PT2081929E - Compostos de 3-isobutil-9,10-dimetoxi- 1,3,4,6,7,11b-hexahidro-2h-pirido[2,1-a]isoquinolin- 2-ol substituídos e métodos com estes relacionados - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "COMPOSTOS DE 3-ISOBUTIL-9,10-DIMETOXI-1,3,4,6,7,11B- HEXAHIDRO—2H—PIRIDO[2,1—A]ISOQUINOLIN-2-OL SUBSTITUÍDOS E MÉTODOS COM ESTES RELACIONADOS"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se geralmente a compostos de 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a] isoquinolin-2-ol substituídos e sua preparação. São também revelados métodos de tratamento de doenças por administração de tais compostos a um animal de sangue quente com necessidade dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H- pirido [2,1-a]isoquinolin-2-ona, também conhecida como tetrabenazina (TBZ), tem sido usada como fármaco durante décadas. A tetrabenazina é um inibidor potente e reversível da captação de catecolaminas pelo transportador vesicular de monoaminas 2 (VMAT2) (IC50 = 3,2 nM) (Scherman, et al, Proc.Natl. Acad. Sei. USA, (1983) 80:584-8) e é actualmente utilizada para o tratamento de vários distúrbios hipercinéticos do movimento. Os efeitos colaterais associados com a TBZ incluem sedação, depressão, acatisia e parkinsonismo. A inibição do VMAT2 pela TBZ resulta na deplecção de monoaminas cerebrais in vivo (Pettibone, DJ et al., Eur. J. Pharmacol. (1984) 102:431-6) . A TBZ também inibe os 1 receptores pré-sinápticos e pós-sinápticos da dopamina no cérebro de rato (Login, IS, et al., (1982) Ann. Neurology 12:257-62; Reches, et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. (1983) 225:515-521). Esta actividade extra-alvo da TBZ poderá ser responsável por alguns dos efeitos secundários observados. A TBZ, que contém dois centros quirais e é uma mistura racémica de dois estereoisómeros, é rápida e extensamente metabolizada ín vivo até à sua forma reduzida, 3-isobutil-9,10-dimetoxi-1, 3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-ol, também conhecida como dihidrotetrabenazina (HTBZ). Pensa-se que existem quatro isómeros individuais da HTBZ: (i)alfa-HTBZ e (±)beta-HTBZ. Crê-se que o 2R, 3R, llbR ou ( + )alfa-HTBZ constitui a configuração absoluta do metabolito activo (Chirality 1997 9:59-62). Apesar do seu sucesso no tratamento de distúrbios hipercinéticos, a tetrabenazina possui uma biodisponibilidade relativamente baixa e variável. A administração de tetrabenazina a seres humanos é complicada pelo extenso metabolismo de primeira passagem, sendo pouca ou nenhuma tetrabenazina encontrada na urina. Existe uma necessidade neste campo técnico de análogos de tetrabenazina que forneçam as propriedades vantaj osas da tetrabenazina, sem expor o organismo a todos os estereoisómeros de dihidrotetrabenazina. Há também uma necessidade de análogos de tetrabenazina que exibam uma semi-vida maior que a tetrabenazina. Existe também neste campo uma necessidade de análogos de tetrabenazina que exibam maior selectividade para o VMAT2 por comparação com a tetrabenazina. A presente invenção proporciona um análogo de tetrabenazina que expõe o organismo a um único estereoisómero de dihidrotetrabenazina, exibe uma maior selectividade para o VMAT2 que a tetrabenazina, apresenta uma 2 semi-vida maior do que a tetrabenazina, e poderá manifestar menor variabilidade quanto à dose necessária de paciente para paciente. A. Brossi et al., Helvetica Chimica Acta 1958, vol. 41, N°4, páginas 1793 a 1806, descrevem a síntese de 2-hidroxi-hidrobenzo[a]quinolizinas; M. Kilbourn et al., Chirality 1997, vol. 9, N°.l, páginas 59-62, descrevem a síntese de derivados de tetrabenazina e dihidrotetrabenazina e a separação dos enantiómeros por meio de cromatografia líquida quiral em coluna; G. Aranda et al., European Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 25, 1990, páginas 369-374, descrevem a síntese de um derivado iodado de tetrabenazina.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em resumo, a presente invenção é genericamente dirigida a compostos de 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7, llb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-ol substituídos e a enantiómeros individuais dos mesmos, bem assim como a métodos para a sua preparação e utilização e a composições farmacêuticas contendo os mesmos. Mais especificamente, os compostos de 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l, 3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-ol substituídos da presente invenção têm a estrutura geral (I) seguinte:

(I) incluindo os estereoisómeros e sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis destes, em que Ri é como definido abaixo. 3

Os compostos de 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-ol substituídos da presente invenção têm utilidade numa ampla gama de aplicações terapêuticas, e podem ser usados para tratar uma variedade de distúrbios, incluindo a família de distúrbios hipercinéticos do movimento. Adicionalmente, estes compostos podem ser úteis no tratamento de outros distúrbios ou estados de doença que estão associados com a inibição do transportador vesicular de monoaminas 2 (VMAT2).

Os métodos descritos incluem a administração de uma quantidade eficaz de 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexa-hidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-ol substituído, de preferência sob a forma de uma composição farmacêutica, a um mamífero com necessidade do mesmo. Assim, ainda numa outra forma de realização, são descritas composições farmacêuticas contendo um ou mais compostos de 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-ol substituídos da presente invenção em combinação com um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Estes e outros aspectos da invenção serão evidentes após referência à seguinte descrição detalhada. Para este fim, são aqui apresentadas várias referências que descrevem mais detalhadamente algumas informações, procedimentos, compostos e/ ou composições anteriores. 0 problema da presente invenção é resolvido com base nas reivindicações N°.1 a N°.12. 4

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras la, lb e lc compreendem três gráficos que mostram a conversão de tetrabenazina, do composto 2-1 e do composto 3-1 nos seus respectivos metabolitos em hepatócitos humanos.

As figuras 2a - 2f compreendem seis gráficos que mostram o perfil de estabilidade dos compostos 3-1 e 2-1 nos microssomas de fígado de rato, cão e humano.

As Figuras 3a - 3d compreendem quatro gráficos que mostram as propriedades farmacocinéticas dos compostos 2-1 e 3-1 em cães e ratos e de ld.l no rato.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Como mencionado acima, a presente invenção é genericamente dirigida a compostos de 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-ol substituídos. Os compostos da presente invenção possuem a seguinte estrutura (I):

(D e estereoisómeros, sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que Ri é -C(=0)-0-alquilo; ou em que Ri é -C (=0)-Ci-6alcanodiilo-NH2, e em que o referido Ci-6alcanodiilo é -CH2-, -CH2CH2-, -CH(CH3)-, -CH2CH2CH2-, -CH(CH3)CH2CH2-,-CH2C(CH3)2CH2-, -CH[CH(CH3)2]-, -CHCH2 [CH (CH3) 2] - ou —C (CH3) 2—, e é opcionalmente substituído com um grupo seleccionado de entre -NH-C(=NH)NH2, -C02H, -C02Me, -SH, 5 -C(0)NH2, -NH2, -SCHsfenilo, -OH, 4-hidroxi-fenilo, imidazolilo e indolilo.

