PT1379551E

PT1379551E - Toxinas bacterianas ribosilantes de adp

Info

Publication number: PT1379551E
Application number: PT02726389T
Authority: PT
Inventors: Mariagrazia Pizza; Vega Masignani; Rino Rappuoli
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2002-03-28
Publication date: 2012-06-06
Also published as: CA2442123A1; EP1379551B1; US20060057155A1; WO2002079242A2; CY1112918T1; AU2002256859A1; GB0108024D0; ES2383592T3; DK1379551T3; ATE555122T1; US7928192B2; WO2002079242A3; EP1379551A2

Description

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DESCRIÇÃO "TOXINAS BACTERIANAS RIBOSILANTES DE ADP"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção está no campo de toxinas bacterianas ribosilantes de ADP e suas utilizações.

TÉCNICA ANTERIOR

Exotoxinas bacterianas ribosilantes de ADP são amplamente conhecidas. Os exemplos incluem toxina de difteria (Corynebacterium difteriae) , exotoxina A (Pseudomonas aeruginosa), toxina da cólera (CT; Vibrio cholerae), enterotoxina lábil ao calor (LT; E.coli) e toxina pertussis (PT).

As toxinas catalisam a transferência de uma unidade de ADP-ribose de NAD+ a uma proteina alvo. CT, por exemplo, transfere ADP-ribose a uma cadeia lateral de arginina especifica da subunidade de Gs, que bloqueia a capacidade de Gs de hidrolisar GTP a GDP. Isto trava a proteina em sua forma 'activa', deste modo a actividade de adenilato ciclase é activada de maneira permanente. Os níveis de cAMP celular elevam-se, que levam ao transporte activo de iões a partir da célula e a perda de água no intestino [1].

As toxinas são tipicamente divididas em dois domínios funcionalmente distintos - A e B. A subunidade A é responsável por a actividade enzimática tóxica, enquanto que a subunidade B é responsável por ligação celular. As subunidades poderiam ser domínios no mesmo polipéptido cadeia, ou poderiam ser cadeias de polipéptido separadas. As próprias subunidades podem ser oligómeros, por exemplo, a subunidade A de CT consiste em Ai e A2 que são ligados por uma ponte dissulfureto, e sua subunidade B é um homopentâmero. Tipicamente, contacto inicial com uma célula alvo é mediado pela subunidade B e então subunidade A sozinha entra na célula. 2

Estruturas cristalinas [2] sao conhecidas para LT [3], CT [4] e PT [5] .

As toxinas são tipicamente imunogénicas, e foram propostas para uso em vacinas acelulares. Um problema, no entanto, é que as proteínas retêm sua actividade tóxica nas vacinas. Para evitar este problema, mutagénese dirigida ao local de resíduos de local activos chave tem sido usada para retirar actividade enzimática tóxica enquanto retém imunogenicidade [por exemplo, refs. 6 (CT e LT), 7 (PT), 8 etc.]. As vacinas acelulares contra tosse convulsa actuais incluem uma forma de toxina pertussis com duas substituições de aminoácido (Arg9—>Lys e Glu129—>Gly; ' PT-9K/129G' [9]).

Bem como suas propriedades imunogénicas, as toxinas têm sido usadas como adjuvantes. A adjuvanticidade parentérica foi observada em primeiro lugar em 1972 [10] e a adjuvanticidade na mucosa em 1984 [11] . Encontrou-se surpreendentemente em 1993 que as formas destoxifiçadas de as toxinas retêm adjuvanticidade [12]. É um objecto da invenção para proporcionar ainda Toxinas bacterianas ribosilantes de ADP.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

As sequências de aminoácidos de seis diferentes toxinas ribosilantes de ADP de bactérias Gram positivas e Gram negativas são dadas na SEQ ID 1, 3, 4, 5, 6 e 7. Estas toxinas são de Neisseria meningitidis, Streptomyces coelicolor, Mycoplasma pneumoniae, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi, e Streptococcus pyogenes. A existência de toxinas ribosilantes de ADP nestas espécies bacterianas não foram sugeridas anteriormente e, além disso, existe somente um nível baixo de identidade de sequência entre estas toxinas e toxinas tal como CT, LT e PT.

Toxinas mutantes da invenção Toxinas mutantes da invenção 3 A invenção proporciona uma proteína que consiste numa sequência de aminoácidos da SEQ IDs 1, excepto que a sequência de aminoácidos contém entre uma e vinte mutação (ões), em que cada mutação envolve um único aminoácido e em que a(s) mutação(ões) reduzem ou eliminam actividade ribosilante do ADP da proteína.

As mutações podem cada independentemente ser uma substituição, uma inserção, ou uma deleção. As sequências de aminoácidos contêm menos de vinte mutações (por exemplo, 19, 18, 17, 16, 15. 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1) .

Mutações preferidas são substituições de único aminoácido (por exemplo, SEQ IDs 10, 12, 14 & 16) . A invenção também proporciona um processo para diminuir a actividade enzimática de ribosilação de ADP de uma toxina da invenção, que compreende mutar um ou mais resíduos de aminoácido de dita toxina. Isto pode convenientemente ser conseguido pela realização de mutagénese dirigida ao local no ácido nucleico que codifica a toxina. A invenção proporciona ainda uma proteína que pode ser obtida por este processo.

Mutações podem também ser introduzidas para melhorar a estabilidade, por exemplo, a inserção de pontes dissulfureto [13].

As proteínas definidas anteriormente são referidas a seguir no presente documento como "toxinas mutantes da invenção" ou "toxoides da invenção".

Locais preferidos para mutação são dados no Quadro 1, juntamente com mutações preferidas naqueles locais. Proteínas da invenção A invenção proporciona uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de um toxina mutante da invenção. A divulgação também proporciona uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de sequência com relação à sequência de aminoácidos de uma 4 toxina mutante da invenção. 0 grau de identidade de sequência é preferivelmente superior a 50% (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais). Estas proteínas incluem homólogos, ortólogos, variantes alélicos e mutantes funcionais. Tipicamente, 50% de identidade ou mais entre duas proteínas é considerado que é uma indicação de equivalência funcional. Identidade entre proteínas é preferivelmente determinada pelo algoritmo de investigação de homologia Smith-Waterman como implementado no programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando um busca de lacuna afim com parâmetros penalidade de lacuna aberta 12 e penalidade de extensão de lacuna=l.

As toxinas mutantes e proteínas definidas anteriormente são colectivamente referidas a seguir no presente documento como as "proteínas da invenção".

As proteínas da invenção podem, obviamente, ser preparadas por vários meios (por exemplo, expressão recombinante, purificação a partir de hospedeiro nativo, síntese química etc.) e em várias formas (por exemplo, nativa, fusões etc.). São preferivelmente preparados em forma substancialmente pura (isto é, substancialmente livre de proteínas célula hospedeira). A invenção também proporciona as proteínas da invenção (particularmente as toxinas mutantes) para uso como adjuvantes e, em particular, como adjuvante nas mucosas. A invenção também proporciona a utilização de proteínas da invenção no fabrico de um medicamento para provocar uma resposta imune num animal. O medicamento é preferivelmente uma composição imunogénica (por exemplo, uma vacina), e compreenderá, além de uma proteína da invenção, um antigénio contra o qual uma resposta imune é para ser provocada. O medicamento é preferivelmente administrado via a mucosa, por exemplo, por via oral ou intranasal. A invenção também proporciona composições imunogénicas 5 (por exemplo, uma vacina) que compreende uma proteína da invenção em mistura com um segundo antigénio. Também proporciona um kit que compreende uma proteína da invenção e um segundo antigénio para administração simultânea, separada ou sequencial. 0 segundo antigénio é preferivelmente uma das proteínas de N. meningitidis reveladas nas referências 14 a 20. A composição pode compreender um terceiro antigénio, um quarto antigénio, um quinto antigénio etc, um ou mais dos quai8s pode ser seleccionado a partir das Proteínas de N. meningitidis revelado nestas sete referências.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona anticorpo que liga a uma proteína da invenção. Estes podem ser policlonal ou monoclonal e podem ser produzidos por qualquer meio adequado. O anticorpo pode incluir uma etiqueta detectável.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona ácido nucleico que codifica as proteínas da invenção. Estes podem ser usados em reacções de hibridação (por exemplo, Northern ou Southern blots, ou em microarrays de ácido nucleico ou 'chips génicos') e reacções de amplificação (por exemplo, PCR, SDA, SSSR, LCR, NASBA, TMA) etc. A invenção também proporciona ácido nucleico que compreende uma ou mais das SEQ ID 11, 13, 15, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e/ou 26.

Também deveria ser apreciado que a divulgação proporciona ácido nucleico que compreende sequências complementares a aquelas descritas anteriormente (por exemplo, para antisense ou sondagem, ou para uso como iniciadores). O ácido nucleico de acordo com a invenção pode, obviamente, ser preparado de muitas formas (por exemplo, por meio de síntese química, a partir de bibliotecas genómicas ou ADNc, a partir do próprio organismo etc.) e 6 pode tomar várias formas (por exemplo, cadeia simples, cadeia dupla, vectores, iniciadores, sondas etc.). 0 ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser marcado, por exemplo, com uma etiqueta radioactiva ou fluorescente. Isto é particularmente útil onde o ácido nucleico é para ser usado como um iniciador ou sonda, por exemplo, em PCR, LCR ou TMA.

Além disso, o termo "ácido nucleico" inclui ADN e ARN, e também seus análogos, tal como aqueles que contêm estruturas modificadas, e também péptido ácidos nucleicos (PNA) etc.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona vectores que compreendem ácido nucleico da invenção (por exemplo, clonagem ou vectores de expressão) e células hospedeiras transformadas com tais vectores.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona composições que compreendem proteína, anticorpo, e/ou ácido nucleico de acordo com a invenção. Estas composições pode ser adequadas como composições imunogénicas, por exemplo, ou como reagentes de diagnóstico, ou como vacinas. A invenção também proporciona ácido nucleico, proteína, ou anticorpo de acordo com a invenção para uso como medicamentos (por exemplo, vacinas) ou reagentes de diagnóstico. A divulgação também proporciona a utilização de ácido nucleico, proteína, ou anticorpo da invenção no fabrico de: (i) um medicamento para tratar ou prevenir infecção bacteriana; (ii) um reagente de diagnóstico para detectar a presença de bactérias ou de anticorpos desencadeados contra bactérias; e/ou (iii) um reagente que pode provocar anticorpos contra bactérias. As ditas bactérias são preferivelmente Neisseria meningitidis.

Um sumário de técnicas padrão e procedimentos que pode ser utilizados para realizar a invenção (por exemplo, utilizar as sequências reveladas para propósitos de 7 vacinação ou diagnóstico) se segue. Este sumário não é uma limitação à invenção mas, ao invés disso, dá exemplos gue podem ser usados, mas não são necessários.

Geral A prática da presente invenção utilizará, a menos gue seja indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, ADN recombinante, e imunologia, que estão dentro da perícia na especialidade. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, por exemplo, em Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Third Edition (2001); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D.

Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principies and Practice, Second Edition (Springer- Verlag. N.Y.), and Handbook of

Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds 1986). Abreviações padrão para nucleótidos e aminoácidos são usados nesta memória descritiva.

Definições

Uma composição que contém X é "substancialmente livre de" Y quando pelo menos 85% em peso do total X+Y na composição é X. Preferivelmente, X compreende pelo menos cerca de 90% em peso do total de X+Y na composição, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% ou ainda 99% em peso. como 0 termo "que compreende" significa "que inclui" bem "que consiste", por exemplo, uma composição "que compreende" X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y. 0 termo "heterólogo" refere-se a dois componentes biológicos que não são encontrados juntamente na natureza. Os componentes podem ser células hospedeiras, genes, ou regiões reguladoras, tal como promotores. Embora os componentes heterólogos não sejam encontrados juntamente na natureza, eles podem funcionar juntos, como quando um promotor heterólogo a um gene é ligado operativamente ao gene. Outro exemplo é onde uma sequência estafilococos é heteróloga a uma célula hospedeira de ratinho. Um exemplo adicional poderia ser dois epitopos das mesmas ou diferentes proteínas que foram montadas numa única proteína numa disposição não encontrada na natureza.

