PT1583541E - Compostos e métodos para o aumento da neurogénese - Google Patents

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DESCRIÇÃO "COMPOSTOS E MÉTODOS PARA O AUMENTO DA NEUROGÉNESE"

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade do documento U.S.S.N. 60/427912, apresentado a 20 de Novembro de 2002.

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção é dirigida a métodos in vitro e in vivo de modulação da neurogénese. Também são descritos novos agentes para o aumento de níveis intracelulares de cAMP, Ca2+ e para modulação da neurogénese.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Estudos realizados nos anos 1960 proporcionaram a primeira indicação de que novos neurónios eram produzidos no cérebro de mamífero adulto (Altman e Das, 1965, 1967) . Contudo, foram precisas mais três décadas e o desenvolvimento de refinados processos técnicos para refutar o dogma de que a neurogénese de mamífero estava restringida à embriogénese e ao período perinatal (para revisão ver Momma et al., 2000; Kuhn e Svendsen, 1999). As células estaminais neuronais (NSC) são uma fonte para novos neurónios no SNC de mamífero. As NSC estão localizadas dentro da zona ependimária e/ou subventricular (SVZ) revestindo 1 o ventrículo lateral (Doetsch et al., 1999; Johansson et al., 1999b) e na circunvolução denteada da formação hipocampal (Gage et al.r 1998). Estudos recentes revelam o potencial para várias localizações adicionais de NSC dentro do SNC adulto (Palmer et al.r 1999). A divisão assimétrica das NSC mantém o seu número de partida prpoduzindo simultaneamente uma população de células precursoras ou progenitoras dividindo-se rapidamente (Johansson et al., 1999b). As células progenitoras respondem a uma gama de estímulos que ditam a extensão da sua proliferação e seu destino em termos de diferenciação e posicionamento.

As NSC do sistema ventricular no adulto são equivalentes prováveis das células estaminais da zona ventricular embrionária revestindo o tubo neuronal. A descendência destas células embrionárias migra para longe, de modo a formar o SNC como neurónios diferenciados e da glia (Jacobson, 1991) . As NSC persistem na parede do ventrículo lateral (LVW) adulto, produzindo progenitores neuronais que migram pelo fluxo migratório rostral até ao bolbo olfactivo. Aí, elas diferenciam-se em células granulares e neurónios periglomerulares (Lois e Alvarez-Buylla, 1993) . No bolbo olfactivo ocorre morte neuronal substancial, criando uma necessidade para substituição continua de neurónios perdidos que é satisfeita pelos progenitores em migração derivados da LVW (Biebl et al., 2000). Adicionalmente, há indicações de que neurónios perdidos de outras regiões do cérebro podem ser substituídos por progenitores da LVW que se diferenciam no fenótipo dos neurónios perdidos com projecções neuronais apropriadas e sinapses com o tipo correcto de célula alvo (Snyder et al., 1997; Magavi et al., 2000). 2

Foram estabelecidas técnicas de cultivo in vitro para identificar os sinais externos envolvidos na regulação da proliferação e diferenciação de NSC (Johansson et al., 1999b; Johansson et al., 1999a). Os mitogénios EGF e FGF básico permitem a expansão de cultura celular de progenitores neuronais isolados da parede do ventrículo e do hipocampo (McKay, 1997; Johansson et al., 1999a). Estes progenitores em divisão permanecem num estado não diferenciado e crescem em clones maiores de células, conhecidas como neurosferas. Após supressão dos mitogénios e da adição de soro, os progenitores diferenciam-se em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos que são as três linhas celulares do cérebro (Doetsch et al., 1999; Johansson et al., 1999b). Podem ser adicionados factores de crescimento específicos, de modo a alterar as proporções de cada tipo de célula formado. Por exemplo, o CNTF actua para dirigir os progenitores neuronais para um destino astrocítico (Johe et al., 1996; Rajan e McKay, 1998). A hormona tireoideia, triiodotironina (T3), promove a diferenciação oligodendrocítica (Johe et al., 1996), enquanto o PDGF melhora a diferenciação neuronal por células progenitoras (Johe et al., 1996; William et al., 1997). Recentemente, mostrou-se que, de facto, neurónios adultos regenerados são integrados dentro do circuito cerebral existente e contribuem para melhorar défices neurológicos (Nakatomi et al., 2002). Interessantemente, observações também mostraram que a neurogénese está a ocorrer não apenas ao nível do bolbo olfactivo e hipocampo. A esse respeito, foi sugerido por Zhao et al. que este processo também pode ocorrer na substantia nigra de murganho adulto, abrindo um novo campo de investigação para o tratamento da doença de Parkinson (Zhao et al., 2003) . 3 A capacidade para expandir progenitores neuronais e manipular o seu destino celular tem enormes implicações para terapias de transplante para doenças neurológicas, onde tipos de células específicos são perdidos. A Doença de Parkinson (PD), por exemplo, é caracterizada por degenerescência de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra. Tratamentos de transplantação anteriores para doentes de PD utilizaram tecido fetal retirado do mesencéfalo ventral, num momento em que os neurónios dopaminérgicos da substantia nigra estão a sofrer diferenciação terminal (Herman e Abrous, 1994) . Estas células foram enxertadas sobre o estriado, onde as mesmas formam contactos sinápticos com neurónios estriários de hospedeiro, o seu alvo sináptico normal. Isto repõe a regeneração e libertação de dopamina para níveis normais, com benefícios funcionais significativos para o doente (Herman e Abrous, 1994) (para revisão, ver Bjorklund e Lindvall, 2000). Contudo, o enxerto de tecido fetal é limitado por considerações éticas e uma ausência de tecido dador. A expansão e manipulação de NSC adultas podem potencialmente proporcionar uma gama de células bem caracterizadas para estratégias baseadas em transplante para doença neurodegenerativa, tal como PD. Para este objectivo, a identificação de factores e vias que governam a proliferação e diferenciação de tipos de células neuronais é fundamentalmente importante.

Estudos mostraram que infusão intraventricular tanto de EGF como FGF básico induz proliferação na população celular da parede do ventrículo adulto. No caso de EGF, foi observada extensa migração de progenitores para dentro de parênquima estriário vizinho (Graig et al., 1996; Kuhn et al., 1997). O EGF aumenta diferenciação em linhagens gliais e reduz a geração de neurónios (Kuhn et al., 1997). Adicionalmente, infusão 4 intraventricular de BDNF em ratos adultos aumenta o número de neurónios produzidos de novo no bolbo olfactivo e fluxo migratório rostral e em estruturas parenquimatosas, incluindo o estriado, septo, tálamo e hipotálamo (Pencea et al., 2001). Deste modo, vários estudos mostraram que a proliferação de progenitores dentro da SVZ da lvw pode ser estimulada e que a sua linhagem pode ser guiada para destinos neuronais ou gliais. Todavia, o número de factores conhecidos por afectarem a neurogénese in vivo é pequeno e os seus efeitos são adversos ou limitados. Consequentemente, é necessário identificar outros factores que podem selectivamente estimular actividade celular estaminal neuronal, proliferação de progenitores neuronais e efectuar diferenciação no fenótipo alvo. Tais factores podem ser utilizados para estimulação in vivo de neurogénese e o cultivo de células para terapia de transplantação. O Ca2+ e o cAMP representam importantes segundos mensageiros intracelulares. Ambos podem ser activados após vários estimulos externos e mostrou-se que são activados por vários receptores ligados a proteína G (GPCR) (Neves et al., 2002). A cascata de cAMP desempenha um papel na sobrevivência e plasticidade neuronal. As células neuroepiteliais têm sistemas de mobilização de Ca2+ que podem ser activados, principalmente, pelo sistema receptor muscarínico durante o desenvolvimento cerebral.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma forma de realização da invenção é dirigida a, pelo menos um agente que eleva níveis intracelulares de cAMP em tecido neuronal, em que o referido agente é seleccionado do grupo consistindo em Tirocalcitonina, Calcitonina, Péptido-1 do 5

Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 e Exendina-4, e análogos de Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 ou Exendina-4, em que o referido análogo de Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 ou Exendina-4 interage com um receptor ligado a proteína G (GPCR) que é o receptor de Péptido-1 do Tipo Glucagom e uma sua combinação, ou um análogo de cAMP, em que o referido análogo de cAMP é seleccionado do grupo consistindo em 8-gCPT-2-O-Me-cAMP, 8-Br-cAMP, Rp-cAMPS, 8-Cl-cAMP, Dibutiril cAMP, pCPT-cAMP e monofosfato de N6-monobutiriladenosina 3',5'-cíclico, para utilização no aumento de neurogénese em tecido neuronal de um doente exibindo um distúrbio do sistema nervoso central, seleccionado do grupo consistindo em distúrbios neurodegenerativos, distúrbios isquémicos, traumas neurológicos e distúrbios de aprendizagem e memória, em que o agente aumenta a neurogénese no doente aumentando, desse modo, a neurogénese no tecido neuronal do doente e em que o aumento de neurogénese é aumento da proliferação, diferenciação, migração ou sobrevivência de uma célula estaminal neuronal adulta no referido tecido neuronal. Nas utilizações, um ou mais agentes de modulação de neurogénese é administrado ao doente. 0 agente de modulação de neurogénese da invenção é seleccionado do grupo consistindo em Tirocalcitonina, Calcitonina, Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 e Exendina-4, e análogos destes e uma sua combinação, ou um análogo de cAMP, em que o referido análogo de cAMP é seleccionado do grupo consistindo em 8-pCPT-2-0-Me-cAMP, 8-Br-cAMP, Rp-cAMPS, 8-Cl-cAMP, Dibutiril cAMP, pCPT-cAMP e monofosfato de N6-monobutiriladenosina 3',5'-cíclico. Esta divulgação também mostra que um inibidor de fosfodiesterase específica de cAMP, um activador da adenilato ciclase e um activador da ribosilação de ADP de uma proteína G estimuladora 6 podem ser utilizados como agentes de modulação de neurogénese. Estes agentes de modulação de neurogénese são listados na Descrição Detalhada. Os distúrbios que podem ser tratados pelos métodos da invenção também são listados na secção de descrição detalhada e incluem, pelo menos, doença de Parkinson e distúrbios Parkinsonianos, doença de Huntington, doença de Alzheimer, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, sindrome de Shy-Drager, paralisia supranuclear progressiva, doença de corpo de Lewy, isquemia espinal, acidente vascular cerebral isquémico, enfarte cerebral, lesão de espinha dorsal, e lesão cerebral e de espinha dorsal relacionada com cancro, demência multi-enfarte e demência geriátrica. 0 nível de administração pode ser, pelo menos, 0,001 ng/kg/dia, pelo menos, 0,01 ng/kg/dia, 0,1 ng/kg/dia, pelo menos, 1 ng/kg/dia, pelo menos, 5 mg/kg/dia, pelo menos, 10 mg/kg/dia ou, pelo menos, 50 mg/kg/dia. Numa forma de realização preferida, a administração eleva os níveis intracelulares de cAMP, pelo menos, 20% acima do normal. A administração pode conduzir a concentrações tecidulares do agente de cerca de 0,0001 nM a 50 nM. A administração pode ser sistémica ou directa dentro do SNC de um doente. Outras vias de administração incluem administração oral, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intracerebroventricular, intraparenquimal, intratecal, intracraniana, bucal, mucosal, nasal e rectal ou administração por um sistema de distribuição lipossomal.

Em utilizações alternativas aqui descritas, o agente de modulação de neurogénese eleva níveis intracelulares de Ca2+ numa célula de um tecido neuronal do doente. Em tais utilizações, o 7 agente de modulação de neurogénese pode ser Antagonista de Receptor de Amilina/Calcitonina (8-32), ANP (humano), CGRP (8-37), Endotelina-1 humana, Bovina, Canina, de Murganho, Porcina, de Rato), g-MSH, Factor de Libertação da Hormona do Crescimento, MGOP 27, PACAP-38, Sarafotoxina S6a, Sarafotoxina S6b, Sarafotoxina S6c, Septida, Somatostatina-28, toxina da Cólera de Vibrio Cholerae, Angiotensina II (sintética humana), [D-Pen2-5]-Encefalina, Adrenomedulina, Endotelina-1 (humana, Porcina) e seus equivalentes funcionais.

Outra forma de realização da invenção é dirigida a um método in vitro de aumento dos níveis de cAMP numa célula estaminal neuronal adulta, através da administração de uma quantidade eficaz de um agente seleccionado do grupo consistindo em Tirocalcitonina, Calcitonina, Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 e Exendina-4 e uma sua combinação, à célula. Nesta divulgação, administrar um agente a uma célula compreende a colocação em contacto de uma célula com um agente. Outros agentes de elevação de cAMP aqui descritos podem ser hormona Adrenocorticotrópica, Endotelina-1 (humana, porcina), MECA, HE-NECA, [Cys3,6, Tyr8, Pro9]-Substância P, [D-ArgO Hyp3, Igl5, D-lgl7, 0ic8]-Bradicinina, Adrenomedulina (humana), [Des-Arg9, Leu8]-Bradicinina, [Des-Arg9]-Bradicinina, [D-Pen2-5]-Encefalina, [D-pGlul, D-Phe2, D-Trp3,6]-LH-RH, Adrenomedulina (26-52), Adrenomedulina (22-52), α-Neo-Endorfina, b-MSH, a-MSH, CART (61-102), Colecistocinina Octapéptido [CCK(26-33)], DTLET, DDAVP, Eledoisina, g-MSH, a-Neurocinina, PACAP-38, Beta-ANP, Galanina (1-13)-Espantida-Amida, M40, [Sar9, Met (0) 11]-Substância P, Sarafotoxina S6a, Sarafotoxina S6b, Sarafotoxina S6c, [Nle8,18, Tyr34]-Hormona Paratiróide (1-34) Amida (Humana), ACTH (Humana), Urotensina II (Globy), Péptido Intestinal Vasoactivo (Humano, Porcino, Rato),

Nor-Binaltorfimina, Proteína Relacionada com Cutia (87-132)-Amida (Humana) e uma combinação destes. A célula pode estar num doente, caso em que a utilização é para estimulação de cAMP intracelular numa célula de um doente. 0 método de administração e os níveis de administração podem ser qualquer método ou nível discutido para agentes de modulação de neurogénese nesta divulgação.

Outra forma de realização da invenção é dirigida a um método para o aumento da neurogénese in vitro. No método, é cultivada uma população de células neuronais (compreendendo células estaminais neuronais adultas). Depois, pelo menos, um agente de modulação de neurogénese é administrado à célula. A administração é repetida, se necessário, até ser alcançado um nível desejado de neurogénese. Em tais métodos, o aumento de neurogénese é o aumento da proliferação, diferenciação, migração ou sobrevivência das referidas células estaminais neuronais adultas e o agente é seleccionado do grupo consistindo em Tirocalcitonina, Calcitonina, Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 e Exendina-4, e análogos de Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 ou Exendina-4, em que o referido análogo de Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 ou Exendina-4 interage com um receptor ligado a proteína G (GPCR) que é o receptor de Péptido-1 do Tipo Glucagom e uma sua combinação, ou um análogo de cAMP, em que o referido análogo de cAMP é seleccionado do grupo consistindo em 8-pCPT-2-0-Me-cAMP, 8-Br-cAMP, Rp-cAMPS, 8-Cl-cAMP, Dibutiril CAMP, pCPT-cAMP e monofosfato de N6-monobutiriladenosina 3',5'-cíclico. A célula estaminal neuronal adulta pode ser cultivada a partir de tecidos, tais como córtex, tubérculo olfactivo, retina, septo, eminência ganglionar lateral, eminência ganglionar medial, 9 amígdala, hipocampo, tálamo, hipotálamo, mesencéfalo ventral e dorsal, tronco cerebral, cerebelo, espinha dorsal. A divulgação também mostra um papel para receptores ligados a proteína G (GPCR) e seus ligandos em biologia de células estaminais in vitro e in vivo. A invenção é baseada nos presentes dados de expressão (dados de PCR e bibliotecas de ADNc) e dados de proliferação in vitro, que mostram que a modulação de níveis intracelulares de cAMP ou Ca2+ através de diversos GPCR pode ser utilizada para influenciar a proliferação, migração, diferenciação ou sobrevivência de células estaminais neuronais adultas (aNSC) e sua descendência in vitro, assim como in situ, no cérebro intacto. Estes dados também indicam CREB como uma ligação a jusante entre GPCR e transcrição.

Em qualquer caso, a célula, tecido neuronal ou doente pode ser qualquer mamífero adulto, tais como rato, murganhos, gato, cão, cavalo, porco, cabra, vaca e, em particular, humano.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIGURA 1: Fosforilação de CREB após tratamento de PACAP e toxina da cólera ocorre num modo reproduzível em células estaminais neuronais adultas de murganho e humanas, como mostrado por transferência de Western. 0 painel superior mostra regulação positiva de fosforilação de CREB em células estaminais neuronais adultas de murganho e humanas, após tratamento de pacap. 0 painel inferior mostra regulação positiva de fosforilação de CREB em células estaminais neuronais adultas de murganho e humanas, após tratamento de toxina da cólera. 10

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os tratamentos tradicionais de doenças e lesões neuronais centraram-se na prevenção de morte neuronal (i. e., apoptose ou necrose) . Em contraste, esta invenção é dirigida a novos tratamentos terapêuticos para doenças e lesões neurológicas baseados na indução de neurogénese, em particular, proliferação de células estaminais neuronais adultas. De acordo com a invenção, foram identificados agentes de modulação de neurogénese chave, de modo a induzir proliferação e/ou diferenciação em células estaminais neuronais adultas. Tais agentes de modulação de neurogénese são úteis para efectuarem a neurogénese para o tratamento de doenças e lesões neurológicas. Como aqui mostrado, níveis aumentados de cAMP e/ou Ca2+ deduzem a proliferação de células estaminais neuronais adultas. Em alguns casos, esta indução segue a activação de receptores ligados a proteína G (GPCR). Os dados aqui divulgados indicam que o aumento dos níveis intracelulares de cAMP e/ou Ca2+ através de diversos compostos (e. g., ligandos de GPCR) pode ser utilizado para aumentar a proliferação de células estaminais neuronais adultas. Além disso, os dados indicam que a descendência das células induzidas para proliferarem por todos os compostos analisados, também retém todo o seu potencial neurogénico. Dados de expressão para os GPCR que se ligam a estes ligandos corroboram a importância destes dois segundos mensageiros na promoção de neurogénese. A "Neurogénese" é aqui definida como proliferação, diferenciação, migração ou sobrevivência de uma célula neuronal in vivo ou in vitro. Na presente invenção, a célula neuronal é 11 uma célula estaminal neuronal adulta. A neurogénese também se refere a um aumento líquido no número de células ou um aumento líquido na sobrevivência celular. Como aqui utilizado, "NSC" incluiria, pelo menos, todas as células estaminais cerebrais, todas as células progenitoras cerebrais e todas as células precursoras cerebrais.

Um agente de modulação de neurogénese é definido como um agente ou reagente que promove a neurogénese. É divulgado nesta invenção um número de novos agentes de modulação de neurogénese.

Nesta divulgação, os termos doença ou distúrbio deverão ter o mesmo significado.

Todos os métodos da invenção podem ser utilizados em mamíferos e células de mamífero. Numa forma de realização preferida, todos os métodos da invenção podem ser utilizados em humanos ou células humanas.

Tecido neuronal inclui, pelo menos, todos os tecidos do cérebro e sistema nervoso central.

Os neurobiólogos utilizaram diversos termos alternadamente para descrever as células não diferenciadas do SNC. Termos, tais como "célula estaminal", "célula precursora" e "célula progenitora", são geralmente utilizados na literatura científica. Contudo, existem diferentes tipos de células não diferenciadas, com características e destinos diferentes. A capacidade de uma célula se dividir sem limite e produzir células filhas que terminalmente se diferenciam em neurónios e da glia são características de célula estaminal. Deste modo, o termo "célula estaminal" (e. g., célula estaminal neuronal), 12 como aqui utilizado, refere-se a uma célula não diferenciada que pode ser induzida a proliferar, utilizando os métodos da presente invenção. A célula estaminal é capaz de auto-manutenção, significando que com cada divisão celular, uma célula filha também será uma célula estaminal. A descendência de célula não estaminal de uma célula estaminal é designada células progenitoras. As células progenitoras produzidas de uma única célula estaminal multipotente são capazes de se diferenciarem em neurónios, astrócitos (tipo I e tipo II) e oligodendrócitos. Por este motivo, a célula estaminal é multipotente, em virtude da sua descendência ter múltiplas vias diferenciativas. 0 termo "célula progenitora" (e. g., célula progenitora neuronal), como aqui utilizado, refere-se a uma célula não diferenciada derivada de uma célula estaminal e não é, por si só, uma célula estaminal. Algumas células progenitoras podem produzir descendência que é capaz de se diferenciar em mais de um tipo de célula. Por exemplo, uma célula 0-2A é uma célula progenitora glial que dá origem a oligodendrócitos e astrócitos de tipo II e, deste modo, poderia ser designada uma célula progenitora bipotencial. Uma caracteristica distintiva de uma célula progenitora é que, ao contrário de uma célula estaminal, tem capacidade proliferativa limitada e, deste modo, não exibe auto-manutenção. Está comprometida a uma particular via de diferenciação e irá, sob condições apropriadas, eventualmente diferenciar-se em glia ou neurónios. 0 termo "células precursoras", como aqui utilizado, refere-se à descendência de células estaminais e, deste modo, inclui células progenitoras e células estaminais filhas. 13 1. Agentes de modulação de neurogénese São aqui descritos agentes de modulação de neurogénese que modulam niveis intracelulares de cAMP e/ou Ca2+. Como aqui utilizado, o agente de modulação de neurogénese também inclui qualquer substância que seja quimicamente e biologicamente capaz de aumentar cLAMP (e. g., através do aumento da síntese ou diminuição da desagregação) e/ou Ca2+ (e. g., através do aumento do influxo ou diminuição do efluxo) . Estes agentes de modulação de neurogénese incluem péptidos, proteínas, proteínas de fusão, compostos químicos e moléculas pequenas, e. g., Tirocalcitonina, Calcitonina, Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 e Exendina-4 e seus análogos e uma sua combinação, ou um análogo de cAMP, em que o referido análogo de cAMP é seleccionado do grupo consistindo em 9-pCPT-2-0-Me-cAMP, 8-Br-cAMP, Rp-cAMPS, 8-Cl-cAMP, Dibutiril cAMP, pCPT-cAMP, e monofosfato de N6-monobutiriladenosina 35'-cíclico, inibidores de PDE (e. g., PDE específicos de cAMP), activadores de adenilato ciclase e activadores de ribosilação de ADP de proteínas G estimuladoras são exemplos adicionais de agentes de modulação de neurogénese aqui descritos. São análogos de cAMP: 8-pCPT-2-0-Me-cAMP (e. g., monofosfato de 8-(4-clorofeniltio)-2'-O-metiladenosina 3',5'-cíclico); 8-Br-cAMP (e. g., monofosfato de 8-bromoadenosina 3',5'-cíclico); Rp-cAMPS (e. g., monofosforotioato de Rp-adenosina 3',5'-cíclico); 8-Cl-cAMP (e. g., 8-cloroadenosina 3',5'-cíclico-monofosfato); Dibutiril cAMP (e. g., monofosfato de N6,2'-O-dibutiriladenosina 3', 5'-cíclico); pCPT-cAMP (e. g., monofosfato de 8-(4-clorofeniltio)adenosina 3',5'-cíclico); e monofosfato de N6-monobutiriladenosina 3',5'-cíclico. 14

Inibidores de PDE exemplificativos incluem: teofilina (e. g., 3,7-di-hidro-l,3-dimetil-lH-purina-2, 6-diona; 2,6-di- hidroxi-1,3-dimetilpurina; 1,3-dimetilxantina), cafeína (e. q., 1,3,7-trimetilxantina); quercetina di-hidrato (e. g., 2-(3,4-di-hidroxifenil)-3,5,7-tri-hidroxi-4H-l-benzopiran-4-ona di-hidrato; 3,3',4',5,7-penta-hidroxiflavona di-hidrato); rolipram (e. g., 4-[3-(ciclopentiloxi)-4-metoxifenil]-2- pirrolidinona); 4-(3-butoxi-4-metoxibenzil)imidazolidin-2-ona; propentofilina (e. g., 3, 7-di-hidro-3-metil-l-(5-oxo-hexil)-7- propil-lH-purina-2, β-diona; 3-metil-l-(5-oxo-hexil)-7- propilxantina); 3-Isobutil-l-metilxantina (e. g., 3,7-di-hidro- l-metil-3-(2-metilpropil)-lH-purina-2,6-diona; IBMX; 3-isobutil-l-metil-2,6(1H,3H)-purinadiona; l-metil-3-isobutilxantina); 8-

Metoximetil-3-isobutil-l-metilxantina (e. g.r 8-metoximetil-IBMX); enoximona (e. g.r 1,3-di-hidro-4-metil-5-[4-metiltiobenzoil]-2H-imidazol-2-ona); cloridrato de papaverina (e. g., cloridrato de 6,7-Dimetoxi 1-veratrilisoquinolina).

