PT1771208E

PT1771208E - Utilização de derivados de tioflavina radiorotulados em imagiologia amiloide para avaliar terapias anti-amiloide

Info

Publication number: PT1771208E
Application number: PT57875577T
Authority: PT
Inventors: William E Klunk; Chester A Mathis
Original assignee: Univ Pittsburgh
Priority date: 2004-07-02
Filing date: 2005-07-01
Publication date: 2013-09-24
Also published as: WO2006014381A3; US8343457B2; DK1771208T3; CA2587248C; US20130045164A1; JP2008505115A; NO339187B1; US8580229B2; AU2005270026A1; CA2830939A1; ES2427963T3; CA2587248A1; CA2830939C; SI1771208T1; CY1114644T1; US20140105820A1; RU2007104107A; BRPI0512893A; NO20070593L; WO2006014381A9

Description

ΕΡ 1 516 628/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Formulação de proteína liofilizada isotónica estável" Antecedentes do invento

Campo do invento

Este invento é dirigido a uma formulação de proteína liofilizada. Em particular, refere-se a uma formulação de proteína liofilizada estável que pode ser reconstituída com um diluente para gerar uma formulação reconstituída estável adequada para administração subcutânea.

Descrição de revelações relacionadas

Nos últimos dez anos, os avanços na biotecnologia têm tornado possível produzir uma variedade de proteínas para aplicações farmacêuticas utilizando técnicas de ADN recombinante. Porque as proteínas são maiores e mais complexas do que os fármacos orgânicos e inorgânicos tradicionais (i.e. possuindo múltiplos grupos funcionais para além de estruturas tridimensionais complexas), a formulação destas proteínas coloca problemas especiais. Para que uma proteína permaneça biologicamente activa, uma formulação tem de preservar intacta a integridade de conformação de pelo menos uma sequência nuclear dos aminoácidos da proteína ao mesmo tempo protegendo da degradação os múltiplos grupos funcionais da proteína. Percursos de degradação para proteínas podem envolver instabilidade química (i.e. qualquer processo que envolve modificação da proteína por formação ou clivagem de ligações resultando numa nova entidade química) ou instabilidade física (i.e. alterações na estrutura de ordem mais elevada da proteína). A instabilidade química pode resultar de desamidação, racemização, hidrólise, oxidação, eliminação beta ou permuta de dissulfureto. A instabilidade física pode resultar de desnaturação, agregação, precipitação ou adsorção, por exemplo. Os três percursos mais comuns de degradação de proteína são agregação, desamidação e oxidação de proteína. Cleland et ai. Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993). 2 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ A crio-dessecação é uma técnica habitualmente utilizada para preservação de proteínas que serve para remover a água da preparação de proteína de interesse. A crio-dessecação, ou liofilização, é um processo pelo qual o material a ser seco é primeiro congelado e depois o gelo ou solvente congelado é removido por sublimação num ambiente de vácuo. Pode-se incluir um excipiente em formulações pré-liofilizadas para melhorar a estabilidade durante o processo de crio-dessecação e/ou para melhorar a estabilidade do produto liofilizado durante o armazenamento. Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) e Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991). A EP-A-661060 refere-se a formulações de imunoglobulina estáveis, toleráveis IV, possuindo um teor de Ig de 13,5-17,5% p/v, com uma osmolaridade de 250-600 mOs/1, e uma viscosidade não superior a 9 cP. É afirmado que esta pode ser utilizada como uma preparação altamente concentrada sem viscosidade indevidamente elevada, que é um problema para a administração IV. A preocupação é assim com a viscosidade da formulação resultante, e não com o fabrico da formulação em si mesmo. Embora exista menção à possibilidade de liofilização, não existe qualquer exemplificação da mesma, e não são reconhecidos quaisquer problemas que possam estar associados à mesma. É um objectivo do presente invento proporcionar uma formulação de proteína liofilizada que seja estável no armazenamento e entrega. É aqui revelada uma formulação de proteína reconstituída estável que é adequada para administração subcutânea. Em certas concretizações, é um objectivo proporcionar uma formulação multiutilização que seja estável pelo menos o tempo durante o qual será administrada a um paciente.

Sumário do invento

Este invento é baseado na constatação de que uma formulação de proteína liofilizada estável pode ser preparada utilizando um lioprotector (preferivelmente um açúcar tal como sacarose ou trealose), formulação liofilizada que pode ser reconstituída para gerar uma formulação reconstituída estável possuindo uma concentração de proteína que é 3 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ significativamente mais elevada (e.g. de cerca de 2-40 vezes mais elevada, preferivelmente 3-10 vezes mais elevada e muito preferivelmente 3-6 vezes mais elevada) do que a concentração de proteína na formulação pré-liofilizada. Em particular, enquanto a concentração de proteína na formulação pré-liofilizada pode ser 5 mg/mL ou menos, a concentração de proteína na formulação reconstituída é geralmente 50 mg/mL ou mais. Estas elevadas concentrações de proteína na formulação reconstituída são consideradas particularmente úteis quando a formulação se destina a administração subcutânea. Apesar da concentração muito elevada de proteína na formulação reconstituída, constatou-se que a formulação reconstituída é estável (i.e. não apresenta níveis significativos ou inaceitáveis de instabilidade química ou física da proteína) a 2-8°C durante pelo menos cerca de 30 dias. Em certas concretizações, a formulação reconstituída é isotónica. Apesar da utilização de concentrações mais baixas do lioprotector para conseguir estas formulações isotónicas após reconstituição, constatou-se aqui que a proteína na formulação liofilizada mantém essencialmente a sua integridade e estabilidade física e química após liofilização e durante o armazenamento.

Quando reconstituída com um diluente compreendendo um conservante (tal como água bacteriostática para injecção, BWFI), a formulação reconstituída pode ser utlizada como uma formulação multiutilização. Uma tal formulação é útil, por exemplo, quando o paciente requer administrações subcutâneas frequentes da proteína para tratar uma condição médica crónica. A vantagem de uma formulação multiutilização é que esta proporciona facilidade de utilização para o paciente, reduz o desperdício ao permitir a utilização total do conteúdo do frasco e resulta em economias de custos significativas para o fabricante, uma vez que várias doses são embaladas num único frasco (menores custos de enchimento e expedição). É aqui revelada uma formulação reconstituída isotónica estável compreendendo uma proteína numa quantidade de pelo menos cerca de 50 mg/mL e um diluente, formulação reconstituída que foi preparada a partir de uma mistura liofilizada de uma proteína e um lioprotector, onde a 4 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ concentração de proteína na formulação reconstituída é cerca de 2-40 vezes mais elevada do que a concentração de proteína na mistura antes da liofilização. É aqui revelada uma formulação reconstituída estável compreendendo um anticorpo numa quantidade de pelo menos cerca de 50 mg/mL e um diluente, formulação reconstituída que foi preparada a partir de uma mistura liofilizada de um anticorpo e um lioprotector, onde a concentração de anticorpo na formulação reconstituída é cerca de 2-40 vezes mais elevada do que a concentração de anticorpo na mistura antes da liofilização. A proporção de lioprotectorrproteína na formulação liofilizada dos parágrafos precedentes depende, por exemplo, tanto da proteína como do lioprotector escolhidos, bem como da concentração de proteína desejada e da isotonicidade da formulação reconstituída. No caso de um anticorpo a todo o comprimento (como a proteína) e de trealose ou sacarose (como o lioprotector) para gerar uma formulação reconstituída isotónica de concentração elevada de proteína, a proporção pode ser, por exemplo, 200-600 moles de trealose ou sacarose para 1 mole de anticorpo.

Geralmente, a formulação pré-liofilizada da proteína e lioprotector incluirá adicionalmente um tampão que proporciona a formulação a um pH adequado, dependendo da proteína na formulação. Para este propósito, constatou-se ser desejável utilizar um tampão de histidina pelo facto de, como demonstrado abaixo, este perecer ter propriedades lioprotectoras. A formulação pode incluir adicionalmente um tensioactivo (e.g. um polissorbato) pelo facto de se ter aqui observado que este pode reduzir a agregação da proteína reconstituída e/ou reduzir a formação de particulados na formulação reconstituída. O tensioactivo pode ser adicionado à formulação pré-liofilizada, à formulação liofilizada e/ou à formulação reconstituída (mas preferivelmente à formulação pré-liofilizada) conforme desejado. 5 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ É aqui revelado um método para preparação de uma formulação reconstituída isotónica estável compreendendo a reconstituição de um mistura liofilizada de uma proteína e um lioprotector num diluente tal que a concentração de proteína na formulação reconstituída é pelo menos 50 mq/mL, onde a concentração de proteína na formulação reconstituída é cerca de 2-40 vezes mais elevada do que a concentração de proteína na mistura antes da liofilização. É aqui revelado um método para preparação de uma formulação compreendendo os passos de: (a) liofilização de uma mistura de uma proteína e um lioprotector; e (b) reconstituição da mistura liofilizada do passo (a) num diluente tal que a formulação reconstituída é isotónica e estável e tem uma concentração de proteína de pelo menos cerca de 50 mg/mL. Por exemplo, a concentração de proteína na formulação reconstituída pode ser de cerca de 80 mg/mL a cerca de 300 mg/mL. Geralmente, a concentração de proteína na formulação reconstituída é cerca de 2-40 vezes mais elevada do que a concentração de proteína na mistura antes da liofilização. É também aqui revelado um artigo fabricado que compreende: (a) um recipiente que contém uma mistura liofilizada de uma proteína e um lioprotector; e (b) instruções para reconstituição da mistura liofilizada com um diluente até uma concentração de proteína na formulação reconstituída de pelo menos cerca de 50 mg/mL. O artigo fabricado pode compreender adicionalmente um segundo recipiente que contém um diluente (e.g. água bacteriostática para injecção (BWFI) compreendendo um álcool aromático). É aqui revelado um método para tratamento de um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação reconstituída aqui revelada a um mamífero, onde o mamífero tem uma perturbação requerendo tratamento com a proteína na formulação. Por exemplo, a formulação pode ser administrada subcutaneamente.

Constatou-se que uma formulação pré-liofilizada útil de anticorpo anti-HER2, conforme identificado nas experiências detalhadas abaixo, compreende um anticorpo anti-HER2 numa 6 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ quantidade de cerca de 5-40 mg/mL (e.g. 20-30 mg/mL) e sacarose ou trealose numa quantidade de cerca de 10-100 mM (e.g. 40-80 mM), um tampão (e.g. histidina, pH 6, ou sucinato, pH 5) e um tensioactivo (e.g. um polissorbato). Constatou-se que a formulação liofilizada é estável a 40°C durante pelo menos 3 meses e estável a 30°C durante pelo menos 6 meses. Esta formulação anti-HER2 pode ser reconstituída com um diluente para gerar uma formulação adequada para administração intravenosa compreendendo anti-HER2 numa quantidade de cerca de 10-30 mg/mL que é estável a 2-8°C durante pelo menos cerca de 30 dias. Onde se desejam concentrações mais elevadas do anticorpo anti-HER2 (por exemplo nos casos em que a entrega subcutânea do anticorpo é o modo de administração pretendido ao paciente), a formulação liofilizada pode ser reconstituída para produzir uma formulação reconstituída estável possuindo uma concentração de proteína de 50 mg/mL ou mais.

Uma formulação pré-liofilizada desejável de anticorpo anti-IgE aqui identificada inclui anticorpo anti-IgE numa quantidade de cerca de 5-40 mg/mL (e.g. 20-30 mg/mL) e sacarose ou trealose numa quantidade de cerca de 60-300 mM (e.g. 80-170 mM) , um tampão (preferivelmente histidina, pH 6) e um tensioactivo (tal como um polissorbato). A formulação liofilizada de anti-IgE é estável a 30°C durante pelo menos 1 ano. Esta formulação pode ser reconstituída para produzir uma formulação compreendendo anti-IgE numa quantidade de cerca de 15-45 mg/mL (e.g. 15-25 mg/mL) adequada para administração intravenosa que é estável a 2-8°C durante pelo menos 1 ano. Alternativamente, onde se desejam concentrações mais elevadas de anti-IgE na formulação, a formulação liofilizada pode ser reconstituída de modo a gerar uma formulação estável possuindo uma concentração de anti-IgE á50 mg/mL.