Uma "origem de replicação" é uma sequência de polinucleótido que inicia e regula a replicação de polinucleótidos, tal como um vector de expressão. A origem de replicação se comporta como um unidade autónoma de replicação de polinucleótido dentro de uma célula, capaz de replicação sob seu próprio controlo. Uma origem de replicação pode ser necessária para um vector replicar numa célula hospedeira particular. Com certas origens de replicação, um vector de expressão pode ser reproduzido num número alto de cópias na presença das proteínas apropriadas dentro da célula. Os exemplos de origens são as sequências que se replicam de forma autónoma, que são eficazes em levedura; e o antigénio T virai, eficaz em células COS-7.

Como são usados no presente documento, um "variante alélico" de uma molécula de ácido nucleico, ou região, para cuja sequência de ácido nucleico é proporcionada no presente documento é uma molécula de ácido nucleico, ou região, que ocorre essencialmente no mesmo locus no genoma de outro ou segundo isolado, e que, devido a variação 9 natural causada por, por exemplo, mutação ou recombinação, tem uma sequência de ácido nucleico similar, mas não idêntica. Uma região codificante de variante alélico tipicamente codifica uma proteína que tem actividade similar a aquela da proteína codificada pelo gene a qual está sendo comparada. Um variante alélico pode também compreender uma alteração nas regiões não traduzidas 5' ou 3' do gene, tal como em regiões de controlo reguladoras (por exemplo, veja-se a patente US 5.753.235).

Sistemas de expressão

Sequências de nucleótido podem ser expressas numa variedade de diferentes sistemas de expressão; por exemplo, aqueles usados com células de mamífero, baculovírus, plantas, bactérias, e levedura, i. Sistemas de mamíferos

Sistemas de expressão de mamíferos são conhecidos na técnica. Um promotor de mamífero é qualquer sequência de ADN capaz de se ligar a ARN polimerase de mamífero e iniciar transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (por exemplo gene estrutural) em ARNm. Um promotor terá uma região de iniciação de transcrição, que é usualmente colocada proximal à extremidade 5' da sequência codificante, e uma TATA box, usualmente localizado 25-30 pares de base (pb) a montante do local de iniciação de transcrição. Pensa-se que a TATA box orienta a ARN polimerase II para começar a síntese de ARN no local correcto. Um promotor de mamífero também conterá um elemento promotor a montante, usualmente localizado dentro de 100-200 pb a montante da TATA box. Um elemento promotor a montante determina a taxa em que transcrição é iniciada e pode agir em orientação [Sambrook et al.].

Genes virais de mamíferos são com frequência altamente expressos e têm uma ampla gama de hospedeiros; portanto, sequências que codificam genes virais de mamíferos proporcionam sequências de promotor particularmente úteis. 10

Os exemplos incluem o promotor precoce SV40, promotor vírus tumor mamário de ratinho LTR, promotor adenovírus principal tardio (Ad MLP), e promotor do vírus da herpes. Além disso, sequências derivadas de genes não virais (por exemplo, o gene de metaloteioneína murina) também proporcionam sequências promotoras úteis. A expressão pode ser constitutiva ou regulada (induzível), dependendo do promotor pode ser induzida com glucocorticóide em células respondedoras a hormonas. A presença de um elemento potenciador (potenciador) , combinado com os elementos promotores descritos anteriormente, aumentará usualmente os níveis de expressão. Um potenciador é uma sequência reguladora de ADN que pode estimular a transcrição até 1000 vezes quando ligada a promotores homólogos ou heterólogos, com o começo da síntese no local de iniciação normal de ARN. Os potenciadores são também activos quando colocados a montante ou a jusante do local de iniciação de transcrição, em orientação normal ou virada, ou a uma distância de mais de 1000 nucleótidos do promotor [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the cell, 2a ed.]. Elementos potenciadores derivados de vírus podem ser particularmente úteis, à medida que usualmente têm uma gama mais ampla de hospedeiros. Os exemplos incluem o potenciador de gene precoce SV40 [Dijkema et al (1985) EMBO J. 4:761] e o potenciador/promotores derivados da repetição terminal longa (LTR) do Vírus do Sarcoma de Rous [Gorman et al. (1982b) PNAS USA 79:6777] e do citomegalovírus humano [Boshart et al. (1985) Cell 41:521]. Adicionalmente, alguns potenciadores são reguláveis e tornam-se activos somente na presença de um indutor, tal como uma hormona ou ião de metal [Sassone-Corsi e Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; M aniatis et al. (1987) Science 236: 1237].

Uma molécula de ADN pode ser expressa 11 intracelularmente em células de mamífero. Uma sequência promotora pode ser directamente ligada com a molécula de ADN, em cujo caso o primeiro aminoácido na terminação N de a proteína recombinante será sempre uma metionina, que é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se for desejado, a terminação N pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

Alternativamente, proteínas estranhas podem também ser segregadas da célula nos meios de crescimento por meio da criação de moléculas quiméricas de ADN que codificam uma proteína de fusão compreendida de um fragmento de sequência líder que trata de secreção da proteína estranha em células de mamífero. Preferivelmente, existem locais de processamento codificados entre o fragmento líder e o gene estranho que pode ser clivado in vivo ou in vitro. 0 fragmento de sequência líder usualmente codifica um péptido sinal compreendido de aminoácidos hidrofóbicos que direccionam a secreção da proteína da célula. A sequência líder tripartida de adenovírus é um exemplo de uma sequência líder que trata da secreção de uma proteína estranha em células de mamífero.

Usualmente, as sequências de terminação de transcrição e poliadenilação reconhecidas pelas células de mamífero são regiões reguladoras localizadas 3' ao codão de terminação de tradução e assim, juntamente com os elementos promotores, flanqueiam a sequência codificante. 0 terminal 3' do ARNm maduro é formado por poliadenilação e clivagem pós-transcricional específica ao local [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot & Whitelaw (1988) "Termination and 3' end Processing of eukaryotic RNA". Em Transcription and splicing (ed. B.D. Hames e D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sei. 14:105]. Estas sequências direccionam a transcrição de um ARNm que pode ser traduzido no polipéptido codificado pelo ADN. Os exemplos de terminador de transcrição/sinais de 12 poliadenilação incluem aqueles derivados de SV40 [Sambrook et al] .

Usualmente, os componentes descritos acima, que compreendem um promotor, sinal de poliadenilação, e sequência de terminação de transcrição são colocados juntos em construções de expressão. Os potenciadores, intrões com locais aceitadores e dadores de splice funcional, e sequências lider podem também ser incluídos numa construção de expressão, se for desejado. As construções de expressão são com frequência mantidas num replicão, tal como um elemento extracromossomal (por exemplo, plasmideos) com capacidade de manutenção estável num hospedeiro, tal como células de mamífero ou bactérias. Sistemas de replicação em mamíferos incluem aqueles derivados de vírus animais, que requerem factores de transactivação para replicar. Por exemplo, os plasmideos que contêm os sistemas de replicação de papovavírus, tal como SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175] ou poliomavirus, replicam a um número extremamente alto de cópias na presença do antigénio T virai apropriado. Exemplos adicionais de replicões de mamíferos incluem aqueles derivados de papilomavírus bovino e vírus do Epstein-Barr. Adicionalmente, o replicão pode ter dois sistemas de replicação, o que permite assim ao mesmo ser mantido, por exemplo, em células de mamífero para a expressão e num hospedeiro procariótico para a clonagem e amplificação. Os exemplos de tais vectores transportadores de bactérias-mamíferos incluem pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946] e pHEBO [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074]. O procedimento de transformação usado depende do hospedeiro a ser transformado. Os métodos para a introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamífero são conhecidos na técnica e incluem transfecção mediada por dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, 13 electroporação, encapsulação do(s) polinucleótido(s) em lipossomas, e microinjecção directa do ADN em núcleos.

Linhas de células de mamíferos disponíveis como hospedeiros para a expressão são conhecidas na técnica e incluem muitas linhas de células imortalizadas disponíveis da Colecção Americana de Culturas Celulares (ATCC), incluindo, mas não limitadas a, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), e um número de outras linhas de células, ii. Sistemas de Baculovirus 0 polinucleótido que codifica a proteína pode também ser inserido num vector de expressão de insectos adequado, e é liqado operativamente aos elementos de controlo dentro desse vector. Construção de vectores utiliza técnicas que são conhecidas na especialidade. Geralmente, os componentes do sistema de expressão incluem um vector de transferência, usualmente um plasmídeo bacteriano, que contém ambos um fragmento do genoma de baculovirus, e um local de restrição conveniente para a inserção do gene ou genes heterólogos a serem expressos; um baculovirus do tipo selvagem com uma sequência homóloga ao fragmento específico de baculovirus no vector de transferência (isto tem em consideração a recombinação homóloga do gene heterólogo no genoma de baculovirus); e células hospedeiras de insectos apropriadas e meios de crescimento.

Após a inserção da sequência de ADN que codifica a proteína no vector de transferência, o vector e o genoma virai tipo selvagem são transfectados numa célula hospedeira de insectos onde permite-se que o vector e genoma virai se recombinem. 0 vírus recombinante empacotado é expresso e placas recombinantes são identificadas e purificadas. Os materiais e métodos para sistemas de expressão de baculovírus/célula de insecto estão 14 comercialmente disponíveis na forma de kit de, entre outros, Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac" kit) . Estas técnicas são geralmente conhecidas aos peritos na especialidade e completamente descritas em Summers & Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (a seguir no presente documento "Summers & Smith").

Antes da inserção da sequência de ADN que codifica a proteína no genoma de baculovírus, os componentes descritos acima, que compreendem um promotor, sequência líder (se for desejado), sequência codificante, e sequência de terminação de transcrição, são usualmente montados numa construção de substituição intermediária (vector de transferência). Isto pode conter um único gene e elementos reguladores operativamente ligados; múltiplos genes, cada um com o seu próprio conjunto de elementos reguladores operativamente ligados; ou múltiplos genes, regulados pelos mesmos conjuntos de elementos reguladores. Construções de substituição intermediária são com frequência mantidas num replicão, tal como um elemento extracromossomal (por exemplo, plasmídeos) com capacidade de manutenção estável num hospedeiro, tal como uma bactéria. 0 replicão terá um sistema de replicação, o que permite assim que o mesmo seja mantido num hospedeiro adequado para a clonagem e amplificação.

Actualmente, o vector de transferência mais comummente usado para introduzir genes estranhos em AcNPV é pAc373. Muitos outros vectores, conhecidos aos peritos na especialidade, foram também desenhados. Estes incluem, por exemplo, pVL985 (que altera o codão de iniciação de polihedrina desde ATG até ATT, e que introduz um local de clonagem BamHI de 32 pb a jusante do ATT; veja-se Luckow & Summers, Virology (1989) 17:31. 0 plasmídeo usualmente também contém o sinal de poliadenilação de poliedrina (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) e um gene de resistência a 15 ampicilina procariótico (amp) e origem de replicação para a selecção e propagação em E. coli.

