PT2271360E

PT2271360E - Vacina

Info

Publication number: PT2271360E
Application number: PT97324917T
Authority: PT
Inventors: William Ripley Ballou; Emmanuel Jules Hanon
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2009-04-16
Publication date: 2015-12-07
Also published as: RS54306B1; KR20110009157A; EP2612680A1; ES2678694T3; JP2011516596A; EA201001479A1; ES2553113T3; CN102099052A; IL208651A0; JP6009007B2; ZA201007331B; CY1116904T1; EP2612680B1; WO2009127676A1; SI2271360T1; BRPI0910963A2; AU2009237647A1; US20120164178A1; CA2720961A1; HRP20151124T1

Description

DESCRIÇÃO "VACINA"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a composições de vacina e imunogénicas melhoradas e à sua utilização em medicina. Em particular, a invenção refere-se a formulações de vacinas ou imunogénicas que compreendem um adjuvante de emulsão de óleo em água e à sua utilização em medicina, em particular à sua utilização para aumentar as respostas imunes a vários antigénios incluindo antigénios de S. pneumoniae, e a métodos de preparação, em que a emulsão de óleo em água compreende um tocol, um óleo metabolizável e um agente emulsionante.

ANTECEDENTES TÉCNICOS São sempre necessárias novas composições ou vacinas com uma imunogenicidade melhorada. Como uma estratégia, têm sido utilizados adjuvantes para testar e melhorar a resposta imune gerada contra qualquer antigénio e/ou reduzir a reatogenicidade/toxicidade no hospedeiro.

As emulsões de óleo em água per se são bem conhecidas na técnica e foram sugeridas como sendo úteis como composições adjuvantes (documentos EP 399843; WO 95/17210) . 0 documento WO95/17210 divulga emulsões de óleo em água que compreendem desde 2 a 10% de esqualeno, desde 2 a 10% de alfa tocoferol e desde 0,3 a 3% de tween 80 e sua utilização isolada ou em combinação com QS21 e/ou 3D-MPL. O documento W099/12565 divulga composições de emulsões de óleo em água que compreendem um óleo metabolizável, uma saponina e um esterol. As emulsões de óleo em água compreendem ainda 3D-MPL. O documento W099/11241 divulga emulsões de óleo em água que compreendem óleo metabolizável e uma saponina, em que o óleo e a saponina estão presentes numa proporção de entre 1:1 e 200:1. O documento WO 2007/071707 divulga uma emulsão de óleo em água que compreende um antigénio de S. pneumoniae não conjugado.

Existe ainda uma necessidade de composições de vacina e imunogénicas melhoradas que proporcionem uma resposta imune adequada e sejam menos reatogénicas no hospedeiro.

DECLARAÇÃO DA INVENÇÃO A presente requerente constatou que se podem utilizar composições de vacina ou imunogénicas que compreendem menores quantidades de cada componente da emulsão de óleo em água, ao mesmo tempo que se mantém uma resposta imune comparável contra um antigénio ou composição antigénica na referida composição. Isto tem a vantagem de manter o nivel de imunogenicidade contra um antigénio enquanto a reatogenicidade no recetor hospedeiro é reduzida.

Por conseguinte, no primeiro aspeto da presente invenção é proporcionada uma composição imunogénica que compreende uma PhtD pneumocócica não conjugada e uma pneumolisina pneumocócica não conjugada, e uma composição adjuvante que compreende uma emulsão de óleo em água, em que a referida emulsão de óleo em água consiste de 0,5 - 10 mg de óleo metabolizável, 3-9 mg de tocol e 0,1-4 mg de agente emulsionante por dose humana e o óleo e agente emulsionante estão num veiculo aquoso, em que o volume da dose se situa entre 0,4 e 1,5 mL.

Num outro aspeto da invenção é proporcionada a utilização de uma composição imunogénica da invenção no fabrico de uma composição imunogénica para o tratamento, alivio ou prevenção de infeção ou doença pneumocócica.

Num outro aspeto, é proporcionado um método ou utilização como definido acima, para proteção contra uma infeção ou doença provocada por um agente patogénico que é uma variante do agente patogénico a partir do qual é derivado o antigénio na composição imunogénica. Noutra forma de realização, é proporcionado um método ou utilização como definido acima para proteção contra infeções ou doenças provocadas por um agente patogénico que compreende um antigénio que é uma variante desse antigénio na composição imunogénica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Ensaio clínico: títulos médios geométricos (GMT) para o anticorpo anti-HA em diferentes pontos temporais (coorte de ATP para a imunogenicidade).

Figura 2: Ensaio clínico: taxa de seroproteção (SPR) para o título de anticorpo HI com um intervalo de confiança de 95% no dia 0 e dia 21 (coorte de ATP para a imunogenicidade).

Figura 3: Ensaio clínico: taxa de seroconversão (SCR) para o título de anticorpo HI com um intervalo de confiança de 95% no dia 21 (coorte de ATP para a imunogenicidade).

Figura 4: Ensaio clínico: fator de seroconversão (SCF) para o titulo de anticorpo HI com um intervalo de confiança de 95% no dia 21 (coorte de ATP para a imunogenicidade).

Figura 5: Estudo em ratinhos: Teste de inibição de hemaglutinina (GMT +/- IC95) em ratinhos BALB/c preparados com estirpes heterossubtípicas (gama de dose de AS03). Figura 5A: Títulos de Hl anti-A/Nova Caledónia/20/99; Figura 5B: Títulos de Hl anti-A/Panamá/2007/99. Figura 5C: Títulos de Hl anti-B/Shandong/7/97 .

Figura 6: Estudo em ratinhos: Teste de inibição de hemaglutinina (GMT +/- IC95) em ratinhos C57BI/6 preparados com estirpes heterossubtípicas (gama de dose de AS03).

Figura 7: Estudo em ratinhos: Resposta imune celular (célula T CD4+) em PBMC de ratinhos C57BI/6 preparados com estirpes heterossubtipicas (gama de dose de AS03).

Figura 8: Estudo em ratinhos: Resposta imune celular (célula T CD4+) em PBMC de ratinhos C57BI/6 preparados com estirpes heterossubtipicas e imunizados com uma dose baixa de antigénio (0,5 yg) com adjuvante na gama de dose de AS03.

Figura 9: Estudo em ratinhos: Títulos ELISA para Ig sérica específica para H5N1 (A e B) e respostas isotípicas de IgGl (C e D) e IgG2b (E e F) anti-H5Nl no dia 14 após imunização (GMT +/-IC95) para duas doses de antigénio diferentes: 1,5 yg (A, C e E) ou 0,38 yg (B, D e F)

Figura 10: Estudo em ratinhos: Teste de inibição da hemoglut inação (GMT +/- IC95) no dia 21 após imunização (GMT +/- IC95) para duas doses de antigénio diferentes: 1,5 yg (A) ou 0,38 yg (B) .

Figura 11: Estudo em ratinhos: Resposta imune celular (célula T CD4+) em ratinhos C57BI/6 não modificados imunizados com diferentes doses de vacina contra ο H5N1 (1,5 ou 0,38 yg)

com adjuvante na gama de dose de AS03: (A) 1,5 yg de Ag de HA (antigénio) ou (B) 0,38 yg Ag de HA (antigénio).

Figura 12: Estudo em porcos. Teste de inibição de hemaglutinina (GMT +/- IC95) em porcos preparados com estirpes homólogas (gama de dose de AS03).

Figura 13: Estudo em ratinhos. Resposta imune humoral medida por ELISA em ratinhos C57bl imunizados com 3 pg de cada de dPly, PhtD e Proteína D em adjuvante AS03 contendo 250, 125 ou 62,5 pg de SB62.

Figura 14: Estudo em ratinhos. Resposta imune humoral medida por ELISA em ratinhos C57bl imunizados com 6, 3 ou 1,5 pg de dPly, PhtD e Proteína D em adjuvante AS03 contendo 250, 125 ou 62,5 pg de SB62.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A requerente pretende que os termos "compreendendo", "compreendem" e "compreende" aqui sejam opcionalmente substituíveis pelos termos "consistindo de", "consistem de" e "consiste de", respetivamente, em cada caso.

As formas de realização aqui relacionadas com as "composições de vacina" da invenção são também aplicáveis às formas de realização relacionadas com as "composições imunogénicas" da invenção, e vice-versa.

Componente de emulsão de óleo em água A composição adjuvante da invenção compreende um adjuvante de emulsão de óleo em água, de um modo preferido, a referida emulsão compreende um óleo metabolizável numa quantidade de 0,5-10 mg, um tocol numa quantidade de 0,5 - 11 mg e um agente emulsionante numa quantidade de 0,4 - 4 mg e que tem gotículas de óleo das quais, pelo menos, 70% em intensidade têm diâmetros de menos de 1 pm.

De modo que qualquer composição de óleo em água seja adequada para administração a humanos, a fase oleosa do sistema de emulsão tem que compreender um óleo metabolizável. O significado da expressão óleo metabolizável é bem conhecido na técnica. Metabolizável pode ser definido como 'sendo capaz de ser transformado por metabolismo' (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25a edição (1974)). O óleo pode ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo sintético, o qual não seja tóxico para o recetor e seja capaz de ser transformado por metabolismo. As nozes, sementes e grãos são fontes comuns de óleos vegetais. Os óleos sintéticos fazem também parte desta invenção e podem incluir óleos comercialmente disponíveis, tais como NEOBEE® e outros. Um óleo metabolizável particularmente adequado é o esqualeno. Esqualeno (2,6,10,15,19,23-Hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosa-hexeno) é um óleo insaturado que se encontra em grandes quantidades no óleo de fígado de tubarão, e em menores quantidades no azeite, óleo de gérmen de trigo, óleo de farelo de arroz e levedura, e é um óleo particularmente preferido para ser utilizado nesta invenção. O esqualeno é um óleo metabolizável em virtude do facto de ser um intermediário na biossíntese do colesterol (Merck Index, 10a Edição, entrada n2 8619) .

De modo adequado, o óleo metabolizável está presente na composição adjuvante numa quantidade de 0,5-10 mg, de um modo preferido, 1-10, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7 ou 5-6 mg (e. g.r 2-3, 5-6, ou 9-10 mg), especif icamente, 5,35 mg ou 2,14 mg. Numa outra forma de realização da invenção, o óleo metabolizável está presente na composição de vacina (ou imunogénica) numa quantidade de 0,5-10 mg, de um modo preferido, 1-10, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7 ou 5-6 mg (e. g. 2-3, 5-6 ou 9-10 mg), especificamente, 5,35 mg ou 2,14 mg. A quantidade de óleo metabolizável na composição de vacina ou imunogénica pode ser expressa como uma percentagem da composição total. De modo adequado o óleo metabolizável está presente na composição de vacina numa quantidade de 0,5% a 2%, de um modo preferido, 0,25-2, ou 0,25-1,75, ou 0,5-1,65, ou 0,6-1,5, ou 0,8-1,4 ou 1-1,25 % (v/v) de óleo no volume total da composição.

Noutra forma de realização especifica, o óleo metabolizável está presente numa quantidade final de cerca de 1,25% do volume total da composição de vacina (ou imunogénica). Noutra forma de realização especifica, o óleo metabolizável está presente numa quantidade final de 0,25% (v/v) do volume total da composição. A titulo de esclarecimento, as concentrações dadas em v/v podem ser convertidas em concentração em p/v aplicando o seguinte fator de conversão: uma concentração de esqualeno de 5% (v/v) é equivalente a uma concentração de esqualeno de 4,28% (p/v). A emulsão de óleo em água compreende um tocol. Os tocóis são bem conhecidos na técnica e são descritos no documento EP0382271. De modo adequado, o tocol é alfa-tocoferol ou um seu derivado, tal como succinato de alfa-tocoferol (também conhecido como succinato de vitamina E) . De um modo preferido, o referido tocol está adequadamente presente na composição adjuvante numa quantidade 3-9, 4-8, 5-7, 5-6 (e. g., 5-6, 2,5-3,5 ou 1-3 mg).

Numa forma de realização especifica, o tocol está presente numa quantidade de 5,94 mg ou 2,38 mg. Numa outra forma de realização, de um modo preferido, o referido tocol está adequadamente presente na composição de vacina (ou imunogénica) numa quantidade 3-9, 4-8, 5-7, 5-6 (e. g.r 5-6, 2,5-3,5 ou 1-3 mg). Numa forma de realização especifica, o tocol está presente numa quantidade de 5,94 mg ou 2,38 mg. A quantidade de tocol pode ser expressa como uma percentagem do volume total da composição de vacina ou imunogénica. De modo adequado, o tocol está presente na composição de vacina numa quantidade de 0,25% a 2% (v/v) do volume total da composição imunogénica, de um modo preferido o 0,25-2 compreende 0,25-2, ou 0,25-1,75, ou 0,5-1,65, ou 0,6-1,5, ou 0,8-1,4 ou 1-1,25 % (v/v) de tocol do volume total.

De um modo preferido, o tocol está presente numa quantidade de entre 0,2% e 2% (v/v) do volume total da composição de vacina (ou imunogénica) , de um modo mais preferido numa quantidade de 1,25% (v/v) num volume de dose de 0,5 mL.

Numa forma de realização especifica, o tocol está presente numa quantidade final de cerca de 1,25% do volume total da composição de vacina ou imunogénica. Noutra forma de realização especifica, o tocol está presente numa quantidade final de 0,25% (v/v) do volume total ou 1,25% (v/v) num volume de dose de 0,5 mL ou 0,9% (v/v), num volume de dose de 0,7 mL, ou 0,5% (v/v) numa dose de 0,5 mL ou 0,35-0,37 %, de um modo preferido, 0,36% numa dose de vacina ou imunogénica de 0,7 mL. A título de esclarecimento, as concentrações dadas em v/v podem ser convertidas em concentração em p/v aplicando o seguinte fator de conversão: uma concentração de alfa-tocoferol de 5% (v/v) é equivalente a uma concentração de alfa-tocoferol de 4,8% (p/v) . A emulsão de óleo em água compreende ainda um agente emulsionante. 0 agente emulsionante pode ser adequadamente monooleato de polioxietileno sorbitano. Numa forma de realização particular o agente emulsionante pode ser selecionado do grupo que compreende: Polissorbato® 80 ou Tween® 80. O referido agente emulsionante está adequadamente presente na composição adjuvante numa quantidade de 0,3-4, 0,4-3 ou 2-3 mg (e. g., 0,4-1,2, 2-3) de agente emulsionante. Numa forma de realização específica o agente emulsionante está presente numa quantidade de 0,97 mg ou 2,425 mg.

Além disso, o referido agente emulsionante está adequadamente presente na composição de vacina ou imunogénica numa quantidade de 0,3-4, 0,4-3 ou 2-3 mg (e. g., 0,4-1,2, 2-3) de agente emulsionante. Numa forma de realização específica, o agente emulsionante está presente numa quantidade de 0,97 mg ou 2,425 mg. A quantidade de agente emulsionante pode ser expressa como uma percentagem do volume total da composição de vacina ou imunogénica. De modo adequado, o agente emulsionante está presente na composição de vacina (ou imunogénica) numa quantidade 0,125-0,8% (v/v) do volume total da composição, de um modo preferido, a 0,08-0,05, ou 0,1-0,7, ou 0,2-0,6, ou 0,25-0,55, ou 0,3-0,52 ou 0,4-0,5% (v/v) do volume total. Numa forma de realização específica, o agente emulsionante está presente numa quantidade de 1%, 0,5% ou 0,2% (v/v) do volume total da composição de vacina ou imunogénica. A título de esclarecimento, as concentrações dadas em v/v podem ser convertidas em concentração em p/v aplicando o seguinte fator de conversão: uma concentração de polissorbato 80 de 1,8% (v/v) é equivalente a uma concentração de polissorbato 80 de 1,91% (p/v).

Numa forma de realização específica, um volume de dose de vacina ou imunogénica de 0,5 mL contém 0,45% (v/v) de Tween 80, e um volume de dose de 0,7 mL contém 0,315% (v/v) de Tween 80. Noutra forma de realização específica, uma dose de 0,5 mL contém 0,18% (v/v) de agente emulsionante e uma dose de composição de vacina ou imunogénica de 0,7 mL contém 0,126% (v/v) de agente emulsionante.

Através da expressão "dose humana" entende-se uma dose que está num volume adequado para utilização humana. Em geral, este situa-se entre 0,25 e 1,5 mL. Numa forma de realização, uma dose humana é 0,5 mL. Numa outra forma de realização, uma dose humana é superior a 0,5 mL, por exemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 mL.

Numa outra forma de realização, uma dose humana é entre 1 mL e 1,5 mL. Noutra forma de realização, em particular quando a composição imunogénica é para a população pediátrica, uma dose humana pode ser inferior a 0,5 mL tal como entre 0,25 e 0,5 mL. A invenção é caracterizada por cada um ou todos os componentes individuais do adjuvante na composição imunogénica estar/estarem a um nível mais baixo do que anteriormente pensado útil e é/são tipicamente como especificados acima. As composições particularmente adequadas compreendem os seguintes componentes adjuvantes nas seguintes quantidades e estão num volume final de dose humana de 0,5 mL:

Tabela 1

Adjuvante Adjuvante Adjuvante Adjuvante Adjuvante Adjuvante Adjuvante

A B E F C G D

emulsão de 125 pL 100 pL 83, 33 pL 62,5 pL 50 pL 31,25 pL 25 pL o/a

Componentes:

Tocoferol 5,94 mg 4,28 mg 3,57 mg 2,68 mg 2,38 mg 1,34 mg 1,19 mg

Esqualeno 5,35 mg 4,75 mg 3,96 mg 2,97 mg 2,14 mg 1,49 mg 1,07 mg

Polissorbato 2,43 mg 1,94 mg 1,62 mg 1,21 mg 0,97 mg 0,61 mg 0,48 mg 80 A invenção proporciona ainda uma composição adjuvante que compreende os componentes individuais como definidos acima e na quantidade definida acima, por exemplo mas não exclusivamente como se ilustra na Tabela 1. Tipicamente, uma tal composição adjuvante estará num volume adequado de dose humana. Nos casos em que o adjuvante está numa forma liquida para ser combinada com uma forma liquida de uma composição antigénica, a composição adjuvante estará num volume adequado de dose humana que é uma fração do volume final pretendido da dose humana, tal como, por exemplo, aproximadamente metade do volume final pretendido da dose humana, por exemplo um volume de 350 pL para uma dose humana pretendida de 0,7 mL, ou um volume de 250 pL para uma dose humana pretendida de 0,5 mL. A composição adjuvante é diluída quando combinada com a composição de antigénio para proporcionar a dose humana final da vacina. O volume final dessa dose variará evidentemente em função do volume inicial da composição adjuvante e do volume de composição de antigénio adicionada à composição adjuvante. Numa forma de realização alternativa, é utilizado adjuvante liquido para reconstituir uma composição de antigénio liofilizada. Nesta forma de realização, o volume adequado de dose humana da composição adjuvante é aproximadamente igual ao volume final da dose humana. A composição adjuvante liquida é adicionada ao frasquinho que contém a composição de antigénio liofilizada. A dose humana final pode variar entre 0,5 e 1,5 mL. O método de produção de emulsões de óleo em água é bem conhecido do especialista na técnica. Em geral, o método compreende misturar a fase oleosa contendo tocol com um tensioativo tal como uma solução de PBS/TWEEN80™, seguida de homogeneização utilizando um homogeneizador; seria evidente para um especialista na técnica que um método que compreenda a passagem da mistura duas vezes através de uma agulha de seringa seria adequado para homogeneizar pequenos volumes de liquido. De igual modo, o processo de emulsificação num microfluidificador (máquina M110S Microfluidics, máximo de 50 passagens, durante um período de 2 minutos a uma pressão máxima de entrada de 6 bar (pressão de saída de cerca de 850 bar)) poderia ser adaptado pelo especialista na técnica para produzir volumes menores ou maiores de emulsão. A adaptação poderia ser conseguida por experimentação de rotina compreendendo a medição da emulsão resultante até ser conseguida uma preparação com gotículas de óleo do diâmetro necessário.