Breve descrição dos desenhos A Figura 1 mostra o efeito do volume de reconstituição sobre a estabilidade de rhuMAb HER2 liofilizado. A formulação liofilizada foi preparada a partir de uma formulação pré-liofilização compreendendo 25 mg/mL de proteína, trealose 60 mM, sucinato de sódio 5 mM, pH 5,0, e 0,01% de Tween 20™. 0 bolo liofilizado foi incubado a 40°C e depois reconstituído 7 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ com 4,0 (ο) ou 20,0 mL (·) de BWFI. A fracção de proteína intacta na formulação reconstituída foi medida por cromatografia de exclusão de tamanhos nativa e definida como a área de pico da proteína nativa em relação à área de pico total incluindo agregados. A Figura 2 ilustra o efeito da concentração de trealose sobre a estabilidade de rhuMAb HER2 liofilizado. A proteína foi liofilizada a 25 mg/mL em sucinato de sódio 5 mM, pH 5,0 (círculos) ou histidina 5 mM, pH 6,0 (quadrados) e concentrações de trealose variando desde 60 mM (proporção molar de 360) a 200 mM (proporção molar de 1200). A proteína liofilizada foi incubada a 40°C quer durante 30 dias (símbolos a cheio) quer durante 91 dias (símbolos a branco). A quantidade de proteína intacta foi medida após reconstituição da proteína liofilizada com 20 mL de BWFI. A Figura 3 demonstra o efeito da concentração de trealose sobre a estabilidade a longo prazo de rhuMAb HER2 liofilizado armazenado a 40°C. A proteína foi liofilizada quer a 25 mg/mL em sucinato de sódio 5 mM, pH 5,0, 0,01% de Tween 20™ e trealose 60 mM () ou em histidina 5 mM, pH 6,0, 0,01% de Tween 20™ e trealose 60 mM (□) quer a 21 mg/mL em sucinato de sódio 10 mM, pH 5,0, 0,2% de Tween 20™ e trealose 250 mM (·). A proteína liofilizada foi incubada a 40°C e depois reconstituída com 20 mL de BWFI. A quantidade de proteína intacta foi medida após reconstituição. A Figura 4 mostra a estabilidade de rhuMAb HER2 liofilizado em manitol 38,4 mM (7 mg/mL), sacarose 20,4 mM (7 mg/mL), histidina 5 mM, pH 6,0, 0,01% de Tween 20™. A proteína liofilizada foi incubada a 40°C e depois reconstituída quer com 4,0 mL (o) quer com 20 mL (·) de BWFI. A quantidade de proteína intacta foi medida após reconstituição. A Figura 5 demonstra a estabilidade de rhuMAb HER2 reconstituído liofilizado em sucinato de sódio 5 mM, pH 5,0, trealose 60 mM, 0,01% de Tween 20™. As amostras foram reconstituídas quer com 4,0 mL (quadrados) quer com 20,0 mL (círculos) de BWFI (20 mL: álcool benzílico a 0,9%; 4 mL: álcool benzílico a 1,1%) e depois armazenadas a 5°C (símbolos 8 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ a cheio) ou a 25°C (símbolos a branco). A % de proteína nativa foi definida como a área de pico da proteína nativa (não degradada) em relação à área de pico total conforme medida por cromatografia de permuta de catiões. A Figura 6 mostra a estabilidade de rhuMAb HER2 reconstituído liofilizado em histidina 5 mM, pH 6,0, trealose 60 mM, 0,01% de Tween 20. As amostras foram reconstituídas quer com 4,0 mL (quadrados) quer com 20,0 mL (círculos) de BWFI (20 mL: álcool benzílico a 0,9%; 4 mL: 1,1% de álcool benzílico) e depois armazenadas a 5°C (símbolos a cheio) ou a 25°C (símbolos a branco). A % de proteína nativa foi definida como a área de pico da proteína nativa (não degradada) em relação à área de pico total conforme medida por cromatografia de permuta de catiões. A Figura 7 revela a estabilidade de rhuMAb HER2 reconstituído liofilizado em histidina 5 mM, pH 6,0, manitol 38,4 mM, sacarose 20,4 mM, 0,01% de Tween 20. As amostras foram reconstituídas quer com 4,0 mL (quadrados) quer com 20,0 mL (círculos) de BWFI (20 mL: álcool benzílico a 0,9%; 4 mL: álcool benzílico a 1,1%) e depois armazenadas a 5°C (símbolos a cheio) ou a 25°C (símbolos a branco). A % de proteína nativa foi definida como a área de pico da proteína nativa (não degradada) em relação à área de pico total conforme medida por cromatografia de permuta de catiões. A Figura 8 mostra a estabilidade de rhuMAb HER2 reconstituído liofilizado em sucinato de sódio 10 mM, pH 5,0, trealose 250 mM, 0,2% de Tween 20. As amostras foram reconstituídas com 20,0 mL de BWFI (álcool benzílico a 0,9%) e depois armazenadas a 5°C (·) ou a 25°C (o). A % de proteína nativa foi definida como a área de pico da proteína nativa (não degradada) em relação à área de pico total conforme medida por cromatografia de permuta de catiões. A Figura 9 mostra a agregação de rhuMAb E25 formulado em tampões variando desde pH 5 a pH 7 para uma concentração de tampão de 10 mM e uma concentração de anticorpo de 5 mg/mL. As amostras foram liofilizadas e ensaiadas no instante zero e após 4 semanas, 8 semanas e 52 semanas de armazenamento a 2-8°C. Os tampões foram: fosfato de potássio pH 7,0 (o); 9 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ fosfato de sódio pH 7,0 (□) ; histidina pH 7,0 (o); sucinato de sódio pH 6,5 (·); sucinato de sódio pH 6,0 (); sucinato de sódio pH 5,5 (♦) ; e sucinato de sódio pH 5,0 (A). A Figura 10 ilustra a agregação de rhuMAb E25 liofilizado em tampão histidina 5 mM a pH 6 e a pH 7 e ensaiada após armazenamento como se segue. O tampão foi: a pH 6,0 armazenado a 2-8°C (o); a pH 6 armazenado a 25°C (□) ; a pH 6 armazenado a 40°C (0); a pH 7 armazenado a 2-8°C (·); a pH 7 armazenado a 25°C (); e a pH 7 armazenado a 40°C (♦) . A Figura 11 ilustra a agregação de 5 mg/mL de rhuMAb E25 formulado em sucinato de sódio 10 mM a pH 5,0 com lioprotector adicionado numa concentração de 275 mM (isotónica). Os lioprotectores foram: controlo, nenhum lioprotector (o) ; manitol (□) ; lactose (0) ; maltose (·) ; trealose () ; e sacarose (♦) . As amostras foram liofilizadas e ensaiadas no instante zero e após 4 semanas, 8 semanas e 52 semanas de armazenamento a 2-8°C. A Figura 12 mostra a agregação de 5 mg/mL de rhuMAb E25 formulado em sucinato de sódio 10 mM a pH 5,0 com lioprotector adicionado numa concentração de 275 mM (isotónica). Os lioprotectores foram: controlo, nenhum lioprotector (o); manitol (□) ; lactose (0) ; maltose (·) ; trealose () ; e sacarose (♦) . As amostras foram liofilizadas e ensaiadas no instante zero e após 4 semanas, 8 semanas e 52 semanas de armazenamento a 40°C. A Figura 13 ilustra a cromatografia de interacção hidrofóbica de 20 mg/mL de rhuMAb E25 liofilizado em tampão de histidina a pH 6 com uma concentração isotónica (i.e. 275 mM) de lactose, armazenado durante 24 semanas a 2-8, 25 ou 40°C, e reconstituído para 20 mg/mL. A Figura 14 mostra a cromatografia de interacção hidrofóbica de 20 mg/mL de rhuMAb E25 liofilizado em tampão de histidina a pH 6, armazenado durante 24 semanas a 2-8, 25 ou 40°C, e reconstituído para 20 mg/mL. 10 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ A Figura 15 ilustra a cromatografia de interacção hidrofóbica de 20 mg/mL de rhuMAb E25 liofilizado em tampão de histidina a pH 6, com uma concentração isotónica (i.e. 275 mM) de sacarose e armazenado durante 24 semanas a 2-8, 25 ou 40°C, e reconstituído para 20 mg/mL. A Figura 16 ilustra o efeito da concentração de açúcar sobre rhuMAb E25 formulado a 20 mg/mL em histidina 5 mM a pH 6,0. Sacarose (·) e trealose (□) foram adicionados à formulação em proporções molares variando de 0 a 2010 (isotónica) (ver Tabela 1 abaixo). As amostras foram liofilizadas e ensaiadas após 12 semanas de armazenamento a 50 °C. TABELA 1

Moles de açúcar : anticorpo E25 Cone. de açúcar (mM) 0 0 260 34, 4 380 51,6 510 68,8 760 103,1 1020 137,5 1530 206,3 2010 275 A Figura 17 revela a agregação de rhuMAb E25 formulado a 25 mg/mL em histidina 5 mM a pH 6 com sacarose 85 mM (o) ; trealose 85 mM (□); sacarose 161 mM (♦) ou trealose 161 mM (A). As amostras foram liofilizadas e armazenadas a 2-8°C seguindo-se reconstituição com álcool benzílico a 0,9% até 100 mg/mL de anticorpo em histidina 20 mM a pH 6 com concentrações de açúcar isotónicas (340 mM) e hipertónicas (644 mM). A Figura 18 mostra a agregação de rhuMAb E25 formulado a 25 mg/mL em histidina 5 mM a pH 6 com sacarose 85 mM (o); trealose 85 mM (□); sacarose 161 mM (♦) ou trealose 161 mM (A). As amostras foram liofilizadas e armazenadas a 30°C seguindo-se reconstituição com álcool benzílico a 0,9% até 100 mg/mL de anticorpo em histidina 20 mM a pH 6 com 11 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ concentrações de açúcar isotónicas (340 mM) e hipertónicas (644 mM). A Figura 19 ilustra a agregação de rhuMAb E25 formulado a 25 mg/mL em histidina 5 mM a pH 6 com sacarose 85 mM (o); trealose 85 mM (□); sacarose 161 mM (♦) ou trealose 161 mM (A). As amostras foram liofilizadas e armazenadas a 50°C seguindo-se reconstituição com álcool benzilico a 0,9% até 100 mg/mL de anticorpo em histidina 20 mM a pH 6 com concentrações de açúcar isotónicas (340 mM) e hipertónicas (644 mM).

Descrição detalhada das concretizações preferidas I. Definições

Por "proteína" pretende-se significar uma sequência de aminoácidos para a qual o comprimento de cadeia é suficiente para produzir os níveis mais elevados de estrutura terciária e/ou quaternária. Isto é para distinguir de "péptidos" ou de outros fármacos de baixo peso molecular que não têm esta estrutura. Tipicamente, a proteína terá aqui um peso molecular de pelo menos cerca de 15-20 kD, preferivelmente pelo menos cerca de 20 kD.

Exemplos de proteínas aqui incluídas dentro da definição incluem proteínas de mamífero, tais como, e.g., hormona de crescimento, incluindo hormona de crescimento de humano e hormona de crescimento de bovino; factor de libertação de hormona de crescimento; hormona paratiroideia; hormona estimulante da tiróide; lipoproteínas; α-1-antitripsina; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; pró-insulina; hormona estimulante de folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulação tais como factor VIIIC, factor IX, factor de tecido, e factor de von Willebrands; factores anticoagulação tais como Proteína C; factor natriurético atrial; tensioactivo de pulmão; um activador de plasminogénio, tal como uroquinase ou activador de plasminogénio do tipo tecido (t-PA); bombazina; trombina; factor de necrose de tumor α e β; encefalinase; RANTES (regulado na activação normalmente expresso e segregado em células T) ; proteína inflamatória de macrófago de humano 12 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ (ΜΙΡ-1-α) ; albumina de soro tal como albumina de soro de humano; substância inibidora mulleriana; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; pró-relaxina; péptido associado a gonadotropina de ratinho; DNase; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas ou factores de crescimento; uma integrina; proteína A ou D; factores reumatóides; um factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5 ou 6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6), ou um factor de crescimento de nervo tal como NGF-β; factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crescimento de fibroblasto tal como aFGF e bFGF; factor de crescimento epidérmico (EGF); factor de crescimento transformante (TGF) tal como TGF-α e TGF-β, incluindo TGF-βΙ, TGF^2, TGF^3, TGF-βΙ ou TGF^5; factor de crescimento I e II do tipo insulina (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I de cérebro); proteínas de ligação de factor de crescimento do tipo insulina; proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina (EPO); trombopoietina (TPO); factores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética de osso (BMP) ; um interferão tal como interferão-α, β e γ; factores estimulantes de colónias (CSFs), e.g., M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (ILs), e.g., IL-1 a IL-10; superóxido-dismutase; receptores de células T; proteínas de membrana de superfície; factor de aceleração de decaimento (DAF); um antigénio virai tal como, por exemplo, uma porção do envelope AIDS; proteínas de transporte; receptores homing; adressinas; proteínas reguladoras; imunoadesinas; anticorpos; e fragmentos ou variantes biologicamente activos de quaisquer dos polipéptidos listados acima. A proteina que é formulada está preferivelmente essencialmente pura e é desejavelmente essencialmente homogénea (i.e. isenta de proteínas contaminantes etc.). Proteína "essencialmente pura" significa uma composição compreendendo pelo menos cerca de 90% em peso da proteína, com base no peso total da composição, preferivelmente pelo menos cerca de 95% em peso. Proteína "essencialmente homogénea" significa uma composição compreendendo pelo menos cerca de 99% em peso de proteína, com base no peso total da composição. 13 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ A proteína pode ser um anticorpo. 0 anticorpo pode-se ligar a qualquer das moléculas acima mencionadas, por exemplo. Exemplos de alvos moleculares para anticorpos incluem proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 e CD34; membros da família de receptores HER tais como o receptor de EGF, receptores HER2, HER3 ou HER4; moléculas de adesão celular tais como LFA-1, Moí, pl50,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina αν/β3 incluindo qualquer das suas subunidades α ou β (e.g. anticorpos anti-CDlla, anti-CD18 ou anti-CDllb); factores de crescimento tais como VEGF; IgE; antigénios de grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidade (OB); proteína C etc. 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos a todo o comprimento que possuem uma região Fc de imunoglobulina) , composições de anticorpo com especificidade poliepitópica, anticorpos biespecíficos, diacorpos e moléculas de cadeia simples, bem como fragmentos de anticorpo (e.g., Fab, F(ab')2, e Fv) . 0 termo "anticorpo monoclonal" como aqui utilizado refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, i.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos com excepção de possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Para além disso, em contraste com preparações anticorpo convencionais (policlonais) que incluem tipicamente anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante sobre o antigénio. Para além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos pelo facto de serem sintetizados pela cultura de hibridoma, não contaminados por outras imunoglobulinas. 0 modificador "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, e não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com o presente 14 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ invento podem ser preparados pelo método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser preparados por métodos de ADN recombinante (ver, e.g.f patente dos E.U.A. N.° 4816567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpo de fago utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.