Vectores de transferência de baculovirus usualmente contêm um promotor de baculovirus. Um promotor de baculovirus é qualguer sequência de ADN capaz de ligar-se a uma ARN polimerase de baculovirus e iniciar a transcrição a jusante (5' a 3') de uma sequência codificante (por exemplo, gene estrutural) em ARNm. Um promotor terá uma região de iniciação de transcrição que é usualmente colocada proximal à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação de transcrição usualmente inclui um local de ligação de ARN polimerase e um local de iniciação de transcrição. Um vector de transferência de baculovirus pode também ter um segundo domínio chamado potenciador, que, se estiver presente, é usualmente distai ao gene estrutural. A expressão pode ser regulada ou constitutiva.

Genes estruturais, abundantemente transcritos em momentos posteriores num ciclo de infecção virai, proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Os exemplos incluem sequências derivadas do gene que codifica a proteína poliédrica virai, Friesen et al., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression," em: The Molecular Biology of Baculovirus (ed. Walter Doerfler); Publ. EPO N° 127 839 e 155 476; e o gene que codifica a proteína plO, Vlak et al., (1988). J. Gen. Virol. 69:765. ADN que codifica sequências sinal adequadas pode ser derivado de genes para proteínas de baculovirus ou insectos segregadas, tal como the gene de poliedrina de baculovirus (Carbonell et al. (1988) Gene, 73:409). Alternativamente, uma vez que os sinais para modificações pós-traducionais de células de mamíferos (tais como clivagem de péptido sinal, clivagem proteolítica, e fosforilação) parecem que são reconhecidas pela célula de insectos, e os sinais requeridos para a secreção e acumulação nuclear também 16 parecem que são conservados entre the células de invertebrados e células de vertebrados, sequências líder não de origem de insectos, tais como aqueles derivados de genes que codificam α-interferão humano, Maeda et ai., (1985), Nature 315:592; péptido de libertação de gastrina humana, Lebacq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 humana, Smith et al., (1985) Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA, 82:8404; IL-3 de ratinho, (Miyajima et al., (1987) Gene 58:273; e glucocerebrosidase humana, Martin et al. (1988) ADN, 7:99, pode também ser usados para tratar da secreção em insectos.

Um polipéptido ou poliproteína recombinante pode ser expresso intracelularmente ou, se for expresso com as sequências reguladoras apropriadas, pode ser segregado. Boa expressão intracelular de proteínas estranhas não fusionadas usualmente requer genes heterólogos que de maneira ideal têm uma sequência líder curta que contém sinais de iniciação de tradução adequados que um sinal de iniciação ATG. Se for desejado, metionina na terminação N pode ser clivada da proteína madura por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

Alternativamente, poliproteínas ou proteínas recombinantes que não são naturalmente segregadas podem ser segregadas da célula de insecto por meio da criação de moléculas quiméricas de ADN que codificam uma proteína de fusão compreendida de um fragmento de sequência líder que trata da secreção da proteína estranha em insectos. O fragmento de sequência líder usualmente codifica um péptido sinal compreendido de aminoácidos hidrofóbicos que direccionam a translocação da proteína no retículo endoplasmático.

Após a inserção da sequência de ADN e/ou o gene que codifica o precursor de produto de expressão da proteína, uma célula hospedeira de insecto é co-transformada com o ADN heterólogo do vector de transferência e o ADN genómico 17 de baculovírus do tipo selvagem -- usualmente por co-transfecção. 0 promotor e sequência de terminação de transcrição da construção compreenderá usualmente uma secção de 2-5 kb do genoma de baculovírus. Os métodos para introduzir ADN heterólogo no local desejado no vírus baculovírus são conhecidos na técnica. (Veja-se Summers & Smith supra; Ju et al. (1987); Smith et al.r Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; e Luckow e Summers (1989)). Por exemplo, a inserção pode ser num gene tal como o gene de poliedrina, por meio de recombinação cruzada dupla homóloga; a inserção pode também ser num local de enzima restrição engenheirado no gene de baculovírus desejado. Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. A sequência de ADN, quando clonada no lugar do gene de poliedrina no vector de expressão, é flanqueada tanto em 5' como 3' por sequências específicas de poliedrina e é posicionada a jusante do promotor de poliedrina. 0 vector de expressão de baculovírus recetemente formado é subsequentemente empacotado num baculovírus recombinante infeccioso. A recombinação homóloga ocorre em frequência baixa (entre cerca de 1% e cerca de 5%) ; assim, a maior parte dos vírus produzidos após a cotransfecção é ainda vírus do tipo selvagem. Portanto, um método é necessário para identificar vírus recombinante. Uma vantagem do sistema de expressão é um rastreio visual que permite que o vírus recombinante seja distinguido. A proteína poliedrina, que é produzida pelo vírus nativo, é produzida em níveis muito altos nos núcleos de células infectadas em momentos posteriores após a infecção virai. A proteína poliedrina acumulada forma corpos de oclusão que também contêm partículas incrustadas. Estes corpos de oclusão, até 15 pm de tamanho, são altamente refractivos, dando aos mesmos uma aparência luminosa brilhante que é facilmente visualizada sob o microscópio de luz. As células infectadas com vírus recombinante não possuem corpos de 18 oclusão. Para distinguir vírus recombinante do vírus do tipo selvagem, o sobrenadante de transfecção é colocado em placas sobre uma monocamada de células de insectos por meio de técnicas conhecidas aos peritos na especialidade. A saber, as placas são rastreadas sob o microscópio de luz para a presença (indicativo de vírus do tipo selvagem) ou ausência (indicativo de vírus recombinante) de corpos de oclusão. "Current Protocols in Microbiology" Vol. 2 (Ausubel et al. eds) em 16,8 (Sup. 10, 1990); Summers & Smith, supra; Miller et al. (1989).

Vectores de expressão de baculovírus recombinante foram desenvolvidos para a infecção em diversas células de insectos. Por exemplo, baculovírus recombinantes foram desenvolvidos para, entre outros: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, e Trichoplusia ni (documento WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; e veja-se geralmente, Fraser, et al. (1989) In vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

As células e meios de cultura celular estão comercialmente disponíveis tanto para a expressão directa como fusão de polipéptidos heterólogos num baculovírus/sistema de expressão; a tecnologia de cultura celular é geralmente conhecida aos peritos na especialidade. Veja-se, por exemplo, Summers & Smith supra.

As células de insectos modificadas podem então ser crescidas num meio nutriente apropriado, que toma em consideração a manutenção estável do(s) plasmídeo(s) presente(s) no hospedeiro insecto modificado. Onde o gene de produto de expressão está sob controlo induzível, o hospedeiro pode ser crescido até densidade alta, e a expressão induzida. Alternativamente, onde a expressão é constitutiva, o produto será continuamente expresso no meio e o meio nutriente precisa ser continuamente circulado, ao 19 mesmo tempo em que se remove o produto de interesse e se aumenta os nutrientes depletados. 0 produto pode ser purificado por tais técnicas como cromatografia, por exemplo, HPLC, cromatografia por afinidade, cromatografia de permuta de ião, etc.; electroforese; centrifugação de gradiente de densidade; extracção de solvente, etc. Quando for apropriado, o produto pode ser purificado adicionalmente, como for requerido, de modo a retirar substancialmente quaisquer proteínas de insectos que estão também presentes no meio, de modo a proporcionar um produto que seja pelo menos substancialmente livre de detritos de hospedeiros, por exemplo, proteínas, lípidos e polissacáridos.

Com a finalidade de obter a expressão de proteína, células hospedeiras recombinantes derivadas dos transformantes são incubadas sob condições que permitem a expressão da sequência que codifica a proteína recombinante. Estas condições variarão dependendo da célula hospedeira seleccionada. No entanto, as condições são facilmente verificáveis aos peritos médios na especialidade, com base no que é conhecido na técnica, iii. Sistemas Vegetais

Existem muitos sistemas de expressão genética da planta inteira e de culturas de células vegetais conhecidos na técnica. Os sistemas de expressão genética de células vegetais exemplares incluem aqueles descritos nas patentes, tais como: US 5.693.506; US 5.659.122; e US 5.608.143. Exemplos adicionais de expressão genética em cultura de células vegetais foram descritos por Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). As descrições de péptidos sinal de proteína vegetal podem ser encontradas além das referências descritas anteriormente em Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler et al., Plant Molecular

Biology 3: 407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein et al., Gene 55:353-356 (1987); 20

Whittier et al., Nucleic Acid Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu et al., Gene 122:247-253 (1992). Uma descrição da regulação de expressão de gene vegetal pela fitohormona, ácido giberélico e enzimas segregadas induzida por ácido giberélico pode ser encontrada em Jones & MacMillin, páginas 21-52 de Advanced Plant Physiology. Malcolm B. Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited. Referências que descrevem outros genes regulados metabolicamente: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038(1990); M aas et al., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel & Hickey, PNAS USA. 84:1337-1339 (1987).

Tipicamente, usando técnicas conhecidas na especialidade, uma sequência de polinucleótido desejado é inserida numa cassete de expressão que compreende elementos reguladores genéticos projectados para a operação em plantas. A cassete de expressão é inserida num vector de expressão desejado com sequências acompanhantes a montante e a jusante da cassete de expressão adequada para a expressão num hospedeiro vegetal. As sequências acompanhantes serão de origem de plasmideo ou virai e proporcionam as características necessárias ao vector para permitir que os vectores movam ADN de um hospedeiro de clonagem original, tal como bactérias, ao hospedeiro vegetal desejado. A construção de vectores básica de bactérias/vegetais proporcionará preferivelmente uma ampla gama de hospedeiros de replicação de origem procariótica; um marcador procariótico seleccionável; e, para transformações com Agrobacterium, sequências de ADN T para a transferência mediada por Agrobacterium a cromossomas vegetais. Onde o gene heterólogo não é prontamente receptivo a detecção, a construção terá preferivelmente também um gene marcador seleccionável adequado para a determinação de se uma célula foi transformada. Uma revisão geral de marcadores adequados, por exemplo, para os membros 21 da família grass, é encontrada em Wilmink & Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11(2):165-185.

As sequências adequadas para permitir a integração da sequência heteróloga no genoma vegetal são também recomendadas. Estas poderiam incluir sequências de transposão e similares para a recombinação homóloga bem como sequências Ti que permitem a inserção aleatória de uma cassete de expressão heteróloga num genoma vegetal. Marcadores seleccionáveis procarióticos adequados incluem resistência para antibióticos tais como ampicilina ou tetraciclina. Outras sequências de ADN que codificam funções adicionais podem também estar presentes no vector, como é conhecido na técnica.

As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem ser incluídas numa cassete de expressão para a expressão da(s) proteína(s) de interesse. Usualmente, haverá somente uma cassete de expressão, embora duas ou mais sejam possíveis. A cassete de expressão recombinante conterá além da sequência que codifica proteína heteróloga os seguintes elementos, uma região promotora, sequências vegetais não traduzidas 5', codão de iniciação dependendo de se ou não o gene estrutural é equipado com um, e uma sequência de transcrição e terminação de tradução. Locais de enzima de restrição únicos nas extremidades 5' e 3' da cassete contam com a fácil inserção num vector preexistente.

Uma sequência heteróloga codificante pode ser para qualquer proteína relacionada com a presente invenção. A sequência que codifica a proteína de interesse codificará um péptido sinal que permite o processamento e translocação da proteína, quando for apropriado, e não terá usualmente qualquer sequência que poderia ter como resultado a ligação da proteína desejada da invenção a uma membrana. Uma vez que, para a maior parte, a região de iniciação transcricional será para um gene que é expresso e 22 translocalizado durante a germinação, por meio da utilização do péptido sinal que trata de translocação, um pode também tratar da translocação da proteína de interesse. Nesse sentido, a proteína ou as proteínas de interesse serão translocalizadas das células em que são expressas e podem ser eficientemente colhidas. Tipicamente a secreção em sementes é através da aleurona ou epitélio escutelar de uma camada no endosperma da semente. Embora não seja requerido que a proteína seja segregada das células nas quais a proteína é produzida, isto facilita o isolamento e purificação da proteína recombinante.

