PT1944026E

PT1944026E - Utilização de agentes que se liguem a um receptor edg no cancro

Info

Publication number: PT1944026E
Application number: PT81524894T
Authority: PT
Inventors: Jeanette Marjorie Wood; Thomas Baumruker; Volker Brinkmann; Diana Mechtcheriakova; Kenneth Richard La Montagne; Peter T Lassota
Original assignee: Novartis Ag; Novartis Pharma Gmbh
Priority date: 2002-05-16
Filing date: 2003-05-15
Publication date: 2013-09-18
Also published as: TWI341197B; KR20110094154A; KR20120025018A; KR101299873B1; KR20100133027A; TWI340036B; KR20130088904A; DK1944026T3; TW200307533A; PL396723A1; KR20050003460A; TW200906381A; ES2428697T3; SI1944026T1

Description

ΡΕ1944026 1

DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE AGENTES QUE SE LIGUEM A UM RECEPTOR EDG NO CANCRO" A invenção presente diz respeito à utilização de um agonista de um receptor esfingosina-l-fosfato (S1P), em especial no tratamento do cancro.

Os agonistas dos receptores S1P são agentes que aceleram a deslocação dos linfócitos para os seus alvos (LH) que originam uma linfopenia resultante de uma redistribuição, preferivelmente reversível, dos linfócitos, da circulação para tecido linfático secundário, sem evocarem uma imunossupressão generalizada. Sequestram-se células néscias; estimulam-se células T CD4 e CD8 e células B do sangue a migrarem para os nodos linfáticos (LN) e para os pachos de Peyer (PP), e deste modo por exemplo inibe-se a infiltração das células para órgãos transplantados.

Os agonistas de receptores S1P são tipicamente análogos de esfingosina, tais como derivados de 2-aminopropano-1,3-diol substituído em 2 ou de 2-amino-propanol, por exemplo um compostos incluindo um grupo com a

fórmula X ΡΕ1944026 2 na qual Z seja H; alquilo Ci-β; alcenilo C2_6; alcinilo C2_ 6; fenilo; fenilo substituído com OH; alquilo Ci-s substituído com 1 a 3 substituintes seleccionados de entre o conjunto constituído por halogéneo, cicloalquilo C3-8, fenilo e fenilo substituído com OH; ou CH2-R4z em que R4z seja OH, aciloxilo ou um resíduo com a fórmula (a)

-ZHL 1 Ui O

>OR «t la) na qual

Zi seja uma ligação directa ou O, preferivelmente 0; R5z e R6z, independentemente, sejam H, ou alquilo Ci-4 substituído opcionalmente com 1, 2 ou 3 átomos de halogéneo;

Riz seja OH, aciloxilo ou um resíduo com a fórmula (a); e R2z e R3Z, independentemente, sejam H, alquilo Ci-4 ou acilo. 0 grupo com a fórmula X é um grupo funcional ligado a título de grupo terminal a uma espécie que pode ser hidrofílica ou lipofílica e incluir um ou mais resíduos alifáticos, alicíclico, aromáticos e/ou heterocíclicos, desde que a molécula resultante na qual um pelo menos de entre Z e Riz seja ou inclua um resíduo com a fórmula (a), sinalize como agonista para um ou mais receptores esfingosina-1-fosfato. 3 ΡΕ1944026

Os agonistas dos receptores S1P são compostos que sinalizam para um ou mais receptores esfingosina-l-fosfato, por exemplo S1P1 a S1P8. A ligação de um agonista a um receptor S1P pode por exemplo originar a dissociação de proteinas G intracelulares heterotriméricas em Ga-GTP e 6βγ-6ΤΡ, e/ou um aumento da fosforilação do receptor ocupado pelo agonista e uma activação dos caminhos/quinases de sinalização a jusante. A afinidade da ligação dos agonistas de receptor S1P pode ser medida tal como se descreve no parágrafo I, adiante. São exemplos de agonistas de receptor S1P apropriados, por exemplo os seguintes (apenas cos compostos com a fórmula IX fazendo parte da invenção):

• Compostos tais como os descritos no EP 627.406 Al, por exemplo um composto com a fórmula I w DH-pRj 4 Ϊ • na qual Ri seja uma cadeia carbonada linear ou ramificada (C12-22) • cadeia na qual possa existir uma ligação ou um heteroátomo seleccionados de entre uma ligação dupla, uma ligação tripla, O, S, NR6, em que R6 seja H, alquilo, aralquilo, acilo ou alcoxicarbonilo, e carbonilo, e/ou 4 ΡΕ1944026 • que possa ter a título de substituinte alcoxilo, alcenilloxilo, alciniloxilo, aralquiloxilo, aci-lo, alquilamino, alquiltio, acilamino, alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilamino, aciloxilo, alquilcarbamoílo, nitro, halogéneo, amino, hidroxi-imino, hidroxilo ou carboxilo; ou • Ri seja • um fenilaquilo no qual o alquilo seja uma cadeia carbonada linear ou ramificada em C6-20; ou • um fenilaquilo no qual o alquilo seja uma cadeia carbonada linear ou ramificada em Ci_30, em que o referido fenilalquilo seja substituído com • uma cadeia carbonada linear ou ramificada em C6-2o, substituída opcionalmente com halogéneo, • uma cadeia alcoxilo linear ou ramificada em Ce-20, substituída opcionalmente com halogéneo, uma cadeia alceniloxilo linear ou ramificada em Ce-20r • fenilalcoxilo, halofenilalcoxilo, fenilalco-xialquilo, fenoxialcoxilo ou fenoxialquilo, cicloalquilalquilo substituído com alquilo C6-20 r ΡΕ1944026 5 heteroarilalquilo substituído com alquilo C6-20 r • alquilo C6-2o heterocíclico ou • alquilo heterocíclico substituído com alquilo C2-20, e na qual a espécie alquilo possa ter • na cadeia carbonada, uma ligação ou um heteroátomo seleccionados de entre uma ligação dupla, uma ligação tripla, 0, S, sulfinilo, sulfonilo, ou NR6, em que Re seja tal como se definiu acima, e • a título de substituinte, alcoxilo, alce-niloxilo, alciniloxilo, aralquiloxilo, acilo, alquilamino, alquiltio, acilamino, alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilamino, aciloxilo, alquilcarbamoílo, nitro, halogéneo, amino, hi-droxilo ou carboxilo, e R2, R3, R4 e R5, sejam independentemente, H, alquilo C1-4 ou acilo ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico; 6 ΡΕ1944026 1.002.792 Al,

Compostos tais como os descritos no por exemplo um composto com a fórmula II

EP

c

53 na qual m seja 1 a 9 e R'2, R'3, R'4 e R'5, sejam independentemente H, alquilo ou acilo, ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico;

• Compostos tais como os descritos no EP 0 778.263 Al, por exemplo um composto com a fórmula III 53 5 na qual W seja H; alquilo Ci-6, alcenilo C2-6 ou alcinilo C2-6; não substituído ou substituído com fenilo substituído com OH; R"40(CH2)n; ou alquilo C1-6 substituído com 1 a 3 substituintes seleccionados de entre o conjunto constituído por halogéneo, cicloalquilo C3-8, fenilo e fenilo substituído com OH; X seja H ou alquilo com cadeia linear, não 7 ΡΕ1944026 substituído ou substituído, contendo um número de átomos de carbono p ou alcoxilo linear, não substituído ou substituído, contendo um número de átomos de carbono p-1, por exemplo substituído com 1 a 3 substituintes seleccionados de entre o conjunto constituído por alquilo Ci_6, OH, alcoxilo Ci_6, aciloxilo, amino, alquilamino Ci_6, acilamino, oxo, haloalquilo Ci-6, halogéneo, fenilo não substituído e fenilo substituído com 1 a 3 substituintes seleccionados de entre o conjunto constituído por alquilo Ci_, OH, alcoxilo Ci_6, acilo, aciloxilo, amino, alquilamino Ci_6, acilamino, haloalquilo Ci_6 e halogéneo; Y seja H, alquilo Ci-6, OH, alcoxilo Ci-6, acilo, aciloxilo, amino, alquilamino Ci-6, acilamino, haloalquilo Ci-6 ou halogéneo, Z2 seja uma ligação simples ou um alquileno com cadeia linear com um número de átomos de carbono de q, p e q, independentemente, sejam inteiros de 1 a 20, com a limitação de que 6^p+q^23, m' seja 1, 2 ou 3, n seja 2 ou 3, R"i, R"2, R"3 e R"4, independentemente, sejam H, alquilo C1-4 ou acilo, ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, • Compostos tais como os descritos no WO 02/18.395, por exemplo um composto com a fórmula IVa ou a IVb ΡΕ1944026 «·>Λ* if» {?;λ |™α <?κ5 κ* Φ*ί

ÍVfc nas quais Xa seja O, S, NRis ou um grupo -(CH2)na-, grupo este que seja não substituído, ou seja substituído com 1 a 4 halogéneos; na seja 1 ou 2, Ris seja H ou alquilo (Ci_4) , alquilo este que seja não substituído ou seja substituído com halogéneo; Ria seja H, OH, alquilo (Ci_4) ou 0-alquilo (Ci_4) , em que o alquilo seja não substituído ou seja substituído com 1 a 3 halogéneos; Rib seja H, OH o alquilo (Ci_4) , em que o alquilo seja não substituído ou seja substituído com halogéneo; os R2a sejam independentemente seleccionados de entre H ou alquilo (Ci_ 4) , alquilo este que seja não substituído ou seja substituído com halogéneo; R3a seja H, OH, halogéneo ou 0-alquilo (Ci-4) , em que o alquilo seja não substituído ou seja substituído com halogéneo; e R3b seja H, OH, halogéneo, alquilo (Ci_4) , em que o alquilo seja não substituído ou seja substituído com hidroxilo, ou O-alquilo (Ci-4), em que o alquilo seja não substituído ou seja substituído com halogéneo; Ya seja -0Η2-, -C(O)-, -CH(OH)-, -C (=NOH) -, 0 ou S, e R4a seja alquilo (C4_i4) ou alcenilo (C4-i4) ; ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico; ΡΕ1944026 9 02/076.995,

Compostos tais como os por exemplo um composto com a

descritos fórmula V

no WO

x;

V na qual mc seja 1, 2 ou 3;

Xc seja O ou uma ligação directa;

Rlc seja H; alquilo Ci_6 substituído opcionalmente com OH, acilo, halogéneo, cicloalquilo C3-10A fenilo ou hidroxifenileno; alcenilo C2-6; alcinilo C2-6; ou fenilo substituído opcionalmente com OH; R2c seja

na qual R5c seja H ou alquilo Ci_4 substituído opcionalmente com 1, 2 ou 3 átomos de halogéneo, e R6c seja H ou alquilo C1-4 substituído opcionalmente com halogéneo; R3c e R4c sejam independentemente H, alquilo Ci_4 substituído opcionalmente com halogéneo, ou acilo, e ΡΕ1944026 10

Rc seja alquilo Ci3_2o que possa opcionalmente conter na cadeia um átomo de oxigénio e que possa ser substituido opcionalmente por nitro, halogéneo, amino, hidroxilo, ou carboxilo; ou um residuo com a fórmula (a)

na qual R7c seja H, alquilo Ci-4alkyl ou alcoxilo

Ci-4, e R.8c seja alcanoilo C1-20 substituído, fenilalquilo Ci-14 em que o alquilo C1-14 seja substituído opcionalmente com halogéneo ou OH, cicloalquil-alcoxilo C1-14 ou fenil-alcoxilo Ci-14, em que o anel cicloalquilo ou fenilo seja opcionalmente substituido com halogéneo, alquilo C1-4 e/ou alcoxilo C1-4, fenil-alcoxil Ci-i4-alquilo C1-14, fenoxi-alcoxilo C1-14 ou fenoxi-alquilo C1-14,

Rc sendo também um residuo com a fórmula (a) em que Rsc seja alcoxilo Ci_i4 quando Ric for alquilo Ci_4, alcenilo C2-6 ou alcinilo C2_6,

ou um composto com a fórmula VI

na qual 11 ΡΕ1944026 nx seja 2, 3 ou 4

Rix seja H; alquilo Ci-6 substituído opcionalmente com OH, acilo, halogéneo, cicloalquilo, fenilo ou hidroxi-fenileno; alcenilo C2-6; alcinilo C2-6; ou fenilo substituído opcionalmente com OH; R2x seja H, alquilo C1-4 ou acilo R3x e R4X sejam independentemente H, alquilo C1-4 substituído opcionalmente com halogéneo ou acilo, R5x seja H, alquilo C1-4 ou alcoxilo C1-4/ e R6x seja alcanoílo C1-2 substituído com cicloalquilo; ciloalquil-alcoxilo C1-14 em que o anel cicloalquilo seja substituído opcionalmente com halogéneo, alquilo C1-4 e/ou alcoxilo Ci-4; fenil-alcoxilo C1-14 em que o anel fenilo seja substituído opcionalmente com halogéneo, alquilo C1-4 e/ou alcoxilo Ci- •4/ R6x sendo também alcoxilo C4-14 quando Rix for alquilo C2-4 substituído com OH, ou pentiloxilo ou hexil- oxilo quando Rix for alquilo C1-4, desde que Rôx não seja fenil-butilenoxilo quando quer R5x seja H, quer Rix seja metilo, ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico; 12 ΡΕ1944026