Outros inibidores de PDE exemplificativos incluem: cloreto de calmidazólio (e. g., cloreto de 1-[bis(4-clorofenil)metil]-3-[2,4-dicloro-b-(2,4-diclorobenziloxi)fenetil] imidazólio; cloreto de 1-[bis(4-clorofenil)metil]-3-[2-(2,4-diclorofenil)-2-(2,4-diclorobenziloxi)etil]-lH-imidazólio); SKF 94836 (e. g., N-ciano-N'-metil-N"-[4-(1,4,5,6-tetra-hidro-4-metil-6-oxo-3-piridazinil)fenil]guanidina; Siguazodano); fragmento 22-36 de neuropéptido Y (e. g., Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-lle-

Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr; aminofilina hidrato (e. g., 3,7-Di-hidro- 1,3-dimetil-lH-purina-2,6-diona, composto com 1,2-etanodiamina (2:1)(Teofilina)2; etilenodiamina; complexo de teofilina hemietilenodiamina); buteína (e. g., 1-(2,4-di-hidroxifenil)-3- (3, 4-di-hidroxifenil)-2-propen-l-ona; 2',3,4,4'-tetra- hidroxicalcona); cloridrato de papaverina (e. g., cloridrato de 15 6,7-dimetoxi-l-veratrilisoquinolina); cloridrato de etazolato (e. g., cloridrato de éster etílico de ácido l-etil-4-[(1-metiletilideno)hidrazino] lH-pirazolo [3, 4 —3o]piridina-5-carboxílico); dicloridrato de trifluoperazina (e. g., dicloridrato de 10-[3-(4-metil-l-piperazinil)propil]-2- trifluorometil-fenotiazina; dicloridrato de trifluoroperazina); e milrinona (e. g., 1,6-Di-hidro-2-metil-6-oxo-(3,4'- bipiridina)-5-carbonitrilo).

Estimuladores exemplificativos de ribosilação de adp incluem: Toxina da tosse convulsa (e. g., Pertussigénio de

Borderella pertussis; factor de sensibilização de Histamina; IAP; Proteína de Activação de Ilhéu; e toxina da Cólera (e. g., Colergénio de vibrio cholera, enterotoxina da Cólera).

Activadores exemplificativos da adenilato ciclase incluem: forscolina.

Agentes que, nas experiências aqui detalhadas, se mostrou aumentarem níveis intracelulares de cAMP incluem

Nome

Sequência peptídica SEQ ID N2

Nor-binaltorfimina Nd SEQ ID N° 1 PACAP-3 8 Híâ-Ser-Asp-Gly-lle-Phe-Thr-Aap-Sôr-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-

Lys-GlfKMet-Ala-VaJ-LysLye-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-

Lys-Arg-Tyr-Ly5-Gln-Arff-Va|-LyS-Asn4.ys«NH2 SEQ ID N° 2 16 (continuação) Nome Sequência peptídica SEQ ID Endotelina 1, humana, porcina Cy3-Ser-Cys-Sef-Ser-í.ewMíi'Asp-Ly5’Glu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-His-Leu-Asp-llello-T rp SEQ ID N° 3 Hormona Adrenocorticotrópica Hormona de Estimulação de Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly- Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro SEQ ID a-Melanócito Ac-Ser-1 yr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 N° 4 Hormona de estimulação de Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly SEQ ID g-melanócito N° 5 a-Neurocinina His-Lys-Thr-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 SEQ ID N° 6 Tirocalcitonina de salmão Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr^ys-Val-Lou^âly^.ys-teu-Ser-Gln-Gli> Leu-Ηίε Lys-Lau-GIn-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-AsrvThP Gfy-Ser-Gly- Thr-Pro-NH2 SEQ ID N° 7 Hormona de estimulação de b-melanócito (beta-MSH), humana Ala-Glu· Lys-Lys-Asp-Ol u-Giy-Pro-T yr-Arg-Met-Glu-His-Pha Arg- T rp-Gly-Ser-ProPro-Lys-Asp SEQ ID N° 8 MECA não péptido HE-NECA, 2-hexinil-5-n- não péptido etilcarboxamido [Cys3,6, Tyr8, Pro9]- Arg-Pro-Cys-Pro-Gln-Cys-Phe-Tyr-Pro-Leu-Met SEQ ID Substância P (agonista N° 9 selectivo de Neurocinina-1) [Des-Arg9, Leu8]- Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu SEQ ID Bradicinina (antagonista N° 10 Bl) [Des-Arg9]-Bradicinina Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Sar-Pro-Phe SEQ ID (antagonista Bl) N° 11 17 (continuação)

Nome Sequência peptídica SEQ ID Ns [D-Pen2-5]-Encefalina Tyr-D-Pen-Gly-Phe-D-Pen SEQ ID (Potente agonista delta) N° 12 [D-pGlul, D-Phe2, D-pGlu-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 SEQ ID D-Trp3,6]-LH-RH N° 13 SEQ ID N° 14 [Nle8, 18, Tyr34]-Hormona Paratiróide (1-34) Amida (Humana) Ser-Val-Ser-Glu-/re-GlrM.€ii-Nle-HiS"Asfi-Leu-Gly-Lys-H(s-Leu-Asn-Ser-Nte-Glu-Arg-VaNGIu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Lêu-Gln-Asp-VaPHtò-Asn-T yr SEQ ID N° 15 ACTH (Humana) Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe^rp-Tfp-Gly-Lye-Pro-Vel-Gly-Lys* Lys-ArB-Arg-Pro-Val-LyB-Val-T yr-PrO“A®n-Gly-A)a*Glu-Asp-Glu- Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe SEQ ID ?—1 o Adrenomedulina (Humana) Tyr-Arg-Gln-S«r-Met-Asn-AsrvPhft-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser- Pha-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys^Thr-Val-GIn-Lys-Leu- Ala-Hls-Gln-Jle-Tyr-G(n-Phe-Thr-Afip-Lyâ-Aíp4.ys-Asp-ASíi- Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-lle-Ser-Pro^3ln-Gly-Tyr-NH2 SEQ ID N° 17 Adrenomedulina (22-52) (Humana) Thr-Val-GIn-Lys-Leu-Ala-His-GIn-lle-Tyr-GIn-Phe-Thr-Asp* Lys- Asp-Lys-Asp-Aan-Val-Ala-PrQArp-Ser-Lys-lle-Ser-Pro-Gln-Gly· Tyr-NH2 Adrenomedulina (26-52) (Humana) (antagonista de Leu-Ala-Hls-Glr>-lle-Tyr-Gln’Phe-Thr-Asp'Lys-Aap-Ly3-Asp“ Asn- Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-lie-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH2 SEQ ID N° 18 ADM) 18 (continuação) Nome Sequência peptídica SEQ ID N2 Alfa-Neo-Endorfina TyrG ly-G ly-Ph e-Leu-A rg Ays-T yr- P ro-Lys SEQ ID (Porcina) Ser-Lgu-Are-Afg-Ser^er-Cya-Ptie-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Jle- Gly-Ale-GIn-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-PliB-Arg-Tyr \—1 o Beta-ANP (Humana) SEQ ID N° 20 SEQ ID N° 21 Calcitonina (Humana) Cys-Gly-Asn-Leu-Êer-Thr-Cys-Met-Lflu-Gly-Thf-Tyr-Thr- Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-ThNphe-Prc>‘Gln-Thr-Ala-!le' Gly-Val-Gly-A!a-Prg SEQ ID N° 22 CART (61-102) (Humana, Lys-Tyr-Gly-GIn-VakPro-Mât-Cys-Asp-Ala-Gly-Glu-GIn-Cy: Ala-Val-Arg-l-yGGIy-AIa-Arg-lle-Gly-Lyí-Leii'Cys-AS[>-Cys· Rato) Pro-Arg-Gly-Thr-Sôf-Cys^Asn-Ser.PheLeu-Leu-LysCys- Leu Colecistocinina Octapéptido Asp-T yr-Met-Gly-T rp-Met-Asp-Phe-NH2 SEQ ID [CCK(26-33)] (Não sulfatado) N° 23 DDAVP (melhora aprendizagem Mpr-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2 SEQ ID e memória humanas) N° 24 DTLET Tyr-D-Thr-Gly-Phe-Leu-Thr SEQ ID N° 25 Eledoisina Glu-ProSer-Lys-Asp-Ala-Phe-lle-Gly-Leu-Met SEQ ID N° 26 SEQ ID N° 27

Galanina (1-13)-Espantida-Amida, M40

Qly-Trp-Thr-L.GU-Aan-SenAla-Qlif-Tyr-Leo-Leu-Gly-PrchPrg-Pro Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-NH2 19 (continuação)

Nome Sequência peptídica SEQ ID N2 SEQ ID N° 28 Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37) (Humano) Hls-Ala-GlirGly-Thr-Phe-ThrSer-Asp-VatSer-Ser-Tyr-Leij-6lu- GlyGln-AÍa-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ata-T rp-Leu-Val-Lys· Gly-Arg- Gly SEQ ID N° 29 Exendina-3 His-Ser-Aíp-Gly-Thr-Phe-Thr-Sef-Asp-LauSer-Lys-GIn-Mei-G|u- ôiu-Glu-Aía-VaiArg-Leu-Phe-lle-Glu-T rp-Leu-bys-Aan-Cfy-Gly. Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pfo-Pro-Pro-Ser-NH2 SEQ ID O u> o Exendina-4 Hfis-Gly-C3lu-Gly-Thr-Píie-Thr-Ser*Asp-Ley-Ser-l-y8*Gln-Mel-Glu.Giu-Glu-Ate-Vel-Arg-Leu-PhMe-Glu-Trp-Uuá.ys-Asn-Gly-Gly- Pro-Ser»Ser-Gly-Ala-Prti-Pro»PfO-Ser-NH2 [Sar9, Met(0)11]-Substância Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Sar-Leu-Met(02)-NH2 SEQ ID P (Agonista de receptor N° 31 NK-1 altamente selectivo) SEQ ID N° 32 Sarafotoxina S6a (cardiotoxina isotoxina) 0}<3-5€η0ν5-Ι^3-Αίρ-Μ6Ι-Τίν-Α5ρ-1.)«-άΙυ-0ν3-Ι-βυ-Α8η-Phe-Cys- Hlí-GIn-Asp-VeMIe-Trp Sarafotoxina S6b (potente actividade constritora coronária) Cys-Ser-Cya-tyí-Asp-Met-Thr-Asp-LyB-G/u-Cys-Lôu-Tyr' Phe-Cys- His-GIn-Asp-Vai-lte-Trp SEQ ID N° 33 Sarafotoxina S6c (causa forte vasoconstrição de Cys-Thr-Cys-Asn-Asp-Met-Thr-Asp-Glu-Glu-Cys-Lôu-Asn-Phe^Cys- Hifi-Gln-Asp-VaHIe-Trp SEQ ID N° 34 vasos coronários) 20 (continuação)

Nome Sequência peptídica SEQ ID

Ns

Urotensina II (Globy) Ala-GlyThr.Ala-Asp-Cy3-Phe.Trp-Lys-Tyr-CyÃ-Val SEQ ID

Wg-Ser-Aíp-Ala-Val-Phe-Thf-Asp-Asii-Tyr-Thr-Ars-Leu-Afg- No 35

Lys- Glr>Mét-A)a-Va/-Lys-l.ys-Tyr-Leu-A3n-Ser-lle-L«íu-Asn- NH2 SEQ ID N° 36 SEQ ID N° 37 Péptido Intestinal Vasoactivo (Humano,

Porcino, Rato) [D-ArgO, Hyp3, Igl5, D-Igl7, 01c8]-Bradicinina (Antagonista B1/B2) D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Igl-Ser-D-igl-Oic-Arg SEQ ID N° 38

Thr.pr<sLau-Ser-Ala-Pro-Cys-ValnAla-Thr-Arg-A6n-$er-CyE-Lys- Pro-Pro-Ala-Pro-Ala-Cys-Cys-Asp-Pro-Cys-Ala-Sen Cys Gln-Cys- Arg-Phe-Pne-Arg-Ser-Ale-CyvSer-Cys-Arg-Val-Leu-SenLeu-Asn- Cys-NH2

Proteína de Sinalização de Cutia (ASP)(87-132) Amida (Humana) SEQ ID N° 39

Proteína Relacionada com Cutia (87-132)-Amida (Humana)

Arg-Cys-VaPArg-LauHis-Glu-SerCyB-Leu-Gly-Gin- Gln-Val'Pro-ÇysCys-Asp-Pro*Cys-Al8-Thf-Cys-Tyr-Cys-Arg· Ph«> Phe-Asn-Ala-Phe-Cys-Tyr.Cys-Arg.Lya-Leu-Gly-Thp Ala-Môl-Asrv Pro-Cys-Ser-Arg-Thr-NH2

Outros agentes que podem aumentar 0 cAMP intracelular incluem metanossulfonato de fenoldopam, cloridrato de dopamina, cloridrato de apomorfina, fosfato de histamina, ACTH, succinato de sumatriptano, trometamina de prostaglandina F2alfa, prostaglandina El, prostaglandina 12, trometamina de iloprost, prostaglandina E2, misoprostol, sulprostona, sal dissódico de ATP, pindolol, secretina, cisaprida, metanossulfonato de 21 fentolamina, nemonaprida, clozapina, sertindole, olanzapina, risperidona, sulpirida, levossulpirida, Cloropromazina, cloropromazina, cloridrato, haloperidol, domperidona, dicloridrato/decanoato/enantato de flufenazina, dicloridrato/decanoato de flufenazina, dicloridrato de flufenazina, atp (adenosina trifosfato), sal dissódico de atp (adenosina trifosfato), cetanserina, tártaro de cetanserina, metergolina, pindolol, cloridrato de prazosina, Ioimbina, cloridrato de ioimbina, teofilina, cafeína, teobromina, aminofilina, amrinona, milrinona, naltrexona, naloxona, albuterol, levalbuterol, metaproterenol, terbutalina, pirbuterol, salmeterol, bitolterol, colterol, dobutamina, 8L-arginina-vasopressina, 8-lisina-vasopressina, desmopressina, metildopa, DOPA, rauvolscina, prazosina, fentolamina, quinidina, dapiprazole, loxiglumida, gonadotropina coriónica, folitropina alfa, folitropina beta (FSH), menotropina (LH, FSH), oxitocina, antagonistas de somatostatina, RMP-7, inibidores de ACE (como captopril), misoprostol, latanoprost, PGEl, alprostadil, somatropina (GH, PRL) secretagogos (MK-677), tabimorelina (NN-703, pamorelina, NNC-26-0323, TRH, cosintropina, corticorelina, glucagom, enteroglucagom, PTH 1-34, cocaína, anfetamina, dextroanfetamina, metanfetamina, fenmetrazina, metilfenidato, dietilpropiona, metirosina, reserpina, minoxidil, sulfasalazina, levamisole e talidomida, fluoreto.

Agentes exemplificativos para o aumento de níveis intracelulares de Ca2+ incluem os agentes sumariados na tabela abaixo: 22

Nome

Sequência peptídica PACAP-3 8 His-Ser*A3P-<3V-|,B‘phe-Thr^sp-Ser-Tyi-Ser-Arg-Tyr. Arg^Lyâ-Gln-Met-Ala-Val-LyG-Lva-Tyr-leu-Ala-Ala-Val- Len-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val'Lys-Asn-Ly3- NH2 SEQ ID N° 1

Toxina da cólera de Vibrio Cholerae Endotelina 1, humana, porcina Angiotensina II, sintética humana Hormona de estimulação de g-melanócito Péptido Natriurético Atrial, humano [D-Pen2-5]-Encefalina (Potente agonista delta) não péptido

Cys-S6r-Çy*-S®r Sor-Lçu-Mel-Asp-Lys-Glu-Cys-Val Tyr-Phe-Cys- His-Leu-Asp-Ile-He-Trp

Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe

Tyr-D-Pen-Gly-Phe-D-Pen Tyr-AfB-G/n-Ser-Met-Asn-Asn-Phs-Glri-Gly-leu-Arg-Ser-Phe-Gly- Cys-Arg-Phe-Gly-Thr^ys-Tfr-Val-Glri-LyS'Leu-Ala-Hi8-Gln-lle- Tyr-Gln-Phe-Thr-AapU.ys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lya-lle-Ser* ProOln-Gly-Tyr-NH2 SEQ ID N° 2 SEQ ID N° 40 SEQ ID N° 5 SEQ ID N° 41 SEQ ID N° 42

Adrenomedulina (Humana)

Antagonista de Receptor de Amilina/Calcitonina(8-32) (Salmão) CGRP (8-37) (Humano) (Antagonista selectivo para receptor CGRP e agonista para receptor de

Val-Leu*Gly-LyB-Leu-Ser*G)ii-<3lu-Leu-H(s-Lys-Lew-Gln-Tfir-Tyr- PrO-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Qy Thr-Pro

Va)-Thr-Hi3-Arg-Leu-A)a-Gly4.eu-Leg-Ser-Arg-$gr-Gly-Gly-Val- Val-Lys-Asn-Asrí-Phe-Val-Pro-Thr-Asn' ValOfy-Ser-Lya-Ala-Phe- NH2 Ser-Asp-Thr-Cys-Trp-Ser-Thr-Ttir-Ser-Pfie-Glo-Lys-Lys-Thr-lle- His-Cys-Lys-Trp^Arg-Glu-Lys-P)t>-Leu-Met-Leu-Met SEQ ID N° 43 SEQ ID N° 44 SEQ ID N° 45 23

Nome (continuação) Sequência peptídica

Calcitonina) MGOP 27

Sarafotoxina S6a (cardiotoxina isotoxina) Sarafotoxina S6b (potente actividade constritora coronária) Sarafotoxina S6c (causa forte vasoconstrição de vasos coronários) Septida (Péptido Preceptor de Substância electiva) Somatostatina-28 Endotelina-1 (Humana, Bovina, Canina, de Murganho, Porcina, de Rato) Çys-Sef-Cys-Lys-Aêp-Mel-Thr-Asp-I ys-Glu-Cyc-Leu-Asn-Phe-CyS' Hrs-GIn-Asp-Val-lle-Trp Cys-Ser-Cys-Lys-Asp-Mei-Thr-Asp-Lye Glu-Cys-Leu-Tvr-Phe-Cys· His-GloAsp-VâHIeT rp

Cys-Thr-Cys-Asn-Asp-Met-Thr-Asp-Glu-Glu-Cva-Leu-Asn-Phe-Cvs* Hle-GIn-Asp-Val-lls-Trp pGlu-Phe-Phe-Prp-Leu-Mef-NH2 Ser-Afa-Asn*Ser-Asn-Pro-Ala-MetAla-PfD-Arg-Glu-Arg-Lys-Ala- GlyGys-Lya-Asn-Phe-PheT rpi-ye-Thr-Phe-Thr-Ser-Cyg

Cys^âer-Cys-Ser.Ser-Leu-Met-Asp-lys-biu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cye His-Leu-Asp-lle- Ite-Trp Tyí-Ale-Asj>Ala-lle-Phé-Tnr-Aín-$er-T yr-Arg-tys-Vâ I-Leu-Gly- Gtn-Leu-Sôr-Ala-ATg-Lys-Leui-eii-GIrvAEp-Ile-Met-Ser-Arg-GIn- Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gfn-Glu· Arg-Ç|y-Ala-Ar9-Ala-Arg-Leu-NH2 Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-GlrvArg-Leu-Ala-Aín-Phe-L.eu-Val-Hie-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ale-lle-Lêu-Ser-Ser-Thr-Aan-Val-Gly-Ser-Aan-Tfir-Tyr SEQ ID N° 46 SEQ ID N° 32 SEQ ID N° 33 SEQ ID N° 34 SEQ ID N° 47 SEQ ID N° 48 SEQ ID N° 49

Factor de Libertação da Hormona do Crescimento (Humano) amida de amilina SEQ ID N° 50 SEQ ID N° 51 24

Os agentes de modulação de neurogénese (também referidos como os agentes) desta divulgação, são como listados nesta secção. Compreende-se que estes agentes de modulação de neurogénese (agentes) podem ser utilizados onde quer que o agente ou agentes de modulação de neurogénese seja especificado nesta descrição. 0 agente de modulação de neurogénese da invenção é seleccionado do grupo de Tirocalcitonina, Calcitonina, Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 e Exendina-4 e seus análogos e uma sua combinação, ou um análogo de cAMP, em que o referido análogo de cAMP é seleccionado do grupo consistindo em 8-pCPT-2-0-Me-cAMP, 8-Br-cAMP, Rp-cAMPS, 8-Cl-cAMP, Dibutiril cAMP, pCPT-cAMP e monofosfato de N6-monobutiriladenosina 3',5'-cíclico. Numa forma de realização preferida da invenção, o agente de modulação de neurogénese aumenta ou mantém a quantidade de células positivas para duplacortina ou a percentagem de células positivas para duplacortina numa população celular ou tecido neuronal. 2. Produção de agentes de modulação de Neurogénese

Os agentes de modulação de neurogénese podem ser produzidos utilizando técnicas conhecidas de síntese química, incluindo a utilização de sintetizadores peptídicos.

Em algumas formas de realização da invenção, o agente de modulação de neurogénese é um péptido ou proteína. Os péptidos e as proteínas podem ser sintetizados quimicamente utilizando sintetizadores peptídicos comercialmente disponíveis. A síntese química de péptidos e proteínas pode ser utilizada para a incorporação de aminoácidos modificados ou não naturais, incluindo aminoácidos D e outras moléculas orgânicas pequenas. A 25 substituição de um ou mais aminoácidos L num péptido ou proteína com as correspondentes isoformas de aminoácidos D pode ser utilizada para aumentar a resistência à hidrólise enzimática e para melhorar uma ou mais propriedades de actividade biológica, í. e., ligação de receptor, potência funcional ou duração de acção. Ver, e. g., Doherty, et al., 1993. J. Med. Chem. 36: 2585-2594; Kirby, et al., 1993, J. Med. Chem. 36: 3802-3808; Morita, et al., 1994, FEBS Lett. 353: 84-88; Wang, et al., 1993

Int. J. Pept. Protein Res. 42: 392-399; Fauchere e Thiunieau, 1992. Adv. Drug Res. 23: 127-159. A introdução de ligações cruzadas covalentes dentro de uma sequência peptidica ou de proteína pode constranger, de modo conformacional e topográfico, a estrutura peptidica. Esta estratégia pode ser utilizada para desenvolver análogos peptidicos ou de proteína de agentes de modulação de neurogénese com potência, selectividade e estabilidade aumentadas. Um número de outros métodos foi utilizado com êxito para introduzir constrangimentos conformacionais dentro de sequências de aminoácidos, para melhorar a sua potência, selectividade de receptor e meia-vida biológica. Estes incluem a utilização de (i) Ca-metilaminoácidos (ver, e. g., Rose, et al., Adv. Protein Chem. 37; 1-109 (1985); Prasad e Balaram, CRC Crit. Rev. Biochem., 16: 307-348 (1984)); (ii) Nc-metilaminoácidos (ver, e. g., Aubry, et al., Int. J. Pept. Protein Res., 18: 195-202 (1981); Manavalan e Momany, Biopolymers, 19: 1943-1973 (1980)); e (iii) aminoácidos a, β-insaturados (ver, e. g., Bach e Gierasch, Biopolymers, 25: 5175-S192 (1986); Singh, et al., Biopolymers, 26; 819-829 (1987)). Estes e muitos outros análogos de aminoácidos estão comercialmente disponíveis ou podem ser facilmente preparados. Adicionalmente, a substituição do ácido 26 C-terminal com uma amida pode ser utilizada para melhorar a solubilidade e depuração de um péptido ou proteína.

Alternativamente, um agente de modulação de neurogénese pode ser obtido por métodos bem conhecidos na técnica para expressão e purificação peptídica ou de proteína recombinante. Pode ser produzida uma molécula de ADN codificando o agente de modulação de neurogénese. A sequência de ADN é conhecida ou pode ser deduzida a partir da sequência de aminoácidos baseada em utilização de codão conhecida. Ver, e. g., Old e Primrose, Principies of Gene Manipulation 3a ed., Blackwell Scientific Publications, 1985; Wada et al., Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118(1992). De um modo preferido, a molécula de ADN inclui sequência adicional, e. g., sítios de reconhecimento para enzimas de restrição que facilitam a sua clonagem dentro de um vector de clonagem adequado, tal como um plasmídeo. Os ácidos nucleicos podem ser ADN, ARN ou uma combinação destes. Ácidos nucleicos codificando o agente de modulação de neurogénese podem ser obtidos por qualquer método conhecido na técnica (e. g., por amplificação por PCR utilizando iniciadores sintéticos hibridizáveis às extremidades 3' e 5' da sequência e/ou através de clonagem a partir de um ADNc ou biblioteca genómica utilizando uma sequência oligonucleotídica específica para a sequência génica proporcionada, ou semelhantes). Os ácidos nucleicos também podem ser produzidos por síntese química.