Uma vez que a última expressão do produto de gene desejado será numa célula eucariótica é desejável determinar se qualquer porção do gene clonado contém sequências que serão processadas como intrões pela maquinaria de spliceossoma do hospedeiro. Se for assim, a mutagénese dirigida ao local da região de "intrão" pode ser conduzida para prevenir a perda de uma porção da mensagem genética como um código de intrão falso, Reed & Maniatis, Cell 41:95-105, 1985. O vector pode ser microinjectado directamente em células vegetais por meio da utilização de micropipetas para transferir mecanicamente o ADN recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genet, 202:179-185, 1985. O material genético pode também ser transferido na célula vegetal usando polietileno glicol, Krens, et al., Nature, 296, 72-74, 1982. Outro método de introdução de segmentos de ácido nucleico é penetração balística a alta velocidade por partículas pequenas com o ácido nucleico dentro da matriz de pérolas pequenas ou partículas, ou na superfície, Klein, et al., Nature, 327, 70-73, 1987 e Knudsen e Muller, 1991, Planta, 185:330-336 ensinam o bombardeamento de partículas de endosperma de cevada para criar cevada transgénica. Ainda outro método de introdução seria fusão de protoplastos com outras entidades, minicélulas, células, 23 lisossomas ou outros corpos de superfície lipídica fusível, Fraley, et al., PNAS USA, 79, 1859-1863, 1982.*** 0 vector também pode ser introduzido nas células vegetais por electroporação (Fromm et al., PNAS USA 82:5824, 1985). Nesta técnica, protoplastos de planta são electroporados em presença de plasmídeos que contêm a construção de gene. Impulsos eléctricos de intensidade de campo alto permeabilizam reversivelmente as biomembranas permitindo a introdução dos plasmídeos. Os protoplastos de planta electroporados voltam a formar a parede celular, dividem e formam calo de planta. Todas as plantas das quais protoplastos podem ser isolados e cultivados para dar plantas regeneradas completas podem ser transformadas pela presente invenção de maneira que se recuperem plantas completas que contêm o gene transferido. Se sabe que praticamente todas as plantas podem ser regeneradas a partir de células cultivadas ou tecidos, que incluem, mas não se limitam a, todas as espécies importantes de cana de açúcar, beterraba sacarina, algodão, frutos e outras árvores, legumes e verduras. Algumas plantas adequadas incluem, por exemplo, espécies dos géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotlana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum e Datura.

Os meios para a regeneração variam entre espécies de plantas, mas geralmente em primeiro lugar é proporcionada uma suspensão de protoplastos transformados que contêm cópias do gene heterólogo. Forma-se tecido de calo e podem ser induzidos brotos de calo e posteriormente formar raízes. Alternativamente, a formação de embriões pode ser induzida a partir da suspensão de protoplastos. Estes embriões germinam como embriões naturais para formar plantas. Os meios de cultivo conterão geralmente diversos aminoácidos e hormonas tais como auxina e citocininas. Também é vantajoso adicionar ácido glutámico e prolina ao meio, especialmente para espécies tais como trigo e alfalfa. Os brotos e raízes normalmente se desenvolvem simultaneamente. A regeneração eficiente dependerá do meio, do genótipo e da história do cultivo. Se estas três variáveis estão controladas, então a regeneração é completamente reproduzível e repetível.

Em alguns sistemas de cultivo de células de planta, a proteína desejada da invenção pode ser segregada ou, alternativamente, a proteína pode ser extraída da planta completa. Se a proteína desejada da invenção é segregada no meio, pode ser recolhida. Alternativamente, os embriões e as semi-sementes sem embrião ou outro tecido de planta podem ser rompidos mecanicamente para gue liberte gualguer proteína segregada entre células e tecidos. A mistura pode ser suspensa numa solução de tampão para recuperar proteínas solúveis. Então, o isolamento convencional de proteínas e métodos de purificação serão usados para purificar a proteína recombinante. Parâmetros de tempo, temperatura, pH, oxigénio e volumes serão ajustados por meio de métodos de rotina para optimizar a expressão e recuperação de proteína heteróloga. iv. Sistemas bacterianos

As técnicas de expressão bacteriana são conhecidas na técnica. Um promotor bacteriano é gualguer seguência de ADN capaz de se ligar a ARN polimerase bacteriana e iniciar a transcrição na direcção 3' de uma seguência codificante (por exemplo, gene estrutural) em ARNm. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição que está normalmente situada proximal à extremidade 5' da sequência codificante. 25

Esta região de iniciação da transcrição normalmente inclui um local de ligação a ARN polimerase e um local de iniciação da transcrição. Um promotor bacteriano pode também ter um segundo domínio chamado um operador, que pode sobrepor um local de ligação a ARN polimerase adjacente no qual começa a síntese de ARN. 0 operador permite a transcrição regulada (induzível) negativa, já que uma proteína repressora de genes pode ligar o operador e assim inibir a transcrição de um gene específico. A expressão constitutiva pode ser produzida em ausência de elementos reguladores negativos tais como o operador. Além disso, a regulação positiva pode ser conseguida por uma sequência de ligação a proteína activadora de genes que, se está presente, está normalmente proximal (5') à sequência de ligação a ARN polimerase. Um exemplo de uma proteína activadora de genes é a proteína activadora de catabolitos (CAP) , que ajuda a iniciar a transcrição do operão lac em E. coli [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173). Portanto, a expressão regulada pode ser tanto positiva como negativa, tanto potenciando como reduzindo assim a transcrição.

As sequências que codificam as enzimas da via metabólica proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem sequências promotoras derivadas de enzimas metabolizantes de açúcares tais como galactose, lactose (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198:1056] e maltose. Exemplos adicionais incluem sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticas tais como triptofano (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; patente de U.S. 4.738.921; documentos EP-A-0036776 e EP-A-0121775]. O sistema promotor de g-laotamase (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes" em Interferon 3 (ed. Gresser)], bacteriófago lambda PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128] e os sistemas 26 promotores de T5 [patente de U.S. 4.689.406] também proporcionam sequências promotoras úteis.

Além disso, os promotores sintéticos que não são produzidos na natureza também atuam de promotores bacterianos. Por exemplo, as sequências de activação da transcrição de um promotor bacteriano ou bacteriófago podem ser ligadas com as sequências do operão de outro promotor bacteriano ou bacteriófago, criando um promotor híbrido sintético [patente de U.S. 4.551.433]. Por exemplo, o promotor tac é um promotor híbrido trp-lac que compreende tanto o promotor trp como as sequências do operão lac que está regulado pelo repressor lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; de Boer et al. (1983) PNAS USA 80:21]. Além disso, um promotor bacteriano pode incluir promotores que são produzidos naturalmente de origem não bacteriana que têm a capacidade de se ligar a ARN polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Um promotor que é produzidp naturalmente de origem não bacteriana também pode ser acoplado a uma ARN polimerase compatível para produzir altos níveis de expressão de alguns genes em procariotas. O sistema de ARN polimerase T7/promotor de bacteriófago é um exemplo de um sistema de promotor acoplado [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) PNAS USA 82:1074]. Além disso, um promotor híbrido também pode compreender um promotor de bacteriófago e uma região de operador de E. coli (documento EP-A-0 267 851).

Além de uma sequência promotora em funcionamento, um local de ligação a ribossoma eficiente também é útil para a expressão de genes estranhos em procariotas. Em E. coli, o local de ligação a ribossoma se chama a sequência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um codão de iniciação (ATG) e uma sequência de 3-9 nucleótidos de comprimento localizada 3-11 nucleótidos na direcção 5' do codão de iniciação [Shine et al. (1975) Nature 254:34] . Acredita-se que a sequência de SD promove a ligação de ARNm ao ribossoma pelo 27 emparelhamento de bases entre a sequência de SD e 3 ' e de ARNr de E. coli 16S [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA". Em Biological regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)].

Uma molécula de ADN pode ser expressa intracelularmente. Uma sequência promotora pode se ligar directamente com a molécula de ADN, em cujo caso o primeiro aminoácido na extremidade N nunca será uma metionina, que está codificada pelo codão de iniciação ATG. Se for desejado, a metionina na extremidade N pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio ou por tanto incubação in vivo como in vitro com uma peptidase da extremidade N de metionina bacteriana (documento EPO-A-O 219 237).

As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa à expressão directa. Normalmente, uma sequência de ADN que codifica a porção da extremidade N de uma proteína bacteriana endógena, ou outra proteína estável, é fusionada com a extremidade 5' de sequências codificantes heterólogas. Após a expressão, esta construção proporcionará uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene da célula de bacteriófago lambda pode se ligar na extremidade 5' de um gene estranho e ser expressa em bactérias. A proteína de fusão resultante retém preferivelmente um local para uma enzima de processamento (factor Xa) para clivar a proteína de bacteriófago do gene estranho [Nagai et al. (1984) Nature 309:810]. As proteínas de fusão também podem ser preparadas com sequências dos genes lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60 : 197], trpE [Allen et al. (1987) 1 . Biotechnol. 5:93; Makoff et ai. (1989) J. Gene. Microbiol. 135:11] e Chey [documento EP-A-0 324 647]. A sequência de ADN na ligação das duas sequências de aminoácidos pode ou pode não codificar um local clivável. Outro exemplo é uma proteína de fusão de ubiquitina. Uma 28 proteína de fusão tal é preparada com a região de ubiquitina que preferivelmente retém um local para uma enzima de processamento (por exemplo, protease de processamento específico de ubiquitina) para clivar a ubiquitina da proteína estranha. Em todo este método, a proteína estranha nativa pode ser isolada [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7:698]. Alternativamente, as proteínas estranhas também podem ser segregadas da célula criando moléculas de ADN quiméricas que codificam uma proteína de fusão que compreende um fragmento da sequência de péptidos sinal que proporciona a secreção da proteína estranha em bactérias [patente de U.S. 4336336]. 0 fragmento da sequência sinal normalmente codifica um péptido sinal que compreende aminoácidos hidrófobos que dirigem a secreção da proteína da célula. A proteína é tanto segregada nos meios de crescimento (bactérias Gram-positivas) como no espaço periplásmico localizado entre a membrana interna e externa da célula (bactérias Gram-negativas). Preferivelmente, existem locais de processamento que podem ser clivados tanto in vivo como in vitro codificados entre o fragmento do péptido sinal e o gene estranho. 0 ADN que codifica sequências sinal adequadas pode ser derivado de genes para proteínas bacterianas segregadas tais como o gene da proteína da membrana externa de E. coli (ompA) [Masui et al. (1983), em: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3:2437] e a sequência sinal da fosfatase alcalina de E. coli (phoA) [Oka et al. (1985) PNAS USA 82:72121]. Como exemplo adicional, a sequência sinal do gene de alfa-amilase de diversas estirpes de Bacillus pode ser usado para segregar proteínas heterólogas de B. subtilis [Paiva et al. (1982) PNAS USA 79:5582; documento EP-A-0 244 042].

Normalmente, as sequências de terminação da transcrição reconhecidas por bactérias são regiões reguladoras 29 localizadas 3 ' com respeito ao codão de terminação da tradução e, portanto, juntamente com o promotor flanqueiam a sequência codificante. Estas sequências diriqem a transcrição de um ARNm que pode ser traduzido no polipéptido codificado pelo ADN. As sequências de terminação da transcrição frequentemente incluem sequências de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos que podem formar estruturas de talo-volta que ajudam na terminação da transcrição. Exemplos incluem sequências de terminação da transcrição derivadas de genes com promotores fortes tais como o gene trp em E. coli, além disso de outros genes biossintéticos.