• Compostos tais como os descritos no WO 02/06.268 Al, por exemplo um composto com a fórmula VII '.a, *%!« •Ύ;

“PHA em que Rid e R2d sejam independentemente H ou um grupo protector de amino; R3d seja hidrogénio ou um grupo protector de hidroxilo; R4d seja alquilo inferior; nd seja um inteiro de 1 a 6;

Xd seja etileno, vinileno, etinileno, um grupo com a fórmula - D-CH2- (em que D seja carbonilo, - CH(OH)-, O, S ou N) , arilo ou arilo substituído com até três substituintes seleccionados de entre o conjunto a tal como se define adiante neste documento;

Yd seja uma ligação simples, alquileno Ci_io, alquileno Ci-io que seja substituído com até três substituintes seleccionados de entre os conjuntos a e b, alquileno Ci_io contendo um átomo de 0 ou de S a meio ou no final da cadeia carbonada, ou alquileno Ci_i0 contendo O ou 13 ΡΕ1944026 S a meio ou no final da cadeia carbonada que seja substituído com até três substituintes seleccionados de entre os conjuntos a e b; R5d seja hidrogénio, cicloalquilo, arilo, hete-rociclo, cicloalquilo substituído com até três substituintes seleccionados de entre os conjuntos a e b, arilo substituído com até três substituintes seleccionados de entre os conjuntos a e b, ou heterociclo substituído com até três substituintes seleccionados de entre os conjuntos a e b; e R6ci e R7d, independentemente, sejam H ou um substituinte seleccionado de entre o conjunto a;

Cconjunto a> seja halogéneo, alquilo inferior, halogenoalquilo inferior, alcoxilo inferior, alquiltio inferior, carboxilo, alcoxicarbonilo inferior, hidroxilo, acilo alifático inferior, amino, mono-alquilamino inferior, di-alquilamino inferior, acilamino alifático inferior, ciano ou nitro;

Cconjunto b> seja cicloalquilo, arilo, heterociclo, qualquer um dos quais substituído opcionalmente com até três substituintes seleccionados de entre o conjunto a; com a limitação de que quando Rsd for hidrogénio, Yd seja quer uma ligação simples, quer alquileno linear Ci- 14 ΡΕ1944026 ίο, ou um sal ou um éster farmacologicamente aceitável destes. • Compostos tais como os descritos na JP-14.316.985 (JP 2002/316.985), por exemplo um composto com a fórmula VIII:

na qual Rie, R2e, P-3e, P-4e, P-5e, P-6e, P-7e, , Xe ^ Xe seja tal como descritos na JP-14.316.985; ou um seu sal ou éster farmacologicamente aceitável. • Compostos tais como os descritos no WO 03/29.184 e no WO 03/29.205, por exemplo compostos com a fórmula IX, que fazem parte da invenção presente:

na qual Xf seja O ou S, e Rif, R2f, R3f e nf sejam tal como descritos no WO 03/29.184 e no WO 03/29.205, por exemplo 2-amino-2-[4-(3-benziloxifenoxi)-2-clorofenil]pro-pil-1,3-propano-diol ou 2-amino-2-[4-(benziloxifeniltio)-2-clorofenil]propil-1,3-propano-diol.

Acilo pode ser um resíduo Ry-CO- no qual Ry seja 15 ΡΕ1944026 alquilo Ci-β, cicloalquilo C3-6, fenilo ou fenil-alquilo Ci_4. A não ser aonde se afirmar algo em contrário, alquilo, alcoxilo, alcenilo e alcinilo podem ser com cadeia linear ou ramificada.

Quando nos compostos com a fórmula I a cadeia carbonada tal como Ri for substituída, ela pode ser substituída com halogéneo, nitro, amino, hidroxilo ou carboxilo. Quando a cadeia carbonada for interrompida por um fenileno opcionalmente substituído, a cadeia carbonada pode ser não substituída. Quando a espécie fenileno for substituída, ela pode ser substituída com halogéneo, nitro, amino, metoxilo, hidroxilo ou carboxilo.

Os compostos com a fórmula I são aqueles nos quais Ri é alquilo C13-20, substituído opcionalmente com nitro, halogéneo, amino, hidroxilo ou carboxilo, e, mais preferivelmente aqueles em que Ri seja fenilalquilo substituído com uma cadeia alquilo C6-i4 substituída opcionalmente com halogéneo e a espécie alquilo seja alquilo Ci_6 substituída opcionalmente com hidroxilo. Ri pode ser fenilalquilo C1-6 substituído no fenilo com uma cadeia de alquilo linear ou ramificada, preferivelmente linear, em C6-1. A cadeia do alquilo C6-14 pode estar nas posições orto, meta ou para, preferivelmente em para. R2 a R5 podem todos eles ser H.

Um composto com a fórmula I é o 2-amino-2- 16 ΡΕ1944026 tetradecil-1,3-propanodiol. Um agonista do receptor S1P com a fórmula I é o FTY720, isto β o 2 — amino—2— [2 — (4 — octilfenil)etil]propano-1,3-diol sob forma livre ou sob a forma de um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico (doravante referido neste documento como Composto A), por exemplo o cloridrato, como se representa:

HO

-HCS:

Um composto com a fórmula II é aquele no qual R'2 a R15 são H e m é 4, isto é, o 2-amino-2-{2-[4-(l-oxo-5-fenilpentil)fenil]etil}propano-l,3-diol, sob forma livre ou sob a forma de um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico (referido doravante neste documento como Composto B), por exemplo o cloridrato.

Um composto com a fórmula III é aquele em que W é CH3, R"i a R"3 são H, Z2 é etileno, X é heptiloxilo e Y é H, isto é, o 2-amino-4-(4-heptiloxifenilo)-2-metil-butanol, sob forma livre ou sob a forma de um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico (referido doravante neste documento como Composto C) , por exemplo o cloridrato. Prefere-se em especial o enantiómero R.

Um composto com a fórmula IVa é o fosfato de FTY720 (R2a é H, R3a é OH, Xa é 0, Rla e Rib são OH) . Um composto com a fórmula IVb é o fosfato de Composto C (R2a é H, R3b é OH, Xa é 0, Ria e Rib são OH, Ya é 0 e R4a é hepti-lo). Um composto com a fórmula V é o fosfato de Composto B. 17 ΡΕ1944026

Um composto com a fórmula V é o éster mono- [ (R) -2-amino-2-metil-4-(4-pentilo-fenil)-butílico] do ácido fosfórico .

Um composto com a fórmula VIII é o (2R)-2-amino-4-[3-(4-ciclo-hexiloxibutil)benzo[b]tien-6-il]-2-metilbutan-l-ol.

Quando os compostos com a fórmula IX têm um ou mais centros assimétricos na molécula, deve entender-se que a invenção presente inclui todos os diversos isómeros ópti-cos, bem como os racematos, diastereómeros e as misturas destes compostos. Os compostos descritos com a fórmula III ou IVb, quando o átomo de carbono portador do grupo amino for assimétrico, podem apresentar a configuração R neste átomo de carbono.

Incluem-se nos exemplos dos sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico dos compostos com as fórmulas I a IX, sais com ácidos inorgânicos, tais como o cloridrato, o bromidrato e o sulfato, sais com ácidos orgânicos, tais como o acetato, o fumarato, o maleato, o benzoato, o citrato, o malato, o metanossulfonato e o benzenossul-fonato, ou, quando apropriado, os sais metálicos, tais como os de sódio, potássio, cálcio e aluminio, os sais com aminas, tais como a trietilamina e os sais como aminoácidos dibásicos, tais como a lisina. Os compostos e os sais dos métodos da invenção presente incluem as suas formas de hidrato e de solvato. 18 ΡΕ1944026

Os agonistas do receptor S1P possuem, com base na sua actividade observada, por exemplo a deslocação de linfócitos para o seu destino, por exemplo tal como se descreve na EP 627.406 AI ou na USP 6.004.565, utilidade por exemplo a titulo de imunossupressores, por exemplo no tratamento da rejeição aguda de alotransplantes. Verificou-se agora que os agonistas dos receptores S1P apresentam propriedades interessantes que os tornam úteis para a quimioterapia do cancro, em especial de tumores sólidos, em particular de tumores sólidos avançados. Existe ainda uma necessidade de expandir o armeiro de tratamentos do cancro para tumores sólidos, em particular nos casos em que o tratamento com compostos anti cancro não seja associado a uma regressão ou a uma estabilização da doença.

Na invenção presente, proporciona-se:

Uma utilização na inibição e no controlo da angiogénese desregulada, por exemplo da angio-génese mediada por esfingosina-l-fosfato (S1P), num sujeito que dela necessite, que inclua administrar-se ao referido sujeito uma quantidade activa do ponto de vista terapêutico de um agonista de receptor de S1P que inclua um grupo com a fórmula IX, ou um seu sal aceitável do ponto de vista terapêutico, e

Uma utilização para se evitem ou se tratarem doenças mediadas por um processo de neo-angio- 19 ΡΕ1944026 génese ou associados a uma angiogénese desregulada num sujeito dela necessitado, incluindo de acordo com as reivindicações administrar-se ao sujeito referido uma quantidade activa do ponto de vista terapêutico de um agonista de receptor de S1P que inclua um grupo com a fórmula IX, ou um seu sal aceitável do ponto de vista terapêutico. 0 termo "tumores sólidos" significa tumores e/ou metástase (aonde quer que estejam localizadas) para além do cancro linfático, por exemplo tumores cerebrais e outros do sistema nervoso central (por exemplo tumores das meninges, cerebrais, da medula espinal, dos nervos cranianos e de outras partes do sistema nervoso central, por exemplo glioblastomas ou blastomas da medula); cancro da cabeça e/ou do pescoço; tumores da mama; tumores do sistema circulatório (por exemplo do coração, do mediastino e da pleura, e de outros órgão intratoráxicos, tumores vasculares e tecido vascular associado a tumores); tumores do sistema excretor (por exemplo do rim, do pélvis renal, do ureter, da bexiga, de outros órgãos urinários não especificados); tumores do tracto gastrointestinal (por exemplo do esófago, do estômago, do intestino delgado, do cólon, colo-rectais, da junção recto-sigmóide, do recto, do ânus e do canal anal), tumores envolvendo o figado e os canais biliares intra-hepáticos, da vesicula, de outras partes não especificadas do tracto biliar, do pâncreas, de outros órgãos digestivos); da cavidade oral (lábio, lingua, 20 ΡΕ1944026 gengiva, sublinguais, do palato bucal, e de outras partes da boca, da glândula parótida, e de outras partes das glândulas salivares, da amigdala, da orofaringe, da nasofaringe, do sinos piriforme, da hipofaringe, e de outros locais nos lábios, na cavidade oral e na faringe); tumores do sistema reprodutivo (por exemplo da vulva, da vagina, do Cervix uteri, do Corpus uteri, do útero, do ovário, e de outros locais associados com os órgãos genitais femininos, da placenta, do pénis, da próstata, do testículo, e de outros locais associados com os órgãos genitais masculinos); tumores do tracto respiratório (por exemplo da cavidade nasal e do ouvido médio, dos sinos acessórios, da laringe, da traqueia, dos brônquios e do pulmão, por exemplo cancro do pulmão de células pequenas ou cancro do pulmão de células não pequenas); tumores do sistema esquelético (por cancro dos ossos e ca cartilagem articular dos membros, da cartilagem articular dos ossos e de outros locais); tumores da pele (por exemplo me41anoma maligno da pele, cancro da pele não melanoma, carcinoma das células basais da pele, carcinoma de células escamosas da pele, mesotelioma, sarcoma de Kaposi); e tumores envolvendo outros tecidos incluindo os nervos periféricos e o sistema nervoso autonômico, o tecido conjuntivo e os tecidos moles, o retroperitoneu e o peritoneu, o olho e a adnexa, a tiróide, a glândula supra-renal e outras glândulas endó-crinas e estruturas relacionadas, neoplasma secundário e não especificado dos nodos linfáticos, neoplasma maligno secundário dos sistemas respiratório e digestivo e neoplasma maligno secundário de outros locais. 21 ΡΕ1944026

Quando se menciona um tumor neste documento, acima ou adiante, ou uma doença tumoral, um carcinoma ou um cancro, também se implicam em alternativa ou adicionalmente metástases no órgão de origem ou noutro local ou tecido e/ou com qualquer outra localização alternativa, qualquer que seja a localização do tumor e/ou da metástase.

