PT2048145E

PT2048145E - Agente incrementando a actividade da proteína quinase c, contendo um derivado de um éter alquílico, ou um seu sal

Info

Publication number: PT2048145E
Application number: PT07791845T
Authority: PT
Inventors: Tetsuo Fukushima; Akiko Takagi; Nobuo Terashima
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 2006-08-04
Filing date: 2007-08-02
Publication date: 2011-01-14
Also published as: DK2048145T3; WO2008016107A1; EP2048145B9; US20100184997A1; IL196754A0; AU2007279673B2; MX2009001255A; JP5255441B2; NO20090214L; SI2048145T1; CN101501026A; PL2048145T3; ES2355768T3; EP2048145A1; EP2048145B1; CA2659835A1; AU2007279673A1; ZA200900743B; DE602007011281D1; EP2048145A4

Description

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DESCRIÇÃO "AGENTE INCREMENTANDO A ACTIVIDADE DA PROTEÍNA QUINASE C, CONTENDO UM DERIVADO DE UM ÉTER ALQUÍLICO, OU UM SEU SAL"

DOMÍNIO TÉCNICO A invenção presente diz respeito a um agente que incrementa superiormente a actividade da proteína quinase C, contendo um derivado de um éter alquílico ou um seu sal.

ESTADO DA TÉCNICA

Nos mamíferos, a proteína quinase C (designada doravante neste documento como "PKC") refere-se a uma família constituída por 12 isoformas, e sabe-se que é uma quinase de serina-treonina que participa na transdução de sinais. Para além disto, sabe-se que a PKC está envolvida na regulação de diversas funções celulares tais como a transmissão nas sinapses, na activação do fluxo iónico, na secreção, no controlo do ciclo celular, na diferenciação, na multiplicação, na génese de tumores, nas metástases, e na apoptose. Sabe-se que os compostos com um efeito de aumentar a actividade da PKC (doravante referidos como "potenciadores da actividade da PKC") manifestam, por exemplo, um efeito de melhoria da perturbação do 2 metabolismo da glucose em modelos da cirrose do fígado em animais (DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 1), e um efeito antineoplásico (DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 2). Os potenciadores da actividade da PKC têm chamado muito a atenção a título de agentes terapêuticos contra diversas doenças, por exemplo, nas perturbações do metabolismo da glucose em pacientes com cirrose do fígado, e em doenças neoplásicas tais como tumores.

Por exemplo, sabe-se que a leucina é um potenciador da actividade da PKC (DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 3). Os aminoácidos com cadeia ramificada (em especial a leucina e a isoleucina), utilizados na terapia de substituição de aminoácidos com cadeia ramificada para pacientes com cirrose do fígado, activam a PKC através da quinase PI3, promovem a absorção de glucose pelos músculos esqueletais, e também melhoram as perturbações do metabolismo da glucose no modelo da cirrose hepática em ratos (DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 1).

Por exemplo, sabe-se que a briostatina e a gnidimacrina também aumentam a actividade da PKC. A briostatina liga-se à PKC (DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 4), activa os isozimas de PKC in vitro (DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 5) , e manifesta um efeito antineoplásico (DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 6) .

Os derivados de éteres alquilicos descritos neste pedido têm sido descritos como possuidores de actividade 3 sobre o sistema nervoso, actividade de regeneração dos nervos, e actividade de promoção do crescimento de neuritos (Documento de Patentes 1). No entanto, não se sabia até que eles aumentavam a actividade da PKC. DOCUMENTO DE PATENTES 1: WO 03/035.647 DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 1: Am. J. Physiol.

Gastrointest. Liver. Physiol., 2005, 288, G1292-1300. DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 2: Curr. Câncer Drug

Targets, 2004, 4, 125-146. DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 3: Biochem. Biophys.

Res. Commun., 2002, 299(5), 693-696. DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 4: Biochem. Pharmacol., 1992, 43(9), 2007-2014. DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 5: Mol. Pharmacol., 1994, 46(2), 374-379. DOCUMENTO NÃO DE PATENTES 6: Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 2001, 142, 1-96.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

PROBLEMAS A RESOLVER POR INTERMÉDIO DA INVENÇÃO 4

Existe uma procura de um agente incrementador da actividade da PKC que seja melhor, e tenha menos efeitos colaterais.