Normalmente, os componentes anteriormente descritos, que compreendem um promotor, sequência sinal (se for desejado), sequência codificante de interesse e sequência de terminação da transcrição, são postos juntos em construções de expressão. As construções de expressão são mantidas frequentemente num replicão, tal como um elemento extracromossómico (por exemplo, plasmídeos), que pode ser mantido de forma estável num hospedeiro, tal como bactérias. O replicão terá um sistema de replicação, permitindo assim que se mantenha num hospedeiro procariota tanto para a expressão como para a clonagem e amplificação. Além disso, um replicão pode ser um plasmídeo tanto de alto como de baixoo número de cópias. Um plasmídeo de alto número de cópias terá geralmente um número de cópias que varia desde aproximadamente 5 até aproximadamente 200, e normalmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Um hospedeiro que contém um plasmídeo de alto número de cópias conterá preferivelmente pelo menos aproximadamente 10, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 20 plasmídeos. Pode ser seleccionado um vector com tanto alto como baixo número de cópias, dependendo do efecto do vector e a proteína estranha sobre o hospedeiro.

Alternativamente, as construções de expressão podem ser 30 integradas no genoma bacteriano com um vector integrante. Os vectores integrantes normalmente contêm pelo menos uma sequência homóloga ao cromossoma bacteriano que permite que o vector se integre. As integrações parecem resultar de recombinações entre ADN homólogo no vector e o cromossoma bacteriano. Por exemplo, os vectores integrantes construídos com ADN de diversas estirpes de Bacillus se integram no cromossoma de Bacillus (documento EP-A-0 127 328). Os vectores integrantes também podem compreender sequências de bacteriófago ou de transposão.

Normalmente, as construções de expressão extracromossómicas e integrantes podem conter marcadores de selecção para permitir a selecção de estirpes bacterianas que foram transformadas. Os marcadores de selecção podem ser expressos no hospedeiro bacteriano e podem incluir genes que fazem com que as bactérias sejam resistentes a fármacos tais como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) e tetraciclina [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Os marcadores de selecção também podem incluir genes biossintéticos tais como aqueles nas vias biossintéticas de histidina, triptofano e leucina. Alternativamente, alguns dos componentes anteriormente descritos podem ser postos juntos em vectores de transformação. Os vectores de transformação compreendem normalmente um marcador de selecção que tanto se mantém num replicão como se desenvolve num vector integrante, como foi descrito anteriormente.

Os vectores de expressão e de transformação, tanto replicões extra-cromossómicos como vectores integrantes, foram desenvolvidos para a transformação em muitas bactérias. Por exemplo, foram desenvolvidos vectores de expressão para, entre outras, as seguintes bactérias: Bacillus subtilis [Paiva et al. (1982) PNAS USA 79:5582; documentos EP-A-0 036 259 e EP-A-0 063 953; documento WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 31 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; documentos EP-A-0 036 776, EP-A-0 136 829 e EP-A-0 136 907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces lividans [patente de U.S. 4.745.056].

Os métodos de introdução de ADN exógeno em hospedeiros bacterianos são muito conhecidos na técnica, e normalmente incluem tanto a transformação de bactérias tratadas com CaCl2 como outros agentes, tais como catiões divalentes e DMSO. O ADN também pode ser introduzido em células bacterianas por electroporação. Os métodos de transformação normalmente variam com as espécies bacterianas a ser transformadas. Veja-se, por exemplo, [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Paiva et al. (1982) PNAS USA 79:5582; documentos EP-A-0 036 259 e EP-A-0 063 953; documento WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) PNAS USA. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) PNAS USA 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. Em Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. Boyer & Nicosia); Mandei et al. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, em: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti e R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. 32

Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr.

Congo Biotechnology 1:412, Streptococcus] . v. Expressão em levedura

Os sistemas de expressão em levedura também são conhecidos para um perito na especialidade. Um promotor de levedura é qualquer sequência de ADN que possa ser ligada a ARN polimerase de levedura e iniciar a transcrição na direcção 3' de uma sequência codificante (por exemplo, gene estrutural) em ARN. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição que está normalmente situada proximal à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição normalmente inclui um local de ligação a ARN polimerase (a "caixa TATA") e um local de iniciação da transcrição. Um promotor de levedura também pode ter um segundo domínio chamado uma sequência activadora na direcção 5' (UAS) que, se está presente, é normalmente distai ao gene estrutural. A UAS permite a expressão regulada (induzível). A expressão constitutiva é produzida em ausência de uma UAS. A expressão regulada pode ser tanto positiva como negativa, tanto potenciando como reduzindo assim a transcrição. A levedura é um organismo fermentante com uma via metabólica activa, pelo que sequências que codificam enzimas na via metabólica proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem álcool desidrogenase (documento EP-A-0 284 044), enolase, glucocinase, glucose-6-fosfato isomerase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAP ou GAPDH), hexocinase, fosfofructocinase, 3-fosfoglicerato mutase e piruvato cinase (PyK) (documento EPO-A-O 329 203) . O gene PH05 da levedura, que codifica fosfatase ácida, também proporciona sequências promotoras úteis [Myanohara et al. (1983) PNAS USA 80:1] .

Além disso, os promotores sintéticos que não são produzidos na natureza também funcionam de promotores de levedura. Por 33 exemplo, as sequências UAS de um promotor de levedura podem ser ligados com a região de activação da transcrição de outro promotor de levedura, criando um promotor hibrido sintético. Exemplos de tais promotores híbridos incluem a sequência reguladora de ADH ligada à região de activação da transcrição de GAP (patentes de U.S. n° 4.876.197 e 4.880.734). Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores que consistem nas sequências reguladoras de tanto os genes ADH2, GAL4, GAL10 como PH05, combinados com a região de activação da transcrição de um gene de enzima glicolítica tal como GAP ou PyK (documento EP-A-0 164 556). Além disso, um promotor de levedura pode incluir promotores que são produzidos naturalmente de origem de não levedura que têm a capacidade de se ligar a ARN polimerase de levedura e iniciar a transcrição. Exemplos de tais promotores incluem, entre outros [Cohen et al. (1980) PNAS USA 77:1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al. (1979) "The expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genesin the Yeast Saccharomyces cerevisiae," em: Plasmids of Medicai, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis e A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2:109;].

Uma molécula de ADN pode ser expressa intracelularmente em levedura. Uma sequência promotora pode se ligar directamente à molécula de ADN, em cujo caso o primeiro aminoácido na extremidade N da proteína recombinante sempre será uma metionina, que está codificada pelo codão de iniciação ATG. Se for desejado, a metionina na extremidade N pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa aos sistemas de expressão de levedura, além de em sistemas de expressão de mamífero, baculovírus e bacterianos. 34

Normalmente, uma sequência de ADN que codifica a porção da extremidade N de uma proteína de levedura endógena, ou outra proteína estável, está fusionada com a extremidade 5' de sequências codificantes heterólogas. Após a expressão, esta construção proporcionará uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene de levedura ou de superóxido dismutase (SOD) humana pode se ligar na extremidade 5' de um gene estranho e ser expressa em levedura. A sequência de ADN na ligação das duas sequências de aminoácidos pode ou pode não codificar um local clivável. Veja-se, por exemplo, o documento EP-A-0 196 056. Outro exemplo é uma proteína de fusão de ubiquitina. Uma proteína de fusão tal se prepara com a região de ubiquitina que preferivelmente retém um local para uma enzima de processamento (por exemplo, protease de processamento específica de ubiquitina) para clivar a ubiquitina da proteína estranha. Portanto, neste método pode ser isolada proteína estranha nativa (por exemplo, o documento WO 88/024066).

Alternativamente, também podem ser segregadas proteínas estranhas da célula nos meios de crescimento criando moléculas de ADN quiméricas que codificam uma proteína de fusão que compreende um fragmento de sequência condutora que proporciona a secreção em levedura da proteína estranha. Preferivelmente, existe locais de processamento codificados entre o fragmento condutor e o gene estranho que podem ser clivados tanto in vivo como in vitro. O fragmento da sequência condutora normalmente codifica um péptido sinal que compreende aminoácidos hidrófobos que dirigem a secreção da proteína da célula. O ADN que codifica sequências sinal adequadas pode ser derivado de genes para proteínas de levedura segregada tais como os genes de levedura invertase (documentos EP-A-0012873; JPO 62.096.086) e de factor A (patente de U.S. 4.588.684). Alternativamente, também existem condutores de origem de 35 não levedura, tais como um condutor de interferão, que proporcionam secreção em levedura (documento EP-A-0060057). Uma classe preferida de condutores da secreção são aqueles que utilizam um fragmento do gene do factor alfa de levedura que contém tanto uma sequência sinal "pre" como uma região "pro". Os tipos de fragmentos de factor alfa que podem ser utilizados incluem o condutor do factor alfa de pre-pro de comprimento completo (aproximadamente 83 resíduos de aminoácidos), além de condutores do factor alfa truncados (normalmente aproximadamente 25 a aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos) (patentes de U.S. 4.546.083 e 4.870.008; documento EP-A-0 324 274). Condutores adicionais que utilizam um fragmento do factor alfa que proporciona a secreção incluem condutores do factor alfa híbridos preparados com uma pré-sequência de uma primeira levedura, mas uma pró-região de um segundo factor alfa de levedura (por exemplo, veja-se o documento WO 89/02463).

Normalmente, as sequências de terminação da transcrição reconhecidas por levedura são regiões reguladoras localizadas em 3' com respeito ao codão de terminação da tradução e, portanto, juntamente com o promotor flanqueiam a sequência codificante. Estas sequências dirigem a transcrição de um ARNm que pode ser traduzido no polipéptido codificado pelo ADN. Exemplos de sequência terminadora da transcrição e outras sequências de terminação reconhecidas por levedura, tais como aquelas que codificam enzimas glicolíticas.

Normalmente, os componentes anteriormente descritos, que compreendem um promotor, condutor (se for desejado), sequência codificante de interesse e sequência de terminação da transcrição, são postos juntos em construções de expressão. As construções de expressão são mantidas frequentemente num replicão, tal como um elemento extracromossómico (por exemplo, plasmídeos), que pode ser mantido de forma estável num hospedeiro, tal como levedura 36 ou bactérias. O replicão pode ter dois sistemas de replicação, permitindo assim que se mantenha, por exemplo, em levedura para a expressão e num hospedeiro procariota para a clonagem e amplificação. Exemplos de tais vectores transportadores de bactérias para levedura incluem YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8:17-241, pCl/1 [Brake et al. (1984) PNAS USA 81:4642-46 461] e YRpl7 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158:157]. Além disso, um replicão pode ser um plasmídeo tanto de alto como de baixo número de cópias. Um plasmídeo de alto número de cópias terá geralmente um número de cópias que varia de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, e normalmente -10 a -150. Um hospedeiro que contém um plasmídeo de alto número de cópias terá preferivelmente pelo menos aproximadamente 10, e mais preferivelmente pelo menos ~20. Pode ser seleccionado um vector tanto com alto como com baixo número de cópias, dependendo do efeito do vector e a proteína estranha sobre o hospedeiro. Veja-se, por exemplo, Brake et al., ante riormente.

Alternativamente, as construções de expressão podem ser integradas no genoma de levedura com um vector integrante. Os vectores integrantes normalmente contêm pelo menos uma sequência homóloga ao cromossoma de levedura que permite que o vector se integre, e preferivelmente contêm duas sequências homólogas que flanqueiam a construção de expressão. As integrações parecem resultar de recombinações entre ADN homólogo no vector e o cromossoma de levedura [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245]. Um vector integrante pode ser dirigido a um locus específico em levedura seleccionando a sequência homóloga apropriada para a inclusão no vector. Veja-se Orr-Weaver et al., anteriormente. Uma ou mais construções de expressão podem ser integradas, afectando possivelmente os níveis de proteína recombinante produzida [Rine et al. (1983) PNAS USA 80:6750). As sequências cromossómicas incluídas no 37 vector podem ser produzidas tanto como um único segmento no vector, que produz a integração do vector inteiro, como dois segmentos homólogos a segmentos adjacentes no cromossoma e que flanqueiam a construção de expressão no vector; que podem produzir a integração estável de somente a construção de expressão.