Tal como aqui são usados, os termos acima têm os seguintes significados: "Alquilo" significa um hidrocarboneto alifático de cadeia linear ou ramificada, aciclico ou cíclico, insaturado ou saturado contendo de 1 a 10 átomos de carbono, enquanto que o termo "Alquilo Ci-4" tem o mesmo significado que alquilo mas contém de 1 a 4 átomos de carbono. "Alquilo C1-6" tem o mesmo significado que alquilo mas contém de 1 a 6 átomos de carbono. Os alquilos de cadeia linear saturada representativos incluem metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo e semelhantes; enquanto que os alquilos ramificados saturados incluem isopropilo, sec-butilo, isobutilo, tert-butilo, isopentilo e similares. Os alquilos cíclicos saturados representativos incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, -CH2-ciclopropilo, -0¾-ciclobutilo, -CH2-ciclopentilo, -CH2-ciclohexilo, enquanto que os alquilos cíclicos insaturados incluem ciclopentenilo e ciclohexenilo. Os alquilos cíclicos incluem anéis di- e poli-homocíclicos tais como decalina e adamantilo. Os alquilos insaturados contêm pelo menos uma ligação dupla ou tripla entre átomos de carbono adjacentes (referidos como "alquenilo" ou "alquinilo", respectivamente). Os alquenilos de cadeias linear e ramificada representativos incluem etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-l-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, enquanto os alquinilos de cadeias linear e ramificada representativos incluem acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-l-butinilo. 6 "Alcanodiilo Ci_6" significa um alquilo Ci_6 divalente a partir do qual dois átomos de hidrogénio são retirados do mesmo átomo de carbono ou de átomos de carbono diferentes, tais como -ch2-, -ch2ch2-, -CH(CH3)-, -CH2CH2CH2-, -CH (CH3) ch2ch2-, -CH2C(CH3)2CH2-. "Resíduo de aminoácido" significa uma estrutura de aminoácido que não possui o grupo hidroxilo do grupo a-carboxilo. Por exemplo, o resíduo de alanina é -C(=0)-CH(NH2)CH3.

Numa forma de realização, o R3 da estrutura (I) é -C(=0)0-alquilo, tal como mostrado na estrutura (II), e em outra forma de realização, o Ri da estrutura (I) é -C (=0) -C1_6alcanodiilo-NH2, como mostrado na estrutura (III) .

Numa forma de realização, o C-i_6alcanodiilo-NH2 da estrutura (III) é o (S)-l-amino-2-metil-propan-l-ilo, como mostrado na estrutura (IV). A estrutura (V) mostra uma concretização da estrutura (I) em que Ri é -C (=0) -Ci-6alcanodiilo-NH2 e o Ci_ 6alcanodiilo está substituído com -C00H. 7

CO,H (V)

Em formas de realização adicionais, Ri da estrutura (I) é um resíduo de aminoácido conforme mostrado na estrutura (VI) . A estrutura (VII) mostra uma forma de realização da estrutura (VI) em que o resíduo de aminoácido é a valina.

(Viíj

Numa forma de realização, os compostos da presente invenção podem existir sob a forma de mistura racémica, como um par diastereomérico, ou como enantiómero individual ou mistura de enantiómeros. A estrutura (VIII) mostra a numeração dos anéis para os compostos de 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,lb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-ol substituídos da invenção. Os estereocentros estão localizados nas posições 2, 3 e 11b do sistema de anéis. Os compostos da presente invenção incluem a confiquração 2 R, 3 R, llb.R, bem como a 2 R, 3R, HbS, a 2 R, 35, 11bR, a 25, 3R, 11bR, a 2R, 35, llb5, a 25, 3 R, llb5, a 25, 35, llbR, e a 25, 35, llb5. Os enantiómeros 2 A, 3 R, llb-R e 8 25, 35, llb5 são mostrados nas estruturas (IX) e (X) , respectivamente.

OR, (IX)

OR (X)

Os compostos da presente invenção podem ser preparados por técnicas de síntese orgânica conhecidas, incluindo os métodos descritos em mais pormenor nos Exemplos. Em geral, os compostos com a estrutura (I) acima podem ser preparados através dos s esquemas de reacção que se seguem, em que todos os substituintes são como definidos acima, a menos que indicado de outra forma.

Esauema de Reaccão 1

A redução de uma mistura racémica de tetrabenazina R, R e 5,5 com um agente redutor de borohidreto fornece dihidrotetrabenazina a. Quando o agente redutor é o tri-sec-butilborohidreto de lítio (L-Selectride), são gerados predominantemente os isómeros 2S, 3R, llb-R e 2R, 35, llb5. 0 uso de borohidreto de sódio resulta numa mistura de todos os quatro estereoisómeros. Os estereoisómeros restantes podem ser sintetizados partindo de qualquer dos estereoisómeros anteriormente gerados, ou de todos eles, e 9 tal como fazendo-os reagir com um agente desidratante, pentacloreto de fósforo, para formar o composto insaturado que é então estereoselectivamente re-hidratado por, por exemplo, um procedimento de hidroboração usando borano-THF para formar um complexo de borano, o qual é oxidado até à dihidrotetrabenazina adequada usando peróxido de hidrogénio (Clarke et al., WO2005077946). Os produtos racémicos podem ainda ser separados por cromatografia quiral para se obterem os enantiómeros individuais.

Esoiieina dfe Reaccão 2

0 intermediário de cloroformato c pode ser gerado por tratamento de a com fosgénio ou trifosgénio. 0 tratamento de c com um álcool na presença de uma base tal como DMAP gera 0 produto de carbonato d. Alternativamente, o carbonato d pode ser gerado directamente por tratamento do álcool a com Um pirocarbonato sob catálise com DMAP.

Rsquema de Reaoção 3

10 A dihidrotetrabenazina a é condensada com um aminoácido protegido por BOC, utilizando cloridrato de l-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDCI) e dimetilaminopiridina (DMAP) em dimetilformamida e cloreto de metileno, seguindo-se a desprotecção da funcionalidade de BOC através de, por exemplo, uma solução 50/50 de ácido trifluoroacético/cloreto de metileno para produzir e.

Alternativamente, a dihidrotetrabenazina a pode ser condensada com um aminoácido protegido por CBZ usando DCC (1,3-diciclo-hexilcarbodiimida), seguindo-se a desprotecção da funcionalidade de CBZ por hidrogenação sob condições adequadas.

Os compostos da presente invenção exibem maior selectividade para VMAT2 do que a tetrabenazina. Como resultado, estes podem proporcionar as propriedades desejáveis da tetrabenazina sem todos os efeitos secundários indesejáveis. Além disso, como mostrado na Figuras 3a - 3d, certos compostos da presente invenção, tais como, por exemplo, o composto 2-1, fornecem inesperadamente uma maior duração de acção do que a tetrabenazina. Isto pode ser particularmente benéfico porque pode possibilitar um regime de administração que requer menos doses por dia do que a tetrabenazina. Por exemplo, enquanto que a tetrabenazina é tipicamente administrada 2-3 vezes por dia, certos compostos da presente invenção, tais como, por exemplo, o composto 2-1, podem ser terapeuticamente eficazes quando administrados apenas uma vez por dia. Assim, devido à duração de acção inesperadamente mais longa proporcionada por estes compostos, pode ser atingida a dosagem de uma vez por dia.