Numa emulsão de óleo em água, o óleo e o agente emulsionante devem estar num veículo aquoso. O veículo aquoso pode ser, por exemplo, solução salina tamponado com fosfato.

De um modo preferido, os sistemas de emulsão de óleo em água da presente invenção têm um pequeno tamanho de goticula de óleo na gama sub-micrométrica. De modo adequado, os tamanhos de goticula situar-se-ão na gama 120 a 750 nm, de um modo mais preferido tamanhos desde 120 a 600 nm de diâmetro. De um modo muito preferido, a emulsão de óleo em água contém goticulas de óleo das quais, pelo menos, 70% em intensidade são menos de 500 nm de diâmetro, de um modo mais preferido pelo menos 80% em intensidade são menos de 300 nm de diâmetro, de um modo mais preferido pelo menos 90% em intensidade situam-se na gama de 120 a 200 nm de diâmetro. O tamanho de goticula de óleo, i. e., diâmetro, de acordo com a presente invenção é dado pela intensidade. Existem várias formas de determinar o diâmetro do tamanho de goticulas de óleo pela intensidade. A intensidade é medida através da utilização de um instrumento calibrador, adequadamente através da dispersão de luz dinâmica, tal como o Malvern Zetasizer 4000 ou, de um modo preferido, o Malvern Zetasizer 3000HS. Um procedimento detalhado é dado no Exemplo II. 2. Uma primeira possibilidade consiste em determinar o diâmetro médio z, ZAD, por dispersão de luz dinâmica (PCS - Espetroscopia de correlação de fotões); este método dá adicionalmente o indice de polidispersidade (PDI), e o ZAD e PDI são calculadas com o algoritmo de valores acumulados. Estes valores não requerem o conhecimento do indice de refração de partículas. Um segundo meio consiste em calcular o diâmetro da goticula de óleo determinando a distribuição de tamanho de partícula total por outro algoritmo, o Contin, ou NNLS, ou o automático do "Malvern" (o algoritmo por defeito fornecido pelo instrumento calibrador). A maioria das vezes, como o índice de refração de partículas de uma composição complexa é desconhecido, apenas a distribuição de intensidade é tida em consideração, e se for necessário a média da intensidade com origem a partir desta distribuição.

Imunoestimulantes Opcionais

Numa forma de realização, a composição adjuvante compreende uma emulsão de óleo e água como aqui descrita. Numa outra forma de realização, a composição adjuvante pode compreender ainda um ou mais adjuvantes ou imunoestimulantes adicionais. Numa outra forma de realização, a composição adjuvante compreende opcionalmente um ou mais adjuvantes ou imunoestimulantes adicionais diferentes de QS21 e/ou MPL. 0 adjuvante adicional opcional é selecionado do grupo: uma saponina, lípido A ou um seu derivado, um oligonucleótido imunoestimulante, um fosfato de glucosaminida alquilo, um sal de metal, um agonista do recetor de tipo Toll ou as suas combinações. É preferido que o adjuvante seja um agonista do recetor de tipo Toll, em particular um agonista de um recetor de tipo Toll 2, 3, 4, 7, 8 ou 9, ou uma saponina. É mais preferido que o sistema adjuvante compreenda dois ou mais adjuvantes da lista acima. De um modo preferido, a combinações contêm um adjuvante saponina (em particular QS21) e/ou um agonista do recetor de tipo Toll 4, tal como 3D-MPL ou um agonista do recetor de tipo Toll 9, tal como um oligonucleót ido imunoestimulante contendo CpG. Outras combinações preferidas compreendem uma saponina (em particular QS21) e um agonista do recetor de tipo Toll 4, tal como uma saponina (em particular QS21) e um ligando do recetor de tipo Toll 4 tal como 3D-MPL ou um fosfato de glucosaminida alquilo.

Numa forma de realização, o adjuvante adicional é um ligando do recetor de tipo Toll (TLR) 4, de um modo preferido, um agonista, tal como um derivado de lípido A, em particular, o monofosforil lípido A ou mais particularmente monofosforil lípido A 3-desacilado (3 D - MPL). 0 3D-MPL encontra-se disponível sob a marca comercial MPL® da GlaxoSmithKline Biologicals North America e promove principalmente a respostas de células T CD4+ com um fenótipo IFN-g (Thl) . Este pode ser produzido de acordo com os métodos divulgados no documento GB 2220211 A. Quimicamente, é uma mistura de monofosforil lípido A 3-desacilado com 3, 4, 5 ou

6 cadeias aciladas. De um modo preferido, nas composições da presente invenção utiliza-se 3 D-MPL de partícula pequena. O 3D-MPL de partícula pequena tem um tamanho de partícula de tal forma que pode ser esterilizado por filtração através de um filtro de 0,22 pm. Tais preparações são descritas no Pedido

Internacional de Patente N2 WO 94/21292. São conhecidos derivados sintéticos de lípido A e pensa-se que sejam agonistas de TLR 4 incluindo, mas não se limitando a: OM174 (di-hidrogenofosfato de 2-desoxi-6-o-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-o-fosfοηο-β-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]-a-D-glucopiranosilo), (documento WO 95/14026) OM 294 DP 1,10-bis(di-hidrogenofosfato) de (3S,9R)-3-[ (R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol, (documentos WO99/64301 e WO 00/0462) OM 197 MP-Ac DP 1-di-hidrogenofosfato 10-(6-amino- hexanoato) de (3S-,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol, (documento WO 01/46127)

Outros ligandos de TLR4 que podem ser utilizados são os fosfatos de glucosaminida alquilo (AGP) tais como aqueles divulgados no documento WO9850399 ou documento US6303347 (os processos para preparação de AGP são também divulgados) , ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGP como divulgados no documento US6764840. Alguns AGP são agonistas de TLR4, e alguns são antagonistas de TLR4. Pensa-se que ambos sejam úteis como adjuvantes.

Outros ligandos de TLR-4 adequados, capazes de originar uma resposta de sinalização através de TLR-4 (Sabroe et al., JI 2003 p 1630-5) são, por exemplo, os lipopolissacáridos de bactérias gram-negat ivas e os seus derivados, ou os seus fragmentos, em particular um derivado de LPS não tóxico (tal como 3D-MPL). Outros agonistas de TLR adequados são: proteína de choque térmico (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 ou 90; Proteína A tensioativa, oligossacáridos de hialuronano, fragmentos de sulfato de heparano, fragmentos de fibronectina, péptidos de fibrinogénio e b-defensina-2, dipéptido de muramilo (MDP) ou proteína F do vírus sincial respiratório. Numa forma de realização, o agonista de TLR é HSP 60, 70 ou 90.

Os recetores de tipo Toll (TLR) são recetores transmembranares de tipo I, evolutivamente conservados entre insetos e humanos. Até à data foram identificados dez TLR (TLR 1-10) (Sabroe et al.r JI 2003 p 1630-5) . Os membros da família de TLR têm domínios extracelulares e intracelulares semelhantes; foi demonstrado que os seus domínios extracelulares têm sequências de repetição ricas em leucina, e os seus domínios intracelulares são semelhantes à região intracelular do recetor de interleucina-1 (IL-1R) . As células de TLR são expressas de modo diferenciado entre células imunes e outras células (incluindo células epiteliais vasculares, adipócitos, miócitos cardíacos e células epiteliais intestinais). O domínio intracelular dos TLR pode interagir com a proteína adaptadora Myd88, a qual possui também o domínio IL-1R na sua região citoplasmática, conduzindo à ativação de citocinas pelo NF-KB; esta via da Myd88 é uma via através da qual a libertação de citocinas é efetuada por ativação de TLR. A expressão principal de TLR é em tipos de células tais como células apresentadoras de antigénios (e. g. células dendríticas, macrófagos etc). A ativação de células dendríticas por estimulação através dos TLR leva à maturação das células dendríticas, e produção de citocinas inflamatórias, tal como IL-12. A investigação realizada até agora verificou que os TLR reconhecem diferentes tipos de agonistas, embora alguns agonistas sejam comuns a vários TLR. Os agonistas de TLR são predominantemente derivados de bactérias ou vírus, e incluem moléculas, tais como flagelina ou lipopolissacárido bacteriano (LPS).

Por "agonista de TLR" entende-se um componente que é capaz de originar uma resposta de sinalização através de uma via de sinalização de TLR, como um ligando direto ou indiretamente através da geração de ligandos endógenos ou exógenos (Sabroe et al. , JI 2003 p 1630-5) .

Noutra forma de realização são utilizados outros agonistas naturais ou sintéticos de moléculas de TLR como imunoestimulantes adicionais opcionais. Estes podem incluir, mas não se limitam aos agonistas para TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 e TLR9.

Numa forma de realização da presente invenção é utilizado um agonista de TLR que é capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-1 (Sabroe et al. , JI 2003 p 1630-5) . De modo adequado, o agonista de TLR capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-1 é selecionado de:

Lipopéptidos tri-acilados (LPs); modulina solúvel em fenol; LP de Mycobacterium tuberculose; S-(2,3-bis(palmitoiloxi)- (2-RS)-propil)-N-palmitoil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, tricloridrato (Pam3Cys) LP que mimetiza o terminal amino acetilado de uma lipoproteina bacteriana e OspA LP de Borrelia burgdorfei.

Numa forma de realização alternativa, é utilizado um agonista de TLR que é capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-2 (Sabroe et al. , JI 2003 p 1630-5) . De modo adequado, o agonista de TLR capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-2 é um ou mais de uma lipoproteina, um peptidoglicano, um lipopéptido bacteriano de M tuberculosis, B burgdorferi. T pallidum; peptidoglicanos de espécies incluindo Staphylococcus aureus; ácidos lipoteicóicos, ácidos manurónicos, porinas de Neisseria, fimbria bacteriana, fatores de virulência de Yersina, viriões de CMV, hemaglutinina de sarampo e zimosano de levedura.

Numa forma de realização alternativa é utilizado um agonista de TLR que é capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-3 (Sabroe et al. , JI 2003 pl630-5) .

De modo adequado, o agonista de TLR capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-3 é ARN de cadeia dupla (ARNds), ou ácido poliinosínico-policitidílico (Poli IC), um padrão de ácido nucleico molecular associado a infeção virai.

Numa forma de realização alternativa é utilizado um agonista de TLR que é capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-5 (Sabroe et al. , JI 2003 p 1630-5) . De modo adequado, o agonista de TLR capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-5 é flagelina bacteriana.

Numa forma de realização alternativa é utilizado um agonista de TLR que é capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-6 (Sabroe et al., JI 2003 pl630-5) .

De modo adequado, o agonista de TLR capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-6 é uma lipoproteína micobacteriana, LP di-acilado e modulina solúvel em fenol. Outros agonistas de TLR6 são descritos no documento W02003043572 .

Numa forma de realização alternativa é utilizado um agonista de TLR que é capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-7 (Sabroe et al. , JI 2003 p 1630-5) . De modo adequado, o agonista de TLR capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-7 é um ARN de cadeia simples (ARNss), loxoribina, um análogo de guanosina nas posições N7 e C8, ou um composto de imidazoquinolina, ou seu derivado. Numa forma de realização, o agonista de TLR é imiquimod. Outros agonistas de TLR7 são descritos no documento W002085905.

Numa forma de realização alternativa é utilizado um agonista de TLR que é capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-8 (Sabroe et al. , JI 2003 p 1630-5) . De modo adequado, o agonista de TLR capaz de originar uma resposta de sinalização através de TLR-8 é um ARN de cadeia simples (ARNss), uma molécula de imidazoquinolina com atividade antiviral, por exemplo, resiquimod (R848); resiquimod é também capaz de ser reconhecido pelo TLR-7. Outros agonistas de TLR-8 que podem ser utilizados incluem aqueles descritos no documento W02 004071459.

Os oligonucleótidos imunoestimulantes ou qualquer outro agonista do recetor de tipo Toll (TLR) 9 podem ser também utilizados. Os oligonucleótidos preferidos para serem utilizados em adjuvantes ou composições de vacina ou imunogénicas da presente invenção são oligonucleótidos contendo CpG, de um modo preferido, contendo dois ou mais motivos de dinucleótidos CpG separados por, pelo menos, três, de um modo mais preferido, pelo menos seis ou mais nucleótidos. Um motivo de CpG é um nucleótido de Citosina, seguido de um nucleótido de Guanina. Os oligonucleótidos de CpG da presente invenção são tipicamente desoxinucleótidos. Numa forma de realização preferida o internucleótido no oligonucleótido é fosforoditioato ou, de um modo mais preferido, uma ligação fosforotioato, embora as ligações fosfodiéster e outras internucleotidicas estejam no âmbito da invenção. Estão também incluídos no âmbito da invenção os oligonucleótidos com ligações internucleótido mistas. Os métodos de produção de oligonucleótidos de fosforotioato ou fosforoditioato são descritos nos documentos US5666153, US5278302 e WO95/26204.

Os exemplos de oligonucleótidos preferidos têm as seguintes sequências. As sequências contêm, de um modo preferido, ligações internucleotidicas modificadas com fosforotioato. OLIGO 1(SEQ ID N2:l): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID 14^:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

OLIGO 3 (SEQ ID N2:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC

ACG

OLIGO 4 (SEQ ID N2:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

OLIGO 5 (SEQ ID N2:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

OLIGO 6 (SEQ ID N2:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456)

Os oligonucleótidos de CpG alternativos podem compreender as sequências preferidas acima na medida em que têm supressões ou adições inconsequentes nas mesmas. Os oligonucleótidos de CpG utilizados na presente invenção podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, ver documento EP 468520) . Convenientemente, tais oligonucleótidos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador automático.

Por conseguinte, noutra forma de realização, a composição adjuvante compreende ainda um imunoestimulante adicional que é selecionado do grupo que consiste de: um agonista de TLR-1, um agonista de TLR-2, agonista de TLR-3, um agonista de TLR-4, agonista de TLR-5, um agonista de TLR-6, agonista de TLR-7, um agonista de TLR-8, agonista de TLR-9, ou uma sua combinação.

Outros imunoestimulantes preferidos para serem utilizados na presente invenção é Quil A e seus derivados. A Quil A é uma preparação de saponinas isolada a partir da árvore sul-americana Quilaja Saponaria Molina e foi descrita pela primeira vez como tendo atividade adjuvante por Dalsgaard et al. em 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlim, p 243-254). Foram isolados fragmentos purificados de Quil A por HPLC que retêm atividade adjuvante sem a toxicidade associada à Quil A (documento EP 0362278), por exemplo, QS7 e QS21 (também conhecido como QA7 e QA21) . A QS-21 é uma saponina natural derivada da casca de Quillaja saponaria Molina que induz células T CD8+ citotóxicas (CTLs), células Thl e uma resposta de anticorpos de IgG2a predominante e é uma saponina preferida no contexto da presente invenção.

Foram descritas formulações particulares de QS21 que são particularmente preferidas, estas formulações compreendem ainda um esterol (documento W096/33739) . Nos casos em que são incluídos esqualeno e uma saponina (opcionalmente QS21), é vantajoso incluir também um esterol (opcionalmente colesterol) à formulação já que isto permite uma redução do nível total de óleo na emulsão. Isto leva a um custo de fabrico reduzido, melhoria do conforto global da vacinação, e também a melhorias qualitativas e quantitativas das respostas imunes resultantes, tal como produção melhorada de IFN-γ. Por conseguinte, o sistema adjuvante da presente invenção compreende tipicamente uma proporção de óleo metabolizável: saponina (p/p) na gama de 200:1 a 300:1, a presente invenção pode ser também utilizada numa forma de "baixo teor em óleo" cuja gama opcional é de 1:1 a 200:1, opcionalmente 20:1 a 100:1, ou substancialmente 48:1, esta vacina retém as propriedades adjuvantes benéficas da totalidade dos componentes, com um perfil de reatogenicidade muito reduzido. Por conseguinte, algumas formas de realização têm uma proporção de esqualeno: QS21 (p/p) na gama de 1:1 a 250:1, ou 20:1 a 200:1, ou 20:1 a 100:1, ou substancialmente 48:1. Opcionalmente é também incluído um esterol (e. g., colesterol) presente numa proporção de saponina:esterol como aqui descrita.

Antigénios e composição de antigénio

As formulações de vacinas ou imunogénicas contêm um antigénio de Streptococcus pneumoniae capaz de desencadear uma resposta imune contra um agente patogénico humano ou animal. Nos casos em que o antigénio pneumocócico é uma proteína, a proteína está opcionalmente conjugada, por exemplo, com um sacárido. Opcionalmente, a proteína está não conjugada ou presente na composição imunogénica como uma proteína livre. Uma proteína não conjugada não está ligada covalentemente a um sacárido como uma proteína transportadora.

