram em seguida concentrados em células Amicon Ultra-4 10 kDa (Millipore) até um volume final de 250 yL. A quantidade de enzimas foi determinada pelo método Bradford.

Reações enzimáticas A atividade enzimática buscada (conversão do 3-metil 3-hidroxi butirato, ou 3-hidroxi isovalerato, ou ainda HIV) foi testada em duas condições experimentais diferindo pelo tampão e o pH da reação.

Condições experimentais N° 1.

100 mM de citrato lOmM de MgC12 10 mM de ATP 20 mM de KC1 200 mM de HIV pH final foi ajustado a 5,5 Condições experimentais N° 2.

100 mM de Tris-HCl pH 7,0 lOmM de MgC12 10 mM de ATP 20 mM de KC1 200 mM de HIV pH final foi ajustado a 7,0 A enzima foi em seguida acrescentada à mistura reacional. O rendimento de produção de proteína é variável, a quantidade de enzima acrescentada varia de uma amostra para a outra, entre 0,01 e 1 mg/mL. As reações de controlo, sem enzima, foram conduzidas em paralelo.

As reações (1 mL) foram colocadas em frascos de 2 mL (Interchim) , seladas com os septos em teflon/sílica/teflon (Interchim). As reações foram incubadas a 37 °C sem agitação durante 72 horas.

Análise das reações O gás presente acima das reações foi recolhido com uma seringa equipada de um sistema antirretorno. O gás foi, em seguida, analisado por cromatografia em fase gasosa (CPG) acoplada a um espetrómetro de massa (SM) . O aparelho foi anteriormente calibrado utilizando uma gama de concentração de isobutileno.

Coluna: BPX5 (SGE) CPG/SM: MSD 5973 (HP)

Para cada cromatograma realizado, obtêm-se três picos principais, o primeiro correspondendo ao ar, o segundo à água e o terceiro ao isobutileno. Nas sessenta e três enzimas produzidas e testadas, onze candidatos potenciais foram identificados na primeira crivagem. Alguns desses candidatos são identificados por uma flecha na Figura 7. A sua identidade é apresentada na lista abaixo, e suas sequências são apresentadas nas SEQ NO 6 a 16 (his-tag não ilustrada).

Candidato 1: SEQ ID NO: 7 Número de acesso Genebank: CAI97800.1 Número de acesso Swissprot/TrEMBL: Ql GAB2 Microrganismos: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (estirpe ATCC 11842 / DSM 20081)

Candidato 2: SEQ ID NO: 8 Número de acesso Genebank: CAJ51653 Número de acesso Swissprot/TrEMBL: Q18K00 Microrganismos: Haloquadratum walsbyi DSM 16790 Candidato 3: SEQ ID NO: 9 Número de acesso Genebank: ABD99494.1 Número de acesso Swissprot/TrEMBL: Q1WU41 Microrganismos: Lactobacillus salivarius subsp. salivarius (estirpe UCC118)

Candidato 4: SEQ ID NO: 10 Número de acesso Genebank: ABJ57000.1 Número de acesso Swissprot/TrEMBL: Q04EX2 Microrganismos: Oenococcus oeni (estirpe BAA-331 / PSU-1)

Candidato 5: SEQ ID NO: 11 Número de acesso Genebank: ABJ67984.1 Número de acesso Swissprot/TrEMBL: Q03FN8 Microrganismos: Pediococcus pentosaceus ATCC 25745 Candidato 6: SEQ ID NO: 12 Número de acesso Genebank: ABV09606.1 Número de acesso Swissprot/TrEMBL: A8AUU9 Microrganismos: Streptococcus gordonii (estirpe

Challis / ATCC 35105 / CHI / DL1 / V288)

Candidato 7: SEQ ID NO: 13 Número de acesso Genebank: ABQ14154.1 Número de acesso Swissprot/TrEMBL: A5EVP2 Microrganismos: Dichelobacter nodosus VCS1703A Candidato 8: SEQ ID NO: 14 Número de acesso Genebank: EDT95457.1 Número de acesso Swissprot/TrEMBL: B2DRT0 Microrganismos: Streptococcus pneumoniae CDC0288-04 Candidato 9: SEQ ID NO: 15 Número de acesso Genebank: AAT86835 Número de acesso Swissprot/TrEMBL: Q5XCM8 Microrganismos: Streptococcus pyogenes serotipo M6 (ATCC BAA-946 / MGAS10394)

Candidato 10: SEQ ID NO: 6 Número de acesso Genebank: AAT43941 Número de acesso Swissprot/TrEMBL: Q6KZB1 Microrganismos: Picrophilus torridus DSM 9790 Candidato 11: SEQ ID NO: 16 Número de acesso Genebank: AAV43007.1 Número de acesso Swissprot/TrEMBL: Q5FJW7 Microrganismos: Lactobacillus acidophilus NCFM A produção mais elevada de IBN foi observada com o candidato 10, isto é, com a enzima descarboxilase purificada de SEQ ID NO: 6 proveniente de Picrophilus torridus. Esta enzima foi retida para ser caracterizada em detalhes.

Exemplo 5: Caracterização da enzima de SEQ ID NO: 6 A enzima recombinante foi purificada como descrito no exemplo 4. Os resultados, apresentados na Figura 8, mostram que a pureza da enzima na amostra proteica final é estimada a 90%. A atividade da enzima isolada foi confirmada. A reação foi conduzida nas condições seguintes:

100 mM de Tris-HCl pH 7,0 lOmM de MgC12 10 mM de ATP 20 mM de KC1 250 mM de HIV pH final foi ajustado a 6,0 3 mg/mL de enzima

Após uma incubação a 30 °C durante 72 h, mede-se o sinal por CPG/SM. Os resultados são apresentados na Figura 9. Na presença de enzima, a produção do IBN é aumentada aqui de um fator cerca de 2,3 em comparação ao ruido de fundo. O ruido de fundo observado aqui é homogéneo com a literatura da química orgânica, que menciona que o ácido 3-hidroxi-isovalérico em solução aquosa e a uma temperatura da ordem de 100 °C descarboxila-se lentamente em terc-butanol, o qual se converte parcialmente por desidratação em isobutileno, seguindo um equilíbrio favorável à formação de terc-butanol (Pressman e Luca, J. Am. Chem. Soc. 1940). Efeito do cossubstrato ATP Condições de teste 100 mM de citrato 50 mM de KC1 10 mM de MgC12 200 mM de HIV (a especificar) 1 mg/mL de enzima purificada pH 5,5

Incubação a 30 °C durante

72 h

Os resultados são apresentados na Figura 10 e mostram que a atividade enzimática é observada apenas na presença de cossubstrato ATP. Outras moléculas, e nomeadamente as moléculas que contêm uma ligação fosfo-anidrido, são suscetíveis de constituir cossubstratos eficazes para a enzima.

Efeito do cofator Mg2+

Condições de teste 100 mM de citrato pH 5,5 50 mM de KC1 10 mM de ATP 200 mM de HIV (a especificar) pH 5,5 1 mg/ml de enzima purificada Incubação a 30 °C durante 72 h

Os resultados são apresentados na Figura 11 e mostram que a atividade da enzima é melhorada na presença de iões Mg2+. Outros iões, e nomeadamente outros iões divalentes, são suscetíveis de serem utilizados como cofator em substituição ou além dos iões Mg2+.

Atividade enzimática em função da temperatura Condições dos testes 100 mM de tampão 50 mM de KC1 10 mM de ATP 200 mM de HIV (a especificar) 1 mg/mL de enzima purificada

Incubação durante 72 h a uma temperatura variável.

Os resultados apresentados na Figura 12 mostram que a enzima é moderadamente termoativa e apresenta um ideal de temperatura de cerca de 50 °C.

Atividade em função de pH Condições dos testes 100 mM de tampão 50 mM de KC1 10 mM de ATP 200 mM de HIV (a especificar) 1 mg/mL de enzima purificada Incubação a 30 °C durante 72 h

As condições ideais foram obtidas a um pH de 5,5, em 100 mM de citrato.

Parâmetros enzimáticos

Uma gama de substrato foi realizada nas condições anteriormente descritas, com uma incubação a 50 °C. O Km da enzima é estimado a 40 mM de HIV.

Otimização das condições reacionais

As condições reacionais ideais foram buscadas. As condições seguintes foram mantidas: 100 mM de citrato 50 mM de KC1

40 mM de ATP

200 mM de HIV 1 mg/mL de enzima

Incubação a 50°C durante 48 h

Como mostrado na Figura 14, o sinal relação sobre ruido de fundo é de cerca de 100.

Exemplo 6. Otimização do nivel de expressão da MDP descarboxilase de P. tórridas em E. coli O nivel de expressão inicial em E. coli BL21 foi baixo, visto que a banda ficou dificilmente visível em SDS-PAGE antes da purificação. O índice de otimização de codão (Codon Optimisation Index) (CAI) da sequência nativa para uma expressão em E. coli foi medido com a utilização do software "Optimizer", disponível em http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/, e inspirando-se do método de Sharp e Li (1987) . 0 valor obtido foi de apenas 0,23, refletindo o nível de expressão limitado da proteína estudada em E. coli.

Uma sequência de codificação para uma proteína idêntica, mas que tem os codões melhor adaptados à expressão em E. coli, foi gerada. 0 CAI desta sequência, 0,77 foi mais próximo de do ideal de 1. A sequência nativa e a sequência otimizada são apresentadas, SEQ ID NO: 17 (Sequência otimizada da MDP descarboxilase de P. torridus (AAT43941) que inclui a His Tag) e SEQ ID NO: 19 (Sequência nativa da MDP descarboxilase de P. torridus (AAT43941) que inclui a His Tag) . A sequência otimizada foi sintetizada por concatenação de oligonucleótidos, e clonada num vetor de expressão pET25. Após transformação do vetor na estirpe E. coli BL21(DE3) e indução que utiliza o protocolo anteriormente descrito, as proteínas foram produzidas, purificadas e analisadas em gel de forma semelhante ao descrito anteriormente. 0 mesmo protocolo foi conduzido com a sequência nativa a título de comparação.

