PT1649760E

PT1649760E - Composição contendo uma bactéria de ácido láctico produzindo equol

Info

Publication number: PT1649760E
Application number: PT47469531T
Authority: PT
Inventors: Shigeto Uchiyama; Tomomi Ueno; Toshimi Suzuki
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2004-06-29
Publication date: 2013-06-25
Also published as: ES2601885T3; SI2548455T1; KR20110044810A; CY1114248T1; AU2004251563A1; CN1826059A; TWI335353B; CN1826059B; MXPA06000074A; EP1649760A1; KR101043465B1; HK1090812A1; KR20060028436A; SG157232A1; CA2531173A1; DK2548455T3; CY1118534T1; PL2548455T3; TW200510542A; MY146563A

Description

1

DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÃO CONTENDO UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO PRODUZINDO EQUOL"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A invenção presente diz respeito à estirpe bacteriana de Lactococcus garvieae que produz equol, a uma composição incluindo a referida estirpe bacteriana, e a um método de produzir equol utilizando a referida estirpe bacteriana de ácido láctico.

ESTADO DA TÉCNICA ANTERIOR À INVENÇÃO

Tem sido até à data referido sobretudo na Europa e nos Estados Unidos da América que a isoflavona (isoflavona de soja) contida nos grãos de soja apresenta eficácias profiláticas (efeito antiestrogénico) no cancro da mama, no carcinoma da próstata, e noutras doenças e que apresenta eficácias de alívio (efeitos do tipo estrogénico) na osteoporose do climatério e de após a menopausa, na hiperlipidemia, na hipertensão, etc. (H. Adlercreutz et al., (1992) Lancet, 339, 1233; H. Adlercreutz et al., (1992) Lancet, 342, 1209-1210; D. D. Baird et al., (1995) J. Clin. Endocrinol. Metab., 80, 1685-1690; A. L. Murkies 2 et al., (1995) Maturitas., 21, 198-195; e D. Agnusdei et al., (1995) Bone and Mineral., 19 (Suplemento), S43-S48).

Recentemente, no entanto, foram levantadas dúvidas acerca da eficácia medicinal da isoflavona da soja e, ao invés, reportou-se que o equol, a titulo de metabolito activo da isoflavona da soja, é um factor chave das eficácias esperadas na aplicação medicinal. Deste modo, estão disponíveis diversos textos nos quais se argumenta que no cancro da mama, no carcinoma da próstata, e na osteoporose do climatério e de após a menopausa, a eficácia da isoflavona da soja é ultrapassada pela do equol, o metabolito da isoflavona da soja (D. Ingram et al., (1997) Lancet, 350, 990-994; A. M. Duncan et al., (2000) Câncer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 9, 581-586; C. Atkinson et al., (2002) J. Nutr., 32(3), 595S: H. Akaza et al., (2002) Jpn. J. Clin. Oncol., 32(8), 296-300; e S. Uchiyama et al., (2001) Ann. Nutr. Metab., 45, 113 (res.)).

Além disto, foram proferidas muitas lições relacionadas com o assunto do equol no 4o Simpósio Internacional Sobre o Papel da Soja na Prevenção e no Tratamento de Doenças Crónicas (San Diego, EUA, 2001), e na colecção de revisões de Dezembro de 2002 sobre estudos de equol. Deste modo, tem vindo a ser mais ou menos aceite nos meios académicos que o equol é a verdadeira entidade por trás das eficácias da isoflavona da soja (K. D. R. Settchell et al., (2002) J. Nutr., 132, 3577-3584). 3

Além disto, em comparação com a isoflavona de soja, o equol é levado até tecidos tais como o tecido da mama e o tecido da próstata com uma eficiência muito maior e, deste facto, a significância fisiológica do equol encontra-se endossada (J. Maubach et al., (2003) J. Chromatography B., 784, 137-144;T. E. Hedlund et al., (2003) The Prostate, 154, 68-78). O equol é produzido pela flora intestinal e o envolvimento de diferenças entre indivíduos na sua produção foi descrito. Também se descreveu que os produtores de equol de entre o Japoneses representam cerca de 50 % (S. Uchiyama et al., (2001) Ann. Nutr. Metab., 45, 113 (res.)). Suspeita-se que os indivíduos que não conseguem produzir equol não possuem bactérias produtoras de equol no intestino. Nestes indivíduos, suspeita-se que os efeitos antiestrogénico e estrogénicos esperados possam não acontecer mesmo que os indivíduos ingiram alimentos provenientes de soja. Para que estes efeitos esperados possam ser expressos nesses indivíduos, um tipo de actuação que parece razoável é o de os levar a ingerir bactérias que produzem equol, ou equol por si próprio.

Com base na ideia acima, os inventores tinham levado a cabo investigações intensivas e isolaram a partir de fezes 3 novas estirpes de micro-organismos e identificaram-nas: nomeadamente os Bacterioides E-23-15 (FERM BP-6435), Streptococcus E-23-17 (FERM BP-6436), e StreptococcusA6G225 (FERM BP-6437), a título de bactérias 4 produtoras de equol adequadas para a expressão dos referidos efeitos antiestrogénicos e semelhantes a estrogénicos, entre outros efeitos, e pediram uma patente reivindicando invenções a respeito destas estirpes de micro-organismos produtoras de equol, e da utilização destes micro-organismos (WO 99/07.392).

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Os inventores levaram a cabo mais estudos e conseguiram isolar e caracterizar uma estirpe bacteriana de ácido láctico pertencente ao género Lactococcus, que é capaz de utilizar o glicósido da daidzeina, a daidzeina, ou a dihidrodaidzeina, para produzir equol, a título de uma nova estirpe de micro-organismo que é fundamentalmente diferente dos micro-organismos previamente isolados e identificados. A invenção presente foi desenvolvida com base no isolamento e na identificação acima, desta nova estirpe de bactéria de ácido láctico. A invenção presente subsume-se nas seguintes invenções, que se resumem nos parágrafos 1-13.

Item 1. Uma composição incluindo bactérias produtoras de ácido láctico produtoras de equol incluindo, a titulo de uma sua componente essencial, uma estirpe bacteriana de ácido láctico pertencente ao género Lactococcus garvieae que apresente uma capacidade de 5 utilizar pelo menos um composto de daidzeina seleccionado de entre o conjunto constituído por glicósidos de daidzeina, daidzeina, e dihidrodaidzeina, para produzir equol.

Item 2. A composição de acordo com o Item 1, na qual a estirpe bacteriana de ácido láctico pertencente ao género Lactococcus garvieae seja o Lactococcus 20-92 depositado com a identidade FERM BP-10036.

Item 3. A composição de acordo com o Item 1, incluindo também pelo menos um membro seleccionado de entre o conjunto constituído pelos compostos de daidzeina e os ingredientes contendo compostos de daidzeina.

Item 4. A composição de acordo com o Item 3, em que o ingrediente, contendo compostos de daidzeina farinha de soja ou leite de soja.

Item 5. A composição de acordo com o Item 3, assumi9ndo a forma de uma bebida ou produto lácteo.

Item 6. A composição de acordo com o Item 3, incluindo também equol. 6

Item 7. A composição de acordo com o Item 6, que assuma a forma de um produto de fermentação de leite de soja.

Item 8. Um método de produzir equol que inclua o passo de se deixar uma estirpe bacteriana de ácido láctico pertencente ao género Lactococcus garvieae com a capacidade de utilizar compostos de daidzeina para produzir equol, actuar sobre pelo menos um membro seleccionado de entre os elementos do conjunto constituído por compostos de daidzeina e ingredientes contendo compostos de daidzeina.

Item 9. 0 método de acordo com o Item 8, em que a referida estirpe bacteriana de ácido láctico pertencente ao género Lactococcus seja a Lactococcus 20-92 depositada sob a identidade FERM BP-10036.

Item 10. O método de acordo com Item 8, no qual o ingrediente contendo compostos de daidzeina seja farinha de soja ou leite de soja.

Item 11. Uma estirpe bacteriana de ácido láctico pertencendo ao género Lactococcus garvieae, tal como a depositada sob a identidade FERM BP-10036. 7 A composição de bactérias de ácido láctico produzindo equol da invenção é descrita em pormenor adiante. A invenção é tal como definida pelas reivindicações apensas. (1) A estirpe bacteriana de ácido láctico pertencente ao género Lactococcus A composição de bactérias de ácido láctico produtora de equol da invenção inclui, a titulo de uma sua componente essencial, uma estirpe bacteriana pertencente ao género Lactococcus garvieae possuindo uma capacidade (actividade metabólica) de utilizar pelo menos um composto de daidzeina seleccionado de entre o conjunto constituído por glicósidos de daidzeina, daidzeina, e dihidrodaidzeina, e deste modo produzir equol.

Um exemplo específico da referida estirpe bacteriana de ácido láctico é a Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) que os inventores isolaram de fezes humanas e identificaram de novo.

As características bacteriológicas da estirpe bacteriana de ácido láctico são descritas em pormenor adiante. I. Estado do crescimento no meio - 8 -

Esta estirpe apresenta um crescimento bom ou normal em agar de EG (Eggerth-Gagnon) , em agar de BL (Sangue Figado), e em meio GAM (Meio Anaeróbico Gifu), quando a cultura é anaeróbica, num recipiente anaeróbico com lã de aço a 37°C durante 48 horas, ou quando a cultura é aeróbica a 37°C durante 48 horas. A morfologia das colónias cresce de um modo circular ou convexo, sendo tanto a superfície como o bordo periférico suaves, e assumindo uma cor cinzento-esbranquiçada no agar de EG e uma cor castanha no agar de BL. Do ponto de vista morfológico, trata-se de um diplococo Gram-positivo. Esta estirpe não é esporogénica. II. Caracteristicas bioquímicas

(1) Temperatura óptima para crescimento: 37°C (2) pH óptimo para crescimento: 7,0 (3) Liquefacção da gelatina: (4) Produção de acetoína a partir de ácido pirúvico: + (5) Hidrólise do ácido hipúrico: - (6) Hidrólise da esculina: + (7) Pirrolidonilarilamidase: + (8) α-Galactosidase: - (9) β-Galactosidase: - (10) β-Glucuronidase: - (11) Fosfatase alcalina: - (12) Leucina-arilamidase: + (13) Arginina dihidrase: + 9 (14) Assimilação de fontes de carbono D-Ribose + L-Arabinose D-Manitol + D-Sorbitol

Lactose D-Trehalose +

Inulina D-Rafinose

Amido +

Glicogénio ácidos orgânicos após (15) Composição em utilização de peptona ou de glucose:

Utilizando meio PYF (extracto de levedura peptona de Fields) (conteúdo em peptona: cerca de 5 %) a titulo de meio de utilização de açúcares e meio PYF com um suplemento de glucose a uma concentração final de 0,5 %, a estirpe da invenção foi submetida a uma cultura aeróbica a 37 °C durante 72 horas e determinaram-se os ácidos orgânicos nas culturas por HPLC. Os resultados (unidade: mM) estão apresentados adiante na Tabela 1

Tabela 1 Ácido orgânico Peptona Glucose Ácido maleico nd nd Ácido succinico 0,00 0,01 Ácido láctico 3, 33 27,35 Ácido fórmico 1,13 0,88 10 Ácido orgânico Peptona Glucose Ácido acético 3, 32 0,57 Ácido piroglutâmico 0,12 0,25 Ácido propiónico nd nd Ácido i-butírico nd nd Ácido n-butírico nd nd Ácido i-valérico nd nd Ácido n-valérico nd nd nd = não detectado A partir das características de cultura e bioquímicas, a estirpe da invenção é classificada como Lactococcus garvieae que é um coco gram-positivo mas difere da estirpe tipificante (Schleifer, K. H., Kraus, J., Dvorak, C., Kilpper-Balz, R., Collins, M. D. e Fischer, W. Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the genus Lactococcus gen. nov. Syst. Appl. Microbiol., 6, 183-195, 1985; ATCC43921 (JCM10343) e ATCC49156 (JCM8735)), no que toca à utilização de amido.