Os compostos da presente invenção incluem os seguintes ésteres: 11 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido [2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do ácido (S)-2-Amino-3-metil- butírico

Os compostos da presente invenção incluem os seguintes carbonatos: 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido [2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do etiléster de ácido carbónico; 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido [2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do butiléster de ácido carbónico; 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do pentiléster de ácido carbónico; 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido [2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do isobutiléster de ácido carbónico; 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido [2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do sec-butiléster de ácido carbónico; 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido [2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do 3-metil-butiléster de ácido carbónico, e 3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido [2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do tert-butiléster de ácido carbónico.

Os compostos da presente invenção podem geralmente ser utilizados sob a forma de ácido livre ou de base livre. Alternativamente, os compostos da presente invenção podem ser utilizados sob a forma de sais de adição de ácido ou de base. Os sais de adição de ácido dos compostos amino livres da presente invenção podem ser preparados por métodos bem conhecidos neste 12 campo, e podem ser formados a partir de ácidos orgânicos e inorgânicos. Os ácidos orgânicos adequados incluem os ácidos maleico, fumárico, benzóico, ascórbico, succinico, metanossulfónico, acético, trifluoroacético, oxálico, propiónico, tartárico, salicilico, cítrico, glucónico, láctico, mandélico, cinâmico, aspártico, esteárico, palmítico, glicólico, glutâmico e benzenossulfónico. Ácidos inorgânicos adequados incluem os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico e nítrico. Os sais de adição de base incluem os que se formam com o anião carboxilato e incluem sais formados com catiões orgânicos e inorgânicos tais como os escolhidos a partir dos metais alcalinos e alcalino-terrosos (por exemplo, lítio, sódio, potássio, magnésio, bário e cálcio) , assim como com o ião amónio e seus derivados substituídos (por exemplo, dibenzilamónio, o termo "sal pretende englobar benzilamónio, 2-hidroxietilamónio). Assim, farmaceuticamente aceitável" de estrutura (i; todas e quaisquer formas de sal aceitáveis. compostos da os

No que respeita aos estereoisómeros, estrutura (I) podem ter centros quirais e podem ocorrer como racematos, misturas racémicas e como enantiómeros ou diastereómeros individuais. Todas essas formas isoméricas estão incluídas na presente invenção, incluindo as suas misturas. Além disso, algumas das formas cristalinas dos compostos de estrutura (I) podem existir como polimorfos, que estão incluídos na presente invenção. Além disso, alguns dos compostos de estrutura (I) podem também formar solvatos com água ou outros solventes orgânicos. Tais solvatos estão similarmente incluídos no âmbito da presente invenção.

Como mencionado acima, os compostos da presente invenção e os seus sais podem reduzir o fornecimento de monoaminas no 13 sistema nervoso central através da inibição da isoforma 2 do transportador vesicular de monoaminas (VMAT2) humano. Como tal, estes compostos e seus sais podem ter utilidade numa ampla gama de aplicações terapêuticas, e podem ser usados para tratar uma variedade de doenças que são causadas por, ou estão ligadas à, inibição da isoforma 2 do transportador de monoaminas humano. Estes distúrbios incluem distúrbios hipercinéticos.

Numa forma de realização, as alterações de saúde que podem ser tratadas pelos compostos da presente invenção incluem o tratamento de distúrbios hipercinéticos como a doença de Huntington, discinesia tardia, sindrome de Tourette e tiques.

Noutra forma de realização da invenção, os compostos da presente invenção e os seus sais podem ser hidrolisados no organismo de um mamífero até compostos que podem inibir a isoforma 2 do transportador vesicular de monoaminas humano. Como tal, estes compostos e seus sais podem ter uma utilidade adicional na alteração das propriedades in vivo do metabolito num mamífero, tais como a concentração máxima ou a duração da acção.

Noutra forma de realização da invenção, são reveladas composições farmacêuticas contendo um ou mais inibidores da recaptação das monoaminas. Para fins de administração, os compostos da presente invenção podem ser formulados como composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem um inibidor da recaptação de monoaminas segundo a presente invenção e um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. O inibidor do VMAT2 está presente na composição numa quantidade que é eficaz para tratar um distúrbio particular - ou seja, numa quantidade suficiente para reduzir o aporte de monoaminas ao sistema nervoso central, e de preferência com uma toxicidade aceitável para o paciente. As concentrações e 14 dosagens apropriadas podem ser facilmente determinadas por um perito na técnica.

Os veículos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis são familiares aos peritos neste campo técnico. Para composições formuladas como soluções líquidas, os transportadores e/ou diluentes aceitáveis incluem soro fisiológico e água esterilizada, e podem incluir opcionalmente antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e outros aditivos comuns. As composições podem também ser formuladas como pílulas, cápsulas, grânulos ou comprimidos contendo, além de um inibidor do VMAT2, diluentes, agentes dispersantes e agentes tensioactivos, aglutinantes e lubrificantes. Um especialista neste campo pode ainda formular o inibidor de VMAT2 de modo adequado, e de acordo com as práticas aceites, tais como as divulgadas em Remington' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1990. É também revelado um método para o tratamento de distúrbios do sistema nervoso central ou periférico. Tais métodos incluem a administração de um composto da presente invenção a um animal de sangue quente numa quantidade suficiente para tratar o distúrbio. Neste contexto, "tratar" inclui a administração profilática. Tais métodos incluem a administração sistémica de um inibidor do VMAT2 da presente invenção, de preferência sob a forma de uma composição farmacêutica, tal como discutido acima. Tal como aqui é usado, o termo "administração sistémica" inclui métodos orais e parentéricos de administração. Para administração oral, as composições farmacêuticas adequadas incluem pós, grânulos, pílulas, comprimidos e cápsulas bem como líquidos, xaropes, suspensões e emulsões. Estas composições também podem incluir aromatizantes, conservantes, agentes de suspensão, espessantes e 15 emulsionantes e outros aditivos farmaceuticamente aceitáveis. Para administração por via parentérica, os compostos da presente invenção podem ser preparados em soluções aquosas para injecção que podem conter, para além do inibidor do VMAT2, tampões, antioxidantes, bacteriostáticos e outros aditivos habitualmente utilizados em tais soluções.

EXEMPLOS Métodos de HPLC para a análise das amostras

Tempo de retenção, tR, em minutos HPLC—MS Analítico - Método 1

Plataforma: Agilent Série 1100: equipado com um sistema de auto-amostraqem, um detector de UV (220 nM e 254 nM), um detector de MS (APCI);

Coluna de HPLC: Phenomenex Synerqi-Max RP 80A, coluna de 2,0 x 50 mm;

Gradiente de HPLC: 1,0 mL/minuto, de acetonitrilo a 10% em áqua até acetonitrilo a 90% em água em 2,5 minutos, mantendo a 90% durante 1 minuto. Tanto o acetonitrilo como a água contêm TFA a 0,025%. HPLC-MS Analítico - Método 2

Plataforma: Agilent Série 1100: equipado com um sistema de auto-amostragem, um detector de UV (220 nM e 254 nM), um detector de MS (APCI);

Coluna de HPLC: Phenomenex Synergi-Max RP 80A, coluna de 2,0 x 50 mm; 16 gradiente de HPLC: 1,0 mL/minuto, de acetonitrilo a 5% em água até acetonitrilo a 95% em água em 13,5 minutos, mantendo a 95% durante 2 minutos. Tanto o acetonitrilo como a água contêm TFA a 0,025%. HPLC—MS Analítico - Método 3

Plataforma: sistema de auto-amostragem Gilson 215,

Compartimento de Coluna Termostatizado Dionex TCC-100 mantido a 30°C, Detector com Sistema de Díodos Dionex PDA-100 (220 nm e 254 nm), bomba de HPLC Dionex P680, Espectrómetro de Massa de quadrupolo simples MSQ, Thermo Finnigan (APCI).