Normalmente, as construções de expressão extracromossómicas e integrantes podem conter marcadores de selecção para permitir a selecção de estirpes de levedura que foram transformadas. Os marcadores de selecção podem incluir genes biossintéticos que podem ser expressos na levedura hospedeiro tais como ADE2, HIS4, LEU2, TRP e ALG7, e o gene de resistência a G418, que confere resistência em células de levedura a tunicamicina e G418, respectivamente. Além disso, um marcador de selecção adequado também pode proporcionar levedura com a capacidade de ser cultivada em presença de compostos tóxicos tais como metal. Por exemplo, a presença de CUPI permite que a levedura seja cultivada em presença de iões cobre [Butt et al. (1987) Microbiol, Rev. 51:351].

Alternativamente, alguns dos componentes anteriormente descritos podem ser postos juntos em vectores de transformação. Os vectores de transformação compreendem normalmente um marcador de selecção que tanto é mantido num replicão como se desenvolve num vector integrante, como se há descrito anteriormente.

Os vectores de expressão e de transformação, tanto replicões extracromossómicos como vectores integrantes, foram desenvolvidos para a transformação em muitas leveduras. Por exemplo, foram desenvolvidos vectores de expressão para, entre outras, as seguintes leveduras: Candida albicans [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltosa [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141]. Hansenula polymorpha [Gleeson et al. (1986) J. Gene. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. 38 (1986) Mol. Gene. Genet. 202:302], Kluyveromyces fragilis [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:737;

Van den Berg et al. (1990) BiolTechnology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141], Pichia pastoris [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; patente de U.S. n° 4, 83 7, 148 e 4,92

9,555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) PNAS USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163],

Schizosaccharomyces pombe [Beach e Nurse (1981) Nature 300:706] e Yarrowia lipolytica [Davidow et al. (1985) Curr.

Genet. 10:380471 Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49] .

Os métodos de introdução de ADN exógeno em hospedeiros de levedura são muito conhecidos na técnica, e normalmente incluem tanto a transformação de esferoplastos como de células de levedura intactas tratadas com catiões alcalinos. Os métodos de transformação normalmente variam com as espécies de levedura a serem transformadas. Veja-se, por exemplo, [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gene. Microbiol. 132:3459;

Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gene. Genet. 202:302;

Hansenula; [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De

Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; patentes de U.S. n° 4,83 7,148 e 4,92 9,555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) PNAS USA 7 5; 19 2 9; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163

Saccharomyces]; [Beach e Nurse (1981) Nature 300:706; Schizosaccharomyces]; [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia] .

Anticorpos 39

Como se usa neste documento, o termo "anticorpo" refere-se a um polipéptido ou grupo de polipéptidos composto por pelo menos um local de combinação de anticorpos. Um "local de combinação de anticorpos" é o espaço de ligação tridimensional com uma forma da superfície interna e distribuição de carga complementar às características de um epítopo de um antigénio, que permite uma ligação do anticorpo com o antigénio. "Anticorpo" inclui, por exemplo, anticorpos de vertebrados, anticorpos híbridos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos alterados, anticorpos univalentes, proteínas de Fab e anticorpos de um único domínio.

Os anticorpos contra as proteínas da invenção são úteis para cromatografia de afinidad, imunoensayos e distinguir/identificar proteínas da invenção.

Os anticorpos contra as proteínas da invenção, tanto policlonais como monoclonais, podem ser preparados por meio de métodos convencionais. Em geral, a proteína é utilizada em primeiro lugar para imunizar um animal adequado, preferivelmente um ratinho, rato, coelho ou cabra. Preferem-se coelhos e cabras para a preparação de soros policlonais devido ao volume de soro que pode ser obtido e a disponibilidade de anticorpos anti-coelho e anti-cabra marcados. A imunização se realiza geralmente misturando ou emulsionando a proteína em solução salina, preferivelmente num adjuvante tal como adjuvante completo de Freund, e injectando a mistura ou emulsão parentericamente (geralmente subcutaneamente ou intramuscularmente). Uma dose de 50-200 pg/injecção é normalmente suficiente. A imunização é reforçada geralmente 2-6 semanas depois com uma ou mais injecções da proteína em solução salina, preferivelmente usando adjuvante incompleto de Freund. Alternativamente podem ser gerados anticorpos por imunização in vitro usando métodos conhecidos na técnica, que para os fins da presente invenção são considerados 40 equivalentes à imunização in vivo. Os anti-soros policlonais são obtidos sangrando o animal imunizado num recipiente de vidro ou plástico, incubando o sangue a 25 °C durante uma hora, seguido de incubação a 4 °C durante 2-18 horas. O soro se recupera por centrifugação (por exemplo, 1.000 g durante 10 minutos). Podem ser obtidos aproximadamente 20-50 ml por sangrado de coelhos.

Os anticorpos monoclonais são preparados usando o método convencional de Kohler & Milstein [Nature (1975) 256:495-96], ou uma modificação do mesmo. Normalmente, um ratinho ou rato se imuniza como foi descrito anteriormente. No entanto, em vez de sangrar ao animal para extrair o soro, o baço (e opcionalmente vários gânglios linfáticos grandes) é extraído e dissociado em células individuais. Se for desejado, as células do baço podem ser rastreadas (depois de eliminar as células não especificamente aderentes) aplicando uma suspensão de células a uma placa ou poço recoberto com o antigénio de proteína. Os linfócitos B que expressam imunoglobulina ligada a membrana específica para o antigénio são ligadas à placa, e não são enxaguados com o resíduo da suspensão. Os linfócitos B resultantes, ou todas as células do baço dissociadas, são então induzidas a se fusionar com células de mieloma para formar hibridomas, e são cultivadas num meio selectivo (por exemplo, meio hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Os hibridomas resultantes são semeados em placa por diluição limitante e são ensaiadas para a produção de anticorpos que se ligam especificamente ao antigénio imunizante (e que não se ligam a antigénios sem relacionar). Os hibridomas que segregam MAb seleccionado são então cultivados tanto in vitro (por exemplo, em garrafas de cultura de tecido ou reactores de fibra oca) como in vivo (como ascite em ratinhos).

Se for desejado, os anticorpos (tanto policlonais como monoclonais) podem ser marcados usando técnicas convencionais. Marcas adequadas incluem fluoróforos, 41 32 125 cromóforos, átomos radiactivos (particularmente P e I), reactivos densos em electrões, enzimas e ligandos que têm componentes de ligação especifica. As enzimas são detectadas normalmente por sua actividade. Por exemplo, a peroxidase de rábano picante é detectada normalmente por sua capacidade para converter 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) num pigmento azul quantif icável com um espectrofotómetro. "Componente de ligação especifica" refere-se a uma proteina que pode se ligar a uma molécula de ligando com alta especificidade como, por exemplo, no caso de um antigénio e um anticorpo monoclonal especifico para o mesmo. Outros componentes de ligação especifica incluem biotina e avidina ou estreptavidina, IgG e proteina A, e os numerosos pares de receptor-ligando conhecidas na técnica. Deve ser entendido que a descrição anterior não pretende classificar as diversas etiquetas em distintas classes, já que a mesma etiqueta pode servir em vários modos diferentes. Por exemplo, 125I pode servir de etiqueta radioactiva ou como reagente denso em electrões. A HRP pode servir de enzima ou de antigénio para um MAb. Além disso, podem ser combinadas diversas etiquetas para o efeito desejado. Por exemplo, os MAb e a avidina também requerem etiquetas na prática da presente invenção: portanto, um poderia marcar um MAb com biotina, e detectar sua presença com avidina marcada com 125I, ou com um Mab anti-biotina marcado com HRP. Outras permutações e possibilidades serão rapidamente evidentes para aqueles peritos na especialidade.

Composições farmacêuticas

As composições farmacêuticas podem compreender tanto polipéptidos, anticorpos como ácido nucleico da invenção. As composições farmacêuticas compreenderão uma quantidade terapeuticamente eficaz de tanto polipéptidos, anticorpos como polinucleótidos da invenção reivindicada. como se usa 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz 42 neste documento refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou afecção desejada, ou para presentar um efeito terapêutico ou preventivo detectável. 0 efeito pode ser detectada, por exemplo, por marcadores quimicos ou niveis de antigénio. Os efeitos terapêuticos também incluem a redução nos sintomas físicos tais como a diminuição da temperatura corporal. A quantidade eficaz precisa para um indivíduo dependerá de seu tamanho e saúde, a natureza e grau da afecção, e os agentes terapêuticos ou combinação de agentes terapêuticos seleccionados para administração. Portanto, não é útil especificar uma quantidade eficaz exacta de antemão. No entanto, a quantidade eficaz para uma situação dada pode ser determinada por experimentação de rotina e está dentro do critério do profissional clínico.

Para os fins da presente invenção, uma dose eficaz será de aproximadamente 0,01 mg/kg a 50 mg/kg ou 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg das construções de ADN no indivíduo ao qual se administra.

Uma composição farmacêutica também pode conter um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um veículo para a administração de um agente terapêutico, tal como anticorpos ou um polipéptido, genes e outros agentes terapêuticos. O termo refere-se a qualquer veículo farmacêutico que por si mesmo não induz a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que recebe a composição, e que pode ser administrado sem excessiva toxicidade. Veículos adequados podem ser macromoléculas grandes lentamente metabolizadas tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácido poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas de vírus inactivos. Tais veículos são muito conhecidos para aqueles peritos na especialidade.

Neste podem ser usados sais farmaceuticamente aceitáveis, 43 por exemplo, sais de ácidos minerais tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e similares; e as sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e similares. Uma discussão meticulosa de excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991) .

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem conter líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, em tais veículos podem estar presentes substâncias auxiliares, tais como agentes humectantes ou emulsionantes, substâncias de tamponamento do pH e similares. Normalmente, as composições terapêuticas são preparadas como injectáveis, tanto como soluções líquidas como suspensões; também pode ser preparadas formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, veículos líquidos antes da injecção. Os lipossomas estão incluídos dentro da definição de um veículo farmaceuticamente aceitável. Métodos de administração

Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas directamente ao indivíduo. Os indivíduos que a serem tratados podem ser animais; em particular, podem ser tratados seres humanos. A administração directa das composições geralmente será levada a cabo por meio de injecção, tanto subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente como intramuscularmente, ou serão administradas ao espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas a uma lesão. Outros modos de administração incluem administração oral e pulmonar, supositórios, e aplicações transdérmicas ou transcutáneas (por exemplo, veja-se o documento WO98/20734), agulhas e pistolas de genes ou hiposprays. 0 tratamento de dosagem pode ser um programa de dose única ou um programa de doses múltiplas. 44

Vacinas

As vacinas de acordo com a invenção podem ser tanto profilácticas (isto é, para prevenir a infecção) como terapêuticas (isto é, para tratar a doença depois da infecção) .