Qualquer das metodologias conhecidas na técnica relevante, em relação à inserção de fragmentos de ácido nucleico dentro de um vector, pode ser utilizada para construir vectores de expressão que contêm um gene quimérico compreendido pelos apropriados sinais de controlo transcricional/traducional e sequências codificando agente de modulação de neurogénese. 27

Sequências promotoras/estimuladoras dentro de vectores de expressão podem utilizar sequências regulatórias de plantas, animais, insectos ou fungos, como aqui proporcionadas. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, o péptido pode ser expresso em células bacterianas, tais como células de E. coli, levedura, insecto, fungos ou células de mamífero. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas dos especialistas na técnica. Numa forma de realização, um ácido nucleico codificando um agente de modulação de neurogénese é expresso em células de mamífero utilizando um vector de expressão de mamífero.

Vectores bacterianos exemplificativos incluem mas não estão limitados a: plasmídeos pUC, tais como pUC7, pUC8, pUC9, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119; plasmídeos pBR, tais como pBR322, pBR325 (Biorad Laboratories, Richmond, CA); pSPORT 1; pT7/T3a-18, pT7/T3a-19; plasmídeos pGEM, tais como pGEM3Z, pGEM-4Z, pGEM-3Zf(+/-), pGEM-5Zf(+/-), pGEM-7Zf(+/-), pGEM-9Zf(+/-), PGEM-llZf(+/-), PGEM-13Zf(+) (Promega, Madison, WI); plasmídeos pSP, tais como pSP70, pSP71, pSP72, pSP73, pSP64, pSP65, pSP64 poly(A), pAlter-1; plasmídeos BLUSCRIPT, tais como pBS II SK(+/-), pBS II KS(+/-), pCR-Script SK(+/-), pBS(+/-) pT7-7, pBS-KS(+/-) pT7-7A, pBS-SK(+/-) pTZ18R; pTZl 8U; pTZ19R, pT7-l pTZl9U; pT7-2 e pQE50 (Qiagen, Chatsworth, CA). As células hospedeiras bacterianas exemplificativas incluem mas não estão limitadas a: BMH 71-18 mut S, C600, C600 hfl, DHl, DH5 a, DH5 aF', DMI, HB101, JM83, JM101, JM103, JM105, JM107, JM108, JM109, JM109(DE3), LE392, KW251, MM294, NM522, NM538, NM539, RRl, Y1088, Y1089, Y1090, AGI, JM110, K802, SCSI, SCS110, XL-1 Blue, XLl-Blue MRF' e XLRl-Blue MR. Muitas estirpes estão comercialmente disponíveis (ver, e. g., ATCC, Rockville, MD; GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). 28

Exemplos de vectores de mamífero incluem: pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840; Invitrogen) e pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195), pCMVp {Invitrogen), pcDNA3 {Invitrogen), pET-3d {Novagen), pProEx-1 (Life Technologies), pFastBac 1 (Life Technologies), pSFV (Life Technologies), pcDNA3, pcDNA.4 e pcDNA6 (Invitrogen), pSL301 (Invitrogen), pSE280 {Invitrogen), pSE380 (Invitrogen), pSE420 (Invitrogen), pTrcHis A,B,C {Invitrogen) , pRSET A,B,C (Invitrogen), pYES2 {Invitrogen) , pAC360 {Invitrogen), pVL.1392 e pVH392

(Invitrogen), pZeoSV (Invitrogen), pRc/CMV {Invitrogen), pRc/RSV {Invitrogen) , pREP4 (Invitrogen), pREP7 (Invitrogen), pREP8 {Invitrogen) , pREP9 (Invitrogen), pREPlO {Invitrogen), pCEP4 {Invitrogen), pEBVHis {Invitrogen) e lambda-Ρορβ. Exemplos de células hospedeiras eucarióticas que podem ser utilizadas para expressar uma proteína de fusão da invenção incluem células de ovário de hámster Chinês (CHO) (e. g., Acesso ATCC N° CCL-61), células embrião de murganho NIH Swiss NIH/3T3 (e. g., Acesso ATCC N° CRL-1658) e células de rim bovino Madin-Darby (MDBK) (Acesso ATCC N° CCL-22). Outros vectores e células hospedeiras seriam evidentes para os especialistas na técnica.

As células hospedeiras podem ser utilizadas para produzir (i. e., superexpressar) péptido em cultura, por exemplo através do cultivo da célula hospedeira (dentro da qual um vector de expressão recombinante codificando o péptido ou proteína foi introduzido) num meio adequado, de modo a que o péptido seja produzido. O método envolve, adicionalmente, o isolamento de péptido ou proteína do meio ou da célula hospedeira. Ausubel et al., (Eds). In: Current Protocols in Molecular Biology. J. Wiley and Sons, Nova Iorque, NI. 1998. 29 0 agente de modulação de neurogénese biologicamente expresso pode ser purificado utilizando técnicas de purificação conhecidas. Um péptido ou proteína recombinante "isolado" ou "purificado" ou porção biologicamente activa, significa que o referido péptido ou proteína é substancialmente isento de material celular ou outras proteínas contaminantes da fonte de célula ou tecido a partir da qual é derivada. A linguagem "substancialmente isento de material celular" inclui preparações nas quais o péptido ou proteína é separado dos componentes celulares das células a partir das quais é isolado ou recombinantemente produzido. Numa forma de realização, a linguagem "substancialmente isento de material celular" inclui preparações de péptido ou proteína tendo menos de cerca de 30% (em peso seco) de produto que não o péptido ou proteína desejado (também aqui referido como uma "proteína contaminante"), de um modo mais preferido, menos de cerca de 20% de proteína contaminante, de um modo ainda mais preferido, menos de cerca de 10% de proteína contaminante e, de um modo muito preferido, menos de cerca de 5% de proteína contaminante. Quando o péptido ou proteína, ou porção biologicamente activa deste, é recombinantemente produzido, também é, de um modo preferido, substancialmente isento de meio de cultura, í. e., o meio de cultura representa menos de cerca de 20%, de um modo mais preferido, menos de cerca de 10% e, de um modo muito preferido, menos de cerca de 5% do volume da preparação de péptido ou proteína.

De um modo preferido, o análogo do agente de modulação de neurogénese é funcionalmente activo. Como aqui utilizado, o termo "funcionalmente activo" refere-se a espécies exibindo um ou mais atributos funcionais conhecidos de neurogénese. 30

Análogos de um agente de modulação de neurogénese da invenção ou as suas fracções individuais, podem ser produzidos por diversos métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as seguências de aminoácidos podem ser modificadas por gualguer número de métodos conhecidos dentro na técnica. Ver, e. g., Sambrook, et al., 1990. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 a ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY) . As modificações incluem: glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de protecção/bloqueio conhecidos, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro reagente celular. Qualquer das numerosas metodologias de modificação química conhecidas na técnica pode ser utilizada, incluindo clivagem química específica por brometo de cianogénio, tripsina, quimotripsina, papaína, protease V8, NaBH4, acetilação, formilação, oxidação, redução e síntese metabólica na presença de tunicamicina.

Os análogos podem ser de comprimento completo ou que não de comprimento completo, se o referido análogo contiver um ácido nucleico ou aminoácido modificado, como descrito infra. Análogos do agente de modulação de neurogénese incluem moléculas compreendendo regiões que são substancialmente homólogas em diversas formas de realização de, pelo menos, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou, de um modo preferido, 95% de identidade de aminoácido quando: (i) comparadas com uma sequência de aminoácidos de tamanho idêntico; (ii) a comparação com uma sequência alinhada nesse alinhamento é realizada por um programa de homologia de computador conhecido na técnica (e. g., software wisconsin GCG) ou (iii) o ácido nucleico codificante é capaz de se hibridar a uma sequência codificando os péptidos supramencionados, sob condições estringentes (preferido), moderadamente estringentes ou não estringentes. Ver, e. g., 31

Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nova Iorque, NY, 1993. 3. Proteínas de Fusão Compreendendo agentes de modulação de

Em diversos aspectos da invenção, os agentes de modulação de neurogénese de proteína e péptido aqui divulgados podem ser expressos como proteínas de fusão. Como exemplos não limitativos, as proteínas de fusão podem incluir uma ou mais caudas poli-His, cauda c-myc, cauda E, cauda S, cauda FLAG, cauda Glu-Glu, cauda HA, cauda HSV, V5, VSV-g, β-galalactosidase, GFP, GST, luciferase, proteína de ligação de maltose, domínio de ligação de fosfatase alcalina de celulose, domínio Fc ou outras sequências heterólogas. Os especialistas na técnica podem preparar tais proteínas de fusão utilizando técnicas de biologia molecular bem conhecidas. Por exemplo, podem ser utilizadas metodologias de ADN recombinante convencionais para produzir proteínas de fusão úteis na prática da invenção.

De acordo com tais métodos, podem ser produzidas construções de fusão e os ADN resultantes podem ser integrados dentro de vectores de expressão, e expressos de modo a produzir as proteínas de fusão para utilização na invenção. Uma célula hospedeira apropriada pode ser transformada ou transfectada com o vector de expressão e utilizada para a expressão e/ou secreção da proteína alvo. As células hospedeiras, presentemente preferidas para utilização na invenção, incluem células de hibridoma imortais, células de mieloma NS/O, células 293, células de ovário de hámster Chinês, células HELA e células COS. 32

As células hospedeiras procarióticas também podem ser modificadas de modo a compreenderem vectores para expressão de proteínas de fusão, tais como pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. e Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) .

Para alguns objectivos, pode ser desejável incluir uma sequência sinal numa proteína de fusão para utilização na invenção. As sequências sinal que podem ser utilizadas com as construções de expressão para utilização na invenção, incluem sequências sinal de cadeia leve de anticorpo, e. g., anticorpo 14.18 (Gillies et al. (1989) J. Immunol. Meth. 125:191), sequências sinal de cadeia pesada de anticorpo, e. g., a sequência sinal de cadeia pesada de anticorpo MOPC141 (Sakano et al. (1980) Nature 286:5774) e quaisquer outras sequências sinal que sejam conhecidas na técnica (ver, e. g., Watson (1984) Nucleic Acids Research 12:5145). Uma discussão detalhada de sequências sinal peptídicas é proporcionada por von Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14:4683.

Como seria evidente para um especialista na técnica, a adequação de uma particular sequência sinal para utilização num vector para secreção, pode requerer alguma experimentação de rotina. Tal experimentação irá incluir a determinação da capacidade da sequência sinal dirigir a secreção de uma proteína de fusão e também uma determinação da configuração óptima, genómica ou ADNc, da sequência a utilizar, para alcançar eficiente secreção de proteínas de fusão. Adicionalmente, um especialista na técnica é capaz de criar um péptido sinal sintético seguindo as regras apresentadas por von Heijne, 33 referenciadas anteriormente e testar para a eficácia de uma tal sequência sinal sintética por experimentação de rotina.

Uma proteína de fusão para utilização na invenção pode incluir um sítio de clivagem proteolítica, de modo a proporcionar para clivagem proteolítica da proteína de fusão codificada. Desta forma, o domínio heterólogo (e. g., proteína GST) pode ser separado da sequência do péptido ou proteína de interesse. Os sítios de clivagem proteolítica úteis incluem sequências de aminoácidos que são reconhecidas por enzimas proteolíticas, tais como tripsina, plasmina ou enterocinase K. Muitos pares sítio de clivagem/agente de clivagem são conhecidos (ver, por exemplo, a Pat. U.S. N° 5726044).

Após síntese por métodos químicos ou biológicos, os péptidos e proteínas para utilização na invenção podem ser purificados, de modo que sejam substancialmente isentos de precursores químicos ou outras substâncias químicas utilizando técnicas de purificação padrão. A linguagem "substancialmente isentos de precursores químicos ou outras substâncias químicas" inclui preparações nas quais o péptido ou proteína é separado de precursores químicos ou outras substâncias químicas que estejam envolvidos na síntese. Numa forma de realização, a linguagem "substancialmente isentos de precursores químicos ou outras substâncias químicas", inclui preparações tendo menos de cerca de 30% (em peso seco) de precursores químicos ou outras substâncias químicas, de um modo mais preferido, menos de cerca de 20% de precursores químicos ou outras substâncias químicas, de um modo ainda mais preferido, menos de cerca de 10% de precursores químicos ou outras substâncias químicas e, de um modo muito preferido, menos de cerca de 5% de precursores químicos ou outras substâncias químicas. 34 4. Composições Compreendendo agente(s) de modulação de

Também são aqui descritas composições farmacêuticas compreendendo um agente de modulação de neurogénese da invenção. Os agentes de modulação de neurogénese da invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas que podem ser utilizadas como agentes terapêuticos para o tratamento de determinadas doenças neurológicas (distúrbios). Estas composições são discutidas nesta secção. Compreende-se que quaisquer composições farmacêuticas e substâncias quimicas discutidas nesta secção podem ser um componente de uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais agentes de modulação de neurogénese.

Agentes de modulação de neurogénese e agentes co-administrados podem ser incorporados dentro de composições farmacêuticas adequadas para administração. Tais composições tipicamente compreendem o agente e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizado, "veiculo farmaceuticamente aceitável", pretende incluir todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento de absorção e semelhantes, compatíveis com administração farmacêutica. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é bem conhecida na técnica. Excepto nos casos em que quaisquer meios convencionais ou agente sejam incompatíveis com o composto activo, está contemplada a sua utilização nas composições. Compostos activos suplementares também podem ser incorporados dentro das composições. Podem ser preparadas modificações dos agentes de modo a afectar a solubilidade ou depuração do péptido. As moléculas peptídicas também podem ser sintetizadas com aminoácidos D, de modo a 35 aumentar a resistência à degradação enzimática. Em alguns casos, a composição pode ser co-administrada com um ou mais agentes solubilizantes, conservantes e agentes estimuladores de permeação.

De um modo preferido, a composição farmacêutica é utilizada para tratar doenças através da estimulação da neurogénese (i. e., crescimento celular, proliferação, migração, sobrevivência e/ou diferenciação). Para tratamento, uma utilização da invenção compreende a administração ao individuo de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica incluindo um agente da invenção (1) isoladamente numa gama de dosagem de 0,001 ng/kg/dia a 500 ng/kg/dia, de um modo preferido, numa gama de dosagem de 0,05 a 200 ng/kg/dia, (2) num factor de aumento de permeabilidade de combinação ou (3) em combinação com um agente localmente ou sistemicamente co-administrado.

Uma composição farmacêutica para utilização na invenção é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem administração parentérica, e. g., intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (e. g., inalação), transdérmica (tópica), transmucosal e rectal. As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parentérica, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, fisiologicamente aceitável, tais como água para injecção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicois, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou parabenos metílicos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tal como ácido etilenodiaminotetraacético; tampões, tais como acetatos, 36 citratos ou fosfatos e agentes para o ajustamento de tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frasquinhos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico.

Administração oral refere-se à administração da formulação por meio da boca através de ingestão ou por meio de qualquer outra parte do sistema gastrointestinal, incluindo o esófago ou através de administração de supositório. Administração parentérica refere-se à distribuição de uma composição, tal como uma composição compreendendo um agente de modulação de neurogénese por uma via que não através do aparelho gastrointestinal (e. g., distribuição oral). Em particular, administração parentérica pode ser por meio de injecção intravenosa, subcutânea, intramuscular ou intramedular (i. e., intratecal). Administração tópica refere-se à aplicação de um agente farmacêutico à superfície externa da pele ou das membranas mucosas (incluindo as membranas de superfície do nariz, pulmões e boca), de modo a que o agente atravesse a superfície externa da pele ou membrana mucosa e entre nos tecidos subjacentes. A administração tópica de um agente farmacêutico pode resultar numa distribuição limitada do agente à pele e tecidos circundantes ou, quando o agente é removido da área de tratamento pela corrente sanguínea, pode resultar em distribuição sistémica do agente.

Numa forma preferida de administração tópica, o agente de promoção de neurogénese é distribuído por distribuição transdérmica. Distribuição transdérmica refere-se à difusão de um agente através da barreira da pele. A pele (stratum corneum e 37 epiderme) actua como uma barreira e poucos agentes farmacêuticos são capazes de penetrar pele intacta. Em contraste, a derme é permeável a muitos solutos e a absorção de fármacos ocorre, por conseguinte, mais facilmente através de pele que é desgastada ou de outro modo despojada da epiderme de modo a expor a derme. A absorção através de pele intacta pode ser melhorada através da colocação do agente activo num veiculo oleoso, antes da aplicação à pele (um processo conhecido como unção) . A administração tópica passiva pode consistir na aplicação do agente activo directamente ao local de tratamento, em combinação com emolientes ou estimuladores de penetração. Outro método para estimular a distribuição através da pele é aumentar a dosagem do agente farmacêutico. A dosagem para administração tópica pode ser aumentada até dez, uma centena ou mil vezes mais do que as dosagens habituais referidas em qualquer outra parte nesta divulgação.

As composições farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem soluções aquosas (se hidrossolúveis) ou dispersões estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injectáveis ou dispersão estéreis. Para administração intravenosa, veículos adequados, fisiologicamente aceitáveis, incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) ou solução salina tamponada com fosfatos (PBS). Em qualquer caso, a composição tem de ser estéril e deverá ser fluida, na medida em que facilite a utilização de seringa. Deve ser estável sob as condições de preparação e armazenamento e deve ser preservada da acção contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. 0 veiculo pode ser um meio solvente ou de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol liquido e 38 semelhantes) e as suas misturas adequadas. A correcta fluidez pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido, no caso de dispersão, e pela utilização de surfactantes. A prevenção da acção de microrganismos pode ser alcançada por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir na composição agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser alcançada através da inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Os veículos fisiologicamente aceitáveis podem ser qualquer veículo conhecido no campo como adequado para aplicação farmacêutica (í. e., tópica, oral e parentérica).

Transportadores farmacêuticos e formulações adequados são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed.) (Genarro, ed. (1995) Mack Publishing Co.r Easton, Pa.). De um modo preferido, os veículos farmacêuticos são escolhidos com base no modo de administração pretendido do agente de modulação de neurogénese. 0 veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir, por exemplo, emolientes, humectantes, espessantes, silicones e água. Formulações adequadas que incluem excipientes farmaceuticamente aceitáveis para introdução do agente de modulação de neurogénese na corrente sanguínea, por vias que não a injecção, podem consultar-se em Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed.) (Genarro, ed. (1995) Mack Publishing Co., Easton, Pa.). 39

Exemplos específicos de veículos incluem óleos e ceras de hidrocarbonetos, tais como óleo mineral, vaselina, parafina, ceresina, ozocerite, cera microcristalina, polietileno e per-hidroesqualeno; triglicéridos, tal como óleo vegetal, gorduras animais, óleo de rícino, manteiga de cacau, óleo de cártamo, óleo de semente de algodoeiro, óleo de milho, azeite, óleo de fígado de bacalhau, óleo de amêndoa, óleo de abacate, óleo de palma, óleo de sésamo, esqualeno e óleo de soja maleato; acetoglicéridos, tal como monoglicéridos acetilados; glicéridos etoxilados, tal como monoestearato de glicerilo etoxilado; ésteres de alquilícos de ácidos gordos, tais como metilo, isopropilo e butilo, laurato de hexilo, laurato de iso-hexilo, palmitato de iso-hexilo, palmitato de isopropilo, oleato de decilo, oleato de isodecilo, estearato de hexadecilo, estearato de decilo, isoestearato de isopropilo, adipato de diisopropilo, adipato de diiso-hexilo, adipato de di-hexildecilo, sebacato de diisopropilo, lactato de laurilo, lactase de miristilo e ésteres de cetil lactato de ácido gordo; ésteres alcenílicos de ácidos gordos, tais como miristato de oleílo, estearato de oleílo e oleato de oleílo; ácidos gordos, tais como ácidos pelargónico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, isoesteárico, hidroxiesteárico, oleico, linoleico, ricinoleico, araquídico, beénico e erúcico; álcoois gordos, tais como álcoois de laurilo, miristilo, cetilo, hexadecilo, estearilo, isoestearilo, hidroxiestearilo, oleílo, ricinoleilo, beenilo, erucilo e 2-octil dodecanilo; éteres de álcool gordo, tais como laurilo, cetilo, estearilo, isoestearilo, oleílo e colesterol, tendo conjugados aos mesmos de 1 a 50 grupos de óxido de etileno ou 1 a 50 grupos de óxido de propileno; éter-ésteres, tais como ésteres de ácido gordo de álcoois gordos etoxilados. 40

Também estão incluídos lanolina e derivados, tais como lanolina, óleo de lanolina, cera de lanolina, álcoois de lanolina, ácidos gordos de lanolina, lanolato de isopropilo, lanolina etoxilada, álcoois de lanolina etoxilada, colesterol etoxilado, álcoois de lanolina propoxilados, álcoois de lanolina acetilados, linoleato de álcoois de lanolina, ricinoleato de álcoois de lanolina, acetato de ricinoleato de álcoois de lanolina, acetato de álcoois etoxilados, hidrogenólise de lanolina, lanolina hidrogenolisada etoxilada, lanolina de sorbitol etoxilada e bases de absorção de lanolina líquidas e semi-sólidas; ésteres de álcool poli-hídrico, tais como ésteres de monoácido gordo e diácido gordo de etilenoglicol, ésteres de monoácido gordo e diácido gordo de dietilenoglicol, ésteres de monoácido gordo e diácido gordo de polietilenoglicol (200-6000), ésteres de monoácido gordo e diácido gordo de propilenoglicol, monooleato de polipropilenoglicol 2000, monoestearato de polipropilenoglicol 2000, monoestearato de propilenoglicol etoxilado, ésteres de monoácido gordo e diácido gordo de glicerilo, ésteres poligordos de poliglicerol, monoestearato de glicerilo etoxilado, monoestearato de 1,3-butilenoglicol, diestearato de 1,3-butilenoglicol, ésteres de ácido gordo de polioxietileno poliol, ésteres de ácido gordo de sorbitano e ésteres de acido gordo de polioxietileno sorbitano são ésteres de álcool poli-hídrico satisfatórios. São adicionalmente incluídas ceras, tais como cera de abelhas, espermacete, miristato de miristilo, cera de abelhas de sorbitol de estearatopolioxietileno de estearilo, ceras de carnaúba e candelilha; fosfolípidos, tais como lecitina e derivados; esteróis, tais como colesterol e ésteres de ácido gordo de colesterol, amidas, tais como amidas de ácido gordo, amidas de ácido gordo etoxilado e alcanolamidas sólidas de ácido 41 gordo. Adicionalmente, o agente de modulação de neurogénese e o transportador farmaceuticamente aceitável podem ser encerrados numa cápsula de gelatina de invólucro duro ou mole, comprimidos em comprimidos ou incorporados directamente dentro da dieta do indivíduo. Especificamente, o agente de modulação de neurogénese pode ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de comprimidos ingeriveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas e semelhantes. Quando o agente de modulação de neurogénese é administrado oralmente, pode ser misturado com outras formas alimentares e estimuladores de aroma farmaceuticamente aceitáveis. Quando o agente de modulação de neurogénese é administrado entericamente, pode ser introduzido numa forma sólida, semi-sólida, suspensão ou emulsão e pode ser misturado com qualquer número de aditivos bem conhecidos, farmaceuticamente aceitáveis. Sistemas de distribuição oral de libertação controlada e/ou revestimentos entéricos para formas de dosagem oralmente administrados são conhecidos na técnica e também estão contemplados.

Composições orais incluem, em geral, um diluente inerte, fisiologicamente aceitável, ou um veiculo comestível. Estes podem ser encerrados em cápsulas de gelatina ou comprimidos em comprimidos. Para efeitos de administração terapêutica oral, o agente de modulação de neurogénese da invenção pode ser incorporado com excipientes fisiológicos e utilizados na forma de comprimidos, trociscos ou cápsulas. As composições orais também podem ser preparadas utilizando um veículo fluido para utilização como um colutório, em que o composto no veículo fluido é aplicado oralmente e bochechado e expectorado ou engolido. Agentes aglutinantes e/ou materiais adjuvantes farmaceuticamente compatíveis podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e 42 semelhantes podem conter qualquer dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma natureza semelhante: um aglutinante, tais como celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; excipientes fisiologicamente aceitáveis, tais como amido ou lactose, um agente desagregante, tais como ácido alginico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante, tais como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante, tal como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante, tais como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante, tais como hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aromatizante de laranja.