MEIOS PARA RESOLVER ESTES PROBLEMAS

Face ao estado da técnica acima, os inventores presentes verificaram que o derivado de éter benzotiofénico e alquilico definido na reivindicação 1 e os seus sais manifestam um efeito de aumento da actividade da PKC e que são portanto úteis a titulo de incrementadores da actividade da PKC, conseguindo deste modo a invenção presente. A invenção presente proporciona o composto definido na reivindicação, para utilização no tratamento ou na prevenção da patologia de metabolismo da glucose nos pacientes com cirrose hepática ou com doenças neoplásicas tais como tumores.

MELHOR MODO DE LEVAR A CABO A INVENÇÃO A invenção presente está descrita em mais pormenor adiante.

Os termos utilizados na descrição presente têm os significados que constam adiante, a não ser aonde se especificar algo em contrário. 5 0 sal do composto da invenção presente pode ser um sal habitualmente conhecido de um grupo básico, tal como um grupo amino, ou um sal de um grupo ácido tal como um grupo hidroxilo.

Incluem-se nos exemplos de sais de grupos básicos os sais com ácidos minerais tais como o ácido clorídrico, o ácido bromidrico, o ácido nitrico e o ácido sulfúrico; sais com ácidos carboxílicos orgânicos tais como o ácido fórmico, o ácido acético, o ácido citrico, o ácido oxálico, o ácido fumárico, o ácido maleico, o ácido succinico, o ácido málico, o ácido tartárico, o ácido aspártico, o ácido tricloroacético e o ácido trifluoroacético; e sais com ácidos sulfónicos tais como o ácido metanossulfónico, o ácido benzenossulfónico, o ácido p-toluenossulfónico, o ácido mesitilenossulfónico e o ácido naftalenossulfónico.

Incluem-se nos sais de grupos ácidos os sais com metais alcalinos tais como sódio e potássio; os sais com metais alcalino-terrosos tais como cálcio e magnésio; os sais de amónio; os sais com bases orgânicas contendo azoto tais como a trimetilamina, a trietilamina, a tributilamina, a piridina, a N,N-dimetilanilina, a N-metilpiperidina, a N-metilmorfolina, a dietilamina, a diciclohexilamina, a procaina, a dibenzilamina, a N-benzil-p-fenetilamina, a 1-efenamina e a N,N'-dibenziletilenodiamina.

Entre os sais descritos acima são preferíveis os sais farmacologicamente aceitáveis. 6

Quando o derivado de éter alquílico definido na reivindicação 1 e os seus sais tiverem isómeros tais como isómeros ópticos, isómeros geométricos e tautómeros, a invenção presente inclui todos esses isómeros. A invenção também inclui os seus hidratos, os seus solvatos, e todas as suas formas cristalinas possíveis. 0 composto é o 1-(3-(2-(l-benzotiofen-5-il)etoxi)propil)azetidin-3-ol (que se referirá doravante como "T-817") ou um seu sal, utilizado nesta invenção, e o sal de T-817 com ácido maleico (que se referirá doravante como "T-817MA") é o mais preferível. 0 derivado de éter alquílico definido na reivindicação 1, ou um seu sal, tem um efeito de aumento da actividade da PKC, e os fármacos contendo este derivado de éter alquílico, ou um seu sal, são úteis no tratamento ou na prevenção de doenças contra as quais seja eficaz o aumento da actividade da PKC.

Pode preparar-se o derivado de éter alquílico ou um seu sal, utilizados na invenção presente, por um método que é do conhecimento geral, por uma combinação adequada dos métodos conhecidos, ou pelo método descrito no DOCUMENTO DE PATENTE 1.

Pode incluir-se o derivado de éter alquílico ou um seu sal, utilizados na invenção presente, num produto 7 farmacológico, tal como um fármaco oral (comprimido, cápsula, pó, grânulo, grânulo pequeno, pílula, suspensão, emulsão, solução, xarope, etc.), injecções, gotas oculares e outros semelhantes, misturando com eles diversos aditivos para fármacos tais como excipientes, aglomerantes, desintegrantes, inibidores de desintegração, agentes anti-aglomerantes e anti-adesivos, lubrificantes, veículos absorventes/adsorventes, solventes, cargas, agentes de isotonicidade, solubilizantes, emulsionantes, agentes de suspensão, espessantes, agentes de revestimento, incrementadores da absorção, promotores da gelificação/coagulação, estabilizantes contra a luz, conservantes, exsicantes, estabilizadores de emulsão/suspensão/dispersão, agentes impedindo alterações da cor, desoxidantes/antioxidantes, agentes saborizantes, agentes corantes, agentes estabilizantes de espumas, agente anti-espumas, agentes calmantes, agentes anti-estáticos e agentes tamponizantes ou reguladores do pH.

