PT1977241E

PT1977241E - Ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpos

Info

Publication number: PT1977241E
Application number: PT07717805T
Authority: PT
Inventors: John Kunich; Cheng Liu
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2006-01-04
Filing date: 2007-01-04
Publication date: 2010-09-16
Also published as: ES2349885T3; AU2007204777A1; BRPI0706420A2; IL192546A; HK1116253A1; KR20080085080A; JP2009522583A; US20090155821A1; WO2007082138A3; CN101395471A; CA2636183A1; EP2246700A1; MX2008008700A; EP1977241B1; WO2007082138A2; IL192546A0; RU2008131931A; AU2007204777B2; DE602007008357D1; PL1977241T3

Description

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DESCRIÇÃO "ENSAIO DE CITOTOXICIDADE CELULAR DEPENDENTE DE ANTICORPOS"

CAMPO TÉCNICO 0 presente pedido de patente está relacionado com métodos para testar citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e, nalgumas realizações, está relacionado com métodos que permitem que a ADCC seja testada em tempo real sem necessidade de células marcadas.

FUNDAMENTO A ADCC é um componente da resposta imune em que anticorpos IgG se ligam a antigénios na superfície de células alvo patogénicas ou tumorigénicas, o que as identifica para destruição pelas células efectoras NK. As células efectoras possuidoras do receptor Fc gama (FcyR) reconhecem e ligam-se à região Fc dos anticorpos ligados à célula alvo. Os anticorpos conferem assim especificidade à morte da célula alvo, a qual é mediada pelas células efectoras, formando uma ponte entre os dois tipos celulares com subsequente libertação de grânulos líticos.

Alguns anticorpos terapêuticos desempenham as suas actividades biológicas através da promoção de ADCC. 2 ΡΕ1977241

Por exemplo, Herceptin®, um anticorpo humanizado usado para o tratamento do cancro da mama, promove ADCC através da ligação ao antigénio HER-2 na superfície de células cancerosas. Igualmente, Rituxan®, um anticorpo quimérico usado para o tratamento de linfoma não-Hodgkin, promove ADCC através da ligação aos antigénios CD20 na superfície de células de linfoma.

As tecnologias para determinar se um anticorpo induz ADCC, tipicamente, envolvem a marcação de células alvo com um material radioactivo, como seja Cr51, como descrito por exemplo em US-A-6840313 ou EP-A-1176195, ou com uma marca fluorescente, como seja Calceína AM. As células marcadas são incubadas com o anticorpo e com as células efectoras, tais como células NK ou PBMCs, e a morte das células alvo por ADCC é detectada através da libertação de radioactividade ou de fluorescência. A marcação das células alvo nesses ensaios requer o descolamento de células aderentes para marcação. Após marcação, o ensaio é realizado com as células alvo em suspensão, o que não é o estado normal das células aderentes. Ainda, o grau de morte celular mediada por ADCC, de um modo geral, é determinado em apenas um ponto várias horas após a mistura das células alvo com células efectoras e com o anticorpo. Foi desenvolvido um ensaio sem marcação, em que a morte celular é determinada através da medição da libertação de desidrogenase de lactato (LDH) do citoplasma das células lisadas para o sobrenadante sem células. No entanto, o método LDH não é um ensaio em tempo real e não distingue 3 ΡΕ1977241 entre morte das células alvo e morte das células efectoras uma vez que ambos tipos de células libertam LDH na lise.

Face ao número de produtos de anticorpos terapêuticos que existem agora no mercado ou em desenvolvimento, verifica-se a necessidade de ensaios in vitro que permitam determinar a actividade ADCC dos anticorpos. Em particular, existe a necessidade de um ensaio ADCC sem marcação para elevado número de amostras que permita a monitorização de ADCC em tempo real e que não requeira o descolamento de células aderentes.

SUMÁRIO 0 presente pedido proporciona métodos de ensaio de ADCC in vitro. Os métodos não envolvem marcação ou requerem níveis reduzidos de marcação e assim são mais fáceis e seguros de realizar do que os ensaios que requerem células marcadas. Os métodos são realizados com células aderentes em vez de células em suspensão. Ainda, os métodos podem ser realizados em tempo real, permitindo que seja seguida a cinética das reacções ADCC e assim podem ser comparadas as cinéticas ADCC de diferentes anticorpos. Os métodos aqui proporcionados são igualmente mais sensíveis que os ensaios de ADCC convencionais, permitindo que sejam detectadas diferenças mínimas na cinética de ADCC entre os diferentes anticorpos. Ainda, nalguns realizações a simplicidade dos métodos aqui proporcionados implica que sejam mais rápidos que os ensaios ADCC convencionais e também 4 ΡΕ1977241 possuam o potencial de serem optimizados para rastreio de actividade ADCC num grande número de amostras.

Os métodos aqui proporcionados compreendem (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento das células alvo num meio de ensaio; e (b) adição ao meio de ensaio das células efectoras e de um anticorpo que se liga às células alvo. Um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, é indicador de ter ocorrido ADCC no meio de ensaio. Um aumento ou ausência de alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, pode ser indicativo da função ADCC não ter ocorrido no meio de ensaio.

Num aspecto, o presente pedido descreve um método de ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), compreendendo: (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo num meio de ensaio, em que as células alvo estão numa monocamada sobre o substrato; e (b) adição ao meio de ensaio de células efectoras e de um anticorpo que se liga às células alvo; em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, é indicativo de ter ocorrido a função ADCC no meio de ensaio e em que um aumento ou ausência de alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras 5 ΡΕ1977241 e do anticorpo, é indicativo da função ADCC não ter ocorrido no meio de ensaio. 0 método pode incluir a medição da impedância em intervalos regulares. 0 método pode incluir o cálculo do índice Celular (IC) a partir de cada medição de impedância e determinar se ocorre uma alteração no índice Celular, em que o índice Celular é calculado a partir de cada medição de impedância usando a fórmula ,( = max.

M em que Rb(f) e Rcei(f) são as resistências dos eléctrodos dependentes da frequência sem células ou com células presentes, respectivamente, e N é o número dos pontos da frequência em que a impedância é medida. 0 método pode ser conduzido usando o sistema RT-CES®. As medições da impedância podem ser realizadas cada 15 minutos. 0 método pode ainda permitir a sementeira das células alvo. As células alvo podem ser semeadas 18 a 24 horas antes da adição do anticorpo e das células efectoras. As células alvo podem ser semeadas numa densidade entre 2K e 100K por alvéolo (e.g., entre 15K e 25K por alvéolo, ou cerca de 20K por alvéolo). A proporção de células efectoras relativamente às células alvo (E:T) pode ser 25:1. A E: T pode ser superior a 10:1, superior a 50:1 ou superior a 100:1. O anticorpo pode ser adicionado numa concentração 6 ΡΕ1977241 entre 1 e 100 μg/ml, entre 1 e 50 μg/ml ou entre 2 e 8 μg/ml. O método pode incluir a adição ao meio de ensaio de dois ou mais anticorpos que se ligam às células alvo, três ou mais anticorpos que se ligam às células alvo, ou quatro ou mais anticorpo que se ligam às células alvo. O anticorpo pode derivar de um doente com uma perturbação auto-imune.

As células alvo podem expressar antigénios apicais. O método pode incluir um passo preliminar de rastreio das células alvo relativamente à expressão do antigénio apical. As células alvo podem ser células cancerosas ou células infectadas por vírus. As células cancerosas podem ser de uma linha celular. As células cancerosas podem ser células SKBR3 ou células MG63.

As células efectoras podem compreender células mononucleadas do sangue periférico (PBMCs), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas ou neutrófilos. 30. O passo (b) do método pode compreender a adição de sangue total, que foi previamente enriquecido nas células efectoras, às células alvo. O passo (b) do método pode compreender a adição de sangue total às células efectoras, em que o sangue total compreende as células efectoras.

Num outro aspecto, o presente pedido de patente descreve um método de rastreio de um anticorpo candidato relativamente à sua capacidade para induzir ADCC contra células alvo, compreendendo: (a) monitorização da impedân- 7 ΡΕ1977241 cia entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo no meio de ensaio; e (b) adição ao meio do ensaio das células efectoras e do anticorpo candidato que se liga às células alvo; em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, é indicativo da capacidade do anticorpo candidato para efectuar a função ADCC contra as células alvo e em que um aumento ou ausência de alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, é indicativo da incapacidade do anticorpo candidato para efectuar a função ADCC contra as células alvo.

Num outro aspecto, o presente pedido descreve um método de identificação de um doente que possui uma doença associada às células alvo que é passível de tratamento com um anticorpo candidato capaz de modular ADCC, em que as células alvo são a) células saudáveis associadas a doença auto-imune, 2) células infectadas por vírus ou 3) células cancerosas, o método compreendendo: (a) monitorização da impedância entre os eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo associadas com a doença; (b) adição de PBMCs isolados do doente e do anticorpo candidato às células alvo; e (c) determinação da ocorrência de uma alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após a adição dos PBMCs e do anticorpo, em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos é indicativo da adequação do doente ao tratamento com o ΡΕ1977241 anticorpo e em que um aumento ou ausência de alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição dos PBMCs e do anticorpo, é indicativo da não adequação do doente para o tratamento com o anticorpo.

Ainda num outro aspecto, o presente pedido de patente descreve um método de rastreio de um composto candidato relativamente à capacidade para modular ADCC, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo no meio de ensaio; (b) adição ao meio de ensaio de células efectoras e de um anticorpo, na presença e ausência do composto candidato, em que o anticorpo se liga às células alvo; e (c) comparação de qualquer alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo na presença do composto candidato, com qualquer alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo na ausência do composto candidato, em que uma alteração na impedância na presença do composto candidato que seja superior a qualquer alteração na impedância na ausência do composto candidato é indicativo de que o composto candidato possui a capacidade de modular ADCC. Facultativamente, o composto candidato a ser testado pode modular ADCC relacionada com auto-imunidade . 0 presente pedido de patente também descreve um método como aqui descrito, o qual é um ensaio para um 9 ΡΕ1977241 grande número de amostras, em que o substrato não condutor compreende dois ou mais alvéolos de microtitulação, cada alvéolo compreendendo pelo menos dois eléctrodos e monitorização da impedância entre os eléctrodos em cada alvéolo.

Num outro aspecto, o presente pedido de patente descreve um ensaio de controlo de qualidade para um anticorpo, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre os eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo num meio de ensaio; e (b) adição de células efectoras e do anticorpo ao meio de ensaio, em que o anticorpo se liga às células alvo; em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato após adição das células efectoras e do anticorpo é indicativo de que o anticorpo é adequado para ser usado na indução de ADCC e em que um aumento ou ausência de alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, é indicativo de que o anticorpo não é adequado para ser usado na indução de ADCC.