Portanto, os inventores designaram esta estirpe como Lactococcus 20-92 e depositaram-na no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology International Patent Organism Depositary, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão a 23 de Janeiro de 2003, sob o número de acessão FERM P-19189. Este micro-organismo está hoje em dia 11 sob depósito nos termos do Tratado de Budapeste, e o seu número de acessão é FERM BP-10036.

Verificou-se que esta estirpe assimila glucose e, em seguida, elabora ácido láctico (ácido L-láctico), verificando que é um membro das bactérias de ácido láctico homofermentativas.

Além disto, a sequenciação do ARN 16Sr desta estirpe revelou uma homologia de 99,189 % com a estirpe tipo Lactococcus garvieae (JCM10343) e de 99,375 % com a Enterococcus seriolicida, JCM8735).

Vem a propósito referir que, uma vez que a Enterococcus seriolicida a que se fez referência acima era semelhante à Lactococcus garvieae na análise da homologia entre os seus ADN, ela foi reclassifiçada como uma Lactococcus garvieae em 1996. Portanto a Lactococcus garvieae apresenta duas estirpes-tipo (a estirpe JCM8753 e a estirpe 10343) que apresentam origens diferentes. A Enterococcus seriolicida (JCM8735) foi derivada do rim de um peixe yellowtail infectado e o Lactococcus garvieae (JCM10343) intrínseco foi derivado de uma mastite bovina.

Para explorar a homologia relativa do Lactococcus 20-92 com os dois tipos de estirpe acima, foi feita uma comparação fenotípica. Apresentam-se os resultados adiante na Tabela 2. 12

Tabela 2

Caracteristicas Estirpe da invenção JCM10343 JCM8735 Desaminação(Arg^NH3) ± ± ± Dependência do crescimento em relação à temperatura 10°C + + + 15 °C + + + 00 o 0 O + + + 37 °C + + + O 0 O + + - 45 °C - - - Crescimento em função do pH pH 4,5 ± ± ± pH 7,5 + + + pH 9, 6 + + + Tolerância ao sal (NaCl) 6,5 + + + Peptidoglicana Lys-Ala-Gly Lys-Ala- Gly Lys- Ala-Gly Tipo de quinona MK-8,9 MK-8,9 Sem quinona MK denota menaquinona

Torna-se aparente a partir da Tabela 2 que a estirpe presente de Lactococcus 20-92 concordava com o tipo de estirpe (JCM10343) de Lactococcus garvieae quanto ao fenótipo, mas era diferente do tipo de estirpe (JCM8735) de Enterococcus seriolicida no comportamento de crescimento a 40 °C e na produção ou não produção de quinona. Portanto considerou-se a estirpe presente relacionada com o Lactococcus garvieae (JCM10343). 13

Pode classificar-se a estirpe presente Lactococcus 20-92 entre os Lactococci de cultura em leite integrando o GRAS [sigla dos Geralmente Reconhecidos Como Seguros pela FDA (Food and Drug Administration, E.U.A.)] considerando-se a sua segurança em alimentos como elevada.

No que toca ao Lactococcus garvieae, não existe nenhuma descrição sugerindo a sua patogenicidade para seres humanos e também não existe nenhuma produção de substâncias virulentas tais como toxinas, e portanto esta espécie bacteriana é em geral reconhecida como sendo uma espécie altamente segura.

Além disto, o Lactococcus garvieae tem até à data sido detectado em queijo mozzarella, leite cru, produtos cárneos processados a baixas temperaturas, plaa-som (um produto fermentado de peixe muito consumido na Tailândia), e em queijo Toma Piemontese que é um queijo Italiano artesanal com denominação de origem protegida (POD), isto é, um queijo tradicional Italiano, entre outros, e está descrito que este micro-organismo é detectado a uma incidência elevada, da ordem de entre 105 células/grama em plaa-som e 108 células/grama no queijo Toma Piemontese, mas este alimento já tem um historial antigo de consumo por seres humanos o que assegura a segurança deste organismo. (P-M. Christine et al., (2002) Int. J. Food Microbiol., 73, 61-70; M. G. Fortina, et al., (2003), Food Microbiol., 20, 379-404). 14

Ao invés, o Enterococcus seriolicida foi descrito como patogénico para peixes em cultura, tal como o yellowtail. Uma vez que o Lactococcus 20-92, que é, deste modo, uma estirpe de Lactococcus garvieae, considerado como estando filogeneticamente relacionado com o Enterococcus seriolicida, existia uma apreensão em relação ao seu potencial patogénico para peixe em cultura. No entanto, estudos pelos inventores em que se comparou uma micrografia electrónica do Lactococcus 20-92 com a da espécie patogénica relacionada (Enterococcus seriolicida KG) revelaram que ao contrário da espécie patogénica referida, a estirpe da invenção não possui nenhuma cápsula à superfície da célula. Portanto, a presente estirpe é considerada como isenta de patogenicidade, e também não a presenta nenhum problema de contaminação ecológica. Esta conclusão também é corroborada pela descrição na literatura seguinte. Deste modo, Yoshida et al. argumentam acerca de patogenicidade de células microbianas para peixes em cultura, que a presença de uma cápsula na superfície celular inibe a fagocitose por macrófagos, com o resultado que as bactérias correspondentes não são especificamente mortas mas que induzem septicémia sistemicamente nos peixes em cultura infectados com a bactéria (T. Yoshida, et al., (1996) Dis. Aquat. Org., 25, 81-86).

Além disto, a presente estirpe de Lactococcus 20-92 mantém a capacidade produtora de equol pretendida (actividade), mesmo no caso de fermentação directa em leite, e tem a característica de que para se manter esta 15 capacidade produtora de equol, não é necessário nenhum meio de cultura particular. Deste modo, ao levar a cabo uma fermentação em leite de soja, tal como utilizado por si só, a estirpe utiliza os compostos de daidzeina no leite de soja para elaborar o equol.

Até este momento, não se conhece nenhuma descrição disponível sobre bactérias de ácido láctico do género Lactococcus com uma tal capacidade de produção de equol. Portanto, a invenção presente proporciona também uma nova estirpe de bactérias de ácido láctico manifestando uma tal capacidade de produção de equol. (2) Compostos de daidzeina e ingredientes contendo compostos de daidzeina

Os compostos de daidzeina que são utilizados pela estirpe presente de Lactococcus 20-92, incluem os glicósidos da daidzeina, a daidzeina, e a dihidrodaidzeína. Um exemplo específico dos referidos glicósidos de daidzeina é a daidzina. A daidzina é um glicósido de isoflavona que contém a daidzeina a título de aglícona (glicósido de daidzeina) . No que toca à daidzina, ela é utilizada pela referida estirpe de micro-organismo para libertar a daidzeina que é utilizada pela estirpe para produzir a dihidrodaidzeína, da qual é por último produzido o equol.

Na invenção presente, o referido composto de daidzeina é utilizado a título de substrato. O substrato 16 inclui não apenas compostos de daidzeina mas também diversos materiais ou ingredientes que os contenham. A titulo de exemplo representativo do material ou ingrediente referido contendo os referidos compostos de daidzeina (referido como o ingrediente contendo daidzeina), pode mencionar-se a isoflavona de soja. A isoflavona da soja já se encontra comercialmente disponível em diversas fontes, tal como em diversos produtos comerciais, podendo utilizar-se, por exemplo, "Fujiflavone PIO" (marca registada) da Fujicco Co., Ltd.. Além dito, o referido ingrediente contendo compostos de daidzeina inclui não só a isoflavona de soja mas também tecidos de plantas tal e qual, por exemplo kudzu (= Pueraria thurbergiana Benth) e raiz de kudzu (araruta), trevo vermelho, luzerna, etc., e os derivados de isoflavona provenientes delas.

Incluem-se como exemplos adicionais do referido ingrediente contendo compostos de daidzeina, não apenas os materiais alimentares referidos acima tais como grão de soja, kudzu, raiz de kudzu, trevo vermelho, luzerna, etc. mas também os produtos processados deles, tais como bagaço de soja (farinha de soja), feijões de soja cozidos, tofu (coalhada de soja), coelhada de soja frita, leite de soja, extracto extracto de hipocótilos de soja, etc., os produtos da fermentação destes, tais como natto (grãos de soja fermentados), molho de soja, miso, tempeh, e bebidas fermentadas de soja. Estes materiais contêm invariavelmente compostos de daidzeina. Além disto, eles contêm não só compostos de daidzeina mas também isoflavonas estrogénicas, 17 tais como a genisteína e os seus glicósidos (genistina, etc.); gliciteína e os seus glicósidos (glicitina, etc.); biochanina A e formononetina que são precursores parcialmente metilados de daidzeina e de genistina e que se podem utilizar com vantagem na invenção presente. (3) Composição da invenção (3-1) Uma composição com bactérias de ácido láctico produzindo equol A composição com bactérias de ácido láctico da invenção inclui, a titulo de uma sua componente essencial, uma estirpe bacteriana de ácido láctico pertencente ao género Lactococcus garvieae que tem a capacidade de actuar sobre um substrato, composto de daidzeina, ou sobre um ingrediente contendo compostos de daidzeina, para produzir equol, sendo o Lactococcus 20-92 acima mencionado um seu exemplo representativo. As estirpes bacterianas de ácido láctico para utilização a titulo da referida componente essencial são em geral estirpes bacterianas viáveis mas não se limitam a elas, mas podem ser quaisquer das suas culturas, preparações em bruto ou purificadas destas culturas, contendo células isoladas, e os seus liofilizados.

