PT1694709E - Imunotoxinas anti-cd64-eta¿ recombinantes - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "IMUNOTOXINAS ANTI-CD64-ETA' RECOMBINANTES"

Campo Técnico A presente invenção refere-se, em geral, ao tratamento de doenças envolvendo CD64 e, mais especificamente, à preparação e utilização de complexos recombinantes, contendo ligandos específicos de CD64 que induzem internalização do complexo após ligação e também agentes citotóxicos, de modo a alterar a função, expressão génica ou viabilidade de uma célula de um modo terapêutico.

Antecedentes da invenção

As medicações actualmente disponíveis para o tratamento de uma ampla variedade de doenças, tais como agentes quimioterapêuticos, corticosteróides e agentes imunossupressores não específicos, têm a desvantagem de potencialmente induzirem algum dano genérico, em virtude da sua não especificidade relativa. Foi tentado moderar esta por intermédio de diversos conceitos terapêuticos. Uma abordagem alternativa é a utilização de agentes imunoterapêuticos para aumentar a especificidade de medicamentos. Esta abordagem foi especialmente descrita para o tratamento de tumores.

Se o agente imunoterapêutico for uma imunotoxina, então, um anticorpo monoclonal (moAb) ou um fragmento de anticorpo que tem 1 uma afinidade especifica para, e. g., marcadores de superfície de células tumorais, é ligado com um reagente citotóxico. Como reagentes citotóxicos foram utilizadas toxinas e radioactividade. Um efeito terapêutico directo sobre as células alvo foi alcançado com anticorpos ligados a elementos radioactivos ou toxinas, de modo a formar os denominados radioimunoconjugados ou imunotoxinas (IT). Quando foram utilizados moAb anti-célula B, radioactivamente marcados, com linfomas de células B, foram observadas regressões tumorais e até remissões completas (1). Em contraste, os resultados com moAb contra tumores sólidos foram bastante decepcionantes. 0 tamanho relativamente grande das IT utilizadas nestes estudos pareceu interferir com a sua capacidade para penetrar os tumores e tornou-as terapêutica ineficaz. A baixa taxa de penetração tumoral colocou um problema particularmente desafiante para tumores fracamente vascularizados. De modo a obter melhor penetração tecidular e tumoral e, em geral, melhores propriedades de difusão, as IT foram miniaturizadas. Foi também especulado que estas IT mais pequenas seriam menos imunogénicas, em virtude do tamanho reduzido dos determinantes antigénicos (2) . Por conseguinte, fragmentos de anticorpo proteoliticamente clivados (miniaturizados) foram conjugados às funções efectoras anteriormente mencionadas (elementos radioactivos ou toxinas). Técnicas de clonagem melhoradas permitiram a preparação de IT completamente recombinantes: regiões codificantes de regiões variáveis de cadeia leve e pesada de imunoglobulina, amplificadas por reacção de polimerização em cadeia, foram ligadas em conjunto por um adaptador sintético, e. g., (Gly4Ser)3. 0 fragmento de cadeia simples resultante de genes de região variável (scFv) foi, depois, geneticamente fundido a uma 2 região codificante de uma enzima cataliticamente activa, incluindo proteínas ou polipéptidos citotoxicamente activos (3).

Os venenos celulares peptídicos que, até à data, têm sido maioritariamente utilizados e, deste modo, mais bem caracterizados são as toxinas bacterianas toxina da difteria (DT), exotoxina A de Pseudomonas (PE) e a Ricina A derivada de plantas (4). Não obstante os seus antecedentes evolutivos diferentes, o mecanismo de actividade citotóxica é essencialmente o mesmo em todas estas toxinas. 0 domínio catalítico inibe a biossíntese proteica por modificação directa do factor de alongamento 2 (EF-2), que é importante para tradução, ou por inactivação do sítio de ligação de EF-2 na subunidade 28S-rRNA de ribossomas.

Na maior parte das construções empregues até à data, a aplicação sistémica de imunotoxinas resulta em efeitos secundários mais ou menos graves. Adicionalmente à síndrome de "derrame vascular", também ocorrem trombocitopenia, hemólise, insuficiência renal e náusea, dependendo da construção empregue e da dosagem aplicada (4). Também foi observada lesão hepática dependente de dose (5) . Adicionalmente aos efeitos secundários documentados, a imunogenicidade das construções é um dos problemas chave da imunoterapia. Isto aplica-se, em particular, à defesa humoral contra os domínios catalíticos empregues, tais como ricina (HARA), PE ou DT (2). Teoricamente, todas as estruturas não humanas podem provocar uma resposta imunitária. Deste modo, a administração repetida de imunotoxinas e imunoconjugados é limitada. Uma consequência lógica destes problemas é o desenvolvimento de imunotoxinas humanas. 3

Até à data, as toxinas humanas utilizadas em imunotoxinas foram, na maioria dos casos, seleccionadas de ribonucleases (6). Visto que as RNases humanas estão presentes em fluidos extracelulares, plasma e tecidos, as mesmas são consideradas menos imunogénicas quando utilizadas em imunotoxinas. Angiogenina (ANG), uma proteina de 14 kDa tendo uma homologia de sequência de 64% com RNase A, foi primeiro isolada de um meio condicionado de célula tumoral, onde foi descoberta, em virtude da sua capacidade de indução de angiogénese (7) . Mostrou-se que a actividade de RNase especifica de ARNt de Angiogenina tem um potencial citotóxico. De acordo com isto, imunotoxinas quimicamente conjugadas subsequentemente exibiram uma actividade tóxica especifica de célula. De modo a avaliar a eficácia de imunotoxinas baseadas em ANG, diferentes conformações de ANG com, e. g., factor de crescimento epidérmico (EGF) ou ligando CD30, foram construídas e testadas com êxito in vitro (8). Outro membro da superfamilia de RNase é a neurotoxina eosinofílica (EDN) . Para EDN, que tem um tamanho de 18,4 kDa, até à data apenas foi descrita a neurotoxicidade directa. Com base na potência documentada, diferentes imunotoxinas baseadas em EDN foram construídas e testadas com êxito in vitro (9).

Muito recentemente, mostrou-se que proteases como a granzima B, ou seus derivados, podem eficientemente preencher a função efectora de imunotoxinas (documento PCT/EP01/04514) . CD64 é uma glicoproteina de superfície celular de 72 kDa, que é normalmente expressa em monócitos/macrófagos e células dendríticas (10). As funções biológicas mediadas por este receptor incluem produção de superóxido e citocina (TNF-α, IL-1, IL-6), citotoxicidade, endocitose/fagocitose e suporte de apresentação de antigénio. Este receptor representa um alvo 4 apropriado para imunoterapia de malignidades hematológicas, em virtude de não estar presente em células estaminais e, deste modo, garantindo regeneração de células efectoras imunitárias positivas para CD64 normais (11). 0 objectivo derradeiro no tratamento de doentes de cancro é a eliminação de cada célula tumoral. Doentes com leucemia mielóide aguda (AML) têm um total de 1012 a 1013 células malignas no momento do diagnóstico. Por definição, a remissão completa é alcançada após terapia logo que menos de 5% de células malignas sejam detectáveis na medula óssea. Contudo, neste momento, estes doentes podem ainda transportar tanto como IO10 células malignas na corrente sanguínea. Estas células residuais mínimas, clinicamente não identificáveis, são a causa mais comum de recidiva (12). Não obstante os avanços em poliquimioterapia e radioterapia, apenas cerca de 20%-30% de doentes com AML alcançam sobrevivência isenta de doença de longo prazo, após terapia de primeira linha. Deste modo, a eliminação de doença residual mínima (MRD) poderá melhorar o resultado de doentes com AML. Abordagens selectivas, incluindo terapias baseadas em anticorpo, direccionamento de agentes citotóxico para estas células poderão oferecer uma ferramenta promissora para eliminação específica de MRD. De modo a melhorar a actividade antitumoral de anticorpos nativos, fármacos, isótopos e toxinas foram conjugados a anticorpos monoclonais (13).

Recentemente, uma imunotoxina anti-CD64 quimicamente ligada mostrou rápida ligação e internalização eficiente dentro de células de leucemia positivas para CD64 in vitro e in vivo (14). A requerente documentou rápida regressão tumoral de massas tumorais variando entre 85% e > 90%, num modelo de AML humana em murganhos NOD/SCID. O principal obstáculo observado neste e 5 outros ensaios eram toxicidades não especificas, principalmente relacionadas com a sindrome de derrame vascular induzida por toxinas quimicamente ligadas baseadas em Ricina A, em virtude da sua ligação não especifica a células epiteliais (13-15). 0 problema associado a imunotoxinas presentemente utilizadas, quimicamente ligadas, são a sua toxicidade, tamanho e composição não específicos, resultando numa reduzida eficiência do agente terapêutico.

