PT2360479E - Teste de activação de monócitos melhorado mais capaz de detectar contaminantes pirogénicos sem serem endotoxinas em produtos médicos - Google Patents

Description

ΕΡ 2 360 479/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Teste de activação de monócitos melhorado mais capaz de detectar contaminantes pirogénicos sem serem endotoxinas em produtos médicos"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se geralmente a um teste de activação de monócitos melhorado que é mais capaz de detectar pirogénios sem serem endotoxinas em produtos médicos, no qual a amostra é incubada com um reagente contendo monócitos num sistema de ensaio compreendendo pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno. 0 invento refere-se também a sistemas de ensaio para utilização nestes testes que incluem pelo menos um poço de microtitulação possuindo pelo menos uma superfície interior compreendendo polipropileno e possuindo uma forma tal que o reagente contendo monócitos se concentra no poço para proporcionar maior contacto célula a célula. O invento refere-se também a um estojo de diagnóstico que pode ser utilizado para testar a presença de pirogénios sem serem endotoxinas numa amostra. 0 invento é estabelecido nas reivindicações.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Quando certos compostos químicos ou biológicos são postos em contacto com o sistema circulatório de seres humanos ou outros mamíferos, provocam uma resposta sistémica conhecida como a resposta inflamatória ou inflamação. A resposta inflamatória é um mecanismo de defesa para proteger o organismo contra uma infecção e/ou lesão, a inflamação aumenta o fluxo sanguíneo para o local de infecção ou lesão, trazendo os necessários fluidos, proteínas e glóbulos brancos sanguíneos (leucócitos) para ajudar no processo de cura. Por exemplo, um sintoma associado à resposta inflamatória é uma elevação da temperatura corporal ou febre, que funciona como um mecanismo de defesa para patogénios que provocam sobreaquecimento. A resposta inflamatória pode estar associada a uma variedade de sintomas "semelhantes aos da gripe" incluindo febre, calafrios, fadiga, dores de cabeça, perda de apetite e rigidez muscular. Um composto químico ou 2 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ biológico que desencadeia febre tem sido historicamente referido como um "pirogénio" ou um composto "pirogénico", referindo-se à resposta de febre que estes compostos podem causar. Alguns compostos quimicos ou biológicos, no entanto, são geralmente pró-inflamatórios e podem ou não causar febre como parte da resposta inflamatória que causam.

Nalguns casos, dependendo da sensibilidade de um indivíduo e do tipo e da concentração de pirogénio ao qual o indivíduo é exposto, um indivíduo pode desenvolver sintomas fatais semelhantes a choque após exposição a um pirogénio. Produtos médicos que podem ser inalados, injectados ou infundidos e dispositivos médicos, tais como membranas ou materiais implantados, representam um risco particular de pirogenicidade. Mesmo os nutrientes podem representar um risco de pirogenicidade. Os pirogénios contidos em produtos médicos e nutrientes são referidos como pirogénios exógenos; em contraste, os pirogénios endógenos são compostos mensageiros do sistema imunitário que medeiam a resposta inflamatória de um indivíduo a pirogénios exógenos. Além da natureza pirogénica do próprio produto ou subprodutos da sua produção, a contaminação do produto pode causar frequentemente pirogenicidade. A pirogenicidade devida a contaminação de um produto pode ser causada por qualquer um de um grupo diverso de pirogénios derivados de bactérias, vírus, fungos, ou até mesmo do hospedeiro. Este problema pode persistir mesmo quando o produto é "esterilizado" através de métodos térmicos ou químicos; um composto pirogénico vulgarmente verificado, uma endotoxina bacteriana (consistindo grandemente em lipopolissacárido (LPS) da parede celular de bactérias Gram-negativas), pode permanecer após as bactérias serem mortas. Assim, o teste de pirogénios de vários produtos farmacêuticos, nutrientes e produtos médicos para aplicação parentérica é necessário para garantir a segurança de tais produtos.

Habitualmente, os compostos que actuam como pirogénios fazem-no através da estimulação da produção de pirogénios endógenos, tais como prostaglandinas e citocinas pró-inflamatórias, em monócitos após contacto com tecido, células ou fluidos corporais. São estes pirogénios produzidos endogenamente que medeiam a resposta inflamatória no 3 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ organismo afectado. Os mais importantes e bem conhecidos destes pirogénios endógenos são as citocinas interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8) e o factor de necrose tumoral (TNF) e o mediador lipídico de baixo peso molecular prostaglandina E2 (PGE2) . Estes compostos são rotineiramente ensaiados através de ELISA, ou ensaios imunossorventes ligados a enzima (para IL-1, IL-6, ou TNF), e EIA, ou imunoensaio enzimático (para PGE2) .

Para evitar uma reacção pirogénica e assegurar a segurança de qualquer fármaco ou produto farmacêutico administrado por via parentérica, a contaminação pirogénica deve ser monitorizada para identificar os lotes individuais que estão contaminados com contaminantes bacterianos. Dois métodos de acordo com a Farmacopeia baseados em animais, o teste de lisado de amebócitos de Limulus (LAL), também referido como o teste de endotoxinas bacterianas (BET), e o teste de pirogénios de coelho, são actualmente utilizados rotineiramente para monitorizar a contaminação de pirogénios em produtos farmacêuticos produzidos em massa. O teste de coelho é um teste in vivo que consiste em injectar um número estatisticamente significativo de coelhos com o composto de amostra e observar o aumento médio na temperatura corporal desencadeado nos animais de teste. Apesar do teste de coelho ser responsivo a um amplo espectro de agentes pirogénicos, incluindo pirogénios sem serem endotoxinas, o teste de coelho tem uma sensibilidade relativamente baixa (ng de endotoxina/ml) em comparação com outros testes de pirogénios (pg endotoxina/ml para o teste LAL). Além disso, a correlação das respostas pirogénicas aos compostos entre as espécies é, na melhor das hipóteses, aproximada. Foi documentado, por exemplo, que a dose de endotoxina bacteriana desencadeando uma resposta pirogénica varia tanto como 10 000 vezes entre espécies. A relativa insensibilidade, os fracos resultados quantitativos, a variabilidade entre as espécies de coelhos, e as questões éticas envolvidas na experimentação animal desfavoreceram o teste de coelho nos últimos anos.

Em contraste com o teste de coelho, que detecta uma ampla variedade de pirogénios, o teste LAL só detecta 4 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ pirogénios endotoxinas. As endotoxinas bacterianas, p.ex., o lipopolissacárido (LPS), que derivam da parede celular de bactérias Gram-negativas, são um dos compostos pirogénicos melhor descritos (Moltz et al., Neurosci. Biobehav. Rev., 1993, 17: 237-269; Tilders et al. , Psychoneuroendocrinology, 1994, 19: 209-232; Rothwell, Crit. Rev. Neurobiol., 1994, 8: 1-10; Zeisberger e Roth, Neuropsychobiology 1993, 28: 106-109). Por conseguinte, pensou-se ser geralmente útil substituir as dispendiosas e demoradas experiências em coelho por um teste LAL directo para endotoxina bacteriana. Esta abordagem tem limitações óbvias. 0 teste LAL é um teste in vitro muito sensível; no entanto, apenas detecta endotoxinas de bactérias Gram-negativas e dá resultados falsos negativos com certos produtos que podem ainda estimular os monócitos a produzir citocinas pirogénicas. O teste LAL é também susceptível a interferência, por exemplo, por elevados níveis proteicos de substâncias de teste ou por glucanos (Roslansky e Novitsky, J. Clin. Microbiol., 1991, 29: 2477; Fennrich et al., Dev. Biol. Stand., 1999, 101: 131). Por outro lado, o teste de Limulus é tão sensível que é facilmente propenso a resultados falsos positivos devido a impurezas que não são relevantes para a qualidade do produto (Fujiwara et al., Yakugaku Zasshi, 1990, 110: 332-340).

Assim, existia a necessidade de um sistema de ensaio não baseado em animais que se caracterizasse por elevada sensibilidade, elevada especificidade e a capacidade de detectar uma grande variedade de pirogénios. Com esta intenção e com uma melhor compreensão da resposta inflamatória humana, foram desenvolvidos sistemas de teste com base na activação in vitro de monócitos humanos. Há cerca de 20 anos, investigadores utilizaram células mononucleares do sangue periférico (PBMC) para detectar endotoxina através da monitorização da liberação de citocinas pirogénicas. (Dinarello et al., J. Clin. Microbiol., 1984, 20: 323; Duff e Atkins, J. Immunol. Methods, 1982, 52: 323). Desde então, foram desenvolvidos vários sistemas de ensaio diferentes, utilizando diferentes fontes de monócitos humanos, incluindo sangue periférico completo humano (WB), PBMC, ou linhas de células monocíticas, tais como MONOMAC-β (MM6) (Ziegler-Heitbrock et al. , Int. J. Câncer, 1988, 41: 456) ou THP-1 5 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ (Tsuchiya et al. , Int. J. Câncer, 1980, 26: 171), e várias leituras, incluindo as citocinas pirogénicas factor de necrose tumoral alfa, TNF- , IL-6, IL-1 , e o metabolito não pirogénico neopterina (Hartung et al., "The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 43", 2001, 29: 99; Poole e

Gaines Das, Eur. J. Parenteral Sciences, 2001, 6: 63; Poole et al., J. Immunol. Methods, 2003, 274: 209; Gaines Das et al., J. Immunol. Methods, 2004, 288: 165). Recentemente, num estudo europeu colaborativo, o "Human(e) Study", seis dos testes de activação de monócitos mais proeminentes, cada um utilizando uma combinação diferente das fontes celulares acima descritas, as leituras foram avaliadas quanto à capacidade de detecção de endotoxinas em produtos médicos adicionados com várias concentrações de endotoxina pura.

Em cinco dos seis testes, as células foram cultivadas em placas de poliestireno de 96 poços com poços de fundo plano (Hoffmann et al., J. Immunol. Methods, 2005, 298 : 161). No sexto teste (com base em Fennrich et al., Dev. Biol. St and., 1999; Fennrich et al., ALTEX, 19 99; Hartung et al., 2001), tubos de centrífuga Eppendorf (1,2 ml) feitos de poliestireno, com fundos cónicos, foram utilizados durante a maior parte da avaliação e, durante o estudo, os tubos de polietileno de Charles River Laboratories, o fabricante do estojo Endosafe® In vitro Pyrogen (IPT) utilizado no estudo, foram substituídos por tubos de polipropileno (1,5 ml), com fundos redondos. Não foi relatado que esta substituição tivesse qualquer efeito significativo no teste, e os próprios tubos de polipropileno foram posteriormente substituídos por placas de 96 poços de poliestireno de poços de fundo plano, quando Charles River Laboratories modificou o Endosafe® IPT para volumes reduzidos. A fonte de monócitos neste teste foi sangue completo e a leitura foi de IL-Ιβ. O sangue completo foi incubado com vários fármacos adicionados com diferentes concentrações de endotoxina.

Carlin e Viitanen divulgam um teste de activação de monócitos, baseado em sangue completo ou células MONOMAC-6 como a fonte de monócitos e IL-6, como a leitura, para avaliação da pirogenicidade inerente da vacina Infanrix, que contém antigénios de Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo vários pirogénios sem serem endotoxinas, i.e., 6 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ toxóide da Difteria, toxóide da Tosse convulsa, e toxóide do Tétano (Pharmeuropa, 2003, 15, 3, 418-423). As células foram cultivadas a uma baixa densidade de células em tubos de grau Eppendorf Bio-Pure livres de endotoxinas de composição não revelada. A pirogenicidade da vacina não era o resultado de contaminação da vacina durante o seu fabrico ou a sua armazenagem. Hartung e Wendel divulgam um teste de activação de monócitos, baseado em sangue completo como fonte de monócitos e IL-1 como a leitura preferida, para detçio de endotoxinas e pirogénios sem serem endotoxinas nas suas formas puras, i.e., LPS de Salmonella abortus equi, estreptolisina 0 (SLO) de Streptococcus pyrogens, e dipéptido muramilo (MDP) (Hartung e Wendel, In Vitro Toxicology, 1996, 9, 4: 353-359; Patente U.S. N.° 5891728). As células foram cultivadas em tubos de polipropileno.