Numa forma de realização da invenção, a composição imunogénica da invenção compreende uma proteína pneumocócica que é opcionalmente um membro das proteínas da família de tríades de poli-histidina (Pht), os fragmentos ou proteínas de fusão ou seus equivalentes imunologicamente funcionais. As proteínas PhtA, PhtB, PhtD ou PhtE podem ter uma sequência de aminoácidos que partilha 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com uma sequência divulgada no documento WO 00/37105 ou WO 00/39299 (e. g. com a sequência de aminoácidos 1-838 ou 21-838 de SEQ ID N2: 4 do documento WO 00/37105 para a PhtD) . Por exemplo, as proteínas de fusão são constituídas pelo comprimento total ou fragmentos de 2, 3 ou 4 de PhtA, PhtB, PhtD, PhtE. Os exemplos de proteínas de fusão são PhtA/B, PhtA/D, PhtA/E, PhtB/A, PhtB/D, PhtB/E, PhtD/A, PhtD/B, PhtD/E, PhtE/A, PhtE/B e PhtE/D, em que as proteínas estão ligadas com os mencionados em primeiro lugar no N-terminal (ver, por exemplo, o documento WO01/98334).

Nos casos em que são utilizados fragmentos das proteínas Pht (separadamente ou como parte de uma proteína de fusão), cada fragmento contém opcionalmente um ou mais motivo(s) de tríade de histidina e/ou regiões em dupla hélice de tais polipéptidos. Um motivo de tríade de histidina é a porção de polipéptido que tem a sequência HxxHxH em que H é histidina e x é um aminoácido diferente de histidina. Uma região de dupla hélice é uma região prevista pelo algoritmo "Coils", Lupus, A et al (1991) Science 252; 1162-1164. Numa forma de realização, o fragmento ou cada fragmento inclui um ou mais motivos de tríade de histidina bem como, pelo menos, uma região de dupla hélice. Numa forma de realização, o fragmento ou cada fragmento contém exatamente ou, pelo menos, 2, 3, 4 ou 5 motivos de tríade de histidina (opcionalmente, com a sequência de Pht nativa entre as 2 ou mais tríades, ou sequência intra-tríade que é mais do que 50, 60, 70, 80, 90 ou 100% idêntica a uma sequência Pht intra-tríade pneumocócica nativa - e. g., a sequência intra-tríade mostrada na SEQ ID Ns: 4 do documento WO 00/37105 para a PhtD) . Numa forma de realização, o fragmento ou cada fragmento contém exatamente ou pelo menos 2, 3 ou 4 regiões em dupla hélice

Numa forma de realização, uma proteína Pht aqui divulgada inclui a proteína de comprimento total com a sequência sinal ligada, a proteína de comprimento total madura com o péptido sinal (por exemplo, 20 aminoácidos no N-terminal) removido, variantes naturais da proteína Pht e fragmentos imunogénicos da proteína Pht (e. g., fragmentos como descritos acima ou polipéptidos que compreendem, pelo menos, 15 ou 20 aminoácidos contíguos de uma sequência de aminoácidos no documento WO00/37105 ou WOOO/39299 em que o referido polipéptido é capaz de desencadear uma resposta imune específica para a referida sequência de aminoácidos no documento WO00/37105 ou WOOO/39299).

Em particular, o termo "PhtD" como aqui utilizado inclui a proteína de comprimento total com a sequência sinal ligada, a proteína de comprimento total madura com o péptido sinal (por exemplo, 20 aminoácidos no N-terminal) removido, variantes naturais de PhtD e fragmentos imunogénicos de PhtD (e. g., fragmentos como descritos acima ou polipéptidos que compreendem, pelo menos, 15 ou 20 aminoácidos contíguos de uma sequência de aminoácidos PhtD no documento WO00/37105 ou WOOO/39299 em que o referido polipéptido é capaz de desencadear uma resposta imune específica para a referida sequência de aminoácidos PhtD no documento WO00/37105 ou WOOO/39299 (e. g. SEQ ID N2: 4 do documento WO 00/37105 para a PhtD).

Numa forma de realização, a composição imunogénica da invenção compreende, pelo menos, 1 proteína selecionada do grupo que consiste da família de Tríades de Poli Histidina (PhtX), família das Proteínas de Ligação de Colina (CbpX), truncados de CbpX, família LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas (ou fusões) de truncado de CbpX-truncado de LytX, pneumolisina (Ply), PspA, PsaA, Spl28, SplOl, Spl30, Spl25 e Spl33. Numa outra forma de realização, a composição imunogénica compreende 2 ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste da família de Tríades de Poli Histidina (PhtX), família das Proteínas de Ligação de Colina (CbpX), truncados de CbpX, família LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas (ou fusões) de truncado de CbpX-truncado de LytX, pneumolisina (Ply), PspA, PsaA e Spl28. Numa forma de realização adicional, a composição imunogénica compreende 2 ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste da família de Tríades de Poli Histidina (PhtX), família das Proteínas de Ligação de Colina (CbpX), truncados de

CbpX, família LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas (ou fusões) de truncado de CbpX-truncado de LytX, pneumolisina (Ply) e Spl28. A família Pht (Tríades de Poli Histidina) compreende as proteínas PhtA, PhtB, PhtD e PhtE. A família é caracterizada por uma sequência de lipidação, dois domínios separados por uma região rica em prolina e várias tríades de histidina, possivelmente envolvidas na ligação de metais ou nucleósidos ou em atividade enzimática, (3-5) regiões em dupla hélice, um N-terminal conservado e um C-terminal heterogéneo. Esta está presente em todas as estirpes de pneumococos testadas. Foram também encontradas proteínas homólogas noutros Estreptococos e Neisseria. Numa forma de realização da invenção, a proteína Pht da invenção é PhtD. Entende-se, contudo, que os termos Pht A, B, D e E referem-se a proteínas que têm sequências divulgadas nas citações abaixo bem como as suas variantes naturais (e feitas pelo Homem) que têm uma homologia de sequência que é, pelo menos, 90% idêntica às proteínas de referência. Opcionalmente, é, pelo menos, 95% idêntica ou, pelo menos, 97% idêntica.

No que se refere às proteínas PhtX, a PhtA é divulgada no documento WO 98/18930, e é também referida como Sp36. Como assinalado acima, é uma proteína da família de tríades de poli-histidina e tem o motivo sinal de tipo II de LXXC. A PhtD é divulgada no documento WO 00/37105, e é também referida como

Sp036D. Como assinalado acima, é também uma proteína da família de tríades de poli-histidina e tem o motivo sinal de tipo II de LXXC. A PhtB é divulgada no documento WO 00/37105, e é também referida como Sp036B. Outro membro da família de PhtB é o

Polipéptido de Degradação C3, como divulgado no documento WO 00/17370. Esta proteína é também da família de tríades de poli-histidina e tem o motivo sinal de tipo II de LXXC. Por exemplo, um equivalente imunologicamente funcional é a proteína Sp42 divulgada no documento WO 98/18930. Um truncado de PhtB (aproximadamente 79kD) é divulgado no documento W099/15675, o qual é também considerado um membro da família de PhtX. A PhtE é divulgada no documento WO00/30299 e é referida como BVH-3. Quando se refere aqui qualquer proteína Pht, entende-se que podem ser utilizados fragmentos imunogénicos ou suas fusões da proteína Pht. Por exemplo, uma referência a PhtX inclui fragmentos imunogénicos ou suas fusões de qualquer proteína Pht. Uma referência a PhtD ou PhtB é também uma referência a fusões de PhtDE ou PhtBE como se encontram, por exemplo, no documento WO0198334 . A pneumolisina é uma toxina multifuncional com atividades citolitica (hemolítica) e de ativação do complemento distintas (Rubins et al. , Am. Respi. Cit Care Med, 153:1339-1346 (1996)). A toxina não é segregada pelos pneumococos, mas é libertada na lise de pneumococos sob a influência da autolisina. Os seus efeitos incluem, e. g., a estimulação da produção de citocinas inflamatórias por monócitos humanos, a inibição do batimento dos cilios no epitélio respiratório humano e a diminuição da atividade bactericida e migração de neutrófilos. 0 efeito mais óbvio da pneumolisina é na lise dos glóbulos vermelhos, a qual envolve a ligação ao colesterol. Uma vez que é uma toxina, esta tem de ser desintoxicada (i. e., não tóxica para um humano quando proporcionada numa dosagem adequada para proteção) antes de poder ser administrada in vivo. A expressão e clonagem da pneumolisina de tipo selvagem ou nativa são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Walker et al. (Infect Immun, 55:1184-1189 (1987)), Mitchell et al. (Biochim Biophys Acta, 1007:67-72 (1989) e Mitchell et al. (NAR, 18:4010 (1990)). A desintoxicação da Ply pode ser realizada por meios químicos, e. g. , submetendo a tratamento com formalina ou glutaraldeído ou uma combinação de ambos (documentos WO 04081515, PCT/EP2005/010258). Tais métodos são bem conhecidos na técnica para várias toxinas. Alternativamente, a Ply pode ser desintoxicada geneticamente. Assim, a invenção abrange derivados de proteínas pneumocócicas que podem ser, por exemplo, proteínas mutadas. O termo "mutada" é aqui utilizado para significar uma molécula que sofreu deleção, adição ou substituição de um ou mais aminoácidos utilizando técnicas bem conhecidas para a mutagénese específica de um lócus ou qualquer outro método convencional. Por exemplo, como descrito acima, uma proteína Ply mutante pode ser alterada para que seja biologicamente inativa ao mesmo tempo que mantém os seus epitopos imunogénicos, ver, por exemplo, documento W090/06951, Berry et al., (Infect Immun, 67:981-985 (1999)) e documento WO99/03884.

Como aqui utilizado, entende-se que o termo "Ply" refere-se a pneumolisina mutada ou desintoxicada adequada para utilização médica (i. e., não tóxica).

No que se refere à família das Proteínas de Ligação de Colina (CbpX), os membros dessa família foram originalmente identificados como proteínas pneumocócicas que podiam ser purificadas por cromatografia de afinidade sobre colina. Todas as proteínas de ligação de colina estão ligadas não covalentemente a unidades de fosforilcolina do ácido teicóico da parede celular e ácido lipoteicóico associado à membrana. Estruturalmente, estas têm várias regiões em comum ao longo de toda a família, embora a natureza exata das proteínas (sequência de aminoácidos, comprimento, etc.) possa variar. Em geral, as proteínas de ligação de colina compreendem uma região N-terminal (N) , regiões de repetição conservadas (RI e/ou R2), uma região rica em prolina (P) e uma região de ligação de colina conservada (C), constituída por repetições múltiplas, que compreendem aproximadamente metade da proteína. Como utilizado neste pedido, a expressão "família das Proteínas de Ligação de Colina (CbpX)" é selecionado do grupo que consiste das Proteínas de Ligação de Colina como identificadas no documento W097/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD e CbpG. A CbpA é divulgada no documento W097/41151. As CbpD e CbpG são divulgadas no documento WOOO/29434. A PspC é divulgada no documento WO97/09994. A PbcA é divulgada no documento W098/21337. A SpsA é uma proteína de ligação de colina divulgada no documento WO 98/39450. Opcionalmente, as Proteínas de Ligação de Colina são selecionadas do grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA e PspC.

Uma forma de realização da invenção compreende truncados de CbpX em que "CbpX" é definida acima e "truncados" refere-se a proteínas CbpX que carecem de 50% ou mais da região de ligação de Colina (C) . Opcionalmente, essas proteínas carecem de toda a região de ligação de colina. Opcionalmente, esses truncados de proteína carecem de (i) a região de ligação de colina e (ii) bem como de uma porção da metade N-terminal da proteína, mantendo, mesmo assim, pelo menos, uma região de repetição (RI ou R2) . Opcionalmente, o truncado tem 2 regiões de repetição (RI e R2) . Os exemplos de tais formas de realização são NRlxR2 e RlxR2 como ilustrados no documento W099/51266 ou W099/51188, contudo, outras proteínas de ligação de colina que carecem de uma região de ligação de colina semelhante são também consideradas no âmbito desta invenção. A família LytX é de proteínas associadas à membrana associadas à lise celular. O domínio N-terminal compreende domínio(s) de ligação de colina, contudo, a família LytX não tem todas as características encontradas na família CbpA assinalada acima e, assim, para a presente invenção, a família LytX é considerada distinta da família CbpX. Em contraste com a família CbpX, o domínio C-terminal contém o domínio catalítico da família de proteínas LytX. A família compreende LytA, B e C. No que se refere à família LytX, a LytA é divulgada em Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987) . A LytB é divulgada no documento WO 98/18930, e é também referida como Sp46. A LytC é também divulgada no documento WO 98/18930, e é também referida como Sp91. Uma forma de realização da invenção compreende LytC.

Outra forma de realização compreende truncados de LytX em que "LytX" é definida acima e "truncados" refere-se a proteínas LytX que carecem de 50% ou mais da região de ligação de Colina. Opcionalmente, tais proteínas carecem da região de ligação de colina completa. Ainda outra forma de realização desta invenção compreende proteínas quiméricas (ou fusões) de truncado de CbpX-truncado de LytX. Opcionalmente, esta compreende NRlxR2 (ou RlxR2) de CbpX e a porção C-terminal (Cterm, i. e., que carece dos domínios de ligação de colina) de LytX (e. g. , LytCCterm ou Sp91 Cterm) . Opcionalmente a CbpX é selecionada do grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA e PspC. Opcionalmente, aquela é CbpA. Opcionalmente, a LytX é LytC (também referida como Sp91) . Outra forma de realização da presente invenção é um truncado de PspA ou PsaA que carece do domínio de ligação de colina (C) e é expresso como uma proteína de fusão com LytX. Opcionalmente, a LytX é LytC.

No que se refere às PsaA e PspA, ambas são conhecidas na técnica. Por exemplo, a PsaA e as suas variantes de supressão transmembranares foram descritas por Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62. A PspA e as suas variantes de supressão transmembranares foram divulgadas, por exemplo, nos documentos US 5804193, WO 92/14488 e WO 99/53940. A Spl28 e a Spl30 são divulgadas no documento WO00/76540. A Spl25 é um exemplo de uma proteína da superfície pneumocócica com o motivo Ancorado na Parede Celular de LPXTG (em que X é qualquer aminoácido) . Verificou-se que qualquer proteína dentro desta classe de proteínas da superfície pneumocócicas com este motivo é útil dentro do contexto desta invenção e é, por conseguinte, considerada uma proteína adicional da invenção. A própria Spl25 é divulgada no documento WO 98/18930, e é também conhecida como ZmpB - uma metaloproteinase de zinco. A SplOl é divulgada no documento WO 98/06734 (onde tem a referência N2 y85993). É caracterizada por uma sequência sinal de Tipo I. A Spl33 é divulgada no documento WO 98/06734 (onde tem a referência N2 y85992) . É também caracterizada por uma sequência sinal de Tipo I.

As proteínas da invenção podem ser também combinadas de modo benéfico. Por combinadas entende-se que a composição imunogénica compreende todas as proteínas dentro das seguintes combinações, como proteínas transportadoras ou como proteínas livres ou uma mistura das duas. Por exemplo, numa combinação de duas proteínas como explicitada a seguir, ambas as proteínas podem ser utilizadas como proteínas transportadoras, ou ambas as proteínas podem estar presentes como proteínas livres, ou ambas podem estar presentes como proteína transportadora e como proteína livre, ou uma pode estar presente como uma proteína transportadora e uma proteína livre enquanto a outra está presente apenas como uma proteína transportadora ou apenas como um proteína livre, ou uma pode estar presente como uma proteína transportadora e a outra como um proteína livre. Nos casos em que é dada uma combinação de três proteínas, existem possibilidades semelhantes. As combinações incluem, mas não se limitam a, PhtD + NRlxR2, PhtD + proteínas quiméricas ou de fusão NRlxR2-Sp91Cterm, PhtD + Ply, PhtD + Spl28, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NRlxR2, proteínas quiméricas ou de fusão PhtA + NR1 XR2-Sp91 Cterm, PhtA + Ply, PhtA + Spl28, PhtA +

PsaA, PhtA + PspA, NRlxR2 + LytC, NRlxR2 + PspA, NRlxR2 + PsaA, NRlxR2 + Spl2 8, RlxR2 + LytC, RlxR2 + PspA, RlxR2 + PsaA, RlxR2 + Spl28, RlxR2 + PhtD, RlxR2 + PhtA. Opcionalmente, NRlxR2 (ou RlxR2) é de CbpA ou PspC. Opcionalmente, é de CbpA. Outras combinações incluem combinações de 3 proteínas, tais como PhtD + NRlxR2 + Ply e PhtA + NRlxR2 + PhtD. Numa forma de realização, a composição de vacina compreende pneumolisina desintoxicada e PhtD ou PhtDE como proteínas transportadoras. Numa outra forma de realização, a composição de vacina compreende pneumolisina desintoxicada e PhtD ou PhtDE como proteínas livres.

Uma resposta imune eficaz contra PhtD ou a sua proteína de fusão é medida, por exemplo, por um ensaio de proteção tal como aquele descrito no exemplo 15. Uma resposta imune eficaz proporciona pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de sobrevivência a 7 dias após estímulo com uma estirpe heteróloga. Dado que a estirpe de estímulo é heteróloga, a proteção proporcionada é devida à resposta imune contra a PhtD ou a sua proteína de fusão.

Alternativamente, uma resposta imune eficaz contra PhtD é medida por ELISA como descrito no exemplo 14. Uma resposta imune eficaz dá uma resposta de IgG anti-PhtD de, pelo menos, 250, 300, 350, 400, 500, 550 ou 600 pg/mL de GMC.

Numa forma de realização, a composição imunogénica da invenção compreende pneumolisina.

Numa forma de realização, a composição imunogénica da invenção compreende uma proteína pneumocócica divulgada no documento US6699703, por exemplo, proteína pneumocócica possuindo a sequência ou codificada pela sequência de SEQ ID N2 1-5326 do documento US6699703.

Numa forma de realização da invenção, a composição imunogénica compreende uma proteína pneumocócica que não é divulgada no documento PCT/EP2007/060743. A presente invenção proporciona ainda uma vacina que contém as composições imunogénicas da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização, a composição imunogénica da invenção compreende uma proteína pneumocócica selecionada do grupo que consiste de PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, LytB, LytC, LytA, Spl25, SP101, Spl28, Spl30, Spl33 ou proteínas divulgadas no documento US6699703, incluindo as proteínas de S. pneumoniae representadas ou codificadas pelas SEQ ID N2: 5225, 5200, 3166, 4360, 5137, 4263, 3166, 5226, 3716, 4360, 5243, 3964, 5179, 3850, 4263, 5137, 5226, 5325, 3850, 5179 ou 5325 do documento US6699703, ou o seu equivalente imunologicamente funcional. Os equivalentes imunologicamente funcionais incluem as sequências que partilham, pelo menos, 80, 90, 95, 98 ou 99% de identidade com a sequência especificada. Os equivalentes imunologicamente funcionais incluem também fragmentos que têm, pelo menos, 6, 10, 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos contíguos da sequência especificada. Os equivalentes imunologicamente funcionais são capazes de desencadear uma resposta imune que reconhece o antigénio nativo.