Num conjunto de concretizações particulares ou alternativas, a invenção presente também proporciona

Uma utilização para incrementar a actividade de um agente quimioterapêutico ou para ultrapassar a resistência a um agente quimioterapêutico num sujeito que dela necessite, incluindo administrar ao sujeito referido uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico de um agonista do recepto S1P, por exemplo um agonista do receptor S1P que inclua um grupo com a fórmula IX, ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, quer concomitantemente, quer sequencialmente ao referido agente quimioterapêutico .

Uma utilização de acordo com a anterior em que o agente quimioterapêutico seja um inibidor dos caminhos de transdução de sinal dirigidos quer contra células do hospedeiro, quer contra processos envolvidos na formação de tumores 22 ΡΕ1944026 e/ou metástases, ou ainda utilizados por células de tumor para a proliferação, a sobrevivência, a diferenciação ou o desenvolvimento de resistência a fármacos.

Uma utilização tal como acima indicada, em que o agonista de receptor S1P seja administrado intermitentemente.

Por "cancro linfático" entendem-se por exemplo tumores do sangue e do sistema linfático (por exemplo doença de Hodgkin, linfoma sem ser de Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfomas relacionados com a SIDA, doenças malignas imunoproliferativas, mieloma múltiplo e neoplasmas malignos do plasma celular, leucemia linfóide, leucemia mielóide aguda ou crónica, leucemia linfocitica aguda ou crónica, leucemia monocitica, outras leucemias de células cujo tipo seja especificado, leucemia de células de tipo não especificado, ouros neoplasmas malignos não especificados dos tecidos linfóide, hematopoiético e de tecidos relacionados, por exemplo linfoma de células grandes difusas, linfoma de células T ou linfoma de células T cutâneas). Inclui-se no cancro mielóide por exemplo a leucemia mielóide aguda ou crónica. 0 termo "agente quimioterapêutico" significa qualquer agente quimioterapêutico para além dos agonistas de receptor S1P de acordo com a seguinte lista: ΡΕ1944026 23 i. um inibidor de aromatase, ii. um antiestrogénio, um anti-androgénio (em particular no caso do cancro da próstata) ou um agonista de gonadorelina, iii. um inibidor da topoisomerase I ou um inibidor da topoisomerase II, iv. Um agente activo nos microtúbulos, um agente alquilante, um antimetabolito antineo-plásico ou um composto de platina, v. um composto alvejando/diminuindo a activi-dade de uma proteína ou de uma quinase de lípidos ou de uma proteína ou uma fosfatase de lípidos, mais um composto anti-angiogénico ou um composto que induza processos de diferenciação celular, vi. um receptor de bradiquinina 1 ou um antagonista de angiotensina II, vii. um inibidor de ciclo-oxigenase, um bisfos-fonato, um inibidor de histona desacetilase, um inibidor de heparanase (evita a degradação do sulfato de heparana), por exemplo Pl-88, um modificador da reacção biológica, preferivelmente uma linfoquina ou interferões, por exem- 24 ΡΕ1944026 uitinação, ou um inibidor que bloqueie os caminhos anti-apoptóticos, viii. um inibidor das isoformas oncogénicas de Ras, por exemplo H-Ras, K-Ras ou N-Ras, ou um inibidor de farnesil transferase, por exemplo L-744,832 ou DK8G557, ix. um inibidor de telomerase, por exemplo telomestatina, x. um inibir de protease, um inibidor de metaloproteinase da matriz, um inibidor de metionina aminopeptidase, por exemplo bengamida ou um seu derivado, ou um inibidor do proteossoma, por exemplo PS-341, e/ou xi) um inibidor de mTOR. 0 termo "inibidor de aromatase", tal como se utiliza neste documento, diz respeito a um composto que iniba a produção de estrogénio, isto é a transformação dos substratos androstenodiona e testosterona, respectivamente em estrona e estradiol. 0 termo inclui, mas não se limita a esteróides, em particular atamestano, exemestano e for-mestano e, em especial, não esteróides, em particular ami-noglutetimida, rogletimida, piridoglutetimida, trilostano, testolactona, cetoconazole, vorozole, fadrozole, anastro-zole e letrozole. Pode administrar-se o exemestano, por 25 ΡΕ1944026 exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo com a marca registada AROMASIN™. Pode administrar-se o formestano, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial LENTARON™. Pode administrar-se o fadrozole, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial AFEMA™. Pode administrar-se o anastrozole sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial ARIMIDEX™. Pode administrar-se o letrozole sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial FEMARA™ ou a FEMAR™. Pode administrar-se a aminoglutetimida sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial ORIMETEN™. Uma combinação da invenção incluindo um agente quimioterapêutico que seja um inibidor de aromatase é especialmente útil para o tratamento de tumores positivos a receptores de hormonas, por exemplo tumores da mama. 0 termo "antiestrogénio", tal como se utiliza neste documento, diz respeito a um composto que antagoniza o efeito dos estrogénios ao nivel do receptor de estro-génio. O termo inclui tamoxifene, fulvestrant, raloxifene e cloridrato de raloxifene. Pode administrar-se o tamoxifene, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial NOLVADEX™. Pode administrar-se o cloridrato de raloxifene, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial EVISTA™. Pode formular-se o fulvestrant tal como está descrito na US 4.659.516 ou pode administrar-se, por 26 ΡΕ1944026 exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial FASLODEX™. Uma combinação da invenção que inclua um agente quimioterapêutico que seja um antiestrogénio é especialmente útil para o tratamento de tumores positivos em relação a receptores de estrogénio, por exemplo tumores da mama. 0 termo "anti-androgénio", tal como se utiliza neste documento, diz respeito a qualquer substância que seja capaz de inibir os efeitos biológicos das hormonas androgénicas e inclui bicalutamida (CASODEX™) , que se pode formular, por exemplo tal como se descreveu na US 4.636.505. O termo "agonista de gonadorelina", tal como se utiliza neste documento, inclui abarelix, goserelina e acetato de goserelina. A goserelina está descrita na US 4.100.274 e pode ser administrada, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial ZOLADEX™. Pode formular-se o abarelix, por exemplo tal como se descreveu na US 5.843.901. O termo "inibidor de topoisomerase I", tal como se utiliza neste documento, inclui topotecano, irinotecano, 9-nitrocamptotecina e o conjugado macromolecular de camptotecina PNU-166148 (composto AI no WO 99/17.804). Pode administrar-se o irinotecano, por exemplo sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial CAMPTOSAR™. Pode administrar-se o topotecano, por exemplo, 27 ΡΕ1944026 sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial HYCAMTIN™. 0 termo "inibidor de topoisomerase II", tal como se utiliza neste documento, inclui as antraciclinas tais como a doxorrubicina (incluindo formulação em lipossomas, por exemplo CAELYX™), daunorrubicina, epirrubicina, idar-rubicina e nemorrubicina, as antraquinonas mitoxantrona e losoxantrona, e as podofilotoxinas etoposido e teniposido. Pode administrar-se o etoposido, por exemplo sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial ET0P0PH0S™. Pode administrar-se o teniposido, por exemplo sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial VM 26-BRISTOL™. Pode administrar-se a doxorrubicina, por exemplo sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial ADRIBLASTIN™. Pode administrar-se a epirrubicina, por exemplo sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial FARMORUBICIN™. Pode administrar-se a idarrubicina, por exemplo sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial ZAVEDOS™. Pode administrar-se a mitoxantrona, por exemplo sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial NOVANTRON™. 0 termo "agente activo nos microtúbulos" diz respeito a agentes que estabilizam ou que desestabilizam os microtúbulos incluindo os taxanos, por exemplo paclitaxel e docetaxel, os alcaloides da vinca, por exemplo, vinblas-tina, em particular sulfato de vinblastina, vincristina, em 28 ΡΕ1944026 particular sulfato de vincristina, e vinorelbina, os discodermolidos e as epotilonas e os seus derivados, por exemplo epotilona B ou um seu derivado. Pode administrar-se o paclitaxel por exemplo sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial TAXOL™. Pode administrar-se o docetaxel, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial TAXOTERE™. Pode administrar-se o sulfato de vinblastina, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial VINBLASTIN R.P.™. Pode administrar-se o sulfato de vincristina, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial FARMISTIN™. Pode obter-se o discodermolido, por exemplo, tal como se descreveu na US 5.010.099. 0 termo "agente alquilante", tal como se utiliza neste documento, inclui, mas não se limita a busulfan, clorambucil, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan ou nitroso-ureia (BCNU ou Gliadel™). Pode administrar-se a ciclof osf amida, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial CYCLOSTIN™. Pode administrar-se a ifosfamida, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial HOLOXAN™. O termo "antimetabolito antineoplásico" inclui, mas não se limita a 5-fluorouracilo, capecitabina, gemcitabina, citarabina, fludarabina, tioguanina, metotre-xato e edatrexato. Pode administrar-se a capecitabina, por 29 ΡΕ1944026 exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial XELODA™. Pode administrar-se a gemcitabina, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial GEMZAR™. 0 termo "composto de platina", tal como se utiliza neste documento, inclui, mas não se limita a carboplatina, cisplatina e oxaliplatia. Pode administrar-se a carboplatina, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial CARBOPLAT™. Pode administrar-se a oxaliplatina, por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial ELOXATIN™. 0 termo "compostos alvejando/diminuindo a actividade de uma proteína ou quinase de lípidos ou outros compostos anti-angiogénicos", tal como se utiliza neste documento, inclui, mas não se limita a proteínas inibidoras de tirosina quinases e/ou de serina quinase e/ou de treonina quinase ou a inibidores de quinase de lípidos, por exemplo compostos alvejando, diminuindo a actividade ou inibindo as tirosina quinase receptoras da família do factor de crescimento epidérmico (EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 sob as formas de homodímeros ou de heterodímeros), as tirosina quinase receptoras da família do factor de crescimento endotelial vascular (VEGFR) , os receptores de factores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFR), os receptores de factor de crescimento de fibroblastos(FGFR) , o receptor 1 de factor de crescimento semelhante a insulina 30 ΡΕ1944026 (IGF-1R), a família de tirosina quinases do receptor Trk, a família de tirosina quinases do receptor Axl, a tirosina quinase do receptor Ret, a tirosina quinase do receptor Kit/SCFR, membros da família c-Abl e os seus produtos de fusão genética (por exemplo BCR-Abl), membros das famílias de proteína quinase C (PKC) e Raf das serina/treonina quinases, membros da família das quinases MEK, SRC, JAK, FAK, PDK ou PI (3, ou da família de quinases relacionadas com PI(3)-quinase, e/ou membros da família de quinases dependente de ciclina (CDK) e compostos anti-angiogénicos possuindo outro mecanismo para a sua actividade, por exemplo não relacionado com a inibição de quinases de proteínas ou de lípidos.

Os compostos que alvejam, diminuem a actividade ou inibem VEGFR são em particular compostos, proteínas ou anticorpos que inibem a tirosina quinase do receptor VEGF, inibem um receptor VEGF ou se ligam a VEGF, e são em especial aqueles compostos, proteínas ou anticorpos monoclonais genérica e especificamente descritos no WO 98/35.958, por exemplo 1-(4-cloroanilino)-4-(4-piridilme-til) ftalazina ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, por exemplo o succinato, no WO 00/27.820, por exemplo um derivado amida do ácido N-aril(tio)antranílico, por exemplo 2-[(4-piridil)metil]amino-N-[3-metoxi-5-(tri-fluorometil)fenil]benzamida ou 2-[(l-oxido-4-piridil)me til ]amino-N-[3-trifluorometilfenil]benzamida, ou nos WO 00/09.495, WO 00/59.509, WO 98/11.223, WO 00/27.819 e na EP 0 769.947; aqueles tais como os descritos por M. Prewett et 31 ΡΕ1944026 al., em Câncer Research 59 (1999) 5209-5218, por F. Yuan et al., em Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 14765-14770, de

Dezembro de 1996, por Z. Zhu et al., em Câncer Res. 58, 1998, 3209-3214, e por J. Mordenti et al., em Toxicologic

Pathology, 27(1), 14-21, 1999; no WO 00/37.502 e no WO 94/10.202; Angiostatin”, descrita por M. S. 0'Reilly et al., Cell 79, 1994, 315-328; Endostatin”, descrita por M. S. 0'Reilly et al., Cell 88, 1997, 277-285; amidas do ácido antranílico; ZD4190; ZD6474; SU5416; SU6668; ou anticorpos anti-VEGF ou anticorpos anti-receptor de VEGF, por exemplo RhuMab.