Yamamoto et al. divulgam um teste de activação de monócitos, baseado em sangue completo ou células de diferentes linhas celulares humanas, sendo preferida a linha celular 28SC, como fonte de monócitos/células monociticas e IL-6 como leitura preferida, para detecção de pirogénios endotoxinas (Jpn. J. Infect. Dis., 2003, 56: 93-100). O teste de endotoxinas é referido como prevendo a possibilidade de um sinergismo in vivo entre a endotoxina e um fármaco parentérico, particularmente interferão, tal que o fármaco aumenta os efeitos pirogénicos da endotoxina. As células foram cultivadas com endotoxina na sua forma pura ou uma mistura de endotoxina na sua forma pura e interferão humano. As células da linha celular foram cultivadas em placas de 96 poços de poliestireno com poços de fundo plano. As células sanguíneas foram cultivadas em tubos de material não especificado.

Nakagawa et al. descrevem um teste de activação de monócitos, baseado em sangue completo ou células MM6-CA8 (um subclone de MONOMAC-6) como fonte de monócitos e IL-6 como leitura preferida, para detecção de endotoxina e pirogénios sem serem endotoxinas nas suas formas puras, i.e., LPS de E. coli 055:B5 e peptidoglicano insolúvel (PG) derivado de S. aureus (Clinicai and Diagnostic Laboratory Immunol., 2002, 9, 3: 588-597). As células MM6-CA8 foram cultivadas em placas de 96 poços de poliestireno. As células sanguíneas foram 7 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ cultivadas em tubos de polipropileno; os volumes utilizados (225 1 de sangue, 25 1 de fãcbu de ensaio, 750 1 de solução salina) exclui a utilização de placas de 96 poços padrão (250 1/poço).

Recentemente, várias fontes indicam que o polipropileno deve ser evitado em ensaios de pirogénios. Por exemplo, Charles River Laboratories recomenda evitar polipropileno porque a natureza hidrófoba de uma superfície de polipropileno poderia resultar na adsorção de endotoxinas numa tal superfície devido aos domínios hidrófobos associados ao componente Lípido A de LPS (Charles River Laboratories, Endosafe Times, Setembro de 2004). Harlan Sera-Lab, um fabricante de testes de biossegurança, afirma que os tubos de polipropileno podem interferir com o ensaio LAL (Harlan Sera-Lab, Catálogo de 2004). E, a European Dialysis and Transplant Nurses Association bem como a European Renal Care Association recomendam evitar polipropileno e a utilização de poliestireno em ensaios de endotoxinas porque o poliestireno não adsorve normalmente endotoxinas (Linhas orientadoras de EDTNA/ERCA).

Assim, existe a necessidade de um teste de pirogénios não baseado em animais, caracterizado por elevada sensibilidade, elevada especificidade e a capacidade de detectar uma ampla variedade de contaminantes pirogénicos em produtos médicos.

SUMÁRIO DO INVENTO

Os requerentes desenvolveram um teste in vitro de pirogénios que é sensível e detecta contaminantes pirogénicos presentes em produtos médicos. Genericamente, o presente invento é dirigido a um método de detecção de pirogénios sem serem endotoxinas numa amostra através da combinação de monócitos, i.e., na forma de um reagente contendo monócitos, e a amostra a testar, num primeiro sistema de ensaio compreendendo pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno, de modo a que os monócitos estejam em contacto com a superfície. Os monócitos e a amostra são incubados de modo a que os monócitos produzam uma citocina ou um mediador endógeno da resposta inflamatória durante a incubação. O 8 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ conteúdo do primeiro sistema de ensaio é transferido para um segundo sistema de ensaio, compreendendo pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para uma citocina ou um mediador endógeno ou marcador da resposta inflamatória. O segundo sistema de ensaio é ensaiado quanto à presença de citocinas ou mediador endógeno ligado ao anticorpo na superfície. Quando os monócitos utilizados neste método são PBMC ou células da linha celular monocítica, os monócitos estão presentes nos sistemas de ensaio a uma densidade celular elevada. 0 teste é como estabelecido nas reivindicações. 0 presente invento refere-se também genericamente a um método de detecção de pirogénios sem serem endotoxinas num produto médico administrado parentericamente através de combinação de sangue completo, como reagente contendo monócitos, com o produto médico a testar num primeiro sistema de ensaio compreendendo pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno, tal que o sangue fica em contacto com a superfície. 0 sangue e o produto médico são incubados de modo a que o sangue produza a citocina IL-6 durante a incubação. O conteúdo do primeiro sistema de ensaio é transferido para um segundo sistema de ensaio compreendendo pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para IL-6. 0 segundo sistema de ensaio é ensaiado quanto à presença de IL-6 ligado ao anticorpo na superfície.

Proporcionamos um método de cultura de monócitos, i.e., na forma de um reagente contendo monócitos, para utilizar num teste de pirogénios sem serem endotoxinas através da combinação dos monócitos com uma amostra a testar num sistema de ensaio compreendendo pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno, de modo a que os monócitos estejam em contacto com a superfície.

Proporcionamos um método de cultura de monócitos como parte de um ensaio de pirogénios sem serem endotoxinas através da combinação dos monócitos com uma amostra num sistema de ensaio compreendendo pelo menos um poço de microtitulação com uma forma tal que o reagente contendo monócitos se concentre em comparação com um poço de microtitulação de fundo plano, uma superfície do poço 9 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ compreendendo polipropileno, de modo a que os monócitos estejam em contacto com a superfície. Quando os monócitos utilizados nestes métodos de cultura são células mononucleares do sangue periférico (PBMC) ou células de uma linha celular monocítica, os monócitos estão presentes nos sistemas de ensaio a uma densidade celular elevada. O invento refere-se também a um método de detecção de pirogénios sem serem endotoxinas num produto médico administrado parentericamente através da combinação de sangue completo, como o reagente contendo monócitos, com o produto médico a testar num sistema de ensaio compreendendo pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno e pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para IL-6, de modo a que o sangue esteja em contacto com a superfície compreendendo polipropileno, e ensaio do sistema de ensaio quando à presença de IL-6 ligada ao anticorpo à superfície. O invento proporciona ainda um estojo de diagnóstico que contém uma placa de microtitulação compreendendo uma pluralidade de poços de microtitulação com uma forma tal que o meio de cultura contido em cada poço se concentre em comparação com um poço de microtitulação de fundo plano, uma superfície de cada poço compreendendo polipropileno, e monócitos criopreservados, i.e., na forma de um reagente contendo monócitos criopreservado, contido nos poços da placa de microtitulação, de modo a que os monócitos estejam em contacto com a superfície dos poços. Quando os monócitos no estojo são células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou células da linha celular monocítica, os monócitos estão presentes nos poços a uma densidade celular elevada. O estojo é estabelecido nas reivindicações. 0 invento proporciona também um estojo de diagnóstico que contém um sistema de ensaio para a detecção de pirogénios sem serem endotoxinas num produto médico administrado parentericamente, o sistema de ensaio compreendendo uma placa de microtitulação contendo uma pluralidade de poços de microtitulação com uma forma tal que o meio de cultura contido em cada poço se concentre em comparação com um poço de microtitulação de fundo plano, uma superfície de cada poço compreendendo polipropileno, sangue completo criopreservado, 10 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ como ο reagente contendo monócitos criopreservado, contido nos poços da placa de microtitulação, de modo a que o sangue esteja em contacto com as superfícies dos poços, e um anticorpo para IL-6. 0 estojo é estabelecido nas reivindicações.

Outros objectos e características deste invento serão em parte evidentes e em parte assinalados aqui adiante.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um gráfico que mostra as respostas de IL-6 para amostras de teste com quatro densidades celulares diferentes (1 milhão, 0,5 milhões, 0,25 milhões e 0,13 milhões de PBMC por poço de 250 μΐ) num teste de activação de monócitos realizado com células mononucleares do sangue periférico em placas de polipropileno com poços de fundo redondo, com IL-6 como leitura. As respostas de IL-6 são ao padrão de endotoxina (1 unidade de endotoxina por ml) e ao controlo positivo de Extraneal® (i.e. um lote deste produto contaminado com pirogénio sem ser endotoxina). A Figura 2 é um gráfico que ilustra as respostas de IL-6 para amostras de teste com baixa densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com sangue completo em placas de poliestireno com poços de fundo plano. As respostas de IL-6 são a LPS, controlo negativo de Extraneal® (i.e. uma fornada limpa deste produto), controlo positivo de Extraneal®, controlo negativo de Hemoglobina (Hb) (i.e. uma fornada limpa deste produto), e controlo positivo de Hemoglobina (Hb) (i.e. uma fornada deste produto contaminada com pirogénio sem ser endotoxina). A Figura 3 é um gráfico que ilustra as respostas de IL-6 para amostras de teste com baixa densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células mononucleares do sangue periférico em placas de poliestireno com poços de fundo plano. As respostas de IL-6 são a LPS, controlos positivo e negativo de Extraneal® e controlos positivo e negativo de Hb. 11 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ A Figura 4 é um gráfico que ilustra as respostas de IL-6 para amostras de teste com baixa densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células MONOMAC6 em placas de poliestireno com poços de fundo plano. As respostas de IL-6 são a LPS, controlos positivo e negativo de

Extraneal® e controlos positivo e negativo de Hb. A Figura 5 é um gráfico que mostra as respostas de IL-6 para amostras de teste com baixa densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células THP-1 em placas de poliestireno com poços de fundo plano. As respostas de IL-6 são a LPS, controlos positivo e negativo de

Extraneal® e controlos positivo e negativo de Hb. A Figura 6 é um gráfico que ilustra as respostas de TNF- para amostras de teste com baixa densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células THP-12A9 em placas de poliestireno com poços de fundo plano. As respostas de TNF- ã© a LPS, controlos positivo e negativo de Extraneal® e controlos positivo e negativo de Hb. A Figura 7 é um gráfico que ilustra as respostas de IL-6 para amostras de teste com baixa densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células do clone M0N0MAC-CA8 em placas de poliestireno com poços de fundo plano. As respostas de IL-6 são a LPS, e controlos positivo e negativo de Extraneal®. A Figura 8 é um gráfico que ilustra as respostas de IL-6 para amostras de teste com baixa densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células 28SC em placas de poliestireno com poços de fundo plano. As respostas de IL-6 são a LPS e controlos positivo e negativo de dextrano. A Figura 9 é um gráfico que mostra as respostas de IL-6 para amostras de teste com elevada densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue periférico em placas de polipropileno com poços de fundo redondo. As respostas de IL-6 são a LPS, controlos positivo e negativo de Extraneal® e controlos positivo e negativo de dextrano. 12 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ A Figura 10 é um gráfico que mostra as respostas de IL-6 para amostras de teste com baixa densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com sangue completo em placas de polipropileno com poços de fundo redondo. As respostas de IL-6 são a LPS, e controlos positivo e negativo de Extraneal®. A Figura 11A é um gráfico que mostra as respostas de IL-6 para placas de polipropileno (colunas negras) e placas de poliestireno (colunas cinzentas) num teste de activação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue periférico (1 milhão de células por poço). As respostas de IL-6 são a LPS, controlos positivo e negativo de Extraneal® e controlos positivo e negativo de Hb. A Figura 11B é um gráfico que mostra as respostas de ΣΡΙ para placas de polipropileno (colunas negras) e placas de poliestireno (colunas cinzentas) num teste de activação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue periférico (1 milhão de células por poço). As respostas de IL-1 ãe a LPS, controlos positivo e negativo de Extraneal® e controlos positivo e negativo de Hb. A Figura 12A é um gráfico que ilustra as respostas de IL-6 para amostras de teste com elevada densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue periférico em placas de polipropileno com poços de fundo redondo. As respostas de IL-6 são a LPS e controlos positivo e negativo de Extraneal®. A Figura 12B é um gráfico que ilustra as respostas de IL-6 para amostras de teste com baixa densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue periférico em placas de poliestireno com poços de fundo plano. As respostas de IL-6 são a LPS e controlos positivo e negativo de Extraneal®. A Figura 13A é um gráfico que ilustra as respostas de IL-6 para amostras de teste com elevada densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue periférico em placas de polipropileno 13 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ com poços de fundo redondo. As respostas de IL-6 sao a LPS e controlos positivo e negativo de Extraneal®. A Figura 13B é um gráfico que ilustra as respostas de IL-6 para amostras de teste com elevada densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue periférico em placas de poliestireno com poços de fundo plano. As respostas de IL-6 são a LPS e controlos positivo e negativo de Extraneal®. A Figura 14A é um gráfico que ilustra as respostas de IL-6 para amostras de teste com elevada densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue periférico em placas de polipropileno com poços de fundo redondo. As respostas de IL-6 são a LPS e controlos positivo e negativo de Extraneal®. A Figura 14B é um gráfico que ilustra as respostas de IL-6 para amostras de teste com elevada densidade celular num teste de activação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue periférico em placas de poliestireno com poços de fundo plano. As respostas de IL-6 são a LPS e controlos positivo e negativo de Extraneal®. A Figura 15 é um gráfico que ilustra as respostas de IL-1 para amostras de teste com elevada densidade celular num teste de IPT comercialmente disponível realizado com sangue completo em placas de poliestireno com poços de fundo plano.