Em contraste com Sera et al., 2001 (15) é divulgado que através do aumento da valência do ligando de ligação, é alcançado um aumento significativo na citotoxicidade in vivo da imunotoxina num modelo de murganho inflamatório crónico. As imunotoxinas bivalentes também podem ser utilizadas no campo do tratamento de doenças (malignas), tais como leucemia mielóide aguda, artrite, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD); incluindo, e. g., enfisema, asma intrínseca e extrínseca, doença cutânea, incluindo, e. g., dermatite atópica, erupção polimórfica à luz, lúpus eritematoso sistémico (SLE) ou doenças auto-imunes, e. g., enxerto versus hospedeiro, esclerose múltipla, sindrome de activação macrofágica, artrite reumatóide, artrite juvenil, doenças intestinais; incluindo, e. g., doença de Crohn, doença intestinal crónica. R.K. Zhoug in JOURNAL OF HEMATOTHERAPY & STEM CELL RESEARCH 10:95-105 (2001) divulga que células blásticas de doentes com leucemia mielóide aguda (AML) geralmente expressam CD64, o receptor de elevada afinidade para imunoglobulina G (FcyRI). Foi construída uma imunotoxina (MDX-44) através da ligação de anticorpo monoclonal anti-CD64 humanizado (mAb) H22, por meio de um ligante bivalente, a cadeia de ricina A desglicolisada (RA) . 6

Linhas celulares de leucemia humanas foram incubadas com MDX-44 ou RA isento de H22. 0 efeito de MDX-44 sobre a proliferação de células de leucemia foi avaliado por incorporação de [3H]timidina. Na presença de interferão-γ (IFN-γ), MDX-44 inibiu significativamente a proliferação de células HL-60, NB4, e U937 CD64+ em culturas de 72 h, num modo dependente de dose. 0 mecanismo de acção pareceu ser a indução de apoptose, como medida por coloração de iodeto de propidio e análise de citometria de fluxo. Contudo, células KG-la e Daudi CD64~ não foram afectadas por MDX-44/ifn-y. Incubação de células HL-60 com MDX-44/IFN-y resultou numa diminuição de 99% em unidades de formação de colónias, ao passo que células de formação de colónias em medula óssea normal não foram significativamente suprimidas por tal tratamento. Células de 60% de doentes de aml (6/10) foram inibidas por MDX-44/IFN-y e a inibição foi correlacionada com expressão de CD64 nestas células (r = 0,65). Num modelo AML humano em murganhos NOD/SCID, MDX-44/IFN-y inibiu 95-98% de proliferação celular AML de exsudado peritoneal e 85-90% de massas sólidas de leucemia. O efeito de MDX-44 sobre células AML era dependente da activação de células por IFN-γ. MDX-44/IFN-y pode ter valor na terapia de células AML expressando CD64 de superfície celular. S. Barth et al. em APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Abril de 2000, p. 1572-1579, divulga uma nova estratégia para a expressão de rIT funcional dirigida para o espaço periplasmático de Escherichia coli. rIT foram recuperadas por congelação-descongelação de sedimentos de culturas agitadas de bactérias cultivadas sob stress osmótico (NaCl a 4% mais sorbitol a 0,5 M) na presença de solutos compatíveis. Solutos compatíveis, tais como glicina betaína e hidroxiectoína, são osmólitos de baixo peso molecular que ocorrem naturalmente em 7 bactérias halofílicas e são conhecidos por protegerem proteínas a elevadas concentrações de sal. Adicionando glicina betaina a 10 mM para o cultivo de E. coli sob stress osmótico permitiu não apenas que as bactérias crescessem sob estas condições de outro modo inibitórias, mas também produziu um microambiente periplasmático para a geração de elevadas concentrações de rIT correctamente enroladas. Proteina purificada por combinações de cromatografia de afinidade de ião metálico e de exclusão de tamanho foi substancialmente estabilizada na presença de hidroxiectoina a 1 M, após várias séries de congelação-descongelação, mesmo a concentrações de proteina muito baixas. As propriedades de ligação e potência citotóxica das rIT foram confirmadas por experiências competitivas. Esta nova expressão guiada por soluto compatível e estratégia de purificação poderá também ser aplicável para produção periplasmática de alto rendimento de proteínas recombinantes em diferentes sistemas de expressão. B. Matthey et al. em Gene 229(1999) 145-153 divulga o desenvolvimento de um novo sistema de expressão bacteriano para produção de elevado nível de rIT. Os mesmos construíram uma série de vectores baseados em pET para secreção periplasmática dirigida por pelB ou produção citoplasmática, sob o controlo do promotor T7lac. Expressão em Escherichia coli BL21(DE3)pLysS permitiu uma indução de isopropil-p-d-tiogalactopiranósido (IPTG) fortemente regulada de síntese proteica. Um aglomerado de poli-histidina clivável por enterocinase foi introduzido dentro desta configuração para purificação por cromatografia de afinidade. Uma importante modificação resultou da inserção de um sítio de múltipla clonagem especificamente concebido. O mesmo contém apenas raros sítios de reconhecimento de restrição enzimática, utilizados para clonagem de genes de região variável de imunoglobulina, assim como sítios de restrição SfiI e NotI únicos para inserção dirigida de fragmentos variáveis de cadeia simples (scFv), disponíveis a partir de sistemas bacteriofágicos estabelecidos. Para este efeito, os mesmos delecionaram dois sítios consenso Sfíl internos, de ocorrência natural, num mutante de deleção de exotoxina A (ETA') de Pseudomonas aeruginosa. Cada elemento estrutural do novo vector (promotor, sequência condutora, cauda de purificação, sequência scFv, marcador seleccionável e gene de toxina) foi flanqueado por sítios de restrição únicos, permitindo substituição direccional simples. A fidelidade de indução de IPTG e expressão de elevado nível foram demonstradas utilizando um scFv anti-CD30 (Ki-4) fundido a ETA'. Estes dados confirmam um sistema vector bacteriano especialmente concebido para eficiente expressão periplasmática de toxinas de fusão baseadas em ETA'. 0 documento WO-A-01/80880 divulga um complexo formado, pelo menos, por componente A e, pelo menos, componente B, em que o componente A transporta uma actividade de ligação para estruturas de superfície celulares e o componente B transporta uma protease, tal como uma granzima B, como função efectora.

Sumário da invenção A presente invenção divulga um complexo recombinante formado de, pelo menos, um componente A, pelo menos, um componente B e, pelo menos, um componente C suplementar, pelo que o componente A compreende um domínio de ligação para o receptor de superfície celular CD64 e o componente B um domínio de morte celular. 0 domínio de ligação do componente A é seleccionado do grupo de moléculas ligando-se activamente, 9 consistindo em anticorpos ou seus derivados ou fragmentos, péptidos sintéticos ou moléculas de baixo peso molecular, ligandos, moléculas de ligação de receptor e seus derivados, mutantes ou suas combinações, que se ligam a CD64. É adicionalmente divulgado que o componente A tem valência superior para CD64, por compreender dois ou mais dominios de ligação, idênticos e/ou diferentes, para CD64. E adicionalmente divulgado que o componente B do complexo altera directamente a função, expressão génica ou viabilidade de uma célula num modo terapêutico e, de modo mais particular, inactiva moléculas responsáveis por biossintese proteica ou activa componentes de apoptose inerente a célula, induzindo apoptose em células definidas através da ligação de componente A. 0 componente B do domínio de morte celular tem propriedades citotóxicas ou é, pelo menos, um membro das enzimas de ribosilação de ADP, tais como a Exotoxina A de Pseudomonas, Difteria, Cólera ou a Tosse Convulsa, Toxina Botulínica, ou um membro das proteínas de inactivação de ribossoma, tais como Diantina, Saporina, Briodina, Gelonina, Ricina, Abrina, Proteína Antivírica da Erva-tintureira (PAP) ou Restrictocina, ou é um membro das RNases (Fosfodiesterases), tais como a RNase seminal Bovina, RNase A Bovina, RNase pancreática Bovina, Angiogenina, Neurotoxina derivada de Eosinófilo (EDN), Proteína Catiónica Eosinofílica (ECP), Onconase, ou Lectina de Rã-touro, ou é um membro das enzimas de activação de Profármacos, tais como Caliqueamicina, Glucose Oxidase, Carboxipeptidase, Fosfatase Alcalina, Citosina-desaminase, beta-Glucosidase, beta-Glucuronidase, beta-Lactamase, Nitrorredutase, Timidina-cinase ou Fosforilase de Nucleósido Purina, ou é um membro da família da catepsina protease, ou um membro das calpaínas, ou um membro das granzimas, ou qualquer derivado das 10 proteínas anteriormente mencionadas, ou uma sua combinação. Numa forma de realização adicional, o componente C suplementar do complexo da presente invenção regula a expressão do gene(s) codificando o complexo. 0 componente C pode possibilitar a purificação do complexo ou seus componentes, suportar a remoção proteolítica de componente A do componente B, ou a internalização do componente B dentro da célula alvo ou a translocação de componente B para dentro de um compartimento subcelular e/ou possibilitar a activação intracelular de componente B. A presente invenção refere-se ao complexo monovalente m22(scFv)-ETA' (SEQ ID N° 7) e ao complexo bivalente m22 (scFv)2-ETA' (SEQ ID N° 8). Também as moléculas de ácidos nucleicos, ADN e/ou ARN codificando para qualquer um dos referidos complexos ou para os componentes individuais para a preparação de um tal complexo, são formas de realização da presente invenção; em particular ácidos nucleicos com as SEQ ID Nos 5 e 6 codificando o complexo monovalente m22(scFv)-ETA' (SEQ ID N° 7) e o complexo bivalente m22 (scFv)2-ETA' (SEQ ID N° 8), respectivamente. Também os vectores compreendendo as referidas moléculas de ácidos nucleicos são formas de realização da presente invenção.