Vacinação

As preparações de vacina contendo as composições imunogénicas da presente invenção podem ser utilizadas para proteger ou tratar um mamífero suscetível a infeção, por meio de administração da referida vacina através da via sistémica ou mucosa. Estas administrações podem incluir injeção através das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou por meio de administração pela mucosa aos aparelhos oral/alimentar, respiratório, urogenital. Embora a vacina da invenção possa ser administrada como uma dose única, os seus componentes pode ser também coadministrados em conjunto ao mesmo tempo ou em alturas diferente (por exemplo, os conjugados de sacáridos pneumocócicos poderiam ser administrados separadamente, ao mesmo tempo ou 1-2 semanas depois da administração do qualquer componente proteico bacteriano da vacina para coordenação ótima das respostas imunes em relação uma à outra) . Além disso, as vacinas da invenção podem ser administradas IM para doses de preparação e IN para doses de reforço. 0 teor de antigénios proteicos na vacina situar-se-á tipicamente na gama 1-100 pg, de um modo preferido, 5-50 pg, muito tipicamente na gama 5-25 pg. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço espaçadas de modo adequado. A preparação de vacina é geralmente descrita em Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press Nova Iorque). O encapsulamento dentro de lipossomas é descrito por Fullerton, Patente US 4235877.

As vacinas da presente invenção podem ser armazenadas em solução ou liofilizadas. De um modo preferido, a solução é liofilizada na presença de um açúcar, tais como sacarose ou lactose. É ainda adicionalmente preferido que elas sejam liofilizadas e extemporaneamente reconstituídas antes da utilização.

Num aspeto da invenção é proporcionado um kit de vacina, compreendendo um frasquinho que contém uma composição imunogénica da invenção, opcionalmente na forma liofilizada, e compreendendo ainda um frasquinho que contém um adjuvante como aqui descrito. É idealizado que neste aspeto da invenção, o adjuvante será utilizado para reconstituir a composição imunogénica liofilizada.

Embora as vacinas da presente invenção possam ser administradas por qualquer via, a administração das vacinas descritas na pele (ID) constitui uma forma de realização da presente invenção. A pele humana compreende uma cutícula "córnea" externa, denominada de estrato córneo, a qual reveste a epiderme. Por baixo desta epiderme está uma camada denominada de derme, a qual, por sua vez, reveste o tecido subcutâneo. Os investigadores demonstraram que a injeção de uma vacina na pele, e, em particular, na derme, estimula uma resposta imune, a qual pode estar também associada a um número de vantagens adicionais. A vacinação intradérmica com as vacinas aqui descritas constitui uma característica preferida da presente invenção. A técnica convencional de injeção intradérmica, o "procedimento de Mantoux", compreende os passos de limpeza da pele, e em seguida estirar com uma mão, e com o bisel de uma agulha de calibre estreito (calibre 26-31) voltado para cima a agulha é inserida num ângulo de entre 10-15°. Uma vez inserido o bisel da agulha, o tambor da agulha é descido e avança-se adicionalmente enquanto se aplica uma ligeira pressão para elevá-la debaixo da pele. O liquido é então injetado muito lentamente formando, desse modo, uma bolha ou protuberância na superfície da pele, seguido de remoção lenta da agulha.

Mais recentemente, foram descritos dispositivos que são especificamente concebidos para administrar agentes líquidos na ou através da pele, por exemplo, os dispositivos descrito nos documentos WO 99/34850 e EP 1092444, também os dispositivos de injeção por jato descritos, por exemplo, nos documentos WO 01/13977; US 5480381, US 5599302, US 5334144, US 5993412, US 5649912, US 5569189, US 5704911, US 5383851, US 5893397, US 5466220, US 5339163, US 5312335, US 5503627, US 5064413, US 5520639, US 4596556, US 4790824, US 4941880, US 4940460, WO 97/37705 e WO 97/13537. Os métodos alternativos de administração intradérmica das preparações de vacina podem incluir seringas e agulhas convencionais, ou dispositivos concebidos para administração balística de vacinas sólidas (documento WO 99/27961) ou adesivos transdérmicos (documento WO 97/48440; documento WO 98/28037); ou aplicados na superfície da pele (administração transdérmica ou transcutânea, documento WO 98/20734; documento WO 98/28037).

Quando as vacinas da presente invenção são para ser administradas na pele, ou mais especificamente na derme, a vacina está num volume líquido pequeno, particularmente um volume entre cerca de 0,05 mL e 0,2 mL. O teor de antigénios nas vacinas cutâneas ou intradérmicas da presente invenção pode ser semelhante às doses convencionais como presentes nas vacinas intramusculares (ver acima). No entanto, é uma característica das vacinas cutâneas ou intradérmicas que as formulações podem ser de "dose baixa". Por conseguinte, os antigénios proteicos em vacinas de "dose baixa" estão, de um modo preferido, presentes em tão pouco quanto 0,1 a 10 pg, de um modo preferido 0,1 a 5 pg por dose; e os antigénios de sacáridos (de um modo preferido, conjugados) podem estar presentes na gama de 0,01-1 pg e, de um modo preferido, entre 0,01 a 0,5 pg de sacárido por dose.

Como aqui utilizado, a expressão "administração intradérmica" significa administração da vacina à região da derme na pele. No entanto, a vacina não se localizará necessariamente apenas na derme. A derme é a camada da pele localizada entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0 mm da superfície na pele humana, mas existe uma determinada quantidade de variação entre indivíduos e em diferentes partes do corpo. Em geral, pode esperar-se que se atinja a derme ao penetrar 1,5 mm abaixo da superfície da pele. A derme está localizada entre o estrato córneo e a epiderme na superfície e na camada subcutânea por debaixo. Dependendo do modo de administração, em última análise, a vacina pode localizar-se exclusiva ou principalmente dentro da derme ou, em última análise, pode distribuir-se dentro da epiderme e da derme. A quantidade de cada antigénio em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos secundários adversos, significativos em vacinados típicos. Essa quantidade variará dependendo do imunogénio específico que é utilizado e como é apresentado.

Numa outra forma de realização é proporcionado um método de tratamento de um indivíduo suscetível ou que sofre de uma doença através da administração de uma composição como substancialmente aqui descrita. É também proporcionado um método para prevenir um indivíduo de contrair uma doença selecionada do grupo que compreende doenças infecciosas bacterianas e virais, doenças parasitárias, em particular doença patogénica intracelular, doenças proliferativas tais como cancros da próstata, mama, colorretal, pulmão, pancreático, renal, ovariano ou melanoma; distúrbios não cancerosos crónicos, alergia compreendendo a administração de uma composição como substancialmente aqui descrita ao referido indivíduo.

Numa outra forma de realização é proporcionada uma composição de vacina para ser utilizada na terapia profilática ou terapia de um estado ou doença em que a composição de vacina compreende um antigénio ou composição de antigénio e uma composição adjuvante consistindo de uma emulsão de óleo em água que compreende 0,5 - 10 mg de óleo metabolizável, 0,5 - 11 mg de tocol e 0,1 - 4 mg de agente emulsionante, por dose humana.

Numa outra forma de realização é proporcionada a utilização de uma composição de vacina no fabrico de um medicamento para ser utilizado em terapia profilática ou terapia de um estado ou doença em que a composição de vacina compreende um antigénio ou composição de antigénio e uma composição adjuvante consistindo de uma emulsão de óleo em água que compreende 0,5-10 mg de óleo metabolizável, 0,5-11 mg de tocol e 0,1-4 mg de agente emulsionante, por dose humana. A invenção será ainda descrita por referência aos seguintes exemplos não limitativos: O Exemplo I descreve métodos de leitura imunológica utilizados em estudos com ratinhos, furões, porcos e humanos. O Exemplo II descreve a preparação da emulsão de óleo em água e formulações adjuvantes utilizadas nos estudos exemplificados. O Exemplo III mostra um ensaio clinico numa população adulta com 18-59 anos de idade com uma vacina que contém uma preparação dissociada de antigénio da gripe e várias doses de adjuvante AS03 O Exemplo IV mostra uma avaliação pré-clinica de vacinas da gripe dissociadas com adjuvante e sem adjuvante (compreendendo várias doses de adjuvante AS03) em ratinhos BALB/c preparados O Exemplo V mostra uma avaliação pré-clinica de vacinas da gripe dissociadas com adjuvante e sem adjuvante (compreendendo várias doses de adjuvante AS03) em ratinhos C57BI/6 preparados 0 Exemplo VI mostra uma avaliação pré-clínica de vacinas da gripe dissociadas com adjuvante e sem adjuvante (compreendendo várias doses de adjuvante AS03 e dose baixa de antigénio) em ratinhos C57BI/6 preparados 0 Exemplo VII mostra uma avaliação pré-clínica de vacinas contra ο H5N1 dissociadas com adjuvante e sem adjuvante (compreendendo várias doses de adjuvante AS03 e antigénio) em ratinhos C57BI/6 não modificados 0 Exemplo VIII mostra uma avaliação pré-clínica de vacinas contra a gripe com adjuvante e sem adjuvante em porcos Brancos Grandes preparados

Exemplo I - Métodos de Leitura Imunológica 1.1. Métodos com ratinhos 1.1.1. Teste de Inibição da Hemoglutinação

Principio do teste (procedimento clássico).

Os títulos de anticorpos anti-Hemaglutinina para as três estirpes de vírus da gripe (sazonais) são determinados utilizando o teste de inibição da hemoglutinação (Hl). 0 princípio do teste de Hl baseia-se na aptidão de anticorpos antigripe específicos para inibir a hemoglutinação dos glóbulos vermelhos (RBC) pela hemaglutinina do vírus da gripe (HA) . Os soros termicamente inativados são tratados com Caulino e RBC para remover inibidores não específicos. Após pré-tratamento, as diluições por duas vezes de soros são incubadas com 4 unidades de hemoglutinação de cada estirpe da gripe. Os glóbulos vermelhos são então adicionados e a inibição da aglutinação é pontuada. Os títulos são expressos como o recíproco da diluição mais elevada de soro que inibiu completamente a hemoglutinação. Como a primeira diluição de soros é 1:20, um nível não detetável é pontuado como um título igual a 10.

Adaptação para H5N1 (descrição específica de Hl utilizando eritrócitos de Cavalo):

Como foi documentado que o ensaio de Hl clássico para a determinação de anticorpos anti-HA não funciona bem para a estirpe H5N1, foi utilizado um protocolo adaptado utilizando RBC de cavalo. Os eritrócitos de cavalos são utilizados para as estirpes pandémicas de H5N1. Suspensão de glóbulos vermelhos de cavalo a 0,5 % (concentração final) em tampão de fosfato contendo 0,5 % de BSA (albumina de soro bovino, concentração final). Esta suspensão é preparada todos os dias lavando glóbulos vermelhos com o mesmo tampão de fosfato e um passo de centrifugação subsequente (10 min, 2000 rpm) . Este passo de lavagem tem de ser repetido uma vez. Após adição dos glóbulos vermelhos de cavalo à mistura reacional de soros e suspensão de vírus; as placas têm de ser incubadas à temperatura ambiente (TA, 20 °C +/- 2 °C) durante duas horas devido à baixa velocidade de sedimentação dos glóbulos vermelhos de cavalo.

Análise estatística

Foi realizada análise estatística sobre os títulos de Hl após vacinação utilizando UNISTAT. 0 protocolo aplicado para análise de variância pode ser resumidamente descrito como se segue: ♦ Transformação logarítmica dos dados ♦ Teste de Shapiro-Wilk em cada população (grupo) para verificar a normalidade da distribuição dos grupos ♦ Teste de Cochran para verificar a homogeneidade da variância entre as diferentes populações (grupos) ♦ Análise de variância em dados selecionados. ♦ Teste para interação de ANOVA bifatorial ♦ Teste Tukey-HSD para comparações múltiplas 1.1.2. Coloração de citocinas intracelulares

Esta técnica permite uma quantificação dos linfócitos T específicos para o antigénio com base na produção de citocinas: células T efetoras e/ou células T efetoras de memória produzem IFN-γ e/ou células T de memória central produzem IL-2. As PBMC são colhidas no dia 7 após imunização.

As células linfoides novamente estimuladas in vitro na presença de inibidor de secreção (Brefeldine). Estas células são em seguida processadas pelo procedimento imunofluorescente convencional utilizando anticorpos fluorescentes (CD4, CD8, IFN-γ e IL-2) . Os resultados são expressos como uma frequência de células positivas para citocinas dentro das células T CD4/CD8. A coloração intracelular de citocinas de células T foi realizada sobre PBMC 7 dias após a segunda imunização. 0 sangue foi recolhido de ratinhos e agrupado em meio RPMI heparinizado + Aditivo. Para sangue, suspensões de PBL diluídas em RPMI + Aditivo foram aplicadas em camada sobre um gradiente de Lympholyte-Mammal de acordo com o protocolo recomendado (centrifugar 20 min a 2500 rpm e T.A.). As células mononucleares na interface foram removidas, lavadas 2x em RPMI + Aditivo e as suspensões de PBMC foram ajustadas a 2 χ 106 células/mL em RPMI com 5% de soro fetal de vitelo. A estimulação de PBMC pelo antigénio in vitro foi realizada a uma concentração final de 1 χ 107 células/mL (tubo FACS) com FI Inteiro (1 pg de HA/estirpe) e em seguida incubada 2 h a 37 °C com a adição de anti-CD28 e anti-CD49d (1 pg/mL para ambos).

Após o passo de re-estimulação pelo antigénio, as PBMC são incubadas de um dia para o outro a 37 °C na presença de Brefeldina (1 pg/mL) a 37 °C para inibir a secreção de citocina. A coloração de IFN-γ /IL-2/CD4/CD8 foi realizada como se segue: As suspensões celulares foram lavadas, ressuspensas em 50 pL de PBS com 1% de FCS contendo 2% de reagente de bloqueio Fc (1/50; 2,4G2). Após 10 min de incubação a 4 °C foram adicionados 50 pL de uma mistura de anti-CD4-PE (2/50) e anti-CD8 perCp (3/50) e incubados durante 30 min a 4 °C. Após uma lavagem em PBS 1% de FCS, as células foram permeabilizadas ressuspendendo em 200 pL de Cytof ix-Cytoperm (Kit BD) e incubadas 20 min a 4 °C. As células foram em seguida lavadas com Perm Wash (Kit BD) e ressuspensas com 50 pL de uma mistura de APC anti-IFN-γ (1/50) + anti-IL-2 FITC (1/50) diluídas em Perm Wash. Após uma incubação mínima de 2 h e máxima de um dia para o outro a 4 °C, as células foram lavadas com Perm Wash e

ressuspensas em PBS com 1% de FCS + 1% de paraf ormaldeído. A análise da amostra foi realizada por FACS. As células vivas foram transferidas (FSC/SSC) e a aquisição foi realizada sobre ~ 20000 eventos (linfócitos) ou 35000 eventos em células T CD4+. As percentagens de IFN-γ + ou IL2+ foram calculadas em populações CD4+ e CD8+ transferidas. 1.1.3. ELISA Anti-H5N1. A quantificação dos títulos de anticorpo de Ig, IgGl e IgG2b anti-H5Nl foi realizada por ELISA utilizando H5N1 dissociado como revestimento. As soluções de vírus e anticorpo foram utilizadas a 100 pL por poço. O vírus H5N1 dissociado foi diluído a uma concentração final de 1 pg/mL em PBS e foi adsorvido de um dia para o outro a 4 °C aos poços das placas de microtitulação de 96 poços (Maxisorb Immunoplate Nunc 439454). As placas foram em seguida incubadas durante 1 hora a 37 °C com 200 pL por poço de PBS contendo 1% de BSA e 0,1% de Tween 20 (tampão de saturação). Doze diluições duas vezes de soros em tampão de saturação foram adicionadas às placas revestidas com H5N1 e incubadas durante lh30 a 37 °C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS com 0,1% de Tween 20. Ig anti-ratinho conjugada, biotinilada (Prozan-E0413) diluída a 1/500 ou IgGl anti-ratinho conjugada, biotinilada (Imtech 1070-08) ou uma IgG2b anti-ratinho biotinilada (Imtech 1090-08) diluída a 1/4000 em PBS com 1% de BSA 0,1% de Tween 20 foi adicionada a cada poço e incubada durante 1,30 hora a 37 °C; Depois de um passo de lavagem, as placas foram incubadas 30 min com um conjugado de Estreptavidina-Biotina-Preoxidase (Prozan P0397) diluído a 1/10000 em PBS com 1% de BSA Tween 20. Para a revelação colorimétrica, as placas foram incubadas 20 min a 22 °C com uma solução de o-fenildiamina (Sigma P4664) a 0,04%, H202 a 0,03% em tampão de citrato 0,1 M pH 4,2. A reação foi parada com H2S04 2 N e as microplacas foram lidas a 490-630 nm. 1.2. Métodos com furões 1.2.1. Teste de Inibição da Hemoglutinação (Hl)

Procedimento de ensaio.

Os títulos de anticorpo anti-hemaglutinina para as três estirpes de vírus da gripe foram determinados utilizando o teste de inibição da hemoglutinação (Hl) . O princípio do teste de Hl baseia-se na aptidão de anticorpos antigripe específicos para inibir a hemoglutinação de glóbulos vermelhos de galinha (RBC) pela hemaglutinina do vírus da gripe (HA). Os soros foram primeiro tratados com uma solução de neuraminidase a 25% (RDE) e foram termicamente inativados para remover os inibidores não específicos. Após pré-tratamento, as diluições duas vezes de soros foram incubadas com 4 unidades de hemoglutinação de cada estirpe da gripe. Os glóbulos vermelhos de galinha foram então adicionados e a inibição da aglutinação foi pontuada. Os títulos foram expressos como o recíproco da diluição mais elevada de soro que inibiu completamente a hemoglutinação. Como a primeira diluição de soros foi 1:10, um nivel não detetável foi pontuado como um titulo igual a 5.

Análise estatística.

Foi realizada análise estatística sobre os títulos de Hl (Dia 41, antes do estímulo) utilizando UNISTAT. O protocolo aplicado para análise de variância pode ser resumidamente descrito como se segue:

Transformação logarítmica de dados.

Teste de Shapiro-Wilk em cada população (grupo) para verificar a normalidade da distribuição dos grupos.

Teste de Cochran para verificar a homogeneidade de variância entre as diferentes populações (grupos).

Teste para interação de ANOVA unifatorial.

Teste de Tuckey-HSD para comparações múltiplas. 1.2.2. Monitorização da temperatura corporal

As temperaturas individuais foram monitorizadas durante o período de estímulo com os transmissores e pelo registo de telemetria. Todos os implantes foram verificados e renovados e foi realizada uma nova calibração por DSI (Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TC Tilburg, Países Baixos) antes de serem colocados na cavidade intraperitoneal. Todos os animais foram individualmente alojados em gaiola individual durante estas medições.