Comparação dos níveis de expressão do candidato 224 que utiliza, seja a sequência nucleotídica nativa, seja a sequência otimizada para a expressão em E. coli.

Os resultados apresentados na Figura 15 mostram que a proteína correspondente ao gene otimizado é claramente visível em gel no lisato celular não purificado (faixa 4), o que traduz um ganho de expressão muito significativo. A pureza da proteína, após a etapa de purificação, é igualmente mais importante no caso do gene otimizado. A atividade foi medida no lisato bruto. Com efeito, esta atividade foi indetetável no lisato bruto obtido com a sequência nucleica nativa. A expressão da proteína foi melhorada de tal maneira, que o lisato bruto obtido a partir da sequência nucleica melhorada (clone 224 otimizado) apresenta agora esta atividade. 0 meio de reação utilizado neste teste foi o seguinte:

Meio de

reação

Incubação 2 dias a 50 °C.

Resultados

Condição n° 1: Lisato do clone 224 otimizado

Condição n° 2: Lisato do clone GB6 (plasmideo pET vazio)

Exemplo 7: processo de sintese de Isobutlleno a partir de 3-hidroxi-3-metil-butirato e conversão em iso-octano.

Uma reação idêntica àquela do frasco 3 do exemplo 3 é realizada num volume de 1 litro, disposta num fermentador que dispõe de um sistema de extração gasosa. A presença da enzima recombinante induz a conversão do 3-hidroxi-3-metil-butirato em isobutileno, que desgaseifica naturalmente, e é recuperado por um sistema de extração gasosa situado na parte superior do fermentador. 0 isobutileno é, em seguida, utilizado para gerar o iso-octeno por adição catalisada pela resina Amberlyst 35wet ou 36wet (Rohm and Haas). 0 iso-octeno é, por fim, reduzido por hidrogenação catalitica em iso-octano.

Exemplo 8: engenharia da enzima para melhorar a sua eficácia para os substratos.

Utiliza-se a tecnologia de mutagénese aleatória para gerar um banco que contém milhares de mutantes a partir do gene descrito no exemplo 1. Integra-se, em seguida, este banco de mutantes no plasmídeo de expressão, e transforma-se o banco em bactérias competentes de estirpe BL21. Isola-se, em seguida, um milhar de bactérias, que se repica em tubos eppendorf que contêm 500 yL de meio LB suplementado em ampicilina. Incuba-se estas amostras num agitador durante 15 horas. No dia seguinte, mede-se a quantidade de isobutileno produzida com a utilização de um ou outro dos protocolos experimentais apresentados nos exemplos anteriores.

Os clones que apresentam uma quantidade de isobutileno significativamente aumentada são, em seguida, validados novamente com utilização do mesmo protocolo experimental. Uma vez validada a sua melhoria, o plasmídeo é extraído de cada estirpe melhorada, e sequenciado. As mutações que dão origem à melhoria de atividade são identificadas, e combinadas num mesmo plasmídeo. O plasmídeo que contém as diferentes mutações de melhoria é, por sua vez, transformado nas bactérias competentes, e o mesmo sistema de análise é efetuado. O clone que as diferentes mutações, que apresenta uma atividade significativamente superior àquela que contém apenas uma única mutação de melhoria, é em seguida utilizado como base para uma nova rodada de mutação/crivagem, na busca de mutantes que apresentam uma atividade ainda melhorada.

Ao fim deste protocolo, o clone que contém várias mutações e tendo a melhor atividade, é selecionado.

Exemplo 9: processo de síntese de etileno a partir de 3-hidroxi-propionato. 0 gene que codifica para a enzima descrita no exemplo 1 é inserido num plasmídeo que permite a expressão de proteínas recombinantes numa estirpe de E. coli. 0 plasmídeo é transformado nas bactérias da referida estirpe. As bactérias transformantes são, em seguida, incubadas num fermentador na presença de propil-difosfato (10 mg/L) e de 3-hidroxi-propionato (1 g/L). A presença da enzima recombinante induz a conversão do 3-hidroxi-propionato em etileno, que desgaseifica espontaneamente, e é recuperado por um sistema de extração gasosa situado na parte superior do fermentador. Mede-se, em seguida, a presença de etileno na amostra de gás correspondente com utilização de um sistema de cromatografia gasosa acoplada a um detetor de infravermelhos, parte do espectro no qual o etileno apresenta uma forte emissão.

Exemplo 10: processo de síntese de propileno a partir de 3-hidroxi-butirato. 0 gene que codifica para a enzima descrita no exemplo 1, ou para uma enzima descrita no exemplo 4, é inserido num plasmídeo que permite a expressão de proteínas recombinantes numa estirpe de E. coli. 0 plasmídeo é transformado nas bactérias da referida estirpe. As bactérias transformantes são, em seguida, incubadas num fermentador na presença de etil-difosfato (10 mg/L) e de 3-hidroxi-butirato (1 g/L) (Sigma, referência 166898). A presença da enzima recombinante induz a conversão do 3-hidroxi-butirato em propileno, que desgaseifica espontaneamente, e é recuperado por um sistema de extração gasosa situado na parte superior do fermentador. Mede-se, em seguida, a presença de propileno na amostra de gás correspondente que utiliza um sistema de cromatografia gasosa acoplada a um detetor de infravermelhos, parte do espectro no qual o propileno apresenta uma forte emissão. Exemplo 11: processo de síntese de propileno a partir de glicose. 0 gene que codifica para a enzima descrita no exemplo 1 ou para uma enzima descrita no exemplo 4 é inserido num plasmídeo que permite a expressão de proteínas recombinantes na bactéria Alcaligenes eutrophus. 0 plasmídeo é transformado nas bactérias da referida estirpe.

As bactérias são, em seguida, incubadas num fermentador na presença de glicose e de etil-difosfato e nas condições de microaerofilia, e depois submetidas a um stress térmico que tem como consequência de fazê-lo produzir grandes quantidades de 3-hidroxi-butirato. A presença da enzima recombinante induz a conversão simultânea do 3-hidroxi-butirato em propileno. 0 propileno desgaseifica naturalmente, e é recuperado por um sistema de extração gasosa situado na parte superior do fermentador. Exemplo 12: processo de síntese de propileno a partir de glicose. 0 presente exemplo descreve um processo muito próximo daquele do exemplo 11. A diferença principal consiste na utilização de uma estirpe de E. coli modificada de modo a produzir o 3-hidroxi-butirato e não uma estirpe natural, tal como Alcaligenes eutrophus. A referida estirpe foi obtida por engenharia de vias metabólicas de modo a resultar na acumulação de 3-hidroxi-butirato. 0 acréscimo de uma MDP descarboxilase, tal como descrito no exemplo 1 ou no exemplo 4, permite converter o 3-hidroxi-butirato em propileno.

Exemplo 13: processo de síntese de isobutileno a partir de glicose. 0 gene que codifica para a enzima descrita no exemplo 1 é inserido num plasmídeo que permite a expressão de proteínas recombinantes numa estirpe de bactérias E. coli, tendo também sofrido alterações metabólicas de modo a sintetizar de forma endógena o 3-hidroxi-3-metil-butirato.

As bactérias são, em seguida, incubadas num fermentador na presença de glicose e nas condições de microaerofilia. A presença da enzima recombinante induz a conversão simultânea do 3-hidroxi-3-metil-butirato em isobutileno, que desgaseifica naturalmente e é recuperado por um sistema de extração gasosa situado na parte superior do fermentador.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Marlière, Philippe <120> Produção de alcenos por descarboxilação de ácidos 3-hidroxi-alcanoicos

<130> B742PC <160> 20 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 400

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met Ala Ser Glu Lys Pro Leu Ala Ala Vai Thr Cys Thr Ala Pro Vai 15 10 15

Asn Ile Ala Vai Ile Lys Tyr Trp Gly Lys Arg Asp Glu Glu Leu Vai 20 25 30

Leu Pro Ile Asn Ser Ser Leu Ser Vai Thr Leu His Gin Asp Gin Leu 35 40 45

Lys Thr Thr Thr Thr Ala Vai Ile Ser Lys Asp Phe Thr Glu Asp Arg 50 55 60

Ile Trp Leu Asn Gly Arg Glu Glu Asp Vai Gly Gin Pro Arg Leu Gin 65 70 75 80

Ala Cys Leu Arg Glu lie Arg Cys Leu Ala Arg Lys Arg Arg Asn Ser 85 90 95

Arg Asp Gly Asp Pro Leu Pro Ser Ser Leu Ser Cys Lys Vai His Vai 100 105 110

Ala Ser Vai Asn Asn Phe Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ala 115 120 125