Ainda num outro aspecto, o presente pedido descreve um ensaio de controlo de qualidade para um anticorpo, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre os eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo num meio de ensaio; (b) adição de células efectoras e do anticorpo ao meio de ensaio, em que o anticorpo se liga às células alvo; e (c) comparação de qualquer alteração na impedância entre os eléctrodos no 10 ΡΕ1977241 substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, com qualquer alteração na impedância para uma amostra controlo, após adição das células efectoras e do anticorpo, que seja superior a qualquer decréscimo na impedância para a amostra controlo, após adição das células efectoras e do anticorpo controlo, é indicativo de que o anticorpo é adequado para ser usado na indução de ADCC e em que a ausência de um decréscimo na impedância para a amostra controlo, após adição das células efectoras e do anticorpo controlo, é indicativo de que o anticorpo não é adequado para ser usado na indução de ADCC. No ensaio de controlo de qualidade, um decréscimo na impedância, após adição das células efectoras e do anticorpo, que seja pelo menos 25% superior ao decréscimo na impedância para a amostra controlo, após adição das células efectoras e do anticorpo controlo, pode ser indicativo de que o anticorpo é adequado para ser usado na indução de ADCC. O presente pedido de patente também descreve um método de rastreio de um composto candidato para usar como fármaco contra uma doença auto-imune, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo num meio de ensaio, em que as células alvo são células saudáveis; (b) adição ao meio de ensaio de células efectoras e de um anticorpo, com e sem o composto candidato, em que o anticorpo se liga às células alvo e em que as células efectoras são PBMCs de um indivíduo diagnosticado com a doença auto-imune; e (c) comparação de qualquer alteração 11 ΡΕ1977241 na impedância na presença de um composto candidato com qualquer alteração na impedância na ausência do composto candidato, em que um decréscimo na impedância na ausência do composto candidato que seja superior a qualquer decréscimo na impedância na presença do composto candidato é indicativo de que o composto candidato é adequado como agente terapêutico contra a doença auto-imune e em que a ausência de um decréscimo na impedância na ausência do composto candidato que seja superior a qualquer decréscimo na impedância na presença do composto candidato é indicativo de que o composto candidato não é adequado como fármaco contra a doença auto-imune.

Num outro aspecto, o presente pedido descreve um método para determinar se um anticorpo candidato é adequado para o tratamento de um indivíduo tendo uma doença auto-imune, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre os eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo associadas à doença auto-imune; e (b) adição do anticorpo candidato e dos PBMCs isolados do indivíduo às células alvo; e (c) comparação de qualquer alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição dos PBMCs e do anticorpo candidato, em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos é indicativo de que o anticorpo é adequado para o tratamento do indivíduo e em que a ausência de um decréscimo na impedância entre os eléctrodos é indicativo de que o anticorpo não é adequado para o tratamento do indivíduo. 12 ΡΕ1977241

Ainda num outro aspecto, o presente pedido descreve um método para determinação de uma concentração óptima de um anticorpo para indução de uma resposta ADCC, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de duas ou mais amostras das células alvo num meio de ensaio; e (b) adição de células efectoras e de um anticorpo a duas ou mais amostras das células alvo, em que o anticorpo se liga às células alvo e em que o anticorpo é adicionado em diferentes concentrações a duas ou mais amostras das células alvo; em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, é indicativo da função ADCC ter ocorrido no ensaio e em que a concentração do anticorpo que resulta no maior decréscimo na impedância é determinada como sendo a concentração óptima.

Num outro aspecto, o presente pedido de patente descreve um método para determinar se um anticorpo se liga a um antigénio apical numa célula alvo, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre os eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento das células alvo num meio de ensaio; e (b) adição de células efectoras e do anticorpo às células alvo; em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, é indicativo de que o anticorpo se liga ao antigénio apical nas células alvo. 13 ΡΕ1977241 A menos que de outra forma seja definido, todos os termos técnicos aqui usados possuem o mesmo significado normalmente atribuído pelos familiarizados com a área em que este invento se insere.

Os detalhes de uma ou mais realizações do invento são descritos nos desenhos juntos na descrição abaixo. Outras características, objectos e vantagens do invento serão aparentes a partir da descrição e desenhos e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIG. 1 descreve um gráfico que representa o índice Celular ao longo do tempo para células SKBR3 que foram semeadas em diluições seriadas de 2 vezes de 40K, 20K, 10K ou 5K por alvéolo, como indicado. FIG. 2 descreve um gráfico que representa o índice Celular ao longo do tempo para células SKBR3 semeadas que foram tratadas após 20 horas com mais meio fresco ("células apenas") ou com Triton X-100 ("células + Triton") para induzir a morte celular. FIG. 3 descreve um gráfico que representa o índice Celular ao longo do tempo para células SKBR3 semeadas que foram tratadas após 20 horas com meio fresco ("Alvos apenas"), Herceptin ("Alvos + Herceptin") ou anticorpos controlo do tipo IgG ("Alvos + IgG"). 14 ΡΕ1977241 FIG. 4 descreve um gráfico que representa o índice Celular ao longo do tempo para células SKBR3 apenas ("Alvos") ou PBMCs apenas ("efectoras") . FIG. 5 descreve um gráfico que representa o índice Celular ao longo do tempo para células SKBR3 apenas, PBMCs apenas ou células SKBR3 que foram tratadas com PBMCs após 20 horas. FIG. 6 descreve um gráfico que representa o índice Celular ao longo do tempo para células SKBR3 apenas, células SKBR3 tratadas com PBMCs às 20 horas ou células SKBR3 tratadas com PBMCs e Herceptin® após 20 horas. FIG. 7 descreve um gráfico que mostra a cinética da lise das células alvo SKBR3 (T) por células efectoras PBMCs (E) numa proporção de E:T de 50:1 ou a 12,5:1, com e sem o mAb Herceptin® conforme indicado. FIG. 8A descreve um gráfico que representa a percentagem de lise determinada, usando um método como aqui descrito, para células alvo SKBR3 tratadas com PBMCs apenas, células alvo SKBR3 tratadas com PBMCs mais as concentrações indicadas de Herceptin®, ou células alvo SKBR3 tratadas com PBMCs mais IgG controlo. A FIG. 8B descreve um gráfico que representa a percentagem de lise determinada usando um ensaio convencional de Calcein-AM para células alvo SKBR3 tratadas com PBMCs apenas, células 15 ΡΕ1977241 alvo SKBR3 tratadas com PBMCs mais as concentrações indicadas de Herceptin® ou células alvo SKBR3 tratadas com PBMCs mais IgG controlo. FIG. 9 descreve um gráfico que representa o índice Celular ao longo do tempo para células SKBR3 e MG63. FIG. ÍOA descreve um gráfico que representa o índice Celular para células MG63 tratadas às 18-20 horas com PBMCs apenas, PBMCs com o anticorpo especifico de alvo RX1 ou PBMCs com o anticorpo IgG controlo. FIG. 10B descreve um gráfico que representa o índice celular para as células SKBR3 tratadas às 18-20 horas com PBMCs apenas, PBMCs com o anticorpo Herceptin® especifico do alvo ou PBMCs com o anticorpo IgG controlo.

DESCRIÇÃO DETALHADA O presente pedido de patente proporciona métodos para a detecção de ADCC através da medição da impedância entre eléctrodos situados na superfície em que as células são semeadas. Pode ser usado qualquer dispositivo adequado para medir a impedância. Nalgumas realizações, a ADCC pode ser detectada usando um dispositivo tendo um substrato não condutor com uma pluralidade de arranjos de eléctrodos posicionados no mesmo, os arranjos estando ligados a uma analisador de impedância. Por exemplo, ADCC pode ser medido usando um dispositivo possuindo arranjos de eléctrodos posicionados num substrato numa câmara inferior, a câmara 16 ΡΕ1977241 inferior estando separada de uma câmara superior por uma membrana. Tal dispositivo poderá também ser usado para detectar a migração de células da câmara superior para a câmara inferior, pelo que a aderência ao substrato na câmara inferior é detectada por um aumento na impedância entre os eléctrodos nos arranjos na câmara inferior. Tais dispositivos estão descritos, por exemplo, em W02004/010103 e WO2004/010102.

Tais dispositivos também podem ser usados para avaliar a citotoxicidade de um composto sobre as células. Por exemplo, um composto pode ser adicionado às células que estão a crescer num substrato contendo eléctrodos e o efeito do composto na impedância entre os eléctrodos pode ser monitorizado, em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos é indicativo de morte celular. Ver, por exemplo, W02005/77104 e WO2005/047482. Ver também, Publicação U.S. N° 2005/0112544, a qual descreve métodos que incluem medição da impedância para avaliar a citotoxicidade celular induzida por Tamoxifen.

Nenhuma das referências descritas usando os dispositivos aqui descritos para avaliar ADCC. W02006/015387 descreve a utilização de sistemas RT-CES para o rastreio de toxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Este documento é no entanto o nosso documento de acordo com o Art 54(3) EPC. Ao contrário dos ensaios de citotoxicidade convencionais, os quais simplesmente envolvem a adição de um composto candidato a uma célula alvo, os ensaios ADCC 17 ΡΕ1977241 envolvem a adição de (a) um anticorpo que se ligará à célula e (b) células efectoras que se ligarão ao anticorpo. Não se espera que as medições de impedância proporcionem uma indicação precisa do número de células alvo num ensaio ADCC, uma vez que se espera que as células alvo e o anticorpo adiram ao substrato. Assim, uma leitura elevada da impedância poderá ser devida a: i) células alvo que aderem ao substrato devido ao anticorpo e às células efectoras não terem induzido ADCC; ou ii) às células efectoras e anticorpos que aderem ao substrato após morte das células alvo por ADCC. Não será de esperar que os sistemas descritos atrás sejam úteis num ensaio de ADCC.

Surpreendentemente, no entanto, os inventores encontraram que sistemas tais como os descritos em W02005/77104 e W02005/047482 podem ser usados em ensaios de ADCC. Em particular, os inventores encontraram que as células efectoras não aderem significativamente ao substrato contendo eléctrodos e que com números adequados de células alvo, proporções adequadas de células efectoras relativamente às células alvo (E:T) e concentrações adequadas de anticorpos, as alterações na impedância entre eléctrodos no substrato podem proporcionar uma indicação precisa dos números de células alvo.

0 ensaio de ADCC através da detecção de alterações na impedância entre eléctrodos num substrato no qual as células alvo são crescidas tem um número significativo de vantagens relativamente aos ensaios de ADCC 18 ΡΕ1977241 convencionais. Ao contrário da maior parte dos ensaios de ADCC convencionais, nalgumas realizações os métodos aqui proporcionados não exigem marcação. Nalgumas realizações, os métodos não envolvem a marcação de células com uma marca radioactiva ou outra marca, tornando os ensaios mais fáceis e seguros de realizar do que os ensaios que requerem células marcadas. Ainda, como aqui discutido, nos ensaios de ADCC convencionais, as células aderentes são destacadas da superfície em que estão a crescer de forma que as células possam ser marcadas e o ensaio ADCC é realizado em suspensão. Uma vez que os métodos aqui proporcionados não exigem marcação, não existe a necessidade de destacar as células, eliminando assim uma potencial fonte de erro devido à perturbação das células aderentes. Pelo contrário, os ensaios ADCC são realizados com as células descoladas do substrato.

Ainda, ao contrário da maioria dos ensaios ADCC convencionais, nalgumas realizações os métodos aqui proporcionados permitem que o número de células seja seguido em tempo real, através da medição da impedância em vários pontos do tempo após adição do anticorpo e das células efectoras. Os métodos aqui proporcionados permitem assim que seja seguida a cinética da reacção ADCC de forma que possa ser comparada a cinética de ADCC dos diferentes anticorpos. Nalgumas realizações os métodos são mais sensíveis do que os ensaios ADCC convencionais, permitindo que sejam detectadas pequenas diferenças na cinética de ADCC dos diferentes anticorpos. Ainda, a simplicidade dos 19 ΡΕ1977241 métodos aqui divulgados significa que são muito mais rápidos do que os ensaios de ADCC convencionais e possuem o potencial de serem optimizados para o rastreio de grande número de amostras relativamente à actividade de ADCC.