Formas de realização adicionais são células ou organismos não humanos sintetizando os referidos complexos, obteníveis através de transformação ou transfecção de células ou organismo não humano com as moléculas de ácidos nucleicos ou vectores das formas de realização anteriormente descritas. Os organismos ou células de acordo com a presente invenção são procariotas, tais como E. coli, B. subtilis, S. carnosus, S. coelicolor ou Marinococcus sp., eucariotas inferiores, tais como Saccharomyces 11 sp., Aspergillus sp.r Spodoptera sp. ou P. pastoris. É também uma forma de realização da presente invenção um medicamento contendo o complexo, moléculas de ácidos nucleicos, vectores, células/extractos celulares ou organismo(s) unicelular, tais como procariotas e/ou eucariotas inferiores, ou extractos de qualquer um dos organismos da presente invenção. É uma forma de realização adicional a utilização do complexo da presente invenção, das moléculas de ácidos nucleicos e/ou dos vectores para influenciar o crescimento celular e a fisiologia de células positivas para CD64; para isso, as células são colocadas em contacto com o complexo e/ou as moléculas de ácidos nucleicos ou vectores, opcionalmente na presença de agentes de transfecção/transdução para proteínas ou ácidos nucleicos, visto serem bem conhecidas do especialista na técnica. É uma forma de realização adicional a utilização do complexo, das moléculas de ácidos nucleicos codificando para esse fim, dos vectores e/ou das células ou organismos para a preparação de um medicamento para o tratamento de leucemia mielóide aguda, reacções de inflamação crónica, tais como: enfisema, asma intrínseca e extrínseca, dermatite atópica, erupção polimórfica à luz, SLE; enxerto versus hospedeiro, esclerose múltipla, síndrome de activação macrofágica, artrite reumatóide, artrite juvenil; doença de Crohn e doença intestinal crónica. É uma forma de realização adicional da presente invenção um método para influenciar o crescimento celular e fisiologia de células CD64+, compreendendo as seguintes etapas: (a) colocação em contacto de células, tecido isolado ou órgãos isolados com o complexo; ou (b) transfecção de células, tecido isolado ou órgãos isolados com as moléculas de ácidos nucleicos. Além disso, a presente invenção compreende um método para produzir o complexo recombinante da invenção, compreendendo as seguintes etapas: transformação/transfecção de células, microrganismo, tais como 12 bactérias, fungos e/ou ciliados, com as moléculas de ácidos nucleicos ou vectores codificando o complexo recombinante ou componentes do mesmo; (b) cultivo das células e/organismos da etapa (a) sob condições adequadas para expressão génica e síntese proteica, de modo a acumular o complexo recombinante intracelularmente ou no meio de cultura circundante; e (c) isolamento e purificação do complexo recombinante da etapa (b).

Breve descrição dos desenhos

Figura 1: Clonagem de m22(scFv)-ETA' e m22 (scFV) 2-ETA'. (a) amplificação por PCR de m22(scFv) (M, escada de 100 pb; corredor 1-4, m22(scFv) (852 pb) ; C, controlo negativo) (b) Estrutura esquemática da região codificante de m22(scFv)-ETA' monovalente e m22(scFV) 2-ETA' bivalente no vector de expressão pET27b de E. coli. O módulo de expressão é composto pelo operador T7-lac indutível por IPTG, o péptido sinal da pectato liase de Erwinia carotovora- (pelB), um aglomerado de Hisi0 sintético e clivável por enterocinase (His-Tag), o scFv m22 anti-CD64 e a região codificante de ETA'.

Figura 2: Expressão bacteriana e purificação de proteínas m22(scFv)-ETA' e m22(scFv) 2-ETA'; (a) proteína m22(scFv)-ETA' após IMAC e SEC, como documentado após SDS-PAGE a 10% (p/v) e coloração Coomassie; 1, m22(scFv)-ETA' (67 kDa); M, Marcador Pré-corado (Bio-Rad) (b) imunotransferência corada com moAb anti-ETA' TC-1 (identificação de corredor correspondente ao painel 2a); (c) proteína m22(scFv) 2-ETA' após NiNTA e SEC, como documentado após SDS-PAGE, transferência de Western e 13 coloração Coomassie; M, Marcador; 1, m22(scFv) 2-ETA' (~ 100 kDa) .

Figura 3: Comparação de eficácia de toxinas imunitárias CD64 na morte in vivo de macrófagos inflamatórios dérmicos murinos. São representadas tanto a toxina recombinante monovalente como bivalente e o anticorpo H22 intacto quimicamente ligado a Ricina A. O eixo vertical mostra a percentagem de morte comparada com locais injectados com placebo e o eixo horizontal contém as diferentes concentrações Molares utilizadas referindo-se à fracção de toxina.

Figura 4: Propriedades de ligação da imunotoxina anti-CD64 recombinante m22(scFv)-ETA'. (a) Ligação de m22(scFv)-ETA' a membranas celulares negativas para CD64 L540Cy e membranas celulares derivadas de AML positivas para CD64 HL-60 documentada por CM-ELISA. (b) Ligação de m22(scFv)-ETA' a células positivas para antigénio por fluxo ou com PBS como controlo negativo. A. Citometria de células L540Cy. As células foram coradas com imunotoxina purificada corada com imunotoxina especifica de CD64. B. Células HL-60 coradas com imunotoxina especifica de CD64. (c) Documentação de actividade de ligação especifica de m22(scFv)-ETA', utilizando um CM-ELISA com diferentes diluições de moAb m22 para competição. A ligação de m22(scFv)-ETA' foi detectada com moAb anti-His conjugado a peroxidase. São apresentados dados de três experiências independentes.

Figura 5: (a) Inibição de crescimento de linhas celulares derivadas de AML após incubação com o m22 (scFv)-ETA' 14 monovalente, como documentado por ensaios de viabilidade celular (18) . (a) HL-60 (CD64+) ou L540Cy (CD64~) e (b) U937 (CD64+) ou IIA1.6 (CD64“) foram tratadas com diversas diluições de imunotoxina anti-CD64 recombinante. HL-60, U937 (-) ou L540Cy, IIA1.6 (---) foram tratadas com m22(scFv)-ETA' e a sua capacidade para metabolizar o XTT num sal de formazano hidrossolúvel (formado por actividade de desidrogenase mitocondrial) foi medida como absorvência a 450 e 650 nm. As medições foram realizadas em triplicado. Os resultados são apresentados como percentagem de células de controlo não tratadas, (d) e (e) mostram a inibição de crescimento de linha celular mielóide aguda promielocitica HL60 e linhas celulares de linfoma histiocítico U 937, após incubação com o m22(scFv) 2-ETA' bivalente, como documentado por ensaios de viabilidade celular (18). Em (d) e (e) HL60 (CD64+) ou U937 (CD64+)HL-60 foram tratadas com rIT e a sua capacidade para metabolizar o XTT num sal de formazano hidrossolúvel (formado por actividade de desidrogenase mitocondrial) foi medida como absorvência a 450 e 650 nm (comprimento de onde de referência) num ensaio de viabilidade celular (18). As medições foram realizadas em triplicado. Os resultados são apresentados como percentagem de células de controlo não tratadas. Actividade citotóxica de m22 (scFv) 2-ETA' (-) em HL60, células U397 (----) e células L540Cy (CD64“) foram utilizadas como controlos negativos (não mostrado, -100% de viabilidade). As medições foram, de novo, realizadas em triplicado. Equação de exibição no gráfico U 937; y = -7,7304Ln(x) + 30,976; valor de R elevado ao quadrado de exibição no gráfico R2 = 0, 9941; Equação de exibição no gráfico HL 60; y = -8,2582Ln(x) + 28,482; valor de R elevado ao quadrado 15 de exibição no gráfico R2=0,9774; IC50 m22(scFv)2-ETA'=HL60 11,715 ng/mL; U937 13,54 ng/mL.

Figura 6: Análise de citometria de fluxo de apoptose induzida em células AML de fresco derivadas de doente pela imunotoxina anti-CD64 recombinante m22(scFv)-ETA' . (a) Ligação de m22(scFv)-ETA' (linhas pretas transparentes) em células primárias. As células foram coradas com Anexina-V-FITC e PI simultaneamente, (b) Tratamento tanto de células primárias AML CD64~ assim como CD64+ derivadas de doente com 100 ng/mL de m22(scFv)-ETA'. Os números no quadrante direito inferior e superior de cada representação gráfica representam a percentagem de células em apoptose precoce (Annv+/Pi-) e apoptose/necrose tardia (AnnV+/Pl+) respectivamente. Os dados são representativos para três experiências separadas realizadas com estas amostras.

Figura 7: Iniciadores utilizados para a construção das imunotoxinas anti-CD64.

Figura 8: Sequência de ácidos nucleicos da construção monovalente pBM-m22(scFv).

Figura 9: Sequência de ácidos nucleicos da construção bivalente m22(scFv) 2-ETA'.

Figura 10: Sequência de aminoácidos da construção monovalente m22(scFv)-ETA' .

Figura 11: Sequência de aminoácidos da construção bivalente m22(scFv) 2-ETA'. 16

Descrição detalhada da invenção 0 complexo de acordo com a invenção são aqueles mencionados na reivindicação 1. 0 âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações e qualquer informação que não esteja abrangida pelas reivindicações é proporcionado apenas para informação.

Definições

Como aqui utilizado, o termo "complexo" refere-se a moléculas lineares com diferentes domínios; a referida molécula pode adoptar uma estrutura secundária e terciária; o termo "complexo" também compreende uma estrutura não linear de ordem superior composta por, pelo menos, duas moléculas que apenas após interacção formam a forma activa do complexo. A interacção pode resultar numa ligação covalente entre as, pelo menos, duas moléculas e/ou as, pelo menos, duas moléculas são estabilizadas através de ligações não covalentes. A interacção pode ocorrer in vitro, i. e., num tubo de ensaio, ou outro recipiente de laboratório apropriado, através da ligação química das, pelo menos, duas moléculas ou partes destas e/ou através da afinidade natural das, pelo menos, duas moléculas ou partes destas umas para as outras. A interacção também pode ocorrer in vivo, í. e., numa célula ou num organismo, pelo que por exemplo enzimas celulares catalisam a formação de ligações covalentes e/ou ligações não covalentes.