As culturas da estirpe bacteriana referida podem ser tipicamente obtidas pelo processo que inclui fazer-se uma cultura da estirpe num meio adequado para o seu 18 crescimento, por exemplo meio MRS, a 37°C durante cerca de 48 horas. Depois da cultura, podem recuperar-se as células por, por exemplo, centrifugação da cultura a 3.000 rpm (4°C) durante 10 minutos. Elas podem ser purificadas da maneira convencional. Além disto, podem liofilizar-se estas células. Também se podem utilizar os liofilizados resultantes a titulo de componente activa da composição da invenção.

Tudo quanto é necessário para a composição da invenção é que contenha as bactérias (células ou os seus equivalentes) a titulo da referida componente activa mas, caso tal se pretenda, pode suplementar-se a composição com nutrientes adequados para a manutenção (ou o crescimento) do micro-organismo, a titulo da referida componente activa. Os nutrientes mencionados acima podem ser, por exemplo o meio nutriente para cultura dos micro-organismos respectivos, tal como contendo BHI, EG, BL e GAM, como se mencionou acima neste documento.

Incluem-se nos exemplos dos outros nutrientes diversos oligossacáridos, tais como os lacto-oligossacáridos, os oligossacáridos de soja, a lactulose, o lactitol, os fruto-oligossacáridos, e os galacto-oligossacáridos. As quantidades destes oligossacáridos não têm nenhuma limitação especial, mas elas são preferivelmente seleccionadas para apresentarem valores tais que a sua concentração final na composição da invenção seja de entre cerca de 1-3 %, em peso. 19 A composição da invenção, acima, quando administrada por via oral, expressa a actividade produtora de equol pretendida dentro do corpo de quem a receber. Em geral os Japoneses têm o hábito de comer alimentos contendo compostos com daidzeina, tipicamente os materiais ou ingredientes alimentares mencionados acima, por exemplo grãos de soja, produtos secundários provenientes deles, e produtos de fermentação deles e, portanto, o consumo da composição da invenção resulta na produção de equol in vi vo.

Além disto, quando necessário, pode suplementar-se a composição da invenção com quantidades adequadas de diversas vitaminas, elementos metálicos vestigiais, e assim por diante. Incluem-se nos exemplos das referidas vitaminas a vitamina B, a vitamina D, a vitamina C, a vitamina E, e a vitamina K [em especial MK-7 (menaquinona-7) derivada do Bacillus natto]. São exemplos dos referidos elementos metálicos vestigiais o zinco, o selénio, o ferro, o manganês, etc. A quantidade do micro-organismo que se formula na composição da invenção pode ser judiciosamente seleccionada consoante o tipo de estirpe bacteriana que se utilizar. Usando o Lactococcus 20-92 a titulo de exemplo, o número de organismos (contagem das células viáveis) é preferivelmente 20 ajustado a cerca de 108~109 células/100 g de composição.

Determina-se o número d células viáveis tal como se segue. Reveste-se uma amostra obtida a um valor conhecido de diluição sobre um meio de agar para cultura de bactérias e faz-se a sua cultura aeróbica a 37°C, contando-se o número de colónias que se formam. A quantidade do micro-organismo descrito acima pode ser ajustada judiciosamente de acordo com a forma da composição que se vai preparar utilizando a quantidade referida acima como referência. (3-2) A composição contendo compostos de daidzeína da invenção A composição da invenção pode conter ainda, caso seja necessário, pelo menos um membro seleccionado de entre o conjunto constituído pelos compostos de daidzeina mencionados acima e por ingredientes contendo compostos de daidzeina. Entre os diversos tipos de compostos de daidzeina e ingredientes contendo compostos de daidzeina, os hipocótilos de grão de soja e os ingredientes alimentares preparados a partir dos hipocótilos, são especialmente preferidos, e, entre estes, os ingredientes alimentares solúveis em água ou emulsionados são ainda mais preferidos. Entre outros exemplos dos referidos ingredientes contendo compostos de daidzeína encontram-se a farinha de soja e o leite de soja. 21

Devido ao substrato contido na formulação, uma pessoa não habituada a consumir grão de soja e outros ingredientes alimentares semelhantes podem consumir a composição por via oral, e o micro-organismo ingerido utiliza o substrato formulado para o objectivo de equol no corpo. A quantidade dos referidos compostos de daidzeina e/ou dos ingredientes contendo compostos de daidzeina na composição não tem qualquer limitação especifica mas pode razoavelmente ser de cerca de 10-25 mg, o que é equivalente ao consumo diário habitual médio de um Japonês. (3-3) Composição contendo equol da invenção A composição da invenção pode também conter equol.

Em geral, o apetite que um indivíduo tem em relação a um alimento aumenta quando o material alimentar sofre por exemplo uma fermentação de ácido láctico, por exemplo. Além disto, o Lactococcus 20-92, que é um exemplo representativo de um micro-organismo para utilização na composição da invenção, tem uma capacidade muito elevada de produção de equol (actividade). A invenção presente proporciona além disto uma composição contendo equol, tal como leite de soja fermentado, que se prepara permitindo que a referida espécie de micro-organismo actue sobre um ingrediente contendo compostos de daidzeina tal como leite 22 de soja, e deste modo deixando-o utilizar os compostos de daidzeina no leite de soja para elaborar o equol. A titulo de substrato para utilização neste aspecto da invenção, podem utilizar-se os diversos tipos de composto de daidzeina e de ingredientes contendo compostos de daidzeina mencionados acima. Entre estes, as soluções ou as emulsões preparadas a partir de leite de soja, de farinha de soja ou outros semelhantes são as preferidas.

Um exemplo preferido especifico da composição contendo equol da invenção é o produto de fermentação obtido por um processo que inclui adicionar-se isoflavona de soja ou um material alimentar que a contenha a um meio adequado e fazer-se a cultura do micro-organismo da invenção, preferivelmente Lactococcus 20-92, neste meio para provocar a fermentação. Mais especificamente, pode levar-se a cabo uma tal fermentação pelo processo que inclui adicionar-se uma quantidade previamente determinada do micro-organismo da invenção a uma mistura de uma solução esterilizada de substrato com um meio nutriente favorável para o crescimento do micro-organismo, tal como BHI, EG, BL ou GAM, ou a leite de vaca, leite de soja, ou um sumo vegetal que possa ser utilizado como alimento, e levando a cabo uma reacção de fermentação anaeróbica ou aeróbica a 37°C sob condições estacionárias durante cerca de 48-96 horas [quando necessário, podem adicionar-se um agente de controlo do pH e um agente redutor (por exemplo extracto de levedura, vitamina Ki, ou outros semelhantes)]. No processo 23 acima, a quantidade de substrato pode ser de cerca de 0,01-0,5 mg/mL e a dimensão do inoculo do micro-organismo pode ser seleccionada adentro da gama de entre cerca de 1 e cerca de 5 %.

Desta maneira, pode produzir-se a composição contendo equol da invenção. Pode aplicar-se esta composição com vantagem sob a forma descrita acima de um produto alimentar ou farmacêutico. Além disto, o equol produzido pode ser isolado e purificado a partir do caldo de cultura ou do produto de fermentação de um modo conhecido por si próprio, pode opcionalmente formular-se com quantidades conhecidas de outros ingredientes alimentares ou outros semelhantes, e pode processar-se a formas do tipo das de produtos alimentares ou farmacêuticos. O isolamento e a purificação que se referiram acima podem ser conseguidos, por exemplo, adsorvendo o produto de fermentação sobre uma resina de permuta iónica (DIAION HP20, produto da Mitsubishi Kasei Corporation), eluindo-o com metanol, e concentrando o eluido à secura. A quantidade de equol na composição da invenção é seleccionada de acordo com a forma de produto alimentar ou farmacêutico que se pretenda produzir e não tem nenhuma restrição especial. Preferivelmente, no entanto, a quantidade deve ser tal que estejam contidos 2-5 mg do equol em cada 100 g da composição total. 24 A presença de equol na composição do produto da invenção pode ser confirmada pelo método descrito adiante neste documento no Exemplo de Teste 1. A composição contendo equol da invenção está localizada num ponto alto da escala de segurança porque o ingrediente activo equol é uma substância com ocorrência natural. Além disto, uma vez que é preparado utilizando a estirpe bacteriana de ácido láctico, o risco de contaminação com produtos químicos provenientes da linha de produção é muito pequeno. A título de vantagens adicionais, podem mencionar-se um rendimento elevado e um custo pequeno, bem como se podem mencionar um gosto e um sabor deliciosos, a título de alimento. (3-4) Formas de alimento

Processa-se em geral a composição contendo bactérias de ácido láctico que produzem equol da invenção sob formas de produtos alimentares incluindo a estirpe bacteriana de ácido láctico específica a título de componente essencial, em combinação com um veículo comestível adequado.

Incluem-se nas formas de alimento específicas da composição da invenção a forma de bebida, de produto lácteo para além da bebida referida (inclusive da forma de leite fermentado), da forma de alimento sólido, da forma micro-encapsulada contendo células, e assim por diante. Incluem- 25 se na composição da invenção sob a forma de bebidas, bebidas de bactérias de ácido láctico e bebidas contendo bactérias de ácido láctico. Os termos "leite fermentado " e "bebida de bactérias de ácido láctico", tal como se utilizam neste documento, são conforme as definições no Artigo 2-37 "Leite

Fermentado", e no Artigo 2-38 "Bebida de Bactérias e Ácido Láctico" dos "Regulamentos relativos aos Ingredientes, etc. de leite e Produtos Lácteos" do anterior Ministério da Saúde e Bem-Estar. Deste modo, "leite fermentado" significa uma preparação pastosa ou liquida resultante da fermentação de um leite ou de um produto lácteo (fresco) por intermédio de bactérias de ácido láctico ou de leveduras. Portanto, o "leite fermentado" inclui não apenas produtos sob a forma de bebidas, mas também sob a forma de iogurtes. A "bebida de bactérias de ácido láctico" significa ma bebida preparada utilizando um produto pastoso ou liquido resultante da fermentação de um leite ou de um produto lácteo com um bactéria ou com uma levedura que o fermentem, a titulo de material principal, diluindo-o com água. A bebida contendo bactérias de ácido láctico inclui bebidas vegetais fermentadas, bebidas de frutos fermentadas, e bebidas de leite de soja fermentadas, etc. Incluem-se nos exemplos de itens sob a forma de produtos lácteos para além das bebidas, produtos sob a forma de colhadas, tais como iogurte. Sob a forma de sólidos incluem-se grânulos, pós (inclusive, por exemplo, pós 26 liofilizados provenientes de leite fermentado), comprimidos, comprimidos efervescentes, gomas, rebuçados d goma, e pudins, etc.