Se um agente de modulação de neurogénese para utilização na invenção for administrado como um agente tópico, a composição para utilização na invenção pode, opcionalmente, compreender outros agentes conhecidos por terem um efeito cosmético ou benéfico sobre a pele. Tais agentes incluem, por exemplo, antioxidantes, protectores solares, um tampão de pH e uma sua combinação. Embora qualquer antioxidante que seja quimicamente compatível possa ser utilizado, antioxidantes preferidos incluem aminoácidos, tais como glicina, histidina, tirosina e triptofano; imidazoles, tal como ácido urocânico; péptidos, tais como D, L-carnosina, D-carnosina, L-carnosina e anserina; carotenóides; carotenos, tais como alfa-caroteno, beta-caroteno e licopeno; ácido lipóico, tal como ácido di-hidrolipóico; tióis, tais como aurotioglucose, propiltiouracilo, tioredoxina, glutationo, cisteína, cistina e cistamina; tiodipropionato de dilaurilo; tiodipropionato de distearilo; ácido tiodipropiónico; compostos de sulfoximina, tais como sulfoximinas de butionina, sulfoximina de homocisteína, sulfonas de butionina, sulfoximina de pentationina, hexationina e heptationina; agentes quelantes metálicos, tais como ácidos alfa-hidroxi-gordos, ácido palmítico, ácido fítico, lactoferrina EDTA e EGTA; ácidos alfa- 43 hidroxilo, tais como ácido cítrico, ácido láctico e ácido málico; ácidos gordos insaturados, tais como ácido gama- linolénico, ácido linoleico e ácido oleico; ácido fólico; ubiquinona e ubiquinol.

Soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do agente de modulação de neurogénese para utilização na invenção (e. g., um ácido nucleico, péptido, proteína de fusão, anticorpo, affibody e semelhantes), na quantidade requerida, num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes anteriormente enumerados, como requerido, seguido de esterilização por filtração. Em geral, as dispersões são preparadas através da incorporação do agente de modulação de neurogénese dentro de um veículo estéril, que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos a partir daqueles anteriormente enumerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos de preparação são a secagem a vácuo e a criodessecação que produzem um pó do ingrediente activo, bem como qualquer ingrediente adicional desejado de uma sua solução anteriormente esterilizada por filtração.

Um número de sistemas que alteram a distribuição de fármacos injectáveis, pode ser utilizado para alterar as propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas de agentes terapêuticos (ver, e. g., K. Reddy, 2000, Annals of Pharmacotherapy 34:915-923). A distribuição de fármacos pode ser modificada através de uma alteração na formulação (e. g., produtos de libertação contínua, lipossomas) ou uma adição à molécula de fármaco (e. g., peguilação). As potenciais vantagens destes mecanismos de distribuição de fármacos incluem uma duração aumentada ou prolongada de actividade farmacológica, uma 44 diminuição em efeitos adversos e concordância e qualidade de vida de doente aumentada. Sistemas injectáveis de libertação continua distribuem fármacos num modo controlado, predeterminado e são particularmente apropriados quando é importante evitar grandes flutuações em concentrações plasmáticas de fármaco. 0 encapsulamento de um fármaco dentro de um lipossoma pode produzir uma meia-vida prolongada e uma distribuição aumentada a tecidos com permeabilidade capilar aumentada (e. g., tumores). A peguilação proporciona um método para modificação de péptidos ou proteínas terapêuticos, de modo a minimizar possíveis limitações (e. g., estabilidade, meia-vida, imunogenicidade) associadas a estes agentes de modulação de neurogénese.

De acordo com a invenção, um ou mais agentes de modulação de neurogénese podem ser formulados com lípidos ou veículos lipídicos (e. g., micelas, lipossomas, microsferas, protocélulas, protobiontes, lipossomas, coacervados e semelhantes), de modo a permitir a formação de multímeros. De modo semelhante, agentes de modulação de neurogénese podem ser multimerizados utilizando peguilação, reticulação, formação de ligação dissulfureto, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) ou outros métodos estabelecidos. 0 agente de modulação de neurogénese multimerizado pode ser formulado numa composição farmacêutica e utilizado para aumentar ou melhorar os seus efeitos. A administração sistémica também pode ser por meio transmucosal ou transdérmico. Para administração transmucosal ou transdérmica, são utilizados na formulação penetrantes apropriados à barreira a ser permeada. Tais penetrantes são, em geral, conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para administração transmucosal, detergentes, sais biliares e 45 derivados de ácido fusídico. A administração transmucosal pode ser alcançada através da utilização de pulverizações nasais ou supositórios. Para administração por inalação, o agente de modulação de neurogénese para utilização na invenção pode ser distribuído na forma de uma pulverização de aerossol, a partir de recipiente ou doseador pressurizado que contém um propulsor adequado, e. g., um gás, tal como dióxido de carbono ou um nebulizador. Para administração transdérmica, o agente de modulação de neurogénese para utilização na invenção pode ser formulado em pomadas, unguentos, géis ou cremes como conhecidos, geralmente, na técnica. Os agentes de modulação de neurogénese também podem ser preparados na forma de supositórios (e. g., com bases de supositório convencionais, tais como manteiga de cacau e outros glicéridos) ou enemas de retenção para distribuição rectal.

Numa forma de realização, os agentes de modulação de neurogénese para utilização na invenção são preparados com veiculos que irão proteger o agente de modulação de neurogénese contra rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo sistemas de distribuição de implantes e microencapsulados. Podem utilizar-se polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como acetato de etileno vinílico, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Os métodos para preparação de tais formulações serão evidentes para os especialistas na técnica. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente a partir de Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensões lipossomais (incluindo lipossomas dirigidos para células infectadas com anticorpos monoclonais para antigénios virais) também podem ser utilizadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de 46 acordo com métodos conhecidos dos especialistas na técnica, por exemplo, como descrito na Pat. U.S. N° 4522811. É especialmente vantajoso formular composições orais ou parentéricas em forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosagem, como aqui utilizada, refere-se a unidades fisicamente discretas adaptadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veiculo farmacêutico requerido. A especificação para as formas unitárias de dosagem para utilização na invenção é ditada e directamente dependente das características únicas do composto activo e do particular efeito terapêutico a ser alcançado e das limitações inerentes na técnica de mistura de um tal como composto activo para o tratamento de indivíduos.

Noutras formas de realização, o agente de modulação de neurogénese é administrado numa composição compreendendo agente de modulação de neurogénese, pelo menos, 90% puro. De um modo preferido, o agente de modulação de neurogénese é formulado num meio proporcionando estabilidade máxima e os menores efeitos secundários relacionados com a formulação. Adicionalmente ao agente de modulação de neurogénese, a composição para utilização na invenção irá, tipicamente, incluir um ou mais transportador proteico, tampão, sal isotónico e estabilizante.

Composições que incluem um ou mais agentes de modulação de neurogénese da invenção, podem ser administradas em qualquer forma convencional, incluindo em qualquer forma conhecida na técnica, na qual podem ou atravessar ou contornar a barreira 47 hematoencefálica. Métodos para permitirem que factores atravessem a barreira hematoencefálica incluem minimização do tamanho do factor, proporcionando factores hidrófobos que podem atravessar mais facilmente, conjugando o agente de modulação de neurogénese de proteína ou outro agente a uma molécula transportadora que tenha um coeficiente de permeabilidade substancial através da barreira hematoencefálica (ver, e. g., Patente U.S. 5670477).

Em alguns casos, o agente de modulação de neurogénese pode ser administrado por um processo cirúrgico implantando um cateter ligado a um dispositivo de bomba. O dispositivo de bomba também pode ser implantado ou ser posicionado extracorporalmente. A administração do agente de modulação de neurogénese pode ser em pulsos intermitentes ou como uma infusão continua. Dispositivos para injecção a áreas discretas do cérebro são conhecidos na técnica (ver, e. g., Patentes U.S. N° 6042579; 5832932; e 4692147). 5. Método para Redução de um Sintoma de um Distúrbio através da Administração de agente(s) de modulação de Neurogénese

Uma forma de realização da invenção é dirigida à redução de um sintoma de um distúrbio num doente, através da administração de um agente de modulação de neurogénese da invenção ao doente. Nessa utilização, um ou mais agentes de modulação de neurogénese são directamente administrados ao animal, os quais irão induzir proliferação e/ou diferenciação adicional de um tecido neuronal adulto do referido animal. Tais utilizações in vivo permitem que distúrbios causados por perda de células, em virtude de lesão ou 48 doença, sejam endogenamente substituídos. Isto irá obviar a necessidade para transplante de células estranhas num doente.

Um agente de modulação de neurogénese para utilização na invenção pode ser administrado sistemicamente a um doente. Numa forma de realização preferida, o agente de modulação de neurogénese é administrado localmente a quaisquer loci implicados na patologia de distúrbio do SNC, i. e., quaisquer loci deficientes em células neuronais como uma causa da doença. Por exemplo, o agente de modulação de neurogénese pode ser administrado localmente ao ventrículo do cérebro, substantia nigra, mesencéfalo, estriado, locus ceruleous, nucleus basalis Meynert, núcleo pedunculopontino, córtex cerebral e espinha dorsal. Um distúrbio do sistema nervoso central da presente invenção é seleccionado de distúrbios neurodegenerativos, distúrbios isquémicos, traumas neurológicos e distúrbios de aprendizagem e memória. A administração de factores de crescimento pode ser realizada por qualquer método, incluindo cânula de injecção, transfecção de células com vectores expressando hormona do crescimento, injecção, aparelho de libertação temporizada que pode administrar substâncias ao local desejado e semelhantes. Composições farmacêuticas podem ser administradas por qualquer método, incluindo cânula de injecção, injecção, administração oral, aparelhos de libertação temporizada e semelhantes. Qualquer factor de crescimento pode ser utilizado, particularmente EGF, TGF-alfa, FGF-1, FGF-2 e NGF. Os factores de crescimento podem ser administrados de qualquer modo conhecido na técnica, no qual os factores podem ou atravessar ou contornar a barreira hematoencefálica. Métodos para permitir que factores atravessem a barreira hematoencefálica incluem 49 minimização do tamanho do factor ou o provimento de factores hidrófobos que possam atravessar mais facilmente. A utilização da invenção tira partido do facto de as células estaminais se localizarem nos tecidos revestindo ventrículos de cérebros maduros. A neurogénese pode ser induzida através da administração de um agente de modulação de neurogénese da invenção directamente a estes locais e, deste modo, evitando administração sistémica desnecessária e possíveis efeitos secundários. Pode ser desejável implantar um dispositivo que administre a composição ao ventrículo e, deste modo, às células estaminais neuronais. Por exemplo, uma cânula ligada a uma bomba osmótica pode ser utilizada para distribuir a composição. Alternativamente, a composição pode ser injectada directamente dentro dos ventrículos. As células podem migrar para regiões que tenham sido danificadas como resultado de lesão ou doença. Além disso, a proximidade imediata dos ventrículos a muitas regiões cerebrais permitiria a difusão de um agente neurológico segregado pelas células (e. g., células estaminais ou sua descendência). A invenção proporciona agentes para utilização na indução de neurogénese in vivo ou in vitro, que podem ser utilizados para tratar diversas doenças e distúrbios do SNC, como aqui descrito em detalhe. 0 termo "tratar", nas suas diversas formas gramaticais em relação à presente invenção, refere-se à prevenção, cura, reversão, atenuação, alívio, melhoramento, minimização, supressão ou interrupção dos efeitos prejudiciais de um distúrbio neurológico, progressão de distúrbio, agente causativo de distúrbio (e. g., bactérias ou vírus), lesão, trauma ou outro estado anormal. Sintomas de distúrbios neurológicos incluem tensão, movimentos anormais, comportamento 50 anormal, tiques, hiperactividade, combatividade, hostilidade, negativismo, defeitos de memória, defeitos sensoriais, defeitos cognitivos, alucinações, delírios agudos, poucos cuidados pessoais e, por vezes, afastamento e reclusão.

Sintomas de movimentos anormais incluem uma ampla variedade de sintomas que podem variar a partir de movimentos involuntários que interferem muito pouco com a qualidade de vida, a movimentos muito graves e incapacitantes. Exemplos de sintomas que se verificam associados a distúrbios neurológicos incluem protrusões involuntárias da língua, movimentos da língua do tipo serpente, movimentos repetitivos dos dedos do pé e mão, tremuras de extremidades ou secções corporais completas, tiques, rigidez muscular, lentidão de movimento, espasmos faciais, contracções agudas de diversos músculos, particularmente do pescoço e ombro, que podem eventualmente conduzir a contracção muscular dolorosa, prolongada, agitação, perturbação e uma incapacidade para permanecer quieto. Sintomas comportamentais anormais, alguns dos quais são por natureza motores, incluem irritabilidade, baixo controlo de impulso, distractibilidade, agressividade e comportamentos estereotípicos que são geralmente verificados com deficiência mental, tais como balançar, saltar, correr, girar, voar.

Qualquer das utilizações da invenção pode ser utilizada para aliviar um sintoma de uma doença ou distúrbio neurológico, tal como doença de Parkinson (paralisia tremente), incluindo doença de Parkinson primária, parkinsonismo secundário e parkinsonismo pós-encefalítico; distúrbios do movimento induzidos por fármaco, incluindo parkinsonismo, distonia aguda, disquinesia tardia e síndrome maligna neuroléptica; doença de Huntington (coreia de Huntington; coreia progressiva crónica; 51 coreia hereditária); delírio (estado confusional agudo); demência; doença de Alzheimer; demências de não Alzheimer, incluindo demência de corpo de Lewy, demência vascular, demência de Binswanger (encefalopatia arteriosclerótica subcortical), demência pugilística, hidrocefalia de pressão normal, paresia geral, demência frontotemporal, demência multi-enfarte e demência de SIDA; deficiência de memória associada à idade (AAMI); amnésias, tais como amnésias retrógradas, anterograduais, globais, específicas de modalidade, transientes, estáveis e progressivas e amnésias pós-traumáticas e doença de Korsakoffs .

Outras doenças e distúrbios incluem hipotensão ortostática idiopática, síndrome de Shy-Drager, paralisia supranuclear progressiva (síndrome de Steele-Richardson-Olszewski); lesões estruturais do cerebelo, tais como aquelas associadas a enfartes, hemorragias ou tumores; degenerescências espinocerebelosas, tais como aquelas associadas a ataxia de Friedreich, abetalipoproteinemia (e. g., síndrome de Bassen-Kornzweig, deficiência de vitamina E), doença de Refsum (doença de armazenamento de ácido fitânico), ataxias cerebelosas, atrofia de múltiplos sistemas (atrofia olivopontocerebelosa), ataxia-telangiectasia e distúrbios multissistémicos mitocondriais; encefalomielite disseminada aguda (encefalomielite pós-infecciosa); adrenoleucodistrofia e adrenomieloneuropatia; atrofia óptica hereditária de Leber; mielopatia associada a HTLV; e esclerose múltipla; distúrbios dos neurónios motores, tais como esclerose lateral amiotrófica, paralisia bulbar progressiva, atrofia muscular progressiva, esclerose lateral primária e paralisia pseudobulbar progressiva e atrofias musculares espinais, tais como atrofia muscular espinal de tipo I (doença de Werdnig-Hoffmann), atrofia muscular 52 espinal de tipo II (intermédia), atrofia muscular espinal de tipo III (doença de Wohlfart-Kugelberg-Welander) e atrofia muscular espinal de tipo IV.

Doenças e distúrbios adicionais incluem distúrbios do plexo, tais como plexopatia e nevrite braquial aguda (amiotrofia nevrálgica); neuropatias periféricas, tais como mononeuropatias, mononeuropatias múltiplas e polineuropatias, incluindo paralisia do nervo ulnar, sindrome do túnel cárpico, paralisia do nervo peroneal, paralisia do nervo radial, sindrome de Guillain-Barré (paralisia ascendente de Landry; polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória aguda), polineuropatia recorrente crónica, neuropatia motora e sensorial hereditária, e. g., tipos I e li (doença de Charcot-Marie-Tooth, atrofia muscular peroneal) e tipo ΙΙΙ (neuropatia intersticial hipertrófica, doença de Dejerine-Sottas); distúrbios da transmissão neuromuscular, tal como miastenia grave; distúrbios neuro-oftalmológicos, tais como sindrome de Horner, oftalmoplegia internuclear, paralisias visuais e sindrome de Parinaud; paralisias do nervo craniano, nevralgia trigeminal (Tique Nervoso); paralisia de Bell; e nevralgia glossofaríngea; lesão induzida por radiação do sistema nervoso; neuropatia induzida por quimioterapia (e. g., encefalopatia); neuropatia de taxol; neuropatia de vincristina; neuropatia diabética; neuropatias autónomas; polineuropatia; e mononeuropatias; e sindromes isquémicas, tais como ataques isquémicos transientes, sindrome esternal subclávia, ataques de gota, acidente vascular cerebral isquémico, acidente vascular cerebral hemorrágica e enfarte cerebral.

Para tratamento da Doença de Huntington, Doença de Alzheimer, Doença de Parkinson e outros distúrbios neurológicos 53 um ou mais dos afectando, principalmente, o prosencéfalo, agentes de modulação de neurogénese divulgados, com ou sem factores de crescimento ou outros agentes neurológicos, seriam distribuídos aos ventrículos do prosencéfalo, de modo a afectar a modificação ou manipulação in vivo das células. Por exemplo, a doença de Parkinson é o resultado de niveis baixos de dopamina no cérebro, particularmente no estriado. Seria vantajoso induzir as próprias células estaminais quiescentes de um doente a dividirem-se in vivo aumentando, deste modo, localmente os niveis de dopamina. As utilizações e composições para utilização na presente invenção proporcionam uma alternativa à utilização de fármacos e à utilização controversa de grandes quantidades de tecido embrionário para tratamento da doença de Parkinson. As células de dopamina podem ser produzidas no estriado pela administração de uma composição compreendendo factores de crescimento ao ventrículo lateral.

Para o tratamento de MS e outros distúrbios desmielinizantes ou hipomielinizantes e para o tratamento de

Esclerose Lateral Amiotrófica ou outras doenças do neurónio motor, um ou mais dos agentes de modulação de neurogénese divulgados, com ou sem factores de crescimento ou outros agentes neurológicos, seriam distribuídos ao canal central. Adicionalmente ao tratamento de tecido do SNC imediatamente circundando um ventrículo, um vector virai, ADN, factor de crescimento ou outro agente neurológico pode ser facilmente administrado à cisterna lombar para circulação por todo o SNC. A infusão de EGF ou factores de crescimento semelhantes podem ser utilizados com os agentes de modulação de neurogénese da invenção, de modo a melhorar a proliferação, migração e diferenciação de células estaminais neuronais e células progenitoras in vivo (ver, e. g., Patente U.S. N° 5851832). Numa 54 forma de realização preferida, EGF e FGF são administrados em conjunto ou sequencialmente. A barreira hematoencefálica pode ser contornada por transfecção in vivo de células com vectores de expressão, contendo genes que codificam para factores de crescimento, de modo que as próprias células produzam o factor. Qualquer modificação genética útil das células está dentro do âmbito da presente invenção. Por exemplo, adicionalmente à modificação genética das células para expressarem factores de crescimento, as células podem ser modificadas para expressarem outros tipos de agentes neurológicos, tal como neurotransmissores. De um modo preferido, a modificação genética é realizada por infecção das células revestindo regiões ventriculares com retrovirus recombinantes ou transfecção, utilizando métodos conhecidos na técnica, incluindo transfecção de CaPO.sub.4, transfecção de DEAE-dextrano, transfecção de polibreno, por fusão de protoplastos, electroporação, lipofecção e semelhantes (ver Maniatis et al., supra). Qualquer método de modificação genética, presentemente conhecido ou desenvolvido posteriormente, pode ser utilizado. Com transfecção de ADN directa, as células poderiam ser modificadas por bombardeamento de partículas, distribuição mediada por receptor e lipossomas catiónicos. Quando são utilizadas construções génicas quiméricas, as mesmas irão, em geral, conter promotores virais, por exemplo repetição terminal longa (LTR) retroviral, vírus símio 40 (SV40), citomegalovírus (CMVj; ou promotores específicos de célula de mamífero, tais como aqueles para TH, dbh, feniletanolamina N-metiltransferase, ChAT, GFAP, nse, as proteínas NF (NF-L, NF-M, NF-H e semelhantes) que dirigem a expressão dos genes estruturais codificando a proteína desejada. 55

As utilizações da invenção podem ser utilizadas para tratar qualquer mamífero adulto, incluindo humanos, vacas, cavalos, cães, ovelhas e gatos. De um modo preferido, as utilizações da invenção são utilizadas para tratar humanos. Num aspecto, a invenção proporciona um tratamento regenerativo para distúrbios neurológicos, estimulando células estaminais neuronais adultas a crescerem, proliferarem, migrarem, sobreviverem e/ou diferenciarem-se, de modo a substituírem células neuronais que foram perdidas ou destruídas. A estimulação in vivo de tais células estaminais pode ser alcançada através da administração local de um agente de modulação de neurogénese da invenção às células numa formulação apropriada. Através do aumento da neurogénese, células danificadas ou em falta podem ser substituídas, para melhorar a função sanguínea. Métodos para preparação das formas de dosagem do agente de modulação de neurogénese são conhecidos ou serão evidentes dos especialistas na técnica. A determinação de uma quantidade eficaz de um agente de modulação de neurogénese a ser administrado está dentro do conhecimento dos especialistas na técnica e será habitual para os especialistas na técnica. A quantidade de agente de modulação de neurogénese a ser administrado irá depender do tamanho exacto e estado do doente mas será, pelo menos, 0,1 ng/kg/dia, pelo menos, 1 ng/kg/dia, pelo menos, 5 ng/kg/dia, pelo menos, 20 ng/kg/dia, pelo menos, 100 ng/kg/dia, pelo menos, 0,5 pg/kg/dia, pelo menos, 2 pg/kg/dia, pelo menos, 5 pg/kg/dia, pelo menos, 50 pg/kg/dia, pelo menos, 500 pg/kg/dia, pelo menos, 1 mg/kg/dia, pelo menos, 5 mg/kg/dia ou, pelo menos, 10 mg ng/kg/dia, num volume de 0,001 a 10 mL. Noutro método de dosagem, o modulador pode ser administrado de modo que um tecido alvo alcance uma concentração de modulador de 0,0001 nM a 50 nM, 0,001 nM a 50 nM, 0,01 nM a 56 50 ηΜ, 0,1 ηΜ a 50 ηΜ, 0,1 ηΜ a 100 ηΜ ou, pelo menos, 1 ηΜ, pelo menos, 50 nM ou, pelo menos, 100 nM. Dosagens preferidas incluem administração subcutânea de, pelo menos, 10 mg duas vezes por semana ou, pelo menos, 25 mg duas vezes por semana; administração subcutânea de, pelo menos, 0,04 mg/kg/semana, pelo menos, 0,08 mg/kg/semana, pelo menos, 0,24 mg/kg/semana, pelo menos, 36 mg/kg/semana ou, pelo menos, 48 mg/kg/semana; administração subcutânea de, pelo menos, 22 mcg duas vezes por semana ou 44 mcg duas vezes por semana; ou administração intravenosa de, pelo menos, 3-10 mg/kg uma vez por mês. São gamas de dosagem particularmente preferidas 0,04 mg/kg a 4 mg/kg e 0,05 mg/kg a 5 mg/kg. Estas dosagens podem ser aumentadas lOx, lOOx ou lOOOx em aplicações transdérmicas ou tópicas.

As composições farmacêuticas adequadas, para utilização na presente invenção, incluem composições em que os ingredientes activos estão contidos numa quantidade eficaz para alcançar a sua finalidade pretendida. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade eficaz para estimular, de modo óptimo, a proliferação de células estaminais adultas. Será entendido que o teor unitário de ingrediente ou ingredientes activos contidos numa dose individual de cada forma de dosagem, não necessita de constituir, por si só, uma quantidade eficaz, uma vez que a quantidade eficaz necessária pode ser alcançada por meio de administração de uma pluralidade de unidades de dosagem (tais como cápsulas ou comprimidos ou suas combinações). Adicionalmente, compreende-se que a alguns níveis de dosagem, uma quantidade eficaz pode não mostrar qualquer efeito mensurável até depois de uma semana, um mês, três meses ou seis meses de utilização. Adicionalmente, compreende-se que uma quantidade eficaz pode encurtar a taxa da deterioração natural que surge com a idade mas não reverter a 57 deterioração que já tenha ocorrido. A determinação das quantidades eficazes está bem dentro da capacidade dos especialistas na técnica, especialmente à luz da divulgação detalhada aqui proporcionada. 0 nível específico de dose para qualquer particular utilizador irá depender de uma variedade de factores, incluindo a actividade do agente de modulação de neurogénese específico empregue, da idade, do nível de actividade física, saúde geral e da gravidade do distúrbio.