Por anticorpo significa-se anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespe-cíficos formados a partir de pelo menos 2 anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpos que ainda exibam a actividade biológica pretendida.

Os compostos que alvejam, diminuam a actividade ou inibam a familia dos receptores de factor de crescimento epidérmico são em particular compostos, proteínas ou anticorpos que inibem membros da familia EGF de tirosina quinases receptoras, por exemplo o receptor EGF, o receptor ErbB2, o receptor ErbB3 e o receptor ErbB4 ou que se liguem EGF ou a ligandos relacionados com EGF, ou que tenham um efeito dual de inibição das quinases receptoras ErbB e VEGF e sejam em especial aqueles compostos, proteínas ou anticorpos monoclonais genérica e especificamente descritos no WO 97/02266, por exemplo o composto do ex°. 39, ou na EP 32 ΡΕ1944026 0 564.409, no WO 99/03.854, na EP 0 520.722, na EP 0 566.226, na EP 0 787.722, na EP 0 837.063, na US 5.747.498, no WO 98/10.767, no WO 97/30.034, no WO 97/49.688, no WO 97/38.983 e, em particular, no WO 96/30.347 (por exemplo o composto conhecido como CP 358774), no WO 96/33.980 (por exemplo o composto ZD 1839) e no WO 95/03.283 (por exemplo o composto ZM105180) ou no PCT/EP02/08.780; por exemplo trastuzumab (HerpetinR) , cetuximab, Iressa, OSI-774, CI-1033, EKB-569, GW-2016, El.l, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.ll, E6.3 ou E7.6.3.

Os compostos que alvejam, diminuem a actividade ou inibem PDGFR são particularmente compostos que inibem o receptor de PDGF, por exemplo um derivado de N-fenil-2- pirimidina-amina, por exemplo o imatinib.

Os compostos que alvejam, diminuem a actividade ou inibem os membros da família c-Abl e os seus produtos de fusão genética, por exemplo um derivado de N-fenil-2-pirimidina-amina, por exemplo imatinib; PD180970; AG957; ou NSC 680410.

Os compostos que alvejam, diminuem a actividade ou inibem a proteína quinase C, Raf, MEK, SRC, JAK, FAK e membros da família PDK, ou PI(3) quinase ou membros relacionados da família da PI(3) quinase, e/ou membros da família das quinases dependentes de ciclina (CDK) são especialmente os derivados de estaurosporina descritos na EP 0 296.110, por exemplo midostaurina; incluem-se nos 33 ΡΕ1944026 exemplos de mais compostos por exemplo UCN-01, safingol, BAY 43-9006, Briostatina 1, Perifosina; U0126; Ilmofosina; RO 318220 e RO 320432; GO 6976; Isis 3521; ou LY333531/LY379196. São compostos anti-angiogénicos adicionais por exemplo a talidomida (THALOMID) e TNP-470.

Os compostos que alvejam, diminuem a actividade ou inibem uma fosfatase de proteína ou de lípido são por exemplo inibidores de fosfatase 1, de fosfatase 2A, PTEN ou CDC25, por exemplo ácido ocadáico ou um seu derivado.

Os compostos que induzem processos de diferenciação são por exemplo o ácido retinóico, os tocoferóis (a, γ ou δ) ou os tocotrienóis (a, γ ou δ). O termo inibidor de ciclo-oxigenase, tal como se utiliza neste documento, inclui, mas não se limita a, por exemplo, celecoxib (CelebrexR) , rofecoxib (VioxxR) , etori-coxib, valdecoxib ou um ácido 5-alquil-2-arilamino-fenilacético, por exemplo ácido 5-metil-2-(2'-cloro-6'-fluoroanilino)fenilacético. 0 termo "inibidor de histona desacetilase", tal como se utiliza neste documento, inclui MS-27-275, SAHA, piroxamida, FR-901228 ou ácido valpróico. O termo "bisfosfonatos", tal como se utiliza 34 ΡΕ1944026 neste documento, inclui, mas não se limita a, os ácidos etridónico, clodrónico, tiludrónico, pamidrónico, alen-drónico, ibandrónico, risedrónico e zoledrónico. Pode administrar-se o "ácido etridónico", por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial DIDRONEL™. Pode administrar-se o "ácido clodrónico", por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial BONEFOS™. Pode administrar-se o "ácido tiludrónico", por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial SKELID™. Pode administrar-se o "ácido pamidrónico", por exemplo sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial AREDIA™. Pode administrar-se o "ácido alendrónico", por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial FOSAMAX™. Pode administrar-se o "ácido ibandrónico", por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial BONDRANAT™. Pode administrar-se o "ácido risedrónico", por exemplo, sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial ACTONEL™. Pode administrar-se o "ácido zoledrónico", por exemplo sob a forma em que é comercializado, por exemplo sob a marca comercial ZOMETA™ 0 termo "inibidor de metaloproteinase da matriz", tal como se utiliza neste documento, inclui, mas não se limita a inibidores de colagénio peptidomiméticos e não petidomiméticos, derivados de tetraciclina, por exemplo inibidores de hidroxamato peptidomiméticos, batimastat e o 35 ΡΕ1944026 seu análogo oralmente biodisponível marimastat, prino-mastat, BMS-279251, BAY 12-9566, TAA211 ou AAJ996. 0 termo "inibidor de mTOR", tal como se utiliza

neste documento, inclui, mas não se limita a rapamicina (sirolimus) ou a um seu derivado. A rapamicina é um antibiótico macrólido conhecido produzido por Streptomyces hygroscopicus. Inclui-se nos derivados adequados de rapamicina por exemplo compostos com a fórmula A

na qual

Riaa seja CH3 ou alcinilo C3-6 R2aa seja H ou -CH2-CH2-OH, 3-hidroxi-2-(hidroxi-metil)-2-metil-propanoílo ou tetrazolilo, e

Xaa seja =0, (Η, H) ou (H,0H) desde que R2aa não seja H quando Xaa for =0 e Rlaa for CH3. ou um seu precursor quando R2aa for -CH2-CH2-OH, por exemplo um seu éter fisiologicamente hidrolisável. 36 ΡΕ1944026

Os compostos com a fórmula A estão descritos por exemplo no W0 94/09.010, no WO 95/16.691, no WO 96/41.807, na USP 5.362.718 ou no WO 99/15.530. Eles podem ser preparados tal como se descreveu ou por analogia com os processos descritos nesta bibliografia.

Os derivados preferidos da rapamicina são a 32-desoxorapamicina, a 16-pent-2-iniloxi-32-deoxorapamicina, a 16-pent-2-iniloxi-32(S)-dihidro-rapamicina, a 16-pent-2-iniloxi-32(S)-dihidro-40-Ο-(2-hidroxietil)-rapamicina e, mais preferivelmente, a 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina. Incluem-se em mais exemplos de derivados de rapamicina por exemplo o CC1779 ou a 40-[3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]-rapamicina ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, tal como descritos na USP 5.362.718, ABT578 ou a 40-(tetrazolil)-rapamicina, em especial a 40-epi-(tetrazolil)-rapamicina, por exemplo tal como descrita no WO 99/15.530, ou rapalogos tal como os descritos por exemplo no WO 98/02.441 e no WO 01/14.387, por exemplo AP23573.

Sempre que se incluem citações de pedidos de patente ou de publicações cientificas, os assuntos neles relacionados com os compostos é deste modo incorporado no pedido presente por citação. Estão de igual forma incluídos os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, os correspondentes racematos, diastereómeros, enantiómeros, tautómeros, bem como as correspondentes modificações 37 ΡΕ1944026 cristalinas de quaisquer dos compostos citados, quando presentes, por exemplo solvatos, hidratos e polimorfos, que estejam descritos nesses documentos. Os compostos utilizados na qualidade de ingredientes activos nas combinações da invenção podem ser preparados e administrados, respec-tivamente, tal como se descreveu nos documentos citados,. Também se encontra adentro do âmbito desta invenção a combinação de mais de dois ingredientes activos distintos, tais como enumerados acima, isto é, uma combinação farmacêutica adentro do âmbito desta invenção poderá incluir três ou mais ingredientes activos. Além disto, tanto o primeiro agente como o co-agente não são o ingrediente idêntico.

Pode demonstrar-se a utilidade dos agonistas de S1P, por exemplo dos agonistas de S1P que incluam um grupo com a fórmula X de acordo com as reivindicações, para tratar tumores sólidos tal como se especificou acima neste documento, em métodos envolvendo testes com animais, bem como em ensaios clínicos, por exemplo de acordo com os métodos que se descrevem adiante neste documento.

Todos os exemplos são exemplos de referência. A. In Vitro A.l Actividade Antitumoral

Utiliza-se uma linha de cancro da mama em murganhos, originalmente isolada de carcinomas mamários, 38 ΡΕ1944026 por exemplo JygMC(A). Ajusta-se o número de células a 5xl05 para plaqueamento em meio fresco, antes do procedimento. Incubam-se as células em meio fresco contendo timidina 2,5 mM sem FCS durante 12 h e depois lavam-se duas vezes com PBS, adicionando-se em seguida meio fresco com 10 % de FCS e incuba-se durante mais 12 h. Em seguida incubam-se as células com meio fresco contendo timidina 2,5 mM sem FCS durante 12 h. Para libertar as células do bloco, lavam-se as células duas vezes com PBS e voltam a plaquear-se em meio fresco contendo 10 % de FCS. Depois de serem sincronizadas, incubam-se as células com ou sem diversas concentrações de um composto com a fórmula I, durante 3, 6, 9, 12, 18 ou 24 h. Colhem-se as células depois de um tratamento com EDTA a 0,2 %, fixam-se com uma solução gelada de etanol a 70 %, hidrolisam-se com 250 yg/mL de RNase A (de tipo 1-A: Sigma Chem. Co.) a 37°C durante 30 minutos e contrastam-se com iodeto de propidio a 10 mg/mL durante 20 minutos. Terminado o período de incubação, determina-se o número de células tanto por contagem num contador Coulter, como por um ensaio colorimétrico SRB. Nestas condições um agonista de S1P, por exemplo o Composto B sob a forma do seu sal cloridrato, inibe a proliferação das células de tumor a concentrações de entre 10“12 e IO”6 M. A.2 Ensaio de formação de Tubo HUVEC Mediada por

S1P utilizam-se

Para o ensaio de formação de tubo, HUVEC das passagens 2-8 e nunca mais do que 70 39 ΡΕ1944026 confluentes antes da colheita. Preparam-se as células para o ensaio lavando-as com Solução Salina Balanceada de Herpes (HBSS da Clonetics) e depois tripsinizam-se com Tripsina/EDTA (a 0,25 mg/mL, da Clonetics). Depois de cerca de 90 % das células se terem soltado da placa, adiciona-se igual volume de Solução Neutralizante de Tripsina (TNS da Clonetics) e obtêm-se as células num tubo cónico contendo pelo menos 10 mL de meio EBM-2 (Clonetics) + 0,1 % de BSA (Sigma). Centrifugam-se as células a 1.000 rpm durante 5 minutos e remove-se o sobrenadante que se substitui com 5 mL de meio fresco EBM-2 + 0,1 % de BSA. Coutam-se as células utilizando um hemocitómetro e ajusta-se o volume da suspensão de células para se conseguir uma concentração de 500.000 células/mL. Preparam-se tubos cónicos com compostos em teste a 100 nM, e toxina da tosse convulsa (PTx) a 10 ng/mL em cada um deles, depois adiciona-se a cada tubo 1 mL da suspensão de células. Incubam-se então os tubis durante ^ hora a 37°C, sob 5 % de CO2. Leva-se a cabo o ensaio de migração utilizando Placas Fluoro-Blok de 24 poços revestidos com fibronectina (poros com dimensão de 8 pm, Falcon #351147) em vez das inserções individuais numa placa de 24 poços. Preparam-se as células e os compostos em teste e pré-incubam-se tal como se descreveu acima, depois adicionam-se 100 pL em cada um dos poços apropriados na Placa de Inserção. Adiciona-se ao fundo dos poços marcados para ausência de estimulação (-) 300 pL do meio EBM-2 + 2 % de meio limpos obre carvão e sem S1P, e 300 pL dos meios contendo S1P (500 nM) ao fundo dos poços marcados para estimulação (+). Incuba-se então a placa durante 4 horas a 37°C, sob 5 % de C02. 40 ΡΕ1944026

Prepara-se calceína AM, a 50 pg/frasco, (Molecular Probes #C3100) adicionando em primeiro lugar 20 pL de DMSO ao frasco. Em seguida adicionam-se 12,5 mL de HBSS (por placa) e aquece-se a 37°C, adicionando-se 150 pL ao frasco. Transferem-se então os conteúdos dos frascos de volta para o HBSS remanescente para se obter a concentração final de 4 pg/mL em calceína AM.