Preparam-se os produtos farmacológicos mencionados acima pelos métodos habituais.

Os produtos sólidos para administração por via oral tais como comprimidos, pós e grânulos podem ser preparados por métodos convencionais, adicionando aditivos para produtos farmacológicos sólidos, por exemplo, excipientes tais como a lactose, a sacarose, o cloreto de sódio, a glucose, amidos, carbonato de cálcio, caulino, celulose cristalina, fosfato de cálcio dibásico anidro, amido parcialmente alfa, amido de milho e ácido algínico; aglomerantes tais como xarope simples, solução de glucose, solução de amido, solução de gelatina, álcool polivinilico, éter polivinilico, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, shellac, metilcelulose, etilcelulose, alginato de sódio, goma-arábica, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxipropilcelulose, água e etanol; agentes desintegrantes tais como amido seco, ácido alginico, agar em pó, amido, polivinilpirrolidona com ligações cruzadas, carboximetilcelulose sódica com ligações cruzadas, carboximetilcelulose cálcica e amidoglicolato de sódio; inibidores da desintegração tais como o álcool estearilico, ácido esteárico, manteiga de cacau e óleos hidrogenados; agentes anti-aglomerantes/anti-adesivos tais como o silicato de alumínio, o hidrogenofosfato de cálcio, o óxido de magnésio, o talco e o ácido silícico anidro; lubrificantes tais como a cerca de carnaúba, o ácido silícico anidro leve, o silicato de alumínio, o silicato de magnésio, óleos endurecidos, derivados de óleos endurecidos, óleo de gergelim, cera de abelhas branqueada, óxido de titânio, gel de hidróxido de alumínio seco, ácido esteárico, estearato de cálcio, estearato de magnésio, talco, hidrogenofosfato de cálcio, laurilsulfato de sódio e polietilenoglicol; incrementadores da absorção tais como os sais de amónio quaternário, o laurilsulfato de sódio, a ureia e enzimas; veículos por absorção/adsorção tais como amido, lactose, caulino, bentonite, ácido silícico anidro, dióxido de silício hidratado, aluminometassilicato de sódio e ácido silícico coloidal. 9

No caso de comprimidos, caso seja necessário, eles podem ser feitos sob a forma de comprimidos revestidos habituais, tais como comprimidos revestidos com açúcar, comprimidos revestidos com gelatina, comprimidos revestidos gástricos, comprimidos revestidos entéricos, e comprimidos revestidos por filme, solúveis em água.

Preparam-se a cápsulas misturando o composto em primeiro lugar com os diversos produtos para fármacos que se listaram acima, e empacotando a mistura em cápsulas em gelatina dura, em cápsulas moles, e outras semelhantes.

Também se podem preparar suspensões e soluções baseadas em água ou em óleo, também se podem preparar xaropes e elixires, utilizando diversos dos aditivos mencionados acima para produtos farmacológicos líquidos, por exemplo, solventes, cargas, agentes de isotonicidade, solubilizantes, emulsionantes, agentes de suspensão e espessantes.

Podem preparar-se injecções por métodos convencionais, utilizando os aditivos para produtos farmacêuticos, por exemplo, diluentes tais como água, álcool etílico, Macrogol, propilenoglicol, ácido cítrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido láctico, lactato de sódio, ácido sulfúrico e hidróxido de sódio; reguladores de pH e agentes tamponizantes tais como o citrato de sódio, acetato de sódio e fosfato de sódio; estabilizadores tais 10 como pirossulfito de sódio, ácido etilenodiaminotetra-acético, ácido tioglicólico e ácido tioláctico; agentes de isotonicidade tais como o sal de cozinha, a glucose, o manitol e o glicerol; solubilizantes tais como a carboximetilcelulose sódica, o propilenoglicol, benzoato de sódio, benzoato de benzilo, uretano, etanolamina e glicerol; agentes calmantes tais como gluconato de cálcio, clorobutanol, glucose e álcool benzílico; e anestésicos locais.