As respostas de IL-1 são a LPS, controlos positivo e negativo de Extraneal®, controlos positivo e negativo de hemoglobina, controlo de solução salina e controlo de Gram-positivas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Os pirogénios estimulam monócitos do sangue (bem como outro leucócitos) e macrófagos para produzir e libertar numerosos mediadores pirogénicos endógenos da resposta inflamatória, incluindo citocinas (p.ex. TNF- , IL-1 , e IL-6). A libertação destes mediadores pirogénicos para a circulação desencadeia uma cascata de eventos conduzindo a uma resposta inflamatória no indivíduo afectado. O teste de 14 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ activação de monócitos do presente invento baseia-se na medição destes pirogénios endógenos como marcador para uma resposta inflamatória. De acordo com uma concretização preferida do presente invento, uma amostra é incubada com um reagente contendo monócitos num primeiro sistema de ensaio compreendendo uma superfície constituída por polipropileno, o reagente contendo monócitos estando presente no sistema de ensaio a uma densidade celular elevada. O conteúdo do primeiro sistema de ensaio é então transferido para um segundo sistema de ensaio compreendendo uma superfície revestida com anticorpos anti-citocina, e o segundo sistema de ensaio é ensaiado quanto à presença de citocinas ligadas à superfície pelos anticorpos. 0 estojo é estabelecido nas reivindicações.

Os testes de pirogénios do presente invento são utilizados para detectar pirogénios sem serem endotoxinas, i.e., bactérias Gram-positivas (p.ex., Staphylococcus aureus) ou seus componentes (p.ex., muropéptido, ácido lipoteicóico, enterotoxinas, estreptolisina) , estimuladores imunitários tais como fito-hemoglutinina ou ésteres de forbol, bem como endotoxinas. Como o teste utiliza a resposta de citocinas dos monócitos a diversos pirogénios, em vez de uma resposta específica a endotoxina de bactérias Gram-negativas, um amplo espectro de agentes pirogénicos pode ser detectado com o teste do presente invento.

Os testes de pirogénios do presente invento têm demonstrado ser mais eficazes na detecção de pirogénios sem serem endotoxinas em lotes contaminados de um produto médico, em comparação com testes convencionais. Os exemplos aqui mostram que estes testes convencionais não são capazes de distinguir amostras de controlo positivo de solução de diálise peritoneal Extraneal®, hemoglobina, ou dextrano de amostras de controlo negativo dos mesmos produtos parentéricos. A amostra de controlo positivo de Extraneal® foi obtida a partir de um lote do produto contaminado com pirogénio sem ser endotoxina; o lote contaminado causou reacções adversas em humanos mas foi negativo quanto à presença de pirogénio de acordo com um teste LAL, que apenas testa pirogénios endotoxinas (Martis, et al., Lancet, 365(9459), 588). A amostra de controlo positivo da 15 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ hemoglobina foi também obtida a partir de um lote do produto contaminado com pirogénio sem ser endotoxina; o lote contaminado causou respostas de febre em coelhos, mas foi negativo quanto à presença de pirogénio de acordo com um teste LAL. 0 controlo positivo de dextrano foi uma preparação de dextrano que se verificou causar febre em seres humanos mas foi negativo quanto à presença de pirogénio de acordo com um teste LAL. A capacidade do teste para detectar contaminantes sem serem endotoxinas em produtos médicos é de grande valor uma vez que permite a identificação de lotes do produto médico contaminados antes do lote ser libertado para utilização em pacientes. Os testes conhecidos funcionam bem no contexto da detecção de pirogénios sem serem endotoxinas e endotoxinas puros, i.e., peptidoglicano (PG) de S. aureus e LPS de E. coli tal como descrito por Nakagawa et al. tal como discutido acima, ou a adição de endotoxina aos produtos, i.e., vários fármacos foram adicionadas com diferentes concentrações de endotoxina nos seis testes do Human(e) Study tal como discutido acima. Os testes LAL funcionam eficazmente quando é proporcionado um produto médico contaminado com endotoxina (Mascoli, C.C., Weary, M.E., J. Parenter Drug Assoe. 2003, 33: 81; Mascoli, C.C., Weary, M.E., Prog. Clin. Biol. Res. 2003, 29: 387). No entanto, quando um produto médico está contaminado com pirogénio sem ser endotoxina, tais testes não conseguem detectar o pirogénio. Sem estar ligado a uma teoria particular, crê-se que o pirogénio sem ser endotoxina interage com o produto médico resultando numa "máscara" do pirogénio e a incapacidade para detectar contaminantes sem serem endotoxinas.

Os testes de pirogénios do presente invento superam este efeito de mascaramento e são capazes de detectar contaminantes sem serem endotoxinas em produtos médicos: por exemplo, numa concretização preferida, em que os PBMC foram cultivados a uma elevada densidade celular em poços de polipropileno de fundo redondo, o teste de pirogénio do presente invento foi capaz de distinguir entre amostras de controlo positivo e negativo de solução Extraneal® e dextrano (ver Figura 9) . Nenhum dos estojos disponíveis que foram testados foi capaz de distinguir entre controlos positivos e negativos de Extraneal® ou de hemoglobina (ver Figuras 1-8). Novamente, sem estar vinculado a uma teoria particular, 16 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ acredita-se que densidades celulares elevadas proporcionam mais células para maior contacto célula a célula. O maior contacto célula a célula facilita uma maior comunicação entre as células e, portanto, resulta numa maior resposta inflamatória a um contaminante pirogénico. As células comunicam umas com as outras através de mediadores solúveis, tais como citocinas, e através de contacto célula a célula, em que as citocinas podem também participar. Um poço de fundo redondo, ou um poço geralmente com uma forma tal que as células fiquem concentradas, proporciona maior contacto célula a célula em comparação com um poço de fundo plano. E, crê-se que o polipropileno aumenta a biodisponibilidade de pirogénios sem serem endotoxinas. Novamente, sem estar vinculado a uma teoria particular, acredita-se que o tratamento da superfície de placas de poliestireno, tal como convencionalmente utilizadas na cultura de células, torna a sua superfície menos hidrófoba e mais capaz de se ligar a células, mas também faz com que a sua superfície se ligue e neutralize pirogénios sem serem endotoxinas. A placa de polipropileno não é de superfície tratada para que permaneça mais hidrófoba que a placa de poliestireno e seja menos provável que neutralize pirogénios sem serem endotoxinas. 1. Componentes do Teste de Pirogénios

Um teste de pirogénios que se caracteriza por alguma combinação dos três elementos descritos acima, elevada densidade celular, fundo redondo (ou uma forma diferente apropriada), e polipropileno, i.e., PBMC presentes a uma densidade celular elevada num poço de poliestireno de fundo redondo, permite uma melhor detecção de contaminação por não endotoxinas em produtos médicos. Os testes de pirogénios do presente invento podem ser utilizados para testar uma variedade de produtos médicos quanto à presença de contaminação de não endotoxinas, incluindo produtos derivados do sangue, produtos médicos para administração parentérica, dialisados, vacinas, soluções intravenosas e qualquer fluido que contacte o corpo ou fluidos corporais. 17 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ A. Citocina ou Mediador Endógeno da Resposta Inflamatória

Qualquer mediador endógeno da resposta inflamatória segregado pelo reagente contendo monócitos que seja detectável pode ser utilizado como a base do teste de pirogénios do presente invento. De preferência, no entanto, é empregue um marcador citocina ou endotelina porque são fáceis de detectar através do método do invento. Verificou-se que os monócitos no sangue completo incubado com uma endotoxina ou pirogénio sem ser endotoxina produzem várias classes de citocinas, incluindo, mas não se limitando a citocinas pró-inflamatórias (TNF- , IL-1, IL-6), citocinas anti- inflamatórias (IL-4, IL-10, IL-13, IL-lra, TGF), Thl (IL-2, IFN, IL-12) , Th2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13), IL-1 IL-lra, IL-8, e PGE2. Marcadores citocinas preferidos para utilização no invento incluem TNF- , IL-1 , IL-lra, IL-6, IL-8 e PGE2. IL-6 é um marcador citocina particularmente preferido para ensaiar no presente invento. A IL-6 é produzida em quantidades detectáveis dentro de um período de incubação relativamente curto. A IL-6 imunorreactiva, ao contrário de IL-1 e TNF- imunorreactivo®, segregada inteiramente para o meio condicionado por células/sangue, em grandes quantidades, permitindo a sua estimativa completa. Em contraste, TNF- e IL-1 imunorreactivos permanecem em grande parte intracelulares, levantando a possibilidade de que preparações de teste que afectem a permeabilidade celular possam mais facilmente interferir no teste com TNF- ou IL-1 (imunorreactivos) como leitura, em vez de IL-6 (ver Figuras 2 e 3). Contudo, TNF- ou IL-1 poderiam também ser utilizados como marcador citocina no presente invento. TNF- é produzido mais cedo que IL-6 na resposta dos monócitos aos pirogénios. Assim, uma concretização do invento que teste TNF-utilizaria um tempo de incubação mais curto ( 1 a 2 horas) que concretizações que ensaiem IL-6. Os diferentes contaminantes pirogénicos podem desencadear diferentes respostas de citocinas na cultura celular. Portanto, o invento pode ser adaptado para detectar a formação de determinadas citocinas quando a contaminação com um determinado pirogénio que cause a secreção dessas citocinas for provável para um produto farmacêutico. 18 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ Β. Anticorpo para a Citocina ou Mediador Endógeno

Uma vez determinada a citocina a ensaiar, tem de ser produzido um anticorpo para essa citocina para utilização no presente invento. Anticorpos policlonais purificados sob condições rigorosas, tal como descrito no Exemplo 1 da Patente U.S. N.° 6696261, funcionam bem no teste de pirogénios. Uma vez que o sangue dos animais a partir dos quais os anticorpos policlonais são isolados é naturalmente isento de pirogénios (se retirado de animais saudáveis), deve-se simplesmente impedir a contaminação das matérias-primas com pirogénios durante a purificação para se obter um produto livre de pirogénios. Tampões e fases sólidas livres de pirogénios são utilizados em colunas de cromatografia de afinidade para obter anticorpos policlonais livres de pirogénios tal como descrito no Exemplo 1 da Patente U.S. N.° 6696261. Alternativamente, podem ser utilizados anticorpos monoclonais de culturas de hibridoma. No entanto, quando se utilizam anticorpos monoclonais, deve ser tomado cuidado para isolar os anticorpos de qualquer pirogénio contaminante que possa estar presente na cultura de células de hibridoma.