Remove-se a placa Fluoro-Blok da incubadora e separa-se a placa de inserção do topo, "inclinando-se" para se remover o excesso de meio ainda agarrado às inserções. Transfere-se então a placa das inserções para uma placa de 24 poços fresca contendo 500 pL/poço da solução de calceína AM a 4 pg/mL. Incuba-se então a placa durante 1½ horas a 37 °C, sob 5 % de C02.

Terminada a incubação, lê-se a placa num Cytofluor II, com uma excitação a 485 nm e uma emissão a 530 nm. O revestimento Fluoro-Blok nas inserções permite contar só as células que migraram para o fundo. Transferem-se os dados para um programa Excel para os cálculos, criam-se gráficos utilizando o SigmaPlot, e utiliza-se o SigmaStat para os testes de significância (teste t). (Figura 7).

Quantifica-se a formação de tubos contando o número de pontos de ramificação (ligação entre dois cordões independentes) em 3 campos independentes sob um aumento de 4 x. Os resultados são reportados como se segue: 41 ΡΕ1944026

Tratamento_Pontos de Ramificação PBS 8 + 5 S1P 42 ± 13 Fosfato de FTY720 48 ± 15 Fosfato de FTY720 + S1P 14 ± 7 Fosfato de Composto C 44 ± 16 Fosfato de Composto C + S1P 18 ± 6

Estes resultados demonstram a capacidade única do Fosfato de FTY720 ou do Fosfato de Composto C para actuar a titulo de agonistas da angiogénese por si sós, mas e duma forma surpreendente, como antagonistas da angiogénese mediada por S1P. 0 Fosfato de Composto C é preferivelmente o racemato ou o enantiómero R. Utiliza-se PTx a titulo de controlo para inibir a actividade mediada por Gia (EDG-1). B. In Vivo B.l Actividade Antitumoral A actividade antitumoral é expressa como T/C % (aumento médio dos volumes de tumores de animais tratados dividido pelo aumento médio de volumes de tumores de animais de controlo, multiplicado por 100).

Transplantam-se alíquotas de células de cancro (lxlO7), por exemplo células de melanoma humano A375, em murganhos BALB/c-nu/nu. Quando os tumores atingem dimensão 42 ΡΕ1944026 de ca. 10x10 mm, distribuem-se aleatoriamente os animais por quatro subgrupos e inicia-se o tratamento com um composto com a fórmula I. Sacrificam-se os animais passadas 2 semanas de tratamento, e nessa altura recolhem-se os tumores e tecidos e preparam-se para análise morfológica e molecular. Determinam-se as dimensões dos tumores com uma craveira. Neste ensaio, um agonista de S1P, por exemplo o Composto B ou o C (sob a forma do seu sal cloridrato) , torna mais lento o crescimento dos tumores quando é administrado a uma dose de entre 0,5 e 5 mg/kg, em relação ao de um controlo a soro salino: por exemplo, por administração de uma dose de 2,5 mg/kg de Composto C-HC1 5x/semana obtém-se um valor final de T/C de 30 %.

B.2 Combinação com um inibidor de proteína tirosina quinase VEGF-R

Tratam-se murganhos nus transplantados com tumores da mama humanos MDA-MB-435 durante 2 semanas com um inibidor de proteina tirosina quinase VEGF-R, por exemplo sucinato de 1-(4-cloroanilino)-4-(4-piridilmetil)ftalazina, a uma dose de 100 mg/kg p.o. 5x/semana, um agonista de receptor S1P, por exemplo o Composto C (sal cloridrato), a uma dose de 2,5 mg/kg i.v. 5x/semana, ou com uma combinação de ambos. A actividade antitumoral é expressa como T/C % tal como se indicou acima. Uma combinação de Composto C-HC1 com sucinato de 1-(4-cloroanilino)-4-(4-piridilmetil)-ftalazina origina um efeito antitumoral maior (T/C % 27) em comparação com o de qualquer um dos agentes por si só 43 ΡΕ1944026 (Composto C-HC1, T/C 66 %; sucinato de 1-(4-cloroanilino)-4-(4-piridilmetil)ftalazina, T/C % 91). também se obtêm boas reacções antitumorais quando se transplantam murganhos nus com células de melanoma humano A375 e se tratam de um modo semelhante com a mesma combinação: o tratamento combinado origina uma T/C % 15 enquanto o tratamento com apenas um dos agentes por si só origina respectivamente valores de T/C % de 35 e de 44. B.3 Actividade Antiangiogénica

Implantam-se por via subcutânea no flanco de murganhos câmara porosas contendo (i) esfingosina-l-fosfato (5 μΜ/câmara) ou (ii) VEGF humano (1 pg/câmara) em 0,5 mL de agar a 0,8 % peso/volume (contendo heparina, 20 U/mL) . S1P ou VEGF induzem o crescimento de tecido vascularizado em torno da câmara, esta reacção depende da dose e pode ser quantificada medindo o peso e o conteúdo em sangue do tecido. Tratam-se os murganhos diariamente (i) por via oral com Composto A (a 0,3, 3, 30 ou 50 mg/kg) ou (ii) por via endovenosa com o enantiómero R do Composto C (a 2,5 mg/kg) ou (iii) por via endovenosa com o enantiómero S do Composto C (a 2,5 mg/kg) ou (iv) por via oral ou endovenosa com veículo (5 % de glucose, 10 mL/kg) , iniciando-se 4-6 horas antes da implantação das câmaras e continuando durante 4 dias. Sacrificam-se os animais para se medirem os tecidos vascularizados 24 h depois da última dose. Determina-se o peso dos tecidos vascularizados em torno da câmara e o seu conteúdo em sangue. 44 ΡΕ1944026

Os animais tratados com Composto A ou com os enantiómeros R ou S do Composto C denotam menor peso e/ou conteúdo em sangue nos tecidos vascularizados, em comparação co os de animais tratados apenas com veiculo. C. Ensaio Clinico

C.l Investigação do beneficio clinico de um agonista do receptor S1P, por exemplo de um composto com a fórmula I, II ou III, por exemplo o Composto A, B ou C

Estudam-se 20 pacientes com tumores sólidos em progressão, de estádio avançado, resistentes ou refractários às terapias padrão, para receberem o composto referido a uma dosagem tal como determinada no estudo de doses crescentes. Investiga-se semanalmente o estado clinico geral de cada paciente por exame fisico e laboratorial. Avaliam-se as alterações de cada tumor e a carga de metástases a cada 2 meses, por exame radiológico. Inicialmente os pacientes recebem tratamento durante 2 meses. Em seguida, eles permanecem sob tratamento durante o periodo de tempo durante o qual a sua doença não progrida e o fármaco seja tolerado satisfatoriamente.

Principais variáveis para avaliação: Segurança (acontecimentos adversos), padrão da bioquimica do sangue e hematologia, dimensões dos tumores por varrimento tomográfico computadorizado (CT) ou imagiologia por ressonância magnética (MRI). 45 ΡΕ1944026 C.2 Tratamento Combinado

Os estudos clínicos adequados são, por exemplo, estudos de rótulo aberto não aleatorizados, de aumento de dose em pacientes com tumores sólidos avançados. Estes estudos provam em especial a sinergia entre os ingredientes activos da combinação da invenção. Os efeitos beneficiais sobre doenças proliferativas podem ser determinados directamente através dos resultados destes estudos, ou por alterações na concepção do estudo conhecidas como tais pelos especialistas da técnica. Estes estudos são, em especial, adequados para comparar os efeitos de uma monoterapia utilizando os ingredientes activos e os da combinação da invenção. Preferivelmente, a dose do agente (a) é escalada até se atingir a Dosagem Máxima Tolerada, e administra-se o co-agente (b) a uma dose fixa. Em alternativa, administra-se o agente (a) a uma dose fixa e escala-se a dose do co-agente (b) . Cada paciente recebe doses do agente (a) quer diariamente, quer intermitentes. Pode determinar-se a eficácia do tratamento nestes estudos, por exemplo, ao fim de 12, 18 ou 24 semanas, por avaliação radiológica dos tumores a cada 6 semanas.

Em alternativa, pode utilizar-se um estudo duplamente cego controlado por placebo, para se provarem os benefícios da combinação da invenção mencionada neste documento. 46 ΡΕ1944026

As dosagens diárias necessárias na prática do método da invenção presente quando se utiliza apenas um agonista de receptor S1P variarão, dependendo de, por exemplo, qual o composto utilizado, o hospedeiro, o modo de administração e a severidade do estado que se estiver a tratar. Uma gama de dosagem diária preferida é de entre cerca de 0,1 e 100 mg sob a forma de uma única dose ou em doses repartidas. As dosagens diárias adequadas para os pacientes são da ordem de entre por exemplo 0,1 e 50 mg p.o. Pode administrar-se o agonista do receptor S1P por qualquer uma das vias convencionais, em especial entéricas, por exemplo por via oral, sob a forma de comprimidos, cápsulas, soluções para beber, por via nasal, pulmonar (por inalação) ou parentérica, por exemplo sob a forma de soluções ou suspensões injectáveis. As formas de unidade de dosagem adequadas para uma administração oral contêm entre ca. de 0,1 a 30 mg, habitualmente 0,25 a 30 mg de agonista de receptor S1P, em conjunto com um ou mais diluentes ou veiculos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico para ele. Para se inibir a angiogénese é importante seleccionar uma dose suficientemente alta do agonista de receptor S1P, uma vez que concentrações pequenas do agonista do receptor S1P promovem a angiogénse. Uma dose adequada para proporcionar um efeito anti-angiogénico quando se administra um agonista do receptor S1P a um paciente, pode ser seleccionada por estudos de concentração e de doses crescentes tal como se descreveram nas A, B, e C acima. também se pode aplicar a combinação da invenção 47 ΡΕ1944026 em conjunto com uma intervenção cirúrgica, com uma hipertermia ligeira prolongada do corpo inteiro e/ou com terapia de irradiação. A administração de uma combinação farmacêutica da invenção resulta num efeito beneficiai, por exemplo um efeito terapêutico sinergistico, por exemplo no que toca a desacelerar, parar ou inverter a formação de neoplasma, a disseminação ou o crescimento de metástases ou uma duração maior da reacção do tumor ou uma inibição da angiogénese; também pode originar outros efeitos beneficiais, por exemplo menos efeitos colaterais, uma melhor qualidade de vida ou uma menor mortalidade e morbilidade, em comparação com uma monoterapia aplicando apenas um dos ingredientes activos do pinto de vista farmacêutico utilizados na combinação da invenção, em especial no tratamento de um tumor que seja refractário aos outros quimioterapêuticos conhecidos como agentes contra o cancro.

Um beneficio adicional é poderem utilizar-se doses menores dos ingredientes activos da combinação da invenção, por exemplo, e que as dosagens necessárias não são só amiúde menores mas também são aplicadas com uma frequência menor, ou podem ser utilizadas para diminuir a incidência de efeitos colaterais, enquanto controlam a taxa de formação do neoplasma. Isto vai de encontro a quanto pretendem e precisam os pacientes que se pretendem tratar.

De acordo com uma concretização da invenção, uma combinação farmacêutica preferida inclui 48 ΡΕ1944026 a) um composto com a fórmula I, II, III, IVa, IVb, V ou VI, por exemplo Composto A, B ou C, e b) a título de co-agente, um ou mais compostos tal como indicado nos parágrafos (ii), (iii), (iv), (v), (vii) ou (xi) acima, por exemplo carboplatina, cisplatina, paclitaxel, docetaxel, gemcitabina, doxorrubicina, um composto alvejando, diminuindo a actividade ou inibindo a família de factor de crescimento endotelial vascular das tirosina quinases receptoras (VEGFR) ou os receptores de factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), um bisfosfonato ou um inibidor de mTOR.

Uma concretização adicional da invenção diz respeito à utilização de um agonista do receptor S1P (a) em combinação com um agente quimioterapêutico (no tratamento de um cancro linfático ou mielóide, por exemplo tal como se descreveu acima. A combinação pode incluir a título de co-agente adicional b) por exemplo busulfan, citarabina, 6-tioguanina, fludarabina, hidroxi-ureia, procarbazina, bleo-micina ou metotrexato. São co-agentes (b) preferidos os inibidores de topoisomerase II, por exemplo a daunorru-bicina ou, em especial, compostos que alvejam, diminuem a actividade ou inibem PDGFR ou dos membros da família c-Abl e os seus produtos de fusão genética, por exemplo imatinib, por exemplo para utilização no tratamento de um cancro linfático. 49 ΡΕ1944026

Os termos "co-administração" ou "administração combinada" ou outros semelhantes tais como se utilizam neste documento, pretendem incluir a administração dos agentes terapêuticos seleccionados a um mesmo paciente, e pretende-se que incluam regimes de tratamento nos quais os agentes não sejam necessariamente administrados nem pela mesma via de administração, nem em simultâneo. É um objectivo desta invenção proporcionar uma composição farmacêutica incluindo uma quantidade, que seja eficaz do ponto de vista terapêutico contra uma doença proliferativa maligna que inclua uma combinação da invenção. Nesta composição, o primeiro agente a) e o co-agente (b) podem ser administrados em conjunto, um a seguir ao outro, ou em separado, numa forma de unidade de dosagem ou em duas formas de unidade de dosagem em separado. As formas de unidade de dosagem também podem constituir uma combinação fixa.