Como aqui utilizado, o termo "imunotoxina" refere-se a moléculas quiméricas nas quais um anticorpo monoclonal de 17 ligação celular, ou seus fragmentos, é quimicamente ligado ou geneticamente fundido a toxinas ou suas subunidades. A porção de toxina da imunotoxina pode ser derivada de diversas fontes, tais como bactérias, fungos, plantas ou animais. Também podem ser utilizadas toxinas de origem humana ou toxinas (fármacos) sintéticas. Imunotoxinas, assim como sua construção, foram revistas anteriormente e são bem conhecidas do especialista na técnica.

Como aqui utilizado, o termo "componente A" do complexo representa o domínio de ligação de CD64 do complexo da presente invenção. Suas combinações; é muito preferido um domínio de ligação de valência superior gerado através da combinação de, pelo menos, duas das moléculas de ligação anteriormente mencionadas.

Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia simples e seus fragmentos, tais como Fab, F(ab')2, Fv e outros fragmentos que retêm a função e especificidade de ligação de antigénio do anticorpo parental.

Como aqui utilizado, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a uma composição de anticorpo tendo uma população de anticorpo homogénea. 0 termo não é limitado com respeito à espécie ou fonte do anticorpo, nem é limitado pelo modo no qual é preparado. 0 termo abrange imunoglobulinas intactas, assim como fragmentos, tais como Fab, F(ab')2, Fv e outros, que retêm a função de ligação de antigénio e especificidade do anticorpo. Nesta invenção, podem ser utilizados anticorpos monoclonais de qualquer espécie de mamífero. Na prática, contudo, os anticorpos 18 serão tipicamente de origem de rato ou murina, em virtude da disponibilidade das linhas celulares de rato ou murinas para utilização na preparação das requeridas linhas celulares híbridas ou hibridomas, de modo a produzir anticorpos monoclonais.

Como aqui utilizado, o termo "anticorpos humanos" significa que as regiões de estrutura de uma imunoglobulina são derivadas de sequências de imunoglobulina humana.

Como aqui utilizado, o termo "fragmentos de anticorpo de cadeia simples" (scFv) refere-se a anticorpos preparados através da determinação dos domínios de ligação (ambas as cadeias pesada e leve) de um anticorpo de ligação e do fornecimento de uma fracção de ligação que permita preservação da função de ligação. Isto forma, essencialmente, um anticorpo radicalmente abreviado, tendo apenas aquela parte do domínio variável necessária para ligação ao antigénio. A determinação e construção de anticorpos de cadeia simples são descritas na Pat. U.S. N° 4946778 por Ladner et al. A fracção "toxina", aqui também denominada "domínio de morte celular" do complexo, é parte do "componente B" da presente invenção e é Exotoxina A de Pseudomonas.

Como aqui utilizado, o termo "CD64" refere-se a uma molécula de superfície humana, como extensamente revista anteriormente. Para fins de imunização, o antigénio CD64 pode ser preparado por qualquer técnica conhecida na técnica.

Anticorpos para CD64 humano são conhecidos na técnica. A presente invenção também contempla uma nova utilização de 19 derivados recombinantes de tais anticorpos, como detalhado anteriormente.

Alternativamente, anticorpos monoclonais anti-CD64 humano podem ser produzidos utilizando antigénio CD64 como imunogénio, desde que esteja disponível um ensaio de rastreio que distinga anticorpos dirigidos contra outros antigénios presentes na composição imunogénica. Também podem ser utilizadas células ou fracções de membrana contendo a molécula de interesse como imunogénios, de modo a preservar os constrangimentos conformacionais proporcionados por um ambiente de membrana. A imunização de animais com células intactas, ou suas fracções, habitualmente produz uma forte resposta imunitária, que gera anticorpos para um grande número de moléculas diferentes. Esta ampla resposta imunitária exclui a utilização das células CD64+ em combinação com antigénio CD64, purificado em rastreio subsequente, para produção de anticorpo específico por clones de hibridoma derivados do baço de murganho ou células linfocíticas. Técnicas genéricas para dedução de soros policlonais e anticorpos monoclonais são expostas abaixo: a) Soros Policlonais

Soros policlonais podem ser preparados por métodos convencionais. Em geral, uma solução contendo o antigénio CD64 é primeiro utilizado para imunizar um animal adequado, de um modo preferido um murganho, rato, coelho ou cabra. Para a preparação de soros policlonais são preferidos coelhos e cabras, em virtude do volume de soro obtenível e da disponibilidade de anticorpos anti-coelho e anti-cabra marcados. A imunização é, em geral, 20 realizada através de mistura ou emulsação da solução contendo antigénio em solução salina, de um modo preferido num adjuvante tal como adjuvante completo de Freund, e injecção parentérica da mistura ou emulsão (em geral, subcutaneamente ou intramuscularmente). Uma dose de 50-200 pg/injecção é tipicamente suficiente. A imunização é, em geral, reforçada 2-6 semanas mais tarde, com uma ou mais injecções da proteina em solução salina, de um modo preferido utilizando adjuvante incompleto de Freund. Pode-se, alternativamente, gerar anticorpos por imunização in vitro utilizando métodos conhecidos na técnica que, para efeitos desta invenção, se considera equivalente a imunização in vivo.

Anti-soros policlonais são obtidos através de recolha de sangue do animal imunizado para dentro de um recipiente de vidro ou plástico, incubando o sangue a 25 °C, durante uma hora, seguido de incubação a 4 °C, durante 2-18 horas. O soro é recuperado por centrifugação (e. g., 1000 g, durante 10 minutos). Podem ser obtidos cerca de 20-50 mL por recolha de sangue de coelhos. b) Anticorpos Monoclonais

Os anticorpos monoclonais são preparados utilizando o método de Kohler e Milstein, Nature (1975) 256:495-96, ou uma sua modificação. Tipicamente, um murganho ou rato é imunizado como descrito anteriormente. Contudo, em vez de recolher sangue o animal para extrair o soro, o baço (e, opcionalmente, vários nódulos linfáticos de grandes dimensões) é removido e dissociado em células únicas. Se desejado, as células do baço podem ser rastreadas (após remoção de células não especificamente 21 aderentes) através da aplicação de uma suspensão celular a uma placa ou poço revestido com o antigénio proteico. Células B, expressando imunoglobulina membranar especifica do antigénio, ligam-se à placa e não são arrastadas por lavagem com o resto da suspensão. Células B resultantes, ou células do baço todas dissociadas, são depois induzidas a fundirem-se com células de mieloma, de modo a formarem hibridomas e são cultivadas num meio selectivo (e. g., meio de hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Os hibridomas resultantes são plaqueados por diluição limitante e são ensaiados para a produção de anticorpos, que se ligam especificamente ao antigénio de superfície celular imunizante desejado (e que não se ligam a antigénios não relacionados). Os hibridomas segregando mAb seleccionados são depois cultivados quer in vitro (e. g., em frascos de cultura de tecidos ou reactores de fibra oca) ou in vivo (como ascite em murganhos) .

Como utilizado na presente invenção, o termo "recombinante" refere-se a fusões da parte de anticorpo à parte de toxina por meio recombinante, tal como através da produção de anticorpos de cadeia simples, que são recombinantemente expressos como parte de uma cadeia polipeptídica mais comprida que também contém uma parte de toxina. A imunotoxina recombinante produzida desta forma pode ser isolada por qualquer técnica conhecida no campo da tecnologia de expressão de ADN recombinante, adequada para este efeito.

Como aqui utilizado, o termo "vector" pode compreender um plasmideo, um cosmideo, um fago, um fagemideo, seus derivados ou um virus. Pode ser utilizado um "vector" circular ou linearizado; um "vector" pode ser utilizado como ADN ou ARN. 22

Como aqui utilizado, o termo "organismo" refere-se a procariotas e eucariotas, unicelulares e multicelulares. "Eucariota", de acordo com a presente invenção, inclui eucariotas inferiores, tal como fungos, vertebrados, tais como mamíferos (humanos e não humanos, incluindo roedores, etc.), aves e peixes, invertebrados, tais como vermes e insectos, plantas, etc. "Célula eucariótica", de acordo com a presente invenção, refere-se a células e cultura celular derivadas dos organismos anteriores, incluindo células estaminais.

De modo a expressar o complexo recombinante, o polipéptido de fusão de fracção de toxina de anticorpo de cadeia simples (também designada "imunotoxina recombinante") da presente invenção em bactérias, tal como E. coli, ou em levedura, tal como em S. cerevisiae, hospedeiros invertebrados como células de insecto, células de Ovário de Hámster Chinês (CHO), COS, BHK, 293T e MDCK, as seguintes etapas são efectuadas:

Transformação ou transfecção de um hospedeiro celular apropriado com um vector recombinante, no qual uma sequência nucleotídica codificando para a proteína de fusão foi inserida sob o controlo dos elementos regulatórios apropriados, particularmente um promotor reconhecido pelas polimerases do hospedeiro celular e, no caso de um hospedeiro procariótico, um sítio de ligação de ribossoma (RBS) apropriado, possibilitando a expressão no referido hospedeiro celular da referida sequência nucleotídica.