Coluna de HPLC: Phenomenex Gemini 5μ C18 110A, 4,6 x 150 mm. Gradiente de HPLC: 2,5 ml/min, de acetonitrilo a 5% em água até acetonitrilo a 90% em água em 9,86 minutos, de acetonitrilo a 90% em água até acetonitrilo a 95% em água em 0,1 minutos, mantendo a 95% durante 1,19 minutos. Tanto o acetonitrilo como a água contêm NH4OH a 0,04%. HPLC-MS Analítico — Método 4

Plataforma: sistema de auto-amostragem Gilson 215,

Compartimento de Coluna Termostatizado Dionex TCC-100 mantido a 30°C, Detector com Sistema de Díodos Dionex PDA-100 (220 nm e 254 nm) , bomba de HPLC Dionex P680, Espectrómetro de Massa de quadrupolo simples MSQ, Thermo Finnigan (APCI)

Coluna de HPLC: Phenomenex Gemini 5μ C18 110A, 3,0 x 150 mm. Gradiente de HPLC: 1,5 mL/min, de acetonitrilo a 5% em água até acetonitrilo a 90% em água em 9,86 minutos, de acetonitrilo a 90% em água até acetonitrilo a 95% em água em 0,1 minutos, mantendo a 95% durante 1,19 minutos. Tanto o acetonitrilo como a água contêm NH40H a 0,04%. 17

Cromatografia Quiral com Fluido Supercrítico para o método de separação quiral 1

Plataforma: Sistema de SFC Berger Multigram II da AutoChem Coluna: coluna de SFC Chiralcel OD-H, 2,1 x 25 cm Modificador: metanol a 20%

Taxa de fluxo: 60 mL/min

Pressão: 100 bar

Temperatura do forno: 35°C

Carga: cerca de 14 mg/injecção (metanol)

Cromatografia Quiral com Fluido Supercrítico para o método de separação quiral 2

Plataforma: Sistema de SFC Berger Multigram II da AutoChem Coluna: coluna de SFC Chiralpak AS-H, 2,1 x 25 cm Modificador: metanol a 20%

Taxa de fluxo: 60 mL/min Pressão: 100 bar Temperatura do forno: 35°C Carga: 40 mg/injecção (MeOH)

Cromatografia Quiral com Fluido Supercrítico para o método de separação guiral 3

Coluna: coluna de SFC Chiralpak IA, 2,1 x 25 cm Modificador: 28% (Metanol/Acetona = 7:3)

Taxa de fluxo: 55 mL/min Pressão: 100 bar 18

Temperatura do forno: 35°C Carga: 50 mg/injecção A amostra foi dissolvida numa mistura 1:1 de Metanol/ Acetona. A concentração final era de 50 mg/mL. EXEMPLO 1 (2R,3R,11BR)-3-ISOBUTIL-9,10-DIMETOXI-1,3,4,6,7,11B-HEXAHIDRO-2H-PIRIDO[2,1-A]ISOQUINOLIN—2—OL((2R,3R,11BR)-DIHIDROTETRABENAZINA)

Passo IA: 3-dimetilaminometil-5-metil-hexan-2-ona

Suspenderam-se dimetilamina HC1 (90g, 1,1 mol) , 5-metil-2- hexanona (450 mL, 3,3 mol) e paraformaldeido (50 g, 1,7 mol) em MeOH (80 mL) e foi adicionado HC1 concentrado (200 pL). A mistura de reacção foi aquecida a 80°C durante 12 horas. A mistura foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente e adicionou-se-lhe NaOH a 10% até a tornar básica. Toda a mistura foi extraída com Et20 (100 mL, 2x). A camada orgânica foi seca com MgS04 e concentrada. A mistura reaccional em bruto foi introduzida numa coluna para um procedimento de cromatografia flash em coluna (0,5:9,5 MeOH:CH2CI2) , fornecendo 30 g (175 mmol) de 3- dimetilaminometil-5-metil-hexan-2-ona la com um rendimento de 16%.

Passo 1B: Metiodeto de 3-dimetilaminometil-5-metil-hexan-2-ona A um balão de fundo redondo adicionou-se 3- dimetilaminometil-5-metil-hexan-2-ona la (30 g, 175 mmol) e EtOAc (300 mL) , seguidos de iodeto de metilo (22 mL, 351 mmol) . A mistura foi agitada durante 12 horas e formou-se um precipitado branco. 0 precipitado foi filtrado, lavado com Et20 (150 mL, 3X) 19 e seco para se obter metiodeto de 3-dimetilaminometil-5-metil-hexan-2-ona lb (44,9 g, 81% de rendimento) sob a forma de um sólido branco em flocos macios.

Passo 1C: Tetrabenazina A um balão de fundo redondo adicionou-se 6,7-dimetoxi- 3,4-dihidroisoquinolina (13g, 67,8 mmol), metiodeto de 3- dimetilaminometil-5-metil-hexan-2-ona lb (26 g, 81,4 mmol) e EtOH (130 mL) . A suspensão foi aquecida a 80°C durante 12 horas. A mistura reaccional foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente e adicionou-se H20 (200 mL) , formando-se um precipitado. O EtOH foi removido por vácuo e foi adicionado CH2CI2 (400 mL) . Adicionou-se uma solução de NaOH a 10% à mistura até esta se tornar básica. A camada aquosa foi então extraída 3 vezes com CH2C12 (250 mL). As camadas orgânicas foram combinadas, secas com MgS04 e concentradas. A mistura reaccional em bruto foi purificada por meio de cromatografia flash em coluna (0,5:9,5 acetona:CH2C12) e posteriormente recristalizada usando EtOAc e hexanos para fornecer 16,1 g (5,1 mmol) de uma mistura racémica de (3 S, llbS) e de (3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi- 1,3,4,6, 7, llb-hexahidro-pirido [2,1-a]isoquinolin-2-ona lc (tetrabenazina,TBZ) com um rendimento de 75%. Os enantiómeros de tetrabenazina foram separados por SFC utilizando uma coluna Chiralpak AD-H com 15% CAN/MeOH mais DMEA 0,5% a 2,5 mL/min, a 100 bar e 35°C, para se obter 4,3 g de (3R, llbR)-tetrabenazina lc.l e 4,3 g de (3S,llbS)-tetrabenazina 1C.2. (3R,llbR) - tetrabenazina lc.l: MS, cálculo: (317); Encontrado 318,7 (M+H) . (3S,llbS)-tetrabenazina 1C.2: MS, cálculo: (317); Encontrado 318,7 (M+H). 20