Para utilização no presente invento, o anticorpo para a citocina é aplicado a uma superfície de um sistema de ensaio. Métodos, tais como revestimento, para anticorpos de ligação numa superfície num sistema de ensaio, tal como um poço de microtitulação, são bem conhecidos nas artes bioquímicas. Muitos sistemas de ensaio estão comercialmente disponíveis, e o fabricante proporciona habitualmente materiais e instruções para revestir anticorpos numa superfície do sistema. Devido à sua facilidade de leitura e ao pequeno volume de amostra necessário, os poços de microtitulação nos quais uma porção da superfície interior do poço é revestida com o anticorpo são utilizados numa concretização preferida do presente invento. Para explorar completamente as vantagens do invento, prefere-se que o poço de microtitulação faça parte de uma placa de microtitulação, que é uma série planar de poços semelhantes, situados de modo a que a série de poços possa ser lida com equipamento automático de leitura de placas de imunoensaio (ver, p.ex., Patente U.S. N.° 5281540). O equipamento automático, tal como leitores de placa de ELISA 19 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ (ver, p.ex., ο Ultramark Microplate Reader, disponível em Bio-Rad Laboratories, Inc.), automatiza o processo de avaliação do ensaio e diminuir significativamente o custo por teste. Se desejado, as placas de poços de microtitulação podem ser tornadas livres de pirogénios (se não forem já fornecidas como tal) através de lavagem extensiva com tampão livre de pirogénios. Numa concretização particularmente preferida do presente invento, anticorpos policlonais anti-IL—6 são revestidos nos poços de uma placa de ELISA. No entanto, outros formatos de teste de imuno-diagnóstico (p.ex., em que o anticorpo é revestido numa vareta ou conta) são aceitáveis para utilização no presente invento.

Para além do anticorpo de "captura", outros anticorpos e reagentes para utilização no ensaio da citocina podem ser aplicados quando se produzem os sistemas de placas de microtitulação para utilização no presente invento. Por exemplo, após o anticorpo de captura ser aplicado na placa de microtitulação, os restantes locais de ligação da placa podem ser "bloqueados" com outra proteína. Após o bloqueio, um anticorpo de detecção marcado (tal como um anticorpo biotinilado ou marcado com uma enzima) pode ser aplicado à placa de microtitulação, juntamente com um composto vitrificador protector. Assim, quando uma amostra é incubada no poço de microtitulação, tal como descrito abaixo, uma citocina libertada é capturada pelo anticorpo de captura ligado ao poço e marcado pelo anticorpo de detecção em simultâneo, durante o período de incubação da amostra. C. Reagente Contendo Monócitos

Como primeiro passo nos testes de pirogénios do presente invento, as células contidas dentro de um reagente contendo monócitos são cultivadas através da combinação do reagente contendo monócitos com uma amostra a testar num sistema de ensaio. O reagente contendo monócitos do presente invento é seleccionado a partir do grupo que consiste em PBMC, células da linha celular monocítica, sangue completo, ou qualquer linha celular que expresse ou possa ser produzida para expressar os receptores semelhantes a Toll (TLR) que estão envolvidos na mediação de respostas a agentes pró-inflamatórios e pirogénicos, incluindo células nas quais 20 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ estes receptores foram induzidos ou clonados. De preferência, a linha celular monocitica é seleccionada a partir do grupo que consiste em MONOMAC-6 (MM6), THP-1, e 28SC. Os monócitos no reagente contendo monócitos são de preferência monócitos da mesma espécie à qual o produto testado é administrado (i.e. humano para produtos farmacêuticos; gato, cão, cavalo, etc. para produtos veterinários) . No entanto, monócitos de outras espécies com a reactividade de pirogénios desejada podem também ser utilizados. Em certas concretizações preferidas, o reagente contendo monócitos compreende PBMC.

Numa concretização do invento, o reagente contendo monócitos é sangue completo e o sistema de ensaio inclui pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno, de modo a que o reagente contendo monócitos esteja em contacto com a superfície.

Noutra concretização, o reagente contendo monócitos é PBMC presentes a elevada densidade celular, e o sistema de ensaio inclui pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno, polietileno, poliestireno ou outro material semelhante em contacto com os PBMC.

Quando o reagente contendo monócitos é PBMC ou células de uma linha celular, o reagente está presente no sistema de ensaio a uma densidade celular elevada, para facilitar um maior contacto célula a célula, tal como acima explicado em detalhe. Em certas concretizações, o reagente contendo monócitos está presente no sistema de ensaio, a uma densidade de células por poço de pelo menos cerca de 125 000 células, pelo menos cerca de 250 000, 500 000, 600 000, 700 000, 800 000, 900 000, 1 000 000, 1 100 000, 1 200 000, 1 300 000, 1 400 000, 1 500 000, 1 600 000, 1 700 000, 1 800 000, 1 900 000 ou 2 000 000 células por poço. Um perito na técnica reconhecerá que a densidade celular máxima é excedida quando existem nutrientes celulares insuficientes no volume de reagente dentro do poço para manter apropriadamente as células dentro do poço.

Quando o reagente contendo monócitos é sangue completo, o reagente está presente no sistema de ensaio a uma densidade celular mais baixa que os PBMC ou as células da linha 21 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ celular. Em certas concretizações onde o reagente contendo monócitos é sangue, o reagente está presente no sistema de ensaio a uma densidade celular de pelo menos cerca de 100 000 células mononucleares de sangue periférico por poço, pelo menos cerca de 200 000, 210 000, 220 000, 230 000, 240 000, 250 000, 260 000, 270 000, 280 000, 290 000, 300 000, 310 000, 320 000, 330 000, 340 000, 350 000, 360 000, 370 000, 380 000, 390 000 ou 400 000 PBMC por poço. Sem estar vinculado a uma teoria particular, acredita-se que o sangue completo pode ser utilizado a uma densidade celular mais baixa, em comparação com os PBMC ou células da linha celular porque os monócitos estão no seu ambiente natural e todos os componentes do soro que podem influenciar a sua resposta a pirogénios estão presentes em solução. Além disso, quando o reagente contendo monócitos compreende sangue completo, a leitura utilizada para o teste de pirogénios é IL-6.

De preferência, quando o sangue é utilizado como reagente contendo monócitos, o sangue é fresco, ou com menos de 24 horas, e de maior preferência com menos de 4 horas. Além disso, quando é utilizado sangue completo, anticoagulantes podem ser incluídos para retardar ou impedir a coagulação do sangue; anticoagulantes adequados incluem citrato (por exemplo, até uma concentração final de 0,38%), heparina (heparinato de sódio), ou fragmina (heparina de baixo peso molecular). Podem ser utilizados aditivos anticoagulantes sem afectar a resposta dos monócitos aos pirogénios na amostra de teste. 0 sangue completo pode também ser diluído com um tampão apropriado ou outro diluente, tal como meio de cultura de células RPMI ou solução salina fisiológica. O sangue completo é de preferência diluído até pelo menos 50%, de maior preferência até de cerca de 5% a cerca de 25%, e ainda de preferência cerca de 20% do volume final para incubação (ver Figura 1 da Patente U.S. N.° 6696261). Através da diluição do sangue completo, a curva da resposta de IL-6 da maioria dos dadores pode ser trazida para dentro de um intervalo compacto que pode ser utilizado para quantificar um intervalo mais amplo de concentrações de contaminação por pirogénios (ver Figura 3 da Patente U.S. N.° 6696261). 22 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ 2. Sistema de Dois Ensaios

Em certas formas de realização do presente invento, o teste de pirogenicidade é realizado num sistema de dois ensaios de recipientes, de modo a que os passos de incubação da amostra com o reagente contendo monócitos e a captura da citocina ou citocinas produzidas pelo reagente contendo monócitos ocorrem em dois sistemas de ensaio de recipientes diferentes. O passo de incubação segue-se ao passo de cultura descrito acima; a incubação da amostra de teste com o reagente contendo monócitos (tal como PBMC) é realizada no mesmo sistema de ensaio que o passo de cultura. O tempo de incubação óptimo para utilização no teste de pirogénios do presente invento variará dependendo das condições de ensaio, a saber, a citocina que é ensaiada. Por exemplo, quando o sangue completo é incubado com endotoxina e a leitura é IL-6, é produzida uma citocina minima adicional pelo reagente contendo monócitos após incubação durante 6 horas; após 4 horas de incubação, foi segregada uma quantidade suficiente de IL-6 pelo reagente para permitir a quantificação do contaminante pirogénio. Quando o sangue completo é incubado com pirogénio sem ser endotoxina e é utilizada qualquer leitura, uma quantidade suficiente de IL-6 foi segregada pelo reagente para permitir a quantificação do contaminante pirogénio após cerca de 16-24 horas de incubação. Para uma concretização do presente invento que ensaia a produção de IL-6, é preferido um tempo de incubação de cerca de 6 a cerca de 24 horas, de maior preferência cerca de 12 a cerca de 24 horas, e ainda de preferência de cerca de 16 a cerca de 24 horas. Se for ensaiada outra citocina, o período de incubação deve ser optimizado para a produção dessa citocina em particular. Tal optimização está dentro das capacidades do perito na técnica. Se a citocina a ensaiar não for libertada pelos monócitos, as células podem ser lisadas através de congelação-descongelação, ou através de adição de um detergente no final do período de incubação numa concentração que não prejudicará a ligação dos ligandos aos anticorpos.

Uma vez completado o passo de incubação, o conteúdo do sistema de ensaio (o primeiro sistema de ensaio), nomeadamente o reagente contendo monócitos e a amostra de teste, é transferido para um segundo sistema de ensaio que 23 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ compreende pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para uma citocina ou um mediador endógeno da resposta inflamatória, p.ex., endotelina. 0 segundo sistema de ensaio é ensaiado quanto à presença de citocina ou mediador endógeno na superfície revestida com o anticorpo anti-citocina ou anti-mediador endógeno. De preferência, são mantidas condições rigorosas, estéreis em todos os pontos do procedimento antes da superfície revestida com anticorpo ser ensaiada quanto à citocina ligada. Se uma placa de ELISA revestida com um anticorpo de captura for utilizada como a concretização do presente invento, a placa é lavada, e é adicionado à placa de ELISA um segundo anticorpo anti-citocina conjugado com uma enzima (a menos que o segundo anticorpo marcado de "detecção" fosse inicialmente adicionado à placa antes da vitrificação ou juntamente com o conteúdo do primeiro sistema de ensaio). A placa de ELISA é novamente lavada e a adição de um substrato à placa de ELISA produzirá uma cor. Após um curto período de incubação, a reacção é terminada, e a densidade óptica da solução é medida num leitor de placas de ELISA. Este processo é ainda descrito no Exemplo 2 da Patente U.S. N.° 6696261. Alternativamente, podem ser utilizadas técnicas de imunoensaio não enzimáticas. Por exemplo, o segundo anticorpo do imunoensaio em "sanduíche" pode ser marcado com uma porção fluorescente ou um isótopo radioactivo. Após lavagem, a quantidade de citocina capturada no poço pode ser quantificada através da detecção da quantidade de fluorescência ou radiação presente no poço. Vários sistemas de ensaio baseados em enzimáticos e não enzimáticos estão comercialmente disponíveis e podem ser facilmente modificados para utilização no presente invento por um vulgar perito na técnica. 3. Sistema de Um Ensaio

Em certas concretizações do presente invento, o teste de pirogenicidade é realizado num sistema de um ensaio de recipientes, de modo a que os passos de incubação da amostra com o reagente contendo monócitos e a captura da citocina ou citocinas produzidas pelo reagente contendo monócitos ocorram no mesmo sistema de ensaio de recipientes. O sistema de ensaio compreende pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno e pelo menos uma superfície tratada com um 24 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ anticorpo para uma citocina ou um mediador endógeno da resposta inflamatória. 0 passo de incubação segue-se ao passo de cultura descrito acima e é efectuado no mesmo sistema de ensaio que o passo de cultura. Tal como descrito acima no contexto do sistema de ensaio de dois recipientes, o tempo de incubação óptimo para utilização no teste de pirogénios do presente invento variará dependendo das condições do ensaio, nomeadamente da citocina que é ensaiada. Geralmente, os ensinamentos sobre o passo de incubação discutidos em relação ao sistema de ensaio de dois recipientes aplicam-se também ao sistema de ensaio de um recipiente. O período de incubação deve ser optimizado para a produção de uma determinada citocina e tal optimização está dentro das capacidades do perito na arte. Se a citocina a ensaiar não for libertada pelos monócitos, as células podem ser lisadas através de congelação-descongelação, ou através da adição de um detergente no final do período de incubação numa concentração que não prejudicará a ligação dos ligados aos anticorpos.