Ala Gly Tyr Ala Cys Leu Ala Tyr Thr Leu Ala Arg Vai Tyr Gly vai 130 135 140

Glu Ser Asp Leu Ser Glu Vai Ala Arg Arg Gly Ser Gly Ser Ala Cys 145 150 155 160

Arg Ser Leu Tyr Gly Gly Phe Vai Glu Trp Gin Met Gly Glu Gin Ala 165 170 175

Asp Gly Lys Asp Ser Ile Ala Arg Gin Vai Ala Pro Glu Ser His Trp 180 185 190

Pro Glu Leu Arg vai Leu ile Leu Vai Vai Ser Ala Glu Lys Lys Leu 195 200 205

Thr Gly Ser Thr Vai Gly Met Arg Ala Ser Vai Glu Thr Ser Pro Leu 210 215 220

Leu Arg Phe Arg Ala Glu Ser Vai Vai Pro Ala Arg Met Ala Glu Met 225 230 235 240

Ala Arg Cys He Arg Glu Arg Asp Phe Pro Ser Phe Ala Gin Leu Thr 245 250 255

Met Lys Asp Ser Asn Gin Phe His Ala Thr Cys Leu Asp Thr Phe Pro 260 265 270

Pro Ile Ser Tyr Leu Asn Ala Ile Ser Trp Arg Ile Ile His Leu Vai 275 280 285

His Arg Phe Asn Ala His His Gly Asp Thr Lys vai Ala Tyr Thr Phe 290 295 300

Asp Ala Gly Pro Asn Ala Vai ile Phe Thr Leu Asp Asp Thr vai Ala 305 310 315 320

Glu Phe Vai Ala Ala Vai Trp His Gly Phe Pro Pro Gly Ser Asn Gly 325 330 335

Asp Thr Phe Leu Lys Gly Leu Gin vai Arg Pro Ala Pro Leu Ser Ala 340 345 350

Glu Leu Gin Ala Ala Leu Ala Met Glu Pro Thr Pro Gly Gly Vai Lys 355 360 365

Tyr Ile Ile Vai Thr Gin Vai Gly Pro Gly Pro Gin Ile Leu Asp Asp 370 375 380

Pro Cys Ala His Leu Leu Gly Pro Asp Gly Leu Pro Lys Pro Ala Ala 385 390 395 400 <210> 2

<211> 396 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2

Met Thr Vai Tyr Thr Ala Ser Vai Thr Ala Pro Vai Asn lie Ala Thr 15 10 15

Leu Lys Tyr Trp Gly Lys Arg Asp The Lys Leu Asn Leu Pro The Asn 20 25 30

Ser Ser Ile Ser Vai Thr Leu Ser Gin Asp Asp Leu Arg Thr Leu Thr 35 40 45

Ser Ala Ala Thr Ala Pro Glu Phe Glu Arg Asp Thr Leu Trp Leu Asn 50 55 60

Gly Glu Pro His Ser Ile Asp Asn Glu Arg Thr Gin Asn Cys Leu Arg 65 70 75 80

Asp Leu Arg Gin Leu Arg Lys Glu Met Glu Ser Lys Asp Ala Ser Leu 85 90 95

Pro Thr Leu Ser Gin Trp Lys Leu His Ile Vai Ser Glu Asn Asn Phe 100 105 110

Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ala Ala Gly Phe Ala Ala Leu 115 120 125

Vai Ser Ala Ile Ala Lys Leu Tyr Gin Leu Pro Gin Ser Thr Ser Glu 130 135 140

Ile Ser Arg Ile Ala Arg Lys Gly Ser Gly Ser Ala Cys Arg Ser Leu 145 150 155 160

Phe Gly Gly Tyr Vai Ala Trp Glu Met Gly Lys Ala Glu Asp Gly His 165 170 175

Asp Ser Met Ala Vai Gin Ile Ala Asp Ser Ser Asp Trp Pro Gin Met 180 185 190

Lys Ala Cys Vai Leu Vai Vai Ser Asp Ile Lys Lys Asp Vai Ser Ser 195 200 205

Thr Gin Gly Met Gin Leu Thr Vai Ala Thr Ser Glu Leu Phe Lys Glu 210 215 220

Arg Ile Glu His Vai Vai Pro Lys Arg Phe Glu Vai Met Arg Lys Ala 225 230 235 240

Ile Vai Glu Lys Asp Phe Ala Thr Phe Ala Lys Glu Thr Met Met Asp 245 250 255

Ser Asn Ser Phe His Ala Thr Cys Leu Asp Ser Phe Pro Pro Ile Phe 260 265 270

Tyr Met Asn Asp Thr Ser Lys Arg Ile Ile Ser Trp Cys His Thr Ile 275 280 285

Asn Gin Phe Tyr Gly Glu Thr Ile Vai Ala Tyr Thr Phe Asp Ala Gly 290 295 300

Pro Asn Ala Vai Leu Tyr Tyr Leu Ala Glu Asn Glu Ser Lys Leu Phe 305 310 315 320

Ala Phe Ile Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Vai Pro Gly Trp Asp Lys Lys 325 330 335

Phe Thr Thr Glu Gin Leu Glu Ala Phe Asn His Gin Phe Glu Ser Ser 340 345 350

Asn Phe Thr Ala Arg Glu Leu Asp Leu Glu Leu Gin Lys Asp Vai Ala 355 360 365

Arg Vai Ile Leu Thr Gin Vai Gly Ser Gly Pro Gin Glu Thr Asn Glu 370 375 380

Ser Leu ile Asp Ala Lys Thr Gly Leu Pro Lys Glu 385 390 395

<210> 3 <211> 404 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 3

Met Ala Ala Ser Ala Asp Ser Gin vai Phe Arg Ala Thr Thr Thr Ala 15 10 15

Pro Vai Asn ile Ala Vai lie Lys Tyr Trp Gly Lys Arg Asp Ala vai 20 25 30

Leu Asn Leu Pro Thr Asn Ser Ser Leu Ser Vai Thr Leu Ser Gin Arg 35 40 45

Ser Leu Arg Thr Leu Thr Thr Ala Ser Cys Ala Pro Phe Tyr Pro Ala 50 55 60

Lys Asp Glu Leu Thr Leu Asn Gly Lys Pro Gin Asp Ile Gin Ser Ser 65 70 75 80

Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ala Ser Leu Arg Ala His Arg Arg Glu 85 90 95

Leu Glu Asp Ala Asn Pro Ser Leu Pro Lys Leu Ser Ser Phe Pro Leu 100 105 110

Arg Ile Vai Ser Glu Asn Asn Phe Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ala Ser 115 120 125

Ser Ala Ala Gly Phe Ala Ala Leu vai Arg Ala Vai Ala Asp Leu Tyr 130 135 140

Gin Leu Pro Gin Ser Pro Arg Asp Leu Ser Arg Ile Ala Arg Gin Gly 145 150 155 160

Ser Gly Ser Ala Cys Arg Ser Leu Met Gly Gly Tyr Vai Ala Trp Arg 165 Π0 175

Ala Gly Ser Leu Glu Asp Gly Ser Asp Ser Leu Ala Glu Glu Vai Ala 180 185 190

Pro Gin Ser His Trp Pro Glu Met Arg Ala Leu Ile Leu Vai Vai Ser 195 200 205

Ala Ala Lys Lys Asp Vai Pro Ser Thr Glu Gly Met Gin Thr Thr Vai 210 215 220

Ala Thr Ser Asn Leu Phe Ala Thr Arg Ala Ser Thr Vai Vai Pro Glu 225 230 235 240

Arg Met Ala Ala Ile Glu Thr Ala Ile Gin Asn Arg Asp Phe Pro Ala 245 250 255

Phe Ala Glu Ile Thr Met Arg Asp Ser Asn Ser Phe His Ala Thr Cys 260 265 270

Leu Asp Ser Trp Pro Pro Ile Phe Tyr Met Asn Asp Vai Ser Arg Ala 275 280 285

Ala Vai Arg Leu Vai His Asp Ile Asn Arg Ala Ile Gly Arg Thr Vai 290 295 300

Cys Ala Tyr Thr Tyr Asp Ala Gly Pro Asn Ala Vai Ile Tyr Tyr Leu 305 310 315 320

Glu Lys Asp Thr Glu Leu Vai Ala Gly Thr Vai Lys Ala Ile Leu Gly 325 330 335

Glu Lys Thr Glu Gly Trp Glu Gly Pro Phe Tyr Thr Pro Leu Lys Asp 340 345 350

Vai Thr Thr Pro Gly vai Ser Leu Asp Glu ile Asp Pro Arg Thr Vai 355 360 365

Glu Ser Leu Lys Asp Gly Vai Ser Arg Vai Ile Leu Thr Gly Vai Gly 370 375 380

Glu Gly Pro Ile Ser Vai Asp Gin His Leu Vai Ser Glu Lys Gly Asp 385 390 395 400

Ile Leu Ser Ala

<210> 4 <211> 325 <212> PRT <213> Lactobacillus plantarum <400> 4

Met Lys Thr Vai Thr Ala Lys Ala His Thr Asn Ile Ala Leu Vai Lys 15 10 15

Tyr Trp Gly Lys Lys Asp Ala Ala Leu Met Leu Pro Gin Asn Gly Ser 20 25 30

Ile Ser Leu Thr Leu Asp His Phe Tyr Thr Gin Thr Ser Vai Thr Phe 35 40 45

Asp Glu His Leu Asp Thr Asp Gin Ile Tyr Phe Asn His Gin His Leu 50 55 60

Pro Thr Gly Lys Ser Ala Arg Ile Ser Gin Phe Leu Asp Leu Ile Arg 65 70 75 80

Gin Arg Ser Gly Gin Thr Asn Tyr Ala Thr Vai Lys Thr Glu Asn His 85 90 95

Vai Pro Thr Ser Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ala Ser Gly Phe Ala Ala 100 105 110