Podem preparar-se gotas oculares por métodos convencionais, misturando de forma adequada o composto com, por exemplo, conservantes tais como o clorobutanol, o desidroacetato de sódio, cloretos de benzalcónio, cloreto de cetilpiridinio, álcool fenetilico, parahidrozibenzoato de metilo e cloreto de benzetónio; agentes tamponizantes tais como borax, ácido bórico e dihidrogenofosfato de potássio; espessantes tais como a metilcelulose, hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, álcool polivinilico, carboximetilcelulose sódica e sulfato de condroitina; solubilizantes tais como o polissorbato 80 e o óleo de rícinos endurecido com polioxietileno 60; estabilizantes tais como o edetato de sódio e o hidrogenossulfito de sódio; e agentes de isotonicidade tais como o cloreto de sódio, o cloreto de potássio e o glicerol. Não existe nenhuma limitação específica do método de se administrarem os produtos farmacêuticos mencionados 11 acima; tem que se decidir, levando em consideração a forma de dosagem, a idade, o sexo e outras condições do paciente, bem como a severidade dos sintomas. A dose do ingrediente activo do produto farmacêutico da invenção presente é decidida adequadamente, de acordo com o regime de dose, a idade e o sexo do paciente, o perfil da doença, e outras condições. No entanto, em geral, podem administrar-se a um adulto 0,1 a 500 mg/dia, de uma só vez ou numa série de administrações.

EXEMPLOS A invenção presente é descrita adiante, por intermédio de alguns exemplos experimentais e alguns exemplos de formulação. No entanto, estes exemplos não limitam de forma nenhuma o âmbito da invenção.

Nestas experiências, utilizou-se ο T-817MA como substância do teste.

Exemplo Experimental 1: aumento da actividade da PKC em culturas de células

Determinou-se a actividade da PKC de acordo com o método de Etcheberrigaray et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(30), 11141-11146), consoante era aplicável. No momento da activação, a PKC migra do 12 citoplasma para as membranas. Utilizou-se como indice da activação da PKC o teor em PKC na fracção membranar sobre o seu teor no citosol. Nesta experiência, mediu-se a actividade da PKCs, uma isoforma conhecida da PKC.

Prepararam-se culturas de células seguindo o método de Hirata et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther., 2005, 314 (1), 252-259).

Removeu-se o córtex cerebral de fetos com 18 dias, de ratos Wistar/ST, e incubou-se em soro salino fisiológico tamponizado com fosfato (ao qual doravante se fará referência como "PBS") contendo 0,25 % de tripsina e 40 unidades Kunitz/mL de DNase I, durante 20 minutos a 37°C. Em seguida, adicionou-se-lhe uma mistura de iguais quantidades de soro fetal de bovinos (fabricado pela JRH Co.) e de meio Eagle Modificado da Dulbecco (doravante referido neste documento com "DMEM"), e dispersaram-se células da suspensão com pipetas. Filtrou-se esta suspensão através de um papel para limpeza de lentes, centrifugou-se durante 5 minutos a 1.000 rpm, e voltaram a dispersar-se as células por intermédio de adição de DMEM contendo 10 % de soro fetal de bovinos, com pipetas. Inocularam-se então as células a uma densidade de 4 χ 105 células/mL, em 5 mL de meio, numa placa de culturas de tecidos com 60 mm de diâmetro, a qual havia sido revestida com poli-L-lisina, e cultivou-se. No Dia 2 a contar do inicio do cultivo, adicionou-se a cada placa 50 pL de uma solução de AraC a 1 13 mmol/L. Passadas 24 horas, alterou-se o meio para 5 mL de DMEM contendo 10 % de soro fetal de bovinos.