Pode levar-se a cabo o processamento para se obterem estas formas de um modo convencional. Para além disto, o veiculo para utilização no processamento a estas diversas formas pode incluir qualquer veículo comestível. São veículos especialmente preferidos aqueles que proporcionam uma boa sensação em boca e melhoram o gosto. Incluem-se nos exemplos de tais veículos com boa sensação em boca e melhorando o gosto os edulcorantes artificiais, sorbitol, xilitol, e assim por diante. Outros veículos preferidos são, por exemplo, agentes capazes de mascarar o gosto tais como a trehalose (produto da Hayashibara), a ciclodextrina, o Benekote BMI (produto da Kao Corporation), etc. A bebida contendo bactérias de ácido láctico como forma de alimento preferida é descrita em pormenor adiante. 0 processamento a uma tal bebida pelo processo inclui uma cultura do micro-organismo num material de fermentação adequado contendo nutrientes para o micro-organismo, tal como em fluidos derivados de vegetais ou de frutos, leite de soja (soja emulsionada), etc. para provocar deste modo a fermentação do material referido. Incluem-se nos vegetais e frutos para utilização a título de material de fermentação peças cortadas, produtos moídos, produtos raspados, sumos em resultado de expressão, produtos tratados por enzimas, e 27 as suas diluições ou concentrados. Incluem-se nos vegetais abóboras, cenouras, tomates, pimentos doces, aipo, espinafre, batatas-doces pigmentadas, milho, beterrabas, couves, salsa, repolhos, e brócolos, etc. Incluem-se nos frutos maçãs, pêssegos, bananas, morangos, uvas, melancias, laranjas, e tangerinas, etc.

Podem obter-se os pedaços, produtos de moenda, e raspados dos vegetais e dos frutos, por exemplo, pelo processo que inclui lavar-se o vegetal ou fruto, submetê-lo a um tratamento de branqueamento, por exemplo colocando-o em água quente, quando necessário, e depois a um corte, pulverização, ou moenda recorrendo a um moinho, misturador, processador de alimentos, produtor de polpas, moinho coloidal, ou outro semelhante. Podem preparar-se sumos utilizando uma prensa filtrante, uma máquina de produção e mistura de sumos, ou outra semelhante. Também se podem preparar sumos filtrando os referidos produtos de moenda (triturados) através de um pano filtrante ou outro material semelhante. Podem preparar-se os produtos tratados com enzimas permitindo a actuação de celulase, pectinase, protopectinase ou outros semelhantes sobre os referidos pedaços, triturados, produtos moidos, ou sumos. Incluem-se nas diluições, diluições com água a entre 1 e 50 vezes. Incluem-se nos concentrados aqueles que se concentram 1 a 100 vezes utilizando meios tais como concentração do congelado, concentração sob pressão reduzida, etc. 28

Pode preparar-se o leite de soja, que é outro exemplo particular do material utilizado a titulo de substrato de fermentação, a partir de materiais de soja de um modo que é de rotina. Inclui-se no leite de soja um homoqenado preparado imergindo grãos de soja pelados em água, pulverizando estes grãos de soja em meio húmido com um moinho adequado ou de outro modo semelhante, e homogeneizando o pulverizado de um modo rotineiro a uma solução contendo a proteína de soja solúvel em água, etc.

Pode levar-se a cabo uma fermentação utilizando um micro-organismo inoculando o referido material substrato de fermentação com o micro-organismo da invenção e incubando o material inoculado em condições estacionárias. Pode suplementar-se opcionalmente o meio com substâncias que promovam a fermentação, assegurando um bom crescimento do micro-organismo utilizado, por exemplo diversas fontes de carbono, tais como glucose, amido, sacarose, lactose, dextrina, sorbitol, frutose, etc., fontes de azoto tais como extracto de levedura, peptona, etc., vitaminas, e minerais. A dimensão do inoculo de micro-organismo deve em geral ser equivalente a uma contagem de células viáveis não inferior a cerca de 1 x 106 células, preferivelmente cerca de 1 x 107 células por centímetro cúbico do fluido substrato de fermentação. No que toca às condições de cultura, a temperatura de fermentação é em geral seleccionada na gama de entre 20-40°C, preferivelmente 29 cerca de 25-37°C, mais preferivelmente 37°C e o período de fermentação é seleccionado na gama de cerca de 8-24 horas.

Para uma fermentação estável, é recomendável preparar antes uma cultura de arranque e inocular o material substrato de fermentação com esta cultura, para a fermentação. Uma cultura de arranque representativa pode ser por exemplo uma cultura obtida inoculando com a estirpe presente de micro-organismo da invenção o referido material substrato de fermentação depois de submetido a uma esterilização pelo processo habitual, durante 5-20 minutos a 90-121°C, ou leite magro em pó com um suplemento de extracto de levedura a 10 %, ou outros semelhantes, prosseguindo a cultura do micro-organismo nas mesmas condições que acima. A cultura de arranque preparada deste modo contém em geral cerca de 107-109 células do micro-organismo da invenção por grama de cultura. O produto de fermentação de ácido láctico obtido pelo processo acima pode por vezes assumir a forma de um coalho (uma forma semelhante à de um iogurte ou de um pudim) e pode consumir-se directamente este produto a título de alimento. O produto de fermentação de ácido láctico no referido coalho alimentar pode também ser homogeneizado em seguida para se preparar a forma de bebida pretendida (por exemplo, uma bebida de leite de soja fermentada). Pode levar-se a cabo esta homogeneização recorrendo a um homogeneizador habitual. Mais especificamente, pode utilizar-se um homogeneizador de alta 30 pressão de Gaulin [LAB 40] a cerca de 200-1.000 kgf/cm2, preferivelmente a cerca de 300-800 kfg/cm2, ou um homogeneizador da Sanwa Machine Industry Co. (número de artigo: HA x 4571, H20-A2, etc.) a não menos do que 150 kg/cm2. Por intermédio desta homogeneização, pode obter-se um produto que é uma bebida, em especial uma bebida de leite de soja fermentado, com um gosto excelente, e em especial uma sensação em boca suave. Quando se leva a cabo uma tal homogeneização, é permitido, quando for necessário, fazer a diluição adequada, adicionar um ácido orgânico para ajustar o pH, e/ou adicionar diversos aditivos que são habitualmente empregues no fabrico de bebidas, tais como açúcares, sumos de fruta, cargas para correcção da viscosidade, tensioactivos, e sabores, nas quantidades adequadas. A título de exemplo preferido particular, de cada tipo de aditivo mencionado acima e do seu teor adicionado (em % ponderai com base no peso do produto de fermentação sob a forma de coalho) listam-se: 8 % de glucose (% ponderai, aplicando-se o mesmo doravante neste documento), 8 % de açúcar, 8 % de dextrina, 0,1 % de ácido cítrico, 0,2 % de éster de ácido gordo com glicerol, e 0,1 % de sabor.

Deste modo a bebida com bactérias de ácido láctico da invenção, tal como uma bebida de leite de soja fermentada, pode ser dispensada de um modo asséptico em contentores adequados de um modo convencional, para proporcionar o produto final. Este produto tem uma boa 31 sensação em boca, permitindo ser bem engolido, e um bom sabor. A dosagem (quantidade ingerida) do produto acima pode ser judiciosamente seleccionada consoante a idade, o sexo, a massa corporal, e a severidade da doença do destinatário, entre outras variáveis, e não tem nenhuma restrição especifica. Em geral, podem ingerir-se diariamente 100-300 mL de um produto para beber, com uma contagem de células viáveis de 108-109 células/mL.

Mais um exemplo particular da composição da invenção sob a forma de alimento, é a forma de comprimido efervescente. Pode preparar-se esta forma formulando a 10-35 % (% ponderai; o mesmo se aplica doravante neste documento) de carbonato de sódio e/ou de hidrogenocarbonato de sódio e 20-70 % de um agente de neutralização, a titulo de ingredientes efervescentes, com 0,01-50 % das bactérias (células imobilizadas) da invenção. 0 agente de neutralização para se utilizar deste modo é um composto ácido capaz de neutralizar o referido carbonato e sódio e/ou hidrogenocarbonato de sódio gerando gás carbónico. São exemplos representativos do agente de neutralização referido ácidos orgânicos tais como o ácido L-tartárico, o ácido citrico, o ácido fumárico e o ácido ascórbico. A quantidade dos referidos ingredientes efervescentes no produto efervescente da invenção é tal que quando este produto da invenção for dissolvido em água, a 32 solução exiba acidez, em especial uma acidez a um pH de cerca de 3,5-4,6. Mais especificamente, pode seleccionar-se a quantidade na gama de 10-35 % de carbonato de sódio e/ou de hidrogenocarbonato de sódio, e 20-70 % de agente neutralizante. Em especial, a quantidade de carbonato de sódio é seleccionada de entre a gama de 11-31 %, preferivelmente 22-26 %; a de hidrogenocarbonato de sódio na de entre 10-35 %, preferivelmente 20-30 %. De entre estas escolhas alternativas, prefere-se a utilização de hidrogenocarbonato de sódio por si só na gama de 20-25 %. Selecciona-se a quantidade de agente neutralizante na gama de entre 20-70 %, preferivelmente 30-40 %. Em especial, prefere-se utilizar ácido L-tartárico na gama de entre 20-25 % e ácido ascórbico na gama de entre 8-15 %. O produto efervescente contém os micro-organismos da invenção e os ingredientes efervescentes a titulo de componentes essenciais e podem opcionalmente estar contidas também diversas quantidades apropriadas de vários aditivos conhecidos tais como o excipiente, aglomerante, desintegrante, lubrificante, carga para viscosidade apropriada, tensioactivo, agente de modulação da osmolaridade, electrólito, edulcorante, sabor, corante, agente de controlo do pH, e assim por diante. São exemplos dos aditivos os amidos tais como o amido de trigo, o amido de batata, o amido de milho, a dextrina, etc.; os sacáridos tais como a sacarose, a glucose, a frutose, a maltose, a xilose, a lactose, etc.; os álcoois de açúcar tais como o sorbitol, o manitol, o maltitol, o xilitol, etc.; os 33 glicósidos de transposição de açúcares tais como açúcar de acoplamento, palatinose, etc.; os excipientes tais como o fosfato de cálcio, o sulfato de cálcio, etc.; os aglomerantes/espessantes tais como os amidos, sacáridos, gelatina, goma-arábica, dextrina, metilcelulose, polivinilpirrolidona, poli(álcool vinilico), hidroxipropilcelulose, goma xantana, pectina, goma de tragacanto, caseína, ácido algínico, etc.; os lubrificantes tais como a leucina, a isoleucina, a L-valina, os ésteres de açúcar, os óleo hidrogenados, o ácido esteárico, o estearato de magnésio, o talco, os macrogóis, etc.; os desintegrantes tais como celulose cristalina (Avicel, Asahi Chemical Industry Co., Ltd.), a carboximetilcelulose (CMC), a carboximetilcelulose sódica (CMC-Na), a carboximetilcelulose cálcica (CMC-Ca), etc.; os tensioactivos tais como o éster de ácidos gordos com polioxietileno-sorbitan (poli-sorbata), a lecitina, etc.; os dipéptidos tais como o aspartame, o alitame, etc.; e os edulcorantes tais como o de stevia, a sacarina, e ouros semelhantes. Todos estes podem ser judiciosamente seleccionados e utilizados em quantidades seleccionadas levando em consideração a relação entre cada um deles e as componentes essenciais, as proporções na preparação, e o método de produção da preparação, entre outros factores.