Tais vacinas compreendem imunizar antigénio (s), imunogénio(s), polipéptido(s), proteína(s) ou ácido nucleico, normalmente em combinação com "veículos farmaceuticamente aceitáveis," que incluem qualquer veículo que não induza por si mesmo a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que recebe a composição. Veículos adequados são macromoléculas grandes lentamente metabolizadas tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tais como gotitas de aceite ou lipossomas) e partículas de vírus inactivos. Tais veículos são muito conhecidos para aqueles peritos na especialidade. Adicionalmente, estes veículos podem actuar de agentes imunoestimulantes ("adjuvantes") . Além disso, o antigénio ou imunogénio pode ser conjugado com um toxóide bacteriano, tal como um toxóide de difteria, tétanos, cólera, patogénios de H. pylori, etc. Adjuvantes preferidos para potenciar a eficácia da composição incluem, mas não se limitam a: (1) sais de alumínio (alume) tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) formulações de emulsão de óleo em água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos tais como muramilpéptidos (veja-se a seguir) ou componentes da parede celular bacteriana) tais como, por exemplo, (a) MF59™ (documento WO 90/14837; Capítulo 10 em Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), que contém 5% de esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (que opcionalmente contém diversas quantidades 45 de MTP-PE (veja-se a seguir), embora não sejam requeridos) formulado em partículas submicrométricas usando um microfluidizador tal como o microfluidizador modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA) , (b) SAF, que contém 10% de esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado com plurónico e thr-MDP (veja-se a seguir) tanto microfluidizado numa emulsão submicrométrica como agitado com vórtice para gerar uma emulsão de maior tamanho de partícula, e (c) sistema de adjuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contém 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 8 0 e um ou mais componentes da parede celular bacteriana do grupo que consiste em monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), preferivelmente MPL + CWS (Detox™) ; (3) podem ser usados adjuvantes de saponina tais como Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) ou partículas geradas a partir dos mesmos tais como ISCOM (complexos imunoestimulantes); (4) adjuvante completo de Freund (CFA) e adjuvante incompleto de Freund (IFA); (5) citocinas tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.)/· interferões (por exemplo, interferão J) , factor estimulante de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de necrose tumoral (TNF) , etc.; e (6) outras substâncias que atuam de agentes imunoestimulantes para potenciar a eficácia da composição. Preferem-se alume e MF 5 9™.

Como se menciona anteriormente, os muramilpéptidos incluem, mas não se limitam a, N-acetil-muramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-MDP), N-acelil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D- isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

As composições imunogénicas (por exemplo, o antigénio imunizante/imunogénio/polipéptido/proteína/ácido nucleico, veículo farmaceuticamente aceitável e adjuvante) 46 normalmente conterão diluentes tais como água, solução salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, substâncias auxiliares tais como agentes humectantes ou emulsionantes, substâncias de tamponamento do pH e similares podem estar presentes em tais veiculos.

Normalmente, as composições imunogénicas são preparadas como injectáveis, tanto como soluções liquidas como suspensões; também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, veiculos líquidos antes da injecção. A preparação também pode ser emulsionada ou encapsulada em lipossomas para potenciar o efeito adjuvante, como se trata anteriormente bajo veículos farmaceuticamente aceitáveis.

As composições imunogénicas usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz dos polipéptidos antigénicos ou imunogénicos, além de qualquer outro dos componentes anteriormente mencionados, conforme seja necessário. Por "quantidade imunologicamente eficaz" se indica que a administração dessa quantidade a um indivíduo, tanto numa dose única como parte de uma serie, é eficaz para o tratamento ou a prevenção. Esta quantidade varia dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, seu grupo taxonómico (por exemplo, primata não humano, primata, etc.), a capacidade de seu sistema imunitário para sintetizar anticorpos, o grau de protecção desejado, a formulação da vacina, a avaliação do médico prático na situação médica e outros factores relevantes. Espera-se que a quantidade esteja num intervalo relativamente amplo que pode ser determinado por ensaios de rotina.

As composições imunogénicas são administrados convencionalmente parentericamente, por exemplo, por meio de injecção, tanto subcutaneamente, intramuscularmente como transdermicamente/transcutaneamente (por exemplo, o documento WO98/20734). Formulações adicionais adequadas 47 para outros modos de administração incluem formulações orais e pulmonares, supositórios e aplicações transdérmicas. 0 tratamento de dosagem pode ser um programa de dose única ou um programa de doses múltiplas. A vacina pode ser administrada conjuntamente com outros agentes imunorreguladores.

Como uma alternativa às vacinas basadas em proteínas pode ser usada vacinação com ADN [por exemplo, Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunol 9:211-283; Donnelly et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648].

Veículos de administração de genes

Os veículos de terapêutica génica para a administração de construções que incluem uma sequência codificante de um agente terapêutico da invenção a ser administrado ao mamífero para a expressão no mamífero podem ser administrados tanto localmente como sistemicamente. Estas construções podem utilizar abordagem de vector virai ou não virai em modalidade in vivo ou ex vivo. A expressão da sequência codificante pode ser induzida usando promotores endógenos ou heterólogos de mamífero. A expressão da sequência codificante in vivo pode ser tanto constitutiva como regulada. A invenção inclui veículos de administração de genes que podem expressar as sequências de ácidos nucleicos contempladas. 0 veículo de administração de genes é preferivelmente um vector virai, e mais preferivelmente um vector retroviral, adenoviral, virai adenoassociado (AAV), de vírus do herpes ou alfaviral. 0 vector virai também pode ser um vector virai de astrovírus, coronavírus, ortomixovírus, papovavírus, paramixovírus, parvovírus, picornavírus, poxvírus ou togavírus. Vejam-se geralmente Jolly (1994) Câncer Gene Therapy 1:51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5:845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapy 6:185-193; e Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153. Os vectores retrovirais são muito conhecidos na 48 técnica e os presentes inventores contemplam que qualquer vector de terapêutica génica retroviral pode ser utilizados na invenção, que inclui os retrovirus de tipo B, C e D, retrovirus xenotrópicos (por exemplo, NZB-X1, NZB-X2 e NZB9-1 (veja-se 0'Neill (1985) J. Virol. 53:160), retrovirus politrópicos, por exemplo, MCF e MCF-MLV (veja-se Kelly (1983) J. Virol. 45:291), espumavirus e lentivirus. Veja-se RNA Tumor Viruses, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

As porções do vector de terapêutica génica retroviral podem ser derivadas de diferentes retrovirus. Por exemplo, as LTR de retrovectores podem ser derivadas de um vírus do sarcoma murino, um local de ligação a ARNt de um vírus do sarcoma de Rous, uma sinal de encapsulamento de um vírus da leucemia murina e uma origem da síntese da segunda cadeia de um vírus da leucose aviária.

Estes vectores retrovirais recombinantes podem ser usados para gerar partículas de vectores retrovirais competentes para a transdução sendo introduzidos em linhas celulares de encapsulamento apropriadas (veja-se a patente de U.S. 5,59 1,624) . Os vectores de retrovirus podem ser construídos para integração específica de local em ADN de células hospedeiro por incorporação de uma enzima integrase quimérica na partícula retroviral (veja-se o documento W096/37626). É preferível que o vector virai recombinante seja um vírus recombinante defeituoso na replicação.

Linhas celulares de encapsulamento adequadas para uso com os vectores de retrovirus anteriormente descritos são muito conhecidas na técnica, são preparadas facilmente (vejam-se os documentos WO95/30763 e WO92/05266) e podem ser usados para criar linhas celulares produtoras (também chamadas linhas celulares de vector ou "VCL") para a produção de partículas de vectores recombinantes. Preferivelmente, as linhas celulares de encapsulamento são preparadas a partir de células parentais humanas (por exemplo, células HT1080) 49 ou linhas celulares parentais de vison que elimina a inactivação em soro humano.

Os retrovirus preferidos para a construção de vectores de terapêutica génica retroviral incluem vírus da leucose aviária, vírus da leucemia bovina, vírus da leucemia murina, vírus indutor de focos em célula de vison vírus do sarcoma murino, vírus da reticuloendoteliose e vírus do sarcoma de Rous. Vírus da leucemia murina particularmente preferidos incluem 4070A e 1504A (Hartley e Rowe (1976) J Virol 19:19-25), Abelson (ATCC n° VR-999), Friend (ATCC n° VR-245), Graffi, Gross (ATCC n° VR-590), Kirsten, vírus do sarcoma de Harvey e vírus da leucemia murina de Rauscher (ATCC n° VR-998) e Moloney (ATCC n° VR-190) . Tais retrovirus podem ser obtidos a partir de repositórios ou colecções tais como a Colecção americana de cultivos tipo ("ATCC") em Rockville, Mariland, ou ser isolada de fontes conhecidas usando técnicas comummente disponíveis.

Vectores de terapêutica génica retrovirais conhecidos como forma de exemplo que podem ser utilizados na presente invenção incluem aqueles descritos nos pedidos de patente GB2200651, EP0415131, EP0345242, EP0334301, WO89/02468; WO89/05349, WO89/09271, W090/02806, W090/07936, WO94/03622, W093/25698, W093/25234, WO93/0230, WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825, WO95/07994, US 5.219740, US 4.405.712, US 4.861.719, US 4.980.289, US 4.717.127, US 5.591.624. Vejam-se também Vile (1993) Câncer Res 53:3860-3864; Vile (1993) Câncer Res 53:962-967; Ram (1993) Câncer Res 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:493-503; Baba (1993) J Neurosurg 79:729-735; Mann (1983) Cell 33:153; Cane (1984) PNAS USA 81:6349; e Miller (1990) Human Gene Therapy 1.

Os vectores de terapêutica génica adenovirais humanos também são conhecidos na técnica e podem ser utilizados na presente invenção. Vejam-se, por exemplo, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 e Rosenfeld (1991) Science 252:431, e 50 os documentos WO93/07283, WO93/06223 e WO93/07282. Vectores de terapêutica génica adenovirais conhecidos como forma de exemplo que podem ser utilizados na presente invenção incluem aqueles descritos nos documentos anteriormente referenciados e nos documentos W094/12649, WO93/03769, W093/19191, W09 4/2 8 938, W095/11984, W095/00655, WO95/27071, W095/29993, W095/3467, W096/05320, W094/08026, WO94/11506, WO93/06223, W094/24299, WO95/14102, W095/24297, WO95/02697, W094/28152, W094/24299, WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835, W094/18922 e WO95/09654. Alternativamente, pode ser utilizados a administração de ADN ligado a adenovirus morto como é descrito em Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-154. Os veículos de administração de genes da invenção também incluem vectores de vírus associados a adenovirus (AAV). Exemplos importantes e preferidos de tais vectores para uso na presente invenção são os vectores com base em AAV-2 desvelados em Srivastava, documento WO93/09239. Os vectores de AAV mais preferidos compreendem as duas repetições invertidas de AAV nas que as D-sequências nativas são modificadas por substituição de nucleótidos, de forma que pelo menos 5 nucleótidos nativos e até 18 nucleótidos nativos, preferivelmente pelo menos 10 nucleótidos nativos até 18 nucleótidos nativos, o mais preferivelmente 10 nucleótidos nativos, são retenidos e o resíduo dos nucleótidos da D-sequência estão deletados ou substituídos com nucleótidos não nativos. As D-sequências nativas das repetições terminais invertidas de AAV são sequências de 20 nucleótidos consecutivos em cada repetição terminal invertida de AAV (isto é, existe uma sequência em cada extremidade) que não participam na formação de HP. O nucleótido de substituição não nativa pode ser qualquer nucleótido distinto do nucleótido encontrado na D-sequência nativa na mesma posição. Outros vectores de AAV como forma de exemplo que podem ser utilizados são pWP-19, pW N-l, ambos dos quais são revelados em Nahreini (1993) Gene 51 124:257-262. Outro exemplo de um vector de AAV tal é psub201 (veja-se Samulski (1987) J. Virol. 61:3096). Outro vector de AAV como forma de exemplo é o vector de ITR de D duplo. A construção do vector de ITR de D duplo se desvela na patente de U.S. 5,47 8,745. Ainda outros vectores são os revelados na patente de U.S. de Cárter 4.797.368 e a patente de U.S. de Muzyczka 5.139.941, a patente de U.S. de Chartejee 5.474.935 e o documento de Kotin W094/288157. Ainda outro exemplo de um vector de AAV que pode ser utilizado na presente invenção é SSV9AFABTKneo, que contém o potenciador de AFP e o promotor de albumina e dirige a expressão predominantemente no fígado. Sua estrutura e construção são reveladas em Su (1996) Human Gene Therapy 7:463-470. Vectores de terapêutica génica de AAV adicionais são descritos nos documentos US 5.354.678, US 5.173.414, US 5.139.941 e US 5.252.479.