Os anticorpos monoclonais incluem aqui especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que estes exibam a actividade biológica desejada (Patente do E.U.A. N.° 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)).

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (e.g., murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras sequências de anticorpo de ligação a antigénio) que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas de humano (anticorpo recipiente) nas quais resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do recipiente estão substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como ratinho, rato ou coelho possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de estrutura (FR, framework) de Fv da imunoglobulina de humano estão substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Para além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se encontram nem no anticorpo recipiente nem nas sequências CDR ou de estrutura (framework) importadas. Estas modificações são efectuadas para refinar e optimizar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado 15 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado compreenderá também optimamente pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et ai., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et ai., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). 0 anticorpo humanizado inclui um anticorpo Primatized™ onde a região do anticorpo de ligação a antigénio é derivada de um anticorpo produzido por imunização de macacos cinomolgos com o antigénio de interesse.

Uma formulação "estável" é uma e que a proteína ai contida mantém essencialmente a sua integridade e estabilidade física e química no armazenamento. Estão disponíveis na especialidade várias técnicas analíticas para medição da estabilidade de proteína e estas são revistas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Mareei Dekker, Inc., New York, New York, Pubs. (1991) e em Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). A estabilidade pode ser medida a uma temperatura seleccionada durante um período de tempo seleccionado. Para um rastreio rápido, a formulação pode ser mantida a 40°C durante 2 semanas a 1 mês, tempo após o qual a estabilidade é medida. Quando se pretende armazenar a formulação a 2-8°C, geralmente a formulação deverá ser estável a 30°C ou 40°C durante pelo menos 1 mês e/ou estável a 2-8°C durante pelo menos 2 anos. Onde se pretende armazenar a formulação a 30°C, geralmente a formulação deverá ser estável durante pelo menos 2 anos a 30 °C e/ou estável a 40°C durante pelo menos 6 meses. Por exemplo, a extensão da agregação após liofilização e armazenamento pode ser utilizada como um indicador de estabilidade da proteína (ver os Exemplos aqui apresentados). Por exemplo, uma formulação "estável" pode ser uma onde menos do que cerca de 10% e preferivelmente menos do que cerca de 5% da proteína estão presentes na formulação como um agregado. Noutras concretizações, pode-se determinar qualquer aumento na formação de agregado após liofilização e 16 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ armazenamento da formulação liofilizada. Por exemplo, uma formulação liofilizada "estável" pode ser uma onde o aumento em agregado na formulação liofilizada é menos do que cerca de 5% e preferivelmente menos do que cerca de 3%, quando a formulação liofilizada é armazenada a 2-8°C durante pelo menos um ano. Noutras concretizações, a estabilidade da formulação de proteína pode ser medida utilizando um ensaio de actividade biológica (ver, e.g., Exemplo 2 abaixo).

Uma formulação "reconstituída" é uma que foi preparada por dissolução de uma formulação de proteína liofilizada num diluente tal que a proteína está dispersa na formulação reconstituída. A formulação reconstituída é adequada para administração (e.g. administração parentérica) a um paciente a ser tratado com a proteína de interesse e pode ser uma que seja adequada para administração subcutânea.

Por "isotónica" pretende-se significar que a formulação de interesse tem essencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. Formulações isotónicas terão geralmente uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsm. A isotonicidade pode ser medida utilizando um osmómetro de pressão de vapor ou do tipo congelação em gelo, por exemplo.

Um "lioprotector" é uma molécula que, quando combinada com uma proteína de interesse, previne ou reduz significativamente a instabilidade química e/ou física da proteína após liofilização e armazenamento subsequente. Exemplos de lioprotectores incluem açúcares tais como sacarose ou trealose; um aminoácido tal como glutamato monossódico ou histidina; uma metilamina tal como betaína; um sal liotrópico tal como sulfato de magnésio; um poliol tal como álcoois de açúcar tri-hídricos ou superiores, e.g. glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol; propilenoglicol; polietilenoglicol; Pluronics; e suas combinações. O lioprotector preferido é um açúcar não redutor, tal como trealose ou sacarose. 0 lioprotector é adicionado à formulação pré-liofilizada numa "quantidade lioprotectora" o que significa que, após liofilização da proteína na presença da quantidade lioprotectora do lioprotector, a proteína essencialmente 17 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ mantém a sua integridade e estabilidade fisica e química após liofilização e armazenamento. 0 "diluente" de interesse é aqui um diluente que é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um humano) e que é útil para a preparação de uma formulação reconstituída. Exemplos de diluentes incluem água estéril, água bacteriostática para injecção (BWFI), uma solução de pH tamponado (e.g. solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

Um "conservante" é um composto que pode ser adicionado ao diluente para essencialmente reduzir a acção bacteriana na formulação reconstituída, facilitando assim a produção de uma formulação reconstituída multiutilização, por exemplo. Exemplos de conservantes potenciais incluem cloreto de octadecildimetilbenzilamónio, cloreto de hexametónio, cloreto de benzalcónio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildimetilamónio nos quais os grupos alquilo são compostos de cadeia longa), e cloreto de benzetónio. Outros tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos tais como fenol, álcool butílico e benzílico, alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, 3-pentanol e m-cresol. 0 conservante mais preferido é aqui o álcool benzílico.

Um "agente de volume" é um composto que acrescenta massa à mistura liofilizada e que contribui para a estrutura física do bolo liofilizado (e.g. facilita a produção de um bolo liofilizado essencialmente uniforme que mantém uma estrutura de poro aberta). Exemplos de agentes de volume incluem manitol, glicina, polietilenoglicol e xorbitol. "Tratamento" refere-se não só ao tratamento terapêutico mas também a medidas profilácticas ou preventivas. Os necessitados de tratamento incluem aqueles que já estão afectados pela perturbação bem como aqueles nos quais se pretende prevenir a perturbação.

Para efeitos do tratamento, "mamífero" refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo 18 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ humanos, animais domésticos e de pecuária, e animais de jardim zoológico, desporto ou de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. Preferivelmente, o mamífero é um humano.

Uma "perturbação" é qualquer condição que beneficiará do tratamento com a proteína. Isto inclui perturbações ou doenças crónicas e agudas incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero para a perturbação em questão. Exemplos não limitativos de perturbações a serem tratadas incluem aqui carcinomas e alergias. II. Modos para realização do invento A. Preparação de proteínas A proteína a ser formulada é preparada utilizando técnicas que estão bem estabelecidas na especialidade incluindo técnicas de síntese (tais como técnicas recombinantes e de síntese peptídica ou uma combinação destas técnicas) ou pode ser isolada a partir de uma fonte endógena da proteína. A proteína escolhida é um anticorpo. Seguem-se técnicas para a produção de anticorpos. (i) Anticorpos policlonais.

Anticorpos policlonais são geralmente criados em animais por múltiplas injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e de um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio relevante com uma proteína que é imunogénica na espécie a ser imunizada, e.g., hemocianina de lapa Fissurella, albumina de soro, tiroglobulina de bovino ou inibidor de tripsina de soja, utilizando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster de maleimidobenzoilo de sulfossucinimida (conjugação através de resíduos cisteína), N-hidroxissucinimida (através de resíduos lisina), glutaraldeído, anidrido sucínico, SOCI2 ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquilo diferentes.

Os animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos ou derivados combinando 1 mg ou 1 pg do péptido ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 19 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ 3 volumes de adjuvante completo de Freund. Um mês mais tarde os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injecção subcutânea em múltiplos locais. Sete a 14 dias mais tarde os animais são sangrados e o soro é ensaiado para determinação do título de anticorpos. Os animais são desafiados até o título atingir um patamar. Preferivelmente, o animal é reforçado com o conjugado do mesmo antigénio, mas conjugado com uma proteína diferente e/ou através de um agente de reticulação diferente. Os conjugados podem também ser preparados em cultura de células recombinantes como proteínas de fusão. Também, utilizam-se adequadamente agentes de agregação, tais como alúmen, para melhorar a resposta imunitária. (ii) Anticorpos monoclonais.

Anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os individual anticorpos que constituem a população são idênticos com excepção de possíveis de mutações ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Assim, o modificador "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando o método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser preparados por métodos de ADN recombinante (Patente do E.U.A. N. 0 4816567) .

No método do hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado como aqui acima descrito para induzir linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são depois fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). 20 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ

As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas num meio de cultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não possuem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT. Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, suportam a produção estável de anticorpos em níveis elevados pelas células produtoras de anticorpo seleccionadas, e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Entre estas, linhas de células de mieloma preferidas são as linhas de mieloma de murino, tais como as derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis no Salk Institute Cell Distribution Center, San Dieqo, Califórnia E.U.A., e as células SP-2 disponíveis na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland E.U.A.. Linhas de células de mieloma de humano e de heteromieloma de ratinho-humano foram também descritas para a produção de anticorpos monoclonais de humano (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)). O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão a crescer é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, pela análise de Scatchard de Muuson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). 21 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ

Após se terem identificado as células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e cultivados por métodos padrão (Coding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Para além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores asciticos num animal.

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido ascitico ou soro por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia em hidroxiapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. O ADN codificando os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (e.g., utilizando sondas de oligonucleótido que são capazes de se ligarem especificamente a genes codificando as cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida deste ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são depois transfectados em células de hospedeiro tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outo modo não produzem proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre a expressão recombinante em bactérias de ADN codificando o anticorpo incluem Skerra et ai., Curr. Opinion in Immunol.r 5:256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

Numa concretização adicional, os anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpo geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murino e de humano, 22 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ respectivamente, utilizando bibliotecas de fago. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos de humano de afinidade elevada (gama nM) por embaralhamento de cadeias (Marks et al. , Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como por infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construção de enormes bibliotecas de fago (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpo monoclonal para isolamento de anticorpos monoclonais. O ADN pode também ser modificado, por exemplo, utilizando as sequências de codificação dos domínios constantes de cadeia pesada e de cadeia leve de humano em substituição das sequências homólogas de murino (Patente do E.U.A. N.° 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851 (1984)), ou ligando covalentemente à sequência de codificação de imunoglobulina a totalidade ou parte da sequência de codificação de um polipéptido não imunoglobulina.

Tipicamente estes polipéptidos não imunoglobulina são utilizados em substituição dos domínios constantes de um anticorpo, ou são utilizados em substituição dos domínios variáveis de um local de combinação com antigénio de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um local de combinação com antigénio possuindo especificidade por um antigénio e outro local de combinação com antigénio possuindo especificidade por um antigénio diferente.

Anticorpos quiméricos ou híbridos podem também ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química de síntese de proteínas, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, podem-se construir imunotoxinas utilizando uma reacção de permuta de dissulfureto ou por formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este propósito incluem iminotiolato e 4-mercaptobutirimidato de metilo. 23 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ (iii) Anticorpos humanizados e humanos. São bem conhecidos na especialidade métodos para humanização de anticorpos não humanos. Geralmente, um anticorpo humanizado possui um ou mais residuos aminoácidos introduzidos no mesmo de uma origem que é não humana. Estes residuos de aminoácido não humanos são muitas vezes referidos como residuos "de importação", que são tipicamente retirados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente realizada de acordo com o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), utilizando CDRs ou sequências de CDR em substituição das sequências correspondentes de um anticorpo humano. Por conseguinte, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente do E.U.A. N.° 4816567), onde substancialmente menos do que um domínio variável de humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos de humano nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR estão substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor. A escolha de domínios variáveis de humano, tanto leves como pesados, a utilizar na preparação dos anticorpos humanizados, é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim chamado método "do melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra a totalidade da biblioteca de sequências conhecidas de domínio variável de humano. A sequência de humano que é mais próxima da sequência de roedor é então aceite como a estrutura (FR, framework) de humano para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al. , J. Mol. Biol. , 196:901 (1987)). Outro método utiliza uma estrutura (framework) particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leve ou pesada. A mesma estrutura (framework) pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)). 24 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de afinidade elevada pelo antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para conseguir este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e de vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulina estão habitualmente disponíveis e são familiares para os peritos na especialidade. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antigénio. Deste modo, resíduos FR podem ser seleccionados e combinados a partir das sequências de recipiente e de importação, de modo a conseguir a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada pelo antigénio ou antigénios alvo. Em geral, os resíduos de CDR estão directamente e muito substancialmente envolvidos em influenciar a ligação de antigénio.