Passo 1D: (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-ol

Dissolveu-se (3R,llbR)-Tetrabenazina lc.l (2g, 6,3 mmol) em

EtOH (70 mL) , arrefecendo-se a solução até 0°C. Adicionou-se então borohidreto de sódio (261 mg, 6,9 mmol), em porções, a 0°C. A reacção completou-se após 30 minutos e foi interrompida com NH4CI saturado (4 mL). O precipitado branco formado foi filtrado e lavado com EtOH (5 mL, 2 x). O EtOH foi removido por vácuo e a camada aquosa foi extraída 3x com CH2C12 (50 mL) . As camadas orgânicas foram combinadas, secas com MgS04 e concentradas. O produto bruto foi purificado por meio de cromatografia flash em coluna (0,5:9,5 MeOH:CH2Cl2) para fornecer 1,6 g (5 mmol) de (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-ol((2R,3R,llbR)-dihidrotetrabenazina) ld.l e 410 mg (1,3 mmol) de (2S,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l, 3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-ol( (2S,3R,llbR)-dihidrotetrabenazina)ld.2. (2R,3R,llbR)-

Dihidrotetrabenazina ld.l: MS, cálculo: (319); Encontrado 320,3 (M+H) . (2S,3R,llbR)-Dihidrotetrabenazina ld.2: MS, cálculo: (319), Encontrado 320,3 (Μ + H). EXEMPLO 2

(2R,3R,11BR)—3—ISOBUTIL—9,10-DIMETOXI-1,3,4,6,7,11B-HEXAHIDRO-2H-PIRIDO[2,1-A]ISOQUINOLIN-2-IL-ÉSTER DO ÁCIDO (S)-2-AMINO-3-METIL-BUTÍRICO

Passo 2A: (2R, 3R, llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l, 3,4,6, 7,11b- hexahidro-2H-pirido[2,1-a] isoquinolin-2-il-éster do ácido(S)-2-Amino-3-metil-butírico, 2-1 21

Dissolveu-se (2R, 3R, llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi- 1,3,4,6,7,llb-hexa-hidro-2H-pirido[2,1—a]isoquinolin-2-ol ld. 1 (200 mg, 0,63mmol) em 3 mL de CH2CI2 anidro, adicionando-se então DMAP (75,0 mg, 0,63 mmol) e Cbz-L-valina (190 mg, 0,75 mmol), e a mistura foi agitada durante 5 min. Adicionou-se então DCC (155 mg, 0,75 mmol), tendo-se formado de imediato um precipitado branco. A mistura foi agitada durante 12 horas, sendo posteriormente filtrada e concentrada. A purificação através de cromatografia flash em coluna (0,2:9,8, MeOH:CH2Cl2) forneceu 360 mg (0,63 mmol) de (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-1,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do ácido 2-benziloxicarbonilamino-3-metil-butírico 2a sob a forma de um sólido amarelo pálido em rendimento quantitativo. O composto 2a (163 mg, 0,29 mmol) foi dissolvido em MeOH (10 mL), adicionou-se Pd/C e a mistura foi purgada com H2. A mistura foi agitada durante 12 horas, filtrada através de celite e concentrada. A purificação através de cromatografia flash em coluna (0,5:9,5, MeOH:CH2Cl2) forneceu 105 mg (0,25 mmol) de (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do ácido(S)-2-amino-3-metil-butírico 2-1 com um rendimento de 85%. MS, cálculo: (419), Encontrado 419,3 (M + H) .

Os compostos adicionais sintetizados pelo mesmo procedimento utilizando diferentes aminoácidos incluem: (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do ácido(R)-2-amino-4-metil-pentanóico 2-2. MS, cálculo: (433); Encontrado 433,4 (Μ + H) (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do ácido(S)-2- 22 amino-4-metil-pentanóico 2-3. MS, cálculo: (433), Encontrado 433,4 (Μ + H) 1-((2R,3R,llbR)-3-isobutil)-9,10-dimetoxi-l, 3,4,6,7, 11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il)éster do 4-metil-éster do ácido(S)-2-amino-succínico 2-4. MS, cálculo: (449), Encontrado 449, 3 (Μ + H) (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do ácido 2-amino-2-metil-propiónico 2-5. MS, cálculo: (405), Encontrado 405,3 (Μ + H) (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l, 3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do ácido(R)-2-amino-propiónico 2-6. MS, cálculo: (391) ; Encontrado 391,3 (Μ + H) (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do ácido(S)-2-amino-propiónico 2-7. MS, cálculo:(391), Encontrado 391,3 (Μ + H) (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do ácido(R)-2-amino-3-metil-butírico 2-8. MS, cálculo: (419), Encontrado 419,4 (Μ + H) (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do ácido amino-acético 2-9. MS, cálculo: (377); Encontrado 377,3 (Μ + H) EXEMPLO 3

(2R,3R,11BR)-3-ISOBUTIL-9,10-DIMETOXI-1,3,4,6,7,11B-HEXAHIDRO-2H-PIRIDO[2,1-a]ISOQUINOLIN-2-IL-ÉSTER DO ETILÉSTER DE ÁCIDO CARBÓNICO 23

Passo 3A: (2r,3r,llbr)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,11b- hexahidro-2h-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do etiléster de ácido carbónico, 3-1

Dissolveu-se (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi- 1,3,4,6,7,llb-hexa-hidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-ol ld. 1 (100 mg, 0,31 mmol) em 3 mL de CH2CI2 anidro, adicionando-se então DMAP (1,0 mg, 0,01 mmol) e piridina (51 \\L, 0,63 mmol), e em seguida cloroformato de etilo gota a gota (45 μΕ, 0,47 mmol) . A mistura de reacção foi deixada em agitação durante 12 horas, sendo depois diluída com CH2CI2 (10 mL) e extraída usando NH4C1 saturado (5 mL) . A camada orgânica foi seca com MgS04 e concentrada. O produto em bruto foi purificado através de cromatografia flash em coluna (1:9, acetona: CH2C12) para fornecer 88 mg (2,25 mmol) de 3-1 sob a forma de uma espuma amarela clara com um rendimento de 72%. MS, cálculo: (392), Encontrado 392,3 (Μ + H) .

Foram também preparados pelo processo acima descrito: (2R,3R, llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquino-lin-2-il-éster do metiléster de ácido carbónico 3-2, com um rendimento de 37%. MS, cálculo: (378), Encontrado 378,1 (Μ + H) (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l, 3,4,6,7,11b-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquino-lin-2-il-éster do butiléster de ácido carbónico 3-3, com um rendimento de 46%. MS, cálculo: (420), Encontrado 420,1 (Μ + H) 24 EXEMPLO 4 MÉTODO PARA DETERMINAR A ESTABILIDADE DOS COMPOSTOS EM HEPATÓCITOS HUMANOS Os hepatócitos humanos criopreservados provenientes de 12 dadores individuais foram descongelados de acordo com as instruções do fornecedor e reunidos num pool. A viabilidade celular foi determinada como sendo superior a 85%. Incubou-se TBZ (1 μΜ) com hepatócitos humanos individuais (1 χ 106 células/mL) a 37°C com 95% de O2 e 5% de CO2 durante 0, 5, 15, 30 e 60 min. Foi adicionada TBZ em DMSO para atingir uma concentração de 1,0 μΜ (quantidade de DMSO inferior a 0,5% v/v) . Todas as concentrações e conteúdos em células foram relativos ao volume de incubação final de 100 μύ. A incubação foi terminada através da mistura de 100 μΐι de acetonitrilo gelado em ácido fórmico a 1% contendo dextrometorfano (1,0 μΜ) como padrão interno para a análise por LC/MS. As proteínas precipitadas foram removidas por centrifugação (1500-2500 x g durante 30 min a 15°C).