Leu Ala Gly Ala Ala Ser Arg Ala Ala Gly Leu Gin Leu Asp Ala Ala 115 120 125

Asp Leu Ser Arg Leu Ala Arg Arg Gly Ser Gly Ser Ala Thr Arg Ser 130 135 140

Ile Phe Gly Gly Phe Vai Glu Trp His Ala Gly His Asp Asp Gin Ser 145 150 155 160

Ser Tyr Ala Glu Vai Leu Gin Asp Pro Vai Asp Trp Asp Ile Gin Met 165 170 175

Ile Ala Vai Vai Leu Lys Ala Thr Lys Lys Thr Ile Ser Ser Thr Asp 180 185 190

Gly Met Ala Arg Vai Vai Ala Thr Ser Pro Tyr Tyr Pro Ala Trp Ile 195 200 205

Thr Thr Ala Glu Thr Asp Leu Lys Arg Met Arg Gin Ala Ile Ala Asp 210 215 220

Arg Asp Leu Thr Thr Vai Gly Gin Ile Ala Glu Thr Asn Ala Met Arg 225 230 235 240

Met His Ala Leu Asn Leu Ser Ala Glu Pro Ala Phe Asn Tyr Phe Thr 245 250 255

Ala Asp Thr Leu Thr Ala Ile Gin Ala Vai Asn Asp Leu Arg Ser His 260 265 270

Gly ile Asn Cys Tyr Tyr Thr Leu Asp Ala Gly Pro Asn vai Lys ile 275 280 285

Ile Cys Ala Gly Gin Asp Thr Asp Thr Ile Met Thr Gly Leu Gin Gin 290 295 300

His Phe Asp Ala Asp Gin Leu Ile Vai Ala Lys Pro Gly Pro Gly Ile 305 310 315 320

Thr Ile Thr Glu Lys 325

<210> 5 <211> 314 <212> PRT <213> Streptococcus pyrogenes <400> 5

Met Asp Pro Asn Vai Ile Thr Vai Thr Ser Tyr Ala Asn Ile Ala lie 15 10 15

Ile Lys Tyr Trp Gly Lys Glu Asn Gin Ala Lys Met Ile Pro Ser Thr 20 25 30

Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Phe Thr Thr Thr Ser Vai 35 40 45

Ser Phe Leu Pro Asp Thr Ala Thr Ser Asp Gin Phe Tyr ile Asn Gly 50 55 60 lie Leu Gin Asn Asp Glu Glu His Thr Lys ile Ser Ala ile ile Asp 65 70 75 80

Gin Phe Arg Gin Pro Gly Gin Ala Phe Vai Lys Met Glu The Gin Asn 85 90 95

Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110

Ala Leu Vai Lys Ala Cys Asp Gin Leu Phe Asp Thr Gin Leu Asp Gin 115 120 125

Lys Ala Leu Ala Gin Lys Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ser Arg 130 135 140

Ser Phe Phe Gly Pro vai Ala Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Ala ile 145 150 155 160

Tyr Lys Vai Glu Thr Asp Leu Lys Met Ala Met Ile Met Leu Vai Leu 165 170 175

Asn Ala Ala Lys Lys Pro Ile Ser Ser Arg Glu Gly Met Lys Leu Cys 180 185 190

Arg Asp Thr Ser Thr Thr Phe Asp Gin Trp Vai Glu Gin Ser Ala Ile 195 200 205

Asp Tyr Gin His Met Leu Thr Tyr Leu Lys Thr Asn Asn Phe Glu Lys 210 215 220

Vai Gly Gin Leu Thr Glu Ala Asn Ala Leu Ala Met His Ala Thr Thr 225 230 235 240

Lys Thr Ala Asn Pro Pro Phe Ser Tyr Leu Thr Lys Glu Ser Tyr Gin 245 250 255

Ala Met Glu Ala Vai Lys Glu Leu Arg Gin Glu Gly Phe Ala Cys Tyr 260 265 270

Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Vai Lys Vai Leu Cys Leu Glu Lys 275 280 285

Asp Leu Ala Gin Leu Ala Glu Arg Leu Gly Lys Asn Tyr Arg Ile lie 290 295 300

Vai Ser Lys Thr Lys Asp Leu Pro Asp Vai 305 310

<210> 6 <211> 324 <212> PRT <213> Picrophilus torridus <4 Ο Ο> 6

Met Glu Asn Tyr Asn Vai Lys Thr Arg Ala Phe Pro Thr Ile Gly Ile 15 10 15

Ile Leu Leu Gly Gly Ile Ser Asp Lys Lys Asn Arg Ile Pro Leu His 20 25 30

Thr Thr Ala Gly Ile Ala Tyr Thr Gly Ile Asn Asn Aep Vai Tyr Thr 35 40 45

Glu Thr Lys Leu Tyr Vai Ser Lys Asp Glu Lys Cys Tyr Ile Asp Gly 50 55 60

Lys Glu Ile Asp Leu Asn Ser Asp Arg Ser Pro Ser Lys Vai lie Asp 65 70 75 80

Lys Phe Lys His Glu Ile Leu Met Arg Vai Asn Leu Asp Asp Glu Asn 85 90 95

Asn Leu Ser Ile Asp Ser Arg Asn Phe Asn Ile Leu Ser Gly Ser Ser 100 105 110

Asp Ser Gly Ala Ala Ala Leu Gly Glu Cys Ile Glu Ser lie Phe Glu 115 120 125

Tyr Asn Ile Asn Ile Phe Thr Phe Glu Asn Asp Leu Gin Arg Ile Ser 130 135 140

Glu Ser Vai Gly Arg Ser Leu Tyr Gly Gly Leu Thr Vai Asn Tyr Ala 145 150 155 160

Asn Gly Arg Glu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Leu Glu Pro Glu Ala Phe 165 170 175

Asn Asn Phe Thr Ile Ile Gly Ala His Phe Asn Ile Asp Arg Lys Pro 130 135 190

Ser Asn Glu Ile His Glu Asn Ile Ile Lys His Glu Asn Tyr Arg Glu 195 200 205

Arg Ile Lys Ser Ala Glu Arg Lys Ala Lys Lys Leu Glu Glu Leu Ser 210 215 220

Arg Asn Ala Asn Ile Lys Gly Ile Phe Glu Leu Ala Glu Ser Asp Thr 225 230 235 240 val Glu Tyr His Lys Met Leu His Asp vai Gly vai Asp ile ile Asn 245 250 255

Asp Arg Met Glu Asn Leu Ile Glu Arg Vai Lys Glu Met Lys Asn Asn 260 265 270

Phe Trp Asn Ser Tyr Ile Vai Thr Gly Gly Pro Asn Vai Phe Vai Ile 275 280 285

Thr Glu Lys Lys Asp Vai Asp Lys Ala Met Glu Gly Leu Asn Asp Leu 290 295 300

Cys Asp Asp Ile Arg Leu Leu Lys Vai Ala Gly Lys Pro Gin Vai Ile 305 310 315 320

Ser Lys Asn Phe

<210> 7 <211> 319 <212> PRT <213> Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus <400> 7

Met Ser Lys Thr Ala Arg Ala His Thr Asn Ile Ala Leu Ile Lys Tyr 15 10 15

Trp Gly Lys Lys Asp Ala Lys Leu Arg Leu Pro Leu Met Ser Ser Leu 20 25 30

Ser Met Thr Leu Asp Ala Phe Tyr Ser Asp Thr Lys Ile Ser Asp Ser 35 40 45

Glu Gin Met Ser Phe Lys Leu Asn Gly Gin Ala Vai Ser Gly Pro Ala 50 55 60

Ala Asp Arg Vai Phe Ala Tyr Leu Arg Ala Met Gin Asp Arg Phe Gly 65 70 75 80

Vai Lys Gly Asn Leu Ala Vai Glu Ser Vai Asn Gin Vai Pro Thr Ala 85 90 95

Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ser Ser Ala Phe Ala Ala Met Ala Ala Ala 100 105 110

Phe Ala Asp His Tyr Gin Leu Gly Vai Asp Arg Gin Glu Leu Ser Arg 115 120 125

Met Ala Arg Met Gly Ser Gly Ser Ala Ser Arg Ser Vai Phe Gly Gly 130 135 140

Phe Ser Vai Trp Gin Lys Gly Asp Ser Asp Gin Thr Ser Tyr Ala Tyr 145 150 155 160

Pro Leu Asp Glu Glu Pro Asp Met Asp Leu Arg Leu Leu Ala vai Glu 165 170 175

Ile Asn Asp Gin Glu Lys Lys Ile Ser Ser Thr Lys Gly Met Glu Met 180 185 190

Ser Lys Ser Ser Pro Phe Tyr Gin Vai Trp Leu Asp Arg Asn Asp Ser 195 200 205

Glu ile Lys Glu Met Glu Glu Ala ile Lys Gin Ala Asp Phe Ser Lys 210 215 220

Leu Gly Ser Leu Ala Glu Leu Asn Ala Ser Glu Met His Thr Leu Thr 225 230 235 240

Phe Thr Ala Vai Pro Gly Phe Thr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ile Lys 245 250 255