Uma dose terapeuticamente eficaz também se refere àquela quantidade necessária para alcançar o efeito desejado, sem efeitos secundários não desejados ou intoleráveis. A toxicidade e eficácia terapêutica de um agente de modulação de neurogénese podem ser determinadas por processos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais. Utilizando métodos padrão, a dosagem que mostra eficácia em cerca de 50% da população de teste, a ED50, pode ser determinada. A eficácia pode ser qualquer sinal de proliferação de células estaminais adultas. De modo semelhante, a dosagem que produz um efeito secundário indesejável a 50% da população, a SD50, pode ser determinada. Efeitos secundários indesejáveis incluem morte, feridas, erupções, vermelhidão anormal e semelhantes. A razão de dose entre efeito secundário e efeitos terapêuticos pode ser expressa como o índice terapêutico e este pode ser expresso como uma razão entre SD5o/ED5o. São preferidos agentes de modulação de neurogénese com elevados índices terapêuticos, i. e., agentes de modulação de neurogénese que são eficazes a dosagem baixa e que não têm efeitos secundários indesejáveis até doses muito elevadas. Um índice terapêutico preferido, é superior a cerca de 3, de um modo mais preferido, o índice terapêutico é superior a 10, de um modo muito preferido, o índice terapêutico é superior a 25, tal como, por exemplo, superior a 50. Além disso, são mais 58 preferidos os agentes de modulação de neurogénese que não têm efeitos secundários a quaisquer níveis de dosagem. Finalmente, são muito preferidos os agentes de modulação de neurogénese que são eficazes a dosagens baixas e não têm efeitos secundários a quaisquer niveis de dosagem. A exacta formulação, via de administração e dosagem podem ser escolhidas dependendo do efeito desejado e podem ser preparadas pelos especialistas na técnica.

Os intervalos de dosagem podem ser determinados por testagem experimental. Um ou mais agentes de modulação de neurogénese para utilização na invenção devem ser administrados utilizando um regime que mantém a proliferação de células estaminais adultas a cerca de 10% acima do normal, cerca de 20% acima do normal, cerca de 50% acima do normal, tal como 100% acima do normal, de um modo preferido, cerca de 200% acima do normal, de um modo mais preferido, cerca de 300% acima do normal e, de um modo muito preferido, cerca de 500% acima do normal. Numa forma de realização preferida, a composição farmacêutica para utilização na invenção pode compreender um agente de modulação de neurogénese da invenção a uma concentração compreendida entre cerca de 0,001% e cerca de 10%, de um modo preferido, entre cerca de 0,01% e cerca de 3%, tal como, por exemplo, cerca de 1%, em peso.

Outro método de administração adequado é proporcionar um agente de modulação de neurogénese da invenção através de um implante ou uma linha celular, capaz de expressar um agente de modulação de neurogénese (e. g., agente de modulação de neurogénese peptídico), de modo que o implante ou linha celular possa proporcionar o agente de modulação de neurogénese a uma célula do SNC. 59

Numa forma de realização preferida da invenção, o agente de modulação de neurogénese da invenção induz neurogénese na região da parede do ventrículo lateral do cérebro. Numa forma de realização mais preferida, o agente de modulação de neurogénese induz neurogénese na parede do ventrículo lateral mas não no hipocampo.

Os métodos da invenção podem ser utilizados para detectar agentes endógenos em células estaminais neuronais adultas que podem ser identificados utilizando RT-PCR ou técnicas de hibridação in situ. Em particular, podem ser identificados genes que são regulados positivamente ou regulados negativamente nestas células, na presença de um ou mais agentes de modulação de neurogénese da invenção. A regulação de tais genes pode indicar que os mesmos estão envolvidos na mediação de vias de transdução de sinal na regulação da função de neurogénese. Além disso, ao se conhecerem os níveis de expressão destes genes e através da análise das variações das sequências genéticas ou de aminoácidos nestes genes ou produtos génicos, pode ser possível diagnosticar a ndoença ou determinar o papel das células estaminais na doença. Tal análise irá proporcionar importante informação para utilização de tratamentos baseados em células para doença. 60 6. Método para Redução de um Sintoma de um Distúrbio através da Administração de Células Tratadas com agente(s) de Modulação de Neurogénese

Recolha de Células e Indução de Neurogénese:

Outra forma de realização da invenção é dirigida a um método para induzir células estaminais adultas a sofrerem neurogénese in vitro - de modo a produzir grande número de células neuronais capazes de se diferenciarem em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. A indução de proliferação e diferenciação de células estaminais podem ser realizadas através do cultivo das células em suspensão ou num substrato sobre o qual as mesmas podem aderir. As células induzidas podem ser utilizadas para tratamento terapêutico. Por exemplo, a terapia pode envolver, pelo menos, (1) proliferação e diferenciação de células neuronais in vitro, depois transplantação, (2) proliferação de células neuronais in vitro, transplantação, depois proliferação e diferenciação adicionais in vivo, (3) proliferação in vitro, transplantação e diferenciação in vivo e (4) proliferação e diferenciação in vivo. Deste modo, a invenção proporciona um meio para a produção de grande número de células para transplantação no tecido neuronal de um hospedeiro, para tratar doença neurodegenerativa e trauma neurológico, para métodos não cirúrgicos de tratamento de doença neurodegenerativa e trauma neurológico e para aplicações de rastreio de fármacos. A descendência de célula estaminal pode ser utilizada para transplantação num hospedeiro heterólogo, autólogo ou xenógeno. As células estaminais multipotentes podem ser obtidas de tecido neuronal embrionário, pós-natal, juvenil ou adulto ou outros tecidos. As células estaminais heterólogas humanas podem ser 61 derivadas de tecido fetal após aborto electivo ou de dador de órgão pós-natal, juvenil ou adulto. Tecido autólogo pode ser obtido por biopsia ou de doentes submetidos a cirurgia (e. g., neurocirurgia), na qual é removido tecido, por exemplo, durante cirurgia de epilepsia, lobectomias temporais e hipocampectomias. As células estaminais foram isoladas de uma variedade de regiões ventriculares de SNC adulto e proliferaram in vitro utilizando os métodos aqui detalhados. Em diversas formas de realização da invenção, o tecido pode ser obtido de qualquer animal, incluindo insectos, peixe, répteis, aves, anfibios, mamíferos. A fonte preferida de tecido (e. g., tecido neuronal) é de mamíferos, de um modo preferido, roedores e primatas e, de um modo muito preferido, murganhos e humanos.

No caso de um animal dador heterólogo, o animal pode ser eutanasiado e o tecido neuronal e área de interesse específica removida utilizando um processo estéril. Áreas de particular interesse incluem qualquer área a partir da qual podem ser obtidas células estaminais neuronais adultas, que irão servir para restaurar a função a uma área degenerada do sistema nervoso do hospedeiro, particularmente o SNC do hospedeiro. Áreas adequadas incluem o córtex cerebral, cerebelo, mesencéfalo, tronco cerebral, espinha dorsal e tecido ventricular e áreas do PNS, incluindo o corpo carotídeo e a medula adrenal. Áreas preferidas incluem regiões nos gânglios basais, de um modo preferido, o estriado que consiste no caudado e putâmen, ou diversos grupos de células, tais como o globus pallidus, o núcleo subtalâmico, o nucleus basalis que se verifica ser degenerado em doentes de doença de Alzheimer, ou a substantia nigra pars compacta que se verifica ser degenerada em doentes de Doença de Parkinson. 0 tecido neuronal particularmente preferido, é obtido de tecido ventricular que se verifica 62 revestir ventrículos do SNC e inclui o subepêndima. 0 termo "ventrículo" refere-se a qualquer cavidade ou corredor dentro do SNC através do qual flui fluido espinal cerebral. Deste modo, o termo abrange não apenas os ventrículos lateral, terceiro e quarto, mas também abrange o canal central, aqueduto cerebral e outras cavidades do SNC. Células podem ser obtidas de tecido dador (e. g., tecido neuronal) por dissociação de células individuais da matriz extracelular de ligação do tecido. Tecido de uma particular região neuronal é removido do cérebro utilizando um processo estéril e as células são dissociadas utilizando qualquer método conhecido na técnica, incluindo tratamento com enzimas, tais como tripsina, colagenase e semelhantes ou através da utilização de métodos físicos de dissociação, tal como com um instrumento rombo. Dissociação de células fetais pode ser efectuada em meio de cultura de tecidos, enquanto um meio preferido, para dissociação de células juvenis e adultas é fluido espinal cerebral artificial pobre em Ca2+ (aCSF). aCSF regular contém NaCl a 124 mM, KC1 a 5 mM, MgCl2 a 1,3 mM, CaCl2 a 2 mM, NaHC03 a 26 mM e D-glucose a 10 mM. aCSF pobre em Ca2+ contém os mesmos ingredientes, à excepção de MgCl2 a uma concentração de 3,2 mM e CaCl2 a uma concentração de 0,1 mM. As células dissociadas são centrifugadas a baixa velocidade, entre 200 e 2000 rpm, habitualmente entre 400 e 800 rpm e, depois, ressuspensas em meio de cultura. As células podem ser cultivadas em suspensão ou num substrato fixo. Contudo, os substratos tendem a induzir diferenciação da descendência de célula estaminal neuronal. Deste modo, as culturas de suspensão são preferidas se for desejado um grande número de descendência de célula estaminal neuronal não diferenciada. As suspensões celulares são semeadas em qualquer receptáculo capaz de suster células, particularmente 63 frascos de cultura, placas de cultura ou garrafas roladoras e, mais particularmente, em pequenos frascos de cultura, tal como frascos de cultura de 25 cm2. As células cultivadas em suspensão são ressuspensas a, aproximadamente, 5 x 104 a 2 x 301 células/mL, de um modo preferido, 1 x 105 células/mL. As células plaqueadas num substrato fixo são plaqueadas a, aproximadamente, 2-3 x 103 células/cm2, de um modo preferido, 2,5 x 103 células/cm2.

As células neuronais dissociadas podem ser colocadas dentro de qualquer meio de cultura conhecido capaz de suportar o crescimento celular, incluindo HEM, DMEM, RPMI, F-12 e semelhantes, contendo suplementos que sejam requeridos para metabolismo celular, tais como glutamina e outros aminoácidos, vitaminas, minerais e proteínas úteis, tal como transferrina e semelhantes. Métodos para cultivar células neuronais são conhecidos. Ver as patentes US 5980885, 5851832, 5753506, 5750376, 5654183, 5589376, 5981165 e 5411883. Uma forma de realização preferida para proliferação de células estaminais é utilizar um meio de cultura definido, isento de soro (e. g., Meio Completo), visto que o soro tende a induzir diferenciação e contém componentes desconhecidos (í. e., é indefinido). Um meio de cultura definido também é preferido, se as células forem para ser utilizadas para fins de transplantação. Um meio de cultura particularmente preferido, é um meio de cultura definido compreendendo uma mistura de DMEM, F12 e uma hormona definida e mistura salina. As condições para cultivar devem ser próximas de condições fisiológicas. O pH do meio de cultura deve ser próximo do pH fisiológico, de um modo preferido, entre pH 6-8, de um modo mais preferido, entre cerca de pH 7 a 7,8, com pH 7,4 sendo muito preferido. As temperaturas fisiológicas variam entre cerca de 30 °C e 40 °C. As células são cultivadas, de um modo preferido, a temperaturas entre cerca de 32 °C e cerca de 38 °C e, de um modo mais preferido, entre cerca de 35 °C e cerca de 37 °C. 0 meio de cultura é suplementado com, pelo menos, um agente de modulação de neurogénese da invenção. 0 número da descendência de célula estaminal neuronal proliferada in vitro a partir do SNC de mamifero pode ser aumentado ou drasticamente mantido, através da colocação em contacto da cultura celular com um factor de modulação de neurogénese da invenção. Esta capacidade de estimular a proliferação de células estaminais é de grande valor quando células estaminais forem para ser recolhidas para transplantação posterior de volta a um doente tornando, desse modo, a cirurgia inicial 1) menos traumática, em virtude de que menos tecido teria de ser removido 2) mais eficiente, em virtude de que um rendimento maior de células estaminais por cirurgia proliferaria in vitro; e 3) mais segura, em virtude de probabilidade reduzida para mutação e transformação neoplásica, com tempo de cultura reduzido. Opcionalmente, as células estaminais do doente, logo que tenham proliferado in vitro, também poderiam ser geneticamente modificadas in vitro utilizando as técnicas descritas abaixo. A modificação genética in vitro pode ser mais desejável em determinadas circunstâncias do que técnicas de modificação genética in vivo, quando é requerido mais controlo sobre a infecção com o material genético.

Após proliferação, a descendência de célula estaminal pode ser criopreservada, por qualquer método conhecido na técnica, até que seja necessária. Numa forma de realização preferida da invenção, as células são derivadas da região da parede do ventrículo lateral do cérebro. Noutra forma de realização 65 preferida da invenção, as células são derivadas do SNC mas não do hipocampo.

Diferenciação Celular: São incluídos na invenção métodos de utilização dos agentes de modulação de neurogénese divulgados, de modo a aumentar ou manter a proliferação de células estaminais adultas in vitro e obter grande número de células diferenciadas. A diferenciação das células pode ser induzida por qualquer método conhecido na técnica. Num método preferido, a diferenciação é induzida através da colocação em contacto da célula com um agente de modulação de neurogénese da invenção que activa a cascata de eventos biológicos que conduz a crescimento e diferenciação. Como divulgado nesta invenção, estes eventos incluem elevação de cAMP e Ca2+ intracelular. A diferenciação celular pode ser monitorizada através da utilização de anticorpos para antigénios específicos para neurónios, astrócitos ou oligodendrócitos podem ser determinados por técnicas de imunocitoquímica bem conhecidas na técnica. São conhecidos muitos marcadores específicos de neurónios. Em particular, marcadores celulares para neurónios incluem NSE, NF, beta-tub, MAP-2; e para a glia, GFAP (um identificador de astrócitos), galactocerebrósido (GalC) (um identificador glicolípido de mielina de oligodendrócitos) e semelhantes. A diferenciação também pode ser monitorizada por histoquímica de hibridação in sítu que também pode ser realizada utilizando sondas de ADNc ou arn específicas para neurotransmissor peptídico ou ARNm de enzima sintetizando neurotransmissor. Estas técnicas podem ser combinadas com métodos de imunocitoquímica, de modo a melhorar a identificação 66 de fenótipos específicos. Se necessário, pode ser realizada análise adicional por processos de transferência de Western e de Northern.

Um método preferido, para a identificação de neurónios utiliza imunocitoquímica para detectar imunorreactividade para NSE, NF, NeuN e a proteína específica de neurónio, tau-1. Em virtude de estes marcadores serem altamente fiáveis, os mesmos continuarão a ser úteis para a identificação primária de neurónios, contudo os neurónios também podem ser identificados com base no seu fenótipo neurotransmissor específico, como anteriormente descrito. Astrócitos de tipo I, que são células gliais diferenciadas que têm uma morfologia achatada, do tipo protoplasmática/fibroblasto, são, de um modo preferido, identificados pela sua imunorreactividade para GFAP, mas não A2B5. Astrócitos de tipo II, que são células gliais diferenciadas que exibem uma morfologia de rolamento de processo estrelado são, de um modo preferido, identificados utilizando imunocitoquímica pelo seu fenótipo GFAP(+),fenótipo A2B5(+).

Administração de células tratadas com um Método da Invenção:

Após expansão in vitro e neurogénese utilizando um método da invenção (ver, secção de Exemplo para uma descrição em detalhe destes métodos), as células podem ser administradas a qualquer animal com sintomas neurológicos ou neurodegenerativos anormais, obtidos de qualquer modo, incluindo aqueles obtidos como resultado de lesões mecânicas, químicas ou electrolíticas, como resultado de aspiração experimental de áreas neuronais ou como resultado de processos de envelhecimento. As lesões 67 particularmente preferidas em modelos animais não humanos são obtidas com β-hidroxi-dopamina (6-OHDA), l-metil-4-fenil-1, 2,3, 6 tetra-hidropiridina (MPTP), ácido iboténico e semelhantes.

Os métodos da presente invenção permitem a utilização de células estaminais adultas que sejam xenógenas para o hospedeiro. Os métodos da invenção são aplicados a estas células (como mostrado nos Exemplos), de modo a expandir o número total ou percentagem total de células estaminais neuronais em cultura, antes de utilização. Uma vez que o SNC é um local um tanto imunoprivilegiado, a resposta imunitária é significativamente menor para xenoenxertos do que em qualquer outra parte no corpo. Em geral, contudo, para que os xenoenxertos sejam bem-sucedidos, prefere-se que seja empregue algum método de redução ou eliminação da resposta imunitária para o tecido implantado. Deste modo, os receptores irão frequentemente ser imunossuprimidos através da utilização de fármacos imunossupressores, tal como ciclosporina, ou através de estratégias de imunossupressão local empregando imunossupressores aplicados localmente. A imunossupressão local é divulgada por Gruber, Transplantation 54:1-11 (1992). Rossini, Pat. U.S. N° 5026365, divulga métodos de encapsulação adequados para imunossupressão local.

Como uma alternativa à utilização de técnicas de imunossupressão, métodos de substituição génica ou nocaute, utilizando recombinação homóloga em células estaminais embrionárias, ensinada por Smithies et al. (Nature 317:230-234 (1985) e alargada à substituição génica ou nocaute em linhas celulares (H. Zheng 35 al., PNAS, 88:8067-8071 (1991)), podem ser aplicados a células precursoras para a ablação de genes do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). As células 68 desprovidas de expressão de MHC poderiam permitir o enxerto de populações celulares neuronais enriquecidas através de barreiras de histocompatibilidade alógenas e, talvez mesmo, xenógenas, sem a necessidade de imunossuprimir o receptor. Revisões gerais e citações para a utilização de métodos recombinantes para reduzir antigenicidade de células dadoras também são divulgadas por Gruber (supra). Abordagens exemplificativas à redução de imunogenicidade de transplantes por modificação de superfície são divulgadas por Faustman, documento WO 92/04033 (1992). Alternativamente, a imunogenicidade do enxerto pode ser reduzida através da preparação de células precursoras de um animal transgénico que tem antigénios de MHC alterados ou delecionados. O enxerto de células preparadas a partir de tecido que é alógeno ao do receptor irá, muito frequentemente, utilizar tipagem de tecido num esforço para muito estreitamente fazer corresponder o tipo de histocompatibilidade do receptor. Idade de célula dadora, assim como idade do receptor, foram demonstradas como sendo factores importantes no melhoramento da probabilidade de sobrevivência de enxerto neuronal. A eficiência de enxerto é reduzida com idade aumentada de células dadoras. Além disso, os enxertos são mais facilmente aceites por receptores mais jovens em comparação com receptores mais velhos. Estes dois factores são susceptiveis de serem tão importantes para sobrevivência de enxerto glial como o são para sobrevivência de enxerto neuronal. Em alguns casos, pode ser possivel preparar células do próprio sistema nervoso do receptor (e. g., no caso de remoção de biopsias de tumor, etc.). Em tais casos, as células podem ser produzidas a partir de tecido dissociado e proliferadas in vitro, utilizando os métodos anteriormente descritos. Após expansão adequada do número de células, as células podem ser recolhidas, geneticamente 69 modificadas se necessário, e preparadas para injecção directa dentro do SNC do receptor. A transplantação pode ser realizada de modo bilateral ou, no caso de um doente sofrendo de Doença de Parkinson, contralateral ao lado mais afectado. A cirurgia é realizada num modo no qual particulares regiões cerebrais podem ser localizadas, tal como em relação a suturas cranianas, particularmente com uma guia estereotáxica. As células são distribuídas a qualquer área neuronal afectada, em particular aos gânglios basais e, de um modo preferido, ao caudado e putâmen, ao nucleus basalis ou à substantia nigra. As células são administradas à particular região utilizando qualquer método que mantenha a integridade de áreas circundantes do cérebro, de um modo preferido, por cânula de injecção. São preferidos métodos de injecção exemplificados por aqueles utilizados por Duncan et al. J. Neurocytology, 17:351-361 (1988) e ampliados proporcionalmente e modificados para utilização em humanos. Métodos ensinados por Gage et al., supra, para a injecção de suspensões celulares, tal como fibroblastos dentro do SNC, também podem ser empregues para injecção de células precursoras neuronais. Abordagens e métodos adicionais podem consultar-se em Neuronal Grafting in the Mammalian SNC (1985) Bjorklund e Stenevi, eds.

Embora fragmentos de tecido sólido e suspensões celulares de tecido neuronal sejam imunogénicos como um todo, poderia ser possível que tipos individuais de células dentro do enxerto fossem eles próprios imunogénicos em menor grau. Por exemplo, Bartlett et al. {Prog. Brain Res. 82: 153-160 (1990)) ab-rogaram a rejeição de enxerto alógeno neuronal, através da pré-selecção de uma subpopulação de células neuroepiteliais embrionárias para 70 enxerto através da utilização de separação de imunoesférulas, com base em expressão de MHC. Deste modo, é proporcionada outra abordagem para reduzir as probabilidades de rejeição de aloenxerto e xenoenxerto pelo receptor, sem a utilização de técnicas de imunossupressão.

As células, quando administradas à particular região neuronal formam, de um modo preferido, um enxerto neuronal, em que as células neuronais formam ligações neuronais ou sinápticas normais com neurónios vizinhos e mantêm contacto com células gliais transplantadas ou existentes que podem formar bainhas de mielina em torno dos axónios dos neurónios e proporcionar uma influência trófica para os neurónios. Como estas células transplantadas formam ligações, as mesmas restabelecem as redes neuronais que tenham sido danificadas em virtude de doença e envelhecimento. A sobrevivência do enxerto no hospedeiro vivo pode ser examinada utilizando diversos rastreios não invasivos, tais como tomografia axial computorizada (rastreio CAT ou rastreio CT), ressonância magnética nuclear ou ressonância magnética de imagiologia (NMR OU MRI) ou, de um modo mais preferido, rastreios de tomografias de emissão de positrões (PET). Examinação post mortem de sobrevivência de enxerto pode ser realizada através da remoção do tecido neuronal e examinação da região afectada macroscopicamente ou, de um modo mais preferido, utilizando microscopia. As células podem ser coradas com quaisquer corantes visíveis sob condições de microscopia óptica ou electrónica, de um modo mais particular, com corantes que são específicos para neurónios e glia. São particularmente úteis anticorpos monoclonais que identificam marcadores de superfície celular neuronais, tal como o anticorpo M6 que identifica 71 neurónios de murganho. São muito preferidos anticorpos que identificam quaisquer neurotransmissores, particularmente aqueles dirigidos para GABA, TH, ChAT e substância P e para enzimas envolvidas na síntese de neurotransmissores, em particular, GAD. As células transplantadas também podem ser identificadas por incorporação prévia de corantes marcadores, tais como microsferas marcadas com rodamina ou fluoresceína, fast blue, bisbenzamida ou marcadores histoquímicos introduzidos de modo retroviral, tal como o gene lac Z que produz beta-galactosidase. A integração funcional do enxerto dentro do tecido neuronal do hospedeiro pode ser avaliada através da examinação da eficácia de enxertos a restaurarem diversas funções, incluindo mas não limitadas a testes para funções endócrinas, motoras, cognitivas e sensoriais. Testes motores que podem ser utilizados incluem aqueles que quantificam movimento rotacional afastado do lado degenerado do cérebro e aqueles que quantificam lentidão de movimento, equilíbrio, coordenação, acinesia ou ausência de movimento, rigidez e tremores. Testes cognitivos incluem diversos testes de capacidade para realizar tarefas do dia-a-dia, assim como diversos testes de memória, incluindo desempenho de labirinto.