Podem preparar-se as composições farmacêuticas de acordo com a invenção de uma maneira que é conhecida por si própria e que seja adequada para uma administração entérica, tal como oral ou rectal, e parentérica a mamíferos (animais de sangue quente), incluindo seres humanos, as quais incluam uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico de pelo menos um parceiro apenas de uma combinação farmacologicamente activa, por exemplo tal como se indicou acima, ou uma sua combinação com um ou mais 50 ΡΕ1944026 veículos ou diluentes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, em particular adequada para aplicação entérica ou parentérica.

As composições farmacêuticas adequadas contêm, por exemplo, entre cerca de 0,1 % e cerca de 99,9 %, preferivelmente entre cerca de 1 % e cerca de 60 %, do ou dos ingredientes activos. As preparações farmacêuticas para a terapia de combinação para administração entérica ou parentérica são, por exemplo, as que se apresentem sob formas de unidade de dosagem, tais como comprimidos revestidos com açúcar, comprimidos, cápsulas ou supositórios, ou ampolas. Quando não se indicar algo em contrário, estas são preparadas de maneiras conhecidas por si próprias, por exemplo incluindo os processos convencionais de mistura, granulação, revestimento com açúcar, dissolução ou liofilização. Entender-se-á que o conteúdo unitário de um parceiro de uma combinação contido numa dose individual de cada forma de dosagem não necessita ele próprio de constituir uma quantidade eficaz, uma vez que a referida quantidade eficaz pode ser conseguida por administração de diversas unidades de dosagem.

Em especial, pode ser administrada em simultâneo uma quantidade eficaz do ponto de vista farmacêutico de cada um dos parceiros da combinação da invenção, ou essa administração pode ser sequencial por qualquer ordem, e as componentes podem ser administradas em separado ou sob a forma de uma combinação fixa. Por exemplo, o método para 51 ΡΕ1944026 atrasar a progressão ou para tratar uma doença maligna proliferativa de acordo com a invenção pode incluir (i) a administração do primeiro agente a) sob forma livre ou a de um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e (ii) a administração de um co-agente b) sob forma livre ou a de um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, em simultâneo ou sequencialmente por qualquer ordem, em quantidades que em conjunto sejam eficazes do ponto de vista terapêutico, preferivelmente em quantidades que apresentem uma eficácia sinergistica, por exemplo em dosagens diárias ou intermitentes correspondendo as quantidades descritas neste documento. Os parceiros individuais da combinação da invenção podem ser administrados em separado em alturas diferentes durante o decurso da terapia ou em conjunto sob formas divididas ou numa combinação singela. Para além disto, o termo administrar-se também inclui a utilização de um precursor de fármaco para qualquer dos parceiros da combinação, que se transforme in vivo no parceiro da combinação tal e qual. A invenção em apreço deve ser portanto entendida como incluindo todos estes regimes de tratamento em simultâneo ou alternado, e o termo "administrando" deve ser interpretado em consonância com isto. A dosagem eficaz de qualquer um dos parceiros da combinação que se emprega na combinação da invenção pode variar dependendo do composto especifico ou da composição farmacêutica que se empregar, do modo de administração, do estado que se estiver a tratar, da severidade do estado que 52 ΡΕ1944026 se estiver a tratar. Deste modo, o regime de dosagem da combinação da invenção é seleccionado e acordo com uma diversidade de factores incluindo a via de administração e a função renal e hepática do paciente. Um médico, agente clinico ou médico veterinário com conhecimentos médios pode rapidamente determinar e receitar a guantidade eficaz de cada um dos ingredientes activos singelos que é necessária para evitar, contrariar ou parar a progressão do estado. Uma precisão óptima a atingir quanto à concentração dos ingredientes activos, adentro da gama de que resulta eficácia sem toxicidade, necessita de um regime baseado na cinética da disponibilidade dos ingredientes activos nos locais alvejados.

As doses diárias do primeiro agente ou primeira componente (a) variarão evidentemente dependendo de uma diversidade de factores, por exemplo o composto seleccionado, o estado que se pretende especificamente tratar e o efeito pretendido. Em geral, no entanto, conseguem obter-se resultados satisfatórios por administração de um agonista do receptor S1P, por exemplo Composto A, B ou C, a taxas de dosagem diárias da ordem de entre cerca de 0,1 e 100 mg, como dose única ou em doses divididas. Pode administrar-se o agonista do receptor S1P por qualquer uma das vias convencionais, em especial por via entérica, por exemplo oral, por exemplo sob a forma de comprimidos, cápsulas, soluções bebíveis, ou por via paren-térica, por exemplo sob a forma de soluções ou suspensões injectáveis. As formas de unidade de dosagem apropriadas 53 ΡΕ1944026 para administração oral incluem entre cerca de 0,1 e 30 mg de componente (a), por exemplo 0,1 a 25 mg, em conjunto com um ou mais diluentes ou veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico para ela.

Pode administrar-se o fadrozole por via oral a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 0,5 e cerca de 10 mg/dia, preferivelmente entre cerca de 1 e cerca de 2,5 mg/dia. Pode administrar-se o exemestano por via oral a seres humanos numa gama de dosagem variando entre cerca de 5 e cerca de 200 mg/dia, preferivelmente entre cerca de 10 e cerca de 25 mg/dia, ou por via paren-térica a entre cerca de 50 e 500 mg/dia, preferivelmente entre cerca de 100 e cerca de 250 mg/dia. Quando se administrar o fármaco numa composição em separado, ela pode assumir a forma descrita na GB 2.177.700. Pode administrar-se o formestano por via parentérica a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 100 e 500 mg/dia, preferivelmente entre cerca de 250 e cerca de 300 mg/dia. Pode administrar-se o anastrozole por via oral a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 0,25 e 20 mg/dia, preferivelmente entre cerca de 0,5 e cerca de 2,5 mg/dia. Pode administrar-se a aminoglutemida a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 200 e 500 mg/dia.

Pode administrar-se o citrato de tamoxifene a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 10 e 40 mg/dia. 54 ΡΕ1944026

Pode administrar-se a vinblastina a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 1,5 e 10 mg/m2*dia. Pode administrar-se o sulfato de vincristina por via parentérica a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 0,025 e 0,05 mg/kg massa corporal*semana. Pode administrar-se a vinorelbina a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 10 e 50 mg/m2*dia. Pode administrar-se o fosfato de etoposido a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 25 e 115 mg/m2*dia, por exemplo 56,8 ou 113,6 mg/m2*dia.

Pode administrar-se o teniposido a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 75 e 150 mg a cerca de duas em duas semanas. Pode administrar-se a doxorrubicina a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 10 a 100 mg/m2*dia, por exemplo 25 ou 50 mg/m2*dia. Pode administrar-se a epirrubicina a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 10 e 200 mg/m2*dia. Pode administrar-se idarrubicina a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 0,5 e 50 mg/m2*dia. Pode administrar-se a mitoxantrona a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 2,5 e 25 mg/m2*dia.

Pode administrar-se o paclitaxel a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 50 e 300 mg/m2*dia. Pode administrar-se o docetaxel a um ser humano a uma gama de dosagens variando entre cerca de 25 e 100 mg/m2*dia. 55 ΡΕ1944026

Pode administrar-se a ciclofosfamida a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 50 e 1.500 mg/m2*dia. Pode administrar-se o melfalan a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 0,5 e 10 mg/m2*dia.

Pode administrar-se o 5-fluorouracilo a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 50 e 1.000 mg/m2*dia, por exemplo 500 mg/m2*dia. Pode administrar-se a capecitabina a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 10 e 1.000 mg/m2*dia. Pode administrar-se o cloridrato de gemcitabina a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 1.000 mg/m2/semana. Pode administrar-se o metotrexato a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 5 e 500 mg/m2*dia.

Pode administrar-se o topotecano a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 1 e 5 mg/m2*dia. Pode administrar-se o irinotecano a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 50 e 350 mg/m2*dia.

Pode administrar-se a carboplatina a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 200 e 400 mg/m2 de cerca de quatro em quatro semanas. Pode administrar-se a cisplatina a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 25 e 75 mg/m2 de cerca de 56 ΡΕ1944026 três em três semanas. Pode administrar-se a oxaliplatina a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 50 e 85 mg/m2 de duas em duas semanas.

Pode administrar-se o imatinib a um ser humano numa gama de dosagens de entre cerca de 2.5 e 850 mg/dia, mais preferivelmente 5 a 600 mg/dia e de preferência 20 A 300 mg/dia.

Pode administrar-se o ácido alendrónico a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 5 e 10 mg/dia. Pode administrar-se o ácido clodrónico a um ser humano por exemplo numa gama de dosagens variando entre cerca de 750 e 1.500 mg/dia. Pode administrar-se o ácido etidrónico a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 200 e 400 mg/dia. Pode administrar-se o ácido ibandrónico a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 1 e 4 mg a cada três ou quatro semanas.

Pode administrar-se o ácido risedrónico a um ser humano num gama de dosagens variando entre cerca de 20 e 30 mg/dia. Pode administrar-se o ácido pamidrónico a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 15 e 90 mg a cada três ou quatro semanas. Pode administrar-se o ácido tiludrónico a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 200 e 400 mg/dia.

Pode administrar-se o trastuzumab a um ser humano 57 ΡΕ1944026 numa gama de dosagens variando entre cerca de 1 e 4 mg/m2/semana.

Pode administrar-se a bicalutamida a um ser humano numa gama de dosagens variando entre cerca de 25 e 50 mg/m2*dia.

Pode administrar-se a 1- (4-cloroanilino)-4-(4-piridilmetil)ftalazina ou um seu sal, por exemplo o succinato, a um ser humano numa gama de dosagens de entre cerca de 50 e 1.500, mais preferivelmente de entre cerca de 100 e 750, e de preferência de entre 250 e 500, mg/dia.

Pode administrar-se a rapamicina ou um seu derivado, por exemplo a 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, numa gama de dosagens variando entre cerca de 0,1 e 25 mg.

Exemplo de Formulação: cápsulas moles 30 mg 30 0 mg 2 0 mg 350 mg

Composto com a fórmula I, por exemplo Composto A, HC1 Polietilenoglicol 300 Polissorbato 80 Total

Os agonistas do receptor S1P, por exemplo um agonista de receptor S1P incluindo um grupo com a fórmula X, são bem tolerados às dosagens necessárias para serem utilizadas de acordo com a invenção presente. Por exemplo, 58 ΡΕ1944026 a LD50 aguda para o Composto A é > 10 mg/kg p.o. em ratos e em macacos.

Num aspecto adicional, a invenção presente diz respeito à utilização de agonistas S1P a titulo de fármacos pro-angiogénicos. IA indução da neo-angiogénese tem sido reconhecida ultimamente como um alvo excelente em diversos estados (por exemplo na angiogénese do miocárdio, na cicatrização de feridas ou da disfunção vascular diabética ou vasculopatia).

Tal como se descreveu acima, concentrações elevadas de agonistas de receptor S1P (de 2 μΜ ou maiores, por exemplo 2-5 μΜ ou cerca de 5 μΜ) exibem efeitos anti-angiogénicos, e os agonistas de receptor S1P conseguem inibir a angiogénese induzida por VEGF. Em contraste, as concentrações pequenas (0,1 -1 μΜ, por exemplo 0,1 - 0,5 μΜ ou 0,5 - 1 μΜ) de agonistas S1P têm um efeito de favorecer a angiogénese e são capazes de potenciar a angiogénese mediada por VEGF. Deste modo, os agonistas S1P podem ter efeitos bifásicos na angiogénese.