Os métodos aqui proporcionados podem ser realizados usando um dispositivo descrito em W02004/010102, W02004/010103, WO2005/077104 ou WO2005/047482 ou um dispositivo baseado nestes projectos. Nalgumas realizações, os métodos aqui proporcionados podem ser realizados usando o sistema RT-CES® produzido por ACEA Biosciences (San Diego, CA). 0 sistema ACEA RT-CES® compreende três componentes: um analisador de sensor electrónico, uma estação de dispositivo e uma placa de microtitulação de 16 alvéolos. 0 leitor compreenderá que pequenas variantes deste sistema estarão dentro do âmbito dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, o sistema pode ter uma placa de microtitulação de 96 alvéolos ou uma placa de microtitulação de 256 alvéolos, em vez de uma placa de microtitulação de 16 alvéolos, para permitir que sejam conduzidos mais ensaios em simultâneo.

Os arranjos de microeléctrodos sensores podem ser fabricados em lâminas de vidro usando métodos de fabrico litográficos e as lâminas contendo os eléctrodos podem ser montadas em tabuleiros de plástico para formar alvéolos contendo eléctrodos. A estaçao do dispositivo pode receber a placa de 20 ΡΕ1977241 microtitulação (e.g., a placa de microtitulação de 16 alvéolos, 256 alvéolos ou de 96 alvéolos) e pode ser capaz de electronicamente accionar qualquer um dos alvéolos relativamente ao analisador dos sensores para medição da impedância. Quando do funcionamento, os dispositivos com células cultivadas nos alvéolos podem ser ligados à estação de serviço e colocados dentro de uma estufa. Cabos eléctri-cos podem ligar a estação do dispositivo ao analisador dos sensores. Usando o controlo do programa informático RT-CES®, o analisador dos sensores pode automaticamente se-leccionar os alvéolos a serem medidos e pode continuamente efectuar medições da impedância. Os dados da impedância do analisador podem ser transferidos para um computador, analisados e processados pelo programa informático integrado. A impedância medida entre os eléctrodos num alvéolo individual tipicamente depende da geometria dos eléctrodos, concentração iónica no alvéolo e da existência de células ligadas aos eléctrodos. Na ausência de células, a impedância dos eléctrodos é determinada principalmente pelo ambiente iónico na interface eléctrodo/solução e na solução global. Na presença de células, as células ligadas às superfícies dos eléctrodos sensores podem alterar o ambiente iónico local na interface eléctrodo/solução, conduzindo a um aumento na impedância. Quanto mais células existirem nos eléctrodos, maior o aumento na impedância célula-eléctrodo.

Para quantificar as células com base na impe- 21 ΡΕ1977241 dância célula-eléctrodo medida, gerou-se um parâmetro designado índice Celular (Cl), de acordo com a fórmula: ÇI~ max A Rm } em que Rb(f±) é a resistência dos eléctrodos dependente da frequência (um componente da impedância) sem células, Rceii(f) é a resistência dos eléctrodos dependente da frequência com células presentes e N é o número dos pontos de frequência em que foi medida a impedância.

Assim, o índice Celular é uma medida quantitativa das células num alvéolo contendo eléctrodos. Nas mesmas condições fisiológicas, mais células ligadas aos eléctrodos conduz a um valor maior de Rcen(f), levando a um maior valor de índice Celular.

Os métodos aqui proporcionados podem incluir medição da impedância em intervalos regulares e cálculo de um índice Celular a partir de medições de impedância de acordo com a fórmula descrita atrás, permitindo assim que seja seguida a reacção ADCC. Os intervalos em que são feitas as medições de impedância podem depender do quão estreitamente se pretende seguir a cinética da reacção. Por exemplo, intervalos curtos podem ser preferidos caso se pretenda seguir a cinética de ADCC de um anticorpo já conhecido como indutor de ADCC, enquanto intervalos mais longos podem ser satisfatórios se o principal objectivo for 22 ΡΕ1977241 determinar se um determinado anticorpo pode induzir ADCC. Os métodos podem incluir fazer medições de impedância em pontos tais como, por exemplo, cada 30 minutos, cada 15 minutos, cada 10 minutos, cada 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 minutos, minuto a minuto ou mais frequentemente do que minuto a minuto.

Os métodos aqui descritos podem ainda incluir sementeira das células alvo no substrato antes da adição de células efectoras e do anticorpo. Por exemplo, as células alvo podem ser semeadas no substrato e deixadas a crescer durante um período de tempo antes da adição das células efectoras e do anticorpo. A sementeira das células alvo antes da adição do anticorpo e das células efectoras pode permitir que as células alvo se liguem ao substrato e cresçam, resultando num aumento da impedância que pode facilitar a detecção de um decréscimo da impedância após adição das células efectoras e do anticorpo. As células alvo, tipicamente, não deverão no entanto crescer excessivamente, uma vez que as células alvo ligadas ao substrato podem tornar-se inacessíveis ao anticorpo devido às células que crescem acima delas. Em tais casos, não será possível detectar ADCC. Está dentro da capacidade dos familiarizados com a área efectuar experiências para determinar o tempo óptimo de cultura das células alvo antes da adição das células efectoras e do anticorpo. Nalgumas realizações, as células alvo podem ser semeadas no substrato 10-30 horas antes da adição das células efectoras e do anticorpo. Por exemplo, as células alvo podem ser semeadas no substrato 23 ΡΕ1977241 18-24 horas (e.g., 19-21 horas) antes da adição das células efectoras e do anticorpo. A densidade a que as células alvo são semeadas pode depender do tamanho das células e da velocidade a que crescem. 0 sistema de detecção tipicamente possui um limite máximo, acima do qual é incapaz de detectar mais crescimento das células. As células alvo deverão assim ser semeadas numa densidade abaixo deste limite para permitir que sejam detectadas alterações da impedância devidas à morte das células. No entanto, as células alvo também deverão ser semeadas numa densidade que seja suficientemente elevada para permitir que as células possuam um efeito na impedância durante o período inicial de crescimento, de forma que possa ser detectado qualquer decréscimo na impedância após adição das células efectoras e do anticorpo. Nalgumas realizações, as células alvo podem ser semeadas numa densidade entre 2K e 100K num alvéolo convencional de 19,6 mm2 (e.g., numa densidade entre 10K e 60K num alvéolo convencional de 19,6 mm2, numa densidade entre 15K e 25K num alvéolo convencional de 19,6 mm2 ou numa densidade de aproximadamente 20 K num alvéolo convencional de 19,6 mm2) . 0 período de tempo durante o qual é feita a medição da impedância, i.e., a duração do ensaio, pode variar dependendo do período entre a sementeira das células alvo e a adição das células efectoras e do anticorpo. Uma redução na impedância devido a ADCC pode geralmente ser - 24 - ΡΕ1977241 detectadas dentro de algumas horas após a adiçao de anticorpo e das células efectoras. Nalguns casos, no entanto, pode ser desejável continuar a monitorizar a impedância durante um período após a morte por ADCC para determinar o grau de morte celular e avaliar se e quando ocorre qualquer novo crescimento celular. Os métodos aqui proporcionados podem incluir medições da impedância durante, sem limites, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas, 100 horas, 200 horas ou mais de 200 horas após sementeira das células alvo.

Os métodos aqui proporcionados podem empregar qualquer número de células efectoras e qualquer número de células alvo, desde que, como descrito atrás, o número de células alvo não seja tão elevado que impeça a detecção precisa de ADCC. Os métodos podem empregar mais células efectoras do que células alvo. A proporção de células efectoras para células alvo (E:T) pode ser, por exemplo, superior a 10:1, superior a 20:1, superior a 50:1, superior a 100:1 ou aproximadamente 25:1. O anticorpo é adicionado às células alvo numa determinada concentração. Por exemplo, o anticorpo pode ser adicionado às células alvo semeadas numa concentração de, por exemplo, entre 1 e 1000 μg/ml, entre 1 e 500 μρ/ιηΐ, entre 1 e 100 μg/ml, entre 1 e 75 μρ/ιηΐ, entre 1 e 50 μg/ml, entre 1 e 25 μg/ml, entre 1 e 10 μρ/ιηΐ, entre 2 e 8 μg/ml ou entre 4 e 6 μρ/ιηΐ. 25 ΡΕ1977241

Nalgumas realizações, os métodos aqui descritos podem ser usados para determinar a concentração óptima de um anticorpo que induza uma resposta ADCC, através da comparação da resposta ADCC obtida usando diferentes concentrações de anticorpos. Por exemplo, um método pode incluir (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de duas ou mais amostras (e.g., duas, três, quatro, cinco ou mais de cinco) das células alvo num meio de ensaio; e (b) adição das células efectoras e do anticorpo às duas ou mais amostras de células alvo, em que o anticorpo se liga às células alvo e em que o anticorpo é adicionado em concentrações diferentes às duas ou mais amostras de células alvo; em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato após a adição das células efectoras e do anticorpo é indicativo da função ADCC ter ocorrido no meio de ensaio e em que a concentração do anticorpo que resulta no maior decréscimo na impedância é determinada como sendo a concentração óptima.

As células efectoras e o anticorpo podem ser adicionados ao meio das células alvo em simultâneo ou separadamente. Por exemplo, as células efectoras podem ser adicionadas ao meio antes do anticorpo ou o anticorpo pode ser adicionado antes das células efectoras. Os métodos aqui descritos podem empregar qualquer combinação de células alvo, células efectoras e anticorpos e a selecção das células alvo, células efectoras e anticorpos usados nos métodos pode depender do objectivo do ensaio. Exemplos de 26 ΡΕ1977241 células alvo, células efectoras e anticorpos adequados para usar nos métodos aqui proporcionados são discutidos abaixo, tal como possíveis aplicações dos ensaios empregando estas células alvo, células efectoras e anticorpos.

As células alvo são células aderentes. Nalgumas realizações as células alvo expressam antigénios apicais. Muitas células são polarizadas e expressam diferentes antigénios nas suas superfície apical e basolateral (Nelson et al., (2003) Nature 422:766-774). Por exemplo, as células epiteliais expressam diferentes antigénios apicais e baso-laterais. Quando o ensaio convencional de ADCC é realizado em suspensão, o anticorpo pode ligar-se a antigénios apicais e basolaterais. Nos métodos aqui proporcionados, no entanto, em que as células aderem ao substrato, o anticorpo liga-se apenas aos antigénios apicais. A capacidade de um anticorpo para induzir ADCC demonstra assim que o anticorpo se liga a um antigénio apical nas células alvo. Os métodos aqui proporcionados podem assim ser usados para determinar se um anticorpo particular se liga a um antigénio apical nas células alvo. Por exemplo, um método pode incluir: (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo num meio de ensaio; e (b) adição de células efectoras e do anticorpo às células alvo; em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato após adição das células efectoras e do anticorpo é indicativo que o anticorpo se liga a um antigénio apical nas células alvo. Alguns anticorpos terapêuticos são capazes de aceder apenas 27 ΡΕ1977241 a antigénios apicais in vivo. Por exemplo, alguns anticorpos são apenas capazes de aceder e se ligarem a antigénios apicais expressos na superfície de tumores. A capacidade de um anticorpo para induzir ADCC através da ligação a antigénios apicais pode assim ser um indicador da eficácia terapêutica do anticorpo in vivo.