Além disto, na preparação efervescente da invenção, as vitaminas, em especial a cianocobalamina e o ácido ascórbico (vitamina C) , podem ser formulados em quantidades adequadas. Não existem limitações específicas 34 das quantidades, mas em geral, a vitamina C, por exemplo, pode ser adicionada até, no máximo, 30 %, preferivelmente a entre 5-25 %. O método de produção da preparação efervescente da invenção pode ser fundamentalmente semelhante ao método convencional para a produção de comprimidos efervescentes deste tipo. Deste modo, pode fabricar-se a preparação da invenção numa forma de comprimido efervescente pesando quantidades previamente determinadas dos ingredientes respectivos, misturando-as, e processando a mistura, por exemplo pelo método de compressão directa do pó ou pelo método se granulação, quer seca, quer em húmido, antes da compressão.

Pode transformar-se a preparação da invenção, obtida deste modo, numa forma de bebida adequada para administração por via oral, meramente colocando-a em água, e procedendo à administração por via oral.

Pode estabelecer-se judiciosamente a sua dosagem (quantidade consumida) consoante a idade, o sexo, a massa corporal, a severidade da doença do destinatário, entre outras variáveis, e ela não tem nenhuma restrição especifica embora em geral se possam dissolver 1-2 comprimidos efervescentes da invenção pesando cerca de 1,5-6,0 g por comprimido em 100-300 mL de água, ingerindo a solução resultante a titulo de uma dose. 35

As proporções especialmente preferidas na mistura do composto de daidzeina substrato ou do ingrediente contendo compostos de daidzeina, da estirpe bacteriana de ácido láctico especifica, e de outros ingredientes opcionalmente formulados na composição da invenção, por 100 g de composição, são: uma guantidade de entre cerca de 10 e 50 mg de composto de daidzeina substrato ou do ingrediente contendo compostos de daidzeina, calculado como daidzeina, cerca de 109-1010 células (contagem de células viáveis) da estirpe bacteriana de ácido láctico especifica, e oligossacáridos e outros numa guantidade de entre cerca de 1-5 g.

Uma vez que a composição produzindo equol da invenção é concebida contendo um micro-organismo (sobretudo bactéria vivas), tal como se mencionou acima neste documento, não são recomendáveis condições de aplicação de calor e de pressão durante o processamento da composição até aos produtos finais. Portanto, no processamento da composição da invenção até estas formas de produto, tais como barras, grânulos, pós, e comprimidos, é preferível formular-se directamente o micro-organismo sob a forma de células liofilizadas ou utilizar células liofilizadas tratadas com um agente de revestimento adequado.

No entanto, a composição contendo bactérias de ácido láctico produtoras de equol da invenção não tem necessariamente que conter bactérias viáveis. Quando a referida composição contendo bactérias viáveis e o referido 36 composto de daidzeína ou outros semelhantes, já referidos, que podem ser utilizados pelas bactérias referidas, contém equol produzido pelas bactérias, ela pode ser submetida a um tratamento de esterilização rotineiro para matar as bactérias. Uma tal esterilização térmica aplicada à composição inibe as deteriorações de qosto e de sabor provenientes de uma fermentação excessiva por parte das bactérias viáveis formuladas na composição, durante a armazenagem ou a distribuição pelo mercado. (3-5) Formas de produto farmacêutico

Pode processar-se a composição contendo bactérias de ácido láctico produtoras de equol da invenção sob a forma de preparações farmacêuticas, contendo em geral a referida estirpe bacteriana de ácido láctico a titulo de uma componente essencial, em conjunto com um veiculo adequado aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Incluem-se no veiculo diversos diluentes e excipientes, tais como cargas, agentes de volume, aglomerantes, humectantes, desintegrantes, tensioactivos, lubrificantes, etc. que sejam conhecidos como utilizados na técnica. Estes podem ser selectivamente utilizados de acordo com a forma de unidade de dosagem da preparação. A titulo de forma de unidade de dosagem da preparação farmacêutica, podem utilizar-se selectivamente diversas formas. As formas representativas são comprimidos, 37 pílulas, pós, soluções, suspensões, emulsões, grânulos, cápsulas, e supositórios.

Incluem-se nos veículos que se podem utilizar no processamento à forma de comprimidos, diversos excipientes tais como lactose, sacarose, cloreto de sódio, glucose, ureia, amido, carbonato de cálcio, caulino, celulose cristalina, ácido silícico, fosfato de potássio, etc.; aglomerantes tais como água, etanol, propanol, xarope simples, solução de glucose, solução de amido, solução de gelatina, carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, metilcelulose, polivinilpirrolidona, etc.; desintegrantes tais como carboximetilcelulose sódica, carboximetilcelulose cálcica, hidroxipropilcelulose pouco substituída, amido seco, alginato de sódio, agar em pó, laminarana em pó, hidrogenocarbonato de sódio, carbonato de cálcio, etc.; tensioactivos tais como ésteres de ácidos gordos com polioxietileno-sorbitan, laurilsulfato de sódio, monoacilglicerol de ácido esteárico, etc.; inibidores da desintegração tais como sacarose, estearina, manteiga de cacau hidrogenada, óleos hidrogenados, etc.; promotores de absorção, tais como bases de amónio quaternário, laurilsulfato de sódio, etc.; humectantes tais como o glicerol, amido, etc.; adsorventes tais como amido, lactose, caulino, bentonite, sílica coloidal, etc.; e lubrificantes tais como talco purificado, estearatos, ácido bórico em pó, polietilenoglicol, e assim por diante. 38

Além disto, quando necessário, podem preparar-se comprimidos sob formas que possuam revestimentos convencionais tais como comprimidos revestidos com açúcar, comprimidos revestidos com gelatina, comprimidos com revestimento entérico, comprimidos revestidos com uma película, etc., ou sob a forma de comprimidos em duas camadas ou de comprimidos em múltiplas camadas. 0 veículo que se pode utilizar na formação de pílulas incluem diversos excipientes tais como a glucose, a lactose, o amido, a manteiga de cacau, os óleos vegetais hidrogenados, o caulino, o talco, etc.; aglomerantes tais como goma-arábica em pó, goma de tragacanto em pó, gelatina, etanol, etc.; e desintegrantes tais como laminarana, agar, e assim por diante.

Incluem-se no veículo que se pode utilizar na formação de supositórios o polietilenoglicol, manteiga de cacau, os álcoois superiores, os ésteres de álcoois superiores, gelatina, e acilgliceróis semi-sintéticos, etc. Pode em geral fabricar-se o produto encapsulado misturando as bactérias da invenção com diversos tipos de veículos farmacêuticos, tais como os que se mencionaram acima, utilizando a mistura como enchimento de cascas de cápsulas duras ou de cascas de cápsulas moles elásticas, de uma maneira convencional.

Além disto, quando necessário, podem incorporar-se corantes, conservantes, sabores, agentes de correcção, 39 edulcorantes, e outros fármacos, no produto farmacêutico da invenção. A quantidade do micro-organismo da invenção a incorporar na preparação da invenção não tem nenhuma limitação especifica, mas pode ser judiciosamente seleccionada de entre uma gama larga. A proporção recomendada em geral é de cerca de 108-101C1 células/g da preparação farmacêutica. Não existe nenhuma limitação especifica em relação ao método de administração da preparação farmacêutica acima, mas pode estabelecer-se de acordo com as formas de preparação, com diversos factores do paciente tais como a idade, o sexo, etc., e da severidade da doença. Por exemplo, os comprimidos, pílulas, soluções, suspensões, emulsões, grânulos, e cápsulas são administrados por via oral e os supositórios são administrados por via rectal.

Pode estabelecer-se judiciosamente a dosagem da referida preparação farmacêutica, de acordo com o método de administração, com a idade e o sexo do paciente além de outros factores, e com a severidade da doença, mas é preferivelmente de cerca de 0,5-20 mg/dia, em termos do micro-organismo da invenção, isto é, do ingrediente activo, por kg de massa corporal. Esta preparação pode ser repartida por 1-4 doses parciais ao dia. 40

Aquando da ingestão (administração) da composição da invenção, o micro-organismo na composição é encaminhado vivo até à parte inferior do tracto digestivo, ou aloja-se nessa zona integrando a flora intestinal, sendo expressa deste modo a sua eficácia esperada. A este respeito, a forma de preparação especialmente preferida é o comprimido com revestimento entérico, com o qual o micro-organismo consegue ser transportado para os intestinos sem ser atacado pelo ácido gástrico. A composição contendo bactérias lácticas produtoras de equol da invenção, tal como obtida da maneira acima, é útil para a profilaxia sistemática e para o tratamento do mal-estar e/ou da osteoporose que ocorrem após a menopausa e de perturbações climatéricas em mulheres de meia-idade e idosas. Pode conseguir-se uma tal profilaxia e um tal tratamento administrando uma quantidade eficaz da referida composição da invenção à mulher de meia-idade ou idosa para quem ela é necessária, ou levando-as a ingerir esta composição. A quantidade eficaz mencionada imediatamente acima não tem nenhuma limitação especifica na medida em que seja suficiente para evitar e controlar as diversas manifestações da osteoporose e das perturbações climatéricas que acompanham o mal-estar e/ou a menopausa em mulheres de meia-idade ou idosas. A titulo de regra geral, no entanto, pode em geral seleccionar-se a dosagem de tal modo que a quantidade de equol excretada na urina da pessoa que tomou a composição da invenção atinge pelo menos 5 ymole (cerca de 1,2 mg)/dia. 41

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é uma representação num diagrama que mostra a relação entre o período de incubação e a contagem de células viáveis tal como é determinada pelo protocolo de teste descrito no Exemplo de Teste 1. A Fig. 2 é uma representação num diagrama que mostra a relação entre o período de incubação e a capacidade de produção de equol (classificação) tal como determinada pelo protocolo de teste descrito no Exemplo de Teste 1.