As temperaturas foram registadas a cada 15 minutos, 4 dias antes do estimulo até 7 dias após o estimulo. 1.2.3. Lavagens nasais

As lavagens nasais foram realizadas através da administração de 5 mL de PBS em ambas as narinas em animais acordados. 0 inoculo foi recolhido numa placa de Petri e colocado em recipientes de amostras sobre gelo seco.

Titulação de vírus nas lavagens nasais

Todas as amostras nasais foram primeiro esterilizadas por filtração através de filtros Spin X (Costar) para remover qualquer contaminação bacteriana. Foram transferidos 50 pL de diluições sucessivas de dez vezes das lavagens nasais para placas de microtitulação contendo 50 pL de meio (10 poços/diluição). Foram então adicionados 100 pL de células MDCK (2,4 x 105 células/mL) a cada poço e incubadas a 35 °C durante 5-7 dias.

Após 5-7 dias de incubação, o meio de cultura é removido suavemente e são adicionados 100 pL de um meio contendo 1/20 WST-1 e incubado durante mais 18 h. A intensidade do corante amarelo de formazano produzida após redução de WST-1 pelas células viáveis é proporcional ao número de células viáveis presentes no poço no final do ensaio de titulação de virus e é quantificada medindo a absorvância de cada poço ao comprimento de onda apropriado (450 nanómetros) . O corte é definido como a OD média de células de controlo não infetadas - 0,3 OD (0,3 OD correspondem a +/- 3 Desvios Padrão da OD de células de controlo não infetadas) . Uma pontuação positiva é definida quando a OD é < corte e em contraste uma pontuação negativa é definida quando a OD é > corte. Os títulos de excreção virai foram determinados por "Reed e Muench" e exprimidos como Log TCID50/mL. 1.3. Métodos em porcos 1.3.1. Teste de inibição da hemoglutinação (Hl)

Procedimento de ensaio.

Os títulos de anticorpo anti-Hemaglutinina para as três estirpes do vírus da gripe foram determinados utilizando o teste de inibição da hemoglutinação (Hl) . O princípio do teste de Hl baseia-se na aptidão de anticorpos antigripe específicos para inibir a hemoglutinação de glóbulos vermelhos de galinha (RBC) pela hemaglutinina do vírus da gripe (HA). Os soros foram primeiro tratados com uma solução de neuraminidase a 25% (RDE) e foram termicamente inativados para remover inibidores não específicos. Após pré-tratamento, as diluições 2 vezes de soros foram incubadas com 4 unidades de hemoglutinação de cada estirpe da gripe. Os glóbulos vermelhos de galinha foram então adicionados e a inibição da aglutinação foi pontuada. Os títulos foram exprimidos como o recíproco da diluição mais elevada de soro que inibiu completamente a hemoglutinação. Como a primeira diluição de soros foi 1:10, um nivel não detetável foi pontuado como um titulo igual a 5.

Análise estatística.

Foram realizadas análises estatísticas sobre os títulos de Hl (Dia 41, antes do estímulo) utilizando UNISTAT. O protocolo aplicado para a análise de variância pode ser resumidamente descrito como se segue:

Transformação logarítmica de dados.

Teste para interação de ANOVA unifatorial.

Teste de Tuckey-HSD para comparações múltiplas. 1.4. Ensaios para avaliar a resposta imune em humanos 1.4.1. Ensaio de Inibição de Hemoglutinação A resposta imune foi determinada medindo os anticorpos contra a Hl utilizando o método descrito pelo WHO Collaborating Centre for Influenza, Centres for Disease Control, Atlanta, EUA (1991) .

Foram realizadas medições dos títulos de anticorpos em amostras de soro descongeladas com um micrométodo padronizado e validado sistematicamente utilizando 4 unidades de inibição de hemoglutinação (4 HIU) dos antigénios apropriados e uma suspensão de eritrócitos de galinha a 0,5%. Os inibidores séricos não específicos foram removidos por tratamento térmico e enzima destruidora de recetores.

Os soros obtidos foram avaliados quanto aos níveis de anticorpos contra a Hl. Começando com uma diluição inicial de 1:10, foi preparada uma série de diluição (por um fator de 2) até uma diluição final de 1:20 480. O ponto final da titulação foi tomado como o passo de diluição mais alto que mostrou uma inibição completa (100%) da hemoglutinação. Todos os ensaios foram realizados em duplicado. 1.4.2. Ensaio de Inibição de Neuraminidase O ensaio foi realizado em placas de microtitulação revestidas com fetuína. Foi preparada uma série de diluição de 2 vezes do antissoro e misturada com uma quantidade padronizada de vírus da gripe A H3N2, H1N1 ou gripe B. O teste baseou-se na atividade biológica da neuraminidase, a qual liberta enzimaticamente ácido neuramínico a partir da fetuína. Após dissociação do ácido neuramínico terminal, a β-D-glactose-N-acetil-galactosamina foi desmascarada. Aos poços foi adicionada aglutinina de amendoim de Arachis hypogaea marcada com peroxidase de rábano-silvestre (HRP), a qual se liga especificamente a estruturas de galactose. A quantidade de aglutinina ligada pode ser detetada e quantificada numa reação de substrato com tetrametilbenzidina (TMB). A diluição de anticorpo mais alta que continua a inibir a atividade da neuraminidase virai em, pelo menos, 50% foi indicada como o titulo NI. 1.4.3. Ensaio de Anticorpo Neutralizante

Foram realizadas medições dos anticorpos neutralizantes em amostras de soro descongeladas. A neutralização do virus pelos anticorpos contidos no soro foi determinada num ensaio de microneutralização. Os soros foram utilizados sem mais tratamento no ensaio.

Cada soro foi testado em triplicado. Uma quantidade padronizada de virus foi misturada com diluições sucessivas de soro e incubada para permitir a ligação dos anticorpos ao virus. Foi então adicionada uma suspensão de células, contendo uma quantidade definida de células MDCK à mistura de virus e antissoro e incubada a 33 °C. Após o período de incubação, a replicação do vírus foi visualizada por hemoglutinação de glóbulos vermelhos de galinha. O título de neutralização a 50% de um soro foi calculado pelo método de Reed e Muench. 1.4.4. Imunidade mediada por células foi avaliada por Citometria de Fluxo de Citocinas (CFC)

As células T CD4 e CD8 específicas para o antigénio no sangue periférico podem ser novamente estimuladas in vitro para produzir IL-2, CD40L, TNF-alfa e IFN se incubadas com o seu antigénio correspondente.

Consequentemente, as células T CD4 e CD8 específicas para o antigénio podem ser enumeradas por citometria de fluxo após marcação com imunofluorescência convencional do fenótipo celular, bem como pela produção de citocinas intracelulares. No presente estudo, o antigénio da vacina da gripe bem como os péptidos derivados a partir da proteína da gripe específica foram utilizados como antigénio para estimular novamente as células T específicas para a gripe. Os resultados foram expressos como uma frequência de células T CD4 ou CD8 positivas para citocina(s) dentro da Subpopulação de células T CD4 ou CD8. 1.4.5. Métodos Estatísticos 1.4.5.1. Critérios finais primários • Percentagem, intensidade e relação com a vacinação de sinais e sintomas locais e gerais induzidos durante um período de seguimento de 7 dias (i. e. dia de vacinação e 6 dias seguintes) após vacinação e na globalidade. • Percentagem, intensidade e relação com a vacinação de sinais e sintomas locais e gerais não induzidos durante um período de seguimento de 21 dias (i. e., dia de vacinação e 20 dias seguintes) após vacinação e na globalidade. • Ocorrência de eventos adversos graves durante todo o estudo. I.4.5.2. Critérios finais secundários

Para a resposta imune humoral:

Variáveis observadas: • Nos dias 0 e 21: inibição da hemoglutinação no soro (Hl) e títulos de anticorpos de NI, testados separadamente contra cada uma das três estirpes do vírus da gripe representadas na vacina (anticorpos anti-HINl, anti-H3N2 e anti-B). • Nos dias 0 e 21: títulos de anticorpos neutralizantes, testados separadamente contra cada uma das três estirpes do vírus da gripe representadas na vacina

Variáveis derivadas (com intervalos de confiança de 95%): • Títulos médios geométricos (GMT) de anticorpos de Hl no soro com intervalos de confiança de 95% (IC de 95%) antes e após vacinação • Taxas de seroconversão1 com IC de 95% no dia 21 • Fatores de conversão** com IC de 95% no dia 21 • Taxas de seroproteção** 1 com IC de 95% no dia 21 • GMT de anticorpo de NI no soro (com intervalos de confiança de 95%) em todos os pontos temporais. • Taxa de seroconversão definida como a percentagem de vacinados que têm, pelo menos, um aumento de 4 vezes nos títulos de Hl no soro no dia 21 em comparação com o dia 0, para cada estirpe de vacina. 1 ** Fator de conversão definido como o aumento em vezes nos GMT de Hl no soro no dia 21 em comparação com o dia 0, para cada estirpe de vacina. *** Taxa de proteção definida como a percentagem de vacinados com um titulo de Hl no soro = 40 após vacinação (para cada estirpe de vacina) que é geralmente aceite como indicando proteção.

Deve ser entendido, que para alguns dos ensaios clínicos, reatogenicidade/segurança podem ser critérios finais secundários, e a imunogenicidade pode ser o critério final primário.

Para a resposta imune mediada por células (CMI)

Variável observada

Nos dias 0 e 21: frequência de células CD4/CD8 positivas para citocinas por 106 em diferentes testes. Cada teste quantifica a resposta de células T CD4/CD8 contra: 1 1

Antigénio da gripe peptídico (pf) (a natureza e origem exatas destes antigénios tem de ser dada/explicada) • Antigénio da gripe dissociado (sf) • Antigénio da gripe inteiro (wf).

Variáveis derivadas : • células que produzem, pelo menos, duas citocinas diferentes (CD40L, IL-2, IFNy, TNFa) • células que produzem, pelo menos, CD40L e outra citocina (IL-2, TNFa, IFNy) • células que produzem, pelo menos, IL-2 e outra citocina (CD40L, TNFa, IFNy) • células que produzem, pelo menos, IFNy e outra citocina (IL-2, TNFa, CD40L) • células que produzem, pelo menos, TNFa e outra citocina (IL-2, CD40L, IFNy) 1.3.5.3. Análise de imunogenicidade A análise de imunogenicidade baseou-se na coorte vacinada total. Para cada grupo de tratamento, foram calculados os seguintes parâmetros (com intervalos de confiança de 95%): 1 1 Títulos médios geométricos (GMT) de Hl e títulos de anticorpos de NI nos dias 0 e 21 • Títulos médios geométricos (GMT) de títulos de anticorpos neutralizantes nos dias 0 e 21. • Fatores de conversão no dia 21. • Taxas de seroconversão (SC) no dia 21 definidas como a percentagem de vacinados que têm, pelo menos, um aumento de 4 vezes nos títulos de Hl no soro no dia 21 em comparação com o dia 0. • Taxas de proteção no dia 21 definidas como a percentagem de vacinados com um titulo de Hl no soro = 1:40. • Foi resumida a frequência de linfócitos T CD4/CD8 que se segregam em resposta (estatística descritiva) para cada grupo de vacinação, em cada ponto temporal (Dia 0, Dia 21) e para cada antigénio (gripe peptídico (pf) , gripe dissociado (sf) e gripe inteiro (wf)). • Estatística descritiva da diferença individual entre as respostas em pontos temporais (Pós-Pré) para cada grupo de vacinação e cada antigénio (pf, sf, e wf) em cada um de 5 testes diferentes. • Foi utilizado um teste não paramétrico (teste de

Kruskall-Wallis) para comparar as diferenças de localização entre os 3 grupos e foi calculado o valor p estatístico para cada antigénio em cada um dos 5 testes diferentes. Todos os testes de significância foram bilaterais. Os valores de p menores ou iguais a 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos.

Exemplo II - Preparação da emulsão de óleo em água e formulações adjuvantes

Salvo indicação em contrário, a emulsão de óleo/água utilizada nos exemplos subsequentes é constituída por uma fase orgânica feita de 2 óleos (alfa-tocoferol e esqualeno), e uma fase aquosa de PBS contendo Tween 80 como agente emulsionante. Salvo indicação em contrário, as formulações adjuvantes de emulsão de óleo em água utilizadas nos exemplos subsequentes foram preparadas compreendendo os seguintes componentes de emulsão de óleo em água (indicadas as concentrações finais) : 2,5% de esqualeno (v/v), 2,5% de alfa-tocoferol (v/v) , 0,9% de monooleato de polioxietileno sorbitano (v/v) (Tween 80), ver o documento WO 95/17210. Esta emulsão, denominada AS03 nos exemplos subsequentes, foi preparada como se segue como um concentrado de duas vezes. II.1. Preparação de emulsão SB62

Este método foi utilizado nos estudos relatados nas secções de exemplos clínicos e pré-clínicos. A preparação da emulsão SB62 é feita misturando, sob forte agitação, uma fase oleosa constituída por componentes hidrófobos (DL-a-tocoferol e esqualeno) e uma fase aquosa contendo os componentes solúveis em água (o detergente aniónico Tween 80 e PBS mod (modificado) , pH 6,8). Enquanto sob agitação, a fase oleosa (1/10 do volume total) é transferida para a fase aquosa (9/10 do volume total), e a mistura é agitada durante 15 minutos à temperatura ambiente. A mistura resultante é em seguida submetida a forças de cisalhamento, impacto e cavitação na câmara de interação de um microfluidificador (15000 PSI - 8 ciclos, ou 3 ciclos no adjuvante utilizado no ensaio clínico descrito no Exemplo III) para produzir gotículas na gama de submícrones (distribuição entre 100 e 200 nm). O pH resultante situa-se entre 6,8 ± 0,1. A emulsão SB62 é em seguida esterilizada por filtração através de uma membrana de 0,22 pm e a emulsão em bruto estéril é conservada refrigerada em recipientes Cupac a 2 a 8 °C. É introduzido gás inerte estéril (azoto ou árgon) no volume morto do recipiente final da emulsão SB62 durante, pelo menos, 15 segundos. A composição final da emulsão SB62 é como se segue:

Tween 80: 1,8% (v/v) 19,4 mg/mL; Esqualeno: 5% (v/v) 42,8 mg/mL; a-tocoferol: 5% (v/v) 47,5 mg/mL; PBS-mod: NaCl 121 mM, KCI 2,38 mM, Na2HP04 7,14 mM, KH2P04 1,3 mM; pH 6,8 ± 0,1.

Exemplo III - Ensaio clínico numa população adulta com 18-59 anos de idade com uma vacina que contém uma preparação dissociada de antigénio da gripe e várias doses de adjuvante AS03 (Flu-LD-004) III.1. Introdução

Foi realizado um estudo de ocultação individual, aleatorizado, controlado de fase II numa população adulta com 18-59 anos de idade em 2006, a fim de avaliar a imunogenicidade, segurança e reatogenicidade da vacina candidata contra a gripe de dose baixa da GlaxoSmithKline Biologicals (i. e. contendo 5yg de HA por estirpe) com duas doses de adjuvante AS03. A resposta imune humoral (i. e. anti-hemaglutinina) foi medida 21 dias após administração intramuscular de uma dose de uma Vacina com adjuvante AS03. Fluarix™ foi utilizado como referência. 111.2. Conceção do estudo

Três grupos de indivíduos em paralelo receberam a seguinte vacina por via intramuscular: um grupo de 100 indivíduos recebeu uma injeção da vacina do vírus gripe dissociada de dose baixa contendo 5 yg de HA com adjuvante AS03 (FluLDl/1) um grupo de 100 indivíduos recebeu um injeção da vacina do vírus gripe dissociada de dose baixa contendo 5 yg de HA com adjuvante a metade da dose de AS03 (AD03 (FluLDl/2) um grupo de 100 indivíduos recebeu uma dose de Fluarix™ (Fluarix)

Plano: uma injeção IM de vacina contra a gripe no dia 0, visitas no sítio do estudo no dia 0 e dia 21 com uma colheita de amostra de sangue (determinação do anticorpo de HI) e um contacto telefónico adicional no dia 30 (conclusão do estudo). A vacina contra a gripe dissociada trivalente padrão Fluarix™ utilizada neste estudo, é uma vacina comercial do ano 2006 desenvolvida e fabricada pela GlaxoSmithKline Biologicals. 111.3. Objetivos do Estudo III. 3.1. Objetivo primário • Para avaliar a resposta imune humoral induzida pelas vacinas do estudo em termos de títulos de anticorpo anti-hemaglutinina:

Variáveis observadas nos dias 0 e 21: títulos de anticorpos de inibição da Hemoglutinação no soro. Variáveis derivadas (com intervalos de confiança de 95%) : • Títulos médios geométricos (GMT) de anticorpos no soro nos dias 0 e 21 • Taxas de seroconversão1 no dia 21 • Fatores de conversão** no dia 21 • Taxas de proteção*** nos dias 0 e 21 *Taxa de seroconversão para a resposta de anticorpos contra a Hemaglutinina é definida como a percentagem de vacinados que têm um título pré-vacinação < 1:10 e um título pós-vacinação > 1:40 ou um título pré-vacinação > 1:10 e, pelo menos, um aumento de quatro vezes do título pós-vacinação **Fator de conversão definido como o número de vezes de aumento nos GMT de Hl no soro após vacinação em comparação com o dia 0; ***Taxa de proteção definida como a percentagem de vacinados com um título de Hl no soro >40 após vacinação que é geralmente aceite como indicando proteção. III.3.2. Objetivo secundário • Para avaliar a segurança e reatogenicidade das vacinas em estudo em termos de eventos adversos locais e gerais induzidos, eventos adversos não induzidos e eventos adversos graves: 1 1. Ocorrência, intensidade e relação com a vacinação de sinais e sintomas locais e gerais induzidos durante um período de seguimento de 7 dias (i. e. dia de vacinação e 6 dias seguintes) após cada vacinação em cada grupo. 2. Ocorrência, intensidade e relação com a vacinação de sinais e sintomas locais e gerais não induzidos durante um período de seguimento de 30 dias (i. e. dia de vacinação e 29 dias seguintes) após a vacinação em cada grupo. 3. Ocorrência e relação de eventos adversos graves durante todo o período de estudo em cada grupo. III.4. Composição de vacina e administração III. 4.1. Preparação da vacina A vacina contra a gripe sem adjuvante é uma vacina contra a gripe inativada de virião dissociado trivalente que consiste de três cargas de antigénio virai monovalente (preparados a partir de, respetivamente, as estirpes da gripe A/H1N1, A/H3N2 e B). Os antigénios presentes nesta vacina são os mesmos que na vacina autorizada Fluarix™ que se encontra disponível no mercado como Fluarix ™ (α-Rix®) desde 1992 e contêm 15 pg de HA/estirpe por dose. As estirpes da gripe incluídas nos lotes clínicos de FluLD são as estirpes que foram escolhidas para o Hemisfério Norte em 2006/2007: 1 1

Estirpe semelhante a A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1): A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1) IVR-116 • Estirpe semelhante a A/Wisconsin/67/2005 (H3N2): A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) NYMCX-161 • B/Malásia/2506/2004.