Os métodos aqui proporcionados podem incluir um passo preliminar de rastreio das células alvo relativamente à expressão de antigénios apicais. Tal passo preliminar pode empregar, por exemplo, RT-PCR ou FACS para identificar as células alvo expressando antigénios apicais que possam ser adequadas para usar nos métodos aqui descritos.

Pode ser usada qualquer célula alvo adequada. Exemplos de células que expressam antigénios apicais incluem, sem limites, células tumorais e célula epiteliais tais como as conhecidas na área. Por exemplo, as glico-proteínas da mucina, tais como os antigénios DF3 e MUCI, são expressas na superfície apical de células epiteliais e são abundamentente expressas na superfície apical de tumores epiteliais (Snijdewin et al., (2001) Int. J. Câncer 93:97-106; e Hayes et al., (1990) J. Immunol. 145:962-970). Ainda, uma variedade de células tumorais expressa um receptor de superfície celular com elevada afinidade para o ácido fólico na sua superfície apical (Lu et al., (2002) Câncer Immunol. Immunother. 51:153-162).

As células alvo podem ser células doentes tais 28 ΡΕ1977241 como, por exemplo, células de cancro ou células infectadas por vírus. Estas células alvo podem ser linhas celulares obtidas a partir de bancos de linhas celulares. Como alternativa, as células podem ser obtidas a partir de um indivíduo tendo uma doença ou perturbação. Por exemplo, as células alvo podem ser obtidas a partir de uma biopsia de tumor de um doente com cancro.

As células de cancro que podem ser usadas como células alvo incluem, mas não estão limitadas a células associadas a Doença de Hodgkin, linfomas de células B não-Hodgkin, linfomas de células T, linfoma maligno, leucemia de linfossarcoma, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiplo, leucemia mielóide crónica, leucemia mielomono-cítica crónica, síndromes mielodisplásicos, perturbações mieloproliferativas, síndrome hipereosinofílico, leucemia eosinofílica, mieloma múltiplo, perturbações linfoprolife-rativas associadas a X, cancro do esófago, cancro do estômago, cancro do cólon, cancro colo-rectal, cancro pancreático e cancro da vesícula, cancro do córtex supra-renal, tumor produtor de ACTH, cancro da bexiga, cancro do cérebro (e.g., neuroblastomas e gliomas), sarcoma de Ewing, cancro da cabeça e pescoço (e.g., cancro da boca e cancro da laringe), cancro do rim (e.g., carcinoma das células renais), cancro do fígado, cancro do pulmão (e.g., cancros das células pequenas e não pequenas do pulmão), efusão peritoneal maligna, efusão pleural maligna, cancros da pele (e.g., melanoma maligno, progressão de tumores de quera-tinócitos da pele humana, carcinoma das células epiteliais, 29 ΡΕ1977241 carcinoma das células escamosas, carcinoma das células basais), mesotelioma, sarcoma de Kaposi, cancro ósseo (e.g., osteomas e sarcomas tais como fibrossarcoma e osteossarcoma) cancros do aparelho reprodutor feminino (e.g., cancro uterino, cancro do endométrio, cancro do ovário e cancro cervical), cancro da mama, cancro da próstata, retinoblastoma, cancro do testículo e cancro da tiróide.

As linhas celulares de cancro que podem ser usadas como células alvo podem ser quaisquer linhas celulares aderentes imortalizadas obtidas, por exemplo, a partir de um banco de células. Exemplos de linhas celulares imortalizadas aderentes incluem, mas não estão limitados a: SKBR3, MG63, CCD-1070Sk, hTERT-HMEl [ME16C], BJ, ATRFLOX [Muta-tect], KEL FIB, HT-1197, LL97A (AlMy), NCI-H510A; NCI-H510], HT-29, SW756, 293, IMR-90 [IMR90], HIAE-55 parte da Wistar Special Collection], SW1417 [SW-1417], Hs737.T, NCI-H661 [H661 ] , CCD841 CoN, Hs 792 (C).M, Per Sei, NC1-H810 [H 810], Pane 05.04, ZR-75-30, T-47D, WISH, HBE135-E6E7, ARPE-19/HPV-16, 10.014 pRSV-T, GH354, MDA-MB-436, T98G[T98-G], Calu-6, BEAS-2B, G-292, clone A141B1, Detroit 539, MNNG/HOS Cl#5 [R-1059-D], BT-549, NCI-H1915], Hs 181.Sk, Hs 839.T, RD, SK-N-MC, 20B8, NCI-H292 [H292], Hs 181.Tes, Malme-3M, HS 617.Mg, JAR, Hs 144.We, HS 742.Sk, Hs875.T, TE 161.T, Hs 738 . St/Int, Hs 895.T, RWPE-1, TE 130.T, TE 84.T, HCC1008, Hs 894(E).Lu, SK-LMS-1, HFF-1, MRC-5 [MRC5], IRR-MRC-5 [ATCC X-55 ; ATCC X55 ; MRC-5 irradiadas], WI-38 [WI38], HeLa, HEK001, FHs 74 Int, Detroit 548, Detroit 573, SW-13, 293T/17, C211, Amdur II, IMR-32, HeLa [Chang Liver], 30 ΡΕ1977241 CHP 3 (Μ.W. ) , CHP 4, LL 47 (MaDo) , HEL 299, Detroit 562, CCD-llLu, KB, A549 [A-549], MDA-MB-134-VI, HLF-a, TE354.T, HeLa 229, HeLa S3, COLO 320DM, clone l-5c-4 [derivado (D) Wong-Kilbourne da conjuntiva de Chang], CCD-13Lu, CCD-8Lu, CCD-19-Lu, CCD-16Lu, AV3, Hs888Lu, CCD-25Lu, COLO 320HSR [COLO 320 HSR] , DLD-1, COLO 205, COLO 201, HCT-15, SW837 [SW-837], LoVo, SW48 [SW-48], SW1463 [SW 1463; SW-1463], SW 1353; SW-1353], 1205Lu [parte da Wistar Special Collection], HCT-8 [HRT-18], AGS, HCT 116, T84, SNU-C2B, SNU-C2A, NCI-H716 [H716], NCI-H747 [H747], NCI-H498 [H498], LS123, NCI-H1688 [H1688], CFPAC-1, L-132, TE 353.Sk, intestino 407, FL, Detroit 525, Detroit 510, C32, WI-38 VA-13 sublinha 2RA [parte da Wistar Special Collection], citrulinemia, Cri du Chat, WI-26 VA4 [parte da Wistar Special Collection], BeWo, WM35 [parte da Wistar Special Collection], MSTO-211H, WRL 68, NCI-H295 [H295], MCF 10A, MCF 10F, RWPE2-W99, SV-HUC-1, HCC202, C3A [HepG2/C3A; derivado de Hep G2 (ATCC HB-8065)], MCF-10-23, 293 cl8, F.thy 62891, Lei Cap, Sal Mat, HCE-2 [50.Bl], A2058, RWPE-

2, Am Ric, Lo Ren, Ron Har, H69AR, hFOB 1.19, Mar Vin, SCC 4, Be Sal, Hs27, B-3, Lu Vin, Ma San, EI Don, SK.N-AS, NCI H1734 [H-1734; H1734], LNZTA3WT4 [LNZTAp53WT4; WT4] , LNZTA3WT11 [LNZTA3p53WTll; WT11], Lo Wen, NCI-H2227], COLO 829, HKB-11, Ce Ar, 90.74, HRT-18G, Be Ar, Em Ar, Win Mec, Ce Geg, TOV-21G, TOV-112D, OV-90, Já Bos, Fe Bos, La Bei, Bo Gin, HS-5, Le Ana, Mel Neg, La Bei II, HEP G2/2.21, ProPakA.6 [PPA.6; ProPak-A.6], LNCaP clone FGC [LNCaP.FGC], HCN-1A, HX [HT1080 xeno], HP [HT1080 poly], 2A, Ne Loc, Jay Sen, Bi Fin e Ray Hot. 31 ΡΕ1977241 Células infectadas por vírus que podem ser usadas como células alvo incluem, por exemplo, células infectadas com vírus de Epstein Barr, HIV, vírus da gripe, vírus da poliomielite, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus da varicela zoster, vírus da rubéola, vírus do sarampo, vírus herpes simples, vírus da Dengue, vírus do papiloma, vírus dos sincícios respiratórios ou vírus da raiva.

As células alvo usadas nos métodos aqui proporcionados podem também ser células saudáveis. ADCC pode estar envolvida na morte de células saudáveis em doentes com doenças auto-imunes, tais como perturbações auto-imunes da tiróide, miastenia grave, artrite reumatóide, lúpus sistémico eritematoso, anemia hemolítica imune (induzida por penicilina), hepatite auto-imune (AIH), oftalmopatia de Grave, HIV [depleção de CD4], enteropatia auto-imune, doença celíaca, miastenia grave (MG), doença de Behcet, oftalmopatia associada a tiróide, tiroidite auto-imune, miocardite virai, doença cardíaca auto-imune, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, doença de Chagas, vitiligo, doença de Crohn, púrpura trombocitopénica idio-pática, neutropenia auto-imune, epilepsia infantil, doença de Kawasaki, hepatite activa crónica auto-imune, diabetes melitus, esclerose múltipla, nefrite anti-glomerular da membrana basal (GBM), doença crónica activa do fígado (CALD), glomerulonefrite (derivada dos complexos imunes), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), infertilidade 32 ΡΕ1977241 masculina não explicada e rejeição de transplantes. A utilização das células saudáveis como células alvo nos métodos aqui descritos pode, assim, ser útil na pesquisa de como anticorpos e células efectoras matam células saudáveis por ADCC em doenças auto-imunes ou na rejeição de transplantes. Quando as células alvo são células saudáveis, elas podem ser, por exemplo, linhas celulares obtidas a partir de bancos de células ou células obtidas a partir do tecido de um indivíduo tendo uma doença auto-imune.

Nalquns casos, pode ser usada uma combinação de mais de um tipo de células alvo, por exemplo, para replicar mais estreitamente a situação in vivo em que o anticorpo pode atingir órgãos e tecidos compreendendo vários tipos de células. As células alvo podem assim incluir mais de uma linha celular ou pode incluir células de mais de um tecido. Nalgumas realizações, as células alvo incluem dois ou mais ou três ou mais tipos de células.

Os métodos aqui descritos podem ser usados para o rastreio de qualquer anticorpo relativamente à capacidade de induzir uma resposta ADCC. 0 presente pedido proporciona assim métodos para o rastreio de um anticorpo candidato relativamente à capacidade para induzir ADCC contra células alvo. Os métodos compreendem (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo num meio de ensaio; e (b) adição ao meio de ensaio de células efectoras e do anticorpo candidato (e.g., um anticorpo que se liga às 33 ΡΕ1977241 células alvo); em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato após adição das células efectoras e do anticorpo indica a capacidade do anticorpo candidato para efectuar ADCC contra as células alvo.