Uma vez completado o passo de incubação, o sistema de ensaio, que compreende pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para uma citocina ou um mediador endógeno da resposta inflamatória, p.ex., endotelina, é ensaiado quanto à presença de citocina ou mediador endógeno na superfície revestida com o anticorpo anti-citocina ou anti-mediador endógeno. De preferência, são mantidas condições rigorosas e estéreis em todos os pontos do procedimento antes da superfície revestida com anticorpo ser ensaiada quanto à citocina ligada. Geralmente, a discussão em relação ao passo de ensaio do sistema de dois ensaios de recipientes, i.e., a discussão da placa de ELISA e de técnicas de imunoensaio não enzimáticas, aplica-se também ao sistema de um ensaio de recipientes.

Em geral, o sistema de um ensaio de recipientes e o sistema de dois ensaios de recipientes são intercambiáveis. 4. Recipientes de Ensaio

Os sistemas de ensaio do presente invento compreendem pelo menos uma superfície em contacto com o reagente contendo monócitos. 0 sistema ou sistemas de ensaio incluem pelo menos 25 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ um poço de microtitulação, e a superfície é pelo menos uma porção do interior do poço de microtitulação. A superfície do poço de microtitulação compreende um revestimento de polipropileno ou todo o poço de microtitulação é composto de polipropileno. Em certas concretizações onde o sistema de ensaio compreende pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para uma citocina ou para um mediador endógeno da resposta inflamatória, a superfície na qual o anticorpo é aplicado é pelo menos uma porção do interior do poço de microtitulação. O poço de microtitulação tem uma forma tal que o reagente contendo monócitos se concentre em comparação com um poço de microtitulação de fundo plano.

Em certas concretizações, o poço ou poços de microtitulação compreendem uma parte de cima aberta, uma região do fundo estendendo-se para baixo a partir do topo aberto, e uma parede do fundo de diâmetro afilado de uma localização acima do ponto mais baixo até o ponto mais baixo.

Em certas concretizações, o poço ou poços de microtitulação compreendem uma parte de cima aberta, uma região do fundo estendendo-se para baixo a partir do topo aberto possuindo uma extremidade superior e uma extremidade inferior, e uma região do fundo possuindo uma extremidade superior e um ponto mais baixo, a região do fundo estendendo-se desde a extremidade inferior da região superior e mais rapidamente afilada em diâmetro que a região superior desde a extremidade superior da região inferior em direcção ao ponto mais baixo. A parede do fundo do referido poço de microtitulação é não planar, de preferência curva, por vezes parabólica. Em certas concretizações particulares, os lados do poço de microtitulação são inclinados para dentro ou a parede do fundo estende-se para baixo. 5. Estojo de Diagnóstico

Qualquer uma das concretizações descritas acima pode ser incorporada num estojo de diagnóstico para a realização de testes de pirogénios. 0 estojo é utilizado para detectar uma variedade de pirogénios sem serem endotoxinas, incluindo 26 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ bactérias Gram-positivas (p.ex., Staphylococcus aureus) ou seus componentes (p.ex., muropéptido, ácido lipoteicóico, enterotoxinas, estreptolisina), bem como pirogénios endotoxinas numa variedade de produtos médicos, incluindo produtos sanguíneos ou outros parentéricos, tais como dialisados, vacinas e soluções intravenosas. Geralmente, tal estojo inclui uma placa de microtitulação compreendendo uma pluralidade de poços de microtitulação numa forma tal que o meio de cultura contido em cada poço se concentra em comparação com um poço de microtitulação de fundo plano, os poços compreendendo pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno. Os poços da placa de microtitulação contêm reagente contendo monócitos criopreservados compreendendo sangue completo criopreservado, células mononucleares de sangue periférico criopreservadas ou células da linha celular monocítica criopreservadas, que estão em contacto com as superfícies dos poços. Em certas concretizações, os poços da placa de microtitulação compreendem polipropileno. Quando o reagente contendo monócitos criopreservado compreende células mononucleares de sangue periférico criopreservadas ou células da linha celular monocítica criopreservadas, o reagente está presente nos poços a uma densidade celular elevada. Os estojos contendo sangue completo criopreservado como o reagente contendo monócitos contém também anticorpo para IL-6, uma vez que a IL-6 é a leitura preferida.

Em concretizações particulares, os poços incluem uma barreira que é impermeável a monócitos. A barreira compreende pelo menos uma superfície constituída por um material isento de pirogénios, que é tipicamente uma membrana, uma grelha, um crivo ou uma peneira. A barreira é de preferência estéril. Materiais de barreira adequados para utilização com placas de microtitulação são conhecidos na técnica. A barreira, que é permeável a fluidos, permite que as células criopreservadas sejam lavadas sem serem removidas dos poços; dimetilsulfóxido (DMSO), que banha células criopreservadas e actua como um conservante, pode ser removido de modo a que não interfira com os testes. As amostras de teste são adicionadas por cima da barreira, penetram a barreira, contactam as células por baixo da barreira, e potencialmente estimulam estas células para produzir citocinas. As citocinas libertadas pelas células difundem-se para o meio acima da barreira. 27 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ

Tipicamente, as soluções acima e abaixo da barreira são cuidadosamente misturadas, através da aspiração das soluções. Subsequentemente, uma alíquota de meio bem misturado de acima da barreira é ensaiada quanto à presença de citocina ou de um mediador endógeno da resposta inflamatória. 6. Interpretação dos Dados de Produção de Citocinas A. Método da Curva Padrão

Para interpretar correctamente os dados de produção de citocinas gerados no teste de pirogénios do presente invento, é gerada uma curva padrão de endotoxina através da incubação do reagente contendo monócitos com endotoxina padrão USP. O objectivo disto é quantificar a resposta de produção de citocinas medida para uma amostra de teste em termos da resposta observada para um pirogénio conhecido. Uma curva padrão pode ser gerada a partir de qualquer número estatisticamente significativo de pontos de dados gerados com concentrações variadas de forma significativa da endotoxina padrão através da utilização de suporte lógico de análise de dados de melhor ajuste padrão. Os métodos de geração de tais curvas padrão são geralmente conhecidos na técnica. Os requerentes verificaram que os pontos de dados de 10, 4, 1, 0,25, 0,06, 0,03, e 0 EU/ml de endotoxina são adequados para a geração de uma curva padrão, mas qualquer número estatisticamente significativo de concentrações ao longo de um intervalo semelhante seria adequado. Uma vez gerada uma curva padrão, a concentração equivalente de não endotoxinas (quantificada em unidades equivalentes de endotoxina) pode ser interpolada a partir da resposta de citocina utilizando a curva padrão. Como a resposta dos reagentes contendo monócitos baseados em sangue completo pode variar significativamente de dador para dador, é importante gerar uma curva padrão para cada conjunto de ensaios realizados com um determinado lote de reagente contendo monócitos. No entanto, como a concretização preferida de placa de ELISA do invento utiliza quantidades muito pequenas de sangue humano (cerca de 40 1/poço), uma única unidade de sangue doado pode ser utilizada para várias centenas de poços. A curva padrão gerada utilizando a endotoxina USP auxilia na normalização dos dados em termos de relação com unidades de endotoxina 28 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ (EU, tal como definido pela USP/FDA, que são idênticas às IU, unidades internacionais tal como definido pela OMS), que é o padrão da indústria para expressar contaminação por endotoxinas/pirogénios. B. Método do Lote de Referência

Alternativamente, os dados da produção de citocinas gerados no teste de pirogénios do presente invento podem ser interpretados através de comparação das respostas de citocinas desencadeadas por lotes de teste de um produto com as desencadeadas por lotes de referência de um produto, um lote de referência contaminado e um lote de referência não contaminado. Primeiro, são identificados os dois lotes de referência de um produto médico: os lotes de referência são testados quanto a pirogénios e são medidas as respostas de citocinas desencadeadas por estes lotes. Em seguida, os lotes de teste são testados quanto a pirogénios e as respostas desencadeadas por estes lotes são comparadas com as dos lotes de referência. Geralmente, um lote de teste será considerado não contaminado se desencadear uma resposta menor que o lote de referência contaminado e uma resposta semelhante à do lote de referência não contaminado. Cada lote de teste pode ser testado uma ou várias vezes. Por exemplo, de acordo com um método de lote de referência, um produto era considerado não contaminado se fosse desencadeada a libertação de não mais de duas vezes tanta IL-6 como no lote de referência não contaminado em quatro de quatro dadores ou sete de oito dadores; o teste foi conduzido em quadruplicado utilizando o sangue de quatro dadores diferentes. Um método de lote de referência preferido é descrito em Gaines-Das et al., 2004, no qual é requerido que a amostra de teste estimule a libertação de menos IL-6 que a referência. Nesse artigo, é necessário que a preparação do teste passe no teste com os PBMNC de quatro dadores diferentes. Se a preparação do teste passar o teste com os PBMNC de três dos quatro dadores, o teste é continuado com PBMNC de mais quatro dadores, nenhum dos quais proporcionou PBMNC para o primeiro teste, e é necessário que a preparação do teste passe no teste com os PBMNC de sete dos oito dadores diferentes. 29 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ

Vantajosamente, ο teste de activação de monócitos do presente invento é mais capaz de detectar a presença de uma ampla variedade de pirogénios, incluindo pirogénios sem serem endotoxinas, em produtos médicos tais como produtos sanguíneos, soluções intravenosas, e vacinas.