Ala Ile Lys Leu Vai Gin Asp Leu Arg Gin Gin Gly Leu Glu Cys Tyr 260 265 270

Tyr Thr lie Asp Ala Gly Pro Asn Vai Lys Vai Leu Cys Gin Gly Lys 275 280 285

Asn Ser Lys Asp Ile Ile Asn Cys Phe Glu Ser Ser Phe Asp Arg Vai 290 295 300

Lys Ile Ile Glu Ala Gly Phe Gly Pro Gly Vai Thr Leu Leu Asp 305 310 315

<210> 8 <211> 324 <212> PRT <213> Haloquadratum walsbyi <400> 8

Met Lys Ala Thr Ala Arg Ala His Pro He Gin Gly Leu lie Lys Tyr 15 10 15

His Gly Met Arg Asp Ser Asp Lys Arg Tyr Pro Tyr His Asp Ser lie 20 25 30

Ser Vai Cys Thr Ala Pro Ser Ala Thr Thr Thr Thr Vai Glu Phe Gin 35 40 45

Ser Asp Ala Ser Gly Asp Vai Tyr ile lie Asp Asn Glu Arg Vai Asp 50 55 60

Gly Arg Ala Ala Glu Arg Ile Asp Ala Vai Vai Glu His Vai Arg Glu 65 70 75 80

Arg Tbr Gly Ile Arg Asp Pro Vai Arg Leu Vai Ser Tbr Asn Ser Phe 85 90 95

Pro Ser Asn Ile Gly Phe Gly Ser Ser Ser Ser Gly Pbe Ala Ala Ala 100 105 110

Ala Met Ala Leu Vai Tbr Ala Ala Gly Glu Glu Leu Tbr His Pro Glu 115 120 125

Ile Ser Thr Ile Ala Arg Arg Gly Ser Ser Ser Ala Ala Arg Ala Vai 130 135 140

Thr Gly Ala Phe Ser Gin Leu Tyr Ser Gly Met Asn Asp Thr Asp Cys 145 150 155 180

His Ala Glu Arg Ile Glu Thr Asp Leu Asp Ala Thr Vai Arg Thr Vai 165 170 175

Ala Ala His Vai Pro Ala Tyr Lys Glu Thr Glu Glu Ala His Arg Glu 180 185 190

Ala Ala Gin Ser His Met Phe Asp Ala Arg Leu Ala His Vai His His 195 200 205

Gin Ile Asp Ala Met Arg Asp Ala Leu Tyr Asn Ala Asp Phe Asp Arg 210 215 220

Ile Phe Glu Leu Ala Glu His Asp Ser Leu Ser Leu Thr Ala Ala Thr 225 230 235 240

Met Thr Gly Pro Ala Gly Trp Vai Tyr Trp Gin Pro Gin Thr Ile Ala 245 250 255 val Phe Asn Thr Vai Arg Glu Leu Arg Glu Arg Glu Ser Ile Pro vai 260 265 270

Tyr Phe Ser Thr Asp Thr Gly Ala Ser Val Tyr Val Asn Thr Thr Ala 275 280 285

Ala His Val Asp Thr Val Glu Ser Ala Ile Ser Asp Ile Gly Ile Asp 290 295 300

Thr Asp ile Trp Thr val Gly Gly Pro Ala Thr val Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320

Asp Ser Leu Phe

<210> 9 <211> 322 <212> PRT <213> Lactobacillus salivarius subsp. salivarius <400> 9

Met Ser Asn His Ala Ala Ala Arg Ala His Thr Asn Ile Ala Leu Ile 15 10 15

Lys Tyr Trp Gly Lys Lys Asp Thr Glu Leu Ile Leu Pro Met Asn Asn 20 25 30

Ser Leu Ser Leu Thr Leu Asp His Phe Tyr Thr Asp Thr Ser Vai Thr 35 40 45

Phe Asp Ser Ser Tyr Thr Lys Asp Thr Phe Ile Leu Asn Gly Lys Glu 50 55 60

Ile Pro Asn Glu Asn Vai His Lys Phe Leu Asn Ile Vai Arg Glu Lys 65 70 75 80

Ala Gly Ile Ser Glu Phe Ala Lys Vai Asn Ser Thr Asn His Vai Pro 85 90 95

Thr Thr Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ala Ser Ala Phe Ala Ala Leu Ala 100 105 110

Ala Ala Ala Ser Lys Ala Ser Gly Met Asn Leu Ser Arg Arg Asp Leu 115 120 125

Ser Arg Leu Ala Arg Arg Gly Ser Gly Ser Ala Thr Arg Ser Ile Tyr 130 135 140

Gly Gly Phe Vai Glu Trp Gin Ala Gly Asp Asn Asp Leu Asn Ser Tyr 145 150 155 160

Ala Vai Pro Phe Ile Glu Asn Vai Ser Trp Asp Ile Lys Met Ile Ala 165 170 175

Vai Vai Ile Asn Ser Lys Pro Lys Lys Ile Thr Ser Arg Ala Gly Met 180 185 190

Gin Thr vai vai Asn Thr Ser Pro Tyr Tyr Asn Ser Trp ile Lys Glu 195 200 205

Ala Asn Arg Ser Ile Pro Leu Met Lys Glu Ala Ile Ser Lys Gin Asp 210 215 220

Phe Thr Thr Met Gly Glu Leu Ala Glu Glu Asn Ala Mét Lys Met His 225 230 235 240

Ala Leu Asn Leu Ser Ala His Pro His Phe Ser Tyr Phe Ser Pro Glu 245 250 255

Ser Xle Gin Vai Met Asn Leu Vai Glu Glu Leu Arg Ser Met Gly Ile 260 265 270

Glu Cys Tyr Tyr Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Vai Lys Ile Ile Cys 275 280 285

Leu Gly Lys Asp Thr Ala Ser lie Thr Ser Phe Leu Gin Lys Asn Leu 290 295 300

Pro Asn Thr Glu Vai Leu Vai Ser Ser Ala Gly Pro Gly Vai Gin Tyr 305 310 315 320

Leu Asp

<210> 10 <211> 314 <212> PRT <213> Oenococcus oeni <400> 10

Met Ala Lys Vai Arg Ala Tyr Thr Asn Ile Ala Leu Ile Lys Tyr Trp 15 10 15

Gly Lys Ser Asp Leu Asn Trp Asn Leu Pro Thr Ser Ser Ser Ile Gly 20 25 30

Leu Thr Leu Asp Arg Phe Tyr Thr Asp Thr Ser Vai Glu Ile Asp Gin 35 40 45

Phe Ser Lys Lys Asp Phe Phe Gin Leu Asn Gly Gin Gin Ile Glu Gly 50 55 60

Pro Lys ile Ser Lys ile ile Asn Phe lie Arg Asn Ser Cys Gly Asn 65 70 75 80

Lys Asn Phe Vai Lys Vai Ile Ser Glu Asn His Vai Pro Thr Ser Ala 85 90 95

Gly Leu Ala Ser Ser Ala Ser Ala Phe Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ala 100 105 110

Asn Gin Ala Phe Gly Leu Glu Leu Asp Asn Arg Glu Leu Ser Lys lie 115 120 125

Ala Arg Ile Gly Ser Gly Ser Ala Ser Arg Ser Xle Phe Gly Gly Phe 130 135 140

Ser Ile Trp His Lys Gly Gin Asn Lys Asp Asp Ser Phe Ala Glu Ser 145 150 155 160 ile Leu Asp Pro vai Asp Phe Asp Ile Arg Vai lie Asp lie Leu Ala 165 170 175

Asp Lys Arg Vai Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gin Gly Met Gin Leu Ala 180 185 190

Gin Thr Ser Pro Asn Tyr Asp Ser Trp Leu Lys Lys Asn Asp Arg Gin 195 200 205 ile Asp Glu Met Leu Lys Ala ile Ser Asp His Asp Leu Glu Lys Ile 210 215 220

Gly Leu Ile Ala Glu Thr Asn Ser Ala Ser Met His Glu Leu Asn Arg 225 230 235 240

Thr Ala Lys Vai Pro Phe Asp Tyr Phe Thr Glu Asn Thr Arg Glu Ile 245 250 255

Ile Ala Glu vai Asp Gin Leu Tyr Lys Lys Gly ile Leu Ala Phe Ala 260 265 270

Thr Vai Asp Ala Gly Pro Asn Vai Lys Vai Ile Thr Asn Ser Glu Tyr 275 280 285

Gin Glu Lys Ile Ile Asn vai Leu Lys Glu Tyr Gly Glu Ile Leu Vai 290 295 300

Gin Lys Pro Gly Arg Gly Vai Ala Asn Vai 305 310

<210> 11 <211> 327 <212> PRT <213> Pediococcus pentosaceus <400> 11

Met Asn Glu Lys His Gly Phe Ala Arg Ala His The Asn Ile Ala Leu 15 10 15

Leu Lys Tyr Trp Gly Lys Ile Asn Ser Asp Leu Ile Leu Pro Ala Asn 20 25 30

Asp Ser ILe Ser Leu Thr Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Asp Thr Glu Vai 35 40 45

Thr Phe Ser Asp Glu Tyr Thr Ser Asn Leu Phe Tyr Leu Asn His Gin 50 55 60

Leu Ile Asp Vai Lys Lys Met Gin Arg Ile Asn Arg Vai Leu Glu Ala 65 70 75 80

Vai Lys Ser Glu Phe Gly Tyr Gin Gly Phe Ala Lys ile Glu Ser Glu 85 90 95

Asn His vai Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ala Ser Gly Met 100 105 110

Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ala Vai Ser Ala Leu Gly Ser His Thr Asp 115 120 125