Como aqui usado, "um decréscimo na impedância" refere-se a qualquer redução na impedância entre os eléctrodos num substrato tendo células alvo semeadas. Um decréscimo na impedância pode ser, por exemplo, uma redução de aproximadamente 1% ou mais, cerca de 5% ou mais, cerca de 10% ou mais, cerca de 15% ou mais, cerca de 20% ou mais, cerca de 25% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais ou cerca de 100% na impedância comparativamente com uma impedância previamente determinada. O anticorpo ou anticorpo candidato usado nos métodos aqui proporcionados pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. Os anticorpos que podem ser usados nos métodos aqui descritos também incluem anticorpos que foram identificados como tendo potencial terapêutico (e.g., anticorpos que já foram usados em ensaios clínicos).

Como aqui usado, o termo "anticorpo" refere-se a moléculas intactas assim como aos seus fragmentos, tais como Fab, F(ab')2 e Fv, os quais são capazes de se ligarem 34 ΡΕ1977241 às células alvo. Por "ligação às células alvo" pretende-se significar que um anticorpo é imuno-específico para um antigénio das células alvo, e.g., um antigénio apical nas células alvo. 0 termo "imuno-específico" significa que o anticorpo possui substancialmente mais afinidade para o antigénio na célula alvo do que afinidade para outras proteínas (e.g., outras proteínas relacionadas).

Por "substancialmente mais afinidade" pretende-se significar que um anticorpo possui afinidade mensuravel-mente superior para um antigénio numa célula alvo, comparativamente com a afinidade para moléculas de reconhecimento da superfície celular contendo domínios de imunoglobulina conhecidos. Por exemplo, a afinidade pode ser pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 103 vezes, 104 vezes, 105 vezes ou 106 vezes superior para um antigénio numa célula alvo do que para moléculas de reconhecimento da superfície celular contendo domínios de imunoglobulina conhecidos.

Os métodos aqui proporcionados podem também ser usados como ensaios de administração ou de estabilidade relativamente a fins de controlo de qualidade (QC). Por exemplo, métodos como aqui descritos podem ser usados para testar lotes de produção de anticorpos, em que a presença de actividade ADCC ou o nível de actividade ADCC é usado para certificar o produto anticorpo como satisfazendo as 35 ΡΕ1977241 regras de controlo de qualidade (e.g., em GMP (Boas práticas de produção, "Good Manufacturing Practice) ou outros padrões). Nalguns casos, a mera presença de actividade ADCC pode ser usada como uma determinação qualitativa de que um anticorpo satisfaz as regras de controlo de qualidade e é adequado para administração. Tais métodos podem não requerer mais interpretação para além da determinação de que a impedância decresce na presença do anticorpo a ser testado. Nalgumas realizações, uma amostra do lote de um anticorpo ADCC para ser certificado pode ser delibera-damente degradado e usado como controlo negativo para comparação com o lote de anticorpo a ser administrado. A curva de leitura de ADCC em tempo real para as duas amostras pode ser comparada e pode ser estabelecido um limiar quantitativo ou qualitativo para a certificação do controlo de qualidade. A resposta dependente da concentração e os parâmetros do ensaio exactos podem ser determinados por tentativa e erro.

De forma semelhante, os métodos aqui descritos podem ser usados para certificar pequenas moléculas ou outros inibidores de actividade ADCC para QC e análise de estabilidade, através da monitorização do decréscimo em tempo real do sinal ADCC como resposta à sua adição às células alvo.

Exemplos de anticorpos disponiveis que podem actuar via ADCC incluem, sem limites, anticorpos para o tratamento de alergia e asma, como seja Daclizumab (Protein 36 ΡΕ1977241

Design Labs/Roche) e CAT-354 (Cambridge Antibody Technology) ; anticorpos para o tratamento de perturbações auto-imunes, tais como MDX-H210 (Medarex/Novartis), Campath* alemtuzumab (ILEX Oncology) e Daclizumab (Protein Design Labs/Roche); anticorpos para o tratamento de cancro, como sejam Campath® ILEX Oncology), R1550 (huHMFGl, Therex, Antisome/Roche), Herceptin® (Genentech), Omnitarg (Genen-tech), Tastuzumab-DMI1 (Genentech/Immunogen), MDX-010 (Medarex), Avastin® (Genentech), Mab-17-Ι (edrecolomab-IGN101, Igeneon, EDR ou Panorex-GSK), labetuzumab, (IMMU 105) (Immunomedics), Tarvacin (Peregrine), Theragyn, There-vex (Pemtumomab) (Antisoma/Roche), TheraCIM hR3 (YM Biosci-ences/Oncoscience), HuMax-EGFr(Genmab) , SGN-40 (Seattle Genetics), SGN-30 (Seattle Genetics), Rituxan® (Rituxan® Genentech/Biogenldec), HuMax-CD4 (Genmab), MDX-060 (Medarex) , Siplizumab (Medlmmune), AME-133 (Applied Molecular Evolution/Lilly), galiximab (Anti-CD80 Mab Biogenldec), HuMax-DC20 (HuMax cd20) (Genmab), LymphoCide® (epra-tuzumab, Immunomedics), péptido MDX-OlO+gplOO (Medarex), MDX010 +/- quimioterapia (Medarex), MDX-010 + péptidos de melanoma (Medaex), AHM (Roche/Chugai) , OvaRex (AltaRex/Uni-ther Pharmaceuticals), J59I (Biovation/Millennium), Renca-rex (WX-G250) (Wilex/Centocor/Johnson & Johnson), WX-G250+IL-2/IFN (Wilex), TRAIL-RlmAb (HGS-ETRl Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences), TRAIL-R2mAb (HGS-ETR2Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences), Vitaxin (MEDI-522 Medlmmune), WX-K931 (Wilex), MT201 (Micromet/Serano), MDX-214 (Medarex), Erbitux (cetuximab, IMC-C255 Imclone, Bristol-Myers Squibb), MEDI- 37 ΡΕ1977241 507 (Medimmune), TRU-015 (um derivado de anticorpo, Trubion), Matuzumab (EMD-72000, EMD Pharmaceuticals/Merck KGaA), Mab ICR62, CHIR-12.12 (Chiron/XOMA), huGl-M195 (NCI) MOR102 (MorphoSys), Remitogen (ID10, anti-MHC classe II, Protein Design Labs) e IGN312 (Igeneon); anticorpos para o tratamento de doenças cardiovasculares, tais como ABC-48 (AERES); anticorpos para o tratamento de doenças infec-ciosas, tais como MDX-010 (Medarex) ; anticorpos para o tratamento de doenças inflamatórias, tais como Humira™ (Cambridge Antibody Technology/Abbott) , Anti-CDlla Mab (Biovation), MLN02 (Millenium/Genentech/Roche) , Daclizumab (Protein Design Labs), Enbrel (fusão do receptor de TNF e IgGl (Amgen/Wyeth), Remicade (Centocor) e TRU-016 (um derivado de anticorpo, Trubion); anticorpos para o tratamento de doenças renais, como seja Humira™ (Cambridge Antibody Technology/Abott) e Rituxan® (Genentech/Biogenldec); e outros anticorpos tais como AMG162 (Amgen) para osteopo-rose, Erbitux-C255, BTI-322, Etanercept e Infliximab.

Quando os métodos aqui descritos são usados para investigar respostas de ADCC em doenças auto-imunes, os anticorpos podem ser, por exemplo, um anticorpo obtido de um indivíduo tendo uma doença auto-imune. Tais anticorpos podem ser obtidos usando, por exemplo, métodos conhecidos dos familiarizados com a matéria (e.g., purificação por afinidade).

Nalguns casos, pode ser desejável adicionar mais de um anticorpo ao meio de ensaio de forma a determinar, 38 ΡΕ1977241 por exemplo, se os anticorpos actuam sinergisticamente ou se interferem uns com os outros em termos da capacidade para induzir ADCC. Os métodos aqui proporcionados podem assim incluir a adição de dois, três, quatro, cinco ou mais de cinco anticorpos ao meio de ensaio.

As células efectoras usadas nos métodos aqui descritos tipicamente são células que expressam um ou mais receptores Fcy. Células efectoras adequadas incluem, mas não estão limitadas a células mononucleadas de sangue periférico (PBMCs), células assassinas naturais, células T citotóxicas e neutrófilos.

Existem várias famílias de receptores Fcy e diferentes células efectoras expressam diferentes receptores Fc. Por exemplo, os neutrófilos normalmente expressam FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e a isoforma de ancoragem a lípidos de FcyRIII (CD16), enquanto as células assassinas naturais (NK) expressam apenas a isoforma transmembranar de FcyRIII. Ainda, existem polimorfismos dentros dos receptores Fc. Por exemplo, FcyRIII nas células NK possui um polimorfismo Phe/Val na posição 158 que se mostrou influenciar a ligação de IgG. As células efectoras usadas nos métodos aqui descritos podem ser seleccionadas com base no receptor Fc que expressam e, nalgumas realizações, na forma polimórfica do receptor Fc que expressam. Os métodos aqui descritos podem assim ser usados para determinar se uma combinação particular de um anticorpo e de uma célula efectora que expressa um receptor Fcy conhecido (e.g., com 39 ΡΕ1977241 um polimorfismo particular) é capaz de matar uma célula alvo por ADCC. Tais estudos podem ser úteis na pesquisa em geral do mecanismo de ligação de IgG aos receptores Fc e podem permitir a identificação de resíduos em receptores Fc e na região Fc de IgG que sejam cruciais para a ligação. Por sua vez, tais estudos podem permitir o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos tendo sequências da região Fc que apresentam ligação óptima aos receptores Fc nas células efectoras, maximizando assim ADCC. Tais estudos podem também ser usados para determinar o genótipo óptimo das células efectoras relativamente a um anticorpo terapêutico existente para ser capaz de induzir uma resposta ADCC, de forma que um potencial doente possa ser testado relativamente à presença de receptores Fc com o genótipo óptimo.

Nalgumas realizações, as células efectoras usadas nos métodos aqui descritos são PBMCs. Os PBMCs são uma mistura de monócitos e linfócitos que podem ser isolados a partir de sangue total usando, por exemplo, protocolos experimentais convencionais descritos na área e nos Exemplos abaixo. A variedade de células encontradas nos PBMCs espera-se que resulte em confusão nas leituras de impedância devido à aderência não específica ao substrato. Surpreendentemente, no entanto, os inventores encontraram que uma alteração na impedância ou índice Celular após adição de um anticorpo e PBMCs é uma indicação precisa de ADCC das células alvo. Sangue total ou sangue que foi pelo menos parcialmente purificado de forma a ser enriquecido, ou parcialmente enriquecido, em células efectoras (e.g., PBMCs), também podem ser útil nos métodos aqui descritos. 40 ΡΕ1977241

Os métodos aqui descritos possuem uma larga variedade de aplicações clinicas. Como aqui discutido atrás, existem polimorfismmos dentro dos receptores Fc humanos que possuem um efeito na capacidade das células efectoras para se ligarem a um anticorpo, e assim podem afectar a capacidade das células efectoras para mediar ADCC. A capacidade das células efectoras num indivíduo para se ligarem a um anticorpo terapêutico pode ter um impacto importante na eficácia clínica do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo IgG anti-CD20 Rituxan® usado no tratamento de doenças malignas linfoproliferativas pode originar um melhor desfecho clínico em doentes homozigóticos para o genótipo FcyRIII158V do que em doentes homozigóticos para o genótipo FcyRlII158F, possivelmente devido ao facto de as células NK portadoras de FcyRIII158V se ligarem mais eficazmente à região Fc de Rituxan®. A capacidade para usar PBMCs de indivíduos (e.g., doentes) como células efectoras significa que os métodos aqui proporcionados podem ser usados para determinar se um anticorpo terapêutico particular é adequado para o tratamento de um doente particular tendo uma doença ou perturbação associada às células alvo. Assim, nalgumas realizações as células efectoras podem ser PBMCs obtidos a partir de um doente tendo uma doença associada às células alvo e o anticorpo pode ser um candidato a anticorpo terapêutico para tratar o doente. Este documento proporciona assim métodos de identificação de um indivíduo 41 ΡΕ1977241 com uma doença associada às células alvo que possa ser adequado ao tratamento com um anticorpo candidato. Os métodos podem compreender (a) monitorização da impedância entre os eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo associadas à doença; (b) adição de PBMCs isolados de um doente e do anticorpo candidato às células alvo; e (c) determinação se uma alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato ocorre após adição dos PBMCs e do anticorpo, em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos é indicativo de ADCC e assim da adequação do doente para ser tratado com o anticorpo.