DEFINIÇÕES

Tal como aqui utilizado, o termo endotoxina ou pirogénio sem ser endotoxina "puro" ou pirogénio na sua "forma pura", refere-se a endotoxina à qual foi retirada a sua proteína associada. A endotoxina pura é também conhecida como lipopolissacárido (LPS). 0 termo "reagente contendo monócitos" significa qualquer solução de células leucócitos monocíticos do sistema imunitário. De preferência, estas células são derivadas do organismo ao qual o produto a testar é para administrar (i.e., humano para produtos farmacêuticos, gato, cão, cavalo, etc. para produtos veterinários) . Um exemplo de um reagente contendo monócitos é sangue completo humano. 0 termo "sistema de ensaio" significa qualquer recipiente e superfície que possa ser utilizado num teste de activação de monócitos, incluindo um recipiente no qual as células são cultivadas e incubadas com uma amostra de teste, bem como um recipiente e uma superfície com anticorpo ligado que possa ser utilizado num imunoensaio. De preferência, em relação à realização de um imunoensaio, tais recipientes são poços de placa de microtitulação com anticorpo ligado a uma superfície no poço, em que pode ser realizado um grande número de imunoensaios ligados a enzimas colorimétricos em paralelo e que pode ser avaliado automaticamente através de uma máquina de leitura de placas de ELISA. No entanto, estão previstos outros sistemas de imunoensaio, especialmente aqueles onde a superfície revestida não faz necessariamente parte da parede do recipiente. Por exemplo, um tubo de teste maior que contenha uma conta de poliestireno ou vareta revestida pelo anticorpo pode ser utilizado no presente invento. 30 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ Ο termo "linha celular monocítica" inclui qualquer linha celular que tenha CD14 endógeno e/ou receptores semelhantes a Toll (TLR) ou que tenha sido transfectada com CD14 e/ou TLR e/ou genes repórter para mediadores inflamatórios/pirogénicos. A linha celular não tem que ser monocítica, desde que possua ou que tenha sido transfectada com os componentes dos "receptores de pirogénios" presentes nos monócitos: estes componentes incluem TLR e CD14. Por exemplo, células de Rim Embrionário Humano (HEK) já têm a maioria dos TLR e podem ser estavelmente transfectadas com os TLR que não possuem - TLR2 e TLR4 - e também CD14 para as tornar suficientemente semelhantes a um monócito para funcionar nos métodos do invento.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação de PBMC. PBMC foram isolados a partir de sangue periférico humano heparinizado que não tinha mais de 4 horas através de centrifugação em gradiente de densidade utilizando Ficoll Paque Plus (Pharmacia #17-1440-02). As células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem cálcio nem magnésio (Gibco #14190), ressuspensas em Meio Essencial Mínimo (MEM (Gibco #11090), tampão HEPES (Gibco #15630), e 5 1 de plasma inactivado por calor do próprio dador (i.e., concentração final de 2%) . Os PBMC foram diluídos até às densidades celulares necessárias (8 milhões, 4 milhões, 2 milhões, e 1 milhão de PBMC por ml).

Cultura de Células. As culturas celulares foram realizadas em quadruplicado nas seguintes placas de microtitulação: Corning Costar #3790, #3359. 125 μΐ de suspensão celular contendo 1 milhão, 0,5 milhões, 0,25 milhões, ou 0,13 milhões de células foram adicionados a cada poço, seguido de 125 μΐ de amostra de teste ou endotoxina padrão (0,0064-20 EU/ml). A mistura de 250 μΐ foi suavemente misturada e incubada a 37±1°C, em CO2 a 5% e em ar húmido. A duração da cultura foi de 16 a 24 horas, após o que alíquotas do fluido de cultura foram obtidas, diluídas de 1 para 2 e 1 para 50, e ensaiadas quanto a IL-6. 31 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ ELISA para IL-6. Placas de 96 poços (Immulon 4, Dynex #011-010-3855) foram revestidas com 150 μΐ de IgG monoclonal de ratinho (R&D Systems #MAB206 dissolvido em tampão bicarbonato, pH 9,5) a 3 pg/ml através de incubação de um dia para o outro a 2-8°C. As placas foram lavadas três vezes com 300 μΐ de tampão de lavagem (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) . Os locais de ligação não específica nas placas foram bloqueados através da adição de 200 μΐ de solução de bloqueio (Albumina de Soro Bovino a 0,02 g/1, Fracção V, livre de proteases). As placas foram novamente lavadas três vezes com 300 μΐ do mesmo tampão de lavagem, e foram adicionados 100 μΐ de amostras (previamente diluídas 1 para 2 e 1 para 50 em diluente de amostras) ou padrões (7,8-1000 pg/ml de padrão internacional da OMS para IL-6, #89/548) a cada poço. 100 μΐ do diluente de amostras foram adicionados a cada poço não utilizado. A placa foi coberta com vedante (Falcon #3073) e incubada com agitação (aproximadamente 300 rpm) durante 1 hora ± 5 minutos. A placa foi então aspirada e lavada cinco vezes com 300 μΐ de tampão de lavagem. Em seguida, 100 μΐ de anticorpo anti-IL-6 humana de cabra biotinilado a 0,2 pg/ml (R&D Systems, #BAF206) foram adicionados a cada poço e a placa foi novamente coberta com vedante e incubada com agitação (aproximadamente 300 rpm) durante 1 hora ± 5 minutos. A placa foi então aspirada e lavada cinco vezes com 300 μΐ de tampão de lavagem. Em seguida, 100 μΐ de fosfatase alcalina (Rockland #S000-05) a 0,02 pg/ml foram adicionados a cada poço e a placa foi novamente coberta com vedante e incubada com agitação (aproximadamente 300 rpm) durante 1 hora ± 5 minutos. A placa foi aspirada e lavada cinco vezes com 300 μΐ de tampão de lavagem. Em seguida, 200 μΐ de pNPP a 1 mg/ml em tampão dietanolamina com MgCl2 0,5 mM foram adicionados a cada poço. A placa foi novamente coberta com vedante e incubada com agitação (aproximadamente 300 rpm) à temperatura ambiente até a maior concentração da curva padrão de IL-6 (1000 pg/ml) ter uma densidade óptica entre cerca de 2,5 e 3,0 a 405 nm, ponto a que a reacção foi parada através da 32 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ adição a cada poço de 50 μΐ de NaOH 2 Μ. A densidade óptica de cada poço foi determinada 30 minutos após a reacção ter sido parada utilizando um leitor de microplacas regulado para 405 nm. A Figura 1 mostra o efeito da densidade celular nas respostas de IL-6 ao padrão de endotoxina (1 EU/ml) e controlo positivo de Extraneal®. O controlo positivo de Extraneal® foi contaminado com pirogénio sem ser endotoxina e causou uma reacção adversa do fármaco nos receptores humanos deste lote mas deu uma resposta negativa no teste LAL (Martis et al. 2005). Os valores são médias ± erro padrão da média de quatro poços replicados. As densidades celulares de 0,25 a 1 milhão e PBMC por poço responderam de forma semelhante ao padrão de endotoxina 1 EU/ml. A amostra de controlo positivo foi melhor detectada utilizando 1 milhão > 0,5 milhões > 0,25 milhões >> 0,13 milhões de células por poço.

Exemplo 2 - Testes de Pirogénios Comparativos

Os métodos aqui descritos como o estado actual da técnica foram replicados. Nenhum destes métodos discrimina controlos positivos do produto para a solução de diálise Extraneal®, hemoglobina e/ou dextrano de controlos negativos do produto.

Os ensaios de Hoffman et al., 2005 foram replicados tal como ai descrito, utilizando placas de microtitulação de poliestireno com poços de fundo plano e leitura de IL-6. O reagente contendo monócitos foi utilizado a baixa densidade celular e foi sangue completo (75 000 células por poço), PBMC (100 000 células por poço), M0N0MAC6 (250 000 células por poço), ou THP-1 (250 000 células por poço) nas Figuras 2-5, respectivamente. Note-se que na Figura 5, a leitura de IL-6 foi substituída por neopterina porque a IL-6 é um pirogénio endógeno (em contraste com a neopterina) e uma leitura mais robusta nos métodos do invento. Na Figura 6, células THP-12A9 a baixa densidade celular (250 000 células por poço) foram utilizadas como reagente contendo monócitos e o TNF foi a leitura. 33 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ Ο ensaio de Nakagawa et al. foi replicado tal como ai descrito utilizando 1 000 000 de células do clone MONOMAC-CA8 por ml como o reagente contendo monócitos, leitura de IL-6, e placas de microtitulação de poliestireno com poços de fundo plano. Ver Figura 7. 0 ensaio de Yamamoto et al. foi replicado tal como ai descrito utilizando 1 000 000 de células 28C por ml como o reagente contendo monócitos, leitura de IL-6, e placas de microtitulação de poliestireno com poços de fundo plano. Ver Figura 8. No entanto, as células 28C foram iniciadas com calcitriol (100 ng/nl) em vez de interferão gama porque este último não conseguiu dar uma curva de dose-resposta à endotoxina padrão.

Exemplo 3 - Teste de Pirogénios do Invento

Culturas (200 1) de sangue completo humano a 20% (40 μΐ = aproximadamente 60 000 PBMC/poço = aprox. 300 000 PBMC/ml) foram realizadas em quadruplicado em placas de polipropileno de 96 poços de fundo redondo (Costar #3790, Corning

Incorporated, USA) . As adições por poço foram: MEM-HEPES (60 1), sangue de um único dador (40 )i padrão de endotoxina ou amostras de Extraneal® diluidas 1:1 com MEM-HEPES (100 1, i.e., a solução Extraneâl estava a uma diluição final de 1 para 4 no poço). O conteúdo dos poços foi misturado através de agitação suave (sem poços de contaminação cruzada) e incubado sem vibração (para permitir que as células assentem) a 37°C durante 16-24 h numa atmosfera de CO2 a 5% em ar. No final da incubação da cultura de tecidos, alíquotas de 100 1 de sobrenadant<transparente de cada poço foram tomadas para o ensaio de IL-6 através de ELISA. A metodologia utilizada para as amostras de dextrano foi semelhante ao descrito acima no Exemplo 1. O isolamento e a cultura de células foi semelhante, excepto que a densidade celular foi de 400 000 células por poço e a diluição da amostra utilizada no ensaio ELISA foi de 1 para 10. O ELISA de IL-6 foi diferente porque utilizou placas revestidas com o anticorpo monoclonal Clonel6 (para captura de IL-6) e um anticorpo policlonal de ovelha conjugado com peroxidase de 34 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ rábano como anticorpo de detecção. O ELISA é utilizado no teste de sangue completo/lL-6 (NIBSC) e no teste de PBMC/IL-6 (Novartis) tal como descrito no artigo de Hoffmann et ai., 2005. A Figura 9 ilustra resultados comparativos para a amostra de controlo negativo de Extraneal® e a amostra de controlo positivo de Extraneal®, e para a amostra de controlo negativo de dextrano e a amostra de controlo positivo de dextrano. Pode observar-se que o teste de pirogénios do invento pode facilmente discriminar entre estes controlos positivos e negativos. O teste foi realizado, em quadruplicado, de acordo com o protocolo descrito acima, com sangue de um único dador. Os valores são médias ± erro padrão da média de quatro poços replicados. A Figura 10 ilustra resultados comparativos para a amostra de controlo negativo de Extraneal® e a amostra de controlo positivo de Extraneal®. Pode observar-se que o teste de pirogénios do invento pode prontamente discriminar entre estes controlos positivos e negativos. O teste foi realizado, em quadruplicado, de acordo com o protocolo descrito acima, com sangue de um único dador. Os valores são médias ± erro padrão das médias de quatro poços replicados. Note-se que a baixa densidade celular foi suficiente para a discriminação de controlos positivos e negativos de Extraneal quando sangue completo foi o reagente contendo monócitos e foram utilizados poços de polipropileno de fundo redondo.

Exemplo 4 - Teste de Pirogénios do Invento: Resultados Comparativos para Placas de Polipropileno vs. Placas de Poliestireno e IL-6 vs. IL-Ιβ para um Único Dador

As amostras de teste foram preparadas de acordo com o método do Exemplo 1, excepto que foram utilizadas densidades celulares de 1 milhão de células por poço, algumas amostras foram submetidas a leitura de IL-Ιβ, e algumas amostras foram colocadas em placas de microtitulação de poliestireno com poços de fundo plano. A Figura 11A mostra que as respostas de IL-6 aos controlos positivos eram claramente distintas dos controlos negativos para os testes realizados em placas de polipropileno, mas não foram distintas para aqueles em placas 35 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ de poliestireno. Os valores são médias ± erro padrão das médias de quatro poços replicados. A Figura 11 B mostra que as respostas de IL-Ιβ aos controlos positivos foram claramente distintas dos controlos negativos para os testes realizados em placas de polipropileno, mas não foram distintas para aqueles em placas de poliestireno. No entanto, a amplitude da resposta na Figura 11B foi muito menor que a da Figura 11A, indicando que IL-Ιβ é uma leitura fraca em comparação com IL-6. Os valores são médias ± erro padrão das médias de quatro poços replicados.