No Dia 8 a contar do inicio da cultura, adicionou-se T-817MA às células, a uma concentração final de 0,1 ymol/L, em termos de T-817. Após esta adição, lavaram-se as células com PBS às 0 (não tratadas), 1, 2 e 4 horas. Em seguida, utilizando um raspador para células, recolheram-se as células num tampão de extracção (20 mmol/L de Tris-HCl, pH 7,5, 2 mmol/L de EDTA, 2 mmol/L de EGTA, 5 mmol/L de DTT, 0,32 mol/L de sacarose, e 1/100 em volume de mistura de inibidores de protease (fabricado pela SIGMA)). Submeteu-se o extracto de células e centrifugou-se durante 20 minutos a 12.000 x g, designando-se o sobrenadante que deste modo se obteve como fracção de citosol. Adicionou-se o tampão de extracção contendo 1 % Triton X-100 à pastilha. Depois de uma ultra-sonicação, deixou-se repousar sobre gelo durante 45 minutos. Voltou a centrifugar-se durante 20 minutos a 12.000 χ g, e designou-se o sobrenadante obtido como fracção de membrana. Mediu-se a concentração proteica no citosol e na fracção de membrana, e ajustou-se o conteúdo em proteína em cada amostra a um determinado valor constante com o tampão de extracção contendo Triton X-100. Diluíram-se então estas amostras com tampão de electroforese contendo mercaptoetanol (fabricado pela Wako Pure Chemical Industries Ltd.) e conduziu-se uma SDS-PAGE (40 mA, 30 minutos) sobre gel de poliacrilamida a 10 %. Completada a SDS-PAGE, transferiu-se a proteína do gel para uma membrana de PVDF (150 mA, 90 minutos) . Agitou-se a 14 membrana durante 60 minutos em PBST (PBS contendo 0,1 % de Tween 20) contendo 5 % de leite desnatado. Em seguida, mergulhou-se a membrana em PBS contendo anticorpo PKCs anti-murganho (fabricado por BD Transduction Laboratories, diluido 500 vezes) e deixou-se repousar durante 90 minutos. Em seguida, depois de se lavar a membrana com PBST, agitou-se durante 90 minutos com PBST contendo anticorpo IgG anti-murganho marcado com HRP (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences, diluido 2.500 vezes). Em seguida, depois de se lavar com PBST, tratou-se a membrana com reagente ECL plus (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences) e detectou-se a luminescência utilizando um sistema Lumino Image Analyzer. Compararam-se as bandas de PKCs das amostras. Ilustram-se os resultados na Fig. 1.

Verificou-se que a PKCs tinha migrado do citoplasma para as membranas às 2 horas e às 4 horas depois de se tratarem as células com ο T-817MA. A migração da PKC a partir do citoplasma e para as membranas pode ser considerada um índice de activação. Demonstrou-se portanto que ο T-817MA apresentava um efeito de aumentar a actividade da PKCs.

Exemplo de Formulação 1

Misturaram-se 50 mg de T-817MA, 20 mg de lactose, 25 mg de amido de milho, e 40 mg de Avicel PH101 (fabricado pela Asahi Kasei Corporation) utilizando uma solução aquosa a 5 % de polivinilpirrolidona K30. Depois de se secar a 15 mistura a 60°C, misturou-se com ela uma mistura de 10 mg de Kollidon CL (fabricado por BASF Co., Ltd.), 10 mg de Avicel PH302 (fabricado por Asahi Kasei Corporation), 18 mg de ácido silicico anidro leve, e 2 mg de estearato de magnésio, e comprimiu-se a comprimidos circulares com um diâmetro de 7 mm, pesando cada um deles 175 mg e contendo 50 mg de T-817MA.

Exemplo de Formulação 2

Misturaram-se 50 mg de T-817MA, 20 mg de lactose e 53 mg de amido de milho utilizando uma solução aquosa a 5 % de polivinilpirrolidona K30, e secou-se a 60°C. Em seguida misturou-se com ela 7 mg de Kollidon CL (fabricado por BASF Co., Ltd.), 18 mg de Avicel PH302 (fabricado por Asahi Kasei Corporation), e 2 mg de estearato de magnésio. Utilizaram-se 150 mg desta mistura como enchimento por cápsula, em cápsulas de gelatina No. 4, para se obterem cápsulas de produto farmacêutico.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO A Fig. 1 é o resultado de uma transferência Western na experiência em que se mediu a actividade da PKC em células em cultura.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL O derivado de éter alquilico, ou o seu sal, da invenção presente, manifesta uma actividade de aumento da actividade da PKC e é útil no tratamento ou na prevenção de diversas doenças nas quais a PKC esteja envolvida, por exemplo, patologia do metabolismo da glucose nos pacientes com cirrose hepática, e doenças neoplásicas tais como tumores.

Lisboa, 7 de Janeiro de 2011.

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. 3-(2-(l-Benzotiofen-5- il)etoxi)propil)azetidin-3-ol ou um seu sal, para utilização no tratamento ou na prevenção de uma patologia do metabolismo da glucose nos pacientes com cirrose do fígado ou com doenças neoplásicas. Lisboa, 7 de Janeiro de 2011.