Portanto, a invenção presente também proporciona: 8. A utilização de um agonista de S1P, por exemplo um agonista de S1P incluindo um grupo com a fórmula X, por exemplo Composto A ou fosfato de Composto A, na indução do processo de neo-angiogénese, por exemplo a titulo de ΡΕ1944026 59 agente pro-angiogénico, por exemplo em indicações nas quais seja indicada a promoção de angiogénese; 9. Um processo para a preparação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de doenças mediadas pela inibição do processo de neo-angiogénese, por exemplo mediadas por factores anti-angiogénicos, por exemplo em indicações nas quais a promoção da angiogénese esteja indicada, por exemplo na cicatrização de feridas ou no tratamento do enfarte do miocárdio ou da disfunção vascular diabética ou vasculopatia, incluindo utilizar-se um agonista de receptor S1P, por exemplo um agonista de S1P que inclua um grupo com a fórmula X, por exemplo o Composto A ou o fosfato do Composto A, a titulo de ingrediente activo; 10. Um método de tratar ou evitar doenças mediadas pela inibição do processo de neo-angiogénese, por exemplo mediadas por factores anti-angiogénicos, por exemplo em indicações nas quais a promoção da angiogénese esteja indicada, tais como por exemplo na cicatrização de feridas ou no tratamento do enfarte do miocárdio ou da disfunção vascular diabética ou da vasculopatia, que inclua administrar-se uma quantidade eficaz de um agonista de receptor S1P, por exemplo um agonista de S1P que inclua 60 ΡΕ1944026 um grupo com a fórmula X, por exemplo o Composto A ou o fosfato do Composto A, a um sujeito que necessite de um tal tratamento.

Os agonistas S1P adequados para promover a angiogénese incluem os que se definiram acima em relação ao tratamento do cancro, por exemplo agonistas S1P que incluam um grupo com a fórmula X ou compostos de acordo com as fórmulas I a IX, ou os seus sais ou ésteres aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Preferivelmente o agonista de S1P é o fosfato do Composto A. Pode utilizar-se o agonista de S1P por si só, ou em combinação com um ou mais agentes adicionais que promovam a angiogénese, por exemplo VEGF.

Para se promover a angiogénese é importante seleccionar uma dose suficientemente pequena do agonista de receptor S1P, uma vez que concentrações elevadas do agonista do receptor S1P inibem a angiogénese. Uma dose adequada para proporcionar um efeito pro-angiogénico quando se administra um agonista de S1P a um paciente pode ser seleccionada por estudos de concentrações e doses crescentes, tal como se descreveram nas secções A, B, e C acima.

Descrição das Figuras A Figura 1 mostra que o fosfato do Composto A promove fortemente a formação de redes semelhantes a capilares de 61 ΡΕ1944026 um modo dependente da dose com uma curva -com a forma de um sino, com actividade máxima a cerca de 0,5 μΜ. A Figura 2 mostra que tanto o fosfato de Composto A como o Composto A a 0,5 - 1 μΜ não atenuam a remodelação mediada por VEGF mas em vez disso colaboram com o factor de crescimento de polipéptidos. A Figura 3 mostra que o fosfato de Composto A bem como a formação de tubo estimulada por S1P é inibida de uma forma praticamente completa pela toxina da tosse convulsa (PTX, a 50 ng/mL), um inibidor das proteínas G heterotriméricas do tipo oíí/o. Isto pode ser interpretado como um envolvimento possivel de sinalização mediada pelo receptor EDG-1 (SlPi) de acontecimentos nas bio-reacções estimuladas pelo fosfato de Composto A. A Figura 4 mostra que a esfingosina a 1 μΜ, que ela própria parece ser menos potente que S1P, atenua a capacidade tanto de S1P como do fosfato de Composto A para induzir estruturas do tipo da de capilares, sem apresentar um efeito inibidor da formação de tubos induzida por VEGF. A este respeito, a esfingosina comporta-se de um modo 62 ΡΕ1944026 diferente do Composto A. Os dados indicam que o equilíbrio entre a esfingosina e S1P parece ser criticamente importante para a activação de células endoteliais/angiogénese, com enorme probabilidade através da família de receptores EDG. De modo importante, concentrações elevadas de esfingosina e de Composto A (2 - 5 μΜ) inibem a formação de tubos despoletada por VEGF. A Figura 5 mostra que o tratamento de HUVEC com fosfato de Composto A a 0,5 μΜ pode resultar numa activação temporária de ERK1/2 com um pico de f osf orilação/activação aos 10 minutos e voltando á linha de base aos 20 minutos. A Figura 6

Testou-se se o Composto A, o fosfato do Composto A, a esfingosina ou o S1P também induzem o factor de tecidos em HUVEC. Os dados obtidos demonstram que nenhum destes compostos por si só, ou em combinações, consegue aumentar a actividade do factor de tecidos, tal como se mostra na Figura 6. 0 Composto A e o fosfato de Composto A podem aumentar ligeiramente o factor de tecidos induzido por VEGF mas não o induzido por TNF-a. A Figura 7 mostra o efeito do Composto C num ensaio de formação de tubos mediada por S1P em HUVEC. ΡΕ1944026 63

Utilizam-se as seguintes abreviaturas: BSA: albumina de soro de bovino ECGS: conjunto de factores de crescimento de células endoteliais S: esfingosina JNK1/2: quinase 1/ do terminal N-c-jun

Equivalentes de TF: equivalentes de factor de tecidos EGR-l/NFAT: proteina 1 do inicio nuclear de células T activadas ECL: quimioluminescência aumentada PBS: soro salino tamponizado com fosfato TA: temperatura ambiente

. reacção de crescimento/ factor P: fosfato de Composto A (FTY720-fosfato)

Pode demonstrar-se a utilidade dos agonistas de receptor S1P, por exemplo dos agonistas de S1P que incluam um grupo com a fórmula X, na promoção da angiogénese, por exemplo de acordo com os métodos que se descrevem adiante neste documento. D. Cultura de células e Materiais

Cultivam-se células endoteliais do cordão umbilical humano (HUVEC) a 37°C sob 5 % de CO2 em meio M199 com suplemento de 20 % de SCS (HyClone, Logan, UT) , 1 U/mL de heparina, 50 yg/mL de ECGS, 2 mM em glutamina, com 100 U/mL de penicilina e 0,1 mg/mL de estreptomicina. Utiliza- 64 ΡΕ1944026

se em experiências as células obtidas até à passagem número 5. Obtêm-se HUVEC não alimentadas durante um período de tempo curto cultivando-as em M199 contendo 1 % de SCS durante 5 h. Obtém-se VEGF165 recombinante humano junto da PromoCell (Heidelberg, Alemanha). Os reagentes ERK1/2 fosfo-específico, anticorpos policlonais para quinase p38, anticorpos ERK1/2 não fosfo e reagente luminescente LumiGLO forma obtidos junto da New England BioLabs (Beverly, MA) , os anticorpos policlonais IkB junto da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Calif.)· A imunoglobulina G (IgG) de burro anti-coelho e a IgG de carneiro anti-rato foram adquiridas à Amersham LIFE SCIENCE (Amersham Place, Inglaterra). As membranas de transferência Immobilon-P são produtos da Millipore (Bedford, MA) . Obteve-se S da Sigma Chemical Co.; obteve-se S1P da Biomol. Prepara-se uma solução de partida de fosfato de Composto A recorrendo ao seguinte protocolo. Dissolve-se fosfato de Composto A em metanol traceado com HC1 concentrado (0,5 mg de fosfato de Composto A em 500 yL de metanol contendo 2 yL de HC1) . Evapora-se o solvente da solução resultante em vazio e volta a dissolver-se o resíduo obtido (variante 1) em solução de BSA desengordurado a 0,1 % em água estéril desionizada (500 yL) ou (variante 2) em solução a 0,5 % de Triton X-100 em água desionizada. Sonicam-se as soluções de partida obtidas (2,5 mM) e armazenam-se a 4°C.

Ensaio de Coagulação

Semeiam-se as células em placas com 6 poços a 80-90 % de confluência e deixam-se de um dia para o outro. 65 ΡΕ1944026

Raspam-se as células das placas e analisa-se a actividade do factor de tecidos de acordo com o método descrito em Clauss, M., J. Biol. Chem. 271, 17629-17634 (1996), Mechtcheriakova, D., Blood 93, 3811-3823 (1999). Em suma,

depois de se induzir durante 4 horas com VEGF (1,5 nM) , TNF-oí (100 U/mL) , S (0,5-2 μΜ) , S1P (0,5-2 μΜ) , Composto A (0,5-2 μΜ) , e fosfato de Composto A (0,5-2 μΜ) , lavam-se as células duas vezes e depois raspam-se com 1 mL de tampão de coagulação (12 mM em acetato de sódio, 7 mM em barbitato de dietilo e 130 mM em cloreto de sódio; pH 7,4). Misturam-se 50 pL de nova suspensão das células com 50 pL de plasma citrado, e determinam-se os periodos de coagulação depois de uma recalcificação com 50 pL de uma solução 20 mM de CaCl2 a 37°C. Determinam-se os equivalentes de TF utilizando uma curva padrão obtida com tromboplastina de cérebro de coelho. E. Análise por Transferência Western A seguir a diversos tratamentos, lavam-se as células por duas vezes com PBS frio, lisaram-se em 100 pL de tampão de Laemmli, rasparam-se e aqueceram-se durante 5 minutos a 95°C. Separaram-se os lisados totais por SDS-PAGE transferindo-se para uma membrana Immobilon-P. Bloqueia-se a membrana durante 30 minutos com PBS contendo 0,1 % de Tween 20 e 3 % de leite desnatados e incuba~se durante 1 hora à TA com um anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio. Lava-se a membrana obtida três vezes durante 5 minutos de cada vez com PBS 0,1 % contendo Tween 2 0 e 66 ΡΕ1944026 incuba-se com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase durante 1 hora à TA. Depois de um passo de lavagem, incuba-se a membrana durante 1 minuto com reagente ECL e expõe-se como película, tal como é necessário. Para se voltar a testar com outro anticorpo, lava-se duas vezes a membrana em PBS, limpa-se durante 30 minutos a 55°C com tampão de limpeza (62,5 mM em Tris-HCL, pH 6,8, com 2 % de SDS, 100 mM em 2-mercaptoetanol) e depois lava-se três vezes durante 5 minutos de cada vez com PBS à TA. Armazena-se a membrana húmida embrulhada em SaranWrap a 4°C depois de cada imunodetecção.

Ensaio de angiogénese in vitro sobre Matrigel

Leva-se a cabo a transfromação morfológica de células endoteliais em estruturas do tipo capilar numa Matriz Matrigel com Factor de Crescimento Reduzido (BD Bioscience) seguindo o processo do fabricante. Em suma, tripsinizam-se as HUVEC, voltam a suspender-se em meio M199 isento de soro e contendo inibidor de tripsina, de soja (1 mg/mL, Sigma). Depois de uma centrifugação voltam a suspender-se as células em meio isento de soro a uma densidade de 0,5 x 105 células/mL, e semeia-se a suspensão de células em placas de cultura de células com 96 poços (Costar, Corning Incorporated) previamente revestidas com 50 yL de Matrigel, na ausência ou na presença de diversos estímulos: VEGF a 1,5 nM, S1P a 0,1-2 μΜ, S a 0,5-2 μΜ, Composto A a 0,5-2 μΜ, e fosfato de Composto A a 0,1-2 μΜ. Oito horas depois, fixam-se as células sobre Matrigel com 3 % de formaldeído 67 ΡΕ1944026 em PBS e mantém-se a 4°C. Quantificam-se os resultados a partir das imagens feitas com um microscópio Nikon Diaphot equipado com uma câmara CCD arrefecida (Kappa GmbH, Gleichen, Alemanha) por contagem directa dos pontos de ramificação em dois campos microscópicos de cada poço, obtidos em duplicado. F. Morfogénese de células endotellals induzida por fosfato de Composto A num ensaio de formação in vitro sobre Matrigel e um possível envolvimento de caminho(s) de sinalização mediados por Gi

Determina-se o efeito do Composto A e do fosfato de Composto A sobre a diferenciação morfogénica de células endoteliais utilizando um ensaio de angiogénese in vitro sobre Matrigel. A morfogénese de células endoteliais é um processo complexo que necessita de interacções extracelulares da célula com a matriz, seguindo-se uma remodelação da matriz, uma migração estimulada, interacções entre células, e uma proteólise perivascular. Tal como se ilustra na Figura 1, o fosfato de Composto A consegue promover fortemente a formação de uma rede de tipo capilar de um modo dependente da dose de acordo com uma curva em forma de sino, denotando uma actividade máxima a cerca de 0,5 μΜ. 0 número de pontos de ramificação por campo microscópico, que reflecte a potência da indução por parte do estimulo, é comparável para o fosfato de Composto A e para S1P, e pode ser signif ictivamente maior do que os efeitos depoletados por VEGF. O Composto A ele próprio a 68 ΡΕ1944026 0,5 - 1 μΜ tem um efeito incrementador fraco, em comparação com o do fosfato de Composto A, mas consistente. Tanto o fosfato de Composto A como o Composto A a 0,5 - 1 μΜ não atenuam a remodelação mediada por VEGF mas em vez disso colaboram com o factor de crescimento de polipéptidos (veja-se por exemplo a Figura 2). Além disto, a formação de microtúbulos estimulada por fosfato de Composto A bem como por SlP é completamente inibida pela toxina da tosse convulsa (PTX, a 50 ng/mL), um inibidor das proteínas G heterotriméricas G to tipo oíí/0. Isto pode ser interpretado como devendo-se a um possível envolvimento de acontecimentos de sinalização mediados por receptor EDG-1 (SlPi) nas bio-reacções estimuladas pelo fosfato de Composto A (veja-se por exemplo a Figura 3). Sal μΜ, que parece por si próprio ser menos potente do que SlP, atenua a capacidade tanto de SlP como do fosfato de Composto A para induzir struturas de tipo capilar, sem apresentar um efeito inibidor da formação de tubos por parte de VEGF (veja-se por exemplo a Figura 4) . A este respeito, S comporta-se de um modo diferente do Composto A. Os dados indicam que o equilíbrio entre S e SlP parece ser criticamente importante para a activação de células endoteliais/angiogénese o mais provavelmente através da família de receptores EDG. De um modo importante, concentrações elevadas de S e de Composto A (2 - 5 μΜ) inibiam a formação de tubos despoletada por VEGF. Estes dados sugerem efeitos bifásicos dependentes da dose de Composto A e de fosfato de Composto A sobre a angiogénese in vitro. 69 ΡΕ1944026