Exemplo 5 - Teste de Pirogénios do Invento: Resultados Comparativos para Placas de Polipropileno vs. Placas de Poliestireno para Múltiplos Dadores

As amostras de teste foram preparadas de acordo com o método do Exemplo 1, excepto que foram utilizadas densidades celulares de 0,88 e 1 milhão de células por poço, foram utilizados três dadores, algumas amostras foram colocadas em placas de microtitulação de poliestireno com poços de fundo plano, e o ELISA de IL-6 utilizou placas revestidas com anticorpo monoclonal Clonelõ e um anticorpo policlonal de ovelha conjugado com peroxidase de rábano como anticorpo de detecção, tal como descrito no artigo de Hoffmann et al., 2005. As Figuras 12A e 12B ilustram a resposta de IL-6 para placas de microtitulação de polipropileno com poços de fundo redondo e placas de microtitulação de poliestireno com poços de fundo plano para uma densidade de células PBMC de 0,88 milhões de células por poço para o dador A, respectivamente. Para o dador A, o teste de pirogénios não distinguiu entre controlos positivos e negativos quando foram utilizadas placas de poliestireno, mas distinguiu entre estes controlos, quando foram utilizadas placas de polipropileno. As Figuras 13A e 13B ilustram a resposta de IL-6 para placas de microtitulação de polipropileno com poços de fundo redondo e placas de microtitulação de poliestireno com poços de fundo plano para uma densidade de células PBMC de 1 milhão de células por poço para o dador B, respectivamente. Embora ambos os testes de pirogénios tenham distinguido entre controlos positivos e negativos para o dador B, a resposta de IL-6 para o controlo positivo foi cerca de 6 vezes maior que a do controlo negativo utilizando as placas de polipropileno, 36 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ mas apenas cerca de 2 vezes maior do que a do controlo negativo utilizando placas de poliestireno. As Figuras 14A e 14B ilustram a resposta de IL-6 para placas de microtitulação de polipropileno com poços de fundo redondo e placas de microtitulação de poliestireno com poços de fundo plano para uma densidade de células PBMC de 0,88 milhões de células por poço para o dador C, respectivamente. Embora ambos os testes de pirogénios tenham distinguido entre controlos positivos e negativos para o dador B, a resposta de IL-6 para o controlo positivo foi cerca de duas vezes maior utilizando as placas de polipropileno versus as placas de poliestireno. Note-se que em polipropileno a resposta ao controlo positivo de Extraneal® excede a resposta à dose maior de padrão de LPS, i.e., 0,4 EU/ml, enquanto em poliestireno a resposta ao controlo positivo de Extraneal® é menor do que a resposta à menor dose de padrão de LPS, i.e., 0,1 EU/ml.

Exemplo 6 - Teste Comparativo de Pirogénios; IPT (Charles River Laboratories) A metodologia utilizada na realização deste teste é descrita na folha de instruções do Teste de Pirogénios In Vitro Endosafe®-IPT (comercialmente disponível em Charles River Laboratories (PIIPT10002)) utilizando o procedimento de ensaio para estimulação de sangue completo utilizando IL-Ιβ e placas de microtitulação de poliestireno. A Figura 15 ilustra que o teste IPT não conseguiu discriminar entre os controlos positivos e negativos de Extraneal® e Hemoglobina, ainda que o estojo tenha respondido ao padrão de LPS e a um controlo positivo do estojo de ácido lipotecóico de uma bactéria Gram-positiva.

Exemplo 7 - Teste de Pirogénios do Invento Utilizando Células Crio-preservadas A suspensão celular (p.ex., 1 milhão de PBMC ou células monocíticas) no plasma e dimetilsulfóxido (ou em sangue completo e dimetilsulfóxido) é adicionada a cada poço de uma placa de polipropileno de 96 poços com poços de 250 1 de fundo redondo, que é então selada e crio-preservada. 37 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ

No dia do teste, a placa é descongelada, colocada à temperatura ambiente, o selo removido e a inserção de 96 poços empurrada firmemente para a posição correcta. A inserção tem paredes de polipropileno e um fundo plano que é uma barreira à passagem de células e não de líquidos. O DMSO é lavado das células através de enchimento da inserção com meio fresco e aspiração do meio para cima e para baixo para misturar as soluções acima e abaixo da barreira de células antes da aspiração e descarte da solução acima da barreira de células. Ao repetir este passo de lavagem 5 vezes, as células são lavadas até ficarem essencialmente livres de DMSO e são mantidas num volume conhecido de meio fresco. A amostra de teste ou padrão e mais meio fresco são adicionados à inserção e, através da aspiração desta solução para cima e para baixo para misturar as soluções acima e abaixo da barreira de células, permite-se que o pirogénio na amostra ou padrão (de pirogénio) aceda às células. A placa é incubada a 37±1°C, em dióxido de carbono gasoso a 5% em ar húmido durante 16-24 horas. Durante a incubação, as células assentam permitindo que as células contactem umas com as outras o que facilita a libertação de IL-6 estimulada com pirogénio. No final do período de incubação, as soluções acima e abaixo da barreira de células são cuidadosamente misturadas através de aspiração da solução acima da barreira de células para cima e para baixo, antes de uma alíquota de meio condicionado pelas células ser tomada para ensaio de IL-6.

Os PBMC crio-preservados são vantajosos porque podem ser facilmente enviados em gelo seco para todo o mundo. Ao contrário do poliestireno, o polipropileno resiste ao azoto líquido sem rachar. À chegada, os PBMC só precisam de ser descongelados e lavados do DMSO para estarem prontos a ser utilizados num teste, em conjunto com a inserção da placa proporcionada. Ao enviar as células a um número óptimo por poço e utilizando as células em conjunto com a inserção da placa, é proporcionado um estojo de teste melhorado ao utilizador final. Com um estojo convencional, as células são 38 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ enviadas num tubo e, uma vez descongeladas, têm de ser lavadas através de centrifugação, que sedimenta as células, permitindo que se dispersem em meio limpo. Habitualmente as células são lavadas duas ou mais vezes deste modo. Depois as células têm de ser contadas e ressuspensas à densidade celular requerida antes de poderem ser dispensadas nos poços. 0 teste de pirogénios do presente invento é muito menos trabalhoso, consome menos tempo e é muito menos traumático para as células em comparação com os testes convencionais que podem resultar em perda de células, activação e morte celular.

Quando se introduzem os elementos do presente invento ou da concretização ou concretizações preferidas deste, os artigos "um", "uma", "o", "a" e "referido", "referida" destinam-se a significar que existe um ou mais dos elementos. Os termos "compreendendo", "incluindo" e "possuindo" destinam-se a ser inclusivos e significam que pode haver elementos adicionais para além dos elementos listados. Uma vez que podem ser feitas várias alterações nos métodos e composições acima sem sair do âmbito do invento, pretende-se que toda a matéria contida na descrição acima deva ser interpretada como ilustrativa e não no sentido limitativo.