As células estaminais adultas podem ser produzidas e transplantadas utilizando os processos anteriores para tratar doenças de desmielinização, como aqui descrito em detalhe. Doenças desmielinizantes humanas, relativamente às quais as células produzidas pelos métodos da presente invenção podem proporcionar tratamento, incluem encefalomielite perivenosa disseminada, MS (tipos Charcot e Marburg), neuromielite óptica, esclerose concêntrica, encefalomielitides agudas, disseminadas, 72 pós-encefalomielite, encefalomielite pós-vacinal, leucoencefalopatia hemorrágica aguda, leucoencefalopatia multifocal progressiva, polineurite idiopática, neuropatia diftérica, doença de Pelizaeus-Merzbacher, neuromielite óptica, esclerose cerebral difusa, mielinólise pontina central, leucodistrofia espongiforme e leucodistrofia (tipo Alexander). Áreas de desmielinização em humanos estão, em geral, associadas a estruturas do tipo placa. As placas podem ser visualizadas por imagiologia de ressonância magnética. As placas acessíveis são a área alvo para injecção de descendência de célula estaminal neuronal preparada pelo método da invenção. São utilizados métodos neurocirúrgicos estereostáticos padrão para injectar suspensões celulares tanto dentro do cérebro como espinha dorsal. Em geral, as células podem ser obtidas de quaisquer das fontes anteriormente discutidas. Contudo, no caso de doenças desmielinizantes, com uma base genética afectando directamente a capacidade da célula de formação de mielina mielinizar axónios, tecido alógeno seria uma fonte preferida das células, uma vez que tecido autólogo (i. e., as células do receptor) não seria, em geral, útil, a menos que as células fossem modificadas de alguma forma, de modo a garantir que a lesão não iria continuar (e. g., modificando geneticamente as células para curar a lesão de desmielinização).

Oligodendrócitos derivados de células proliferadas e diferenciadas in vitro podem ser injectados dentro de áreas alvo desmielinizadas no receptor. Também podem ser injectadas quantidades apropriadas de astrócitos de tipo I. Astrócitos de tipo I são conhecidos por segregarem PDGF que promove a migração e a divisão celular de oligodendrócitos (ver, e. g., Nobel 73

Nature 333:560-652 (1988); Richardson et al., et al., 53:309-319 (1988)).

Cell,

Um tratamento preferido, da doença de desmielinização utiliza células não diferenciadas (e. g., células estaminais ou células progenitoras). Neurosferas cultivadas utilizando um método da invenção podem ser dissociadas, de modo a obter células individuais que são, depois, colocadas em meio de injecção e injectadas directamente dentro da região alvo desmielinizada. As células diferenciam-se in vivo. Astrócitos podem promover remielinização em diversos paradigmas. Por conseguinte, nos casos onde a proliferação de oligodendrócito seja importante, a capacidade de células precursoras darem origem a astrócitos de tipo I pode ser útil. Em outras situações, PDGF pode ser aplicado topicamente durante a transplantação assim como, a seguir, com doses repetidas ao local de implante.

Qualquer método adequado para a implantação de células próximo dos alvos desmielinizados pode ser utilizado, de modo que as células possam ficar associadas aos axónios desmielinizados. As células gliais são dotadas de motilidade e são conhecidas por migrarem, ao longo e através dos seus alvos neuronais permitindo, desse modo, o espaçamento de injecções. A remielinização pela injecção de células é uma terapêutica útil numa ampla gama de estados desmielinizantes. Deve também ter-se presente que, em algumas circunstâncias, a remielinização por células não irá resultar em remielinização permanente e serão requeridas injecções ou cirurgias repetidas. Tais abordagens terapêuticas oferecem vantagem em relação a deixar o estado não tratado e podem poupar a vida do receptor. 74

Todas as utilizações desta divulgação envolvem administração do agente de modulação de neurogénese da invenção. A administração pode utilizar vias conhecidas, incluindo aquelas aqui descritas. Como exemplos não limitativos, um ou mais agentes de modulação de neurogénese podem ser administrados oralmente ou por injecção. 0 termo injecção, em todo este pedido, abrange todas as formas de injecção conhecidas na técnica e, pelo menos, os métodos de injecção mais geralmente descritos, tais como injecção subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intracerebroventricular, intraparenquimal, intratecal e intracraniana. Se a administração for por meios que não a injecção, todos os meios conhecidos estão contemplados, incluindo administração através da mucosa bucal, nasal ou rectal. Sistemas de distribuição geralmente conhecidos incluem administração por fusão peptidica, de modo a melhorar a absorção ou por meio de sistemas de distribuição micelares ou lipossomais.

As utilizações da invenção podem ser testadas em modelos animais de doenças neurológicas. Existem muitos desses modelos. Por exemplo, os mesmos são listados em Alan A Boulton, Glen B Baker, Roger F Butterworth "Animal Models of Neurological Disease", Humana Press (1992) e Alan A Boulton, Glen B Baker, Roger F Butterworth "Animal Models of Neurological Disease II", Blackwell Publishing (2000) . Também, modelos de murganho para as seguintes doenças podem ser adquiridos por um fornecedor comercial, tal como o Jackson Laboratory: Doença de Alzheimer, Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), sindrome de Angelman, Defeitos de Astrócito, Defeitos de Ataxia (Movimento), Defeitos de Comportamento e Aprendizagem, Defeitos Cerebelosos, Defeitos de Canais e Transportadores, Ritmos Circadianos, Defeitos Corticais, Epilepsia, Sindrome de Retardação Mental de X Frágil, 75 doença de Huntington, Defeitos Metabólicos, Defeitos de Mielinização, Defeitos de Tubo Neuronal, Neurodegenerescência,

Defeitos Neurodesenvolvimentais, Defeitos Neuromusculares, Tensão de Facilidade de Mutagénese de Neurociência, Defeitos de Receptor de Neurotransmissor e Vesícula Sináptica, Defeitos de Factor Neurotrófico, Doença de Parkinson, Defeitos de Receptor, Resposta a Catecolaminas, Tremura, Defeitos de Tremura e Defeitos Vestibulares e Audição. (Ver, e. g., http://jaxmice.jax.org/jaxmicedb/html/sbmodel 13.shtml; mais de 100 estirpes de modelos de murganho de doenças neurológicas são listadas em http://jaxmice.jax.org/jaxmicedb/html/model_13.shtml). Os modelos de rato de doenças neurológicas são numerosos e podem consultar-se, por exemplo, em revisões recentes (e. g., Cenci, Whishaw e Schallert, Nat Rev Neurosci. Julho de 2002;3(7): 574-9) . Um especialista na técnica, lendo esta divulgação, seria capaz de utilizar os resultados desta divulgação para conceber modelos de teste animal, de modo a determinar eficácia in vivo. Ver, também, o Exemplo 13.

Modelos animais de doenças neurológicas incluem, pelo menos, as seguintes estirpes de murganho: 129-Akp2rm/Sor 129-Col4a3rm/Dec 129-Cstbrm/Rm 129-Edn3rm/Ywa 129-FYnrm/Sor 129- Shhrm2Amc

129/Sv-Csktm/Soi: 129/S v-Kcneltm/sfh 129/Sv-Noqtm/M,c 129Pl/ReJ 129Pl/ReJ--Lama2dy 129P3/J 129P3/JEms 129P4. Cg-AxinF7+ 129P4/RrRk 12 9 S-Adprtltm/Zqw 129S-Ssttm/Utd 129S1 -HprttmI <cre)Mnn 129S1/S v-p+ Tyr Kit Isi~J/ + 129Sl/SvImJ 129S4/SvJa e-Ntf5tmIJae 129S6-Cln3tmINbm 129S6/SvEvTac-AtmtmIAwb 129Xl/SvJ 129Xl/SvJ-PrlrtmICnp ABP.EL- (D2Mitl32-D2Mitl03)/Frk ABP,EL-{D2Mitl33-D2Mit30)/Frk ABP.EL-

(D2Mit422-D2Mit21)IFrk ABP.EL-E12e ABP/Le AK.B6-Cln8mndl+ ALR/LtJ ALS/LtJ B10 .PA-Pldnpa H3e a7Sn B6 x B10.A-H2a H2-T187SqSnJ- Lmxladr~7J B6 x B10.Q- -H2q/SgJ-het 2J/ + B6 x B6CBCa Aw~J/A-Myo5af/r 76

Gnb5flr B6 x BALB/cBy-cla B6 x BALB/cByJ-Grid2LcJ/+ B6 x BALB/cByJ-Lpinlfld/ + B6 x BALB/cByJ-mceph/+ B6 x C57BLKS-.m Lepr^ Myol5sh2J B6 x STOCK Tyrc~ch Bmp5se +1+ Myo6sv B6 x STOCK a p Hps5ru2 Ednrb3 B6 x STOCK het B6 x STOCK rb B6-Pax3Sp. Cq-N B6.129-Tq (Pcp2-cre) 2Mpln B6.129-Abcdltm/Kan B6.129-Adra2ctmIGsb B6.129-ApoetmIUunc LdlrerrmIHer B6.129-AscllrmIAnd B6.129-BlmhtmIGeb B6.129-CalbltmIMpin B6.129-pintmIGos B6.129-GabrdtmIGeh B6.129-Gria2tmIRod B6.129-Grm4tmIHpn B6.129-Grm5tmIRod B6.129-Hdhtm3Mem B6.129-Hdhtm4Mem B6.129-Hdhtm5Mem B6.129-Htr2ctmIJul B6.129-IduatmIclk B6.129 -Kif3armIGsn B6.129-Penk-rstmIplg B6.129 -PsenltmIshn B6.129P1 -Lama2dy B6.129 P2(C)~ Mecp2tm/ 4 IBird B6.129 P2-ApobtmIUnc B6.129P2-ApoetmIUnc B6.129P2-Camk2atmISva B6.129P2-FmrItmICgr B6.129P2-Hprtb~m3 B6.129P2-NcamItmICgn B6 A29P2-PrlrtmICnp B6.129P2-PsaptmISuz B6.129S-Kns2tmIGsn B6.129S1-CncatmIN9°r B6 A29Sl-Grik2tmIsfh B6.129S1 -MapklOtmIFlv B6.129S1-ThrbtmIDf B 6.12 9 S 2 -Adra2atmILel B6.129S2-CrhrmIMãj B6.129S2 -Drd2tmILow B6.129S2-EnltmIAlj B6.129S2-Ntrk2tmIBbd B6.129S2-PomcItjrÍlLoi,f B6.129S3-Twistlpde B6 A29S4-BdnfrmIJãC B6.129S4-Cdk5rtmILht B6.129S4-Cdk5tmIKul B6.129S4-DrdlaunIJcd B6 129S4-Drd3tfflIPac B6 12954 HdhtmIMem B6.129S4-HqstmISor B6 A29S4-NqfrtmIJãe B6 129S4-NosltmIPth B6 129S4-Ntf3tmlJae B6 129S4-Ntf3tm2Jãe B6 12954-PdyntmIute B6 129S4-rrgpvltfflIJui

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TqN(S0D1)2Gur B6Cq-TqN(SOD1-G93A) dllGur B6Cq-

TqN(tetFosb) 4468Nes B6 . Cq-Atp7aMo^bl° B6 . Cg-Atp7aMo~pew2J B6 . Cq- 77

Atp7aMo~ro B6. Cq-Cln6ncIf B6.Cq -FbnlTsk +/ + Pldnpo B6.C q-Glrbspa B6 . Cq-Kitlsl Ca B6 . Cq-Kitw~24J B6.C q-Kitw~25J B6 .Cg-Mitf^'^ B6 . Cg- Mi t fMi-wh jMi tfMi B g _ Cq_Mi t fMi-wh / Mitfmlrw B6. Cq-MitfMi wh/Mitfmi sp B6 . Cq-Μγο 7asM^8J B6.Cg-Os +/ + Cacnalatg~la B6.Cq-Otopl1^ B6.Cq- Pldnpa B6. Cq-Pmp22Tr~J Re/+ + B6. Cq-Rorasg + +/+ Myo5ad Bmp5se B6 .Cq~Rorag/+ B6.C q-T2J +/+ Ok B6-Cq-Uspl4a> Í-J B6 . Cq-enrTg(MpbReg> 36Pop B6.Cg-wí Tyrplb/+ + B6.D2 -Cacnala19 B6.D2 -Car2n B6.b2-Kitlsl~d/+ B6.D2 .Kitw~45J Β6.Ό2 -Kitw~73J B6.D2 -Pmp22Tr~J B6 .O2-ínqls/ J e B6 .KB2-Cln8mnd/MsrJ. Outros modelos animais incluem estirpes que contêm as mesmas mutações que as estirpes anteriormente descritas, mas num fundo genético diferente.

Outro exemplo, os agentes de modulação de neurogénese desta divulgação podem ser testados nos seguintes modelos animais de doença/distúrbios/trauma do SNC, de modo a demonstrar recuperação. Modelos de epilepsia incluem, pelo menos, ataques induzidos por electrochoque (Billington A et ai., Neuroreport 2000 Nov 27; 11(17):3817-22), pentileno-tetrazol (Gamaniel K et al., Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 1989 Fev; 35(2):63-8) ou ataques induzidos por ácido cainico (Riban V et al., Neuroscience 2002;112 (1) : 101-11) . Modelos de psicose/esquizofrenia incluem, pelo menos,

estereotipias/locomoção induzidas por anfetamina (Borison RL & Diamond BI, Blol Psychlatry 1978 Abril; 13(2):217-25), estereotipias induzidas por MK-801 (Tiedtke et al., J neuronal Transm Gen Sect 1990; 81(3):173-82), induzidas por MAM (metilo-azoxi-metanol) (Fiore M et al., Neuropharmacology 1999 Jun; 38 (6) : 857-69; Talamini LM et al., Brain Res 1999 Nov 13; 847(1):105-20) ou modelo reeler (Ballmaier M et al., Eur j Neurosci 2002 Abril; 15(17):1197-205). Modelos de doença de Parkinson incluem, pelo menos, degenerescência induzida por MPTP (Schmidt & Ferger, J Neuronal Transm 2001; 108(11):1263-82), 78 6-OH dopamina (0'Dell & Marshall, Neuroreport 1996 Nov 4; 7 (15-17):2457-61). Modelos de doença de Alzheimer incluem, pelo menos, modelo de lesão de fímbria fórnice (Krugel et ai., Int J Dev Neurosci 2001 Jun; 19(3):263-77), modelo de lesão de prosencéfalo basal (Moyse E et ai., Brain Res 1993 Abril 2; 607 (1-2):154-60). Modelos de acidente vascular cerebral incluem, pelo menos, isquemia Focal (Schwartz DA et ai., Brain Res Mol Brain Res 2002 Maio 30; 101(1—2):12-22); isquemia global (oclusão de 2 ou 4 vasos) (Roof RL et ai., Stroke 2001 Nov; 32(11):2648-57; Yagita Y et ai., Stroke 2001 Ago; 32(8): 1890-6). Modelos de esclerose múltipla incluem, pelo menos, encefalomielite auto-imune experimental induzida por glicoproteína de oligodendrócito de mielina (Slavin A et ai., Autoimmunity 1998; 28(2):109-20). Modelos de esclerose lateral amiotrófica incluem, pelo menos, o modelo de murganho pmn (Kennel P et ai., J Neurol Sei 2000 Nov 1; 180(1-2):55-61). Modelos de ansiedade incluem, pelo menos, teste plus-maze elevado (Holmes A et ai., Behav Neurosci 2001 Out; 115(5):1129-44), teste de enterramento de berlinde (Broekkamp et ai., Eur J Pharmacol 1986 Jul 31; 126(3):223-9), teste de campo aberto (Pelleymounter et ai., J Pharmacol Exp Ther 2002 Jul; 302(1):145-52). Modelos de depressão incluem, pelo menos, teste de incapacidade aprendida, teste de natação forçada (Shirayama Y et ai., J Neurosci 2002 Abril 15; 22(8):3251-61), bulbectomia (0'Connor et ai., Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 1988; 12(1):41-51) . Modelo para aprendizagem/memória inclui, pelo menos, teste de labirinto de água de Morris (Schenk F & Morris RG, Exp Brain Res 1985;58(1):11-28) . Modelos para doença de Huntington incluem, pelo menos, injecção de ácido quinolínico (Marco S et ai., J Neurohiol 2002 Mar; 50(4):323-32), transgénicos/knock-ins (revisto em Menalled LB e Chesselet MF, tendência Pharmacol Sei. 2002 Jan; 23(1):32-9). Modelos de 79 animal idoso incluem, pelo menos, a utilização de animais velhos, tais como murganhos velhos e ratos velhos.

Os GPCR, listados ou referidos neste pedido, são úteis como marcadores para populações especificas de células estaminais/progenitoras adultas, em particular aNSC/progenitores, ou podem servir como diagnóstico. Compostos farmacologicamente activos (incluindo agentes para destruição de ARNm) que interagem com estes GPCR ou seus ARNm correspondentes podem modular a proliferação, diferenciação, sobrevivência ou migração de células estaminais adultas e servem como terapêutica para doenças degenerativas ou psiquiátricas/neurológicas, trauma ou lesão. Estes podem ser utilizados in vitro como marcadores para seleccionar tipos de células desejadas para transplantação. Os compostos ou receptores referidos neste pedido, são ferramentas úteis na identificação de novos fármacos e terapias relacionados com proliferação, diferenciação, sobrevivência e migração de células estaminais.

Exemplos

Salvo indicação em contrário, todas as experiências foram realizadas utilizando técnicas padrão de biologia molecular e que também são descritas no pedido U.S. co-pendente 10/429062, apresentado a 2 de Maio de 2003. EXEMPLO 1: Reagentes

Substâncias químicas para dissociação de tecido incluíram tripsina, hialuronidase e DNase (todas adquiridas à SIGMA). Meio 80 (DMEM glucose a 4,5 mg/mL e DMEM/F12), suplemento B27 e tripsina/EDTA foram adquiridos à GIBCO. Todos os recipientes em plástico foram adquiridos à CorningCostar. EGF para culturas celulares foi adquirido à BD Biosciences e o kit ATP-SL foi adquirido à BioThema.

Para as substâncias de teste, a biblioteca foi adquirida a Phoenix pharmaceuticals Inc, EUA, variety Pack Peptide Library (#L-001). Compostos adquiridos à Sigma-Aldrich incluíram forscolina (#F6886), rolipram (#R6520), n-6, 2-o-dibutiriladenosina (#D0260), toxina da cólera (#C8052), MECA (#A024), HE-NECA (#H8034), nor-Binaltorfimina (#N1771) e hormona adrenocorticotrópica (#A0298). EXEMPLO 2: Culturas de neurosferas de murganho A parede lateral anterior do ventrículo lateral de murganhos de 5-6 semanas de idade foi enzimaticamente dissociada em hialuronidase a 0,8 mg/mL e tripsina a 0,5 mg/mL, em DMEM contendo glucose a 4,5 mg/mL e 80 unidades/mL de DNase, a 37 °C, durante 20 minutos. As células foram suavemente trituradas e misturadas com meio Neurosfera (DMEM/F12, suplemento B27, HEPES a 12,5 mM, pH 7,4), 100 unidades/mL de penicilina e estreptomicina a 100 pg/mL. Após passagem através de um passador de 70 pm, as células foram sedimentadas a 200 x g, durante 4 minutos. O sobrenadante foi subsequentemente removido e as células foram ressuspensas em meio Neurosfera, suplementado com EGF a 3 nM. As células foram plaqueadas em placas de cultura e incubadas a 37 °C. As neurosferas estavam prontas a ser decompostas a, aproximadamente, 7 dias após plaqueamento. 81

De modo a decompor culturas de neurosferas, as neurosferas foram recolhidas por centrifugação a 200 x g, durante 4 minutos. As neurosferas foram ressuspensas em 0,5 mL de tripsina/EDTA em HBSS (lx), incubadas a 37 °C, durante 2 minutos e trituradas suavemente, de modo a auxiliar a dissociação. Após outra incubação de 3 minutos, a 37 °C e trituração, as células foram sedimentadas a 220 x g, durante 4 minutos. As células foram ressuspensas em meio Neurosfera recém-preparado, suplementado com EGF a 3 nM e bFGF a 1 nM. As células foram plaqueadas e incubadas a 37 °c. EXEMPLO 3: Ensaio de ΆΤΡ

Para determinar a proliferação, as neurosferas foram decompostas e semeadas em meio Neurosfera como células únicas em placas de 96 poços, a 10000 células/poço. A seguinte experiência foi realizada em conjuntos de quatro experiências paralelas (i. e., realizadas em quadruplicado), de modo a que as células possam ser utilizadas para diferentes ensaios. Foram adicionadas substâncias a serem testadas e as células foram incubadas a 37 °C, durante 4 dias. As células foram lisadas Triton-XlOO a 0,1% em tampão Tris-EDTA. ATP intracelular foi medido utilizando um kit ATP-SL, de acordo com as instruções do fabricante (BioThema, Suécia). O ATP intracelular mostrou correlacionar-se com número de células. Para cada experiência, os poços foram visualmente examinados para sinais de neurogénese e contados, de modo a confirmar os resultados do ensaio. Os resultados eram repetiveis e estatisticamente significativos. 82

EXEMPLO 4: Método de detecção de cAMP

De modo a testar elevações em níveis de cAMP, foi utilizado 0 Kit de Ensaio de Quimioluminescência de AMP Cíclico HitHunter EFC (DiscoveRx, EUA), como adquirido à Applied Biosystems. As células foram dissociadas como anteriormente descrito. As células foram, depois, semeadas como cultura de neurosfera não aderente, a 30000 células/poço, de modo a permitir medições reproduzíveis de níveis de cAMP. As células foram deixadas a repousar, durante 2 horas, antes de adição das substâncias de teste. Após o período de repouso, IBMX a 1 mM (3 isobutil-1-metil-xantina, Sigma) foi adicionado a cada poço e incubado, durante 10 minutos, a 37 °C, de acordo com as instruções do fabricante. As substâncias de teste foram incubadas, durante 20 minutos, a 37 °C, antes das células serem lisadas e cAMP foi medido. Cada substância foi testada em 3 doses (100, 10 ou 1 nM), com cada dose testada em quadruplicado. O cAMP foi medido de acordo com as instruções do kit e os resultados foram representados como pmol/poço. O teste t de Student foi utilizado para calcular para significância.

EXEMPLO 5: Medição de Ca2+ utilizando sistema repórter de elemento de resposta de NFAT

Foram determinadas elevações em níveis de Ca2+ utilizando uma construção de vector que codificava para o factor nuclear do elemento de resposta de células T activadas (NFAT) ligado a um repórter de luciferase. O NFAT foi anteriormente referido como sendo regulado num modo dependente de Ca2+ (Rao et al., 1997). O sinal de luciferase foi detectado com o kit Staedy-Glo (Promega). Após dissociação das células (como anteriormente 83 descrito), 4-6 x 106 células foram centrif ugadas a 250 x g, durante 4 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em 100 pL de Solução Núcleofector™ (Amaxa GmbH) e 10 pg de ADN de vector NFAT-Luc por 106 células. A suspensão foi transferida para uma cuveta e electroporada. As células transfectadas foram semeadas a 50000 células/poço como culturas de neurosferas não aderentes. As células foram deixadas a repousar, de um dia para o outro, antes de serem colocadas em contacto com as substâncias de teste. Cada substância foi testada em 3-4 doses (100, 15 ou 1,5, 0,15 nM), com cada dose testada em quadruplicado. Luciferase foi medida de acordo com as instruções do fabricante a 18-24 horas após a indução. Os resultados foram representados como factor de indução comparado com controlo não tratado. O teste t de Student foi utilizado para calcular significância comparada com controlo não tratado. EXEMPLO 6: Bibliotecas de adnc e análise de expressão

Para a biblioteca de ADNc de LVW, ARN foi isolado do

ventrículo lateral anterior de murganhos adultos (C57 black). Foi gerada uma biblioteca de ADNc iniciada com oligo dT utilizando processos padrão (RT-PCR Superscript One-Step com Taq platina, Invitrogen) e, depois, submetida a análise de sequência (9000 sequências) . Para a biblioteca de ADNc de Neurosfera, ARN foi isolado de neurosferas de segunda geração derivadas da parede do ventrículo lateral anterior de murganhos adultos (C57 black) e expandido utilizando os factores de crescimento EGF e FGF2. Foi gerada uma biblioteca de adnc normalizada com oligo dT utilizando processos padrão (RT-PCR Superscript One-Step com Taq platina, Invitrogen) e, depois, submetida a análise de sequência (12500 sequências). 84

Culturas de Células Estaminais Neuronais Humanas Adultas (aHNSC)

Uma biopsia da parede lateral anterior do ventrículo lateral foi retirada de um doente humano adulto e enzimaticamente dissociada em PDD (Papaína a 2,5 U/mL; Dispase a 1 U/mL; Dnase I a 250 U/mL) em DMEM contendo glucose a 4,5 mg/mL e 37 °C, durante 20 min. As células foram suavemente trituradas e misturadas com três volumes de DMEM/F12; soro bovino fetal (FBS) a 10%. As células foram sedimentadas a 250 x g, durante 5 min. O sobrenadante foi subsequentemente removido e as células ressuspensas em DMEM F12 com FBS a 10%, plaqueadas sobre placas de cultura revestidas com fibronectina e incubadas, a 37 °C, em CO2 a 5%. No dia seguinte, a expansão da cultura foi iniciada por troca de meios para meios de cultura de aHNSC (DMEM/F12; BIT 9500; EGF a 20 ng/mL; FGF2 a 20 ng/mL). As aHNSC foram decompostas utilizando tripsina e EDTA sob condições padrão. FBS foi subsequentemente adicionado, de modo a inibir a reacção e as células recolhidas por centrifugação a 250 x g, durante 5 min. As aHNSC foram re-plaqueadas em meios de cultura de aHNSC.