Resumidamente, as amostras foram separadas através de um método de HPLC por gradiente, usando um sistema de UPLC da Acquity constituído por uma bomba, um aquecedor de coluna (40°C) e uma bandeja de desgaseificador por vácuo/fase móvel. A fase móvel A correspondeu a água em ácido fórmico a 0,1% e a fase móvel B correspondeu a acetonitrilo em ácido fórmico a 0,1%. A eluição por gradiente foi como se segue: fase móvel B: 0-10% em 0-0,75 min, 40-90% em 1,25-1,5 min, 90-0% em 1,75-2,0 min, e o tempo de corrida foi de 3 min. A coluna de fase reversa foi uma coluna BEH C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 pm). A taxa de fluxo foi de 0,8 mL/min e o volume de injecção foi de 7,5 pL. As amostras foram monitorizadas com um espectrómetro de massa API-3000 e uma fonte 25 de iões ESI em modo positivo, m/z de TBZ 318,4 > 220,4, m/z de HTBZ 320,3 > 302,3, e m/z de dextrometorfano 272,2 > 147,2.

As Figuras la, lb, e lc mostram a conversão de tetrabenazina, do composto 2-1 e do composto 3-1 em hepatócitos humanos para HTBZ no caso da tetrabenazina e para ld.l no caso dos compostos 2-1 e 3—1. A tetrabenazina e o composto 3-1 evidenciaram uma conversão rápida, enquanto que a do composto 2-1 foi comparativamente lenta. EXEMPLO 5

MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DE COMPOSTOS EM MICROSSOMAS HEPÁTICOS DE MAMÍFERO

Resumidamente, incubou-se um pool de microssomas hepáticos humanos (0,1 ou 0,5 mg/mL; n>10; dadores dos dois sexos) a 37°C com o composto de teste na presença de um sistema gerador de NADPH contendo tampão de fosfato de potássio 50 mM, pH 7,4, cloreto de magnésio 3 mM, EDTA 1 mM, NADP 1 mM, G-6-P 5 mM e G-6-PD a 1 Unidade/mL.

As incubações foram realizadas em seis placas modificadas contendo 96 poços fundos de 2,0 mL, usando 1 μΜ de cada composto (DMSO a 0,01%) com um volume total de 250 μΐ. Cada placa, representando um só ponto de tempo, continha 96 microtubos Titertube®, o que permitiu testar 48 compostos em duplicado em cada ponto de tempo (0, 5, 10, 20, 40 e 60 minutos) . A reacção foi parada pela adição de um reagente de paragem adequado (0,3 mL de acetonitrilo contendo um padrão interno patenteado). As proteínas precipitadas foram removidas por centrifugação durante 15 min a 3000 rpm, e o fluido sobrenadante (~0,1 mL) foi analisado por LC/MS para determinar a % do composto original remanescente. 26

As amostras foram separadas por um método de HPLC por gradiente, usando um sistema de LC da Agilent constituído por uma bomba, um aquecedor de coluna (40°C) e uma bandeja de desgaseificador por vácuo/fase móvel. A fase móvel A correspondeu a água em ácido fórmico a 0,1% e a fase móvel B correspondeu a acetonitrilo em ácido fórmico a 0,1%. A eluição por gradiente foi como se segue: fase móvel B: 0-30% em 0-0,30 min, 30-98% em 0,7- 1.1 min, 98-0% em 1.50-1.51 min, e o tempo de corrida foi de 3 min para 3-1; Fase móvel B: 5-98% em 0,5-2,5 min, 98-5% em 4,0- 4.1 min, e o tempo de corrida foi de 6,5 min para 2-1. A coluna de fase reversa foi uma coluna Luna C18 (20 x 2 mm, 5 μπι) para 3-1 e uma coluna C18 Synergi (150 x 2 mm, 5 μπι) para 2-1. A taxa de fluxo foi de 0,55 mL/min para 3-1 e de 0,4 mL/min para 2-1, e 0 volume de injecção foi de 20μ1. As amostras foram monitorizadas com um espectrómetro de massa API-3000 e uma fonte de iões ESI em modo positivo, m/z de TBZ 318,4 > 220, 4, m/z de HTBZ 320,3 > 302,3, e m/z de dextrometorfano 272,2 > 147,2.

As figuras 2a a 2f mostram a conversão, nos microssomas de fígado humano, de rato e de cão, do composto 2-1 e do composto 3- 1 para ld.l. Em cada uma das espécies, a conversão do composto 2-1 para ld.l foi mais lenta do que a conversão verificada no caso do composto 3-1 para o composto ld.l. EXEMPLO 6 AVALIAÇÃO FARMACOCINÉTICA (PK) Método em Animais: 1. Rato

Em resumo, foi administrada uma dose oral única (10 mg/kg) de 2-1 e 3-1, em PEG a 10% em metilcelulose a 0,25% em água milli 27 Q, a ratos (3 ratos/dose) para uma avaliação farmacocinética. Realizaram-se colheitas seriadas para a recolha de amostras de sangue, efectuadas em cada animal tratado em nove pontos de tempo que variaram entre a pré-dose e 24 horas pós-dose (0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 horas) para a administração oral. As amostras de plasma foram armazenadas a ^-80°C até à análise. 2. Cão

Em resumo, foi administrada uma dose oral única (6,1 mg/ kg para 3-1 e 10 mg/kg para 2-1), em PEG a 10% em metilcelulose a 0,25% em água milli Q, a cães (3 cães/dose) para uma avaliação farmacocinética. Realizaram-se colheitas seriadas para a recolha de amostras de sangue, efectuadas em cada animal tratado em nove pontos de tempo que que variaram entre a pré-dose e 24 horas pós-dose (0, 0,25, 0,5, 1, 1, 5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36 e 48 horas) para a administração por via oral. As amostras de plasma foram armazenadas a ^-80°C até à análise. Método Bioanalítico Geral:

As amostras de plasma foram descongeladas em gelo e transferiram-se 50 pL de plasma para uma placa de 96 poços. As proteínas do plasma foram precipitadas pela adição de 150 pL de acetonitrilo (ACN) pré-refrigerado contendo 75 ng/mL de padrão interno. Foram adicionados 50 pl adicionais de ACN/água (60:40) a cada amostra. Prepararam-se amostras para uma curva de calibração por diluição em série em ACN/água (60:40). Transferiram-se cinquenta microlitros de cada amostra de padrão para uma placa de 96 poços, seguindo-se a adição de 150pl de acetonitrilo (ACN) contendo 75 ng/mL do padrão interno e 50 pL de plasma de rato como branco. As placas foram tapadas, agitadas e centrifugadas a 28 3000 rpm durante 20 min. O sobrenadante foi recolhido e injectado num sistema de LC-MS/MS para quantificação. O método de ensaio não validado exibiu boa linearidade, especificidade e exactidão para 3-1, 2-1 e ld.l ao longo do intervalo de concentrações de 1 a 1000 ng/mL e o limite inferior de quantificação de 3-1, 2-1 e ld.l correspondeu a 1 ng/mL para todos. Foram usados três conjuntos de amostras de CQ (4, 40, 400, 800 ng/ml) para 3-1, 2-1 e ld.l como controlo de qualidade para os estudos necessários, tendo estas amostras sido preparadas do mesmo modo que os padrões. A quantificação foi realizada ajustando as razões das áreas de pico a uma curva de calibração linear ponderada (1/x2) . Método farmacocinético: A farmacocinética descritiva foi derivada e avaliada com base nas concentrações plasmáticas de 3-1, 2-1 e ld.l detectadas em cada rato individual. Os parâmetros farmacocinéticos foram determinados por Análise Não-Compartimental dos perfis de concentração plasmática-tempo de 3-1, 2-1 e ld.l, recorrendo ao programa de software de modelação farmacocinética WinNonlin, Versão Profissional 5.0.1 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA) . A Figura 3a mostra que, no rato, os perfis de concentração plasmática-tempo do composto ld.l que resultam das administrações orais de 3-1 e de ld.l são indistinguíveis. Não foi detectado 3-1 no plasma de rato após a administração oral de 3-1. A Figura 3b mostra o perfil de concentração plasmática-tempo dos compostos ld.l e 2-1 no rato após a administração oral de 2-1. A Figura 3c mostra o perfil de concentração plasmática-tempo dos compostos ld.l e 3-1 no cão após a administração oral de 3-1. 29 A Figura 3d mostra o perfil de concentração plasmática-tempo dos compostos ld.l e 2-1 no cão após a administração oral de 2-1.