Alternativamente, é agora possível produzir animais transgénicos (e.g., ratinhos) que são capazes, após imunização, de produzir um reportório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção de cadeia pesada de anticorpo (JH) em ratinhos mutantes quiméricos e da linha germinal resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência do arranjo de gene de imunoglobulina da linha germinal de humano nestes ratinhos mutantes de linha germinal resultará na produção de anticorpo de humano após desafio com antigénio. Ver, e.g., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993). Podem-se também obter anticorpos de humano a partir de 25 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ bibliotecas de apresentaçao de fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al. , J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)) . (iv) Anticorpos biespecíficos

Anticorpos biespecíficos (BsAbs) são anticorpos que têm especificidades de ligação por pelo menos dois epítopos diferentes. Estes anticorpos podem ser derivados de anticorpos a todo ou comprimento ou derivados de fragmentos de anticorpo (e.g. anticorpos biespecíficos F(ab')2)· São conhecidos na especialidade métodos para preparação de anticorpos biespecíficos. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos a todo o comprimento é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Por causa do arranjo aleatório das cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta, que é usualmente realizada por passos de cromatografia de afinidade, é bastante trabalhosa e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são revelados em WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). proporciona

De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação (locais de combinação anticorpo-antigénio) desejadas são fundidas com sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é preferivelmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões de charneira, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para a ligação da cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. ADNs codificando as fusões da cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, da cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados, e são co-transfectados num organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona uma grande 26 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ flexibilidade no ajustamento das proporções mútuas dos três fragmentos de polipéptido em concretizações em que proporções desiguais das três cadeias polipeptídicas utilizadas na construção proporcionam os rendimentos óptimos. No entanto, é possível inserir as sequências de codificação para duas ou para todas as três cadeias polipeptídicas em um vector de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em proporções iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as proporções não têm particular significância.

Numa concretização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecificos são compostos por uma cadeia pesada imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e por um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrido (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Constatou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado das combinações de cadeias de imunoglobulina indesejadas, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecifica proporciona um modo fácil de separação. Esta abordagem é revelada na WO 94/04690 publicada em 3 de Março de 1994. Para mais detalhes sobre a geração de anticorpos biespecificos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Os anticorpos biespecificos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode estar acoplado a avidina e o outro a biotina. Tais anticorpos têm sido propostos, por exemplo, para direccionar células do sistema imunitário a células indesejadas (Patente dos E.U.A. N.° 4676980), e para tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373). Podem-se preparar anticorpos heteroconjugados utilizando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na especialidade, e são revelados na Patente dos E.U.A. N.° 4676980, em conjunto com várias técnicas de reticulação. Técnicas para geração de anticorpos biespecificos a partir de fragmentos de anticorpo têm também sido descritas 27 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ na literatura. As técnicas seguintes podem também ser utilizadas para a produção de fragmentos de anticorpo bivalentes que não são necessariamente biespecíficos. Por exemplo, fragmentos Fab' recuperados a partir de E. coli podem ser acoplados quimicamente in vitro para formar anticorpos bivalentes. Ver, Shalaby et ai., J. Exp. Med., 175 : 217-225 (1992) . Têm também sido descritas várias técnicas para preparação e isolamento de fragmentos de anticorpo bivalentes directamente a partir de culturas de células recombinantes. Por exemplo, têm sido produzidos heterodímeros bivalentes utilizando fechos (zippers) de leucina. Kostelny et ai., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Os péptidos de fecho de leucina a partir das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão génica. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de charneira para formar monómeros e depois reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. A tecnologia do "diacorpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) tem proporcionado um mecanismo alternativo para preparação de fragmentos de anticorpo biespecíficos/bivalentes. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligador que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Por conseguinte, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelharem-se com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando por isso dois locais de ligação de antigénio. Tem também sido reportada outra estratégia para preparação de fragmentos de anticorpo biespecíficos/bivalentes pela utilização de dímeros Fv de cadeia simples (sFv). Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). B. Preparação da formulação liofilizada

Após a preparação da proteína de interesse como descrito acima, é produzida uma "formulação pré-liofilizada". A quantidade de proteína presente na formulação pré-liofilizada é determinada tomando em consideração os volumes de dose desejados, modo(s) de administração etc. Onde a proteína 28 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ escolhida é um anticorpo intacto (tal como um anticorpo anti-IgE ou um anticorpo anti-HER2), um exemplo de uma concentração de proteína de partida é de cerca de 2 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, preferivelmente de cerca de 5 mg/mL a cerca de 40 mg/mL e muito preferivelmente de cerca de 20-30 mg/mL. A proteína está geralmente presente em solução. Por exemplo, a proteína pode estar presente numa solução de pH tamponado a um pH de cerca de 4-8, e preferivelmente de cerca de 5-7. Exemplos de tampões incluem histidina, fosfato, Tris, citrato, sucinato e outros ácidos orgânicos. A concentração de tampão pode ser de cerca de 1 mM a cerca de 2 0 mM, ou de cerca de 3 mM a cerca de 15 mM, dependendo, por exemplo, do tampão e da isotonicidade desejada da formulação (e.g. da formulação reconstituída) . O tampão preferido é histidina pelo facto de, como demonstrado abaixo, esta poder ter propriedades lioprotectoras. O sucinato mostrou ser outro tampão útil. O lioprotector é adicionado à formulação pré-liofilizada. Em concretizações preferidas, o lioprotector é um açúcar não redutor tal como sacarose ou trealose. A quantidade de lioprotector na formulação pré-liofilizada é geralmente tal que, após reconstituição, a formulação resultante será isotónica. No entanto, podem também ser adequadas formulações reconstituídas hipertónicas. Além disso, a quantidade de lioprotector não pode ser tão baixa tal que ocorra uma quantidade inaceitável de degradação/agregação da proteína na liofilização. Onde o lioprotector é um açúcar (tal como sacarose ou trealose) e a proteína é um anticorpo, exemplos de concentrações de lioprotector na formulação pré-liofilizada são de cerca de 10 mM a cerca de 40 0 mM, e preferivelmente de cerca de 3 0 mM a cerca de 300 mM, e muito preferivelmente de cerca de 50 mM a cerca de 100 mM. A proporção de proteína para lioprotector é seleccionada para cada combinação de proteína e lioprotector. No caso de um anticorpo como a proteína escolhida e de um açúcar (e.g., sacarose ou trealose) como o lioprotector para gerar uma formulação reconstituída isotónica com uma concentração de proteína elevada, a proporção molar de lioprotector para 29 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ anticorpo é de 200 a 600 moles de lioprotector para 1 mole de anticorpo.

Constata-se que é desejável adicionar um tensioactivo à formulação pré-liofilizada. Alternativamente, ou adicionalmente, o tensioactivo pode ser adicionado à formulação liofilizada e/ou à formulação reconstituída. Exemplos de tensioactivos incluem tensioactivos não iónicos tais como polissorbatos (e.g. polissorbatos 20 ou 80); poloxameros (e.g. poloxamero 188); Triton; dodecilsulfato de sódio (SDS); laurilsulfato de sódio; octilglicósido sódico; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil- , miristil ou cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- ou isoestearamidopropil-betaína (e.g. lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- ou isoestearamidopropil-dimetilamina; metilcocoil-taurato sódico ou metiloleil-taurato dissódico; e a série MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, New Jersey), polietilglicol, polipropilglicol e copolímeros de etileno e propilenoglicol (e.g. Pluronics, PF68 etc). A quantidade de tensioactivo adicionado é tal que reduz a agregação da proteína reconstituída e minimiza a formação de particulados após reconstituição. Por exemplo, o tensioactivo pode estar presente na formulação pré-liofilizada numa quantidade de cerca de 0,001-0,5%, e preferivelmente de cerca de 0,005-0,05%.

Em certas concretizações do invento, uma mistura do lioprotector (tal como sacarose ou trealose) e de um agente de volume (e.g. manitol ou glicina) é utilizada na preparação da formulação pré-liofilização. O agente de volume pode permitir a produção de um bolo liofilizado uniforme sem bolsas excessivas no mesmo etc.

Outros transportadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis tais como os descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edição, Osol, A. Ed. (1980) podem ser incluídos na formulação pré-liofilizada (e/ou na formulação liofilizada e/ou na formulação reconstituída) desde que estes não afectem adversamente as 30 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ características desejadas da formulação. Transportadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não-tóxicos para recipientes nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem; agentes de tamponamento adicionais; conservantes; co-solventes; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; agentes quelantes tais como EDTA; complexos de metal (e.g. complexos de Zn-proteina); polímeros biodegradáveis tais como poliésteres; e/ou contra-iões formadores de sal tais como sódio. A presente formulação pode também conter mais do que uma proteína conforme necessário para a indicação particular que está a ser tratada, preferivelmente aquelas com actividades complementares que não afectam adversamente a outra proteína. Por exemplo, pode ser desejável proporcionar dois ou mais anticorpos que se ligam ao receptor HER2 ou IgE numa única formulação. Além disso, anticorpos anti-HER2 e anti-VEGF podem ser combinados nessa formulação única. Estas proteínas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

As formulações a utilizar para administração in vivo têm de ser estéreis. Isto é prontamente conseguido por filtração através de membranas de filtração esterilizante, antes ou após liofilização e reconstituição. Alternativamente, a esterilidade de toda a mistura pode ser conseguida por autoclavagem dos ingredientes, excepto da proteína, a cerca de 120°C durante cerca de 30 minutos, por exemplo.

Após a proteína, lioprotector e outros componentes opcionais serem misturados em conjunto, a formulação é liofilizada. Para este propósito estão disponíveis muitos crio-dessecadores diferentes tais como os crio-dessecadores Hull50™ (Hull, E.U.A.) ou GT20™ (Leybold-Heraeus, Alemanha). A crio-dessecação é realizada por congelação da formulação e subsequentemente sublimação do gelo a partir do conteúdo congelado a uma temperatura adequada para secagem primária. Sob esta condição, a temperatura do produto está abaixo do ponto eutéctico ou da temperatura de colapso da formulação. Tipicamente, a temperatura de prateleira para a secagem primária variará de cerca de -30 a 25°C (desde que o produto permaneça congelado durante a secagem primária) a uma pressão 31 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ adequada, variando tipicamente de cerca de 50 a 250 mTorr. A formulação, tamanho e tipo do recipiente contendo a amostra (e.g., um frasco de vidro) e o volume de liquido ditarão principalmente o tempo requerido para secagem, que pode variar desde algumas horas até vários dias (e.g. 40-60 h) . Uma etapa de secagem secundária pode ser realizada a cerca de 0-40°C, dependendo principalmente do tipo e do tamanho do recipiente e do tipo de proteína utilizada. No entanto, constatou-se aqui que pode não ser necessário um passo de secagem secundária. Por exemplo, a temperatura de prateleira ao longo de toda a fase de remoção de água da liofilização pode ser de cerca de 15-30°C (e.g., cerca de 20°C). O tempo e pressão requeridos para secagem secundária serão tais que é produzido um bolo liofilizado adequado, dependendo, e.g., da temperatura e de outros parâmetros. O tempo de secagem secundária é ditado pelo nível de humidade residual desejado no produto e tipicamente demora pelo menos cerca de 5 horas (e.g. 10-15 horas). A pressão pode ser a mesma que é utilizada durante o passo de secagem primária. As condições de crio-dessecação podem variar dependendo da formulação e do tamanho do frasco.

Em alguns casos, pode ser desejável liofilizar a formulação de proteína no recipiente no qual a reconstituição da proteína será realizada de modo a evitar um passo de transferência. O recipiente neste caso pode ser, por exemplo, um frasco de 3, 5, 10, 20, 50 ou 100 cm3.

Como princípio geral, a liofilização resultará numa formulação liofilizada na qual o teor de humidade da mesma é inferior a cerca de 5%, e preferivelmente inferior a cerca de 3%. C. Reconstituição da formulação liofilizada

Na etapa desejada, tipicamente quando é o momento de administrar a proteína ao paciente, a formulação liofilizada pode ser reconstituída com um diluente tal que a concentração de proteína na formulação reconstituída é pelo menos 50 mg/mL, por exemplo de cerca de 50 mg/mL a cerca de 400 mg/mL, mais preferivelmente de cerca de 80 mg/mL a cerca de 300 mg/mL, e muito preferivelmente de cerca de 90 mg/mL a cerca 32 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ de 150 mg/mL. Estas elevadas concentrações de proteína na formulação reconstituída são consideradas particularmente úteis onde se pretende a entrega subcutânea da formulação reconstituída. No entanto, para outras vias de administração, tais como administração intravenosa, podem ser desejadas concentrações mais baixas da proteína na formulação reconstituída (por exemplo de cerca de 5-50 mg/mL ou de cerca de 10-40 mg/mL de proteína na formulação reconstituída). Em certas concretizações, a concentração de proteína na formulação reconstituída é significativamente mais elevada do que na formulação pré-liofilizada. Por exemplo, a concentração de proteína na formulação reconstituída pode ser cerca de 2-40 vezes, preferivelmente 3-10 vezes e muito preferivelmente 3-6 vezes (e.g. pelo menos três vezes ou pelo menos quatro vezes) a da formulação pré-liofilizada. A reconstituição ocorre geralmente a uma temperatura de cerca de 25°C para assegurar a hidratação completa, ainda que se possam utilizar outras temperaturas conforme desejado. O tempo requerido para reconstituição dependerá, e.g., do tipo de diluente, quantidade de excipiente(s) e proteína. Exemplos de diluentes incluem água estéril, água bacteriostática para injecção (BWFI), uma solução de pH tamponado (e.g. solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose. O diluente contém opcionalmente um conservante. Exemplos de conservantes foram descritos acima, com álcoois aromáticos tais como álcool benzílico ou fenol sendo os conservantes preferidos. A quantidade de conservante utilizado é determinada por avaliação de diferentes concentrações de conservante quanto à compatibilidade com a proteína e ensaio da eficácia do conservante. Por exemplo, se o conservante é um álcool aromático (tal como álcool benzílico), este pode estar presente numa quantidade de cerca de 0,1-2,0% e preferivelmente de cerca de 0,5-1,5%, mas muito preferivelmente cerca de 1,0-1,2%.