RT-PCR

As culturas aHNSC foram recolhidas e o ARN total foi extraído com um kit RNeasy mini (Qiagen) de acordo com o manual.

Os pares iniciadores para os genes seguintes (ver a tabela abaixo) foram concebidos e sintetizados de modo a identificarem a sua presença em aHNSC. 85

Nome do gene AD0RA2A EDNRA CALCRL MC1R MC5R VIPR1 VIPR2 SSTR1 SSTR2 ADCYAP1R1 Número de Acesso Iniciadores

Gene Bank NM__0006 75 NM_001957 NM_005795 NM_002386 NM_005913 NM_004624 NM_003382 M_0 01049 NM_0 01050 NM_0 01118 5'-CAATGTGCTGGTGTGCTGG (SEQ ID N° 52) 3'-TAGACACCCAGCATGAGCAG(SEQ ID N° 53) 5'-CAGGATCATTTACCAGAAC(SEQ ID N° 54) 3'-GACGCTGCTTAAGATGTTC(SEQ ID N° 55) 5'-AGAGCCTAAGTTGCCAAAGG(SEQ ID N° 56) 3'-GAATCAGCACAAATTCAATG(SEQ ID N° 57) 5'-GAACCGGAACCTGCACTC(SEQ ID N° 58) 3'-TGCCCAGCAGGATGGTGAG(SEQ ID N° 59) 5'-GAGAACATCTTGGTCATAGG(SEQ ID N° 60) 3'-AGCATTAAAGTGAGATGAAG(SEQ ID N° 61) 5'-GCTACACCATTGGCTACGG(SEQ ID N° 62) 3'-GACTGCTGTCACTCTTCCTG(SEQ ID N° 63) 5'-GATGTCTCTTGCAACAGGAAG(SEQ ID N° 64) 3'-GCAAACACCATGTAGTGGAC(SEQ ID N° 65) 5'-GGGAACTCTATGGTCATCTACGTGA(SEQ ID N° 66) 3'-GAAATGTGTACAACACGAAGCCC(SEQ ID N° 67) 5'-GGCAACACACTTGTCATTTATGTCA(SEQ ID N° 68) 3'-AGGTAGCAAAGACAGATGATGGTGA(SEQ ID N° 69) 5'-TACTTTGATGACACAGGCTGCT(SEQ ID N° 70) 3-'AGTACAGCCACCACAAAGCCCT(SEQ ID N° 71)

Foi realizado RT-PCR de uma etapa (Life Technologies) com os iniciadores, de modo a detectar o ARNm dos genes de interesse.

Como um controlo positivo foram utilizados iniciadores para o gene Flt-1. Sabe-se que o gene Flt-1 é expresso nas aHNSC. 86

Como um controlo negativo foram utilizados iniciadores para o gene Flt-1 e foi adicionada só enzima Taq, de modo a garantir que o material não tinha contaminação genómica.

Os produtos de PCR foram corridos num gel de agarose a 1,5% contendo brometo de etidio. As bandas do tamanho correcto foram cortadas, limpas com o kit de extracção de gel da Qiagen. De modo a aumentar a quantidade de material para sequenciação, as bandas foram amplificadas de novo com os seus iniciadores correspondentes e, a seguir, sequenciadas, de modo a confirmar a sua identidade.

EXEMPLO 7: Ensaios de fosforilação CREB

Resumidamente, NSC foram decompostas numa suspensão celular simples, como anteriormente descrito. A suspensão foi plaqueada em placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina, a uma densidade de 106 células/poço. As células foram incubadas em meios suplementados com 1% de soro de vitelo fetal (FBS) e deixadas a aderir, de um dia para o outro. Na manhã seguinte, os meios foram cuidadosamente substituídos com DMEM/F12 de fresco e foi adicionado ao meio PACAP a 100 nM ou toxina da cólera a 100 nM. Fosforilação CREB foi determinada a intervalos de tempo de 15 minutos e 4 horas após tratamento de PACAP e a intervalos de tempo de 15 minutos, 4 horas, 6 horas e 8 horas após tratamento de toxina da cólera. Os lisados celulares foram recolhidos e foi realizada análise de transferência de Western seguindo processos padrão (Patrone et al., 1999). Foi utilizado o anticorpo específico anti-fosfo-CREB (diluição de 1:1000; Upstate Biotechnology). 87 EXEMPLO 8: Análise de citometria de fluxo

As células foram decompostas como suspensões celulares simples, como anteriormente descrito. As células foram plaqueadas em placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina, a uma densidade de 106 células/poço. A seguir a isto, FBS a 1% foi adicionado aos meios e as células foram deixadas a aderir, de um dia para o outro. Na manhã seguinte, os meios foram cuidadosamente substituídos com DMEM/F12 de fresco e a substância de teste foi adicionada a uma concentração final predeterminada. As células foram cultivadas durante 4 dias na presença da substância. Uma troca completa de meios foi realizada a meio do periodo de incubação. As células foram recolhidas por incubação com tripsina/EDTA, durante 5 minutos, a 37 °C e lavagem suave com uma pipeta de 1000 pL. As células foram lavadas e centrifugadas com 500 pL de meios a 250 x g, durante 4 minutos. A seguir a isto, 2 x 105 células foram transferidas para dentro de tubos de minicentrifuga e sedimentadas. O sedimento foi cuidadosamente ressuspendido em 50 pL de tampão de fixação (Caltag) e incubado, durante 15 minutos, à temperatura ambiente (RT) . A seguir, 450 pL de PBS foram adicionados ao tubo. As células foram centrifugadas a 200 x g, durante 5 minutos e o sobrenadante foi removido. As células foram ressuspensas em 100 pL de tampão de permeabilização (Caltag) e anticorpo primário foi adicionado (Duplacortina 1:200, Santa Cruz), durante 20 minutos, à temperatura ambiente. As células foram lavadas como anteriormente e ressuspensas em anticorpo secundário diluído em 100 pL de PBS (IgG de FITC anti-cabra, 1:500, Vector Laboratories). As células foram incubadas no escuro, durante 20 minutos, à temperatura ambiente. A seguir, as células foram 88 lavadas como anteriormente, ressuspensas em 100 pL de PBS e transferidas para tubos adequados para análise FACS.

Para análise FACS, as células foram analisadas num FACSCalibur (Becton Dickinson). Sinais de fluorescência de células individuais foram excitados por um laser de ião árgon a 488 nm e as emissões de fluorescência resultantes de cada célula foram recolhidas utilizando filtros de banda passante regulados a 530 ± 30. Foi utilizado software de aquisição e análise Cell Quest Pro para recolher as intensidades de sinal de fluorescência, assim como propriedades de dispersão directa e lateral das células. O software também foi utilizado para fixar parâmetros de activação de canal electrónico lógico, concebido para diferenciar entre células vivas versus mortas, assim como entre células positivas e negativas. Foi analisado um total de 10000 células por amostra. EXEMPLO 9: Níveis de cAMP correlacionam-se com proliferação de células estaminais neuronais O objectivo desta investigação foi o de determinar se cAMP e Ca2+ são reguladores importantes de proliferação em células estaminais neuronais adultas. As experiências analisaram um grande número de substâncias de teste, muitas das quais regularam cAMP e/ou Ca2+ por meio de GPCR. Os resultados destas experiências indicaram que 1) níveis de cAMP estavam correlacionados com proliferação de células estaminais neuronais de murganho; 2) estimulação de Ca2+ intracelular estava correlacionada com proliferação de células estaminais neuronais de murganho; e 3) células estaminais adultas de murganho retêm o seu potencial para se diferenciarem em direcção a qualquer 89 célula neuronal (fenótipo); 4) células estaminais neuronais adultas de murganho e humanas mostraram respostas semelhantes, reproduzíveis, à estimulação de cAMP.

De modo a determinar se as vias de cAMP causam proliferação, células estaminais neuronais adultas foram estimuladas in vitro por incubação com um conjunto diverso de activadores celulares de cAMP (Tabela 1, coluna 1) . Os resultados destes estudos claramente demonstram que a indução de cAMP em células estaminais neuronais conduz a proliferação celular (Tabela 1, colunas 2-6). As células estaminais adultas de murganho cultivadas in vitro foram induzidas a proliferarem-se, após tratamento com vários compostos pertencendo a uma biblioteca química de ligandos de GPCR (Exemplo 1; Tabela 2, coluna 1) . Os níveis de cAMP foram medidos 15 minutos após os diferentes tratamentos (Tabela 2, colunas 5-6). Os níveis de ATP, uma medida de número de células, foram medidos após 4 dias de tratamento (Tabela 2, colunas 3-4). Os resultados indicam uma clara correlação entre proliferação (níveis de ATP) e indução de cAMP em todas as substâncias analisadas. Os GPCR para os ligandos listados nas Tabelas 1 e 2, são mostrados na Tabela 3, colunas 1-3. Dados de expressão dos GPCR foram obtidos de neurosferas de murganho e bibliotecas de ADNc de ventrículo lateral (Tabela 3, colunas 4-5). 90

Tabela 1: Proliferação (níveis de ATP) e níveis de cAMP são estreitamente correlacionados em células estaminais neuronais adultas de murganho

Substância Cone. (nMolar) ATP (nM de ATP/poço) Factor de Indução de ATP CAMP (pmol/poço) Factor de Indução de cAMP Veículo 9,3±0,6 1,0 0,02±0,01 Forscolina 1000 10,4±2,4 1,1 0,0 7±0,01 3,1 ** Rolipram 100 10,4±0,4 1,1* 0,09±0,03 3,8 * N-6 2-0- Dibutiriladenosina 100 13,9±1,1 1,5 ** 0,10±0,01 4^5 * * * Toxina da cólera 100 12,9±1,6 1,4 * 0,07±0,01 3,1 *** (10 nM) A Tabela 1 mostra níveis de ATP, reflectindo o número de células e níveis de cAMP, após tratamento de células estaminais neuronais adultas com activadores químicos de cAMP. As substâncias de teste foram adicionadas a culturas de células estaminais adultas de murganho às doses indicadas e, após 15 minutos, os níveis de cAMP foram medidos. Níveis de ATP foram medidos após 4 dias em cultura. 0 factor de indução foi determinado por comparação com células tratadas com veículo. Os dados foram representados como o valor médio ± SD de testes em quadruplicado numa experiência típica. Os valores representativos foram calculados com base em duas experiências separadas. *, P<0,05; **, P<0,005; *** P<0,001 (teste t de Student). n.s. = não significativo. 91

Tabela 2: Ligandos de GPCR que estimulam proliferação (níveis de ATP) e activação de cAMP em células estaminais neuronais adultas de murganho. Cada um destes agentes é um agente de modulação de neurogénese.

Substância Cone. (nM) ATP (nM de ATP/poço) Factor de Indução de ATP CAMP (pmol /poço) Factor de Indução de cAMP Veículo 16,4±1,3 2,23±0,52 Hormona adrenocorticotrópica 10 18,6±1,0 1,1 * 6,36+2,58 2,8 * (100 nM) Veículo 16,4±1,3 1,84±0,53 Endotelina-1 (humana, porcina) 10 41,7±7,2 2,5 * 3,64±1,13 2,0* Veículo 4,5±0,6 1,84±0,53 MECA 100 7,4±0,7 1,6 ** 3,89±1,00 2,1 * HE-NECA 1000 8,2±1,1 1,8 ** 3,32±0,28 1,8 *** (10 nM) Veículo 8,6±1,4 0,13±0,02 [Cys3,6, Tyr8, Pro9]-Substância P 100 11,2±0,4 1,3 ** 0,29±10 2,2 * Veículo 8,6±1,4 0,13±0,02 [D-ArgO, Hyp3, 115, D-Igl7, 0ic8]-Bradicinina 100 13,1±2,1 1,5 * 0,17±0,02 1,3 * (10 nM) Veículo 10,3±0,6 0,06±0,01 Adrenomedulina (humana) 100 11,6+0,8 1,1 * 0,15+0,3 2,5 ** Veículo 8,8±0,9 0,03±0,01 [Des-Arg9,Leu8]-Bradicinina 10 9,8±0,4 1,1 * 0,09±0,02 2,6 * (1 nM) [Des-Arg9]-Bradicinina 1 10,4±1,0 1,2 * 0,06±0,01 ]_ η * * * 92 (continuação)

Substância Cone. (nM) ATP (nM de ATP/poço) Factor de Indução de ATP cAMP (pmol /poço) Factor de Indução de cAMP [D-Pen2-5]-Encefalina 10 10,7+0,9 1,2 ** 0,06+0,01 1,7* [D-pGlul, D-Phe2, D-Trp3,6]-LH-RH 100 11,1+0,4 1,3 *** 0,07+0,02 2,0* (1 nM) Veículo 7,8±2,0 0,21±0,08 Adrenomedulina (26-52) 1 11,4±0,7 1,5 ** 0,33±0,07 1,6 * Adrenomedulina (22-52) 100 12,3±1,1 1,6 ** 0,34±0,07 1,6 * α-Neo-Endorfina 100 13,8±2,1 1, 8 ** 0,36±0,09 1,7 * (1 nM) Veículo 10,3±2,2 0,17±0,04 β-MSH 100 13,6±1,6 1,3 * 0,23 ±0,02 1,3 ** (10 nM) Veículo 7,8±2,0 2,23±0,52 a-MSH 100 14,7±3,5 ]_ 9 * * * 5,82±0,86 2,6 ** (100 nM) Veículo 7,1±0,5 0,17±0,04 Tirocalcitonina (Salmão) 1 9,2±0,7 1,3 * 0,63±0,23 3,8* (1 nM) Veículo 7,1±0,5 0,10±0,02 Calcitonina (humana) 100 9,9+1,6 1, 4* 0,35+0,15 3,3 * CART (61-102)D 100 8,3±0,4 1,2 ** 0,i3±0, 02 1,2 * (10 nM) Veículo 8,8±0,9 0,09±0,03 Colecistocinina Octapéptido [CCK(26-33) ] 10 9,8±0,4 1,1* 0,27±0,06 3, 1 ** (100 nM) Veículo 7,6±1,0 0,14±0,02 93 (continuação)

Substância Cone. (nM) ATP (nM de ATP/poço) Factor de Indução de ATP cAMP (pmol /poço) Factor de Indução de cAMP DTLET 10 9,2+0,9 1,2 * 0,20+0,02 1,4* (100 nM) Veículo 7,6±1,0 0,14±0,02 DDAVP 100 11,5±1,4 1,5 k 0,27±0,02 ]_ Cj * * * (10 nM) Veículo 8,5±1,5 0,84±0,11 Eledoisina 100 10,4±1, 1 1,2 k 1,0±0,06 1,2 * (1 nM) Veículo 6,3±0,2 0,57±0,14 γ-MSH 10 7,4±0,5 1,2 k 0,96±0,18 1,7* (100 nM) Veículo 8,7±1,5 0,05±0,06 a-Neurocinina 100 11,0±1,4 1,3 k 0,11±0,03 2,3 * (10 nM) Veículo 9,4±1,4 0,03±0,01 PACAP-3 8 100 26.9±3,7 2,9 k k 0,13±0,03 4,2 ** Veículo 10,3±2,2 0,17±0,04 Beta-ANP 100 13,6+2,1 1,3 k 070+0,04 4^2 * * * Veículo 6,3±0,2 0,57±0,14 Galanina (1—13)— Espantida-Amida, M40 100 7,10±0,5 1,1 k 0,82±0,08 1,4 ** (1 nM) Veículo 12,5±1,8 0,07±0,06 [Sar9, Met (0)11]-Substância P 100 39,7±2,1 3,2 k k k 0,16±0,05 2,2 * Veículo 12,5±1,8 0,30±0,08 Sarafotoxina S6a 10 43,3±4,5 3,5 k k k 0,41±0,06 1,4* 94 (continuação)

Substância Cone. (nM) ATP (nM de ATP/poço) Factor de Indução de ATP cAMP (pmol /poço) Factor de Indução de cAMP Veículo 15,2±3,2 0,07±0,06 Sarafotoxina S6b 100 43,0+7,8 2, 8 ** 0,43+0,22 6,0 * Sarafotoxina S6c 10 39,9±6,6 2,6 ** 0,21±0,03 3,0 ** Veículo 13,5±1,9 0,06±0,01 [Nle8,18,Tyr34]-Hormona Paratiróide (1-34) Amida (Humana) 1000 23,5±2,7 1, 7 ** 0,16±0,05 2,6 * (10 nM) ACTH (Humana) 1000 15,7±1,3 1,2 * 0,11±0,02 1, 8 ** (100 nM) Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37) (Humano) 1000 18,3±1,4 1,3 ** 0,08±0,01 1,4* (100 nM) Veículo 12,3±1,1 0,14±0,05 Exendina-3 100 14,2±1,0 1,2* 0,21±0,03 1,5 * (10 nM) Veículo 12,3±1,1 0,30±0,08 Exendina-4 1000 16,0±2,0 1,3 * 0,49±0,04 1,6 *** (10 nM) Veículo 12,3±1,1 0,20±0,07 Urotensina II (Globy) 100 14,3±1, 1 1,2 * 0,50±0,15 2,6 * (10 nM) Péptido Intestinal Vasoactivo (Humano, Porcino, Rato) 1000 20,6±1,2 l 7 * * * 0,39±0,12 2,0 * (100 nM) Veículo 13,4±1,8 0,97±0,46 Nor-Binaltorfimina 0,1 19,4±3,2 1,4* 6,10±3,72 6,3 ** (0,01 nM) 95 (continuação)

Substância Cone. (nM) ATP (nM de ATP/poço) Factor de Indução de ATP cAMP (pmol /poço) Factor de Indução de cAMP Veículo 7,8±2,0 0,21±0,08 Proteína Relacionada com Cutia (87—132)— Amida (Humana) 10 11.2+1,7 1,4 * 0,5+0,20 2,4* A Tabela 2 mostra níveis de ATP, reflectindo número de células e níveis de cAMP. As substâncias de teste foram adicionadas a culturas de células estaminais adultas de murganho às doses indicadas. Após quatro dias, valores para ATP e cAMP foram ensaiados. 0 factor de indução foi determinado por comparação com células tratadas com veículo. Os dados foram representados como o valor médio ± SD de testes em quadruplicado numa experiência típica. Os valores representativos eram baseados em duas experiências separadas. *, P<0,05; **, P<0,005; *** P<0,001 (teste t de Student) . n.s. = não significativo. a Significativo em concentração mais baixa.

Tabela 3: Análise de expressão de possíveis alvos para os ligandos de GPCR listados na Tabela 2

Nome Oficial Símbolo Símbolo Expressão Expressão Expressão de de de de parede de Ligação a Ligação a neurosfera ventricular neurosfera Lócus de Lócus de lateral de de humano murganho humano murganho murganho Receptor adenosina A2a Adora2a ADORA2A SIM SIM n.d. Receptor adenosina A2b Adora2b ADORA2B SIM SIM SIM Receptor adenosina A3 Adora3 ADORA3 n.d. n.d. n.d. 96 (continuação)

Nome Oficial Símbolo de Ligação a Lócus de murganho Símbolo de Ligação a Lócus humano Expressão de neurosfera de murganho Expressão de parede ventricular lateral de murganho Expressão de neurosfera de humano Receptor 1 de polipéptido 1 de activação de adenilato ciclase Adcyaplr1 ADCYAP1R1 SIM SIM SIM Receptor de adrenomedulina Admr ADMR n.d. n.d. SIM receptor 2 de vasopressina arginina Avpr2 AVPR2 n.d. n.d. n.d. Receptor de bradicinina, beta 1 Bdkrbl BDKRB1 n.d. n.d. n.d. Receptor de bradicinina, beta 2 Bdkrb2 BDKRB2 n.d. n.d. n.d. Receptor de calcitonina Calcr CALCR n.d. n.d. n.d. Receptor do tipo calcitonina Calcr1 CALCRL n.d. n.d. SIM Receptor de colecistocinina A Cckar CCKAR n.d. n.d. SIM Receptor de colecistocinina B Cckbr CCKBR n.d. n.d. SIM Receptor de endotelina tipo A Ednra EDNRA SIM SIM SIM Receptor de endotelina tipo B Ednrb EDNRB SIM SIM n.d. Receptor 1 de galanina Galr 1 GALRl n.d. n.d. n.d. Receptor 2 de galanina Galr2 GALR2 n.d. n.d. n.d. Receptor 3 de galanina Galr 3 GALR3 n.d. n.d. n.d. 97 (continuação)

Nome Oficial Símbolo de Ligação a Lócus de murganho Símbolo de Ligação a Lócus humano Expressão de neurosfera de murganho Expressão de parede ventricular lateral de murganho Expressão de neurosfera de humano Receptor de péptido 1 do tipo glucagom Glplr GLP1R n.d. n.d. n.d. Receptor de hormona de libertação de gonadotropina Gnrhr GNRHR n. d. n.d. n.d. Receptor de melanocortina 1 Mclr MC1R n.d. n.d. SIM Receptor de melanocortina 2 Mc2r MC2R n.d. n.d. n.d. Receptor de melanocortina 3 Mc3r MC3R n.d. n.d. n.d. Receptor de melanocortina 4 Mc4r MC4R n.d. n.d. n.d. Receptor de melanocortina 5 Mc5r MC5R n.d. n.d. SIM Receptor 1 de péptido natriurético Npr 1 NPR1 n.d. n.d. n.d. Receptor 2 de péptido natriurético Npr 2 NPR2 n.d. n.d. n.d. Receptor 3 de péptido natriurético Npr 3 NPR3 n.d. n.d. n.d. Receptor opióide, delta 1 Oprdl OPRDl n.d. n.d. n.d. Receptor opióide, capa 1 Oprkl OPRKl n.d. n.d. n.d. Receptor 1 de taquicinina Tacr 1 TACRl n.d. n.d. n.d. Receptor 2 de taquicinina Tacr2 TACR2 n.d. n.d. n.d. 98 (continuação)

Nome Oficial Símbolo de Ligação a Lócus de murganho Símbolo de Ligação a Lócus humano Expressão de neurosfera de murganho Expressão de parede ventricular lateral de murganho Expressão de neurosfera de humano Receptor 3 de taquicinina Tacr3 TACR3 n.d. n.d. n.d. Receptor 1 de péptido intestinal vasoactivo Viprl VIPR1 SIM SIM SIM Receptor 2 de péptido intestinal vasoactivo Vipr2 VIPR2 SIM SIM SIM Receptor 14 ligado a proteína G Gpr 14 GPR14 n.d. n.d. n.d. Receptor 1 de hormona paratiróide Pthrl PTHR1 n.d. n.d. n.d. A Tabela 3 mostra que se verificou que os GPCR são expressos em culturas de células estaminais adultas de murganho e/ou humanas. A expressão génica em células ou tecido de murganho foi determinada por análise de biblioteca de ADNc e expressão humana utilizando RT-PCR.

Um número de compostos que não foram anteriormente identificados como estimuladores de cAMP intracelular foi testado para estimulação de neurogénese. Este teste foi utilizado para determinar: 1) se havia compostos adicionais que pudessem estimular a neurogénese por qualquer mecanismo; e 2) se havia compostos adicionais que pudessem estimular a neurogénese por aumento de cAMP intracelular. Surpreendentemente, verificou-se que vários destes compostos estimulam a neurogénese, ainda que não se sabia anteriormente 99 que os mesmos aumentavam níveis intracelulares de cAMP. Os compostos rastreados incluíram: (Des-Arg9, Leu8)-Bradicinina, (Des-Arg9)-Bradicinina, Alfa-Neo-Endorfina, CART (61-102), DTLET, Eledoisina, Urotensina II, [Nle8,18, Tyr34]-Hormona Paratiróide (1-34) Amida e [Cys3,6, Tyr8, Pro9]-Substância P (ver a Tabela 2) . A presente revisão da literatura mostra que estas propriedades (de elevação de cAMP intracelular e indução de neurogénese) não eram anteriormente conhecidas.