Os antigénios são derivados de virus cultivados em ovos. A dissociação é realizada com desoxicolato de sódio antes do passo de inativação, o qual é realizado através da ação subsequente de desoxicolato de sódio e formaldeido. A vacina contra a gripe (FluLD) de dose baixa com adjuvante AS03 (lotes clínicos) baseia-se na vacina Fluarix™ comercialmente disponível (preparada a partir de, respetivamente, estirpes da gripe A/H1N1, A/H3N2 e B) , mas com um menor teor de antigénio e com adjuvante do sistema adjuvante da GSK, AS03. O AS03 consiste de uma emulsão de óleo em água (SB62) que contém dois óleos biodegradáveis, esqualeno e a-tocoferol (Vitamina E) , e um tensioativo, polissorbato 80 (Tween 80) . Os antigénios da gripe são incorporados na fase aquosa do sistema adjuvante por mistura simples com a emulsão. Foram testadas duas formulações, que diferem na quantidade de adjuvante introduzido com os antigénios Flu no lote da vacina. As vacinas com adjuvante contêm 5 yg de hemaglutinina (HA) de cada estirpe de vírus da gripe por dose, combinadas com uma dose completa (AS03) ou meia dose (AS03 ^) do sistema adjuvante AS03. Os excipientes são os seguintes: polissorbato 80 (Tween 80), octoxinol 10 (Triton X-100), hidrogenossuccinato de alfa-tocoferilo, cloreto de sódio, hidrogenofosfato dissódico, di-hidrogenofosfato potássico, cloreto de potássio, água para preparação injetável.

As vacinas contra a gripe de dose baixa com adjuvante AS03 (FluLD, dose completa ou meia dose de AS03) são vacinas livres de conservantes. No entanto, elas contêm quantidades vestigiais de tiomersal (< 1,25 pg de Hg por dose) a partir das fases iniciais do processo de fabrico. Elas são ambas apresentadas como vacinas monodose em seringas pré-cheias de vidro (Tipo I) a um volume de 0,5 mL/dose. III. 4.1.1. Composição de vacina contra a gripe com adjuvante AS03

Uma dose de FluLD (dose completa ou meia dose de AS03) corresponde a 0,5 mL. A composição é proporcionada na Tabela 3. O teor de HA por dose é 5 pg para ambas as formulações, sendo a única diferença a quantidade de AS03 presente nos recipientes finais.

Abreviaturas: HA = Hemaglutinina. 0 teor total em Polissorbato 80 corresponde a 4,972 mg por dose quando é utilizada uma dose completa de AS03, e 2,547 mg por dose quando é utilizada meia dose de AS03. III. 4.1.2. Produção da preparação de antigénio da gripe inativado dissociado

Os antigénios da gripe são idênticos àqueles incluídos na Fluarix™ (Vacina contra o Vírus da Gripe). As cargas monovalentes consistem de vírus dissociados inativados purificados que são preparados a partir de sementes de trabalho das três estirpes de vírus da gripe, tipo A (H1N1 e H3N2) e tipo B, as quais são cultivadas individualmente em ovos de galinha embrionados. Estas sementes de trabalho são derivadas de estirpes que foram recebidas de um centro que colabora com a WHO, que segue as recomendações anuais da WHO. Para o processo de preparação dos antigénios é feita referência, a título de ilustração, ao documento WO 02/097072. Os volumes das três cargas monovalentes baseiam-se no teor de HA medido em cada carga monovalente antes da formulação e no volume de fabrico alvo .

Uma solução salina tamponada com fosfato concentrado 10 vezes (pH 7,4 quando concentrado 1 vez) e uma pré-mistura de Tween 80 e hidrogenossuccinato de α-tocoferilo são diluídos em água para preparação injetável, seguido de agitação durante 5-30 minutos à temperatura ambiente.

As três cargas monovalentes concentradas são em seguida sucessivamente diluídas na solução de solução salina tamponada com fosfato/Tween 80 - hidrogenossuccinato de α-tocoferilo resultante a uma concentração de 20 pg de HA de cada carga monovalente de A (H1N1, H3N2)

23,32 pg de HA da carga monovalente de B por mL de carga trivalente intermediária (5 pg de HA de cada carga monovalente de A e 5,83 pg de HA de B/500 pL de carga final trivalente).

Entre as adições de cada carga monovalente, a mistura é agitada durante 10 - 30 minutos à temperatura ambiente e durante 15 - 30 minutos após adição da última carga monovalente. Esta carga trivalente intermediária também referida como "pré-combinação" pode ser mantida a +2 - +8 °C ou adicionalmente processada até ao passo final de formulação no mesmo dia. O volume final da pré-combinação é de 250 pL por dose. III.4.1.3. Preparaçao das composiçoes de vacina com adjuvante AS03

Vacina com adjuvante: LD AS03 1/1 (Tabela 4) São adicionados PBS mod concentrado 10 vezes (pH 7,4 quando concentrado uma vez; NaCl 137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HPC>4 8,1 mM, KH2P04 1,47 mM, pH 7,4) bem como uma mistura contendo Tween80, Triton X-100 e VES (quantidades tomadas tendo em consideração o detergente presente nas estirpes) a água para preparação injetável. Após 5 a 30 minutos de agitação, são adicionados 20 pg de HA por mL de cada estirpe H1N1 e H3N2 e 23,32 pg de HA por mL de estirpe B com 10 a 30 minutos de agitação entre cada adição. Após 15 a 30 minutos de agitação, é rejeitado um pequeno volume da chamada "carga intermediária" para análise e conservado entre +2 e +8 °C. A carga intermediária é em PBS mod concentrado 1 vez. A concentração de detergentes no alvo são 488 pg de Tween 80 por mL, 73, 6 pg de Triton X-100 por mL e 66,6 pg de VES por mL. A formulação final é em seguida preparada: é adicionado um volume igual de SB62 (ver preparação no Exemplo II) a cada 250 pL de carga intermediária de pré-combinação e misturado durante 30 a 60 minutos à temperatura ambiente. Verifica-se se o pH está entre 6,8 e 7,5. A formulação é purgada com azoto e em seguida conservada entre +2 e 8 °C antes do enchimento.

(1): A composição da carga final de tampão é: NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM, Na2HP04 8, 1 mM, KH2P04 1,47 mM, pH 7,4

Vacina com adjuvante: LD AS03 1/2 (Tabela 5) São adicionados PBS mod concentrado 10 vezes (pH 7,4 quando concentrado uma vez - ver composição acima) bem como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e VES (quantidades tomando em consideração o detergente presente nas estirpes) a água para preparação injetável. Após 5 a 30 minutos agitação, são

adicionados 20 yg de HA por mL de cada estirpe H1N1 e H3N2 e 23,32 yg de HA por mL de estirpe B com 10 a 30 minutos de agitação entre cada adição. Após 15 a 30 minutos de agitação, é rejeitado um pequeno volume da chamada "carga intermediária" para análise e conservado entre +2 e +8 °C. O PBS mod é concentrado 1 vez na carga intermediária. A concentração de detergentes no alvo são 488 yg de Tween 80 por mL, 73, 6 yg de Triton X—100 por mL e 66,6 yg de VES por mL A formulação final é em seguida preparada: SB62 é primeiro diluído com o tampão de PBS mod e agitado durante 15 - 30 minutos à TA. É então adicionado um volume igual deste SB62 diluído a cada 250 yL de pré-combinação de carga intermediária. Após 30 a 60 minutos de agitação à TA, verifica-se se o pH está entre 6,8 e 7,5. A formulação é purgada com azoto e em seguida conservada entre +2 e 8 °C antes do enchimento. O volume final de ambas as formulações é 500 yL por dose e a concentração final de HA é 10 yg de cada carga monovalente de A e 11,66 yg de carga monovalente de B por mL de carga final trivalente. As concentrações alvo finais de Tween 80, Triton X-100 (resíduo do fabrico da monocarga de H3N2) e hidrogenossuccinato de a-tocoferilo (hidrogenossuccinato de a-tocoferilo é uma forma de éster de RRR (D isómero)-a-tocoferol) são 244 yg/mL, 58,6 yg/mL e 33,3 yg/mL, respetivamente.

Tabela 5 Vacina de dose baixa com adjuvante AS03 (meia dose de adjuvante)

(1): A composição da carga final de tampão é: NaCl 137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8, 1 mM, KH2P04 1,47 mM, pH 7,4 III.4.2. Administração da vacina A vacina é enchida em seringas de vidro estéreis de 1,25 mL Tipo I (Ph. Eur.). Cada seringa é enchida até um alvo de 0,57 mL (gama: 0,54-0, 60 mL) . As vacinas foram administradas por via intramuscular na região deltoide do braço não dominante. Todas as vacinas foram apresentadas como seringas pré-cheias (0,5 mL). A fim de assegurar injeção IM apropriada da vacina, foi utilizada uma agulha de, pelo menos, 25G e, pelo menos, 2,5 cm de comprimento. 111.5 Resultados da população de estudo

Um total de 300 indivíduos foi envolvido neste estudo: 100 indivíduos em cada um dos 3 grupos. A idade média da coorte vacinada total no tempo de vacinação foi de 36,7 anos com um desvio padrão de 13,67 anos. A idade média e distribuição de género dos indivíduos nos 3 grupos de vacina foram semelhantes. 111.6 Resultados da imunogenicidade A análise da imunogenicidade foi realizada na coorte de ATP para a imunogenicidade (297 indivíduos).

Resposta imune humoral A fim de avaliar a resposta imune humoral induzida pela vacina candidata contra a gripe de dose baixa com adjuvante AS03, foram calculados os seguintes parâmetros (com intervalos de confiança de 95%) para cada grupo de tratamento: • Títulos médios geométricos (GMT) dos títulos de anticorpos de Hl nos dias 0 e 21; • Taxas de seroconversão (SC) nos dias 21; • Fatores de conversão no dia 21; • Taxas de proteção no dia 0 e 21. III.6.1 Títulos médios geométricos (GMT) de Hl

Os GMT para os anticorpos de Hl com IC de 95% são mostrados na Tabela 10 e Figura 1. As razões GMT ajustadas entre os grupos são mostradas na Tabela 11.

Os GMT pré-vacinação dos anticorpos de Hl para todas as 3 estirpes de vacinas estavam dentro da mesma gama nos 3 grupos de tratamento. Os GMT observados no dia 21 para os grupos com adjuvante tendem a ser superiores ao grupo Fluarix para todas as 3 estirpes com uma diferença estatística (sem sobreposição dos IC de 95% e a razão GMT ajustada não contém o valor 1) entre FluLDl/1 e Fluarix para a estirpe de vacina A/Wisconsin. Foi também observada uma diferença estatística (razão GMT ajustada não contém o valor 1) entre FluLDl/2 e Fluarix para a estirpe de vacina B/Malásia.

Tabela 10 - índices de seropositividade e Títulos médios geométricos (GMT) para o anticorpo anti-HA no dia 0 e 21 (coorte de ATP para a imunogenicidade)

FluLDl/1 = Vacina contra a gripe de dose baixa (5 ug de HA/estirpe) com dose completa de adjuvante AS03

FluLDl/2 = Vacina contra a gripe de dose baixa (5 ug de HA/estirpe) com meia dose de adjuvante AS03

Fluarix = Vacina Fluarix GMT = Titulo médio geométrico de anticorpos N = Número de indivíduos com resultados disponíveis n/% = número/percentagem de indivíduos seropositivos (titulo de Hl >=1:10) IC de 95% = um intervalo de confiança de 95%, LL = Limite Inferior, UL = Limite Superior MIN/MAX = Mínimo/Máximo PRE = Pré-vacinação no dia 0 PI (D21) = Pós-vacinação no dia 21 TABELA 11 - Razões GMT ajustadas entre grupos para cada estirpe de vacina no dia 21 (coorte de ATP para a

FluLDl/2 = Vacina contra a gripe de dose baixa (5 ug de HA/estirpe) com meia dose de adjuvante AS 0 3

Fluarix = Vacina Fluarix

Ajustada GMT = título médio geométrico de anticorpos ajustado ao título de base N = Número de indivíduos com resultados pré- e pós-vacinação disponíveis IC de 95% = intervalo de confiança de 95% para a razão GMT ajustada (Modelo de Ancova: ajuste para a variância agrupada do titulo de base com mais do que 2 grupos); LL = limite inferior, UL = limite superior III. 6.2 Fatores de conversão dos títulos de anticorpos anti-HI, taxas de seroproteção e taxas de seroconversão (correlações para proteção como estabelecidas para a vacina contra a gripe em humanos)

Os resultados são apresentados na Tabela 6 - Figura 2 para as taxas de seroproteção, Tabela 7 - Figura 3 para as taxas de seroconversão e Tabela 8 - Figura 4 para os fatores de conversão. O limiar pedido pelas Autoridades Europeias para as taxas de seroproteção (70%) foi atingido em todos os grupos (pelo menos 94,9%). Para cada estirpe de vacina, as taxas de seroproteção no dia 21 para os 3 grupos estavam dentro da mesma gama. 0 limiar pedido pelas Autoridades Europeias para as taxas de seroconversão (40%) foi atingido em todos os grupos (pelo menos 65%).

Para a estirpe de vacina A/Nova Caledónia, a SCR no dia 21 para os 3 grupos estava dentro da mesma gama.

Para a estirpe de vacina A/Wisconsin, a SCR no dia 21 para o grupo FluLDl/1 tendeu a ser mais alta em comparação com o grupo Fluarix. A SCR no dia 21 para o grupo FluLDl/2 estava dentro da mesma gama em comparação com o Grupo Fluarix.

Para a estirpe de vacina B/Malásia, a SCR no dia 21 para o grupo FluLDl/2 tendeu a ser mais alta em comparação com o grupo Fluarix. A SCR no dia 21 para o grupo FluLDl/1 estava dentro da mesma gama em comparação com o grupo Fluarix. O limiar pedido pelas Autoridades Europeias para os fatores de seroconversão (2,5) foi atingido em todos os grupos (pelo menos 6,2).

Para a estirpe de vacina A/Nova Caledónia, o SCF no dia 21 para os 3 grupos pareceu estar dentro da mesma gama. O valor observado para o grupo FluLDl/2 foi inferior ao valor observado para o grupo Fluarix mas podia ser explicado pela taxa de seroproteção pré-vacinação mais alta no grupo FluLDl/2.

Para a estirpe de vacina A/Wisconsin, o SCF no dia 21 para o grupo FluLDl/1 tendeu a ser mais alto em comparação com o grupo Fluarix. 0 SCF no dia 21 para o grupo FluLDl/2 estava dentro da mesma gama em comparação com grupo Fluarix.

Para a estirpe de vacina B/Malásia, o SCF no dia 21 para os dois grupos com adjuvante tendeu a ser mais alto em comparação com o grupo Fluarix.

FluLDl/2 = Vacina contra a gripe de dose baixa (5 ug de HA/estirpe) com meia dose de adjuvante AS03 Fluarix = Vacina Fluarix N = Número de indivíduos com resultados disponíveis n/% = Número/percentagem de indivíduos seroprotegidos (título de HI >= 40 1/DIL) IC de 95% = intervalo de confiança de 95%, LL = Limite Inferior, UL = Limite Superior PRE = Pré-vacinação no dia 0 PI (Dl) = Pós-vacinação no dia 21 Fonte de dados = Anexo tabela ΙΙΙΑ

FluLDl/2 = Vacina contra a gripe de dose baixa (5 ug de HA/estirpe) com meia dose de adjuvante AS03 Fluarix = Vacina Fluarix Seroconversão definida como:

Para indivíduos inicialmente seronegativos, título de anticorpos >= 40 1/DIL após vacinação

Para indivíduos inicialmente seropositivos, título de anticorpos após vacinação >= 4 vezes o título de anticorpos pré-vacinação N = Número de indivíduos com resultados pré- e pós-vacinação disponíveis n/% = Número/percentagem de indivíduos seroconvertidos IC de 95% = intervalo de confiança de 95%, LL = Limite Inferior, UL = Limite Superior

FluLDl/2 = Vacina contra a gripe de dose baixa (5 ug de HA/estirpe) com meia dose de adjuvante AS03 Fluarix = Vacina Fluarix N = Número de indivíduos com resultados pré- e pós-vacinação disponíveis SCF = Fator de seroconversão ou razão média geométrica (média[log10(PI(D21)/PRE)]) IC de 95% = intervalo de confiança de 95%, LL = Limite Inferior, UL = Limite Superior III.7 Conclusões sobre a segurança

Uma reatogenicidade mais alta em termos de sintomas induzidos (locais/gerais) e não induzidos nos grupos de vacina com adjuvante em comparação com o grupo Fluarix foi a tendência global observada neste estudo.

Uma redução no teor de AS03 na vacina com adjuvante tem um impacto significativo em todos os sintomas de grau 3 gerais e locais. A ocorrência de sintomas não induzidos tendeu a ser mais alta nos grupos de vacina com adjuvante (55% e 47% dos indivíduos), em comparação com o grupo Fluarix (35%). A partir destes resultados, pode concluir-se que a reatogenicidade e o perfil de segurança das vacinas candidatas são satisfatórios e clinicamente aceitáveis. III.8. Conclusões globais III. 8.1. Resultados da imunogenicidade 0 objetivo primário deste estudo foi avaliar a resposta imune humoral (títulos de anticorpos anti-HI) desencadeada pela vacina contra a gripe de dose baixa com duas concentrações diferentes de adjuvante AS03, e pela Fluarix.