Leu Thr Asn Leu Ser Arg Leu Ala Arg Leu Gly Ser Gly Ser Ala Ser 130 135 140

Arg Ser Vai Phe Gly Gly Ile Vai His Trp His Arg Gly Tyr Asp His 145 150 155 160

Gin Ser Ser Phe Ala Glu Gin ile Vai Ser Glu Asp Gin ile Asp Leu 165 170 175

Asn Met Vai Thr Ile Vai Ile Asp Arg Arg Gin Lys Lys Vai Lys Ser 180 185 190

Thr Leu Gly Met Gin His Thr Ala Ser Thr Ser Pro Phe Tyr Pro Ala 195 200 205

Trp Vai Glu Ala Thr Asn Gin Ala Ile Pro Glu Met Ile Ser Ala Vai 210 215 220

Gin Asn Asn Asp Phe Thr Lys Ile Gly Glu Leu Ala Glu His Ser Ala 225 230 235 240

Ala Met Met His Ala Thr Thr Leu Ser Ser Lys Pro Ala Phe Thr Tyr 245 250 255

Phe Ala Pro Glu Thr Ile Gin Ala ile Lys Leu Vai Glu Gin Leu Arg 260 265 270

Glu Ser Gly ile Glu Cys Tyr Tyr Thr Cie Asp Ala Gly Pro Asn Vai 275 280 285

Lys Vai leu Cys Gin Ser Lys Asn Ile Thr Arg Vai Lys Arg Phe Phe 290 295 300

Ala Ser Tyr Phe Asp Gin Asp Gin Leu Vai Vai Ala Lys Pro Gly Ser 305 310 315 320

Gly Ile Lys Phe Thr Lys Asn 325

<210> 12 <211> 315 <212> PRT <213> Streptococcus gordonii <400> 12

Met Asp Arg Lys Pro Vai Ser Vai Lys Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Ile 15 10 15

Vai Lys Tyr Trp Gly Lys Lys Asp Ala Glu Lys Met Ile Pro Ser Thr 20 25 30

Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Tyr Thr Glu Thr Gin Leu 35 40 45

Ser Pro Leu Pro Asp Thr Ala Thr Gly Asp Glu Phe Tyr Ile Asp Gly 50 55 60

Gin Leu Gin Ser Pro Ala Glu His Ala Lys Ile Ser Lys Ile Ile Asp 65 70 75 80

Arg Phe Arg Ser Pro Glu Asp Gly Phe Vai Arg Vai Asp Thr Ser Asn 85 90 95

Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110

Ala Leu Vai Lys Ala Cys Asn Ala Tyr Phe Gin Thr Gly Tyr Gin Thr 115 120 125

Glu Glu Leu Ala Gin Leu Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ala Arg 130 135 140

Ser Phe Phe Gly Pro Leu Ala Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Ala Ile 145 150 155 160

Tyr Pro Vai Lys Thr Asp Leu Lys Leu Ala Met Ile Met Leu Vai Leu 165 170 175

His Asp Glu lys Lys Pro Ile Ser Ser Arg Asp Gly Met Glu Leu Cys 180 185 190

Ala Lys Thr Ser Thr ile Phe Pro Asp Trp ile Ala Gin Ser Ala Leu 195 200 205

Asp Tyr Gin Ala Met Leu Gly Tyr Leu Gin Asp Asn Asp Phe Ala Lys 210 215 220

Vai Gly Gin Leu Thr Glu Glu Asn Ala Leu Arg Met His Ala Thr Thr 225 230 235 240

Glu Lys Ala Tyr Pro Pro Phe Ser Tyr Leu Thr Glu Glu Ser Tyr Gin 245 250 255

Ala Met Asp Ala Vai Arg Lys Leu Arg Glu Gin Gly Glu Arg Cys Tyr 260 265 270

Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Vai Lys Vai Leu Cys Leu Glu Glu 275 280 285

Asp Leu Asp His Leu Ala Ala ile Phe Glu Lys Asp Tyr Arg Leu ile 290 295 300

Vai Ser Lys Thr Lys Asp Leu Ser Asp Glu Ser 305 310 315

<210> 13 <211> 328 <212> PRT <213> Dichelobacter nodosus <400> 13

Met His Ser Ala Thr Ala Phe Ala Pro Ala Asn Ile Ala Leu Ala Lys 15 10 15

Tyr Trp Gly Lys Arg Asp Ala Gin Leu Asn Leu Pro Thr Asn Gly Ser 20 25 30

Leu Ser Ile Ser Leu Ala His Leu Gly Thr Thr Thr Thr Ile Ser Ala 35 40 45

Gly Glu Arg Asp Gin Leu Tyr Cys Asp His Arg Leu Leu Pro Pro Asp 50 55 60

Thr Ala Phe Vai Gin Lys Vai Trp His Phe Ile Asp Phe Cys Gin Pro 65 70 75 80

Lys Arg Pro Pro Leu Vai Ile His Thr Gin Asn Asn Ile Pro Thr Ala 85 90 95

Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ala Ser Gly Phe Ala Ala Leu Thr Leu Ala 100 105 110

Leu Asn Asp Phe Phe Gin Trp Ser Leu Ser Arg Glu Gin Leu Ser Gin 115 120 125

Xle Ala Arg Arg Gly Ser Gly Ser Ala Cys Arg Ser Leu Trp Gin Gly 130 135 140

Phe Vai Tyr Trp Gin Lys Gly Glu Lys Ala Asp Gly Ser Asp Cys Tyr 145 150 155 160

Ala Arg Pro ile Ala Ser Asp Trp Gin Aap Leu Arg Leu Gly ile ile 165 170 175

Thr Ile Asp Ala Ala Ala Lys Lys Ile Ser Ser Arg Gin Ala Met Asn 180 185 190

His Thr Ala Ala Ser Ser Pro Leu Phe Ser Ser Trp Thr Gin Ala Ala 195 200 205

Glu Ala Asp Leu Lys vai ile Tyr Gin Ala vai Leu Asp Arg Asp Phe 210 215 220

Leu Thr Leu Ala Gin Thr Ala Glu Ala Asn Ala Leu Met Met His Ala 225 230 235 240

Ser Leu Leu Ala Ala Arg Pro Ala Ile Phe Tyr Trp Gin Pro Gin Thr 245 250 255

Leu Ala Met Leu Gin Cya ile Trp Gin Ala Arg Ala Glu Gly Leu Ala 260 265 270

Vai Tyr Ala Thr Leu Asp Ala Gly Ala Asn Vai Lys Leu Leu Tyr Arg 275 280 285

Ala Gin Asp Glu Ala Glu Ile Ala Ser Met Phe Pro Gin Ala Gin Leu 290 295 300

Ile Asn Pro Phe Gin Thr Vai Thr Ser Ser Ala Arg Eis Thr Gly Glu 305 310 315 320

Asp Ala Gin Lys Pro Ser Leu Lys 325

<210> 14 <211> 317 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 14

Met Asp Arg Glu Pro Vai Thr Vai Arg Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Ile 15 10 15

Ile Lys Tyr Trp Gly Lys Lys Lys Glu Lys Glu Met Vai Pro Ala Thr 20 25 30

Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Tyr Thr Glu Thr Thr Leu 35 40 45

Ser Pro Leu Pro Ala Asn Vai Thr Ala Asp Glu Phe Tyr Ile Asn Gly 50 55 60

Gin Leu Gin Asn Glu Vai Glu His Ala Lys Met Ser Lys Ile Ile Asp 65 70 75 80

Arg Tyr Arg Pro Ala Gly Glu Gly Phe Vai Arg Ile Asp Thr Gin Asn 85 90 95

Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110

Ala Leu Vai Lys Ala Cys Asn Ala Tyr Phe Lys Leu Gly Leu Asp Arg 115 120 125

Ser Gin Leu Ala Gin Glu Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ser Arg 130 135 140

Ser Phe Tyr Gly Pro Leu Gly Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Glu Ile 145 150 155 160

Tyr Pro Vai Glu Thr Asp Leu Lys Leu Ala Met Ile Met Leu vai Leu 165 170 175

Glu Asp Lys Lys Lys Pro Ile Ser Ser Arg Asp Gly Met Lys Leu Cys 180 185 190

Vai Glu Thr Ser Thr Thr Phe Asp Asp Trp vai Arg Gin Ser Glu Lys 195 200 205

Asp Tyr Gin Asp Met Leu Ile Tyr Leu Lys Glu Asn Asp Phe Ala Lys 210 215 220

Ile Gly Glu Leu Thr Glu Lys Asn Ala Leu Ala Met His Ala Thr Thr 225 230 235 240

Lys Thr Ala Ser Pro Ala Phe Ser Tyr Leu Thr Asp Ala Ser Tyr Glu 245 250 255

Ala Met Ala Phe Vai Arg Gin Leu Arg Glu Lys Gly Glu Ala Cys Tyr 260 265 270

Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Vai Lys Vai Phe Cys Gin Glu Lys 275 280 285

Asp Leu Glu His Leu Ser Glu lie Phe Gly Gin Arg Tyr Arg Leu lie 290 295 300

Vai Ser Lys Thr Lys Asp Leu Ser Gin Asp Asp Cys Cys 305 310 315

<210> 15 <211> 314 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 15

Met Asp Pro Asn Vai Ile Thr Vai Thr Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Xle 15 10 15

Ile Lys Tyr Trp Gly Lys Glu Asn Gin Ala Lys Met Ile Pro Ser Thr 20 25 30

Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Phe Thr Thr Thr Ser Vai 35 40 45

Ser Phe Leu Pro Asp Thr Ala Thr Ser Asp Gin Phe Tyr Ile Asn Gly 50 55 60 vai Leu Gin Asn Asp Glu Glu His Thr Lys ile Ser Ala lie lie Asp 65 70 75 80

Gin Phe Arg Gin Pro Gly Gin Ala Phe Vai Lys Met Glu Thr Gin Asn 85 90 95

Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 lio

Ala Leu vai Lys Ala Cys Asp Gin Leu Phe Asn Thr Gin Leu Asp Gin 115 120 125

Lys Ala Leu Ala Gin Lys Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ser Arg 130 135 140

Ser Phe Phe Gly Pro Vai Ala Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Ala Ile 145 150 155 160