Estas figuras mostram que a semi-vida plasmática de ld.l após a administração oral do composto 2-1 é 2-3 vezes superior à encontrada após a administração oral do composto 3—1. EXEMPLO 7 ENSAIO DE LIGAÇÃO À ISOFORMA 2 DO TRANSPORTADOR VESICULAR DE MONOAMINAS (VMAT2) (ADAPTADO A PARTIR DE TENG, ET AL., J. NEUROCHEM. 71, 258-65, 1998)

Procedimento A:

Preparação de Vesículas de Estriado de Ratos

Os estriados de três ratos foram recolhidos num pool e homogeneizados em sacarose 0,32 Μ. O homogeneizado foi então centrifugado a 2000xg durante 10 min a 4°C e o sobrenadante resultante foi centrifugado a 10.000 x g durante 30 min a 4°C. O pellet resultante, contendo a fracção sinaptossómica enriquecida (2 mL) , foi submetido a choque osmótico pela adição de 7 ml de H20 destilada e, em seguida, a suspensão foi homogeneizada. A osmolaridade foi restaurada pela adição de 0,9 ml de HEPES 0,25 M e de 0,9 mL de tampão neutro (pH 7,5) de sal dipotássico do ácido L-( + )-tartárico 1,0 M, seguindo-se uma centrifugação de 20 min (20.000 x g, a 4°C ). O sobrenadante foi em seguida centrifugado durante 60 min (55.000 x g a 4°C) e o sobrenadante resultante foi centrifugado durante 45 min (100.000 x g a 4°C) . O pellet resultante foi ressuspenso em HEPES 25 mM, sal dipotássico do ácido L-( + )-tartárico 100 mM, MgCl2 5 mM, NaCl 10 mM, EGTA 0,05 mM, pH 7,5, a uma concentração de proteína de 1-2 mg/mL, e foi 30 armazenado a -80°C durante um período de até 3 semanas sem perda apreciável da actividade de ligação. Imediatamente antes da utilização, o pellet final foi ressuspenso no tampão de ligação (HEPES 25 mM, sal dipotássico do ácido L-( + )-tartárico 100 mM, MgCl2 5 mM, NaCl 10 mM, EGTA 0,05 mM, EDTA 0,1 mM, ácido ascórbico 1,7 mM, pH 7,4).

Ligação de [3H]-dihidrotetrabenazina (DHTBZ)

Alíquotas da suspensão de vesículas (0,16 mL, 15 pg de proteína/mL) são incubadas com compostos competidores (variando entre 1E-6M e 1E-12M) e [3H]-dihidrotetrabenazina 2 nM (HTBZ; actividade específica: 20 Ci/mmol, American Radiolabeled

Chemicals, Inc), durante 1 h à temperatura ambiente, num volume total de 0,5 mL. A reacção é terminada por filtração rápida das amostras através de filtros Whatman GF/F utilizando um colector de células Brandel. A ligação não específica é determinada utilizando tetrabenazina (TBZ) 20 μΜ. Os filtros são previamente embebidos durante 2h em polietilenoimina gelada (0,5%). Depois de lavados três vezes com o tampão gelado, os filtros são colocados em frascos de cintilação com 10 mL de cocktail de cintilação. A radioactividade ligada é determinada por espectrometria de cintilação.

Procedimento B: O procedimento foi adaptado a partir do que foi descrito anteriormente (Near, (1986), Mol. Pharmacol. 30: 252-7). Os homogenatos do proencéfalo de ratos Sprague-Dawley foram preparados por homogeneização e lavagem por centrifugação, tal como descrito anteriormente (Hoare et al., (2003) Peptides 24.1881-97) . Num volume total de 0,2 mL, em placas de 96 poços de 31 baixa ligação (Corning #3605), 12 concentrações do isómero ou análogo de HTBZ competiram contra 6 nM de 3H-dihidrotetrabenezina (American Radiolabeled Chemicals, Kd 2.6nM), no homogenato de proencéfalo de ratos (100 pg de proteína de membrana por poço), em tampão para ligação a VMAT2 (soro fisiológico tamponado por fosfato da Dulbecco, EDTA 1 mM, pH 7,4) . Após a incubação a 25°C durante duas horas, o radioligando ligado foi recolhido através de filtração rápida em filtros de fibra de vidro GF/B usando um colector Unifilter-96 (PerkinElmer). As placas de filtro foram pré-tratadas durante 10 minutos com polietilenoimina a 0,1% e, após a recolha, foram lavadas com 800 pL do tampão para ligação a VMAT2. O radioligando ligado foi quantificado por contagem de cintilações utilizando um Topcount NXT (PerkinElmer).

Tabela 1. Afinidade para VMAT2 a partir de Estudos de Ligação Competitiva

Composto |pKi (n) |Ki (nM) 2R, 3R, llbR-HTBZ [8,7 ± 0,2 (6) 1,9 25, 3 R, llbR-HTBZ \l, 9 ± 0,1 (5) 13 25, 35, llbS-HTBZ \6, 7 ± o","i (3) 202 2R, 35, llbS-HTBZ *6,1 ± 0,7' (4) 1714 Composto 3-1 \Ί, 9 ± oTT (2) 14 Composto 2-1 Ϊ6, 7 ± 0,2 (2) 187 Os dados correspondem à média + SD de pelo menos duas experiências independentes. Os valores de Ki foram determinados utilizando um valor de Kd de 1,2 nM publicado para as membranas do estriado de ratos (Roland et al., 2000). 32 EXEMPLO 8

ENSAIOS DE SELECTIVIDADE DE LIGAÇÃO AO RECEPTOR

Os quatro estereoisómeros de HTBZ e compostos da presente invenção foram testados quanto à especificidade para o receptor por rastreio contra um painel de 80 receptores, canais iónicos e transportadores (Perfil de alto rendimento, Cerep, SA). Subsequentemente, os compostos foram testados em ensaios seleccionados de ligação competitiva ao longo de um intervalo de concentrações para determinar a sua afinidade para os receptores abaixo descritos. (a) Receptor de dopamina D2S:

Referência: Grandy et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 9762-6

Fonte: (células CHO) recombinantes humanas Ligando: [3H]espiperona 1,0 nM Tempo de incubação/temperatura: 90 min / 25°C Tampão de incubação: HEPES 50mM, NaCl lOOmM, EDTA lmM, MgCl2 3mM, pH 7,4

Ligando não especifico: clozapina (10 μΜ)

Kd: 27 pM

Bmax: 6,9 pmol/mg

Ligação específica: 600 cpm Método de quantificação: contagem de cintilações (b) Receptor de dopamina D4.4:

Referência: Van Tol et al. (1992) Nature, 358: 149-152.