No dia 21, as três vacinas excederam os requisitos das Autoridades Europeias para o registo anual de vacinas contra a gripe de viriões dissociados ("Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for Influenza Vaccines" para a avaliação imunológica das alterações anuais das estirpes CPMP/BWP/214/96) . Os GMT tenderam a ser mais altos nos grupos com adjuvante em comparação com o grupo Fluarix, com uma diferença estatisticamente significativa observada para as estirpes de vacinas A/Wisconsin (FluLDl/1 vs. Fluarix) e B/Malásia (FluLDl/2 vs. Fluarix). Foram observadas taxas de seroproteção semelhantes em todos os três grupos de vacinas, que variam desde 94,9% a 99%. Constatou-se que as taxas de seroconversão e os fatores de seroconversão eram mais altos nos grupos com adjuvante do que no grupo Fluarix. Os dados deste estudo revelaram também que a imunogenicidade induzida pela vacina com metade da dosagem de adjuvante AS03 era comparável à induzida com a dose completa de adjuvante. III. 8.2. Resultados de reatogenicidade e segurança A administração da vacina candidata contra a gripe de dose baixa com adjuvante AS03 foi segura e clinicamente bem tolerada na população do estudo, i. e., pessoas adultas com entre 18 e 59 anos de idade. A vacina com meia dose de adjuvante apresentou uma diminuição acentuada na incidência de sintomas locais e gerais induzidos, em comparação com a vacina com dose completa de adjuvante.

Exemplo IV - Avaliação pré-clínica de vacinas da gripe dissociadas com adjuvante e sem adjuvante (compreendendo várias doses de adjuvante AS03) em ratinhos BALB/c preparados IV. 1. Conceção experimental e objetivo

Foram realizadas experiências em ratinhos preparados com o virus da gripe para avaliar o aumento nas respostas humorais pelas vacinas da gripe induzidas com AS03 formuladas com este adjuvante de óleo em água. Para simular a situação em seres humanos, foi realizada uma experiência utilizando ratinhos preparados com estirpes heterossubtipicas. IV.1.1. Tratamento/grupo (Tabela 9)

Grupos de 27 ratinhos BALB/c fêmeas adultos foram preparados por via intranasal (20 pL volume) no dia 0 com virus da gripe trivalente inteiro inativado com formalina (5 pg de HA para cada estirpe). As estirpes de preparação consistiram de variantes de deriva anteriores (5 pg de HA de H1N1 A/Johannesburg/82/96, H3N2 A/Sydney/5/97, B/Harbin/7/94 inteiro inativado) àquelas incluídas na vacina. Vinte e oito dias mais tarde, os ratinhos foram vacinados com uma única dose do candidato a vacina por via intramuscular num volume total de 50 pL. Os ratinhos foram imunizados com formulações contendo antigénios dissociados sozinhos (dissociados trivalentes simples) ou formulações contendo antigénios dissociados com adjuvante nas duas doses de AS03 (completa ou 1/5) . As estirpes utilizadas para as imunizações incluíram os antigénios virais de H1N1 A/Nova Caledónia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99, B/Shangdong/7/97 (1,5 pg/estirpe, 1/10 da dose humana).

IV.1.2. Preparação das formulações de vacina

Uma Pré-mistura de Tween 80, Triton X100 e Succinato de Vitamina E (VES) é preparada para se conseguir uma concentração final na vacina de 750 pg/mL de Tween 80, 110 pg/mL de Triton X100 e 100 pg/mL de VES. As quantidades utilizadas na pré-mistura são calculadas tendo em consideração as quantidades de detergente e VES já presentes nas estirpes.

Preparação de um litro de tampão salino concentrado 10 vezes (PBS pH 7,4): a 0,800 L de água para preparação injetável, adicionar NaCl 80 g, KCI 2 g, Na2HPC>4 11,44 g, KH2PO4 2 g. Após solubilização, ajustar a 1,0 L com água para preparação injetável. O pH situar-se-á a 7,4 quando diluído 10 vezes.

Dissociado trivalente/simples A formulação de uma dose de 50 pL é preparada extemporaneamente de acordo com a seguinte sequência: Água para preparação injetável + Tampão Salino (PBS concentrado 10 vezes pH 7,4) + Pré-mistura, 5 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 1,5 pg de HA de estirpe H1N1, 10 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 1,5 pg de HA de estirpe H3N2, 10 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 1,5 pg de HA de estirpe B, 15 min de agitação magnética à temperatura ambiente. As formulações são injetadas dentro da hora após o final da sua preparação.

Dissociado trivalente/AS03

Uma Pré-mistura de Tween 80, Triton X100 e Succinato de

Vitamina E (VES) é preparada para se conseguir uma concentração final na vacina de 750 pg/mL de Tween 80, 110 pg/mL de Triton X100 e 100 pg/mL de VES. As quantidades utilizadas na pré-mistura são calculadas tendo em consideração as quantidades de detergente e VES já presentes nas estirpes. A formulação de uma dose de 50 pL é preparada extemporaneamente de acordo com a seguinte sequência: Água para preparação injetável + Tampão Salino (PBS concentrado 10 vezes pH 7,4) + Pré-mistura, 5 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 1,5 pg de HA da estirpe H1N1, 10 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 1,5 pg de HA da estirpe H3N2, 10 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 1,5 pg de HA da estirpe B, 15 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 25 pL de emulsão SB62 para o AS03 de dose completa ou 5 pL de emulsão SB62 para o AS03 de 1/5 de dose, 15 min de agitação magnética à temperatura ambiente. As formulações são injetadas dentro da hora após o final da sua preparação. IV.1.3. Leituras (Tabela 10) A resposta imune humoral à vacinação foi medida antes da imunização (dia 28) e 14 dias após a imunização (27 ratinhos/grupo). Amostras de soro foram testadas pelo teste de inibição da hemoglutinação (Hl).

IV.2. Resultados IV.2.1. Imunidade humoral

Os resultados são apresentados na Figura 5. Neste modelo de ratinho de preparação heterossubtípico seguido de vacinação única, foi demonstrado que o AS03 e as suas diluições induzem títulos de Hl mais altos em comparação com a vacina simples. Para todas as estirpes de gripe A, foi observado um aumento estatisticamente significativo dos títulos de Hl (p < 0,05) .

Para a estirpe H1N1, foi também observada uma diferença significativa nos títulos de Hl entre AS03 e AS03 1/5 (p < 0,05) . Uma dose reduzida de AS03 não conseguiu aumentar os títulos de Hl para todas as três estirpes em comparação com a vacina simples. Foram observadas respostas muito baixas contra a estirpe B (B/Shangdong) ; é provável que isto seja devido à deriva antigénica significativa entre as estirpes B utilizadas para a preparação e a vacinação. IV.3. Sumário dos resultados e conclusões

Em conclusão, foi observado um aumento nos títulos de Hl nos animais preparados com estirpes heterossubtípicas quando se utilizam as vacinas com adjuvante AS03 em comparação com a vacina simples. Uma dose completa de AS03 foi ótima para se obter títulos de Hl robustos contra todas as três estirpes de vacinas da gripe.

Exemplo V - Avaliação pré-clínica de vacinas da gripe dissociadas com adjuvante e sem adjuvante (compreendendo várias doses de adjuvante AS03) em ratinhos C57BI/6 preparados V.l. Conceção experimental e objetivo

Foram realizadas experiências em ratinhos preparados com o vírus da gripe para avaliar o aumento nas respostas humoral e celular pelas vacinas da gripe induzidas com AS03 formuladas com este adjuvante de óleo em água. A fim de simular a situação em seres humanos, foi realizada uma experiência utilizando ratinhos preparados com estirpes heterossubtípicas. V.l.l. Tratamento/grupo (Tabela 11)

Grupos de 25 ratinhos C57BI/6 fêmeas adultos foram preparados por via intranasal (20 pL volume) no dia 0 com vírus da gripe trivalente inteiro inativado com formalina (5 pg de HA para cada estirpe). As estirpes de condicionamento consistiram de variantes de deriva anteriores (5 pg de HA de H1N1 A/Pequim/262/95, H3N2 A/ Panamá/2007/99, B/ Shangdong/7/97 inteiro inativado) àquelas incluídas na vacina. Vinte e oito dias mais tarde, os ratinhos foram vacinados com uma dose única do candidato a vacina por via intramuscular num volume total de 100 pL. Os ratinhos foram imunizados com formulações contendo antigénios dissociados sozinhos (dissociados trivalentes simples) ou formulações contendo antigénios dissociados com adjuvante nas três doses de AS03 (completa, 1/2 ou 1/5) . As estirpes utilizadas para as imunizações incluíram antigénios virais de H1N1 A/Nova Caledónia/20/99, H3N2 A/Nova Iorque/55/2004, B/Jiangsu/10/2003 (1,5 pg/estirpe, 1/10 da dose humana).

V.1.2. Preparação das formulações de vacina

Dissociado trivalente/simples

As formulações para uma dose de 100 pL são preparadas extemporaneamente de acordo com a seguinte sequência: Água para preparação injetável + Tampão Salino (PBS concentrado 10 vezes, pH 7,4 preparado como se explica no exemplo IV) + Fluarix

Clínica Lote DFLUA014 (1,5 pg por estirpe na dose final).

Dissociado trivalente/AS03

As formulações para uma dose de 100 pL são preparadas extemporaneamente de acordo com a seguinte sequência: Água para preparação injetável + Tampão Salino (PBS concentrado 10 vezes, pH 7,4 preparado como se explica no exemplo IV) + Fluarix Clínica Lote DFLUA014 (1,5 pg por estirpe na dose final) + 25 pL de emulsão SB62 para a dose completa ou 12,5 pL de emulsão de SB 62 para ^ dose ou 5 pL de emulsão SB62 para 1/5 de dose. As formulações são injetadas dentro da hora após o final da preparação. V.1.3. Leituras (Tabela 12) A resposta imune humoral à vacinação foi medida 21 dias após imunização (10 ratinhos/grupo) e as amostras de soro foram testadas pelo teste de inibição da hemoglutinação (HI). A resposta imune celular foi testada 7 dias após imunização por revelação de citocinas intracelulares (ICS).

V.2. Resultados V.2.1. Imunidade humoral (10 ratinhos/grupo).

Os resultados são apresentados na Figura 6. Neste modelo de ratinho de preparação heterossubtípica, seguido de uma única vacinação, verificou-se que o AS03 e diluições (1/2 e 1/5) do mesmo induzem títulos de Hl mais altos em comparação com a vacina simples. Para todas as três estirpes, não foi observada diferença dos títulos de Hl entre ratinhos que receberam a vacina com adjuvante uma dose completa de AS03 ou doses reduzidas de AS03. V.2.2. Imunidade celular (15 ratinhos/grupo).

Os resultados são apresentados na Figura 7. Qualquer que fosse a diluição de AS03, foram observados respostas de células T CD4+ mais altas em ratinhos imunizados com vacina dissociada trivalente com adjuvante AS03 em comparação com ratinhos imunizados com dissociados trivalentes simples. Em comparação com a resposta induzida em ratinhos imunizados com dissociado trivalente com adjuvante numa dose completa de AS03, foi observada uma tendência para respostas celulares inferiores quando os ratinhos foram imunizados com dissociado trivalente com adjuvante nas doses menores de AS03. V.3. Sumário de resultados e conclusões

Em conclusão, foi observado um aumento nas respostas humoral e celular em animais preparados com estirpes heterossubtípicas quando se utilizou as vacinas com adjuvante AS03 em comparação com a vacina simples. Foi observada uma grandeza de resposta humoral semelhante entre ratinhos imunizados com a dose completa ou doses fracionadas de adjuvante AS03. No entanto, uma redução na dose de adjuvante foi associada a uma tendência para uma grandeza reduzida da resposta de células T CD4+.

Exemplo VI - Avaliação pré-clínica da resposta imune celular induzida pelas vacinas da gripe dissociadas com adjuvante e sem adjuvante (compreendendo várias doses de adjuvante AS03 e dose baixa de antigénio) em ratinhos C57BI/6 preparados VI.1. Conceção experimental e objetivo

Foram realizadas experiências em ratinhos preparados com o vírus da gripe para avaliar o aumento nas respostas imunes celulares pelas vacinas da gripe induzidas pelo AS03 contendo dose baixa de antigénio (0,5 pg/estirpe, 1/30 da dose humana) e formuladas com este adjuvante de óleo em água. Para simular a situação em seres humanos, foi realizada uma experiência utilizando ratinhos preparados com estirpes heterossubtípicas. VI.1.1. Tratamento/grupo (Tabela 13)

Grupos de 15 ratinhos C57BI/6 fêmeas adultos foram preparados por via intranasal (20 pL volume) no dia 0 com vírus da gripe trivalente inteiro inativado com formalina (5 pg de HA para cada estirpe) . As estirpes de condicionamento consistiram de variantes de deriva anteriores (5 pg de HA de H1N1 A/Pequim/262/95, H3N2 A/ Panamá/2007/99, B/ Shangdong/7/97 inteiro inativado) àquelas incluídas na vacina. Vinte e oito dias mais tarde, os ratinhos foram vacinados com uma dose única da vacina candidata por via intramuscular num volume total de 50 pL. Os ratinhos foram imunizados com formulações contendo antigénios dissociados sozinhos (dissociados trivalentes simples) ou formulações contendo antigénios dissociados com adjuvante nas três doses de AS03 (completa, 1/2 ou 1/5) . As estirpes utilizadas para as imunizações incluíram os antigénios virais de H1N1 A/Nova Caledónia/20/99, H3N2 A/Nova Iorque/55/2004, B/Jiangsu/10/2003 (0,5 pg/estirpe, 1/30 da dose humana).

VI.1.2. Preparação das formulações de vacina

Dissociado trivalente/simples

As formulações para uma dose de 50 pL são preparadas extemporaneamente de acordo com a seguinte sequência: Água para preparação injetável + Tampão Salino (concentrado 10 vezes PBS, pH 7,4 preparado como se explica no exemplo IV) + Fluarix Clínica Lote DFLUA014 (0,5 pg por estirpe na dose final).

Dissociado trivalente /AS03

As formulações para uma dose de 50 pL são preparadas extemporaneamente de acordo com a seguinte sequência: Água para preparação injetável + Tampão Salino (PBS concentrado 10 vezes, pH 7,4 preparado como se explica no exemplo IV) + Fluarix Clínica Lote DFLUA014 (0,5 pg por estirpe na dose final) + 25 pL de emulsão SB62 para a dose completa ou 12,5 pL de emulsão SB62 para a Vi dose ou 5 pL de emulsão SB62 para 1/5 da dose. As formulações são injetadas dentro da hora após o final da preparação. VI.1.3. Leituras (Tabela 14) A resposta imune celular foi testada 7 dias após imunização por coloração de citocinas intracelulares.

VI.2. Resultados VI.2.1. Imunidade celular

Os resultados são apresentados na Figura 8. Foram observadas respostas de células T CD4+ marginalmente mais elevadas em ratinhos imunizados com vacina dissociada trivalente com adjuvante na AS03 (dose completa ou 1/2 dose) em comparação com ratinhos imunizados com dissociados trivalentes simples. Em comparação com a resposta induzida em ratinhos imunizados com dissociados trivalentes simples ou com adjuvante com uma dose completa ou com meia dose de AS03, foram observadas respostas celulares mais altas quando os ratinhos foram imunizados com dissociado trivalente com adjuvante a 1/5 da dose de AS03. VI.3. Sumário dos resultados e conclusões

Em conclusão, foi observado um aumento mínimo nas respostas de células T CD4+ em animais preparados heterossubtípicos quando foram utilizadas vacinas com adjuvante AS03 em comparação com a vacina simples. Não foi observada qualquer resposta à dose de adjuvante nesta experiência e, de facto, um 1/5 da dose de AS03 induziu frequências mais altas de células T CD4+ específicas para o antigénio do que era observado com doses mais altas de adjuvante. No seu todo, estes dados não são consistentes com outras experiências pré-clínicas e podem ser sugestivos de um problema técnico com esta experiência particular.

Exemplo VII - Avaliação pré-clínica de vacinas contra o H5N1 dissociadas com adjuvante e sem adjuvante (compreendendo várias doses de adjuvante AS03 e antigénio) em ratinhos C57BI/6 não modificados VII.1. Conceção experimental e objetivo

Foram realizadas experiências em ratinhos não modificados para H5N1 para avaliar o aumento nas respostas imunes humoral e celular pelas vacinas contra H5N1 dissociadas induzidas pelo AS03 formuladas com este adjuvante de óleo em água. No caso de uma pandemia, prevê-se que toda a população mundial seja imunologicamente não modificada para a nova estirpe da gripe pandémica circulante. Devido a este estado imunológico não modificado uma vacina contra a pandemia requererá provavelmente duas doses de vacina para proteger os indivíduos da infeção e doença grave provocada por uma nova estirpe da gripe. Para representar esta ausência de exposição prévia um modelo de ratinho não modificado foi desenvolvido para avaliar a imunogenicidade da vacina. VII. 1.1. Tratamento/grupo (Tabela 15)

Grupos de 15 ratinhos C57BI/6 fêmeas adultos não modificados foram imunizados nos dias 0 e 28 com o candidato a vacina contra ο H5N1 pandémico por via intramuscular num volume total de 50 pL. Os ratinhos foram imunizados com formulações contendo antigénios de H5N1 dissociados sozinhos (H5N1 dissociado simples) ou formulações contendo antigénios dissociados com adjuvante nas diferentes doses de AS03 (dupla, completa, 1/2 ou 1/5) . As estirpes utilizadas para as imunizações incluíram o antigénio viral de H5N1 A/Vietname/1194/04 (1,5 ou 0,38 pg/estirpe correspondente a 1/10 da dose humana). Não foi feita nenhuma formulação com uma dose dupla de AS03 mas, em vez disso, uma injeção simultânea de uma dose de 50 pL de H5N1 dissociado/AS03 completo + uma dose de 50 pL de AS03.