Tyr Lys Vai Glu Thr Asp Leu Lys Met Ala Met Ile Met Leu Vai Leu 165 170 175

Asn Ala Ala Lys Lys Pro Ile Ser Ser Arg Glu Gly Met Lys Leu Cys 180 185 190

Arg Asp Thr Ser Thr Thr Phe Asp Glu Trp Vai Glu Gin Ser Ala Ile 195 200 205

Asp Tyr Gin His Met Leu Thr Tyr Leu Lys Thr Asn Asn Phe Glu Lys 210 215 220

Vai Gly Gin Leu Thr Glu Ala Asn Ala Leu Ala Met His Ala Thr Thr 225 230 235 240

Lys Thr Ala Asn Pro Pro Phe Ser Tyr Leu Thr Lys Glu Ser Tyr Gin 245 250 255

Ala Met Glu Ala Vai Lys Glu Leu Arg Gin Glu Gly Phe Ala Cys Tyr 260 265 270

Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Vai Lys Vai Leu Cys Leu Glu Lys 275 280 285

Asp Leu Ala Gin Leu Ala Glu Arg Leu Gly Lys Asn Tyr Arg Ile Ile 290 295 300

Vai Ser Lys Thr Lys Asp Leu Pro Asp Vai 305 310

<210> 16 <211> 320 <212> PRT <213> Lactobacillus acidophilus NCFM <400> 16

Met Lys Asn The Ala Arg Ala His The Asn Ile Ala Leu Ile Lys Tye 15 10 15

Trp Gly Lys Ser Asp Pro Ile Leu Arg Leu Pro Leu Met Ser Ser Leu 20 25 30

Ser Met Thr Leu Asp Ala Phe Tyr Thr Asp Thr Leu Ile Glu Lys Thr 35 40 45

Asp Ala Lys Asn Glu Phe Tye Leu Asn Gly Lys Arg Gin Asn Arg Gin 50 55 60

Ala Lys Lys Arg Vai Phe Ser Tyr Leu Asp Thr Leu Lys Glu Lys Phe 65 70 75 80

Gly Tyr Thr Asp Asn Leu Ile Vai Lys Ser Thr Asn His Vai Pro Thr 85 90 95

Ser Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ser Ser Ala Phe Ala Ala Leu Ala Ala 100 105 110

Ser Phe Cys Lys Leu Tyr Asn Leu Asp Vai Asp Lys Thr Glu Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Ala Arg Leu Gly Ser Gly Ser Ala Ser Arg Ser Ile Phe Gly 130 135 140

Gly Phe Ala Ile Trp Gin Lys Gly Asn Ser Asn Gin Ser Ser Tyr Ala 145 150 155 160

Tyr Ala Leu Asp Glu Lys Pro Lys Met Asp Leu Gin Leu Leu Ala Vai 165 170 175

Glu Leu Asn Thr Glu Gin Lys Lys Ile Ser Ser Thr Lys Gly Met Lys 180 185 190

Asp Ala Gin Ser Ser Pro Phe Phe Ser Thr Trp Thr Asn Arg Asn Gin 195 200 205

Leu Glu Leu Asp Glu Met Ile Lys Ala ile Lys Gin Asn Asp Phe Thr 210 215 220

Ala Leu Gly Ser Leu Ala Glu Leu Asn Ala Asn Glu Met Hls Ala Ile 225 230 235 240

Asn Leu Thr Ala Gin Pro Glu Phe Thr Tyr Phe Met Pro Glu Thr lie 245 250 255

Arg Ala Ile Lys Leu Vai Glu Asp Leu Arg Thr Lys Gly Ile Glu Cys 260 265 270

Tyr Tyr Thr Ile Asp Ala Gly Pro Asn Ile Lys Vai Leu Cys Gin Leu 275 280 285

Lys Asn Arg Lys Glu Ile Ile Glu His Phe Glu Ser Vai Phe Asn Asn 290 295 300

Vai Asn Ile Vai Ser Ala Ser Phe Gly Pro Gly Vai Ile Tyr Leu Asp 305 310 315 320

<210> 17 <211> 996 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência otimizada da MDP descarboxilase de P. torridus (AAT43941) incluindo o His Tag <22 0> <221> CDS <222> (1)..(996) <400> 17 atg cat cat cat cat cac cac gag aac tat aat gtt aaa acc cgt goa 48

Hat His His His His His His Glu Asn Tyr Asn vai Lys Thr Acg Ala 15 10 15 ttt ccg acc att ggt att att ctg ctg ggt ggc att age gac aaa aaa 96

Pbe Pro Tbr Ile Gly Ile Ile Leu Leu Gly Gly Ile Ser Asp Lys Lys 20 25 30 aac cgt att ccg ctg cat acc acc gea ggt att gea tat acc ggc ate 144

Asn Arg ile Pro Leu His Tbr Thr Ala Gly ile Ala Tyr Thr Gly Ile 35 40 45 aat aac gat gtg tac acc gaa acc aaa ctg tat gtg age aaa gac gaa 192

Asn Asn Asp Vai Tyr Thr Glu Thr Lys Leu Tyr vai Ser Lys Asp Glu 50 55 60 aaa tgc tat ate gat ggc aaa gaa ate gat ctg aat age gat cgt age 240

Lys Cys Tyr Ile Asp Gly Lys Glu Ile Asp Leu Asn Ser Asp Arg Ser 65 70 75 80 ccg age aaa gtg ate gat aaa ttc aaa cat gaa ate ctg atg cgt gtg 288

Pro Ser Lys Vai ile Asp Lys Phe Lys His Glu ile Leu Met Arg vai 85 90 95 aat ctg gat gat gaa aac aac ctg age att gat age ege aat ttt aac 336

Asn Leu Asp Asp Glu Asn Asn Leu Ser Ile Asp Ser Arg Asn Phe Asn 100 105 110 att ctg age ggt age age gat age ggt gea gea gea ctg ggt gaa tgc 384

Ile Leu Ser Gly Ser Ser Asp Ser Gly Ala Ala Ala Leu Gly Glu Cys 115 120 125 att gaa age ate ttc gag tac aac ate aac ate ttc acc ttt gaa aat 432

Ile Glu Ser ile Phe Glu Tyr Asn ile Asn Ile Phe Thr Phe Glu Asn 130 135 140 gat ctg cag cgt att age gaa age gtt ggt cgt age ctg tat ggt ggt 480

Asp Leu Gin Arg Ile Ser Glu Ser Vai Gly Arg Ser Leu Tyr Gly Gly 145 150 155 160 ctg acc gtt aat tat gea aat ggt cgt gaa age ctg acc gaa ccg ctg 528

Leu Thr Vai Asn Tyr Ala Asn Gly Arg Glu Ser Leu Thr Glu Pro Leu 165 170 175 ctg gaa ccg gaa gea ttt aac aac ttt acc ate ate ggt gee cat ttt 576

Leu Glu Pro Glu Ala Phe Asn Asn Phe Thr Ile Ile Gly Ala His Phe 180 185 190 aac att gat ege aaa ccg age aac gaa ate cac gaa aac ate ate aaa 624

Asn Ile Asp Arg Lys Pro Ser Asn Glu Ile His Glu Asn Ile Ile Lys 195 200 205 cat gag aac tat cgc gaa cgt att aaa age gea gag ege aaa gea aaa 672

His Glu Asn Tyr Arg Glu Arg Ile Lys Ser Ala Glu Arg Lys Ala Lys 210 215 220 aaa ctg gaa gaa ctg age cgt aat gee aac att aaa ggc att ttt gaa 720

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<210> 18 <211> 330 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Constructo Sintético <400> 18

Met His His His His His His Glu Asn Tyr Asn Vai Lys Thr Arg Ala 15 10 15

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Ile Glu Ser Ile Phe Glu Tyr Asn Ile Asn Ile Phe Thr Phe Glu Asn 130 135 140

Asp Leu Gin Arg Ile Ser Glu Ser Vai Gly Arg Ser Leu Tyr Gly Gly 145 150 155 160

Leu Thr Val Asn Tyr Ala Asn Gly Arg Glu Ser Leu Thr Glu Pro Leu 165 170 175

Leu Glu Pro Glu Ala Phe Asn Asn Phe Thr Ile Ile Gly Ala His Phe 180 185 190

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Lys Leu Glu Glu Leu Ser Arg Asn Ala Asn Ile Lys Gly Ile Phe Glu 225 230 235 240

Leu Ala Glu Ser Asp Thr Val Glu Tyr His Lys Met Leu His Asp Val 245 250 255

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Glu Gly Leu Asn Asp Leu Cys Asp Asp Ile Arg Leu Leu Lys Val Ala 305 310 315 320

Gly Lys Pro Gin Val Ile Ser Lys Asn Phe 325 330

<210> 19 <211> 993 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência nativa da MDP descarboxilase de P. torridus (AAT43941) incluindo o His Tag <22 0> <221> CDS <222> (1)..(993) <400> 19 atg cat cat cac cat cac cat gaa aat tac aat gtt aag aca agg gcg 48

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Asn Ile Asp Arg Lys Pro Ser Asn Glu Ile His Glu Asn Ile Ile Lys 195 200 205 cat gaa aat tac agg gaa aga ata aaa agt gct gag aga aag gcg aaa 672

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Lys Leu Glu Glu Leu Ser Arg Asn Ala Asn Ile Lys Gly Ile Phe Glu 225 230 235 240 ctt gca gaa tcc gat aca gtg gaa tac cat aaa atg ctc cat gat gtt 768

Leu Ala Glu Ser Asp Thr Vai Glu Tyr His Lys Met Leu His Asp Vai 245 250 255 ggc gtt gac ata ata aat gat aga atg gag aac ctc att gaa agg gta 816

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<210> 20 <211> 330 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Constructo Sintético <400> 20

Met His His His His His His Glu Asn Tyr Asn Vai Lys Thr Arg Ala 15 10 15

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Leu Thr Val Asn Tyr Ala Asn Gly Arg Glu Ser Leu Thr Glu Pro Leu 165 170 175