Nalgumas realizações, as células alvo podem ser células associadas a doenças malignas linfoproliferativas B e o anticorpo candidato pode ser Rituxan®. De acordo com tais realizações, são aqui proporcionados métodos que podem ser usados para determinar se um doente tendo uma doença maligna linfoproliferativa B é adequado para tratamento com Rituxan®. 0 método pode, certamente, ser conduzido com PBMCs de um doente particular em combinação com qualquer um dos outros anticorpos e células alvo aqui descritas para identificar o anticorpo óptimo para tratamento do doente. Ainda, quando os PBMCs são identificados como capazes de induzir ADCC em combinação com um anticorpo particular, o genótipo dos PBMCs pode ser determinado e os PBMCs de outros indivíduos podem ser testados usando métodos de genotipagem convencionais para estabelecer se são adequados para o tratamento com aquele anticorpo. 42 ΡΕ1977241

Sempre que os PBMCs de um indivíduo forem usados como células efectoras, as células alvo podem também ser células do indivíduo (e.g., células de cancro obtidas de uma biopsia) de modo que o método é um método personalizado para determinar se um anticorpo particular em combinação com os PBMCs do indivíduo é capaz de matar células alvo no doente por ADCC. À medida que mais produtos de anticorpos ficam disponíveis, os métodos aqui descritos permitirão a selecção do melhor produto de anticorpo para optimizar os resultados clínicos num doente particular.

Os métodos aqui proporcionados também podem ser adaptados ao rastreio de compostos relativamente à capacidade para aumentar ou diminuir ADCC induzida por diferentes combinações de células efectoras e anticorpos. Assim, este documento proporciona métodos de rastreio de compostos relativamente à capacidade para modular ADCC. Os métodos podem compreender (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo num meio de ensaio; (b) adição do composto, células efectoras e de um anticorpo que se liga às células alvo no meio de ensaio; e (c) determinação se o composto modula ADCC através da comparação de qualquer alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo na presença do composto, com qualquer alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato após adição das células efectoras e do anticorpo na ausência do composto. 43 ΡΕ1977241

Como aqui discutido, um decréscimo na impedância, após adição das células efectoras e do anticorpo, é indicativo de ter ocorrido ADCC no meio de ensaio. Um decréscimo adicional na impedância observado na presença de um composto a ser testado pode ser uma indicação de que o composto aumenta ADCC. Pelo contrário, um aumento na impedância na presença do composto pode ser uma indicação de que o composto diminui ADCC. Nalgumas situações, pode ser desejável identificar compostos que aumentam ADCC. Por exemplo, os métodos podem ser usados para identificar compostos que aumentam a resposta ADCC induzida por um anticorpo terapêutico e PBMCs contra células de cancro. Noutras situações, pode ser desejável identificar compostos que diminuem ADCC. Por exemplo, podem ser usados métodos para identificar compostos que diminuem a resposta ADCC induzida por anticorpos e PBMCs de um doente com uma doença auto-imune contra células alvo saudáveis. 0 facto de um composto não actuar como modulador de ADCC pode também ser útil nalgumas situações, uma vez que mostra que o composto (o qual pode ele próprio ter um outro objectivo terapêutico) não interfere com a capacidade de uma combinação particular célula efectora-anticorpo para induzir ADCC.

Tais métodos podem empregar qualquer uma das células, células efectoras e anticorpos aqui descritos. Nalgumas realizações, a combinação de célula efectora-anticorpo empregue pode ser uma combinação que já foi identificada como sendo capaz de induzir uma resposta ADCC 44 ΡΕ1977241 contra as células alvo em questão. 0 composto a ser testado pode ser adicionado às células alvo simultaneamente com as células efectoras e o anticorpo. Como alternativa, o composto a ser testado pode ser adicionado às células alvo antes das células efectoras e do anticorpo ou após as células efectoras e o anticorpo.

Os compostos que podem ser testados relativamente à capacidade para modular ADCC nos métodos aqui descritos incluem, mas não estão restringidos a péptidos, peptóides, proteínas, lípidos, metais, moléculas orgânicas pequenas, aptâmeros de RNA, antibióticos e outros fármacos, poli-aminas e combinações ou derivados dos mesmos. As pequenas moléculas orgânicas tipicamente possuem um peso molecular entre cerca de 50 daltons e cerca de 2500 daltons (e.g., entre cerca de 300 e cerca de 800 daltons) . Os compostos candidatos podem derivar de grandes bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Por exemplo, bibliotecas de compostos sintéticos são comercializados por MayBridge Chemical Co. ((Revillet, Cornwall, UK) ou Aldrich (Milwau-kee, WI). Como alternativa, podem ser usadas bibliotecas de compostos naturais na forma de extractos de bactérias, fungos, plantas e animais. Ainda, compostos candidatos podem ser produzidos por síntese química usando química combinatória, quer como compostos individuais quer como misturas.

Nalgumas realizações, o composto a ser testado pode ser um composto que já é usado no tratamento de uma doença a que as células alvo estão associadas e o anticorpo 45 ΡΕ1977241 pode ser uma anticorpo desenvolvido para o tratamento daquela doença. Por exemplo, quando as células alvo são células de cancro, o composto a ser testado pode ser um agente quimioterapêutico e o anticorpo pode ser um anticorpo terapêutico desenvolvido para o tratamento de cancro. Métodos como os aqui proporcionados podem ser usados para determinar se o agente quimioterapêutico aumenta ou diminui a morte das células alvo pelo anticorpo por ADCC. De forma semelhante, o composto a ser testado pode ser um dos que modulam ADCC num doente com uma perturbação auto-imune. Em tais casos, o anticorpo a ser adicionado pode ser um anticorpo que causa actividade auto-imune via ADCC num indivíduo com uma doença auto-imune.

Nalgumas realizações, os métodos aqui descritos podem ser métodos para um grande número de amostras que simultaneamente avaliam a capacidade de múltiplas combinações de anticorpos, células efectoras e células alvo para produzir uma resposta ADCC, facultativamente na presença de compostos que podem modular a resposta ADCC. Em tais realizações, as células alvo podem ser semeadas num substrato não condutor contendo dois ou mais alvéolos, cada alvéolo compreendendo pelo menos dois eléctrodos e o método pode incluir monitorização de qualquer alteração na impedância entre os eléctrodos em cada alvéolo individual. 0 sistema RT-CES® e os programas informáticos associados aqui descritos são adequados para usar em ensaios para um grande número de amostras. 46 ΡΕ1977241

Nalgumas realizações as células alvo, anticorpos e células efectoras adicionadas a cada alvéolo podem ser os mesmos ou diferentes, dependendo do objectivo do ensaio, Nalgumas realizações, por exemplo, o método pode ser usado para testar simultaneamente a capacidade de múltiplos anticorpos terapêuticos candidatos para induzir ADCC contra uma variedade de células alvo na presença de PBMCs derivados de um doente ou PBMCs de vários doentes. Tais métodos para um elevado número de amostras também podem ser usados para testar simultaneamente a capacidade de um único anticorpo candidato para induzir ADCC contra a mesma célula alvo ou contra uma variedade de diferentes células alvo, na presença das mesmas células efectoras numa variedade de concentrações de anticorpos. Ainda, tais métodos para um elevado número de amostras podem ser usados para simultaneamente comparar a cinética de ADCC de uma variedade de anticorpos diferentes. Os ensaios para um elevado número de amostras podem também ser usados para testar compostos relativamente à capacidade para modular respostas ADCC, como discutido atrás.

Ainda, a utilização de um método como aqui descrito, como parte de um método para um elevado número de amostras, permite que sejam realizadas paralelamente experiências de controlo com o método para testar actividade ADCC aqui descrito. Por exemplo, um ensaio de controlo adequado pode incluir a sementeira e o crescimento de células alvo e a monitorização da impedância na ausência de células efectoras e de anticorpo. Outras experiências de 47 ΡΕ1977241 controlo podem compreender a adição de células efectoras sozinhas ou a adição de anticorpo sozinho às células alvo semeadas. 0 invento será ainda descrito no exemplo que se segue.

EXEMPLO 1. Introdução 0 sistema RT-CES® (Sensor electrónico para células em tempo real) da ACEA Biosciences (San Diego, CA) utiliza uma leitura electrónica da impedância para quantificar de forma não invasiva o status celular em tempo real. As células são semeadas em placas de microtitulação E-Plate (ACEA Biosciences), as quais são integradas com arranjos de sensores microelectrónicos. A interacção das células com a superfície do microeléctrodo gera uma resposta de impedância célula-eléctrodo, a qual indica o status das células em termos de morfologia, qualidade de adesão e número. 0 sistema ACEA foi usado para desenvolver um ensaio ADCC em tempo real para células aderentes. Foram usadas duas linhas celulares: SKBR3 (uma linha celular de adenocarcinoma mamário); e MG63 (uma linha células osteo-blástica). SKBR3 é uma linha celular aderente que expressa em excesso o antigénio HER-2. Herceptin®, um anticorpo humanizado contra HER-2, medeia a morte de células SKBR3 48 ΡΕ1977241 por ADCC na presença de células efectoras. MG63 é uma linha de células aderentes que expressa em excesso M-CSF. Chir-RX1, um anticorpo IgGl humanizado contra M-CSF, medeia ADCC contra as células MG63 na presença de células efectoras.