VII. 1.2. Preparação das formulações de vacina

Preparação de um litro de Tampão de Carga Final (PBS pH 7,2 ± 0,2) : a 0, 800 L de água para preparação injetável, adicionar NaCl 7, 699 g, KCI 0,200 g, MgCl2 x 6H20 0, 100 g, Na2HP04 x 12 H20 2,600 g, KH2PO4 0,373 g. Após solubilização, ajustar a 1,0 L com água para preparação injetável H5N1 dissociado/ simples

Preparação de uma dose de 50 pL: São adicionados tiomersal (quantidades tendo em consideração a sua concentração na estirpe) e Triton X100 ao

Tampão de Carga Final. Não é adicionado Tween 80 uma vez que o teor alvo na formulação é atingido pela concentração de Tween da estirpe. As concentrações finais são de 10 pg/mL para o

Tiomersal, 368 pg/mL para o Tween 80 e 35 pg/mL para o Triton X100 na dose de formulação de 1,5 pg. Aquelas são de 10 pg/mL para o Tiomersal, 93 pg/mL para o Tween80 e 8,9 pg/mL para o Triton X100 na dose de formulação de 0,38 pg. Após 5-30 min de agitação magnética são adicionados 1,5 ou 0,38 pg de HA (estirpe H5N1). As formulações são agitadas durante 30-60 minutos. O pH é verificado. As injeções ocorrem dentro da hora após o final da formulação. H5N1 dissociado/ AS03

Preparação de uma dose de 50 pL; São adicionados tiomersal (quantidades tendo em consideração a sua concentração na estirpe) e Triton X100 ao

Tampão de Carga Final. Não é adicionada Tween 80 uma vez que o teor alvo na formulação é atingido pela concentração de Tween da estirpe. As concentrações finais são de 10 pg/mL para o Tiomersal, 368 pg/mL para o Tween 80 e 35 pg/mL para o Triton X100 na dose de formulação de 1,5 pg. Aquelas são de 10 pg/mL para o Tiomersal, 93 pg/mL para o Tween80 e 8,9 pg/mL para o Triton X100 na dose de formulação de 0,38 pg. Após 5-30 min de agitação magnética são adicionados 1,5 ou 0,38 pg de HA (estirpe H5N1). Após 30-60 minutos de agitação magnética, são adicionados 25 ou 12,5 ou 5 pL de emulsão SB62. As formulações são agitadas durante 30-60 minutos. O pH é verificado. As injeções ocorrem dentro da hora após o final da formulação VII.1.3. Leituras (Tabela 16) A resposta imune humoral foi medida 14 dias após imunização (10 ratinhos/grupo) através dos títulos de anticorpos anti-Ig, IgGl e IgG2b (Figura 9, A-F) . A resposta imune humoral foi também medida 21 dias após imunização (10 ratinhos/grupo) pelo ensaio de inibição de hemoglutinação anti-H5Nl (Figura 10, A-B) . A resposta imune celular foi testada 6 dias após imunização (5 grupos de 3 ratinhos por grupo) através da revelação de citocinas intracelulares (ICS) de células T CD4+ específicas para o antigénio enumeradas por citometria de fluxo (Figura 11, A-B).

VII.2. Resultados VII. 2.1. Resposta imune humoral: ELISA e isotipos.

Os resultados são apresentados na Figura 9. A cada dose de vacina contra ο H5N1 fragmentado, todos os grupos com adjuvante induziram títulos de anticorpos de Ig, IgGl e IgG2b anti-H5Nl mais altos em comparação com a vacina contra o H5N1 dissociada sem adjuvante (Figuras 9-A a F). A cada dose de vacina contra ο H5N1 dissociada; a resposta de anticorpos de IgGl anti-H5Nl foi 4-5 vezes superior à resposta de anticorpos de IgG2b anti-H5Nl (Figuras 9-C a F). Com uma dose de 1,5 pg de HA de vacina contra ο H5N1 dissociada e combinada com cada dose de adjuvante, não foram observadas diferenças das respostas de anticorpos de Ig, IgGl e IgG2b anti-H5Nl (Figuras 9-A, C e E).

Com uma dose de 0,38 pg de HA de vacina contra ο H5N1 dissociada, foi obtida uma tendência para títulos de Ig anti-H5Nl mais altos após imunização com vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante a 2x a dose completa em comparação com a resposta induzida pela vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante a AS03/2 (p=0,7315) e AS03 1/5 (p=0,9744) (Figura 9-B) . Esta tendência foi também observada para a resposta de anticorpos de IgGl anti-H5Nl (Figura 9-D) . No entanto, a potência não foi suficiente para se observar uma diferença estatisticamente significativa (potência de 25% para uma diferença de 1,7 vezes, ou 47% para uma diferença de 2 vezes) . VII.2.2. Resposta imune humoral: títulos de Hl.

Com uma dose de 1,5 μg de HA/ratinhos: A cada dose de adjuvante, todos os ratinhos imunizados com vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante AS03 induziram títulos de Hl mais altos em comparação com a resposta obtida em ratinhos imunizados com a vacina contra ο H5N1 dissociada sem adjuvante (Figura 10-A). Não foram observadas diferenças de títulos de Hl quando a vacina contra ο H5N1 dissociada foi adjuvada com uma gama de dose de AS03 (Figura 10-A).

Com uma dose de 0,38 μg de HA/dose A cada dose de adjuvante, todos os ratinhos imunizados com vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante AS03 induziram títulos de Hl mais altos em comparação com a resposta obtida em ratinhos imunizados com a vacina contra ο H5N1 dissociada sem adjuvante (Figura 10B).

Foram observados títulos de Hl significativamente mais altos com a vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante a 2x a dose completa de AS03 em comparação com a resposta obtida com a vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante a AS03/2 (p=0,032 para uma diferença de 4 vezes) (Figura 10B). Não foram observadas diferenças nos títulos de Hl em ratinhos imunizados com vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante a 2x a dose completa de AS03 ou uma dose completa de AS03 ou entre ratinhos imunizados com vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante a AS03/2 ou AS03/5 (Figura 10B).

Comparação entre doses de antigénio (1,5 μg ou 0,38 ug) : Não foram observadas diferenças dos títulos de Hl entre ratinhos imunizados com cada dose de HA de vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante a AS03, AS03/2 ou AS03/5, exceto entre ratinhos imunizados com 1,5 pg de HA de H5N1 dissociado com adjuvante a AS03/5 e ratinhos imunizados com 0,38 pg de HA de H5N1 dissociado com adjuvante a 2x a dose completa de AS03 (Figura 10) . Os títulos de Hl foram significativamente mais altos após imunização com 0,38 pg de HA de H5N1 dissociado com adjuvante a 2x a dose completa de AS03 em comparação com a dose de antigénio mais alta combinada com a dose menor de adjuvante (1,5 pg de HA com AS03/5, p=0,0193 para uma diferença de 4 vezes) (Figura 10). VII. 2.3. Resposta imune celular

Os resultados são apresentados na Figura 11. A cada dose de vacina contra ο H5N1 dissociada (1,5 ou 0,38 pg) foram observadas respostas de células T CD4+ mais altas em ratinhos imunizados com vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante a várias doses de AS03 em comparação com ratinhos imunizados com a vacina contra ο H5N1 dissociada sem adjuvante (Figura 11). A uma dose de 1,5 pg de vacina contra ο H5N1 dissociada, uma redução das doses de AS03 correspondeu a uma diminuição na frequência de célula T CD4+ (Figura 11A). No entanto, a uma dose de 0,38 pg de vacina contra ο H5N1 dissociada não foi observada qualquer diferença nas respostas de células T CD4+ entre as diferentes doses de adjuvante em ratinhos imunizados com vacinas contra ο H5N1 dissociadas com adjuvante AS03 (Figura 11B). VII.3. Sumário dos resultados e conclusões

Os estudos de imunogenicidade em ratinhos mostraram que a vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante induzia respostas humoral (ELISA anti-H5Nl e títulos de Hl) e celular (células T CD4 +) significativamente mais altas do que aquelas induzidas pela vacina contra ο H5N1 dissociada sem adjuvante. Não foi observado qualquer efeito de resposta à dose de antigénio para a resposta imune humoral entre ratinhos imunizados com 1,5 pg e 0,38 pg de vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante, sugerindo que na presença de adjuvante podem ser necessárias doses ainda menores de HA para observar um efeito de resposta à dose neste modelo.

Foi observado um forte aumento nas respostas de células T CD4+ em ratinhos não modificados quando se utilizaram as vacinas pandémicas de H5N1 com adjuvante AS03 em comparação com a vacina contra ο H5N1 simples. Não foi observado qualquer impacto da diluição de AS03 quando uma dose de 0,38 pg de vacina contra o H5N1 dissociada foi utilizada como candidato a vacina, enquanto foi observada uma diminuição das respostas de células T CD4 quando foram utilizados 1,5 pg de vacina contra ο H5N1 dissociada com adjuvante à dose reduzida de AS03.

Como anteriormente observado, não foram observadas diferenças nas respostas imunes humoral e celular entre ratinhos imunizados com vacina contra ο H5N1 dissociada (a qualquer dose de antigénio) com adjuvante a uma dose completa de AS03 ou a AS03/2. Foi detetada alguma melhoria na resposta imune quando foi utilizada uma dose 2x a completa de AS03 na formulação de vacina e, em conformidade, foi detetada uma diminuição na resposta imune quando foi utilizado AS03/5 na formulação de vacina.

No seu todo, os dados aqui relatados suportam a potência deste novo sistema adjuvante nesta formulação de vacina.

Exemplo VIII - Avaliação pré-clínica de vacinas contra a gripe com adjuvante e sem adjuvante em porcos Brancos Grandes preparados VIII.1. Conceção experimental e objetivo

Foi realizada uma experiência em porcos preparados com gripe para avaliar o aumento das respostas humorais pelas vacinas da gripe induzidas pelo AS03 formuladas com este adjuvante de óleo em água.

Os porcos foram utilizados para avaliar uma gama de dose de AS03 num modelo animal próximo dos seres humanos. Os porcos apresentam uma longa lista de analogias biológicas que estabelecem este animal como fisiologicamente o mais próximo do homem com muito poucas exceções (Douglas R., 1972) . Além do mais, é geralmente observada a manifestação de infeção por gripe em porcos. VIII. 1.1. Tratamento/grupo (Tabela 17)

Grupos de 10 porcos Brancos Grandes fêmeas adultos foram preparados no dia 0 com virus da gripe trivalente inteiro inativado com formalina (25 pg de HA para cada estirpe) por via intranasal num volume total de 200 pL. As estirpes de condicionamento consistiram de estirpes homólogas às estirpes de vacinas (25 pg de HA de H1N1 A/Nova Caledónia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99 e B/Shangdong/7/97 inteiro inativado). Vinte e oito dias mais tarde, os porcos foram vacinados com uma dose única da vacina candidata por via intramuscular num volume total de 500 pL. Os porcos foram imunizados com formulações contendo antigénios dissociados sozinhos (dissociados trivalentes simples) ou formulações contendo antigénios dissociados com adjuvante numa gama de dose de AS03 (completa, 1/2 ou 1/5) . As estirpes utilizadas para as imunizações incluíram antigénios virais de H1N1 A/Nova Caledónia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99 e B/Shangdong/7/97 (15 pg de HA para as estirpes de H1N1 A/Nova

Caledónia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99 e 17,5 pg da estirpe B/Shangdong/7/97 como numa dose humana).

Grupos (10 porcos/grupo):

VIII.1.2. Preparação das formulações de vacina

Dissociado trivalente/simples É preparada uma pré-mistura de Tween 80, Triton X100 e Succinato de Vitamina E (VES) para se conseguir uma concentração final na vacina de 750 pg/mL de Tween 80, 110 pg/mL de Triton X100 e 100 pg/mL de VES. As quantidades utilizadas na pré-mistura têm em consideração o seu teor nas estirpes. A formulação de uma dose de 500 pL é preparada extemporaneamente de acordo com a seguinte sequência: Água para preparação injetável + Tampão Salino (PBS concentrado 10 vezes, pH 7,4 preparado como se explica no exemplo IV) + Pré-mistura, 5 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 15 pg de HA da estirpe H1N1, 10 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 15 pg de HA da estirpe H3N2, 10 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 17,5 pg de HA da estirpe B, 15 min de agitação magnética à temperatura ambiente. As formulações são injetadas dentro da hora após o final da sua preparação.

Dissociado trivalente /AS03 É preparada uma pré-mistura de Tween 80, Triton X100 e

Succinato de Vitamina E (VES) para se conseguir uma concentração final na vacina de 750 pg/mL de Tween 80, 110 pg/mL de Triton

X100 e 100 pg/mL de VES. As quantidades utilizadas na pré-mistura têm em consideração o seu teor nas estirpes. A formulação de uma dose de 500 pL é preparada extemporaneamente de acordo com a seguinte sequência: Água para preparação injetável + Tampão Salino (PBS concentrado 10 vezes, pH 7,4 preparado como se explica no exemplo IV) + Pré-mistura, 5 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 15 pg de HA da estirpe H1N1, 10 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 15 pg de HA da estirpe H3N2, 10 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 17,5 pg de HA da estirpe B, 15 min de agitação magnética à temperatura ambiente, + 250 pL de emulsão SB62 para a dose completa de AS03 ou 125 pL de emulsão SB62 para a 1/2 dose de AS03 ou 50 pL de emulsão SB62 para o AS03 a 1/5 de dose, 15 min de agitação magnética à temperatura ambiente. As formulações são injetadas dentro da hora após o final da sua preparação. VIII.1.3. Leituras (Tabela 18) A resposta imune humoral à vacinação foi medida antes do condicionamento intranasal (dia 0), antes da imunização (dia 28) e 14 dias após a imunização (10 porcos/grupo) . As amostras de soro foram testadas pelo teste de inibição de hemoglutinação (Hl) .

VIII.2. Resultados e conclusões VIII. 2.1. Imunidade humoral

Os resultados são apresentados na Figura 12. Qualquer que fosse a diluição do adjuvante, as formulações trivalentes dissociadas com adjuvante AS03 induzem uma resposta de Hl mais forte a todas as estirpes do que a formulação trivalente simples neste modelo de preparação homólogo, embora a significância estatística não seja sempre atingida para todas as três estirpes. Foi observado um efeito da dose de adjuvante com ligeiras diferenças de estirpe para estirpe. Para estirpes menos imunogénicas tais como B/Shangdong, apenas a vacina trivalente dissociada com adjuvante a uma dose completa de AS03 foi significativamente diferente da vacina simples. Em contraste com a vacina dissociada trivalente com adjuvante a uma dose completa de AS03, uma dose reduzida de AS03 não conseguiu aumentar os títulos de Hl para todas as três estirpes acima daqueles observados com a vacina simples.

Exemplo IX

Imunogenicidade de antigénios dPly-PhtD-PD com adjuvante AS03 a diferentes diluições. IX.1 Experiência Lims 20080257 A dPly (pneumolisina desintoxicada) e a PhtD (proteína D tríade de poli-histidina) são proteínas de Streptococcus pneumoniae enquanto a PD é proteína D de Haemophilus influenzae. Os ratinhos C57bl foram imunizados por via intramuscular três vezes (Dias 0, 14 e 28) com 1/10 de uma dose humana de dois lotes clínicos liofilizados de dPly-PhtD-PD (DSPEA005A e 006A) com adjuvante em AS03A (250 pg de SB62) (Grupos 1 e 2) . Foi utilizado um lote pré-clínico líquido de dPly-PhtD-PD em AS03A como vacina de referência (Grupo 3) . Foi também avaliado o lote clínico DSPEA005 reconstituído com AS03B (125 pg de SB62) e AS03C (62,5 pg de SB62) (Grupos 4 e 5) . Finalmente, os dois lotes clínicos liofilizados reconstituídos com solução salina foram injetados como comparadores para medir o efeito do adjuvante sobre a resposta imune induzida contra os antigénios dPly, PhtD e PD (Grupos 6 e 7) .

Os ratinhos foram sangrados no dia 42 e foi medida a resposta de anticorpos dirigida contra cada antigénio por ELISA. Os dados são apresentados na Figura 13 como GMC em pg/mL.

Foi demonstrada a consistência dos dois lotes clínicos de dPly-PhtD-PD (DSPEA005A e 006A). Não foi demonstrado qualquer impacto da liofilização (Grupo 1 e 2 vs o Grupo 3) . Foram induzidos títulos de anticorpo significativamente mais altos contra todos os antigénios pelas formulações com AS03 (Grupos 1 a 5) em comparação com as formulações sem adjuvante (Grupos 6 e 7) . Exceto para PD na formulação de AS03C (Grupo 5), não foi observada qualquer diferença significativa nos títulos de anticorpos induzidos contra cada antigénio pela formulação que contém diferentes concentrações de adjuvante (Grupos 1, 4 e 5) . IX.2 Experiência Lims 20080334-20080340

Os ratinhos C57bl foram imunizados por via intramuscular três vezes (Dias 0, 14 e 28) com 1/10 de uma dose humana dos lotes clínicos liofilizados de dPly-PhtD-PD (DSPEA006A) a diferentes concentrações (15-15-15; 30-30-30 e 60-60-60 pg) e reconstituídos em solução salina ou com adjuvante em AS03A (250 pg de SB62), AS03B (125 pg de SB62) e AS03C (62,5 pg de SB62) . Os ratinhos foram sangrados no dia 42 e foi medida a resposta de anticorpos dirigida contra cada antigénio por ELISA. Os dados são apresentados na Figura 14 como GMC em pg/mL.

Foi demonstrado um aumento significativo dos títulos de anticorpos dirigidos contra todos os antigénios na formulação contendo AS03 (Grupos 1 a 9) em comparação com as formulações contendo apenas solução salina (Grupos 10 a 12) . Não foi observado um impacto evidente da dose de antigénio na resposta imune dirigida contra cada antigénio. Não foi observado um impacto significativo da diluição do adjuvante sobre a resposta de anticorpos dirigida contra dPly e PhtD. Para PD foi observada uma diferença significativa entre AS03A e C à concentração de antigénio de 3 e 6 yg.

Lisboa, 25 de novembro de 2015

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunogénica compreendendo uma PhtD pneumocócica não conjugada e uma pneumolisina pneumocócica não conjugada, e uma composição adjuvante consistindo de uma emulsão de óleo em água, em que a referida emulsão de óleo em água consiste de 0,5-10 mg de óleo metabolizável, 3-9 mg de tocol e 0,1-4 mg de agente emulsionante por dose humana e o óleo e agente emulsionante estão num veiculo aquoso, em que o volume da dose se situa entre 0,4 e 1,5 mL.
2. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1 em que o volume da dose é 0,5 mL.
3. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 em que a emulsão de óleo em água compreende 1- 10, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7 ou 5-6 mg de óleo metabolizável, por dose humana.
4. Composição imunogénica de acordo com as reivindicações 1-3 em que a emulsão de óleo em água compreende 4-8, 5-7 ou 5-6 mg de tocol, por dose humana.
5. Composição imunogénica de acordo com as reivindicações 1-4 em que a emulsão de óleo em água compreende 0,3-4, 0,4-3 ou 2- 3 mg de agente emulsionante, por dose humana.
6. Composição imunogénica de acordo com as reivindicações 1-5 em que o óleo metabolizável é esqualeno.
7. Composição imunogénica como reivindicada em qualquer das reivindicações 1-6 em que o tocol é alfa-tocoferol.
8. Composição imunogénica como reivindicada em qualquer das reivindicações 1-7 em que o agente emulsionante é monooleato de polioxietileno sorbitano.
9. Composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 para utilização em terapia profilática ou terapia de infeção pneumocócica ou doença pneumocócica.
10. Utilização de uma composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 no fabrico de um medicamento para utilização em terapia profilática ou terapia de infeção pneumocócica ou doença pneumocócica. Lisboa, 25 de novembro de 2015