Fig. 3 é uma representação num diagrama que mostra a relação entre o período de incubação e a produção de equol tal como determinada pelo protocolo de teste descrito no Exemplo de Teste 1. A Fig. 4 é uma representação num diagrama que mostra o decurso ao longo do tempo da concentração em cada um dos compostos de daidzeína e do equol na cultura, tal como monitorizados de acordo com o protocolo descrito no Exemplo de Teste 2. 42 A Fig. 5 é uma representação num diagrama que mostra a relação entre o periodo de armazenagem e a capacidade de produção de equol (classificação) tal como determinada de acordo com o protocolo de teste descrito no Exemplo de Teste 3. A Fig. 6 é uma representação num diagrama que mostra os comportamentos dependentes do período de incubação, da estirpe produtora de equol (alterações no desempenho de crescimento, capacidade de produção de equol, e produção de equol) tal como determinados na experiência descrita nos Exemplos de Teste 1-3. A Fig. 7 é uma representação num diagrama que mostra a relação entre o período de incubação e a contagem de células viáveis tal como determinada pelo protocolo de teste descrito no Exemplo de Teste 4.

MELHOR MODO DE LEVAR A CABO A INVENÇÃO

Os exemplos de produção da composição contendo bactérias de ácido láctico produzindo equol da invenção presente que se seguem destinam-se a descrever a invenção presente em mais pormenor e não devem de modo nenhum ser interpretados como definindo a invenção. 43

Exemplo 1 (1) Produção de uma bebida de leite de soja fermentado

Misturaram-se os seguintes ingredientes de acordo com a fórmula, para se preparar a composição da invenção sob a forma de uma bebida de leite de soja fermentado. iCultura de fermentação de proteína de soja!

solúvel em água £100 mL iVitaminas & minerais q.s • Sabor ........... • iÁgua ............ Total 115 0 mL

Obteve-se a cultura de fermentação de proteína de soja solúvel em água acima dissolvendo 13 g de proteína de soja solúvel em água em 100 mL de água, adicionando-lhe 108-109 células de Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036), e fermentando a 37°C durante 24-48 horas. A proteína de soja solúvel em água que se utilizou continha cerca de 1-2 mg, calculados como daidzeína, de compostos de daidzeína por grama. (2) Produção de um leite fermentado 44

Misturaram-se os seguintes ingredientes de acordo com a fórmula para se preparar a composição da invenção sob a forma de um leite fermentado.

iiLeite fermentado por Lactococcus 0-92 100 mL iiVitaminas & minerais q.s. iiSabor q-.s·______________ iiÁgua q-s·__________________ sTotal 150 mL

Obteve-se o leite fermentado por Lactococcus 20-92 adicionando 108-109 células de Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) a 1 L de leite de vaca (com um conteúdo de 8,5 % ou maior em sólidos de leite não gordura, e um conteúdo em gordura de leite de 3,8 % ou maior), e levando a cabo a fermentação durante 24-48 horas. (3) Produção de vim pó liofilizado de leite de soja fermentado

Utilizando cerca de 109 células de Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) e 100 g de leite de soja (sólidos de soja 10 %, conteúdo em compostos de daidzeina 10-15 mg, calculado como daidzeina), levou-se a cabo uma fermentação de ácido láctico a 37°C durante 72-96 horas para a produção de equol. Liofilizou-se o produto desta fermentação para se preparar um pó. O conteúdo em equol no pó, tal como determinado por HPLC, era de 0,1-0,3 %, em peso. 45

Pesaram-se o pó obtido acima e diversos outros ingredientes, de acordo com a fórmula que se segue, e misturaram-se para se preparar a composição da invenção sob a forma de pó (forma de alimento e forma de produto farmacêutico). iiPó liofilizado de leite de soja!Í2,2 g ^fermentado (conteúdo em equol 0,005 g) iÍExcipiente (amido de milho) Jfcij lvitaminas & minerais -q-s. l Sabor jiTotal 20 g (4) Produção de um pó

Pesaram-se os ingredientes seguintes de acordo com a fórmula e misturaram-se para se preparar a composição da invenção sob a forma de um pó (forma de alimento e forma de produto farmacêutico).

Lactococcus 20-92 liofilizado em pó Excipiente (lactose) ............. Vitaminas & minerais ........... Sabor ....................N-.S·..... Total |20 g 46

Obteve-se Lactococcus 20-92 sob a forma de um pó liofilizado de uma cultura de Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) nu meio de cultura líquido apropriado (MRS) (37°C, 24-48 h), separando e recolhendo células provenientes de um cultura em leite magro a 10 %, e liofilizou-se a suspensão. O conteúdo do pó em células era de 109-101C1 células/g.

Pode transformar-se o pó acima num pó contendo daidzeína misturando-o com mais 4,1 g de isoflavonas de soja em pó.

Por consumo do pó contendo daidzeína obtido deste modo, os resultados em termos de excreção urinária de equol eram de cerca de 5 pmoles (cerca de 1,2 mg) ao dia, indicando claramente que a quantidade de equol correspondente às excreções acima pode ser produzida in vivo. (5) Produção de grânulos

Pesaram-se os ingredientes seguintes de acordo com a fórmula e misturaram-se para se preparar a composição da invenção sob uma forma granular (forma de alimento e forma de produto farmacêutico). ^Isoflavonas semi-purifiçadas de soja em pó !Lactococcus 20-92 liofilizado em pó 4,1 g.| 1, o g ! q. s . Éster de ácido com sacarose 47 iVitaminas & minerais ...................................................|g„-,s..·.. Sabor q. . Total [2 0 g 0 Lactococcus 20-92 liofilizado em pó que se utilizou era do mesmo que se utilizara acima em (1).

Do consumo da composição acima resulta o transporte em simultâneo de daidzeina e de bactérias produtoras de equol até ao intestino grosso, dando assim origem à produção de equol no intestino grosso.

Apresentam-se em seguida os Exemplos de Teste relacionados com a estirpe bacteriana da invenção de ácido láctico produtora de equol.

Exemplo de Teste 1

Teste do desempenho em crescimento, da capacidade de produção de equol (actividade), e da produção de equol (1) Protocolo do Teste

Incubou-se Lactococcus 20-92 (107—109 células/g) em 5 mL de caldo BHI [um meio líquido para crescimento (meio basal)], anaerobicamente a 37°C durante 24 horas e diluiu-se a cultura a 102 e a 104 células como o meio basal. 48

Misturaram-se tanto a cultura obtida quando se completou a incubação como as suas diluições preparadas acima, respectivamente, a 0,2 mL de cada, com 5 mL de quer meio basal com suplemento de daidzeína (daidzeína adicionada a meio BHI a uma concentração final de 10 yg/mL), quer leite de vaca, quer ainda leite de soja, respectivamente, fazendo-se culturas anaeróbicas a 37°C. Ajustaram-se os períodos de incubação a 8, 24, 48, 72, e 96 horas para o caso do meio basal suplementado com daidzeína a 10 yg/mL bem como para o leite de soja, e a 8, 24 e 48 horas para o caso do leite de vaca.

Antes de se iniciar a incubação e no final de cada período de incubação, obtiveram-se amostras de 0,1 mL e de 0,2 mL da cultura, submetendo-se respectivamente à contagem das células e à determinação da capacidade de produção de equol (actividade). Além disto, tanto para o meio basal contendo 10 yg/mL de daidzeína como para o leite de soja, amostraram-se 0,5 mL de cada cultura antes de se iniciar a incubação e no final de cada período de incubação, e determinou-se a quantidade de equol produzido em cada amostra.

Determinou-se o número de bactérias do seguinte modo. Diluiu-se cada amostra com 0,1 mL com PBS(-) (produto da Nissui Co.) para se prepararem diluições a 104, 105, 106 e 107 vezes, e utilizaram-se 0,1 mL de cada uma destas diluições para revestir placas de meio GAM em agar, 49 incubando-se aerobicamente a 37 °C durante 24 horas. Contaram-se as colónias formadas no meio, para utilização a titulo de número de bactérias.

Determinou-se como se segue a capacidade de produção de equol (actividade). Misturou-se cada uma das amostras de 0,2 mL com 5 mL do meio basal com suplemento de daidzeina (sempre em triplicado) e incubou-se anaerobicamente a 37 °C durante 96 horas. Quando se completou a incubação, obtiveram-se amostras de 0,5 mL das culturas respectivas e extrairam-se por duas vezes com porções de 5 mL de acetato de etilo, quantificando-se a daidzeina, a dihidrodaidzeina (intermediário), e o equol no extracto por HPLC. Além disto, com base na quantidade total, calculou-se a percentagem em equol. Anotaram-se os resultados classificando-os através da seguinte escala com 5 pontos, e utilizou-se o valor médio de 3 amostras como indice da capacidade de produção de equol (actividade). 4: Equol (90 % ou mais) 3: Equol produzido, diminuindo a daidzeina para menos de 50 % (formação do intermediário) 2: Equol produzido, daidzeina residual (50 % ou mais) (formação do intermediário) 1: Formação do intermediário, equol não produzido 0: Nem intermediário nem equol produzidos, não diminuindo a daidzeina 50

Determinou-se a quantidade de equol produzido como se seque. Extraiu-se cada uma das amostras de 0,5 mL por duas vezes com porções de 5 mL de acetato de etilo e quantificaram-se por HPLC a daidzeina, a dihidrodaidzeina (intermediário), e o equol no extracto. Em sequida, utilizaram-se as concentrações respectivas para calcular a quantidade de equol produzido. (2) Resultados do Teste (2-1) Os resultados das contagens de células (desempenho no crescimento) estão apresentados na Fig. 1.

Na representação diagramática, (1) representa o resultado obtido no caso em que se utilizou o meio basal com suplemento de daidzeina, (2) representa o resultado obtido quando se utilizou leite de soja, e (3) representa o resultado obtido quando se utilizou leite de vaca. Nos diagramas, o eixo horizontal representa o periodo de incubação (h) e o eixo vertical representa a contagem de células viáveis (Log CFU/mL).

Pode ver-se nos diagramas respectivos, o desempenho no crescimento da estirpe da invenção é bom e, independentemente da dimensão do inoculo que se utilizou, a fase estacionária do crescimento foi invariavelmente atingida em 8 horas de incubação para todas as amostras com meio basal com suplemento de daidzeina, com leite de soja e com leite de vaca. Verificou-se que a contagem das células 51 viáveis era sempre de ]_o9,1”9'4 CFU/mL no meio basal com suplemento de daidzeina, de io8,5~8'7 CFU/mL em leite de soja, e de io8'0-8'4 FU/mL em leite de vaca. (2-2) Apresentam-se os valores de capacidade de produção de equol (actividade) na Fig. 2.