Realizaram-se experiências para determinar se o sistema ACEA poderá ser usado para monitorizar a morte em tempo real de células alvo SKBR3 e MG63 por ADCC, mediada por células efectoras PBMCs e Herceptin® ou RX-1. 2. Preparação de células alvo, anticorpos e PBMCs

As células SKBR3 (ATCC, Manassas, VA; catálogo #HTB-30) foram cultivadas em meio DME-15. 0 anticorpo humanizado Herceptin® (Genentech Corporation, South San Francisco, CA; marca registada Trastuzumab) foi reconstituído com água para preparar uma solução stock a 21 mg/ml antes de usar. Herceptin® é estável durante 30 dias após reconstituição. PBMCs humanos foram preparados de fresco a partir de sangue humano obtido a partir de dadores saudáveis. Amostras de sangue humano venoso (8,5 ml) foram colhidas em tubos de tampa amarela com citrato de amónio (ACD-A) . Os tubos foram invertidos 10-15 vezes e sangue total foi removido de cada tubo com tampa amarela e transferido para um tubo cónico de 50 ml. O sangue foi diluído a 1:3 com PBS em 2% de FBS. Doze ml de Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, 49 ΡΕ1977241

Piscataway, NJ; cat #17-1440-02) foram distribuídos lentamente por baixo da mistura de sangue/PBS. As amostras foram centrifugadas à temperatura ambiente a 2350 rpm durante 30 minutos antes da remoção da camada superior (plasma/PBS) por aspiração. As camadas de células brancas foram colhidas com pipetas estéreis e reunidas num tubo cónico de 50 ml. No caso de grumos visíveis de WBC permanecerem por baixo da camada de células brancas, todo o material WBC foi colhido, com cuidado para não remover excesso de Ficoll-Hypaque. Adicionou-se PBS-2% FBS estéril para prefazer o volume para 30 ml e a mistura foi misturada por inversão. As suspensões de PBMCs diluídas foram centri-fugadas a 250 xg (1064 rpm para o rotor Beckman GH3.8) à temperatura ambiente durante 17 minutos e o sedimento de células foi colhido. 0 sedimento de PBMCs foi suspenso em 2,5 ml de meio R-2 (meio RPMI-1640 com 2% de FBS inactivado pelo calor), bem misturado e transferido para um tubo cónico de 15 ml. Os PBMCs foram lavados uma vez com meio R-2 e o número de células viáveis foi avaliado POR exclusão com azul Tripano (Invitrogen cat.#15250-061 ou equivalente) . 3. Ensaio de morte por ADCC de células SKBR3 por Herceptin® e PBMCs

Antes de conduzir o ensaio de ADCC, várias experiências foram realizadas para avaliar o efeito das células SKBR3 sozinhas, com o anticorpo Herceptin® ou com células efectoras PBMCs, na leitura do índice Celular do sistema RT-CES®. 50 ΡΕ1977241

As células SKBR3 foram semeadas a 40K, 20K, 10K ou 5K por alvéolo e colocadas no leitor RT-CES®. Adicionou-se meio fresco após 20 horas e os índices Celulares foram monitorizados durante 100 horas. Como se mostra na Figura 1, o índice Celular aumentou à medida que as células SKBR3 proliferaram. O índice Celular teve um limite de detecção máximo de 60K a 160K células por alvéolo.

Em experiências subsequentes, células SKBR3 foram semeadas a 40K por alvéolo. Após 20 horas, adicionou-se meio fresco a um grupo de alvéolos e PBS contendo Triton X-100 foi adicionado a um segundo grupo de alvéolos e a placa voltou para o leitor. Como se mostra na Figura 2, uma queda no índice Celular após adição de Triton X-100, indicou morte celular. Noutras experiências, células SKBR3 foram semeadas a 20K por alvéolo e meio apenas, Herceptin® ou anticorpo controlo IgG foi adicionado 20 horas mais tarde. A adição de Herceptin® ou IgG apenas não alterou significativamente o índice Celular comparativamente com o índice Celular quando não se adicionou qualquer anticorpo (Figura 3) . O índice Celular de células SKBR3 semeadas a 20K por alvéolo foi então comparado com o índice Celular de PBMCs adicionados sozinhos ao meio numa quantidade final de 5 x 105 células por alvéolo. Surpreendentemente, os PBMCs não tiveram um efeito significativo no índice Celular (Figura 4), indicando que a utilização de PBMCs como 51 ΡΕ1977241 células efectoras num ensaio ADCC não interferirá com a detecção precisa da morte de células SKBR3. Quando os PBMCs foram adicionados aos alvéolos contendo células SKBR3 semeadas a 20K por alvéolo, o índice Celular caiu (Figura 5) , indicando que os PBMCs efectores sozinhos possuem um efeito de morte NK nas células alvo SKBR3.

Foi então conduzido um ensaio para detectar a morte por ADCC de células SKBR3 pelo anticorpo alvo Herceptin® na presença de PBMCs efectores. As células alvo foram semeadas a 20K por alvéolo 20 horas antes do inicio do ensaio ADCC. No inicio do ensaio ADCC, a placa foi removida temporariamente do Sistema ACEA para adição do anticorpo e de células efectoras.

As células efectoras PBMCs foram adicionadas às células alvo SKBR3 numa proporção de 25:1 de efectora:alvo, juntamente com o anticorpo Herceptin® numa concentração final de 5 μρ/ιηΐ. A placa de células voltou então para o Sistema ACEA para a monitorização continua do índice Celular durante as 48 horas seguintes. A Figura 6 mostra uma comparação do índice Celular de células SKBR3 sozinhas, células SKBR3 com PBMCs e células SKBR com o anticorpo Herceptin® e PBMCs. Uma queda dramática no índice Celular foi registada após adição de PBMCs e Herceptin®, reflectindo a morte das células SKBR3 por ADCC. A experiência foi repetida com células SKBR3 com PBMCs efectores numa proporção E:T de 50:1 ou 12,5:1, com 52 ΡΕ1977241 ou sem Herceptin® numa concentração de 5 μρ/πιΐ. A figura 7 mostra a cinética de morte por ADCC nestas experiências, conforme medido em termos de percentagem de lise celular, a qual foi calculada de acordo com a equação que se segue: ÍB-áice Selalar **ss t-rat-sjsesstc coss. ss~icorpo - ladiss % iiss = 100 x _Celular coes. •sga.tasi&ato cs-re astictir·;·*_ Σadies Celular sess. anticorpo

Os resultados na Figura 7 demonstram um aumento dramático na lise celular na presença de Herceptin® e de PBMCs como resultado de ADCC.

4. Comparação do ensaio de ADCC em tempo real com o ensaio de ADCC com libertação de Calceína AM

Foram realizadas experiências para comparar a % de lise detectada usando o ensaio de ADCC em tempo real com a % de lise detectada usando um ensaio de ADCC com libertação de Calceína AM. O ensaio de Calceína-AM foi conduzido usando o protocolo que se segue. Um frasco de Calceína AM (Molecular Probes, Eugene, OR; catálogo # C-3099) numa solução a 1 mg/ml em DMSO seco foi descongelado e misturado suavemente por pipetagem.

Para marcar as células SKBR3, o meio foi removido e a monocamada lavada com 10 ml de PBS apenas (sem soro 53 ΡΕ1977241 fetal bovino (FBS)). A monocamada foi descolada através da adição de 5 ml de EDTA/PBS e incubação até 10 minutos a 37°C. Adicionou-se dez ml de RIO fresco (meio RPMI-1640 com 10% de FBS inactivado pelo calor, Pen/Stre (100 μρ/ιηΐ final) e L-glutamina (2 mM final). As células foram colhidas, centrifugadas e contadas e 2,5 x 106 células foram transferidas para novos tubos de 15 ml. As células foram suspensas em 2,5 ml de R-10 num tubo cónico de 15 ml e 12,5 μΐ de Calceina AM (5 μΜ) foram adicionados a cada tubo. Os tubos foram incubados durante 30 minutos a 37°C em atmosfera húmida de 5%de CO2, assegurando que as tampas estavam ligeiramente desapertadas. As células foram suavemente misturadas cada 10 minutos para evitar a sua sedimentação. As células marcadas foram lavadas duas vezes com 10 ml de R-2 (meio RPMI-1640 com 2% de FBS inactivado pelo calor) . As células foram suspensas em meio R-10 para se atingir 5 x 105 células/ml.

As células alvo SKBR3 foram semeadas a 20K por alvéolo para o ensaio de ADCC. No estabelecimento do ensaio ADCC, as células efectoras PBMCs foram adicionadas às células alvo numa proporção de 25:1, juntamente com o anticorpo controlo IgG ou Herceptin® nas concentrações apresentadas na Figura 8. As misturas das células alvo, células efectoras e anticorpos foram deixadas a incubar a 37°C durante quatro horas. No final da incubação, as células foram sedimentadas e a libertação de Calceina AM foi medida no sobrenadante. 54 ΡΕ1977241 A média do fundo causado pelo meio controlo para cada alvo foi subtraída para cada linha celular alvo individual antes da análise e a percentagem do min relativamente ao max foi calculada usando a seguinte equação: & Max = ISDx ssàdia da cessss libartadc-s *s-ss®a£arsse3aaa£:as sséâ .h-srt-askís 0 ensaio foi considerado inválido se a percentagem de libertação mínima relativamente à libertação máxima foi superior a 37%. A percentagem de lise específica foi calculada a partir da média de pontos em triplicado usando a seguinte equação: % ..sa- LO SX s«dl«. CPSB.S gxpjagim^gtatiar-asádiat gnsss •««dia eassss ssáximDs li&ersadd-s-mêáiis cpss dsrssàss «spcsi-aís* A percentagem de lise detectada usando o ensaio de Calceína-AM está apresentada na Figura 8B. A Figura 8A mostra a percentagem de lise detectada num ensaio paralelo conduzido com o sistema RT-CES®. As células alvo SKBR3 foram semeadas 18-20 horas antes da adição de células efectoras PBMCs e do anticorpo IgG ou Herceptin® nas mesmas proporções e concentrações do ensaio de Calceína-AM. A percentagem de lise detectada usando o sistema RT-CES foi aproximadamente 2 vezes superior à percentagem de lise usando a marcação com Calceína-AM. Isto pode ser devido ao facto de o ensaio de Calceína-AM requerer que as células 55 ΡΕ1977241 estejam em suspensão, enquanto as células estão aderentes no ensaio RT-CES. 5. Ensaio de morte por ADCC de células MG63 pelo anticorpo monoclonal RX-1 e PBMCs

As células MG63 e SKBR3 foram semeadas a 20K células por alvéolo e os índices Celulares foram monitorizados durante 24 horas. 0 crescimento de células SKBR3 possui uma relação linear com o índice Celular, enquanto, de um modo geral, tal não se observa com o crescimento das células MG63 (Figura 9). Entre cerca de 7 horas e cerca de 17 horas, no entanto, o crescimento das células MG63 mostrou uma relação aproximadamente linear com o índice Celular, sugerindo que o ensaio ADCC deveria ser realizado dentro deste período de tempo para as células MG63.

Um ensaio ADCC foi conduzido com as células alvo MG63 semeadas a 20K por alvéolo. 0 índice Celular para as células MG63 sozinhas foi comparado com o índice Celular para as células MG63 às quais PBMCs, PBMCs e o anticorpo controlo IgG ou PBMC e o anticorpo RX1 foram adicionados após 18-20 horas. A proporção de células efectoras PBMCs relativamente às células alvo MG63 em cada experiência foi de 50:1 e o anticorpo foi adicionado numa concentração de 5 μρ/ιηΐ. Como se mostra na Figura 10A, o índice Celular caiu após a adição de PBMC e RX1 como resultado de ADCC das células MG63. As cinéticas da ADCC foram, no entanto, diferentes das cinéticas observadas quando a mesma experiência 56 ΡΕ1977241 foi repetida com células SKBR3 na presença de PBMCs, PBMCs e IgG ou PBMCs e Herceptin® (Figura 10B). Estes resultados demonstram a utilidade do ensaio ADCC em tempo real para fornecer informação detalhada da cinética de ADCC. 6. Conclusão

Os ensaios ADCC aqui descritos proporcionam melhorias relativamente aos actuais métodos para testar ADCC. Ao contrário dos métodos convencionais, os ensaios baseados em RT-CES® podem ser usados para seguir a morte por ADCC em tempo real e permitem que seja seguida deta-lhadamente a cinética de ADCC. Os ensaios são mais sensíveis do que outros ensaios ADCC actualmente disponíveis, são mais rápidos e possuem o potencial para serem optimi-zados para o rastreio de um elevado número de amostras. Ainda, os ensaios não envolvem marcação e não são radio-activos ou requerem níveis reduzidos de marcação, tornando-os mais seguros do que os ensaios que envolvem a marcação radioactiva, por exemplo. Uma vez que os ensaios podem ser conduzidos com células aderentes, sem descolamento da placa, permitem uma avaliação mais precisa de ADCC em células in vivo. Assim, os ensaios de ADCC aqui descritos melhorarão a capacidade para testar anticorpos terapêuticos candidatos relativamente à actividade de ADCC.