Leu Glu Pro Glu Ala Phe Asn Asn Phe Thr Ile Ile Gly Ala His Phe 180 185 190

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His Glu Asn Tyr Arg Glu Arg Ile Lys Ser Ala Glu Arg Lys Ala Lys 210 215 220

Lys Leu Glu Glu Leu Ser Arg Asn Ala Asn Ile Lys Gly Ile Phe Glu 225 230 235 240

Leu Ala Glu Ser Asp Thr Val Glu Tyr His Lys Met Leu His Asp Val 245 250 255

Gly Val Asp Ile Ile Asn Asp Arg Met Glu Asn Leu Ile Glu Arg Val 260 265 270

Lys Glu Met Lys Asn Asn Phe Trp Asn Ser Tyr Ile Val Thr Gly Gly 275 280 285

Pro Asn Val Phe Val Ile Thr Glu Lys Lys Asp Val Asp Lys Ala Met 290 295 300

Glu Gly Leu Asn Asp Leu Cys Asp Asp Ile Arg Leu Leu Lys Val Ala 305 310 315 320

Gly Lys Pro Gin Val Ile Ser Lys Asn Phe 325 330

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de não patente citados na descrição • WONG MS et al. Biotech. Bioeng, 2008 [0003] • LADYGINA N et al. Process Biochemistry, 2006, vol. 41, 1001 [0004] [0008] • WACKETT LP. Current Opinion in Chemical Biology, 2008, vol. 21, 187 [0004] • WITHERS ST et al. Appl. Environ Microbiol, 2007, vol. 73, 6277 [0005] • FUJII T. et al. Appl. Environ. Microbiol., 1988, vol. 54, 583 [0006] • FUKUDA H et al. BBRC, 1994, vol. 201 (2), 516 [0006] • FUKUDA H. et al. Agric. Biol. Chem., 1984, vol. 48, 1679 [0006] • MEIGH et al. Nature, 1960, vol. 186, 902 [0008] • ADAMS ; YANG. PNAS, 1979, vol. 76, 170 [0008] • STINSON; SPENCER. Plant Physiol., 1969, vol. 44, 1217 [0008] • THOMPSON ; SPENCER. Nature, 1966, vol. 210, 5036 [0008] • SHIMOKAWA ; KASAI. Agr. Biol. Chem., 1970, vol. 34 (11), 1640 [0008] • HANSON ; KENDE. Plant Physiology, 1976, vol. 57, 528 [0008] • NEEDLEMAN ; WUNSCH. J. Mol. Biol., 1970, vol. 48, 443 [0054] • SMITH; WATERMAN. J. Mol. Biol., 1981, vol. 147, 195 [0054] • PRESSMAN ; LUCA. J. Am. Chem. Soc., 1940 [0104]

Claims (30)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo de produção de um alceno terminal, caracterizado por compreender uma etapa de conversão de um 3-hidroxi-alcanoato por uma enzima que apresenta uma atividade de mevalonato difosfato descarboxilase, em que o 3-hidroxi-alcanoato é um composto da fórmula HO-CO-CHs-C (R1) (R2)-OH ou 0"-C0-CH2-C (R1) (R2)-OH em que R1 e R2 são escolhidos, independentemente, entre um átomo de hidrogénio, um resíduo metilo e um resíduo etilo, e em que a conversão é feita na presença de um cossubstrato, o referido cossubstrato sendo o ATP, um rNTP, um dNTP ou uma mistura de várias destas moléculas, um polifosfato ou o pirofosfato.
2. 2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, que compreende uma etapa de conversão de 3-hidroxi-butirato em propileno.
3. 3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, que compreende uma etapa de conversão de 3-hidroxi-valerato em 1-butileno.
4. 4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, que compreende uma etapa de conversão de 3-hidroxi-3-metil-butirato em isobutileno.
5. 5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, que compreende uma etapa de conversão de 3-hidroxi-3-metil-valerato em isoamileno.
6. 6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a enzima compreende uma sequência de aminoácidos escolhida entre SEQ ID Nos 1 a 16, ou uma sequência que apresenta pelo menos 15% de homologia de sequência com uma destas.
7. 7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, em que a enzima compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 50% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% de homologia de sequência com uma das sequências SEQ ID NOs: 1 a 16
8. 8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a enzima compreender toda ou parte da sequência SEQ ID NO: 6, ou de uma sequência que apresenta pelo menos 15% de homologia de sequência com esta.
9. 9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, em que a enzima compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 50% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% de homologia de sequência com SEQ ID NO: 6.
10. 10. Processo de produção de isobutileno, caracterizado por compreender uma etapa de conversão de 3-hidroxi-3- metil-butirato por uma enzima que apresenta uma atividade de mevalonato difosfato descarboxilase.
11. 11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, em que a enzima apresenta uma atividade de mevalonato difosfato descarboxilase é uma enzima que compreende toda ou parte da sequência SEQ ID NO: 6, ou de uma sequência que apresenta pelo menos 15% de homologia de sequência com esta.
12. 12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, em que a enzima compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 50% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% de homologia de sequência com SEQ ID NO: 6.
13. 13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, segundo o qual se acrescenta à reação um cofator de fórmula geral R-O-PO2H-O-PO3H2 em que R é um átomo de hidrogénio, um radical metilo, etilo ou propilo, e pode igualmente ser qualquer radical alquilo, linear, ramificado ou cíclico, ou qualquer outro radical orgânico monovalente.
14. 14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, segundo o qual se acrescenta à reação um cofator de fórmula geral R-O-PO2H-CH2-PO3H2, em que R é preferencialmente um átomo de hidrogénio, um radical metilo, etilo ou propilo, e pode igualmente ser qualquer radical alquilo, linear, ramificado ou cíclico, ou qualquer outro radical orgânico monovalente.
15. 15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a etapa de conversão ser realizada in vitro, em sistema acelular.
16. 16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por a etapa de conversão ser realizada na presença de um microrganismo que produz a referida mevalonato difosfato descarboxilase.
17. 17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela utilização de um microrganismo que tem a propriedade natural ou artificial de produzir um ou vários 3-hidroxi-alcanoatos conforme definido na reivindicação 1 de forma endógena, e exprimindo ou superexprimindo também a referida mevalonato difosfato descarboxilase, natural ou modificada, a fim de produzir alcenos terminais diretamente a partir de uma fonte de carbono.
18. 18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, em que o microrganismo é uma bactéria de estirpe Alcaligenes eutrophus ou Bacillus megaterium, ou uma bactéria, uma levedura ou um fungo recombinante de modo a superproduzir um ou vários 3-hidroxi-alcanoatos conforme definido na reivindicação 1.
19. 19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 ou 18, em que a fonte de carbono é a glicose ou qualquer outra hexose, a xilose ou qualquer outra pentose, o glicerol ou qualquer outro poliol, ou ainda o amido, a celulose, a hemicelulose, um poli-3-hidroxi-alcanoato ou qualquer outro polímero, o processo sendo então realizado na presença de um sistema para degradar o referido polímero em monómero, como, por exemplo, uma enzima adaptada (amilase, hemicelulase, celulase, poli-3-hidroxi-alcanoase) e/ou as condições químicas específicas.
20. 20. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela utilização de um microrganismo fotossintético que tem a propriedade natural ou artificial de produzir um ou vários 3-hidroxi-alcanoatos de forma endógena, e superexprimindo também a mevalonato difosfato descarboxilase, natural ou modificada, a fim de produzir alcenos terminais diretamente a partir de CO2 presente em solução.
21. 21. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pela utilização de um primeiro microrganismo que permite a transformação de uma fonte de carbono em 3-hidroxi-alcanoato conforme definido na reivindicação 1, e de uma mevalonato difosfato descarboxilase, isolada ou expressa por um segundo microrganismo, que permite a conversão do referido 3- hidroxi-alcanoato em alceno terminal.
22. 22. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pela utilização de uma planta que exprime uma mevalonato difosfato descarboxilase, para produzir alcenos terminais por descarboxilação de 3-hidroxialcanoatos conforme definido na reivindicação 1.
23. 23. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pela utilização de uma planta que tem a propriedade artificial de produzir de forma endógena um ou vários 3-hidroxi-alcanoatos conforme definido na reivindicação 1.
24. 24. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende uma etapa de recolha gasosa dos alcenos terminais de desgaseificação da reação.
25. 25. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o processo ser conduzido em microaerofilia.
26. 26. Utilização de uma enzima mevalonato difosfato descarboxilase, ou de um microrganismo que produz uma mevalonato difosfato descarboxilase, para a produção de compostos alcenos terminais a partir de 3-hidroxi-alcanoatos conforme definido na reivindicação 1.
27. 27. Utilização de uma enzima mevalonato difosfato descarboxilase, de acordo com a reivindicação 26, caracterlzada por a enzima compreender toda ou parte da sequência SEQ ID NO: 6 ou de uma sequência que apresenta pelo menos 15% de homologia de sequência com esta.
28. 28. Utilização, de acordo com a reivindicação 27, em que a enzima compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 50% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% de homologia de sequência com SEQ ID NO: 6.
29. 29. Composição que compreende um microrganismo que produz uma mevalonato difosfato descarboxilase, um meio de cultura adequado e um composto 3-hidroxi-alcanoato conforme definido na reivindicação 1.
30. 30. Planta ou microrganismo que tem a propriedade natural ou artificial de produzir um ou vários 3-hidroxialcanoatos conforme definido na reivindicação 1 de forma endógena, e exprimindo ou superexprimindo também uma mevalonato difosfato descarboxilase, natural ou modificada, a fim de produzir alcenos terminais diretamente a partir de uma fonte de carbono.