Como aqui utilizada, a expressão "morte de células expressando CD64" deve ser compreendida como implicando uma inibição de síntese proteica ou indução de apoptose, resultando na eliminação ou morte destas células; podem ser empregues 23 diversos mecanismos moleculares; por exemplo, pode ser utilizado o mecanismo que altera a função de uma célula, aqueles que alteram o padrão de expressão génica de uma célula ou aquelas que directamente efectuam a viabilidade de uma célula.

Como aqui utilizada, a expressão "células expressando CD64" refere-se a células com CD64 como antigénio de superfície. CD64 é principalmente expresso em monócitos, macrófagos e células apresentadoras de antigénios (APC). Qualquer tipo de célula expressando CD64 pode ser considerada para tratamento com as imunotoxinas recombinantes ou composições compreendendo as mesmas da presente invenção. A invenção também se refere a moléculas de ácidos nucleicos ou vectores que codificam para o complexo de acordo com a invenção ou para componentes individuais para preparação do complexo.

Também são reivindicadas células e/ou organismos que sintetizam os complexos completos de acordo com a invenção, ou seus componentes individuais, depois de serem transformados ou transfectados com as moléculas de ácidos nucleicos ou vectores de acordo com a invenção.

Os organismos de acordo com a invenção são de origem quer procariótica, especialmente E. coli, B. subtilis, S. carnosus, S. coelicolor, Marinococcus sp.r ou eucariotas inferiores, especialmente Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Spodoptera sp., P. pastoris. 24 A invenção também se refere a medicamentos compreendendo um complexo de acordo com a invenção; adicionalmente, a invenção refere-se a medicamentos compreendendo um ácido nucleico codificando para o referido complexo, ou células e/ou extractos celulares compreendendo o ácido nucleico e/ou o referido complexo. Tipicamente, os complexos, ácidos nucleicos, células ou extractos celulares de acordo com a invenção são administrados em formas de dosagem fisiologicamente aceitáveis. Estas incluem, por exemplo, Tris, NaCl, tampões de fosfatos e todos os sistemas tampão aprovados, especialmente incluindo sistemas tampão que são caracterizados pela adição de estabilizantes proteicos aprovados. A administração é efectuada, em particular, por administrações parentéricas, intravenosas, subcutâneas, intramusculares, intratumorais, transnasais e por aplicação transmucosal. A dosagem dos complexos de acordo com a invenção para serem administrados deve ser estabelecida para cada aplicação em cada doença a ser novamente tratada, por estudos clínicos de fase I (estudos de dose escalonados). Ácidos nucleicos ou vectores que codificam para um complexo de acordo com a invenção são, de um modo vantajoso, administrados em formas de dosagem fisiologicamente aceitáveis. Estas incluem, por exemplo, Tris, NaCl, tampões de fosfatos e todos os sistemas tampão aprovados, especialmente incluindo sistemas tampão que são caracterizados pela adição de estabilizantes aprovados para os ácidos nucleicos e/ou vectores a utilizar. A administração é efectuada, em particular, por administrações parentéricas, intravenosas, subcutâneas, intramusculares, intratumorais, transnasais e por aplicação transmucosal. 25 0 complexo de acordo com a invenção, moléculas de ácidos nucleicos codificando para o complexo ou para componentes do mesmo, células e/ou extractos celulares compreendendo o complexo e/ou ácidos nucleicos codificando para o complexo ou para componentes do mesmo podem ser utilizados para a preparação de um medicamento para tratamento de leucemia mielóide aguda e reacções de inflamação crónica. Em particular, o referido medicamento é útil para o tratamento de reacções de inflamação crónica, tais como enfisema, asma intrínseca e extrínseca; dermatite atópica, erupção polimórfica à luz, SLE, enxerto versus hospedeiro, esclerose múltipla, síndrome de activação macrofágica, artrite reumatóide, artrite juvenil, doença de Crohn e doença intestinal crónica, etc.

Exemplos Métodos

Estirpes bacterianas, oligonucleótidos e plasmídeos XLl-blue de E. coli (supE44 hsdR17 recAl endAl gyr A46 thi relAl lacF'[pro AB+ laclq lacZÚM15 TnlO(tetr)]) foi utilizada para propagação de plasmídeos e BL21 Star™ de E. coli (DE3) (F ompT hsdSB (rB”mB“) gal dcm rnel31 DE3) como hospedeiro para síntese de imunotoxinas recombinantes. Oligonucleótidos sintéticos foram sintetizados pela MWG Biotech (Ebersberg, Alemanha). 0 vector de expressão bacteriano pBMl.l é derivado do plasmídeo pET27b (Novagen, Madison, EUA) e é utilizado para fusão N-terminal de ligandos de Sfi I/Not I ao mutante de deleção modificado de Exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (20). Os plasmídeos foram preparados pelo método de lise 26 alcalina e purificados utilizando kits de preparação de plasmideos da Qiagen (Hilden, Alemanha). Fragmentos de restrição ou produtos de PCR foram separados por electroforese em gel de agarose horizontal e extraídos com QIAquick (Qiagen). Todos os processos de clonagem padrão foram efectuados como descrito por Sambrook et al. (17).

Amostras de doentes e linhas celulares

Amostras heparinizadas de sangue periférico de um doente adulto com AML foram obtidas após consentimento informado e com a aprovação da comissão de ética de investigação clínica da Universidade de Aachen. Células mononucleares (MNC) foram isoladas por centrifugação de gradiente de baixa densidade (< 1,007 g/mL), utilizando meio de separação Ficoll-Paque PLUSm (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemanha). Todas as linhas celulares, incluindo as linhas celulares HL-60 derivadas de AML CD64+ (proporcionadas por T. Thepen, Utrecht, Países Baixos) e U937 (DSMZ; German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemanha) e CD64“-L540Cy (16) e IIA1.6 (proporcionadas por T. Thepen), foram cultivadas em meio completo (RPMI 1640) suplementado com 10% (v/v) de soro de vitelo fetal (FCS) inactivado por calor, penicilina a 50 pg/mL, estreptomicina a 100 pg/mL e L-glutamina a 2 mM. Todas as células foram cultivadas a 37 °C, numa atmosfera de ar com CO2 a 5% (16). 27

Construção e expressão de m22(scFv)-ETA' e m22(scFv) 2-ETA' recombinantes O gene m22(scFv) foi amplificado a partir do plasmideo contendo m22 (gentilmente cedido por T. Thepen) por PCR utilizando o iniciador oligonucleotidico m22(scFv)Back: 5'-atg-GCT-CAG-GGT-GCG-GCC-CAG-CCG~GCC-ATG-GCC-CAG-GTG-CAG-CTG-GTG-G (SEQ ID N° 1); letras em negrito: sitio consenso Sfi I; em itálico: regiãoõ'-m22(scFv); e o iniciador oligonucleotidico m22(scFv)For: 5'-GAG-TCA- TTC- TCG-ACT -TGC-GGC-CGC-TTT-GAT-CTC-CAG-CTT-GGT-CC G (SEQ ID N° 2); letras em negrito: sitio consenso Not I; em itálico: região 3'-m22(scFv). Após digestão de Sfi I/Not I, o fragmento de PCR foi clonado dentro do vector de expressão bacteriano pBMl.l (16) e digerido com as mesmas enzimas de restrição. A construção monovalente (scFv) resultante pBM-m22(scFv) (SEQ ID N° 5) foi verificada por análise de sequência de ADN. Para construção da imunotoxina bivalente m22 (scFV)2-ETA' (SEQ ID N° 6), m22(scFv) foi amplificado por PCR com o iniciador m22(back): 5'- GAG-CCC-AAG-CTT-ATG-GCC-CAG-GTG-CAG-CTG-GTG G (SEQ ID N° 3); letras em negrito: sitio consenso Hindlll; em itálico: região 5'-m22(scFv); e com o iniciador m22For: 5'-GCA-ACT-GCG-GCC-GGC-TGG-GCC-gcc-ggc-tgg-gcc-qac-qaq- cca-ccq-cca-ccT-TTG-ATC-TCC-AGC-TTG-GTC-CCT-TG G (SEQ ID N° 4); letras em negrito: sitio consenso Sfi I; letras sublinhadas: região adaptadora; em itálico: região 5'- m22(scFv). Após digestão de Hindlll/Sfil, o fragmento de PCR foi clonado dentro de pBM-m22(scFv), digerido com os mesmos sitios de restrição, de modo a obter a construção bivalente m22(scFv) 2-ETA' (SEQ ID N° 6). Após transformação dentro de BL21 Star™ (DE3), as proteínas de fusão m22(scFv)-ETA' (SEQ ID N° 7) e m22(scFv)2-ETA' (SEQ ID N° 8) foram expressas no espaço periplasmático sob stress osmótico, na presença de solutos compatíveis, como 28 descrito por Barth et al., (16). Resumidamente (a seguinte secção intitulada "Expressão periplasmática e purificação do m22(scFv)2-ETA' recombinante" proporciona uma descrição mais detalhada do método), bactérias transformadas foram recolhidas 15 h após indução por IPTG. 0 sedimento bacteriano foi ressuspenso em tampão de sonicação (Tris/HCl a 75 mM (pH 8),

NaCl a 300 mM, 1 cápsula de inibidores de protease/50 mL (Complete™, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha), DTT a 5 mM, EDTA a 10 mM, glicerol a 10% (v/v) ) a 4 °C e sonicado 6 vezes, durante 30 s, a 200 W. As proteínas de fusão m22(scFv)-ETA' (SEQ ID N° 7) foram enriquecidas por IMAC (cromatografia de afinidade de ião metálico imobilizado) utilizando colunas de Sepharose quelante de niquel-ácido nitriloacético (Qiagen) e SEC (cromatografia de exclusão de tamanho) com Bio-Prep SE-100/17 (Biorad, Munique, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Proteína recombinante foi eluída com PBS (pH 7,4) e NaCl a 1 M, analisada por electroforese em gel de

Dodecilssulfato de sódio/poliacrilamida (SDS-PAGE), quantificada por densitometria (Densitómetro de Imagiologia GS-700; Biorad) após coloração Coomassie, em comparação com padrões de BSA (Figuras 2a e 2b) e verificada por ensaios Bradford (Biorad).