Ainda, os ensaios ADCC aqui proporcionados podem ser usados para identificar populações de doentes adequados para o tratamento com um anticorpo particular. Como 57 ΡΕ1977241 discutido atrás, os ensaios podem ser conduzidos usando PBMCs como células efectoras. Existem polimorfismos nos receptores Fc nas células efectoras PBMCs que podem afectar a capacidade das células efectoras para se ligarem ao anticorpo especifico alvo e, assim, para mediar ADCC. Os ensaios ADCC aqui proporcionados são ensaios rápidos e fáceis que podem ser usados para determinar se os PBMCs de um doente particular, em combinação com um anticorpo terapêutico, são capazes de mediar ADCC das células alvo.

Resumindo, os métodos do ensaio ADCC aqui proporcionados possuem o potencial de alterar a forma como ADCC é medido, tanto na indústria para o desenvolvimento de fármacos como na investigação básica para estudar a resposta imune mediada por anticorpos.

Lisboa, 9 de Setembro de 2010

Claims

ΡΕ1977241 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para testar citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) compreendendo: (a) monitorização da impedância entre os eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento das células alvo num meio de ensaio, em que as células alvo estão numa monocamada no substrato; e (b) adição ao meio do ensaio de células efectoras e de um anticorpo que se liga às células alvo; em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, é indicativo da função ADCC ter ocorrido no meio do ensaio e em que um aumento ou ausência de alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, é indicativo da função ADCC não ter ocorrido no meio de ensaio, em que, facultativamente, o anticorpo deriva de um doente com uma perturbação auto-imune. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo medição da impedância em intervalos regulares . 3. 0 método de acordo com a reivindicação 2, compreendendo o cálculo de um índice Celular (Cl) a partir de cada medição de impedância e determinação da ocorrência 2 ΡΕ1977241 de uma alteraçao no índice Celular, em que o índice Celular deriva de cada medição da impedância usando a fórmula C/'= max

) em que Rb(f) e Rcei(f) são as resistências dos eléctrodos dependentes de frequência sem células ou com células presentes, respectivamente, e N é o número dos pontos de frequência em que a impedância é medida. 4. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que as medições da impedância são feitas cada 15 minutos. 5. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o método ainda compreende a sementeira das células alvo e em que, facultativamente, as células alvo são semeadas 18 a 24 horas antes da adição do anticorpo e das células efectoras. 6. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que as células alvo são semeadas numa densidade entre 2K e 100K por alvéolo ou em que as células alvo são semeadas a uma densidade entre 15K e 25K por alvéolo ou em que as células alvo são semeadas a uma densidade de aproximadamente 20K por alvéolo. 3 ΡΕ1977241 7. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a proporção de células efectoras relativamente a células alvo (E:T) é 25:1 ou em que a E:T é superior a 10:1 ou em que a E:T é superior a 50:1 ou em que a E:T é superior a 100:1.
8. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o anticorpo é adicionado numa concentração entre 1 e 100 μg/ml, entre 1 e 50 μg/ml ou entre 2 e 8 μg/ml.
9. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, compreendendo a adição ao meio de ensaio de dois ou mais anticorpos que se ligam às células alvo ou a adição ao meio de ensaio de três ou mais anticorpos que se ligam às células alvo ou adição ao meio de ensaio de quatro ou mais anticorpos que se ligam às células alvo. 10 . 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em que as células alvo expressam antigénios apicais, facultativamente compreendendo um passo preliminar de rastreio de células alvo relativamente à expressão de antigénios apicais. 11. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que as células alvo sao células 4 ΡΕ1977241 de cancro, facultativamente as células de cancro são células SKBR3 ou células MG63. 12. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e que as células efectoras compreendem células mononucleadas de sangue periférico (PBMCs), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas ou neutrófilos. 13. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o passo (b) compreende a adição às células alvo de sangue total que foi parcialmente enriquecido em células efectoras ou compreende a adição de sangue total às células efectoras e em que o sangue total compreende as células efectoras.
14. Um método de rastreio de um anticorpo candidato relativamente à capacidade para induzir ADCC de células alvo, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo no meio de ensaio; e (b) adição das células efectoras e do anticorpo candidato que se liga às células alvo no meio do ensaio; em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, é indicativo da capacidade do anticorpo candidato para efectuar a função ADCC contra as células alvo e em que um aumento ou ausência de alteração na 5 ΡΕ1977241 impedância entre os eléctrodos no substrato após adição das células efectoras e do anticorpo é indicativo da incapacidade do anticorpo candidato para efectuar a função ADCC contra as células alvo.
15. Um método de identificação de um doente que possui uma doença associada às células alvo, o qual é passível de tratamento com um anticorpo candidato capaz de modular ADCC, em que as células alvo são 1) células saudáveis associadas a doença auto-imune, 2) células infectadas por vírus ou 3) células cancerosas, o método compreendendo: (a) monitorização da impedância entre os eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo associadas à doença; (b) adição de PBMCs isolados do doente e do anticorpo candidato às células alvo; e (c) determinação se uma alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato ocorre após a adição dos PBMCs e do anticorpo, em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos é indicativo da adequação do doente ao tratamento com o anticorpo e em que um aumento ou ausência de alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato após adição dos PBMCs e do anticorpo é indicativo da não adequação do doente para o tratamento com o anticorpo.
16. Um método de rastreio de um composto candidato relativamente à capacidade para modular ADCC, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num 6 ΡΕ1977241 substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo no meio de ensaio; (b) adição ao meio de ensaio de células efectoras e de um anticorpo, na presença e ausência do composto candidato, em que o anticorpo se liga às células alvo; e (c) comparação de qualquer alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo na presença do composto candidato, com qualquer alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo na ausência do composto candidato, em que uma alteração na impedância na presença do composto candidato que seja superior a qualquer alteração na impedância na ausência do composto candidato é indicativo de que o composto candidato possui a capacidade de modular ADCC, em que facultativamente, o composto candidato a ser testado modula ADCC relacionada com auto-imunidade.
17. Um método de acordo com qualquer reivindicação anterior que é um ensaio para um elevado número de amostras, e em que o substrato não condutor compreende dois ou mais alvéolos de microtitulação, cada alvéolo compreende pelo menos dois eléctrodos e monitorização da impedância entre os eléctrodos em cada alvéolo.
18. Um ensaio de controlo da qualidade para um anticorpo, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre os eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células 7 ΡΕ1977241 alvo num meio de ensaio; e (b) adição de células efectoras e do anticorpo ao meio de ensaio, em que o anticorpo se liga às células alvo; em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato após adição das células efectoras e do anticorpo é indicativo de que o anticorpo é adequado para ser ser usado na indução de ADCC e em que um aumento ou ausência de alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após adição das células efectoras e do anticorpo, é indicativo de que o anticorpo não é adequado para ser usado na indução de ADCC.
19. Um ensaio de controlo de qualidade para um anticorpo, compreendendo: a) monitorização da impedância entre os eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo num meio de ensaio; (b) adição de células efectoras e do anticorpo ao meio de ensaio, em que o anticorpo se liga às células alvo; e (c) comparação de qualquer alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato, após a adição das células efectoras e do anticorpo, com qualquer alteração na impedância relativamente a uma amostra controlo, após a adição das células efectoras e de um anticorpo controlo; em que um decréscimo na impedância, após adição das células efectoras e do anticorpo, que seja superior a qualquer decréscimo na impedância da amostra controlo, após adição das células efectoras e do anticorpo controlo, é indicativo de que o anticorpo não é adequado para ser usado na indução ΡΕ1977241 de ADCC e em que a ausência de um decréscimo na impedância, após adição das células efectoras e do anticorpo, que seja superior a qualquer decréscimo na impedância relativamente à amostra controlo, após adição das células efectoras e do anticorpo controlo, é indicativo de que o anticorpo é adequado para ser usado na indução de ADCC.
20. Um método de rastreio de um composto candidato para usar como fármaco contra uma doença auto-imune, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo num meio de ensaio, em que as células alvo são células saudáveis; (b) adição ao meio de ensaio de células efectoras e de um anticorpo, com e sem o composto candidato, em que o anticorpo se liga às células alvo e em que as células efectoras são PBMCs de um indivíduo diagnosticado com a doença auto-imune ; e (c) comparação de qualquer alteração na impedância na presença de um composto candidato com qualquer alteração na impedância na ausência do composto candidato, em que um decréscimo na impedância na ausência do composto candidato que seja superior a qualquer decréscimo na impedância na presença do composto candidato é indicativo de que o composto candidato é adequado como agente terapêutico contra a doença auto-imune e em que a ausência de um decréscimo na impedância na ausência do composto candidato que seja superior a qualquer decréscimo na impedância na presença do 9 ΡΕ1977241 composto candidato é indicativo de que o composto candidato não é adequado como fármaco contra a doença auto-imune.
21. Um método para determinar se um anticorpo candidato é adequado para o tratamento de um indivíduo tendo uma doença auto-imune, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre os eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de células alvo associadas à doença auto-imune; e (b) adição do anticorpo candidato e dos PBMCs isolados do indivíduo às células alvo; e (c) determinação se uma alteração na impedância entre os eléctrodos no substrato após adição dos PBMCs e do anticorpo candidato, em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos é indicativo de que o anticorpo é adequado para o tratamento do indivíduo e em que a ausência de um decréscimo na impedância entre os eléctrodos é indicativo de que o anticorpo não é adequado para o tratamento do indivíduo.
22. Um método para determinar uma concentração óptima de um anticorpo para a indução de uma resposta ADCC, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento de duas ou mais amostras das células alvo num meio de ensaio; e (b) adição de células efectoras e de um anticorpo a duas ou mais amostras das células alvo, em que o anticorpo se liga às células alvo e em que o anticorpo é adicionado em 10 ΡΕ1977241 diferentes concentrações a duas ou mais amostras das células alvo; em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato após adição das células efectoras e do anticorpo é indicativo da função ADCC ter ocorrido no ensaio e em que a concentração do anticorpo que resulta no maior decréscimo na impedância é determinado como sendo a concentração óptima.
23. Um método para determinar se um anticorpo se liga a um antigénio apical numa célula alvo, compreendendo: (a) monitorização da impedância entre os eléctrodos num substrato não condutor que suporta o crescimento das células alvo num meio de ensaio; e (b) adição de células efectoras e do anticorpo às células alvo; em que um decréscimo na impedância entre os eléctrodos no substrato após adição das células efectoras e do anticorpo é indicativo de que o anticorpo se liga a um antigénio apical nas células alvo. Lisboa, 9 de Setembro de 2010