Fonte: (células CHO) recombinantes humanas Ligando: [3H]espiperona 0,3 nM Tempo/temperatura de incubação: 60 min / 22°C Ligando não específico: (+)butaclamol (10 μΜ) 33

Kd: 0,19 nM Método de quantificação: Contagem de cintilações

Tabela 2. Dados de Selectividade de Ligação ao Receptor \2Rr3R,1lbR- jj 2S, 3R, llbR- \2S, 3S, llbS- 2R,3S,llbS- 3-1 2-1 \ HTBZ | HTBZ \ HTBZ HTBZ D2S(h) | -6% de jj inibição a | 10 μΜ | 17% de jj inibição a | 3 0 μΜ jj 192 57 15% de inibição a 10 μΜ 2% de inibição a 10 μΜ D4.4 (h) ij 0% de jj inibição a | 1 μΜ jj 30% de jj inibição a \ 10 μΜ jj 9% de jj inibição a | 1 μΜ 67 15% de inibição a 10 μΜ 13% de inibição a 10 μΜ ,,1,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„

Os valores correspondem ou a Ki (nM) ou à % de inibição à concentração testada. 2R, 3R, llb.R-HTBZ e os dois análogos estruturais de 2R, 3R, llbR-HTBZ, os compostos 2-1 e 3-1, demonstraram selectividade para VMAT2. Em contraste, os estereoisómeros 25, 35, llb5 e 2R, 35, llb5 HTBZ exibiram elevada afinidade de ligação para D2(S). O 25, 3 R, llbR HTBZ mostrou alguma inibição de grau menor dos receptores de dopamina testados. Esta actividade extra-alvo de certos isómeros de HTBZ poderá contribuir para alguns dos efeitos secundários observados com a TBZ. EXEMPLO 9 REDUÇÕES DA ACTIVIDADE LOCOMOTORA INDUZIDAS PELO INIBIDOR DE VMAT2

Os ratos deste estudo (Sprague-Dawley, 100-300 g) são adaptados a um alojamento único durante pelo menos 3 dias antes de serem testados. Aos ratos são administradas substâncias de teste pelas vias oral, intraperitoneal, subcutânea ou intravenosa 34 (entre 1-100 mg/kg), ou controlos de veículo. Após um período de pré-tratamento de 15-60 minutos, os ratos são colocados numa gaiola transparente rodeada por detectores de fotocélulas (San Diego Instruments). A actividade locomotora dos ratos é detectada por interrupções dos feixes das fotocélulas e a actividade é definida como o número de interrupções dos feixes por sessão. Os períodos de observação variam entre 15 minutos e 2 horas. Os efeitos dos compostos novos são comparados com os efeitos do veículo e do controlo positivo (diazepam a 3 mg/kg) usando a análise ANOVA de uma via, seguindo-se análises post hoc de Student e Neuman-Keul. São usados 8-10 ratos por cada condição de teste. EXEMPLO 10 PTOSE INDUZIDA PELO INIBIDOR DE VMAT2

Os ratos (Sprague-Dawley, 100-300 g) são adaptados a um alojamento único durante pelo menos 3 dias antes de serem testados. Aos ratos são administradas substâncias de teste pelas vias oral, intraperitoneal, subcutânea ou intravenosa (entre 1-100 mg/kg), ou controlos de veículo. Após um período de pré-tratamento de 15 minutos, os ratos são colocados numa gaiola transparente para observação da ptose. A ptose é avaliada numa escala de 4 pontos: Olhos totalmente abertos = 0, olhos M, fechados = 1, olhos 1'5 fechados = 2, olhos % fechados = 4, olhos completamente fechados = 4. As medições são efectuadas com intervalos de 15 minutos até 3 horas após a administração dos compostos. Os efeitos dos novos compostos são comparados com os efeitos do veículo usando a análise ANOVA de uma via, seguida de 35 análises post hoc de por cada condição de

Student teste. e Neuman-Keul São usados 8-10 ratos

Lisboa, 5 de Abril de 2013 36

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto possuindo a seguinte estrutura:

   (I) e os estereoisómeros, sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos do mesmo, caracterizado por Rx ser -C(=0)-0-alquilo.
2. 2. Um composto possuindo a seguinte estrutura:

   (I) * e estereoisómeros, sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos do mesmo, caracterizado por Ri ser -C(=0)-Ci-6 alcanodiilo-NH2, e em que o dito Ci_6alcanodiilo é -CH2-, -CH2CH2-, -CH(CH3)-, -ch2ch2ch2-, -CH(CH3)CH2CH2-, -ch2c (CH3) 2ch2-, -CH[CH (CH3) 2]-, -CHCH2 [CH (CH3) 2]ou -C(CH3)2-, e é opcionalmente substituído com um grupo seleccionado de entre -NH-C(=NH)NH2, -C02H, -C02Me, -SH, 1 -C(0)NH2, -NH2, -SCH3fenilo, -OH, 4-hidroxi-fenilo, imidazolilo e indolilo.
3. 3. 0 composto, de acordo com a reivindicação N°.2, caracterizado por o composto ser o 3-isobutil-9,10-dimetoxi-1,3,4,6,7, llb-hexahidro-2H-pirido[2,1—a]isoquinolin-2-il-éster do ácido 2-amino-3-metil-butírico ou um estereoisómero, sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
4. 4. O composto, de acordo com a reivindicação N°.3, caracterizado por o composto ser o (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-1,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do ácido 2-amino-3-metil-butírico ou um estereoisómero, sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
5. 5. O composto, de acordo com a reivindicação N°.4, caracterizado por o composto ser o (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-1,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin-2-il-éster do ácido (S)-2-Amino-3-metil-butirico ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
6. 6. Uma composição farmacêutica, caracterizada por compreender um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.l a N° . 5 e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
7. 7. A composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação N°.6, caracterizada por o composto ser o (2R,3R,llbR)-3-isobutil-9,10-dimetoxi-l,3,4,6,7,llb-hexahidro-2H-pirido[2,1-a]isoquinolin -2-il-éster do ácido (S)-2-Amino-3-metil-butirico ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
8. 8. Utilização da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação N°.6, para a preparação de um medicamento para o tratamento de perturbações hipercinéticas, compreendendo a 2 administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz a um indivíduo que dela necessite.
9. 9. 0 uso, de acordo com a reivindicação N°.8, caracterizado por a desordem hipercinética ser a doença de Huntington, discinésia tardia, síndrome de Tourette ou tiques.
10. 10. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação N°.6, para utilização no tratamento de distúrbios hipercinéticos, compreendendo a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz a um indivíduo que dela necessite.
11. 11. A composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação N°.10, caracterizada por a desordem hipercinética ser a doença de Huntington, discinésia tardia, síndrome de Tourette ou tiques.
12. 12. O composto, de acordo com a reivindicação N°.2, caracterizado por o composto ter a seguinte estrutura:

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