Expressão periplasmática e purificação do m22(scFv) 2-ETA' recombinante

Expressão Periplasmática e Purificação do m22(scFv)2-ETA' Recombinante. IT recombinantes (rIT) foram expressas, sob o controlo do promotor T71ac indutivel por IPTG, em BL21 (DE3) de E. coli, como descrito recentemente (1) . Resumidamente, bactérias foram cultivadas, de um dia para o outro, a 26 °C, em Terrific Broth (30) contendo canamicina a 50 pg/mL e ZnCl2 a 29 0,5 mM. A cultura foi diluída 30 vezes em 200 mL do mesmo meio. A uma A6oo de 2 foi suplementado com sorbitol a 0,5 M, NaCl a 4% e glicina betaina a 10 mM e incubado, a 26 °C, durante 30-60 min adicionais. A expressão de rIT foi induzida pela adição de IPTG a 2 mM, a 26 °C. Mais tarde (15 h), as células foram recolhidas por centrifugação, a 3700 g, durante 10 min, a 4 °C. Para a totalidade das próximas etapas, os tubos foram mantidos sobre gelo. O sedimento bacteriano foi centrifugado e o seu peso húmido determinado. As células foram congeladas a -196 °C. Após descongelação, as células foram ressuspendidas em Tris-HCl a 75 mM (pH 8), NaCl a 300 mM, 1 cápsula de inibidores de protease/50 mL (Complet, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha), DTT a 5 mM, EDTA a 10 mM e glicerol a 10% (v/v)) e sonicadas 6 vezes, durante 30 s, a 200 w. A fracção periplasmática foi recuperada após centrifugação, a 21000 g, durante 5 min, a 4 °C e transferida para PBS (pH 8), NaCl a 300 mM e glicerol a 10%, utilizando colunas de dessalinização PD10 (Pharmacia, Freiburg, Alemanha). ΠΤ foi parcialmente purificada por cromatografia de afinidade de ião metálico imobilizado, que continha Sepharose quelante de níquel-ácido nitriloacético (Qiagen) numa Àkta FPLC {Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). Proteína ligada foi eluída com imidazole PBS a 500 mM (pH 8), NaCl a 1 M e glicerol a 10%. Fracções contendo o m22(scFv)2-ETA' bivalente foram agregadas, concentradas por ultrafiltração e, finalmente, purificadas utilizando SEC com colunas HI-Prep 26/60 Sephacryl S100 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) na estação de trabalho Àkta FPLC. Proteína foi eluída com PBS (pH 7,4), analisada por SDS-PAGE, quantificada após coloração Coomassie, em comparação com padrões de bsa (Figura 2 c) e verificada por ensaios Bradford (Bio-Rad). 30

Análise de SDS-PAGE e Transferência de Western SDS-PAGE e transferência de Western foram realizados como descrito (16). m22(scFv)-ETA' (SEQ ID N° 7) foi detectado por moAb anti-ETA' TC-1 (20) (gentilmente cedido por O.R. Galloway, Columbus, Ohio) . Anticorpo ligado foi corado com um moAb de igG anti-murganho conjugado a fosfatase alcalina (Sigma Chemical Co., Deisenhofen, Alemanha) e uma solução de Tris-HCl (pH 8,0) e naftol-AS-Bi-fosfato a 0,2 mg/mL (Sigma Chemical Co.) mais Fast-Red a 1 mg/mL (Serva, Heidelberg, Alemanha). ELISA de membrana celular (CM)

A actividade de ligação das proteínas de fusão m22 (scFv) -ETA' (SEQ ID N° 7) e m22 (scFv) 2-ETA' (SEQ ID N° 8) foi determinada por CM-ELISA, utilizando membranas biologicamente activas de células tumorais, como descrito por Tur et al. (19) (ELISA Maxisorp-Plates (Nalgen Nunc International, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 100 pL (aproximadamente 0,9 mg de proteína/mL) de fracções membranares preparadas de fresco de linhas celulares CD64+ HL-60/U-937 e L-540Cy como controlo em tampão bicarbonato a 0,02 M (pH 9,6), de um dia para o outro, a 4 °C. As placas foram lavadas cinco vezes com PBS (pH 7,4) contendo Tween 20 a 0,2% (TPBS) e bloqueadas com 200 pL de BSA a 2% em PBS (PBSA) . Após incubação, de um dia para o outro, a 4 °C, as placas foram lavadas cinco vezes com TPBS e 2-10 pg/mL de m22 (scFv)-ETA' (SEQ ID N° 7) diluída com BSA a 0,5% e Tween 20 a 0,05% em PBS foi adicionado às placas e incubadas, à temperatura ambiente (23 °C) RT, durante 1 h. A seguir, as placas foram lavadas e a ligação da imunotoxina recombinante foi detectada com o moAb anti-ETA' TC-1 e fragmentos F(ab')2 de IgG 31 de cabra anti-murganho conjugado a peroxidase (Boehringer, Ingelheim, Alemanha) de acordo com as recomendações do fabricante. Anticorpos ligados foram visualizados após adição de 100 pL de solução de 2', 2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS®) (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha) através da medição da extinção a 415 nm com um Leitor de ELISA (MWG Biotech).

Especificidade de Ligação

A especificidade de ligação das imunotoxinas recombinantes foi testada por CM-ELISA seguindo o protocolo anteriormente descrito utilizando o moAb m22 parentérico para competição (Acris, Bad Nauheim, Alemanha). Resumidamente, placas de ELISA Maxisorp foram revestidas com fracções membranares de células HL-60 positivas para CD64. Após bloqueio, as placas foram incubadas com uma concentração fixa (—35 pg/mL) de imunotoxina recombinante m22(scFv)-ETA' (SEQ ID N° 7). As experiências de competição foram realizadas na presença ou ausência de diferentes concentrações (100 ng - 10 pg/mL) de moAb m22. A ligação de m22(scFv)-ETA' (SEQ ID N° 7) foi detectada utilizando anti-His-Peroxidase (Roche Molecular Biochemicals) após adição de ABTS.

Análises de citometria de fluxo A actividade de ligação celular de m22(scFv)-eta' (SEQ ID N° 7) e m22(scFv)2- ETA' (SEQ ID N° 8) expressas em de E. coli BL21 Star™ (DE3) foi avaliada utilizando um instrumento de citometria de fluxo FACSCalibur e software CellQuest (Becton 32

Dickinson, Heidelberg, Alemanha) . As células foram coradas com scFv-imunotoxina como descrito (25) . Resumidamente, dez mil eventos foram recolhidos por cada amostra e análises de células intactas foram realizadas utilizando canais de dispersão apropriados, de modo a excluir detritos celulares e agregados. 5 x 105 células foram incubadas, durante 1 h, sobre gelo, com 50 pL do extracto proteico bacteriano de m22(scFv)-ETA' (SEQ ID N° 7), a uma concentração de 30-40 pg/mL. As células foram lavadas com tampão PBA contendo BSA a 0,2% p/v e azida de sódio a 0,05% p/v e, depois, incubadas, durante 30 min, com moAb anti-TC-1 diluído 1:2 em tampão PBA. As células foram lavadas e incubadas com IgG de cabra anti-murganho marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (DAKO Diagnostica, Hamburgo, Alemanha), durante 1 h, a 4 °C. Após uma lavagem final, as células foram tratadas com 2 pL de iodeto de propídio a 6,25 mg/mL e subsequentemente analisadas por FACS.

Ensaio colorimétrico de proliferação celular O efeito citotóxico de m22 (scFv)-ETA' (SEQ ID N° 7) sobre linhas celulares alvo foi determinado por medição de metabolização de sal de tetrazólio amarelo (XTT) num corante de formazano alaranjado hidrossolúvel, determinada como publicado por (25). Varias diluições da toxina recombinante foram distribuídas em alíquotas de 100 pL em placas de 96 poços. 2-4 x 104 células alvo em alíquotas de 100 pL de meio completo foram adicionadas e as placas foram incubadas, durante 48 h, a 37 °C. Posteriormente, as culturas celulares foram pulsadas com 100 pL de meio de cultura de fresco, suplementado com XTT/PMS (concentrações finais de 0,3 mg e 0,383 ng, respectivamente) durante 4 h. As absorvências espectrofotométricas das amostras 33 foram medidas a 450 e 650 nm (comprimento de onda de referência) com um leitor de ELISA (MWG Biotech). A concentração requerida para alcançar uma redução de 50% de sintese proteica (IC50), relativamente a células de controlo não tratadas e a controlos positivos tratados com Triton X a 1%, foi calculada graficamente, por meio de diagramas gerados em Excel. Todas as medições foram realizadas em triplicado.