Preferivelmente, a formulação reconstituída possui menos do que 6000 partículas por frasco com um tamanho >10 ym. 33

ΕΡ 1 516 628/PT D. Administração da formulação reconstituída A formulação reconstituída é administrada a um mamífero necessitado de tratamento com a proteína, preferivelmente um humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como um bólus ou por perfusão contínua durante um período de tempo, pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica ou inalação. A formulação reconstituída pode ser administrada ao mamífero por administração subcutânea (i.e. debaixo da pele). Para estes propósitos, a formulação pode ser injectada utilizando uma seringa. No entanto, estão disponíveis outros dispositivos para administração da formulação tais como dispositivos para injecção (e.g. os dispositivos Inject-ease™ e Genject™) ; canetas injectoras (tais como a GenPen™) ; dispositivos sem agulha (e.g. MediJector™ e BioJector™) ; e sistemas de entrega por implante subcutâneo. A dosagem apropriada ("quantidade terapeuticamente eficaz") da proteína dependerá, por exemplo, da condição a ser tratada, da gravidade e progressão da condição, se a proteína é administrada para fins preventivos ou terapêuticos, de terapias anteriores, da história clínica do paciente e da resposta à proteína, do tipo de proteína utilizada, e da discrição do médico assistente. A proteína é adequadamente administrada ao paciente de uma só vez ou ao longo de uma série de tratamentos e pode ser administrada ao paciente em qualquer momento subsequente ao diagnóstico. A proteína pode ser administrada como o único tratamento ou em conjunto com outros fármacos ou terapias úteis no tratamento da condição em questão.

Onde a proteína escolhida é um anticorpo, de cerca de 0,1-20 mg/kg são uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas. No entanto, podem ser úteis outros regimes de dosagem. O progresso desta terapia é facilmente monitorizado por técnicas convencionais. 34 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ

No caso de um anticorpo anti-HER2, uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo pode ser administrada para tratar ou prevenir um cancro caracterizado por sobre-expressão do receptor HER2. Está contemplado que uma formulação reconstituída do anticorpo anti-HER2 pode ser utilizada para tratar cancro da mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon e/ou bexiga. Por exemplo, o anticorpo anti-HER2 pode ser utilizado para tratar carcinoma ductal in situ (DCIS). Exemplos de dosagens do anticorpo anti-HER2 estão no intervalo de 1-10 mg/kg por uma ou mais administrações separadas.

As utilizações para uma formulação anti-IgE incluem o tratamento ou profilaxia de doenças alérgicas mediadas por IgE, infecções parasitárias, cistite intersticial e asma, por exemplo. Dependendo da doença ou perturbação a ser tratada, é administrada ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz (e.g. de cerca de 1-15 mg/kg) do anticorpo anti-IgE. E. Artigos fabricados É revelado um artigo fabricado que contém a formulação liofilizada do presente invento e proporciona instruções para a sua reconstituição e/ou utilização. O artigo fabricado compreende um recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (e.g. frascos de câmara dupla), seringas (tais como seringas de câmara dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém a formulação liofilizada e o rótulo sobre ou associado ao recipiente pode indicar orientações para reconstituição e/ou utilização. Por exemplo, o rótulo pode indicar que a formulação liofilizada é reconstituído até concentrações de proteína como descrito acima. 0 recipiente pode ainda indicar que a formulação é útil ou destinada a administração subcutânea. O recipiente que contém a formulação pode ser um frasco multiutilização, que permite administrações repetidas (e.g. de 2-6 administrações) da formulação reconstituída. O artigo fabricado pode compreender ainda um segundo recipiente compreendendo um diluente adequado (e.g. BWFI). Na mistura do diluente e da formulação liofilizada, a concentração final de proteína na formulação 35 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ reconstituída será geralmente pelo menos 50 mg/mL. O artigo fabricado pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e folhetos com instruções para utilização. 0 invento será mais plenamente compreendido por referência aos exemplos seguintes. No entanto, estes não devem ser entendidos como limitantes do âmbito do invento. EXEMPLO 1 FORMULAÇÃO ANTI-HER2 A sobre-expressão do produto proto-oncogénico HER2 (pl85HER2) tem sido associada a uma variedade de malignidades agressivas de humano. O anticorpo monoclonal de murino conhecido como muMAb4D5 é dirigido contra o domínio extracelular (ECD) de pl85HER2. A molécula muMAb4D5 tem sido humanizada numa tentativa para melhorar a sua eficácia clínica reduzindo a imunogenicidade e permitindo-lhe suportar funções de efector de humano (ver WO 92/22653). Este exemplo descreve o desenvolvimento de uma formulação liofilizada compreendendo anticorpo humanizado huMAb4D5-8 a todo o comprimento descrito na WO 92/22653.

No desenvolvimento de uma formulação liofilizada, excipientes e tampões são inicialmente rastreados por medição da estabilidade da proteína após liofilização e reconstituição. A proteína liofilizada em cada formulação é também submetida a estudos acelerados de estabilidade para determinar a estabilidade potencial da proteína durante a sua vida em prateleira. Estes estudos acelerados são usualmente realizados a temperaturas acima das condições de armazenamento propostas e os dados são depois utilizados para estimar a energia de activação para as reacções de degradação assumindo uma cinética de Arrhenius (Cleland et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993)). A energia de activação é depois utilizada para calcular a vida em prateleira esperada da formulação de proteína nas condições de armazenamento propostas. 36 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ

Em estudos iniciais de rastreio, investigou-se a estabilidade de várias formulações liofilizadas de anticorpo humanizado recombinante anti-HER2 (rhuMAb HER2) após incubação a 5°C (condição de armazenamento proposta) e a 40°C (condição de estabilidade acelerada). No estado liquido, observou-se que o rhuMAb HER2 se degradava por desamidação (30Asn de cadeia leve) e formação de isoaspartato via um intermediário de amida cíclica, sucinimida (102Asp de cadeia pesada). A desamidação foi minimizada a pH 5,0 resultando em degradação principalmente na sucinimida. A pH 6,0, observou-se uma desamidação ligeiramente mais elevada na formulação de proteína líquida. As formulações liofilizadas foram por isso estudadas com: (a) tampão sucinato 5 ou 10 mM, pH 5,0 ou (b) tampão histidina 5 ou 10 mM, pH 6,0. Ambos os tampões continham o tensioactivo, polissorbato 20 (Tween 20™) , que foi utilizado para reduzir o potencial para agregação da proteína reconstituída e minimizar a formação de particulados após reconstituição. Estes tampões foram utilizados com e sem vários açúcares. A proteína foi formulada no tampão para 5,0, 21,0 ou 25,0 mg/mL. Estas formulações foram depois liofilizadas e avaliadas quanto à estabilidade da proteína após 2 semanas a 5°C e 40°C. No liofilizador, os frascos foram congelados a uma temperatura de prateleira de -55°C durante aproximadamente 5 horas seguindo-se secagem primária a uma temperatura de prateleira de 5°C e 150 mTorr durante 30 horas, e a secagem até 1-2% de humidade residual foi conseguida com secagem secundária a uma temperatura de prateleira de 20°C durante 10 horas. O percurso de degradação principal para esta proteína após liofilização era a agregação, e por isso a estabilidade da proteína foi avaliada por cromatografia de exclusão de tamanhos nativa para medir a recuperação de proteína nativa intacta (% de proteína intacta na Tabela 2 abaixo).

Mediram-se os efeitos de estabilização de vários açúcares lioprotectores sobre a proteína liofilizada em sucinato de sódio 10 mM, pH 5,0 (Tabela 2) . Para elevadas concentrações de açúcar (250-275 mM) e baixa concentração de proteína (5,0 mg/mL), trealose e lactose estabilizaram a proteína contra agregação para a proteína liofilizada armazenada durante 2 semanas a 40°C. No entanto, observou-se que a lactose, um açúcar redutor, reagia com a proteína 37 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ durante um prazo de armazenamento mais longo a 40°C. As formulações para 5,0 mg/mL de proteína contendo quer sorbitol quer manitol produziram proteína agregada após armazenamento a 40 °C durante 2 semanas. À concentração mais elevada de proteína (21,0 mg/mL), formulações compreendendo manitol, ou manitol em combinação com sorbitol ou glicina, continham proteína agregada após liofilização e armazenamento em ambas as condições. Em contraste, trealose e sacarose preveniram a agregação para ambas as condições de armazenamento.

Avaliaram-se as formulações de trealose 250 mM e lactose 250 mM quanto à estabilidade a longo prazo. Após 9 meses a 40°C ou 12 meses a 5°C, não ocorreu qualquer alteração na % de proteína intacta para a formulação de trealose. Para a formulação de lactose, a % de proteína intacta permaneceu constante (a mesma inicial) após 3 meses a 40°C ou 6 meses a 25°C. A formulação de trealose pôde ser armazenada a temperatura ambiente controlada (15-30°C) durante 2 anos sem uma alteração significativa na % de proteína intacta. A formulação de histidina 10 mM, pH 6,0, com manitol continha menos proteína agregada após armazenamento a 40°C durante 2 semanas do que a formulação de sucinato 10 mM, pH 5,0 com manitol. Este resultado pode estar relacionado com algum efeito de estabilização conferido pela histidina sozinha. Após armazenamento a 40°C durante 2 semanas, ocorreu porém agregação significativa para as formulações de histidina sozinha ou de histidina/manitol. A adição de sacarose numa massa igual à de manitol (10 mg/mL de cada) na formulação de histidina estabilizou a proteína contra agregação para ambas as condições de armazenamento. A utilização de glicina com manitol não melhorou a estabilidade da proteína, enquanto a formulação de sacarose/glicina proporcionou a mesma estabilidade que a formulação de sacarose/manitol. Estes resultados mostraram adicionalmente que a sacarose era útil para prevenir a agregação da proteína liofilizada durante o armazenamento. 38 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ TABELA 2

Composição antes da liofilização % de proteína intacta a [Proteína]b (mg/mL) Formulação Liquido (5°C) Liofilizada (2 semanas, 5°C) Liofilizada (2 semanas, 40°C) Sucinato de sódio 10 mH pH 5,0 5, 0 Trealose 275 mM, 0,01% de Tween 20™ 98,9 99, 1 98,9 5, 0 Lactose 275 mM, 0,01% Tween 20™ 96, 8 96,5 96,6 5, 0 Sorbitol 275 mM, 0,01% de Tween 20™ 99, 4 99,3 95, 4 5, 0 Manitol 250 mM, 0,01% de Tween 20™ 100,0 99,9 98,8 5, 0 Trealose 250 mM, 0,01% de Tween 20™ 100,0 99,9 100,0 5, 0 Lactose 250 mM, 0,01% de Tween 20™ 100,0 100, 0 100,0 21,0 Trealose 250 mM, 0,2% Tween 20™ 99,3 99, 1 99, 1 21,0 Sacarose 250 mM, 0,2% Tween 20™ 99,6 99,6 99, 7 21,0 Manitol 250 mM, 0,01% de Tween 20™ 100,0 94,6 94,0 21, 0 Manitol 188 mM / sorbitol 63 mM, 0,01% de Tween 20™ 99, 8 98,6 96,5 21,0 Manitol 250 mM / glicina 25 mM, 0,01% de Tween 20™ 99,5 96,5 96, 4 Histidina 10 mM pH 6,0 21,0 Nenhum açúcar, 0,01% de Tween 20™ 100,0 99,9 98,9 21,0 Manitol 54,9 mM, 0,01% de Tween 20™ 100,0 99,9 99,2 21,0 Sacarose 29,2 mM / glicina 266,4 mM, 0,01% de Tween 20™ 100,0 100, 0 99,6 21,0 Manitol 54,9 mM / glicina 266,4 mM, 0,01 % Tween 20™ 100,0 99,8 98,9 39 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ

Composição antes da liofilização % de proteína intacta a [Proteína]b (mg/mL) Formulação Liquido (5°C) Liofilizada (2 semanas, 5°C) Liofilizada (2 semanas, 40°C) Sucinato de sódio 10 mM pH 5,0 21,0 Manitol 54,9 mM / sacarose 29,2 mM, 0,01% de Tween 20™ 99, 8 100, 0 99, 7 a. A fracção de proteína intacta foi medida por HPLC de exclusão de tamanhos nativa e definida como a área de pico da proteína nativa em relação à área de pico total incluindo agregados (coluna TSK3000 SW XL, TosoHaas, com um caudal de 1,0 mL/min; eluição com solução salina tamponada com fosfato; detecção a 214 e 280 nm) . As formulações de proteína foram analisadas antes da liofilização (líquido, 5°C) e após liofilização e armazenamento a 5°C ou 40°C durante 2 semanas. b. As formulações contendo 5 mg/mL de proteína foram reconstituídas com água destilada (20 mL, 5,0 mg/mL de proteína) e as formulações contendo 21 mg/mL de proteína foram reconstituídas com água bacteriostática para injecção (BWFI, álcool benzílico a 0,9%; 20 mL, 20 mg/mL de proteína). A entrega de uma elevada concentração de proteína é muitas vezes requerida para administração subcutânea devido às limitações de volume (<1,5 mL) e a requisitos de dosagem (^ 100 mg) . No entanto, elevadas concentrações de proteína (h 50 mg/mL) são muitas vezes difíceis de conseguir no processo de fabricação dado que, a concentrações elevadas, a proteína tem uma tendência para se agregar durante o processamento e torna-se difícil de manipular (e.g. bombear) e filtrar para esterilização. Alternativamente, o processo de liofilização pode proporcionar um método para permitir a concentração da proteína. Por exemplo, a proteína é utilizada para encher frascos com um volume (Vf) e depois liofilizada. A proteína liofilizada é depois reconstituída com um volume (Vr) de água ou conservante (e.g. BWFI) menor do que o volume original (e.g. Vr = 0,25 Vf) resultando numa concentração mais elevada de proteína na solução reconstituída. Este processo resulta também na concentração dos tampões e excipientes. Para administração subcutânea, a solução é desejavelmente isotónica. 40 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ A quantidade de trealose no rhuMAb HER2 liofilizado foi reduzida para produzir uma solução isotónica após reconstituição para proporcionar 100 mg/mL de proteína. O efeito de estabilização de trealose foi determinado em função da concentração para sucinato de sódio 5 mM, pH 5,0, e histidina 5 mM, pH 6,0, para 25,0 mg/mL de proteína (Tabela 3) . Para concentrações de trealose de 60 a 200 mM, não ocorreu qualquer agregação significativa após incubação da proteína liofilizada durante 4 semanas a 40°C. Estas formulações foram reconstituídas com 20 mL de água bacteriostática para injecção (BWFI, USP, álcool benzílico a 0,9%). A reconstituição da formulação de trealose 50 mM (sucinato de sódio 5 mM) com 4 mL de BWFI (100 mg/mL de proteína) após incubação durante 4 semanas a 40°C produziu um ligeiro aumento na formação de agregado. As formulações reconstituídas preservadas proporcionaram a vantagem de múltiplas retiradas a partir do mesmo frasco sem preocupações de esterilidade. Ao utilizar agulhas esterilizadas, estas formulações permitirão várias doses a partir de um mesmo frasco. 41 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ TABELA 3

Composição antes da liofilização % de proteína intacta a [Proteína] (mg/mL) Formulação Liquido (5°C) Liofilizada (4 semanas, 5°C) Liofilizada (4 semanas, 40°C) Sucinato de sódio 5 mM pH 5,0 25, 0 Trealose 50 mM, 0,01% de Tween 20™ b 100,00 100,0 99,5 25, 0 Trealose 60 mM, 0,01% de Tween 20™ 100, 0 100,0 99,9 25, 0 Trealose 60 mM, 0,01% de Tween 20™ 100, 0 100,0 99,2 25, 0 Trealose 100 mM, 0,01% de Tween 20™ 100, 0 100,0 99, 7 25, 0 Trealose 150 mM, 0,01% de Tween 20™ 100, 0 100,0 99,8 25, 0 Trealose 200 mM, 0,01% Tween 20™ 100, 0 100,0 100,0 Histidina 5 mM pH 6,0 25, 0 Manitol 38,4 mM / sacarose 20,4 mM, 0,01% de Tween 20™ 100,0 100,0 99,3 25, 0 Manitol 38,4 mM / sacarose 20,4 mM, 0,01% de Tween 20™ c 100,0 100,0 99,4 25, 0 Trealose 60 mM, 0,01% de Tween 20™ d 100,0 100,0 99,8 25, 0 Trealose 60 mM, 0,01% de Tween 20™ 100,0 100,0 99,4 25, 0 Trealose 100 mM, 0,01% de Tween 20™ 100,0 100,0 99,6 25, 0 Trealose 150 mM, 0,01% de Tween 20™ 100,0 100,0 100,0 25, 0 Trealose 200 mM, 0,01% de Tween 20™ 100,0 100,0 100,0 a. A fracção de proteína intacta foi medida por HPLC de exclusão de tamanhos nativa e definida como a área de pico da proteína nativa em relação à área de pico total incluindo agregados (coluna TSK3000 SW XL, TosoHaas, com um caudal de 42 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ 1,0 mL/min; eluição com solução salina tamponada com fosfato; detecção a 214 e 280 nm) . As formulações de proteína foram analisadas antes da liofilização (líquido, 5°C) e após liofilização e armazenamento a 5°C ou 40°C durante 4 semanas. As formulações foram reconstituídas com água bacteriostática para injecção (BWFI, USP, álcool benzilico a 0,9% p/p; 20 mL, 22 mg/mL de proteína). b. Reconstituída com 4 mL de BWFI (álcool benzilico a 0,9%) para proporcionar 100 mg/mL de proteína. c. Reconstituída com 4 mL de BWFI (álcool benzilico a 1,1%) para proporcionar 100 mg/mL de proteína. d. Amostra incubada durante 2 semanas a 5°C ou 40°C e depois reconstituída com 20 mL de BWFI (álcool benzilico a 0,9%) para proporcionar 22 mg/mL de proteína.

Presentemente, o rhuMAb HER2 está a ser investigado como um agente terapêutico para o tratamento de cancro da mama. A proteína é doseada a pacientes com 2 mg/kg numa base semanal. Uma vez que o peso médio destes pacientes é 65 kg, a dose semanal média é 130 mg de rhuMAb HER2. Para administração subcutânea, volumes de injecção de 1,5 mL ou menos são bem tolerados e por isso a concentração de proteína para uma administração subcutânea semanal de rhuMAb HER2 pode ser aproximadamente 100 mg/mL (dose média de 130 mg/1,5 mL). Como mencionado acima, esta elevada concentração de proteína é difícil de obter e manter numa forma estável. Para conseguir esta elevada concentração de proteína, rhuMAb HER2 formulado em: (a) sucinato de sódio 5 mM, pH 5,0, ou (b) histidina 5 mM, pH 6,0, foi liofilizado para 25 mg/mL de proteína em trealose 60 mM, 0,01% de Tween 20™. A liofilização foi realizada por enchimento de 18 mL da formulação de proteína em frascos de 50 cm3. No liof ilizador, os frascos foram congelados a uma temperatura de prateleira de -55°C durante aproximadamente 5 horas seguindo-se secagem primária a uma temperatura de prateleira de 5°C e 150 mTorr durante 30 horas, e a secagem até 1-2% de humidade residual foi conseguida com secagem secundária a uma temperatura de prateleira de 20°C durante 10 horas. Termopares colocados em frascos contendo o placebo (formulação sem proteína) indicaram que o produto nos frascos foi mantido abaixo de -10°C ao longo da secagem primária. Estudos de rolhagem 43 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ sequencial durante a liofilização revelaram que a humidade residual após secagem primária era usualmente inferior a 10%. A proteína liofilizada foi depois reconstituída quer com 4 quer com 20 mL de BWFI (álcool benzílico a 0,9 ou 1,1%) para proporcionar soluções concentradas de proteína: (a) 4 mL: 102 mg/mL de rhuMAb HER2, trealose 245 mM, sucinato de sódio 21 mM, pH 5,0 ou histidina 21 mM, pH 6,0, 0,04% de Tween 20™; (b) 20 mL: 22 mg/mL de rhuMAb HER2, trealose 52 mM, sucinato de sódio 4 mM, pH 5,0 ou histidina 4 mM, pH 6,0, 0,009% de Tween 20™.

Após armazenamento das formulações liofilizadas durante 4 semanas a 40°C e reconstituição para 22 mg/mL de proteína, a quantidade de proteína agregada pareceu aumentar ligeiramente com a diminuição da concentração de trealose. A estabilidade da proteína liofilizada não foi afectada pelo volume de reconstituição. Como se mostra na Figura 1, a quantidade de proteína intacta após incubação da proteína liofilizada a 40°C foi a mesma para a formulação de trealose 60 mM, sucinato de sódio 5 mM, pH 5,0, 0,01% de Tween 20™ reconstituída quer com 4 quer com 20 mL de BWFI.

Os resultados apresentados na Tabela 3 sugeriram que pode existir uma relação entre a concentração de trealose e a estabilidade da proteína. Para avaliar adicionalmente esta relação, as formulações contendo diferentes concentrações de trealose formuladas quer em sucinato de sódio quer em histidina foram incubadas durante 91 dias a 40°C. A estabilidade foi depois medida em função da proporção molar de trealose para proteína para cada concentração de trealose. Como se mostra na Figura 2, a estabilidade da proteína diminuiu claramente com a diminuição da concentração de trealose para ambas as formulações. Não existia nestas formulações qualquer diferença aparente entre os dois tampões, sucinato e histidina, sugerindo que o estabilizador principal sob estas condições é a trealose. Além disso, a diminuição observada em proteína intacta para ambas as formulações seria aceitável, mesmo para a baixa concentração 44 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ trealose, para uma formulação que é armazenada a 2-8°C ao longo da sua vida em prateleira. No entanto, se é requerida estabilidade à temperatura ambiente controlada (temperatura máxima de 30°C), podem ser necessárias concentrações mais elevadas de trealose (^600:1 de trealose:proteína) dependendo das especificações de estabilidade para o produto (i.e. a especificação para a quantidade de proteína intacta restante após 2 anos de armazenamento) . Tipicamente, uma condição de armazenamento a temperatura ambiente controlada necessitaria de estabilidade durante 6 meses a 40°C o que é equivalente a armazenamento a 30°C durante 2 anos.

Como se mostra na Figura 3, a formulação de trealose 250 mM estava inalterada após 6 meses a 40°C enquanto ambas as formulações de trealose 60 mM eram menos estáveis. As formulações de trealose 60 mM podem então requerer armazenamento refrigerado se a especificação de produto no final da sua vida em prateleira for, por exemplo, >98% de proteína intacta por cromatografia de exclusão de tamanhos nativa.

No estudo de rastreio anterior, observou-se também que a sacarose preveniu a agregação de rhuMAb HER2 após liofilização e armazenamento subsequente. Para conseguir soluções isotónicas após reconstituição para administração subcutânea (concentração de componentes de formulação e proteína de aproximadamente quatro vezes), a concentração de sacarose tem de ser reduzida significativamente. A concentração mássica igual de sacarose e manitol (agente de volume) utilizada nos estudos de rastreio preveniu a agregação da proteína. Uma concentração inferior de sacarose e manitol (concentrações mássicas iguais) foi escolhida como uma formulação subcutânea potencial de rhuMAb HER2. A solução de proteína (25 mg/mL de proteína, histidina 5 mM, pH 6,0, manitol 38,4 mM (7 mg/mL), sacarose 20,4 mM (7 mg/mL), 0,01% de Tween 20™) foi liofilizada do mesmo modo que a formulação de trealose 60 mM excepto que o ciclo de secagem primária foi prolongado até 54 horas. Após 4 semanas a 40°C, ocorreu um ligeiro aumento na quantidade de agregados após reconstituição com 4,0 ou 20,0 mL de BWFI (Tabela 3). A quantidade de proteína agregada era a mesma para reconstituição a 22 ou 100 mg/mL de proteína (Figura 4). Tal 45 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ como as formulações de trealose 60 mM, a formulação de manitol/sacarose proporcionou menos proteína intacta ao longo do tempo a 40°C. A proporção molar de sacarose para proteína para esta formulação era 120 para 1, indicando que a combinação de manitol/sacarose pode ser mais eficaz do que a trealose sozinha para a mesma proporção molar de açúcar de estabilização (Figuras 2 e 4) .

Nos exemplos anteriores, determinou-se a estabilidade das formulações liofilizadas de rhuMAb HER2 em função da temperatura. Estes estudos demonstraram que as formulações de trealose e manitol/sacarose preveniram a degradação da proteína no estado liofilizado a temperaturas elevadas (40°C). No entanto, estas experiências não abordaram a estabilidade da proteína após reconstituição e armazenamento. Uma vez reconstituídas com BWFI, as formulações liofilizadas de rhuMAb HER2 podem ser utilizadas para várias administrações do fármaco. Em particular, a configuração em frasco (450 mg de rhuMAb HER2) foi concebida para proporcionar três doses ao paciente médio (130 mg de rhuMAb HER2 por dose). Uma vez que o fármaco é doseado semanalmente, o frasco pode ser armazenado pelo menos três semanas após reconstituição. Para assegurar que o rhuMAb HER2 permanecia estável após reconstituição, foram realizados estudos de estabilidade com as formulações de rhuMAb HER2 reconstituídas a 5 0 C e 2 5 0 C .