Na Fig. 2, (1) representa o resultado obtido no caso em que se utilizou o meio basal com suplemento de daidzeina, (2) representa o resultado obtido no caso em que se utilizou leite de soja, e (3) representa o resultado obtido no caso em que se utilizou leite de vaca. Nos diagramas, o eixo horizontal representa o período de incubação (h) e o eixo vertical representa a classificação da actividade. É óbvio a partir dos resultados apresentados na Fig. 2 que a capacidade de produção de equol (actividade) tende a aumentar ao longo do tempo em todas as amostras, quer em meio basal com suplemento de daidzeina, quer em leite de soja, quer ainda em leite de vaca. Também podia confirmar-se que mesmo nos casos em que se utilizou leite de vaca e naqueles em leite de soja, se mantém a capacidade de produção de equol (actividade) da estirpe da invenção. (2-3) Resultados da determinação da produção de equol 52

As quantidades de equol produzidas no meio basal com suplemento de daidzeina e em leite de soja (cerca de 80 yg/mL calculados como daidzeina) foram tal como se mostra na Fig. 3.

Em relação à Fig. 3, (1) representa o resultado obtido no caso em que se utilizou o meio basal com suplemento de daidzeina, (2) representa o resultado obtido no caso em que se utilizou leite de soja. Em cada diagrama, o eixo horizontal representa o periodo de incubação (h) e o eixo vertical representa a concentração em equol (yg/mL).

Em ambos os meios, começou a notar-se a produção de equol passadas 48 horas do inicio da incubação. No caso em que se utilizou leite de soja, a quantidade de equol produzida variou com a dimensão do inoculo e em especial ao teor de inoculação de 4,00 %, a produção do equol chegou a atingir os 57,0 yg/mL às 96 horas de incubação.

Embora, em leite de soja, 90 % ou mais da daidzeina que serve de precursor do equol esteja presente sob a forma de glicósido (sob a forma ligada a glucose), o pico que correspondia ao glicósido já não era observado no cromatograma de após a incubação e este facto sugere que a estirpe da invenção decompõe o glicósido (actividade de β-glucosidase) para originar daidzeina, metabolizando também esta daidzeina a equol.

Exemplo de Teste 2 53

Caminho de produção de equol no Lactococcus 20-92 (1) Protocolo do teste

Fez-se uma cultura aeróbica de Lactococcus 20-92 (107 células/mL) em 5 mL de caldo BHI (um meio liquido para crescimento, meio basal) a 37°C durante 24 horas, e misturaram-se 0,2 mL da cultura resultante com 5 mL de meio basal com suplemento de daidzeina, incubando-se a mistura anaerobicamente a 37°C. Ajustaram-se os períodos de incubação a 8 h, 24 h, 30 h, 36 h, 48 h, 51 h, 54 h, 60 h, 84 h, e 96 h.

Antes do inicio da incubação e no final de cada período de incubação, obtiveram-se amostras de 0,5 mL e quantificaram-se em cada amostra as concentrações em daidzeina, dihidrodaidzeína (intermediário), e equol. (2) Resultados

Representaram-se os resultados obtidos na Fig. 4. A Fig. 4 é um conjunto de diagramas representando as alterações ao longo do tempo das concentrações em daidzeina (à esquerda), em dihidrodaidzeína (ao centro), e em equol (à direita) . Em cada um dos diagramas, o eixo horizontal representa o período de incubação (h) e o eixo 54 vertical representa a concentração (em yg/mL) da substância correspondente. A partir dos dados apresentados na Fig. 4 tornar-se-á aparente que a concentração em daidzeina começou a declinar às 48 horas de incubação, que o composto intermediário, dihidrodaidzeina foi formado durante o periodo compreendido entre as 48 horas e as 60 horas de incubação, e que a produção do equol se iniciou às 48 horas de incubação. Também se pode confirmar que o metabolismo da daidzeina ao equol se havia substancialmente completado às 60 horas de incubação.

Se por um lado os resultados acima indicaram que ocorria o metabolismo da daidzeina a equol através do referido composto intermediário, dihidrodaidzeina, os resultados também sugeriram que a formação da dihidrodaidzeina e o seu metabolismo a equol ocorreram em paralelo.

Exemplo de Teste 3

Estabilidade de leites fermentados contendo a estirpe Lactococcus 20-92 a baixa temperatura (1) Protocolo do teste

Obteve-se uma cultura de Lactococcus 20-92 em 5 mL de um meio de crescimento liquido (meio basal), 55 anaerobicamente a 37°C durante 24 horas, e utilizou-se a cultura resultante para se inocular 1 L e 2 L de leite de vaca, e 1 L de leite desnatado comercial (contendo 10 % de sólidos) , respectivamente, a um teor de 4 %, e fez-se a cultura aerobicamente em condições estacionárias a 37°C durante 48 horas. Armazenaram-se as culturas a 4°C.

No caso do leite de vaca, monitorizou-se a capacidade de produção de equol (actividade) semanalmente a partir do instante em que se completou a cultura e até às 4 semanas de armazenagem a baixa temperatura, de 4°C. Além disto, reservaram-se dois dos tubos e armazenaram-se, respectivamente até ao dia 42 e até ao dia 51, e determinou-se em todos os casos a actividade.

No caso do leite desnatado, determinou-se a actividade quando se completou a cultura e durante a semana 1 e o dia 34 da armazenagem a baixa temperatura, de 4°C.

Geraram-se as classificações de actividade antes da armazenagem e no final de cada período de armazenagem, recorrendo ao método descrito acima que incluía inocularem-se 5 mL de meio basal com suplemento de 10 yg/mL de daidzeína a um teor de 4 % (0,2 mL) , em triplicado, manter a cultura anaeróbica do micro-organismo a 37°C durante 96 horas, e determinarem-se as concentrações em daidzeína, dihidrodaidzeína (intermediário), e equol para se classificar a actividade. 56 (2) Resultados

Apresentam-se os resultados na Fig. 5. Na Fig. 5, o eixo horizontal representa o período de armazenagem (dias) e o eixo vertical representa a classificação de actividade.

Tal como é aparente desta representação diagramática dos resultados, no que diz respeito ao leite de vaca, a capacidade de produção de equol (actividade) é mantida até à semana 4 da armazenagem a baixa temperatura, de 4°C, depois de se haver completado a cultura em ambos os casos de 1 L e de 2 L. Além disto, no caso de 2 L de leite de vaca, verificou-se que a actividade se mantinha até ao dia 51, que foi o último dia em que se monitorizou a estabilidade de armazenagem a 4°C. No caso de 1 L de leite desnatado comercial, também, a capacidade de produção de equol (actividade) manteve-se aparentemente até ao dia 34, último dia em que se monitorizou a estabilidade de armazenagem a baixa temperatura, a 4°C, depois de completada a cultura.

Os resultados acima indicam que o leite fermentado preparado utilizando Lactococcus 20-92 é capaz de manter a actividade mesmo em condições de armazenagem a baixa temperatura e, portanto, também é adequado para uma distribuição alimentar. 57 A relação entre o desempenho de crescimento de Lactococcus 20-92 e a sua capacidade de produção de equol (actividade) e a quantidade de equol produzida, tal como se podem deduzir dos resultados obtidos nos Exemplos de Teste 1-3 acima, pode ser representada por diagramas tal como se ilustra na Fig. 6.

Deste modo, embora as condições das culturas variassem para meios de cultura diferentes, pode manter-se a capacidade de produção de equol (actividade) tanto na fase de crescimento como na fase estacionária. Por outro lado, no que toca à produção de equol, parece que o enzima começa a ser expressou ou activado para produzir equol ao fim de um determinado período na fase estacionária.

Exemplo de Teste 4

Tolerância do leite fermentado preparado pela utilização de Lactococcus20-92 ao suco Gástrico (1) Protocolo do teste

Fez-se uma cultura anaeróbica de Lactococcus 20-92 em 5 mL de um meio líquido para crescimento anaeróbico (caldo BHI, meio basal) a 37°C durante 24 horas. Utilizou-se a cultura resultante (109 células/g) para inocular 1 L de leite de vaca a um teor de 4 %, e incubou-se

aerobicamente sob condições estacionárias, a 37°C durante 48 horas. Completada a cultura, armazenou-se o leite a 4°C 58 e, considerando-o como leite fermentado, sujeitou-se ao seguinte teste.

A titulo de sucos gástricos artificiais, prepararam-se tampões de glicina-HCl 50 mM (a pH 2,5 e a pH

3.0) com um suplemento de 0,045 % de pepsina. A titulo de controlo preparou-se um tampão de glicina-HCl 50 mM (pH 6.0) .

Adicionou-se a 9 mL de cada suco gástrico artificial 1 mL do leite fermentado armazenado a baixa temperatura, e incubou-se a mistura (cultivou-se) aerobicamente em condições estacionárias numa incubadora a 37 °C.

Ajustaram-se os periodos de incubação a 1 h, 2 h, e 3 h, e amostraram-se aliquotas de 0,1 mL e de 0,2 mL de cada cultura, respectivamente antes do inicio da incubação e no final de cada periodo de incubação, sujeitando-se à determinação da contagem de células viáveis (no caso das amostras de 0,1 mL) e da capacidade de produção de equol (actividade) (no caso das de 0,2 mL).

Levou-se a cabo a determinação da contagem de células viáveis de acordo com o processo descrito acima no Exemplo de Teste 1— (1), que inclui a obtenção de amostras de 0,1 mL de cada cultura, diluir a amostra 104, 105, 106 e 107 vezes com PBS(-) da Nissui, revestirem-se 0,1 mL de cada diluição sobre meio GAM sobre agar, incubar-se o meio 59 inoculado aerobicamente a 37 °C durante 24 horas, e contarem-se as colónias formadas no agar de GAM.

Levou-se a cabo a determinação da capacidade de produção de equol (actividade) de acordo com o processo descrito acima no Exemplo de Teste 1-(1), que inclui inocularem-se 5 mL de meio basal com suplemento de daidzeina com 0,2 mL (4 %) da amostra (em triplicado), incubar o meio inoculado anaerobicamente a 37°C durante 96 horas, e medir as concentrações em daidzeina, dihidrodaidzeina (intermediário), e em equol no meio para se classificar a actividade. (2) Resultados

Apresentam-se os resultados obtidos na Fig. 7-A (contagem de células viáveis) e B (concentração em equol).

Na Fig. 7-A, o eixo horizontal representa o período de incubação (h) e o eixo vertical representa a contagem de células viáveis (Log CFU/mL em leite).

Na Fig. 7-B, o eixo horizontal representa o período de incubação (h) e o eixo vertical representa a actividade de equol (classificação).