Ensaio de citometria de fluxo de apoptose Células mononucleares de amostras de sangue de doentes foram isoladas por centrifugação de Ficoll-Paque. Expressão de CD64 de superfície celular foi confirmada por citometria de fluxo utilizando a imunotoxina m22(scFv)-ETA', como anteriormente descrito. Aproximadamente 5 x 105 células mononucleares/poço foram semeadas em placas de 12 poços de fundo achatado em RPMI 1640, suplementado com FCS a 10%, em triplicado. Imunotoxina a 100 ng/mL foi adicionada a cada poço e as células cultivadas, durante 18 h, a 37 °C e atmosfera de ar com C02 a 5%. Células apoptóticas foram detectadas utilizando um kit I de detecção de apoptose de anexina V-FITC (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha). Resumidamente, células intactas foram coradas simultaneamente com Anexina V conjugada a FITC (AnnV) e PI em PBS, de acordo com o protocolo do fabricante. Foram analisadas dez mil células por citometria de fluxo e as subpopulações de AnnV-/PI-, AnnV+/PI-, AnnV+/PI+ e AnnV-/PI+ foram contadas. Células apoptóticas precoces com fosfatidilserina exposta mas membranas celulares intactas ligaram-se a Anexina V-FITC mas excluíram PI. Deste modo, verificou-se que as quatro populações de AnnV-/PI-, AnnV+/PI-, AnnV+/PI+ e AnnV-/PI+ correspondem a células vivas, células 34 apoptóticas precoces, células apoptóticas/necróticas tardias e células necróticas, respectivamente.

Indução de inflamação cutânea, injecções de imunotoxina e biopsias

Em todas as experiências, foram utilizados murganhos FVB/N transgénicos expressando FcyRI humano. De modo a induzir inflamação cutânea crónica, uma área de 1,5 por 1,0 cm em ambos os flancos dos murganhos foi rapada e o irritante laurilssulfato de sódio (SLS) (5% em solução salina) foi diariamente aplicado epicutaneamente, em dez dias consecutivos. Os animais foram anestesiados com 20 pL de uma mistura 4:3 de Aescoket {Aesculaap, Gent, Bélgica) e Rompun (Bayer, Leverkusen,

Alemanha), intramuscularmente injectada. Injecções intradérmicas, (10 pL; 10:1 em solução salina; a gama M na Figura 3 refere-se à fracção de toxina) com as amostras de teste em diferentes concentrações foram administradas. Para fins de controlo, injecções idênticas de solução salina foram administradas contralateralmente. Os animais foram mortos e biopsias puncionadas de 3 mm foram retiradas, congeladas imediatamente em azoto liquido e armazenadas a -70 °C, antes de utilização.

Coloração imuno-histoquímica de CD64

Biopsias foram cortadas em secções de 6 pm num micrótomo frigorifico e montadas em lâminas revestidas. Após secagem, de um dia para o outro, as secções foram fixas, durante 10 min, com acetona desidratada secas ao ar. As lâminas foram incubadas com 35 FITC conjugado 10.1 (Serotec 1:40) em soro de murganho normal de PBS a 2% (NMS), durante 45 min. As lâminas foram lavadas três vezes, durante 5 min, com PBS, Tween a 0,05%, após o que anti-FITC de ovelha conjugado a fosfatase alcalina (AP) (Boehringer Mannheim, 1:400) em PBS (soro AB Humano a 1%, NMS a 1%, durante 30 min). Após lavagem duas vezes em PBS/Tween e uma vez em Tris-HCI (0,1 M, pH 8,5), a actividade de AP foi demonstrada utilizando fosfato AS-BI de naftol (sal de sódio, 50 mg/lOOmL; Sigma) como substrato e fucsina nova (10 mg/lOOmL; Merck, Whitehouse Station, N.J.) como cromógeno dissolvido em Tris-HCI a 0,1 M, pH 8,5, resultando em coloração rosa/vermelho. A actividade de AP endógena foi inibida por adição de levamisole (35 mg/lOOmL, Sigma) à mistura de reacção. As lâminas foram ligeiramente contrastadas com hematoxilina. As secções foram pontuadas para células positivas por dois observadores independentes e a percentagem de morte foi calculada em comparação com locais não injectados.

Resultados

Construção e expressão de m22(scFv)-ETA' e m22(scFv) 2-ETA' m22(scFv) (figura la) e m22(scFv)2 amplificados por PCR foram inseridos, de modo direccional, dentro de pBMl.l resistente à canamicina, contendo um operador lac indutível por IPTG, um péptido sinal pe/B, seguido de uma cauda de Hisio clivável por enterocinase e ETA' modificada (Figura lb) . O dominio delecionado ia de Exotoxina de Pseudomonas responsável por reconhecimento celular não específico foi, deste modo, substituído por m22(scFv) ou m22(scFv)2' específicos de CD64. Clonagem bem-sucedida foi verificada por análise de sequência. 36

Após transformação, BL21 Star™ (DE3) de E. coli foram cultivadas sob condições de stress osmótico, na presença de solutos compatíveis. A imunotoxina recombinante foi dirigida para dentro do espaço periplasmático e os m22(scFv)-ETA' (SEQ ID N° 7) (Mr 67000) ou m22(scFv) 2-ETA' (SEQ ID N° 8) (Mr 106000) funcionais directamente purificados por combinações de IMAC e SEC para >90% de pureza. Pelo menos 1 mg de proteína purificada foi rotineiramente preparada a partir de 1 L de culturas bacterianas agitadas (figura 2a e 2c) . Imunotoxina recombinante intacta foi segregada para o compartimento periplasmático, como visualizado por imunotransferência utilizando TC-1, um anticorpo monoclonal específico de ETA' (figura 2b).

Propriedades de ligação de Imunotoxina específica de CD64 A fusão das regiões codificantes de scFv às sequências codificantes truncadas de ETA' não afectou a actividade de ligação do formato de anticorpo VH/VL. Imunotoxina anti-CD64 recombinante purificada ligou-se sempre a fracções de membrana celular AML mas não a membranas L540Cy negativas para CD64 e células intactas correspondentes, como medido por CM-ELISA (figura 4a) e citometria de fluxo (figura 3b), respectivamente. A especificidade de CD64 foi documentada por experiências de CM-ELISA competitivo: a ligação de m22 (scFv)-ETA' contra fracções de membrana HL-60 positivas para CD64 foi inibida -70% por moAb m22 a 10 pg/mL (figura 4c). 37

Actividade citotóxica in vitro

De modo a caracterizar a actividade citotóxica da imunotoxina anti-CD64 recombinante in vitro, foi avaliada a proliferação de diferentes células alvo após incubação com diferentes quantidades de m22(scFv)-ETA' (SEQ ID N° 7). A inibição de crescimento de linhas celulares derivadas de AML HL-60 e U937 foi documentada por um ensaio colorimétrico baseado em XTT. Foram observados efeitos tóxicos contra células CD64+, com uma IC50 mediana calculada de 11,6 ng/mL sobre células HL-60 (figura 5a) e 12,9 ng/mL sobre células U937, respectivamente (figura 5b) . A linha celular L540Cy derivada de Hodgkin, negativa para CD64, não foi afectada por concentrações de proteína recombinante de até 10 pg/mL. Foram realizadas experiências análogas com a proteína bivalente m22(scFv) 2-ETA (figura 5d e 5e) . A IC50 em células HL-60 foi determinada como sendo 11,715 ng/mL e em células U937, 13,54 ng/mL.

Análise de apoptose em células primárias AML

Os efeitos de m22(scFv)-ETA' sobre a indução de apoptose numa população preparada de fresco de células de mieloma agudo de um doente foram examinados por citometria de fluxo. A imunofenotipagem revelou -90% de células leucémicas. A expressão de CD64 nas células primárias foi verificada directamente com m22(scFv)-GFP e numa abordagem sanduíche com m22(scFv)-ETA' (figura 5a). Duas análises de citometria de fluxo colorida utilizando Anexina-V-FITC e PI (figura 5b) discriminaram quatro populações, viável (quadrante inferior esquerdo), apoptótica precoce (quadrante inferior direito), apoptótica/necrótica tardia (quadrante superior direito) e células necróticas 38 (quadrante superior esquerdo). Células primárias leucémicas negativas para CD64, derivadas de doente, tratadas com m22 (scFv)-ETA', durante 18 h, permaneceram maioritariamente viáveis (~90%). Células primárias AML CD64+, derivadas de doente, tratadas com a imunotoxina recombinante após incubação, durante 18 h, mostraram populações celulares viáveis (-44%), apoptóticas precoces (-41%) e apoptóticas/necróticas tardias (-15%).

Actividade citotóxica in vivo

De modo a estabelecer eficácia in vivo das imunotoxinas anti-CD64 recombinantes, foi testada a capacidade de eliminar macrófagos activados da pele num modelo de murganho transgénico hCD64. A inflamação crónica foi induzida através de aplicação epicutânea do irritante laurilssulfato de sódio (5% em PBS), resultando em inflamação cutânea local crónica. Amostras de teste foram injectadas intracutaneamente e a eficácia foi determinada por coloração imuno-histoquímica para células expressando CD64, em biopsias retiradas de locais cutâneos tratados após 24 horas e comparação com locais tratados com placebo. Duas imunotoxinas anti-CD64 recombinantes, (m22 (scFv)-ETA') (SEQ ID N° 7) monovalente e (m22 (scFV) 2-ETA') (SEQ ID N° 8) bivalente, foram testadas e a eficácia, expressa como percentagem de morte de células expressando CD64 em comparação com placebo, foi comparada com uma toxina quimicamente ligada baseada em Ricina A, (H22-Ricina A), e uma toxina ETA quimicamente ligada, (M22-ETA), tabela 1. A imunotoxina anti-CD64 recombinante bivalente mostrou um aumento significativo na morte de células expressando CD64 in vivo, em comparação com a versão monovalente e com uma curva de 39 dose-resposta semelhante comparada com imunotoxinas quimicamente ligadas.