Aspectos do invento 1. Método de detecção de pirogénios sem serem endotoxinas numa amostra compreendendo os passos de: combinação de um reagente contendo monócitos e a amostra a testar num primeiro sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno, em que o reagente contendo monócitos compreende células mononucleares de sangue periférico ou células da linha celular monocítica, está em contacto com a referida superfície, e está presente no referido sistema de ensaio numa densidade celular elevada; incubação do reagente contendo monócitos e a amostra, em que o reagente contendo monócitos produz uma citocina ou um mediador endógeno da resposta inflamatória; transferência do conteúdo do primeiro sistema de ensaio para um segundo sistema de ensaio que compreende pelo menos uma 39 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ superfície tratada com um anticorpo para uma citocina ou um mediador endógeno da resposta inflamatória; e ensaio do segundo sistema de ensaio quanto à presença da citocina ou mediador endógeno ligados ao anticorpo na superfície; em que um nível elevado de citocina ou mediador endógeno ligados à superfície indica a presença de pirogénios na amostra testada. 2. Método de detecção de pirogénios sem serem endotoxinas num produto médico administrado parentericamente compreendendo os passos de: combinação de um reagente contendo monócitos e o produto médico a testar num primeiro sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno, em que o reagente contendo monócitos compreende sangue completo e está em contacto com a referida superfície; incubação do reagente contendo monócitos e o produto médico, em que o reagente contendo monócitos produz IL-6; transferência do conteúdo do primeiro sistema de ensaio para um segundo sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para IL-β; e ensaio do segundo sistema de ensaio quanto à presença de IL-6 ligada ao anticorpo na superfície; em que um nível elevado de IL-6 ligada à superfície indica a presença de pirogénios no produto médico testado. 3. Método de detecção de pirogénios sem serem endotoxinas num produto médico administrado parentericamente compreendendo os passos de: combinação de um reagente contendo monócitos e o produto médico a testar num sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno e pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para IL-6, em que o reagente contendo monócitos compreende sangue completo e está em contacto com a referida superfície compreendendo polipropileno; e ensaio do sistema de ensaio quanto à presença de IL-6 ligada ao anticorpo na superfície; em que um nível elevado de IL-6 ligada à superfície indica a presença de pirogénios no produto médico testado. 40 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ 4. Método de cultura de células contidas num reagente contendo monócitos para utilização num ensaio de pirogénios sem serem endotoxinas compreendendo o passo de: combinação do reagente contendo monócitos e uma amostra a testar num sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície compreendendo polipropileno, em que o reagente contendo monócitos compreende células mononucleares de sangue periférico ou células da linha celular monocítica, está em contacto com a referida superfície, e está presente no referido sistema de ensaio numa densidade celular elevada. 5. Método do aspecto 4 em que o sistema de ensaio compreende pelo menos um poço de microtitulação com um formato tal que o reagente contendo monócitos está concentrado em comparação com um poço de microtitulação de fundo plano, em que pelo menos uma superfície do referido poço compreende polipropileno, e o reagente contendo monócitos está presente nesse poço numa densidade celular elevada. 6. Método do aspecto 1 ou 2 em que pelo menos um dos primeiro e segundo sistemas de ensaio inclui pelo menos um poço de microtitulação, e a(s) superfície(s) é(são) pelo menos uma porção do interior do poço de microtitulação. 7. Método do aspecto 3 ou 4 em que o sistema de ensaio inclui pelo menos um poço de microtitulação, e a(s) superfície(s) é(são) pelo menos uma porção do interior do poço de microtitulação. 8. Método de qualquer um dos aspectos 5-7 em que o poço tem um formato tal que o reagente contendo monócitos está concentrado para proporcionar maior contacto célula a célula em comparação com um poço de microtitulação de fundo plano. 9. Método de qualquer um dos aspectos 5-7 em que o poço de microtitulação compreende um topo aberto, uma região superior que se estende para baixo desde o topo aberto, e uma parede de fundo de diâmetro afilado desde uma localização acima do ponto mais baixo até ao ponto mais baixo. 10. Método de qualquer um dos aspectos 5-7 em que o poço de microtitulação compreende um topo aberto, uma região 41 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ superior que se estende para baixo desde o topo aberto possuindo uma extremidade superior e uma extremidade inferior, e uma região de fundo possuindo uma extremidade superior e um ponto mais baixo, a região de fundo estendendo-se desde a extremidade inferior da região superior e mais rapidamente afilada em diâmetro do que a região superior desde a extremidade superior da região inferior no sentido do ponto mais baixo. 11. Método do aspecto 9 em que a parede de fundo do referido poço de microtitulação é não planar, curva, parabólica ou estendendo-se para baixo. 12. Método de qualquer um dos aspectos 5-7 em que os lados do referido poço de microtitulação são inclinados para dentro. 13. Método do aspecto 5 em que o sistema de ensaio compreende pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para uma citocina, e a superfície sobre a qual o anticorpo é aplicado é pelo menos uma porção do interior do referido poço de microtitulação. 14. Método do aspecto 13 em que o anticorpo é um anticorpo para um mediador endógeno da resposta inflamatória. 15. Método do aspecto 14 em que o mediador endógeno é endotelina. 16. Método do aspecto 5 compreendendo ainda o passo de ensaio do sistema de ensaio quanto à presença de citocina ou mediador endógeno ligados ao anticorpo na superfície, em que um nível elevado de citocina ou mediador endógeno ligados à superfície indica a presença de pirogénios na amostra testada. 13 ou 16 em consiste em (IL-lra), e factor de 17. Método de qualquer um dos aspectos 1, que a citocina é seleccionada do grupo que interleucina-1 (IL-1), interleucina-lra interleucina-β (IL-6), interleucina-8 (IL-8), necrose tumoral (TNF ). 18. Método do aspecto 17 em que a citocina é IL-6. 42 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ 19. Método de qualquer uma dos aspectos 1-18 em que o anticorpo é um anticorpo policlonal. 20. Método de qualquer um dos aspectos 1-18 em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal. 21. Método de qualquer uma dos aspectos 1-20 em que o(s) sistema(s) de ensaio é(são) um ensaio imunossorvente ligado a enzimas colorimétrico (ELISA), um imunoensaio marcado radioactivamente, ou um imunoensaio marcado com fluorescência. 22. Método de qualquer um dos aspectos 1 ou 4-21 em que a linha celular monocitica compreende uma linha celular monocitica humana. 23. Método do aspecto 22 em que a linha celular monocitica é MONOMAC-6, THP-1 ou 28SC. 24. Método de qualquer um dos aspectos 1 e 4-21 em que a linha celular monocitica compreende uma linha celular possuindo CD14 endógeno e receptores semelhantes a Toll ou que foi transfectada com CD14 e/ou receptores semelhantes a Toll e/ou genes repórter para mediadores inflamatórios ou pirogénicos. 25. Método de qualquer um dos aspectos 1 e 4-24 em que a amostra é um produto médico administrado parentericamente. 26. Método de qualquer um dos aspectos 2, 3 e 25 em que 0 produto médico administrado parentericamente é seleccionado do grupo que consiste num produto sanguíneo, uma solução de diálise, uma vacina e um expansor de plasma. 27. Método de qualquer um dos aspectos 1 e 4-26 em que o reagente contendo monócitos está presente no referido sistema de ensaio numa densidade celular de pelo menos cerca de 250 000, 500 000, 600 000, 700 000, 800 000, 900 000, 1 000 000, 1 100 000, 1 200 000, 1 300 000, 1 400 000, 1 500,000, 1 600 000, 1 700 000, 1 800 000, 1 900 000 ou 2 000 000 células por poço. 43 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ 28. Método de qualquer um dos aspectos 1 e 4-27 em que as células mononucleares de sangue periférico compreendem células mononucleares de sangue periférico humanas. 29. Método de qualquer um dos aspectos 2, 3, 6-12, 19-21 e 26 em que o reagente contendo monócitos compreende adicionalmente um diluente. 30. Método da reivindicação 29 em que o diluente é meio RPMI . 31. Método de qualquer um dos aspectos 2, 3, 6-12, 19- 21, 26, 29 e 30 em que o reagente contendo monócitos compreende adicionalmente um anticoagulante. 32. Método de qualquer um dos aspectos 2, 3, 6-12, 19- 21, 26 e 29-31 em que o sangue completo compreende sangue completo humano. 33. Método de qualquer um dos aspectos 2, 3, 6-12, 19- 21, 26 e 29-31 em que o reagente contendo monócitos está presente no referido sistema de ensaio numa densidade celular superior a cerca de 100 000, 200 000, 210 000, 220 000, 230 000, 240 000, 250 000, 260 000, 270 000, 280 000, 290 000, 300 000, 310 000, 320 000, 330 000, 340 000, 350 000, 360 000, 370 000, 380 000, 390 000 ou 400 000 células mononucleares de sangue periférico por poço. 34. Estojo de diagnóstico compreendendo: uma placa de microtitulação compreendendo uma pluralidade de poços de microtitulação com um formato tal que as células contidas em cada poço estão concentradas em comparação com um poço de microtitulação de fundo plano, uma superfície do referido poço compreendendo polipropileno; e um reagente contendo monócitos crio-preservados que está contido nos poços da referida placa, em que o reagente contendo monócitos compreende células mononucleares de sangue periférico crio-preservadas ou células da linha celular monocítica crio-preservadas, está em contacto com as superfícies dos referidos poços, e está presente no referido poço numa densidade celular elevada. 44 ΕΡ 2 360 479/ΡΤ 35. Estojo de diagnóstico compreendendo: um sistema de ensaio para detecção de pirogénios sem serem endotoxinas num produto médico administrado parentericamente, o referido sistema de ensaio compreendendo uma placa de microtitulação compreendendo uma pluralidade de poços de microtitulação com um formato tal que as células contidas em cada poço estão concentradas em comparação com um poço de microtitulação de fundo plano, uma superfície do referido poço compreendendo polipropileno; um reagente contendo monócitos crio-preservados que está contido nos poços da referida placa, em que o reagente contendo monócitos compreende sangue completo crio-preservado e está em contacto com as superfícies dos referidos poços; e um anticorpo para IL-6. 36. Estojo do aspecto 34 ou 35 em que o referido poço compreende ainda uma barreira que é impermeável a monócitos. 37. Estojo do aspecto 36 em que a referida barreira compreende uma membrana, uma grelha, um crivo ou uma peneira.

Lisboa, 2014-06-23

Claims (13)

1. ΕΡ 2 360 479/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Teste de pirogénios in vitro compreendendo os passos de: (a) combinação de um reagente contendo monócitos e uma amostra a testar num primeiro sistema de ensaio que inclui uma placa de microtitulação compreendendo uma pluralidade de poços de microtitulação com um formato tal que o reagente contendo monócitos está concentrado para proporcionar maior contacto célula a célula em comparação com um poço de microtitulação de fundo plano, em que a parede do fundo de cada poço de microtitulação é não planar, curva, parabólica ou se estende para baixo, e em que a superfície de cada poço de microtitulação compreende um revestimento de polipropileno ou a totalidade do poço de microtitulação é composta por polipropileno; (b) incubação do reagente contendo monócitos e a amostra, em que, quando a amostra compreende um pirogénio, o reagente contendo monócitos produz uma citocina ou um mediador endógeno da resposta inflamatória; (c) transferência do conteúdo do primeiro sistema de ensaio para um segundo sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para a citocina ou o mediador endógeno da resposta inflamatória; e (d) ensaio do segundo sistema de ensaio quanto à presença de citocina ou mediador endógeno ligados ao anticorpo na superfície, em que um nível elevado de citocina ou mediador endógeno ligados à superfície indica a presença de pirogénios na amostra testada.
2. 2. Teste de pirogénios in vitro compreendendo os passos de: (a) combinação de um reagente contendo monócitos e uma amostra a testar num primeiro sistema de ensaio que compreende (i) uma placa de microtitulação compreendendo uma pluralidade de poços de microtitulação, com um formato tal que o reagente contendo monócitos está concentrado para proporcionar maior contacto célula a célula em comparação com um poço de microtitulação de fundo plano, em que a parede do fundo de cada poço de microtitulação é não planar, curva, ΕΡ 2 360 479/ΡΤ 2/4 parabólica ou se estende para baixo, e em que a superfície de cada placa de microtitulação compreende um revestimento de polipropileno ou a totalidade do poço de microtitulação é composta por polipropileno e em que, quando a amostra compreende um pirogénio, o reagente contendo monócitos produz uma citocina ou um mediador endógeno da resposta inflamatória, e (ii) pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para a citocina ou o mediador endógeno da resposta inflamatória; (b) incubação do reagente contendo monócitos e a amostra; e (c) ensaio do sistema de ensaio quanto à presença de citocina ou mediador endógeno ligados ao anticorpo na superfície, em que um nível elevado da citocina ou do mediador endógeno ligados à superfície indica a presença de pirogénios na amostra testada.
3. 3. Teste de pirogénios in vitro da reivindicação 1 ou 2, em que a amostra é um produto farmacêutico, um nutriente ou um produto médico.
4. 4. Teste de pirogénios in vitro de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que a citocina ou o mediador endógeno da resposta inflamatória é uma citocina pró-inflamatória ou uma citocina Thl.
5. 5. Teste de pirogénios in vitro de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a citocina ou o mediador endógeno da resposta inflamatória é IL-2, IFN, IL-1, IL-lra, IL-6, IL-8, TNF- ou endotelina.
6. 6. Teste de pirogénios in vitro da reivindicação 1, em que os lados do referido poço de microtitulação são inclinados para dentro.
7. 7. Teste de pirogénios in vitro de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o reagente contendo monócitos compreende células mononucleares de sangue periférico ou células da linha celular monocítica, opcionalmente, em que a linha celular monocítica compreende uma linha celular monocítica humana seleccionada do grupo que consiste em: M0N0MAC-6, THP-1, 28SC, e uma linha celular possuindo CD14 endógeno e receptores semelhantes a Toll ou que foi ΕΡ 2 360 479/ΡΤ 3/4 transfectada com CD14 e/ou receptores semelhantes a Toll e/ou genes repórter para mediadores inflamatórios ou pirogénicos.
8. 8. Teste de pirogénios in vitro de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o reagente contendo monócitos compreende um número de células suficiente para proporcionar pelo menos ou cerca de 125 000 células por poço do primeiro sistema de ensaio.
9. 9. Estojo de diagnóstico para utilização no teste de pirogénios in vitro de qualquer das reivindicações precedentes compreendendo (i) um sistema de ensaio compreendendo uma placa de microtitulação compreendendo uma pluralidade de poços de microtitulação, cada poço com um formato tal que, quando um reagente contendo monócitos está presente nos poços de microtitulação, o reagente contendo monócitos está concentrado para proporcionar maior contacto célula a célula em comparação com um poço de fundo plano, em que a parede do fundo de cada poço de microtitulação é não planar, curva, parabólica ou se estende para baixo, e em que a superfície de cada poço compreendendo um revestimento de polipropileno ou a totalidade do poço é composta por polipropileno, e (ii) um reagente contendo monócitos crio-preservados compreendendo sangue completo crio-preservado, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) crio-preservadas ou células da linha celular monocítica crio-preservadas; e, em que ou o sistema de ensaio compreende adicionalmente pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para uma citocina ou um mediador endógeno de uma resposta inflamatória, ou o estojo compreende um segundo sistema de ensaio compreendendo pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para uma citocina ou um mediador endógeno de uma resposta inflamatória, em que a citocina ou o mediador endógeno é um que é produzido pelo reagente contendo monócitos.
10. 10. Estojo de diagnóstico da reivindicação 9, em que a citocina ou o mediador endógeno de uma resposta inflamatória é IL-2, IFN, IL-1, IL-lra, IL-6, IL-8, TNF- ou endotelina.
11. 11. Estojo de diagnóstico da reivindicação 9, em que cada poço de microtitulação da placa de microtitulação ΕΡ 2 360 479/ΡΤ 4/4 compreende monócitos crio-preservados, opcionalmente no número óptimo de células por poço.
12. 12. Estojo de diagnóstico da reivindicação 9, em que as células mononucleares de sangue periférico crio-preservadas ou células da linha celular monocítica crio-preservadas estão presentes num poço da placa de microtitulação com uma densidade celular de pelo menos cerca de 250 000 células por poço.
13. 13. Estojo de diagnóstico da reivindicação 9, em que o sangue completo crio-preservado está presente num poço da placa de microtitulação com uma densidade celular de pelo menos cerca de 100 000 PBMC por poço. Lisboa, 2014-06-23