Estas experiências foram repetidas com avaliação visual dos poços para sinais de neurogénese e para confirmar os resultados do ensaio anterior. Os resultados eram reprodutíveis. A análise visual confirmou as presentes constatações anteriores e não revelou nada que pudesse contradizer as constatações anteriores. EXEMPLO 10: Níveis de Ca2+ correlacionam-se com proliferação de células estaminais neuronais

De modo a mostrar que a proliferação, após aumento intracelular de Ca2+ em resposta a ligandos de GPCR, é regulada positivamente em células estaminais adultas de murganho cultivadas in vitro, as células foram tratadas com um número de substâncias de teste (Tabela 4, coluna 1) . O Ca2+ foi medido por meio de regulação do factor nuclear do gene de células T activado (NFAT; Exemplo 5) . Os resultados mostraram uma clara correlação entre níveis de ATP (Tabela 4, colunas 3-4) e regulação positiva de NFAT (Tabela 4, colunas 5-6). Isto indica que os níveis de Ca2+ são fortemente correlacionados com proliferação de células estaminais neuronais. Verificou-se que os GPCR que desencadeiam Ca2+ para os ligandos analisados (Tabela 5, colunas 1-3) estão presentes nas duas bibliotecas de 100 ADNc analisadas (Exemplo 6; Tabela 5, colunas 4-5). As Tabelas 3 e 5 (colunas 6) indicam GPCR que foram identificados em material de células estaminais humanas utilizando análise de RT-PCR. Isto corrobora as presentes constatações em células estaminais adultas de murganho, sugerindo que a activação de Ca2+ também pode ser importante para o desencadeamento de proliferação mediada por GPCR em células estaminais humanas.

Tabela 4: Ligandos de GPCR que regulam repórter NFAT-Luclferase (Ca2+) e ATP (proliferação) . Cada um destes agentes é um agente de modulação de neurogénese.

Substância Cone. (nMolar) ATP (nM de ATP/poço) Factor de Indução de ATP Unidades de NFAT Luciferase Factor de Indução de NFAT Veículo 9,8±2,1 42,9±7,4 Antagonista de Receptor de Amilina/Calcitonina(8- 32) 100 15,0±2,2 1,5 * 57,3±5,4 1 3 * * * (0, 15 nM) Veículo 9,8±1,6 42,9±7,4 ANP (humano) 10 12,7+1,0 1,3* 65,9±8,9 1,5 * (1,5 nM) Veículo 8,8±0,9 21,114,1 CGRP (8-37) 100 10,4+0,5 1,2 ** 28,311,1 1,3 ** (a 15 nM) Veículo 4,5±0,6 3,4±0,8 Endotelina-1 (humana, Bovina, Canina, de Murganho, Porcina, de Rato) 10 14,4±2,4 3,2* 8,312,5 2,4 * (0, 15 nM) Veículo 6,3±0,2 2,4±1,4 101 (continuação)

Substância Cone. (nMolar) ATP (nM de ATP/poço) Factor de Indução de ATP Unidades de NFAT Luciferase Factor de Indução de NFAT γ-MSH 10 7,4±0,5 1,2 * 4,8+1, 5 2,0 * (1,5 nM) Veículo 7, 5±0,6 2,4±1, 4 Factor de Libertação da Hormona do Crescimento 10 12,610,9 1,7 k 4,510, 6 1,9 ** (15 nM) Veículo 8,2±0,8 2,4±1, 4 MGOP 27 100 10,211,2 1,2 k 4,0+0, 4 1,7 * (1,5 nM) Veículo 9.4±1,4 3,5±0, 9 PACAP-38 10 22,010,9 2,3 k k k 6,211, 6 1,7 * Veículo 12,5±1,8 1,9±0, 5 Sarafotoxina S6a 1 38,913,2 3,1 k k k 6,312, 4 3,4 * Veículo 15,2±3,2 1,9±0, 5 Sarafotoxina S6b 100 43,017,8 2, 8 k k 13,417 ,0 7,2 * Sarafotoxina S6c 1 41,614,8 2,7 k k k 8,312, 0 4,4 * Septida 100 25,113,1 1,7 k 3,710, 9 2,0 * Veículo 14,0±1,8 1,9±0, 5 Somatostatina-28 10 17,1+1,5 1,2 k 3,0+0, 4 1,6 * (100 nM) Veículo 9,3±0,06 8,2±0, 7 Toxina da cólera de Víbrío Cholerae 100 12,911,6 1,4 k 11,611 ,0 1,4 ** Veículo 9,8±2,1 5,6±0. 5 Angiotensina II (sintética humana) 11,7+0,6 1,2 k 12,0+3 i 7 2,1 * Veículo 8,8±0,9 5,6±0, 5 [D-Pen2-5]-Encefalina 10 10,710,9 1,2 k 10,312 ,1 1,8* (100 nM) Veículo 10,3±0,6 5,6±0, 5 102 (continuação)

Substância Cone. ATP (nM Factor de Unidades Factor de (nMolar) de Indução de NFAT Indução ATP/poço) de ATP Luciferase de NFAT Adrenomedulina 100 11,6±0,8 1,1 * 12,4±0,9 2,2 ** Endotelina-1 (humana, 10 35,3±3,7 1,3* 13,3±1,3 1,6 ** Porcina)

Tabela 4: Células estaminais neuronais adultas de murganho foram transfectadas, de forma transiente, com a construção NFAT-Luciferase e induzidas com substâncias de teste às doses indicadas. As células foram analisadas 24 horas após indução. Foi analisada actividade de NFAT-Luciferase e ATP. 0 factor de indução foi determinado por comparação com células tratadas com veículo. Os dados foram representados como o valor médio ± SD de testes em quadruplicado numa experiência típica. Os valores representativos eram baseados em duas experiências separadas. *, P<0,05; **, P<0,005; *** P<0,001 (teste t de Student). n.s. = não significativo. a Significativo em concentração mais baixa. 103

Tabela 5: Análise de expressão de alvos para os ligandos de GPCR listados na Tabela 4

Nome Oficial Símbolo de Ligação a Lócus de murganho Símbolo de Ligação a Lócus humano Expressão de neurosfera de murganho Expressão de parede ventricular lateral de murganho Expressão de neurosfera de humano Receptor 1 de polipéptido 1 de activação de adenilato ciclase Adcyaplrl ADCYAP1R1 SIM SIM SIM Receptor lb de angiotensina Agtrlb AGTR1 n.d. n.d. n.d. Receptor II de angiotensina, tipo 2 Agtr2 AGTR2 n.d. n.d. n.d. Receptor de calcitonina Calcr CALCR n.d. n.d. n.d. Receptor do tipo calcitonina Calcrl CALCRL n.d. n.d. SIM Receptor de endotelina tipo A Ednra EDNRA SIM SIM SIM Receptor de endotelina tipo B Ednrb EDNRB SIM SIM n.d. 104 (continuação)

Nome Oficial Símbolo de Ligação a Lócus de murganho Símbolo de Ligação a Lócus humano Expressão de neurosfera de murganho Expressão de parede ventricular lateral de murganho Expressão de neurosfera de humano Receptor de hormona de libertação da hormona do crescimento Ghrhr GHRHR n.d. n.d. n.d. Receptor de melanocortina 1 Mclr MC1R n.d. n.d. SIM Receptor de melanocortina 3 Mc3r MC3R n.d. n.d. n.d. Receptor de melanocortina 4 Mc4r MC4R n.d. n.d. n.d. Receptor de melanocortina 5 Mc5r MC5R n.d. n.d. SIM Receptor 1 de péptido natriurético Nprl NPR1 n.d. n.d. n.d. Receptor 2 de péptido natriurético Npr2 NPR2 n.d. n.d. n.d. Receptor 3 de péptido natriurético Npr3 NPR3 n.d. n.d. n.d. 105 (continuação)

Nome Oficial Símbolo de Ligação a Lócus de murganho Símbolo de Ligação a Lócus humano Expressão de neurosfera de murganho Expressão de parede ventricular lateral de murganho Expressão de neurosfera de humano Receptor opióide, delta 1 Oprdl OPRDl n.d. n.d. n.d. Receptor 1 de somatostatina Sstrl SSTRl SIM SIM SIM Receptor 2 de somatostatina Sstr2 SSTR2 SIM SIM SIM Receptor 3 de somatostatina Sstr3 SSTR3 SIM SIM n.d. Receptor 4 de somatostatina Sstr4 SSTR4 SIM SIM n.d. Receptor 5 de somatostatina Sstr5 SSTR5 SIM SIM n.d. Receptor 1 de taquicinina Tacrl TACR1 n.d. n.d. n.d. Receptor 1 de péptido intestinal vasoactivo Viprl VIPR1 SIM SIM SIM Receptor 2 de péptido intestinal vasoactivo Vipr2 VIPR2 SIM SIM SIM 106

EXEMPLO 11: Respostas de células estaminais humanas e de murganho a estimulação de cAMP

As experiências anteriormente descritas sugerem que a indução intracelular de cAMP ocorre em células estaminais neuronais adultas proliferativas de murganho. De modo a adicionalmente investigar a relevância destas constatações, foi estudada a via de cAMP em sistemas humano e de murganho. Visto que a fosforilação de CREB é um efector a jusante bem conhecido na via de activação de cAMP (Lonze e Ginty, 2002), o estado de fosforilação deste factor de transcrição foi investigado em experiências de evolução temporal. Foram utilizados dois activadores de cAMP, PACAP e toxina da cólera, (Exemplo 7) . PACAP e toxina da cólera foram adicionados às células estaminais neuronais adultas humanas e de murganho. Análise de transferência Western mostrou regulação positiva semelhante em células estaminais neuronais de murganho como em humanas (FIG. 1) . Os resultados claramente demonstram que o padrão de fosforilação de CREB em ambos os sistemas é responsivo a PACAP e toxina da cólera, num modo reproduzível (FIG. 1). Isto sugere que células estaminais de murganho e humanas respondem em formas semelhantes após indução celular de cAMP. GPCR, cujos ligandos se mostrou serem proliferativos em aNSC de murganho, também estavam presentes em aNSC humanas (Tabela 3, coluna 6). EXEMPLO 12: Células estaminais neuronais adultas retêm o seu potencial neuronal após estímulos proliferativos de GPCR.

Para compreender se células estaminais neuronais adultas em proliferação retinham o seu potencial neuronal após tratamento de ligando de GPCR, foi realizada análise de modo a determinar a 107 expressão do marcador neuronal precoce Duplacortina. As células estaminais neuronais foram tratadas com vários ligandos de GPCR, durante 4 dias. Foi realizada análise de citometria de fluxo nas células com um anticorpo contra o marcador neuronal precoce Duplacortina. Como mostrado na Tabela 6, todas as células tratadas com ligando de GPCR analisadas continuaram a expressar Duplacortina, após quatro dias em cultura (ver também o Exemplo 8). Isto indicou que NSC adultas tratadas com ligando ainda eram capazes de se diferenciarem em direcção a um fenótipo neuronal.

Tabela 6: Células estaminais neuronais adultas retêm o seu potencial neuronal após proliferação com ligandos de GPCR.

Substância Concentração % de células positivas para Duplacortina Factor de Indução EGF/FGF 3 nM/1 nM 2,63±1,86 1 Forscolina 10 μΜ 6,3 2, 5 Toxina da cólera de Vibrio Cholerae 100 nM 6,7 2,6 Endotelina I, humana, porcina 10 nM 5,0 2,0 PACAP-38 100 nM 5,2 2,0 (D-Trp7,Ala8,D-PhelO)-a-Hormona de estimulação de Melanócito F:6-11/GHRP 100 nM 5,3 2,1 a-Neurocinina 100 nM 4,6 1,8 Tirocalcitonina de salmão 100 nM 3,9 1,5 MECA 10 μΜ 2,2 0,9 [Des-Arg9]-Bradicinina 100 nM 4,5 1,8 108 (continuação)

Substância Concentração % de células positivas para Duplacortina Factor de Indução Eledoisina 100 nM 4,3 1,7 Hormona de estimulação de γ-melanócito 100 nM 4,1 1,6 [D-Pen2-5]-Encefalina 100 nM 3,3 1,3 α-Neo-Endorfina (Porcina) 100 nM 4,0 1,6 DTLET 100 nM 4,1 1,6 [D-ArgO, Hyp3, Igl5, D-Igl7, Oic8]-Bradicinina 100 nM 3,6 1,4 [D-pGlul, D-Phe2, D-Trp3,6]-LH-RH 100 nM 3,4 1,3 Adrenomedulina (Humana) 100 nM 4,2 1,6 Adrenomedulina (22-52) (Humana) 100 nM 2,0 co o Proteína Relacionada com Cutia (87-132)-Amida (Humana) 100 nM 2,4 0, 9 Angiotensina II (Humana) 100 nM 3,1 1,2 Hormona de Estimulação de β-Melanócito 100 nM 4,1 1,6 CART (61-102) (Humana, Rato) 100 nM 4,7 1,8 Colecistocinina Octapéptido [CCK(26—33)] (Não sulfatado) 100 nM 3,2 1,3 DDAVP (melhora aprendizagem e memória humanas) 100 nM 4,6 1,8 Sarafotoxina S6a (cardiotoxina isotoxina) 100 nM 3,2 1,3 109

Tabela 6: Células proliferadas por ligandos de GPCR mantiveram ou aumentaram o seu potencial para amadurecerem em direcção a um fenótipo neuronal. A soma destes resultados e estudos anteriores sobre PACAP (ver, e. g., Pedido de Patente U.S. com o N° de Série 60/377734, apresentado a 3 de Maio de 2002; Pedido de Patente U.S. com o N° de Série 06/393264, apresentado a 2 de Julho de 2002; Pedido de Patente U.S. com o N° de Série 10/429062, apresentado a 2 de Maio de 2003; Mercer et al., J. Neurosci. Res.r manuscrito em publicação) indica que compostos (e. g., ligandos naturais, pequenas entidades químicas, proteínas de afinidade, etc.) que aumentam níveis de cAMP ou Ca2+ podem estimular a proliferação de células estaminais neuronais adultas in vitro e in vivo. Nalguns casos, esta estimulação pode ser mediada por GPCR. Adicionalmente, a elevação só de cAMP (i. e., num modo independente de GPCR) pode deduzir um aumento na proliferação de células estaminais neuronais. Este aumento foi observado com diversos activadores de cAMP, incluindo 1) derivados de cAMP, tal como N-6,2-O-Dibutiriladenosina; 2) inibidores de fosfodiesterases de cAMP, tais como 3-Isobutil-l-Metilxantina (IBMX) e rolipram; 3) activadores de adenilato ciclase, tal como forscolina; e 4) compostos que elevam a ribosilação de ADP da subunidade alfa da proteína G estimuladora (Gs), tal como toxina da cólera. Pensa-se que a toxina da cólera e compostos relacionados actuem através da redução da actividade de GTPase e activação da subunidade alfa. Isto conduz a um aumento na actividade da adenilato ciclase, resultando em níveis aumentados de cAMP. Adicionalmente, como aqui mostrado, vários ligandos que actuam através de GPCR e aumentam o teor de Ca2+ intracelular, também são eficazes na promoção de neurogénese, incluindo proliferação celular. 110

Estas experiências mostram que a activação de cAMP ou Ca2+ pode ser utilizada em abordagens terapêuticas para modular a proliferação, diferenciação, sobrevivência ou migração de células estaminais neuronais adultas/células progenitoras em diferentes estados fisiológicos ou patológicos. Os diversos compostos (e. g., ligandos de GPCR) aqui descritos podem exibir diferentes especificidades celulares e perfis de destino que os tornam adequados para diferentes estados fisiológicos ou patológicos. Facto importante, células estaminais neuronais adultas retiveram o seu potencial neuronal após tratamento de ligando de GPCR. A soma destas constatações indica uma ampla gama de compostos terapêuticos para estimulação da neurogénese através da elevação intracelular de cAMP e/ou Ca2+.

Exemplo 13 Proliferação de Células Progenitoras

Um agente de modulação de neurogénese é administrado intraperitonealmente a animais de teste adultos (n=12), a diversas concentrações de 0,01 a 100 mg/kg. Solução salina é proporcionada como um controlo negativo. Com início duas horas após administração de agente de modulação de neurogénese, os animais são injectados com quatro injecções intraperitoneais de bromodesoxiuridina (BrdU; 50 mg/kg cada), a intervalos de três horas. Os animais são perfundidos após 1, 2 ou 3 dias ou após 1, 2, 3 ou 4 semanas após administração de agente de modulação de neurogénese. Para animais estudados por mais de um dia, BrdU é administrada por minibomba.

Em perfusão, os animais são perfundidos transcardialmente, com 50 mL de solução salina tamponada com fosfatos (PBS) fria e, 111 depois, 100 mL de paraformaldeído a 4% em PBS. Os cérebros são fixados após remoção em paraformaldeido a 4% em PBS, durante 24 horas, a 4 °C durante, pelo menos, 3 dias antes de seccionamento. As secções são preparadas utilizando um micrótomo de congelação e armazenadas em crioprotector, at -20 °C, antes de imunocoloração para BrdU.

As secções são imunocoradas para BrdU com anti-BrdU de murganho, emparelhado com uma IgG de cabra anti-murganho biotinilada. Complexo de avidina-biotina-peroxidase de rábano (HRP) é aplicado a secções e a imunorreactividade é visualizada fazendo reagir diaminobenzidina com o HRP. São utilizadas técnicas padrão para estimar o número total de células positivas para BrdU em cada secção e em cada região do cérebro. É realizada análise e quantificação para regiões cerebrais proliferativas, correntes migratórias e áreas de relevância clinica (algumas, mas não todas, destas áreas são exemplificadas abaixo). Esta análise é realizada com DAB (diaminobenzidina) ou visualização de fluorescência utilizando um ou vários dos seguintes anticorpos: como marcadores neuronais NeuN, Tujl, hidroxilase anti-tirosina, anti-MAP-2 etc.; como marcadores gliais anti-GFAP, anti-SlOO etc.; como marcadores oligodendrociticos anti-GalC, anti-PLP etc. Para visualização de BrdU: anti-BrdU. A quantificação será realizada em todas as áreas do cérebro utilizando quantificação estereológica. Em particular, as seguintes regiões são de particular interesse: circunvolução denteada de hipocampo dorsal, CAl/álveo de hipocampo dorsal, bolbo olfactivo (OB), zona subventricular (SVZ) e estriado. Quantificação de coloração dupla com microscópio confocal será realizada para cada estrutura (e. g., 112 OB, DG, CAl/álveo, SVZ, parede-para-estriado) verificando BrdU+ para coloração dupla com os marcadores de linhagem.

Outros detalhes experimentais aqui não listados são conhecidos de um especialista na técnica e podem ser consultados, por exemplo, em Pencea V et ah, J. Neurosci, Sept 1 (2001), 21(17):6706-17. A experiência é realizada com animais de tipo selvagem, assim como um modelo animal de uma doença neurológica. Tais modelos são enumerados na secção de discussão detalhada. Um animal preferido, é o murganho.

Em toda esta memória descritiva, diversas patentes, pedido publicado, sequências de ADN e proteina do GenBank e referências cientificas são citados para descrever o estado e conteúdo da técnica.

REFERENCIAS

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Lisboa, 30 de Março de 2011 117

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Pelo menos um agente que eleva níveis intracelulares de cAMP em tecido neuronal, em que o referido agente é seleccionado do grupo consistindo em Tirocalcitonina, Calcitonina, Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 e Exendina-4, e análogos de Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 ou Exendina-4, em que o referido análogo de Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 ou Exendina-4 interage com um receptor ligado a proteína G (GPCR) que é o receptor de Péptido-1 do Tipo Glucagom e uma sua combinação, ou um análogo de cAMP, em que o referido análogo de cAMP é seleccionado do grupo consistindo em 8-pCPT-2-0-Me-cAMP, 8-Br-cAMP, Rp-cAMPS, 8-Cl-cAMP, Dibutiril cAMP, pCPT-cAMP e monofosfato de N6- monobutiriladenosina 3',5'-cíclico, para utilização no aumento da neurogénese em tecido neuronal de um doente exibindo um distúrbio do sistema nervoso central, seleccionado do grupo consistindo em distúrbios neurodegenerativos, distúrbios isquémicos, traumas neurológicos e distúrbios de aprendizagem e memória, em que o agente aumenta a neurogénese no doente aumentando, desse modo, a neurogénese no tecido neuronal do doente e em que o aumento da neurogénese é aumento da proliferação, diferenciação, migração ou sobrevivência de uma célula estaminal neuronal adulta no referido tecido neuronal.
2. 2. Agente da reivindicação 1, em que o distúrbio do sistema nervoso central é caracterizado por, pelo menos, um sintoma seleccionado do grupo consistindo em tensão, movimentos anómalos, comportamento anómalo, tiques, hiperactividade, 1 combatividade, hostilidade, negativismo, defeitos de memória, defeitos sensoriais, defeitos cognitivos, alucinações, delírios agudos, poucos cuidados pessoais, afastamento e reclusão.
3. 3. Agente de qualquer reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o distúrbio de sistema nervoso é seleccionado do grupo consistindo em doença de Parkinson e distúrbios Parkinsonianos, doença de Huntington, doença de Alzheimer, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Shy-Drager, paralisia supranuclear progressiva, doença de corpo de Lewy, isquemia espinal, acidente vascular cerebral isquémico, enfarte cerebral, lesão de espinha dorsal, e lesão cerebral e de espinha dorsal relacionada com cancro, demência multi-enfarte, demência geriátrica e defeitos cognitivos.
4. 4. Agente de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o agente é administrado ao sistema nervoso central do doente.
5. 5. Agente de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o agente é administrado por uma via seleccionada do grupo consistindo em administração oral, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intracerebroventricular, intraparenquimal, intratecal, intracraniana, bucal, mucosal, nasal e rectal.
6. 6. Agente de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o agente é administrado por um sistema de distribuição lipossomal. 2
7. 7. Agente de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o referido aumento da neurogénese é realizado por uma activação de um receptor GPCR no referido tecido neuronal, em que o referido receptor GPCR é seleccionado do grupo consistindo em receptor de Calcitonina, receptor do tipo de receptor de Calcitonina e receptor de Péptido-1 do Tipo Glucagom.
8. 8. Método in vitro para aumentar ou estimular os niveis intracelulares de cAMP numa célula estaminal neuronal adulta, compreendendo a colocação em contacto da referida célula com uma quantidade eficaz de um agente seleccionado do grupo consistindo em Tirocalcitonina, Calcitonina, Péptido-1 do Tipo Glucagom (7-37), Exendina-3 e Exendina-4 e uma sua combinação, pelo que o nivel intracelular de cAMP na referida célula é aumentado e em que a proliferação, diferenciação, migração ou sobrevivência da referida célula estaminal neuronal adulta é aumentada.
9. 9. Método para o aumento da neurogénese in vitro, compreendendo as etapas de a) cultivo de uma população de células neuronais, compreendendo células estaminais neuronais adultas; b) adição às células cultivadas de, pelo menos, um agente de aumento da neurogénese; c) se necessário, repetição da etapa b) até que um nivel desejado de neurogénese seja alcançado, em que o aumento da neurogénese é o aumento da proliferação, diferenciação, migração ou sobrevivência das referidas células estaminais neuronais adultas e em que, 3 adicionalmente, o referido agente de aumento da neurogénese é como definido na reivindicação 1.
10. 10. Método da reivindicação 9, em que a célula estaminal adulta é isolada de tecido seleccionado do grupo consistindo em córtex, tubérculo olfactivo, retina, septo, eminência ganglionar lateral, eminência ganglionar medial, amígdala, hipocampo, tálamo, hipotálamo, mesencéfalo ventral e dorsal, tronco cerebral, cerebelo, espinha dorsal.
11. 11. Método da reivindicação 9 ou reivindicação 10, em que a célula estaminal adulta é isolada de um mamífero.
12. 12. Método da reivindicação 11, em que o mamífero é um humano.
13. 13. Utilização de, pelo menos, um agente que eleva níveis intracelulares de cAMP em tecido neuronal, em que o referido agente é como definido na reivindicação 1, na preparação de uma composição para o aumento da neurogénese em tecido neuronal de um doente exibindo um distúrbio do sistema nervoso central, seleccionado do grupo consistindo em distúrbios neurodegenerativos, distúrbios isquémicos, traumas neurológicos e distúrbios de aprendizagem e memória, em que o agente aumenta a neurogénese no doente aumentando, desse modo, a neurogénese no tecido neuronal do doente e em que o aumento da neurogénese é aumento da proliferação, diferenciação, migração ou sobrevivência de uma célula estaminal neuronal adulta no referido tecido neuronal. Lisboa, 30 de Março de 2011 4 1/1 A. PACAP C P15m P41i Murganho ***** ^ Humano B Toxina da cólera C CTlSm CT6h CT8h Murganho C ^ ÇT15m CT4h Humano

    FIG. 1