Para administração subcutânea, as formulações foram reconstituídas para 100 mg/mL (4 mL de BWFI). Para esta elevada concentração de proteína, a proteína pode ser mais susceptível a agregação do que a forma de dosagem intravenosa que foi reconstituída para 22 mg/mL de proteína (20 mL de BWFI). As quatro formulações de rhuMAb HER2 do exemplo anterior foram avaliadas quanto à agregação (perda de proteína intacta) . Como se mostra nas Tabelas 4 a 6, não existia qualquer diferença em estabilidade para formulações reconstituídas para 22 e 100 mg/mL de proteína. Adicionalmente, estas formulações mantiveram a proteína completamente intacta durante até 90 dias a 5°C e 30 dias a 25 °C, indicando que a proteína reconstituída podia ser armazenada refrigerada durante pelo menos 90 dias. Ao contrário da estabilidade da proteína liofilizada no exemplo 46 ΕΡ 1 516 628/PT anterior, a concentração de trealose na formulação não afectou a estabilidade da proteína (Tabela 7). TABELA 4

Estabilidade das formulações reconstituídas para rhuMAb HER2 liofilizado para 25 mg/mL de proteína em sucinato de sódio 5 mM, pH 5,0,trealose 60 mM, 0,01% de Tween 20™

Tempo (dias) % de proteína intacta 22 mg/mL de proteína 100 mg/mL de proteína 5°C 25°C 5°C 25°C 0 99,9 99,9 99, 7 99, 7 14 ND 100, 0 ND 100, 0 30 100,0 100,0 100,0 100, 0 91 99,8 ND 100 ND

As amostras foram reconstituídas com 4,0 ou 20,0 mL de BWFI (álcool benzilico a 1,1% ou 0,9%), e depois armazenadas a 5°C ou 25°C. A % de proteína intacta foi definida como a fracção da área de pico nativa conforme medida por cromatografia de exclusão de tamanhos nativa. ND = não determinada. TABELA 5

Tempo (dias) % de proteína intacta 22 mg/mL proteína 100 mg/mL proteína 5°C 25°C 5°C 25°C 0 100,0 100,0 100,0 100,0 14 ND 100,0 ND 100,0 31 99,3 99,7 100,0 100,0 61 100,0 ND ND ND

Estabilidade das formulações reconstituídas para rhuMAb HER2 liofilizado para 25 mg/mL de proteína em histidina 5 mM, pH 6,0, trealose 60 mM, 0,01% de Tween 20™

As amostras foram reconstituídas com 4,0 ou 20,0 mL de BWFI (álcool benzilico a 1,1% ou 0,9%), e depois armazenadas a 5°C ou 25°C. A % de proteína intacta foi definida como a fracção da área de pico nativa conforme medida por cromatografia de exclusão de tamanhos nativa. ND = não determinada. 1 47 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ TABELA 6

Estabilidade das formulações reconstituídas para rhuMAb HER2 liofilizado para 25 mg/mL de proteína em histidina 5 mM, pH 6,0, manitol 38,4 mM, sacarose 20,4 mM, 0,01% de Tween 20™ Tempo (dias) % de proteína intacta 1 22 mg/mL de proteína l 100 mg/mL de proteína 1 5°C 25°C 5°C 25°C 0 99,7 99,7 99,8 co : 14 ND 100, 0 ND ^Ω ^Ω co : 31 100,0 100, 0 100,0 100,0 : 92 100,0 ND 100,0 ND

As amostras foram reconstituídas com 4,0 ou 20,0 mL de BWFI (álcool benzílico a 1,1% ou 0,9%), e depois armazenadas a 5°C ou 25°C. A % de proteína intacta foi definida como a fracção da área de pico nativa conforme medida por cromatografia de exclusão de tamanhos nativa. ND = não determinada. TABELA 7

Estabilidade das formulações reconstituídas para rhuMAb HER2 liofilizado j para 21 mg/mL de proteína em sucinato de sódio 10 mM, pH 5,0, trealose j 250 mM, 0,2% de Tween 20™ Tempo (dias) % de proteína 1 21 mg/mL de proteína 5°C 25°C j 0 99,8 99, 8 j 14 ND 100,0 | 31 99,9 99, 4 | ; 92 99,8 ND |

As amostras foram reconstituídas com 20, 0 mL de BWFI (álcool benzílico a 0,9%), e depois armazenadas a 5°C ou 25°C. A % de proteína intacta foi definida como a fracção da área de pico nativa conforme medida por cromatografia de exclusão de tamanhos nativa. ND = não determinada.

Como mencionado anteriormente, o principal percurso de degradação para rhuMAb HER2 em soluções aquosas é a 48 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ desamidação ou formação de sucinimida. A perda de proteína nativa devida a desamidação ou formação de sucinimida foi avaliada para as quatro formulações de rhuMAb HER2 reconstituídas. A análise de desamidação de rhuMAb HER2 e formação de sucinimida foi realizada utilizando cromatografia de permuta de catiões. Uma coluna Bakerbond Wide-Pore Carboxy Sulfon (CSX) (4, 6 x 250 mm) foi operada com um caudal de 1 mL/min. Os tampões de fase móvel foram (A) fosfato de sódio 0,02 M, pH 6,9, e (B) fosfato de sódio 0,02 M, pH 6,9, NaCl 0,2 Μ. A cromatografia foi depois realizada a 40°C como se segue: TABELA 8

Tempo (min) % de Tampão B 0 10 55 45 57 100 62 100 62,1 10 63 10 A eluiçao dos picos foi monitorizada a 214 nm e carregaram-se 75 pg de proteína para cada análise.

Outra vez, não existiam quaisquer diferenças em estabilidade das formulações reconstituídas para 22 e 100 mg/mL de proteína (Figuras 5 a 7) . A degradação de proteína foi mais rápida a 25°C do que a 5°C para cada formulação, e a velocidade de degradação era comparável para todas as formulações armazenadas a 5°C. As formulações contendo histidina sofreram uma velocidade de degradação a 25°C ligeiramente superior à das formulações de sucinato. A quantidade de trealose na formulação não afectou a velocidade de degradação a qualquer temperatura (Figuras 5 e 8) . Estes resultados mostraram que estas quatro formulações proporcionam uma velocidade de degradação aceitável sob condições de armazenamento refrigeradas (5°C) para o período de utilização pretendido (30 dias após reconstituição com BWFI). 49 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ

As formulações multiutilização deverão passar o ensaio de eficácia de conservante como descrito pela US Pharmacopeia (USP) para utilização nos Estados Unidos da América. A formulação liofilizada de rhuMAb HER2 consistindo de 25 mg/mL proteína, histidina 5 mM, pH 6,0, trealose 60 mM, 0,01% de Tween 20™ foi reconstituída com 20 mL de álcool benzílico a concentrações entre 0,9 e 1,5% p/p. Para concentrações a ou acima de 1,3% p/p, a solução reconstituída tornou-se turva após incubação de um dia para o outro à temperatura ambiente (~25°C). A reconstituição com a solução padrão de BWFI (álcool benzílico a 0,9%) resultou numa solução que não passou consistentemente os testes de desafio de conservante. No entanto, a reconstituição com álcool benzílico a 1,0 ou 1,1% foi não só compatível com a formulação mas também passou o ensaio de desafio de conservante. As especificações do fabricante para a solução requeriam um intervalo de ± 10% e por conseguinte as formulações liofilizadas são reconstituídas com álcool benzílico a 1,1% (1,1 ± 0,1%).

Foi desenvolvido um ciclo de liofilização num único passo para a formulação de rhuMAb HER2. No ciclo de liofilização num único passo, rhuMAb HER2 a 25 mg/mL, trealose 60 mM, histidina 5 mM, pH 6, e 0,01% de polissorbato 20, foi liofilizada a uma temperatura de prateleira de 20°C e uma pressão de 150 mTorr. Após 47 horas, o teor de humidade residual do bolo liofilizado era inferior a 5%. Este ciclo de liofilização é considerado útil pelo facto de simplificar o processo de fabricação, eliminando o passo de secagem secundária. EXEMPLO 2

FORMULAÇÃO ANTI-IgE

Anticorpos de IgE ligam-se a receptores específicos de elevada afinidade sobre mastócitos, conduzindo a desgranulação de mastócitos e a libertação de mediadores, tais como histamina, que produzem sintomas associados a alergia. Por isso, anticorpos anti-IgE que bloqueiam a ligação de IgE ao seu receptor de elevada afinidade são de valor terapêutico potencial no tratamento de alergia. Estes anticorpos também não podem ligar-se a IgE após esta se ligar 50 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ ao receptor porque isto despoletaria a libertação de histamina. Este exemplo descreve o desenvolvimento de uma formulação liofilizada compreendendo anticorpo humanizado anti-IgE MaEll a todo o comprimento descrito em Presta et al. J. Immunology, 151: 2623-2632 (1993).

Materiais: Nas formulações descritas abaixo utilizou-se rhuMAb E25 altamente purificado (anticorpo humanizado recombinante anti-IgE MaEll) que não continha Tween 20™. As membranas de diálise Spectra/Por 7 foram compradas na Spectrum (Los Angeles, CA). Todos os outros reagentes utilizados neste estudo foram obtidos a partir de fontes comerciais e eram de grau de pureza analítico. Tampões de formulação e de fase móvel de cromatografia foram preparados por mistura da quantidade apropriada de tampão e de sal com água Milli-Q num balão volumétrico.

Formulação: Uma fracção de E25 S Sepharose foi dialisada em tampões de formulação como especificado. A diálise foi realizada por um mínimo de permutas de tampão de 4 x 2L durante um período de 48 horas a 2-8°C. Após diálise, o lioprotector foi adicionado numa concentração isotónica a algumas das formulações como requerido. A concentração de proteína após diálise foi determinada por espectroscopia de UV utilizando uma absortividade molar de 1,60. A proteína dialisada foi diluída até à concentração de formulação predeterminada com um tampão de formulação apropriado, esterilizada por filtração utilizando um filtro Millex-GV de 0,22 pm (Millipore) e dispensada em frascos de vidro pré-lavados e esterilizados em autoclave. Os frascos foram providos com rolhas de liofilização de teflon siliconizado e o conteúdo liofilizado utilizando as condições seguintes: a formulação E25 foi congelada até -55°C a 80°C/hora e o conteúdo do frasco foi mantido congelado durante 4 horas. A temperatura de prateleira foi elevada em rampa até 25°C a 10°C/hora para secagem primária. A secagem primária foi realizada a 25°C, uma pressão da câmara de vácuo de 50 μ durante 39 horas tal que a humidade residual do bolo liofilizado foi 1-2%. Após liofilização, um frasco de cada formulação foi removido para a análise a t = 0 e os frascos restantes foram mantidos a várias temperaturas que incluem 51 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ - 70°C, 28°C, 25°C, 30°C (temperatura ambiente controlada) 40 0C e 50 °C.

Cromatografia: A cromatografia de exclusão de tamanhos nativa foi realizada numa coluna Bio-Rad Bio-Select SEC 250-5 (300 x 7, 8 mm). A coluna foi equilibrada e operada em PBS com um caudal de 0,5 mL/min utilizando um HPLC Hewlett Packard 1090L equipado com detector de arranjo de díodo. Foram utilizados padrões de peso molecular (Bio-Rad, Inc.) consistindo de tiroglobulina (670 kD) , gama-globulina (158 kD) , ovalbumina (44 kD) e cianocobalamina (1,35 kD) para calibrar a coluna. A carga de amostra era 25 pg e a proteína foi detectada por monitorização da absorção de UV a 214 nm utilizando software Turbochrom 3 (PE Nelson, Inc.).

Cromatografia de interacção hidrofóbica: Fragmentos F(ab')2 do anticorpo E25 foram cromatografados utilizando uma coluna TosoHaas Butyl-NPR (3,5 x 4,6 mm) e um HPLC Hewlett Packard 1090L equipado com um detector de arranjo de díodo. O tampão de eluição A foi: Tris 20 mM, sulfato de amónio 2 M, 20% (v/v) de glicerol, pH 8,0, enquanto o tampão de eluição B foi: Tris 20 mM, 20% (v/v) glicerol, pH 8,0. A coluna foi equilibrada com 10% de tampão de eluição B com um caudal de 1,0 mL/min por um mínimo de 20 minutos. A carga de amostra era 5 pg e a proteína foi detectada por monitorização da absorção de UV a 214 nm utilizando o software de aquisição de dados Turbochrom 3 (PE Nelson, Inc.). Após injecção da amostra, a coluna foi mantida a 10% de tampão B durante 1 minuto seguindo-se um gradiente linear de 10% a 62% de tampão B em 20 minutos. A coluna foi lavada com 100% de tampão B durante 5 minutos e reequilibrada com 10% de tampão B por um mínimo de 20 minutos entre injecções sucessivas de amostra.

Actividade de ligação de anticorpo: Um ensaio de inibição da ligação de receptor de IgE (IE25:2) foi realizado como descrito em Presta et al., supra, em amostras diluídas a 20 pg/mL e 30 pg/mL em diluente de ensaio (solução salina tamponada com fosfato, 0,5% de BSA, 0,05% de polissorbato 20, 0,01% de Timerosol). Cada diluição foi depois analisada em triplicado e os resultados foram multiplicados por um factor de diluição apropriado para proporcionar uma concentração activa. Calculou-se a média dos resultados de 6 ensaios. O 52 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ ensaio mede a capacidade de rhuMAb E25 em se ligar competitivamente a IgE e desse modo impedir IgE de se ligar ao seu receptor de elevada afinidade que está imobilizado numa placa de ELISA. Os resultados são divididos pela concentração de anticorpo como determinado por espectroscopia de absorção de UV e reportados como uma actividade especifica. Experiências anteriores têm mostrado que este ensaio é indicativo de estabilidade.