Tabela 1: Eficácia como % de morte de células expressando CD64 em comparação com placebo.

Concentração (M) Toxina IO-7 10~8 10~9 H22-Ricina A 99 91 79 M22-ETA 90 82 68 m22(scFv)2-ETA' 97 88 74 m22(scFv)-ETA' 36 30 10

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Lisboa, 10 de Março de 2011 42

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Complexo recombinante tendo, pelo menos, um componente A, pelo menos, um componente B, de acordo com o qual o componente A compreende dois ou mais domínios de ligação para o receptor de superfície celular CD64 e o componente B é um domínio de morte celular, em que o complexo é o complexo recombinante monovalente m22(scFv)2-ETA' (SEQ ID N° 8) ou o complexo bivalente m22(scFv)2-eta' (SEQ ID N°
2. 2. Moléculas de ácidos nucleicos codificando para o complexo recombinante, concebido de acordo com a reivindicação 1 para o complexo completo.
3. 3. Vectores compreendendo uma molécula de ácido nucleico da reivindicação 2.
4. 4. Células que não células estaminais embrionárias humanas ou organismos não humanos sintetizando o complexo recombinante de acordo com a reivindicação 1, obteníveis através da transformação ou transfecção das mesmas com moléculas de ácidos nucleicos da reivindicação 2 ou vectores de acordo com a reivindicação 3.
5. 5. Organismos ou células de acordo com a reivindicação 4, em que os organismos são procariotas, tais como E. colí, B. subtilis, S. carnosus, S. coelicolor ou Marinococcus sp., eucariotas inferiores, tais como Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Spodoptera sp. ou P. pastoris. 1 Medicamento compreendendo um complexo de acordo com a reivindicação 1, moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 2, vectores de acordo com a reivindicação 3, células isoladas e/ou extractos destas de acordo com a reivindicação 4 ou 5, organismo unicelular, tais como procariotas e eucariotas inferiores ou extractos dos organismos de acordo com as reivindicações 4 ou 5. Utilização do complexo de acordo com a reivindicação 1 e/ou das moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 2 e/ou os vectores de acordo com a reivindicação 3 na preparação de um medicamento para influenciar o crescimento celular e a fisiologia de células CD64+. Utilização do complexo de acordo com a reivindicação 1, ou das moléculas de ácidos nucleicos codificando para esse fim de acordo com a reivindicação 2, ou dos vectores de acordo com a reivindicação 3 e/ou de células ou organismos de acordo com a reivindicação 4 ou 5 para a preparação de um medicamento para o tratamento de leucemia mielóide aguda, reacções de inflamação crónica, tais como enfisema, asma intrínseca e extrínseca, dermatite atópica, erupção polimórfica à luz, SLE, enxerto versus hospedeiro, esclerose múltipla, sindrome de activação macrofágica, artrite reumatóide, artrite juvenil, doença de Crohn e doença intestinal crónica. Método para produzir o complexo recombinante de acordo com a reivindicação 1, compreendendo as seguintes etapas: (a) transformação/transfecção de células que não células estaminais embrionárias humanas, microrganismo, tais como bactérias, fungos e/ou ciliados, com as moléculas de ácidos nucleicos ou vectores de acordo com a reivindicação 2 e/ou 3; (b) cultivo das células, microrganismos e/ou organismos da etapa (a), sob condições adequadas para expressão génica e síntese proteica, com o fim de acumular o complexo recombinante intracelularmente ou no meio de cultura circundante; e (c) isolamento e purificação do complexo recombinante da etapa (b). Lisboa, 10 de Março de 2011 3 1/20

   Fig.la 2/20 pET27b

   ATG sítio consenso de enterocinase

   ATG Sítio consenso de enterocinase Fig.lb 67 kDa -► Fig.2a 4/20 1 Μ 67kDa-► ; / Fig.2b 1 2 175 - 100 kDa -► 83 - 62 ~ 47.5 “ 32.5 “ 25 “ 16.5 - Fig.2c 5/20 de morte

   L540Cy HL-60 CD64- CD 64+ Fig,4a 6/20 :ro de células

   -► intensidade de fluorescência Fig.4b

   [c] moab m22 Fig.4c 7/20

   Fig.Sa viabilidade relativa (%)

   Fig.Sb 8/20

   Fig.Sc

   9/20 ο Contagens

   ► intensidade de fluorescência Fig.6a Células primárias negativas para CD64 10/20 CD64-negative primary cells

   -► Anexina V-FITC Células primárias positivas para CD64

   ► Anexina V-FITC Fig.6b 11/20 Fig. 7 m22(scFv)Backr 5'atggctcagg gtgcggccca gccggccatg gcccaggtgc agctggtgg 3' m22(scFv)For: 5'gagtcattct cgacttgcgg ccgctttgat ctccagcttg gtcc 3' m22(back: 5'gagcccaagc ttatggccca ggtgcagctg gtg 3' m22For: 5'gcaactgcgg ccggctgggc cgccggctgg gccgacgagc caccgccacc tttgatctcc agcttggtcc cttgg 3' 12/20 Fig. 8 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60 atggccatgg gccatcatca tcatcatcat catcatcatc acagcagcgg ccatatcgac 120 gacgacgaca agcatatgaa gcttatggcc cagccggcca tggcccaggt gcagctggtg 180 gagagcggtg gaggtgttgt gcaacctggc cggtccctgc gcctgtcctg ctcctcgtot 240 ggcttcattt tcagtgacaa ttacatgtat tgggtgagac aggcacctgg aaaaggtctt 300 gagtgggttg caaccattag tgatggtggt agttacacct actatccaga cagtgtgaag 360 ggaagattta caatatcgag agacaacagc aagaacacat tgttcctgca aatggacagc 420 ctgagacccg aagacaccgg ggtctatttt tgtgcaagag gctactatag gtacgagggg 480 gctatggact actggggcca agggaccccg gtcaccgtga gctcaggagg tggcggctcc 540 ggaggtggag gcagcggagg 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cggtggctcg tcggcccagc cggccatggc ccaggtgcag 1020 ctggtggaga gcggtggagg tgttgtgcaa cctggccggt ccctgcgcct gtcctgctcc 1080 tcgtctggct tcattttcag tgacaattac atgtattggg tgagacaggc acctggaaaa 1140 ggtcttgagt gggttgcaac cattagtgat ggtggtagtt acacctacta tccagacagt 1200 gtgaagggaa gatttacaat atcgagagac aacagcaaga acacattgtt cctgcaaatg 1260 gacagcotga gacccgaaga caccggggtc tatttttgtg caagaggcta ctataggtac 1320 gagggggcta tggactactg gggccaaggg accccggtca ccgtgagctc aggaggtggc 1380 ggctccggag gtggaggcag cggagggggc ggatccgaca tccagctgac ccagagccca 1440 agcagcctga gcgccagcgt gggtgacaga gtgaccatca cctgtaagtc cagtcaaagt 1500 gacatccagc tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggtga cagagtgacc 1560 atcacctgta agtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa ctacttggcc 1620 tggtaccagc agaagccagg taaggctcca aagctgctga tctactgggc atccactagg 1680 gaatctggtg tgccaagcag attcagcggt agcggtagcg gtaccgactt caccttcacc 1740 atcagcagcc tccagccaga ggacatcgcc acctactact gccatcaata cctctcctcg 1800 tggacgttcg gccaagggac 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gaccctggcc gcgccggagg cggcgggcga ggtcgaacgg 2700 ctgatcggcc atccgctgcc gctgcgcctg gacgccatca ccggccccga ggaggaaggc 2760 gggcgcctgg agaccattct cggctggccg ctggccgagc gcaccgtggt gattccctcg 2820 gcgatcccca ccgacccgcg caacgtcggc ggcgacctcg acccgtccag catccccgac 2880 aaggaacagg cgatcagcgc cctgccggac tacgccagcç agcccggcaa accgccgcgc 2940 gaggacctga agtaa 2955 14/20 Fig. 10 Met 1 Lys Tyr Leu Leu 5 Pro Thr Ala Ala Gin Pro Ala 20 Met Ala Met Gly His His Ser 35 Ser Gly His Ile Asp 40 Met Ala 50 Gin Pxo Ala Met Ala 55 Gin Gly 65 Vai Vai Gin Pro Gly 70 Arg Ser Gly Phe Ile Phe Ser 85 Asp Asn Tyr Gly Lys Gly Leu 100 Glu Trp Vai Ala Thr Tyr Tyr 115 Pro Asp Ser Vai Lys 120 Asn Ser 130 Lys Asn Thr Leu Phe 135 Leu Asp 145 Thr Gly Vai Tyr Phe 150 Cys Ala Ala Met Asp Tyr Trp 165 Gly Gin Gly Gly Gly Gly Ser 180 Gly Gly Gly Gly Gin Leu Thr 195 Gin Ser Pro Ser Ser 200 Vai Thr 210 Ile Thr Cys Lys Ser 215 Ser Ser 225 Pro Ser Ser Leu Ser 230 Ala Ser Cys Lys Ser Ser Gin 245 Ser Vai Leu Leu Ala Trp Tyr 2 60 Gin 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