G. Activação das quinases de MAP ERK1/2 pelo fosfato de Composto A A transdução de sinal por quinases de MAP desempenha um papel chave numa série de funções das células endoteliais. Tratando HUVEC com fosfato de Composto A a 0,5 μΜ pode resultar numa activação temporária de ERKl/2 com um pico de fosforilação/activação durante 10 minutos, voltando à linha de base passados 20 minutos (veja-se por exemplo a Figura 5) . Não se consegue detectar nenhuma activação da quinase p38 nem de JNK1/2 pelo fosfato de Composto A nas HUVEC. Além disto, o fosfato de Composto A pode despoletar a activação de ERKl/2 de um modo dependente da dose, denotando um máximo de actividade a 2 μΜ. Isto contrasta com os resultados do ensaio de formação de tubos, nos quais o fosfato do Composto A a 2 μΜ pode ser menos potente do que a 0,5 μΜ. Nem o Composto A nem S são capazes de induzir a activação da quinase de MAP em células endoteliais com uma cinética de tratamento na gama de entre 5 minutos e 60 minutos. Para se estimar o papel possivel do programa inflamatório/dependente de NFkB nas bio-reacções estimuladas pelo fosfato do Composto A em células endoteliais, voltam a sondar-se as membranas com anticorpos anti-ΙκΒ. Os teores em IkB não são afectados pelo tratamento com fosfato de Composto A. Além disto o tratamento de células endoteliais com fosfato de Composto A pode não conseguir induzir a expressão de E-Selectina como gene secundário reactivo dependente de NFkB. Deste modo, os 70 ΡΕ1944026 dados indicam fortemente que a sinalização do fosfato de Composto A não envolve a activação de NFkB - principal cascata na reacção inflamatória aguda nas células endoteliais. Η. O Composto A e o fosfato de Composto A não induzem a expressão do factor de tecidos nas células endoteliais

Um aspecto caracteristico importante tanto do estimulo inflamatório clássico TNF-α como do factor de crescimento angiogénico principal VEGF nas células endoteliais é a sua potência para regular em alta o factor de tecidos. 0 Composto A, o fosfato do Composto A, S ou S1P são testados para se saber se também induzem factor de tecidos nas HUVEC. Os dados obtidos demonstram que nenhum destes compostos por si só ou em combinações consegue aumentar a actividade do factor de tecidos (veja-se por exemplo a Figura 6) . 0 Composto A o fosfato de Composto A podem aumentar ligeiramente o factor de tecidos induzido por VEGF mas não o induzido por TNF-α. 0 conjunto dos dados obtidos indica que o Composto A, o fosfato do Composto A, S e S1P funcionam mecanisticamente de modos diferentes dos do VEGF angiogénico e do TNF-α inflamatório. I. Pode determinar-se a finidade de ligação dos agonistas de receptor S1P a receptores S1P humanos individuais pelo seguinte processo: 71 ΡΕ1944026

Transfecgão temporária de receptores S1P humanos em células HEK293

Clonam-se receptores EDG e proteínas G±, e misturam-se quantidades iguais de 4 cADN para o receptor EDG, para Gí-oí, para Gi-β e para Gi-γ, utilizando-se para transfectar monocamadas de células HEK293 utilizando o método do precipitado de fosfato de cálcio (M. Wigler et al., Cell. 1977; 11; 223 e DS. Im et al., Mol. Pharmacol. 2000; 57; 753) . Em suma, adiciona-se uma mistura de ADN contendo 25 yg de ADN e CaCl2 0,25 M a Na2HP04 2 mM tampo-nizado com HEPES. Envenenam-se monocamadas subconfluentes de células HEK293 com cloroquina 25 mM, e depois aplica-se o ADN precipitado sobre as células. Passadas 4 h, lavam-se as monocamadas com soro salino tamponizado com fosfato e voltam a colocar-se em meio (90 % de meio essencial modificado da Dulbecco (DMEM) a 1:1 com F-12 + 10 % de soro fetal de bovino). Colhem-se as células 48-72 h depois da adição do ADN raspando no tampão HME (em mM: 20 em HEPES, 5 em MgCl2, 1 em EDTA, pH 7,4) contendo 10 % de sacarose, sobre gelo, e quebram-se utilizando um homogeneizador Dounce. Depois de uma centrifugação a 800xg, dilui-se o sobrenadante com HME sem sacarose e centrifuga-se a 100,000xg durante 1 h. Volta a homogeneizar-se a pastilha obtida e centrifuga-se durante mais uma hora a 100,000xg. Esta pastilha de membranas em bruto é de novo suspensa em HME com sacarose, divide-se em aliquotas, e congela-se rapidamente por imersão em azoto líquidos. Armazenam-se as membranas a 70°C. Determina-se a concentração proteica 72 ΡΕ1944026 espectroscopicamente recorrendo à determinação de proteínas de Bradford.

Ensaio de ligação a GTPyS utilizando preparações de receptor SlP/membrana de HEK293

Levam-se a cabo os ensaios de ligação a GTPyS tal como descrito em DS. Im et al., Mol. Pharmacol. 2000; 57: 753. Mede-se a ligação mediada por ligando de GTPyS a proteínas G em tampão de ligação a GTP (em mM: 50 em HEPES, 100 em NaCl, 10 em MgCl2, pH 7,5) utilizando 25 yg de uma preparação de membranas de células HEK293 temporariamente transfectadas. Adiciona-se ligando a membranas na presença de GDP 10 μΜ e de [35S]GTPyS 0,1 nM (a 1.200 Ci/mmol) e incuba-se a 30°C durante 30 minutos. Separa-se a GTPyS ligada da não ligada utilizando o dispositivo de colheita Brandel (Gaithersburg, MD) e conta-se com um contador de cintilação líquida.

Lisboa, 12 de setembro de 2013

Claims

ΡΕ1944026 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um agonista de receptor S1P que seja um composto com a fórmula IX R

na qual Rif seja halogéneo, tri-halometilo, hidroxilo, alquilo inferior contendo 1 a 7 átomos de carbono, fenilo, aralquilo, alcoxilo inferior contendo 1 a 4 átomos de carbono, trifluorometiloxilo, fenoxilo, ciclo-hexilmetiloxilo, aralquiloxilo substituído ou não substituído, piridilmetiloxilo, cinamiloxilo, naftilmetiloxilo, fenoximetilo, hidroximetilo, hidroxietilo, alquiltio inferior contendo 1 a 4 átomos de carbono, alquilsulfinilo inferior contendo 1 a 4 átomos de carbono, alquilsulfonilo inferior contendo 1 a 4 átomos de carbono, benziltio, acetilo, nitro ou ciano; R2f seja hidrogénio, halogéneo, tri-halometilo, alcoxilo inferior contendo 1 a 4 átomos de carbono, alquilo inferior contendo 1 a 7 átomos de carbono, fenetilo, ou benziloxilo; 2 ΡΕ1944026 R3f seja hidrogénio, halogéneo, trifluorometilo, alcoxilo inferior contendo 1 a 4 átomos de carbono, hidroxilo, benziloxilo, alquilo inferior contendo 1 a 7 átomos de carbono, fenilo ou alcoximetilo inferior contendo 1 a 4 átomos de carbono; Xf seja O ou S; e nf seja um inteiro de 1 a 4, ou um seu sal farmacologicamente aceitável, para utilização num método de evitar ou de tratar doenças mediadas por um processo de neo-angiogénese ou associadas a uma angiogénese desregulada, em que as doenças referidas sejam seleccionadas de entre o conjunto constituído por cancro, angiogénese do miocárdio, cicatrização de feridas e disfunção vascular diabética ou vasculopatia.
2. Um agonista de receptor S1P para utilização de acordo com a reivindicação 1, para evitar e para tratar tumores sólidos.
3. Um agonista de receptor S1P para utilização de acordo com a reivindicação 1, para inibir o crescimento de tumores sólidos ou para tratar a invasividade de tumores sólidos ou os sintomas associados com esse crescimento tumoral. 3 ΡΕ1944026
4. Um agonista de receptor S1P com a fórmula IX tal como definida na reivindicação 1, ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, para utilização num método para evitar ou para tratar doenças mediadas por um processo de neo-angiogénese ou associadas a uma angiogénese desregulada, em que as doenças referidas sejam seleccionadas de entre o conjunto constituído por cancro, angiogénese do miocárdio, cicatrização de feridas, disfunção vascular diabética ou vasculopatia, patologias linfoproliferativas e mieloproliferativas, em que se administre o agonista de receptor S1P concomitantemente ou sequencialmente com um agente quimioterapêutico.
5. Um agonista de receptor S1P para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o agente quimioterapêutico seja seleccionado de entre i. um inibidor de aromatase, ii. um anti estrogénico, um anti androgénico ou um agonista de gonadorelina, iii. um inibidor de topoisomerase I ou um inibidor de topoisomerase II, iv. um agente activo em microtúbulos, um agente alquilante, um antimetabolito antineoplásico ou um composto de platina, ΡΕ1944026 4 v. um composto alvejando/diminuindo a acti-vidade de uma quinase de proteína ou de lípido ou a actividade de uma fosfatase de proteína ou de lípido, um composto anti-angiogénico adicional ou um composto que induza processos de diferenciação celular, vi. um receptor de bradiquinina ou um antagonista de angiotensina II, vii. um inibidor de ciclo-oxigenase, um bis-fosfonato, um inibidor de histona desacetilase, um inibidor de heparanase, um modificador da reacção biológica, um inibidor da ubiquiti-nação, ou um inibidor que bloqueie caminhos anti-apoptóticos, viii. um inibidor das isoformas oncogénicas de Ras, ix. um inibidor de telomerase, x. um inibidor de protease, um inibidor de metaloproteinase da matriz, um inibidor de metionina aminopeptidase, ou um inibidor do proteossoma, e/ou xi) um inibidor de mTOR. 5 ΡΕ1944026
6. Um agonista do receptor S1P para utilização de acordo com a reivindicação 4 ou com a reivindicação 5, para evitar ou para tratar tumores do sangue ou do sistema linfático ou o cancro mielóide.
7. Um agonista do receptor S1P para utilização de acordo com a reivindicação 4, em combinação com um agente quimioterapêutico, para tratar um cancro linfático ou mielóide, em que o agente quimioterapêutico seja seleccionado de entre busulfan, citarabina, 6-tioguanina, fludarabina, hidroxi-ureia, procarbazina, bleomicina e metotrexato.
8. Um agonista do receptor S1P para utilização de acordo com a reivindicação 4, em combinação com um agente quimioterapêutico, para tratar um cancro linfático, em que o agente quimioterapêutico seja seleccionado de entre a daunorrubicina e o imatinib.
9. Um agonista do receptor S1P para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que se administre intermitentemente o agonista do receptor S1P.
10. Um agonista do receptor S1P tal como se definiu na reivindicação 1, para utilização na prevenção ou no tratamento de doenças mediadas pela inibição do processo de neo-angiogénese, em que as doenças referidas sejam seleccionadas de entre o conjunto constituido por cancro, 6 ΡΕ1944026 angiogénese do miocárdio, cicatrização de feridas e disfunção vascular diabética ou vasculopatia.
11. Um agonista do receptor S1P para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o S1P agonista do receptor seja 2-amino-2-[4-(benziloxifeniltio)-2-clorofenil]propil-1,3-propano-diol ou 2-amino-2-[4-(3-benziloxifenoxi)-2-clorofenil]propil-1,3-propano-diol, sob forma livre ou a de um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico. Lisboa, 12 de setembro de 2013