Ensaio de particulado: Os conteúdos reconstituídos de frascos de rhuMAb E25 liofilizado foram reunidos para conseguir um volume de aproximadamente 7 mL. Determinou-se uma contagem do número de partículas de tamanho variando de 2 a 80 pm presentes em 1 mL de amostra utilizando um contador Hiac/Royco modelo 8000. O contador foi primeiro lavado com 1 mL de amostra três vezes seguindo-se a medição de 1 mL de amostra em triplicado. O equipamento determina o número de partículas por mL que são iguais a ou maiores do que 10 pm e o número de partículas por mL que são iguais a ou maiores do que 25 pm. O primeiro passo no desenvolvimento de uma formulação para o anticorpo anti-IgE foi determinar um tampão e um pH adequados para liofilização e armazenamento do produto. O anticorpo numa concentração de 5,0 mg/mL foi formulado em tampões de sucinato 10 mM variando de pH 5,0 a pH 6,5 e em tampões de fosfato de sódio, fosfato de potássio e histidina a pH 7,0. A Figura 9 mostra que se observaram percentagens aumentadas de agregado de anticorpo nas formulações a pH mais elevado, tanto antes como após liofilização. Uma excepção foi a formulação de histidina a pH 7, onde não se observou qualquer aumento em agregado no armazenamento a 2-8°C. A Figura 10 mostra rhuMAb E25 liofilizado em tampão histidina 5 mM para ambos os pH 6 e pH 7 e armazenado durante 1 ano a 2-8°C, 25°C e 40°C. Para cada tempo de ensaio e temperatura de armazenamento, a formulação a pH 6 tinha menos agregado do que o anticorpo formulado a pH 7. Estes resultados mostram que a histidina a pH 6 é um sistema de tampão particularmente útil para prevenir a agregação do anticorpo.

Para facilitar o rastreio de lioprotectores, o anticorpo anti-IgE foi formulado em sucinato de sódio a pH 5 com ou sem 53 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ um lioprotector. Lioprotectores potenciais, adicionados em concentrações isotónicas, foram agrupados em 3 categorias: (a) monossacárido não redutor (i.e. manitol); (b) dissacáridos redutores (i.e. lactose e maltose); e (c) dissacáridos não redutores (i.e. trealose e sacarose).

Nas Figuras 11 e 12 mostra-se a agregação das formulações após armazenamento a 2-8°C e 40°C durante um ano. Com armazenamento a 2-8°C, a formulação de monossacárido (manitol) formou agregados a uma velocidade similar à do controlo de tampão, enquanto formulações contendo os dissacáridos foram igualmente eficazes no controlo da agregação (Figura 11). Os resultados após armazenamento a 40°C eram similares com a excepção da formulação de sacarose que rapidamente formou agregados (o que estava relacionado com um escurecimento do bolo crio-dessecado (Figura 12)). Foi depois mostrado que isto era causado por degradação de sacarose após armazenamento não só a pH ácido mas também a temperatura elevada. A cromatografia de interacção hidrofóbica do anticorpo formulado em tampão de histidina a pH 6 com lactose mostra que o anticorpo é alterado após armazenamento durante 6 meses a 40°C (Figura 13). Os picos de cromatografia estão alargados e o tempo de retenção diminui. Estas alterações não são observadas com as formulações de controlo de tampão e de sacarose armazenadas sob condições similares como se mostra nas Figuras 14 e 15, respectivamente. Adicionalmente, a focagem isoeléctrica mostrou um desvio ácido no pi do anticorpo formulado em lactose e armazenado a 25°C e a 40°C. Isto indica que os açúcares redutores não são adequados como lioprotectores para o anticorpo.

Na Figura 16 mostra-se a agregação de formulações liofilizadas de anti-IgE numa concentração de 20 mg/mL em tampão de histidina 5 mM a pH 6 com várias concentrações de sacarose e trealose após armazenamento durante 12 semanas a 50°C. Ambos os açúcares têm um efeito protector similar sobre a agregação quando a concentração de açúcar é superior a 500 moles de açúcar por mole de anticorpo. A partir destes resultados, foram identificadas formulações isotónicas e 54 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ hipertónicas, tanto de sacarose como de trealose, para desenvolvimento subsequente. As formulações são desenhadas para serem utilizadas no enchimento, antes da liofilização, numa concentração de anticorpo relativamente baixa e o produto liofilizado é reconstituído, com menos volume do que o utilizado para enchimento, com áqua bacteriostática para injecção (BWFI) compreendendo álcool benzílico a 0,9%. Isto permite a concentração do anticorpo imediatamente antes da entrega subcutânea e inclui um conservante para uma formulação multiutilização potencial ao mesmo tempo evitando interacções entre a proteína e o conservante durante o armazenamento a longo prazo.

Formulação isotónica: Anti-IgE foi formulado para 25 mg/mL em tampão histidina 5 mM a pH 6 com 500 moles de açúcar por mole de anticorpo o que iguala uma concentração de açúcar de 85 mM. Esta formulação é reconstituída com BWFI (álcool benzílico a 0,9%) para um volume que é quatro vezes inferior ao que foi utilizado para enchimento. Isto resulta numa concentração de 100 mg/mL de anticorpo em histidina 20 mM a pH 6 com uma concentração de açúcar isotónica de 340 mM.

Formulação hipertónica: Anti-IgE foi formulado para 25 mg/mL em tampão histidina 5 mM a pH 6 com 1000 moles de açúcar por mole anticorpo o que iguala uma concentração de açúcar de 161 mM. Esta formulação é reconstituída com BWFI (álcool benzílico a 0,9%) para um volume que é quatro vezes inferior ao que foi utilizado para enchimento. Isto resulta numa concentração de 100 mg/mL de anticorpo em histidina 20 mM a pH 6 com uma concentração de açúcar hipertónica de 644 mM.

Nas Figuras 17 a 19 mostram-se comparações da agregação de anticorpo das formulações isotónica e hipertónica após armazenamento durante até 36 semanas. Não se observa qualquer alteração na agregação em ambas as formulações hipertónicas ou isotónicas com o armazenamento a 2-8°C (Figura 17). Com armazenamento a temperatura ambiente controlada (30°C) não é observada agregação aumentada nas formulações hipertónicas enquanto ocorre um aumento de agregado de 1 a 2% nas formulações isotónicas (Figura 18). Finalmente, após armazenamento a 50°C observa-se um aumento mínimo em agregado 55 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ com as formulações hipertónicas, um aumento de 4% em agregado ocorre com a formulação de trealose isotónica e um aumento de 12% em agregado ocorre com a formulação de sacarose isotónica (Figura 19). Estes resultados mostram que a formulação isotónica contém a quantidade mínima de açúcar necessária para manter a estabilidade do anticorpo com o armazenamento a uma temperatura até 30°C. A actividade de ligação de anti-IgE nas formulações isotónicas e hipertónicas foi medida num ensaio de inibição do receptor de IgE. Constatou-se que a actividade de ligação das formulações de sacarose e trealose isotónicas e hipertónicas ficou essencialmente inalterada após armazenamento a -70°C, 2- 8°C, 30°C e 50°C durante até 36 semanas. É conhecido que formulações liofilizadas de proteínas contêm agregados ou particulados insolúveis (Cleland et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 10 (4):307-377 (1993)). Por conseguinte, foi realizado um ensaio de particulado de anticorpo liofilizado para uma concentração de 25 mg/mL em histidina 5 mM, pH 6, com a adição de sacarose e trealose 85 mM e 161 mM. Adicionou-se polissorbato 20 às formulações numa concentração de 0,005%, 0,01% e 0,02%. As amostras foram liofilizadas e ensaiadas após reconstituição para 100 mg/mL de anticorpo em histidina 20 mM, pH 6, com açúcar 340 mM e 644 mM. A concentração de polissorbato 20 após reconstituição era 0,02%, 0,04% e 0,08%. A Tabela 9 abaixo mostra o número de partículas de tamanho igual ou maior do que 10 pm e igual ou maior do que 25 pm a partir das formulações de sacarose e trealose isotónicas e hipertónicas. Adicionou-se polissorbato 20 às formulações em concentrações de 0,005%, 0,01% e 0,02% antes da liofilização. Os resultados mostram que a adição de Tween™ à formulação reduz significativamente o número de partículas em cada intervalo de tamanho testado. As especificações da US Pharmacopeia (USP) para injecções de pequeno volume são não mais do que 6000 partículas maiores ou iguais a 10 pm e não mais do que 600 partículas maiores ou iguais a 25 pm por recipiente (Cleland et al., supra). Com a 56 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ adiçao de polissorbato 20, ambas as formulações hipertónicas e isotónicas passam esta especificação. TABELA 9

Formulação Polissorbato 20 Partículas por mL £ 10 μπι £ 25 μπι Sacarose isotónica Nenhum 16122 28 0,005% 173 2 0, 01% 224 5 0,02% 303 6 Sacarose hipertónica Nenhum 14220 84 0,005% 73 6 0,01% 51 0 0,02% 6 Trealose isotónica Nenhum 33407 24 0,005% 569 4 0,01% 991 16 0, 02% 605 9 Trealose hipertónica Nenhum 24967 28 0,005% 310 11 0, 01% 209 6 0, 02% 344 6

Na Tabela 10 abaixo mostra-se uma formulação desenvolvida para o anticorpo anti-IgE (i.e. 143 mg de formulação isotónica de rhuMAb E25 por frasco) que é considerada útil para entrega subcutânea deste anticorpo. Um frasco de 10 cm3 é cheio com 5,7 mL de rhuMAb E25 numa concentração de 25 mg/mL formulado em histidina 5 mM a pH 6,0 com 0,01% de polissorbato 20. É adicionada sacarose como um lioprotector numa concentração de 85 mM o que corresponde a uma proporção molar de açúcar para anticorpo de 500 para 1. O conteúdo do frasco é liofilizado e reconstituído com álcool benzílico a 0,9% até um quarto do volume do enchimento ou 1,2 mL. A concentração final de componentes na formulação é aumentada quatro vezes até 100 mg/mL de rhuMAb E25 em histidina 20 mM a pH 6 com 0,04% de polissorbato 20 e sacarose 340 mM (isotónica) e álcool benzílico a 0,9%. A formulação contém tampão de histidina a pH 6 por causa do seu 57 ΕΡ 1 516 628/ΡΤ efeito protector demonstrado sobre a agregação do anticorpo. Foi adicionada sacarose como o lioprotector por causa da utilização anterior na indústria farmacêutica. A concentração de açúcar foi escolhida para resultar numa formulação isotónica após reconstituição. Finalmente, o polissorbato 20 é adicionado para prevenir a formação de agregados insolúveis. TABELA 10

Formulação pré-liofilizada (Enchimento de 5,7 mL num frasco de 10 cm3) Formulação reconstituída (1,2 mL de álcool benzílico a 0,9%) rhuMAb E25 25 mg/mL rhuMAb E25 100 mg/mL Histidina 5 mM, pH 6,0 Histidina 20 mM, pH 6,0 Sacarose 85 mM Sacarose 340 mM 0,01% de polissorbato 20 0,04% de polissorbato 20 - Álcool benzílico a 0,9%

Lisboa, 2013-09-18

Claims

ΕΡ 1 516 628/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação compreendendo uma mistura liofilizada de um lioprotector e de um anticorpo, onde a proporção molar de lioprotector : anticorpo é 200-600 moles de lioprotector : 1 mole de anticorpo, onde o lioprotector é trealose ou sacarose e onde o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, onde o anticorpo é um anticorpo anti-HER2 ou um anticorpo anti-IgE.
3. Formulação de acordo com a reivindicação 2, onde o anticorpo é humanizado.
4. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, onde a formulação compreende um tensioactivo.
5. Formulação de acordo com a reivindicação 4, onde o tensioactivo é polissorbato 20.
6. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, onde a formulação compreende um tampão.
7. Formulação de acordo com a reivindicação 6, onde o tampão é um tampão de histidina ou de sucinato.
8. Método para preparação de uma formulação, o método compreendendo os passos de: (a) liofilização de uma mistura de um lioprotector e de um anticorpo, onde a proporção molar de lioprotector : anticorpo é 200-600 moles de lioprotector : 1 mole de anticorpo, onde o lioprotector é trealose ou sacarose e onde o anticorpo é um anticorpo monoclonal; e (b) reconstituição da mistura liofilizada do passo (a) num diluente tal que a formulação reconstituída é isotónica e estável e tem uma concentração de anticorpo de pelo menos 50 mg/mL, onde a concentração de anticorpo na formulação reconstituída é cerca de 2-40 vezes mais elevada do que a concentração de anticorpo na mistura antes da liofilização. ΕΡ 1 516 628/ΡΤ 2/2
9. Método de acordo com a reivindicação 8, onde o anticorpo é um anticorpo anti-HER2 ou um anticorpo anti-IgE.
10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, onde a formulação compreende um tampão.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, onde o tampão é um tampão de histidina ou sucinato. Lisboa, 2013-09-18