Pode deduzir-se quanto se segue a partir dos resultados apresentados nas Figs. 7-A e 7-B. Deste modo, na solução tampão a pH 6,0, a contagem de células viáveis 60 mantinha-se a 108 células/mL até à 3a hora, e em seguida a capacidade de produção de equol (actividade) também se mantinha. No suco gástrico artificial a pH 3,0, a contagem de células viáveis mantinha-se até à 3a hora de incubação e, neste caso, a actividade também se mantinha. Por outro lado, no suco gástrico artificial a pH 2,5, iniciava-se um decréscimo notável da contagem de células viáveis à 2a hora de incubação e a actividade também desaparecia.

Quando são estudados no mesmo sistema de teste que o acima, os probióticos (micro-organismos que prosseguem vivos até ao canal intestinal e exibem actividade fisiológica nesse local) existentes no mercado são reportados como não sofrendo alterações nas suas contagens de células viáveis a pH 3,0, mas diminuindo significativamente a pH 2,5. Isto significa que a tolerância ao suco gástrico a pH 3,0 permite a estes micro-organismos passarem vivos através do estômago. Portanto, pode esperar-se que o leite fermentado preparado utilizando Lactococcus 20-92 consiga transportar de uma forma razoável os organismos vivos até aos intestinos, para os deixar exibir uma actividade prolongada na parte inferior do intestino delgado e no intestino grosso.

Exemplo de Teste 5

Teste de tolerância à bilis do Lactococcus 20—92 61

Determinou-se a tolerância à bilis com o Cartão VITEK GPI (Nippon Biomérieux Co., Ltd) e avaliou-se utilizando os desempenhos de crescimento da estirpe da invenção em bilis a 10 % e a 40 % como indicadores. (1) Protocolo do teste

Plaqueou-se Lactococcus 20-92 (IO8-9 células) sobre agar de Tripticase-Soja com um suplemento de 5 % de sangue de carneiro e fez-se uma cultura aeróbica a 37°C durante 24 horas. Obtiveram-se as colónias obtidas no fim da cultura com uma ansa em platina e preparou-se uma suspensão homogénea delas em soro salino estéril a 0,5 %. Colocou-se esta suspensão num cartão VITEK GPI e, passadas 15 horas de incubação a 35°C, avaliou-se o desempenho da estirpe em termos de crescimento na presença de bílis utilizando o corante (indicador de pH). A bílis havia sido preparada dissolvendo uma quantidade previamente determinada de bílis em pó em água destilada estéril, e colocando-a no Cartão antes do teste. (2) Resultados

Os resultados do teste acima indicam que o Lactococcus 20-92 cresce em bílis a 10 % e a 40 %, denotando uma tolerância a bílis, até 40 %.

Exemplo de Teste 6 62

Teste de Lactococcus 20-92 por Hemólise (1) Protocolo do teste

Plaqueou-se Lactococcus 20-92 (IO8-9 células) sobre agar de Tripticase-So j a com um suplemento de 5 % de sangue de carneiro e fez-se uma cultura anaeróbica (N2:C02:H2 = 8:1:1) a 37°C durante 24-48 horas. Observou-se a porção circundante da colónia formada no meio após se ter completado a cultura, e avaliou-se o potencial hemolitico de acordo com a extensão da decomposição das componentes de sangue (despigmentação ou alteração da cor). (2) Resultados

Em resultado do teste acima, não se observou despigmentação (aparecimento de uma zona transparente, incolor) em torno da colónia, indicando que o Lactococcus 20-92 não provoca hemólise β e, sob este aspecto, é um micro-organismo seguro.

Exemplo de Teste 7

Teste de enzima de infiltração de células no Lactococcus 20-92

No que toca à invasão sistémica pelas bactérias de ácido láctico ingeridas, uma depressão da função defensiva do mesentério ou uma diminuição das funções do 63 mesentério ela própria podem ser consideradas como sendo o factor, do lado do hospedeiro. A titulo de factor do lado das bactérias, pode mencionar-se a sua actividade enzimática (enzimas de infiltração de células), decompondo as proteoglicanas do complexo lipido-proteico que constitui o mesentério.

Este teste pretendia investigar se o Lactococcus 20-92 possui actividades enzimáticas de infiltração de células, nomeadamente actividades de colagenase (gelatinase), hialuronidase e sialidase (neuraminidase), ou não, e ele foi levado a cabo da seguinte maneira. (1) Protocolo do teste

Plaqueou-se Lactococcus 20-92 (dimensão do plaqueamento: IO8-9 células) sobre um meio de agar com suplemento de sangue e fez-se uma cultura anaeróbica (N2:C02:H2 = 8:1:1) a 37°C durante 24-48 horas.

Obtiveram-se as colónias obtidas no fim da cultura com uma ansa em platina e preparou-se uma suspensão homogénea delas em água destilada estéril. Utilizando esta suspensão, investigou-se a presença ou a ausência de colagenase (gelatinase) com Api™ (Nippon Biomérieux Co., Ltd.) utilizando como indicador a degradação da gelatina.

Além dito, conduziu-se o teste para se verificar se o Lactococcus 20-92 tem ou não actividades de 64 hialuronidase e de sialidase (neuraminidase)por um processo que incluía incubar-se o Lactococcus 20-92 em solução de tampão Tris-HCl (pH 7,0) contendo a título de substrato, ácido hialurónico ou ácido siálico (a 37 °C, aeróbica, 15 minutos para a actividade de sialidase e 24 h para a actividade de hialuronidase), e medindo os graus de diminuição das concentrações dos substratos respectivos. (2) Resultados O Lactococcus 20-92 não evidenciou nenhuma das actividades de colagenase (gelatinase), hialuronidase, nem sialidase (neuraminidase).

Deste modo, atento o facto de a estirpe da invenção não possuir enzimas que infiltrem células os quais constituem um factor de infectividade, confirmou-se que a estirpe era a de um micro-organismo altamente seguro, também dos pontos de vista da sua infectividade.

Exemplo de Teste 8

Teste de resistência à vancomicina A aquisição de resistência a antibióticos (mutação) pelas bactérias tem sido um assunto muito preocupante nos últimos anos. Não é raro que pacientes infectados com bactérias que adquiriram uma tal resistência a antibióticos sucumbam à morte por causa de não reagirem 65 aos antibióticos. Em especial, a emergência de bactérias resistentes à vancomicina (VRE) é um assunto que gera grande preocupação no dominio da medicina clinica actual. Além disto, existe uma apreensão de que os organismos ingeridos contenham o gene de resistência à vancomicina e que atinjam e se alojem nos intestinos aonde entram em contacto com micro-organismos virulentos ou infecciosos (bactéria patogénicas), o gene de resistência à vancomicina possa ser transferido para as bactérias patogénicas, com o resultado de que estas bactérias também adquiram resistência à vancomicina. É portanto necessário, pelo menos, que os micro-organismos que são utilizados a titulo de probióticos não sejam organismos resistentes à vancomicina.

Este teste destinava-se a investigar a susceptibilidade do Lactococcus 20-92 à vancomicina e foi levado a cabo como se segue. (1) Protocolo do teste

Levou-se a cabo o teste de susceptibilidade à vancomicina utilizando o Sensi-Disk (produto da Nippon Becton-Dickinson Company, Ltd.). Plaqueou-se Lactococcus 20-92 (dimensão do plaqueamento: 108-9 células) sobre meio de agar GAM, colocou-se um disco contendo 30 pg de vancomicina no meio, e fez-se uma cultura aeróbica a 37°C durante 24 horas. Após o periodo de incubação referido, 66 mediu-se o diâmetro da zona de inibição formada em torno do disco, e avaliou-se de acordo com a tabela de avaliação. (2) Resultados 0 diâmetro da zona de inibição do Lactococcus 20-92 era de 11,9±0,2 mm, e a avaliação da sua susceptibilidade de acordo com a tabela de avaliação era positiva (susceptivel: = 10 mm). Este resultado indicava que a estirpe da invenção não era uma estirpe resistente à vancomicina e, portanto, é considerada segura.

Apresenta-se no Exemplo 2 adiante um exemplo da produção do equol a partir da daidzeina utilizando a estirpe bacteriana de ácido láctico da invenção.

Exemplo 2

Produção do equol

Preparou-se um mL de uma suspensão contendo 107-109 células de Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) em meio GAM para cultura de bactérias anaeróbicas e adicionou-se esta suspensão a 100 g de leite de soja (concentração em sólidos: cerca de 2,2 %). Incubou-se a mistura anaerobicamente a 37°C durante 72-96 horas e monitorizou-se o equol produzido na cultura por HPLC. Calculou-se o conteúdo em compostos de daidzeina no leite de soja referido como sendo 95 yg/mL, calculado como daidzeina. 67 0 resultado indicava a formação de 10,716,3 yg/mL (média 1 desvio padrão de 3 experiências) de equol na cultura em leite de soja acima.

Estes valores mostram de um modo muito claro que explorando o micro-organismo da invenção, se pode produzir equol a partir dos compostos de daidzeina contidos em materiais alimentares com uma boa eficiência e a um baixo custo.

Lisboa, 18 de Junho de 2013.

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição contendo Lactococcus garvieae produtor de equol que inclua, a titulo de uma sua componente essencial, um Lactococcus garvieae que tenha a capacidade de utilizar pelo menos um composto de daidzeina seleccionado de entre o conjunto constituído por glicósidos de daidzeina, daidzeina, e dihidrodaidzeina, para a produção de equol.

2. A composição de acordo com a Reivindicação 1, na qual o referido Lactococcus garvieae seja o Lactococcus 20-92 depositado sob a identidade FERM BP-10036.

3. A composição de acordo com a Reivindicação 1, incluindo além disto também farinha de soja ou leite de soja.

4. A composição de acordo com a Reivindicação 1, que assuma a forma de uma bebida ou de um produto lácteo.

5. A composição de acordo com a Reivindicação 1, que assuma a forma de um produto de fermentação de leite de soja. 2

6. Um Lactococcus garvieae que tenha a capacidade de utilizar pelo menos um composto de daidzeina seleccionado de entre o conjunto constituído por glicósidos de daidzeina, daidzeina, e dihidrodaidzeina, para produzir equol.

7. 0 Lactococcus garvieae de acordo com a reivindicação 6, tal como depositado sob a identidade FERM BP-10036.

8. A utilização de uma composição contendo Lactococcus garvieae que inclua a título de uma sua componente essencial Lactococcus garvieae para a produção de equol, utilizando pelo menos um composto de daidzeina seleccionado de entre o conjunto constituído por glicósidos de daidzeina, daidzeina, e dihidrodaidzeina.

9. A utilização de acordo com a Reivindicação 8, em que o referido Lactococcus garvieae seja o Lactococcus 20-92 depositado sob a identidade FERM BP-10036.

10. A utilização de acordo com a Reivindicação 8, em que a composição contenha também farinha de soja ou leite de soja.

11. A utilização de acordo com a Reivindicação 8, em que a composição assuma a forma de uma bebida ou a de um produto lácteo. Lisboa, 18 de Junho de 2013.