Os vectores de terapêutica génica da invenção também incluem vectores de herpes. Exemplos importantes e preferidos são vectores do vírus do herpes simples que contêm uma sequência que codifica um polipéptido de timidina cinase tal como os revelados nos documentos US 5,28 8,641 e EP0176170 (Roizman). Vectores do VHS como forma de exemplo adicionais incluem HFEM/ICP6-LacZ revelado no documento WO95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac descrito em Geller (1988) Science 241:1667-1669 e nos documentos W090/09441 e WO92/07945, VHS Us3::pgC-lacZ descrito em Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11-19 e VHS 7134, 2 RH 105 e GAL4 descritos no documento EP 0453242 (Breakefield), e aqueles depositados na ATCC com os números de acesso VR-977 e VR-260.

Também se contemplam vectores de terapêutica génica do alfavírus que podem ser utilizados na presente invenção. Vectores do alfavírus preferidos são vectores do vírus Sindbis. Togavírus, vírus do bosque de Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vírus de Middleberg (ATCC VR-370), vírus de 52 rio Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), vírus da encefalitis equina venezolana (ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; (ATCC VR-532), e aqueles descritos nas patentes de U.S. 5.091.309, 5.217.879 e WO92/10578. Mais particularmente, são utilizáveis aqueles vectores de alfavírus descritos no documento de U.S. n° de serie 08/405.627 apresentada o 15 de Março de 1995, os documentos W094/21792, WO92/10518,

WO95/07994, US 5.091.309 e US 5,217.879. Tais alfavírus podem ser obtidos de repositórios ou colecções tais como a ATCC em Rockville, Mariland, ou ser isolados de fontes conhecidas usando técnicas comummente disponíveis. Preferivelmente são usadosvectores de alfavírus com citotoxicidade reduzida (veja-se o documento USSN 08/679640).

Os sistemas de vector de ADN tais como os sistemas de expressão em camadas eucariotas também são úteis para expressar os ácidos nucleicos da invenção. Veja-se o documento WO95/07994 para uma descrição detalhada de sistemas de expressão em camadas eucariotas. Preferivelmente, os sistemas de expressão em camadas eucariotas da invenção derivam-se de vectores de alfavírus e o mais preferivelmente de vectores virais de Sindbis. Outros vectores virais adequados para uso na presente invenção incluem aqueles derivados do vírus da poliomielite, por exemplo, ATCC VR-58 e aqueles descritos em Evans, Nature 339 (1989) 385 e Sabin (1973) J. Biol.

Standardization 1:115; rinovírus, por exemplo, ATCC VR-1110 e aqueles descritos em Arnold (1990) J Cell Biochem L401; vírus da varíola tais como o vírus da varíola do canário ou o vírus da variolovacina, por exemplo, ATCC VR-111 e ATCC VR-2010 e aqueles descritos em Fisher-Hoch (1989) PNAS USA 86:317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sei 569:86, Flexner (1990) Vaccine 8:17; nos documentos US 4,60 3,112 e US 4,76 9,330 e WO89/01973; vírus SV40, por exemplo, ATCC VR-305 e aqueles descritos em Mulligan (1979) Nature 277:108 e 53

Madzak (1992) J Gene Virol 73:1533; vírus da gripe, por exemplo, ATCC VR-797 e vírus recombinantes da gripe produzidos utilizando técnicas de genética inversa como são descritas no documento US 5.166.057 e em Enami (1990) PNAS USA 87:3802-3805; Enami & Palese (1991) J Virol 65:2711-2113 e Luytjes (1989) Cell 59:110, (vejam-se também McMichael (1983) NEJ Med 309:13 e Yap (1978) Nature 273:238 e Nature (1979) 277:108); virus da imunodeficiência humana como é descrito no documento EP-0386882 e em Buchschacher (1992) J. Virol. 66:2731; vírus do sarampo, por exemplo, ATCC VR-67 e VR-1247 e aqueles descritos no documento EP-0440219; virus de Aura, por exemplo, ATCC VR-368; vírus de Bebaru, por exemplo, ATCC VR-600 e ATCC VR-1240; vírus de Cabassou, por exemplo, ATCC VR-922; vírus de Chikungunya, por exemplo, ATCC VR-64 e ATCC VR-1241; vírus de Fort Morgan, por exemplo, ATCC VR-924; vírus de Getah, por exemplo, ATCC VR-369 e ATCC VR-1243; vírus de Kyzilagach, por exemplo, ATCC VR-927; vírus de Mayaro, por exemplo, ATCC VR-66; vírus de Mucambo, por exemplo, ATCC VR-580 e ATCC VR-1244; vírus de Ndumu, por exemplo, ATCC VR-371; vírus de Pixuna, por exemplo, ATCC VR-372 e ATCC VR-1245; vírus de Tonate, por exemplo, ATCC VR-925; vírus de Triniti, por exemplo, ATCC VR-469; vírus de Uma, por exemplo, ATCC VR-374; vírus de Whataroa, por exemplo, ATCC VR-926; vírus E-62-33, por exemplo, ATCC VR-375; vírus de 0'Nyong, vírus da encefalite oriental, por exemplo, ATCC VR-65 e ATCC VR-1242; virus da encefalite ocidental, por exemplo, ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622 e ATCC VR-1252; e coronavirus, por exemplo, ATCC VR-740 e aqueles descritos em Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med 121:190. A administração das composições da presente invenção em células não se limita aos vectores virais anteriormente mencionados. Podem ser utilizados outros métodos e meios de administração tais como, por exemplo, vectores de expressão de ácidos nucleico, ADN condensado policatiónico ligado ou 54 sem ligar a adenovírus morto só, por exemplo, veja-se o documento USSN 08/366.787 apresentada em 30 de Dezembre de 1994 e Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154, ADN ligado de ligando, por exemplo, veja-se Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-16987, veículos de células de administração de células eucariotas, por exemplo, veja-se o documento USSN 08/240.030 apresentada em 9 de maio de 1994 e o documento USSN 08/404.796, deposição de materiais de hidrogel fotopolimerizados, pistola de partículas de transferência de genes de mano como é descrito na patente de U.S. n° 5.149.655, radiação ionizante como é descrito nos documentos US 5.206.152 e em WO92/11033, neutralização de carga nucleica ou fusão com membranas celulares. Abordagem adicionais são descritas em Philip (1994) Mol Cell Biol 14:2411-2418 e em Woffendin (1994) PNAS USA 91:1581-1585. A transferência de genes mediada por partículas pode ser utilizads, por exemplo, veja-se o documento de U.S. n° de serie 60/023.867. Brevemente, a sequência pode ser inserida em vectores convencionais que contêm sequências de controlo convencionais para a expressão de alto nível, e depois ser incubada com moléculas de transferência de genes sintéticas tais como catiões de ligação a ADN polimérico como polilisina, protamina e albumina, ligados a ligandos que escolhem células como alvo tais como asialo-orosomucoide, como é descrito em Wu & Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432, insulina como é descrito em Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40:253-263, galactose como é descrito em Plank (1992) Bioconjugate Chem 3:533-539, lactose ou transferrina. Também pode ser utilizado ADN nu. Os métodos de introdução de ADN nu como forma de exemplo são descritos nos documentos WO 90/11092 e US 5.580.859. A eficiência de captação pode ser melhorada usando pérolas de látex biodegradáveis. As pérolas de látex revestidas de ADN são transportadas eficientemente em células depois da iniciação da endocitose por as pérolas. O método pode ser melhorado 55 adicionalmente por tratamento das pérolas para aumentar a hidrofobia e assim facilitar o rompimento do endossoma e libertação do ADN no citoplasma.

Os lipossomas que podem actuar de veículos de administração de genes são descritos nos documentos US 5.422.120, W095/13796, W094/23697, W091/14445 e EP-52 4,968. Como é descrito no documento USSN 60/023.67, na administração não virai, as sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipéptido podem ser inseridas em vectores convencionais que contêm sequências de controlo convencionais para a expressão de alto nível, e depois são incubadas com moléculas de transferência de genes sintéticas tais como catiões de ligação a ADN poliméricos como polilisina, protamina e albumina, ligados a ligandos que escolhem células como alvo tais como asialo-orosomucoide, insulina, galactose, lactose ou transferrina. Outros sistemas de administração incluem o uso de lipossomas para encapsular ADN que compreende o gene sob o controlo de uma variedade de promotores específicos de tecido ou ubiquamente activos. Outra administração não virai adequada para uso inclui sistemas de administração mecânica tais como a abordagem descrito em Woffendin et al. (1994) PNAS USA 91(24) :11581-11585. Além disso, a sequência codificante e o produto de expressão de tal podem ser administrados por meio da deposição de materiais de hidrogel fotopolimerizados. Outros métodos convencionais para a administração de genes que podem ser usados para a administração da sequência codificante incluem, por exemplo, uso de pistola de partículas de transferência de genes de mão, como é descrito no documento US 5.149.655; uso de radiação ionizante para activar o gene transferido, como é descrito nos documentos US 5.206.152 e WO92/11033.

Os veículos de administração de genes de lipossomas e policatiónicos como forma de exemplo são aqueles descritos nos documentos US 5.422.120 e 4.762.915; nos documentos 56 WO 95/13796; W094/23697; e W091/14445; no documento EP0524968; e em Stryer, Biochemistry, páginas 236-240 (1975) W.H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149:119; Wang (1987) PNAS USA 84:7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.

Uma composição de polinucleótido pode compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um veiculo de terapêutica génica, como o termo foi definido anteriormente. Para os fins da presente invenção, uma dose eficaz será de aproximadamente 0,01 mg/kg a 50 mg/kg ou 0, 05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg das construções de ADN no indivíduo ao que se administra. Métodos de administração

Uma vez formuladas, as composições de polinucleótido da invenção podem ser administrado (1) directamente ao indivíduo; (2) ser administrado ex vivo, a células derivadas do indivíduo; ou (3) in vitro para a expressão de proteínas recombinantes. Os indivíduos a serem tratados podem ser aves ou mamíferos (incluindo seres humanos). A administração directa das composições será levada a cabo geralmente por meio de injecção, tanto subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente como intramuscularmente, ou serão administradas ao espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas a uma lesão. Outros modos de administração incluem administração oral e pulmonar, supositórios e aplicações transdérmicas ou transcutáneas (por exemplo, veja-se o documento WO98/20734), agulhas e pistolas de genes ou hiposprays. O tratamento de dosagem pode ser um programa de dose única ou um programa de doses múltiplas. Os métodos para a administração ex vivo e a reimplantação de células transformadas num indivíduo são conhecidas na técnica e são descritos em, por exemplo, o documento W093/14778. Exemplos de células úteis em aplicações ex vivo 57 incluem, por exemplo, citoblastos, particularmente hematopoiéticos, linfócitos, macrófagos, células dendriticas ou células tumorais.

Geralmente, a administração de ácidos nucleicos para aplicações tanto ex vivo como in vitro pode ser levada a cabo por os seguintes métodos, por exemplo, transfecção mediada por dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, encapsulação de polinucleótido(s) em lipossomas e microinjecção directa do ADN em núcleos, todos muito conhecidos na técnica.

Composições farmacêuticas de polinucleótidos e polipéptidos

Além disso dos veículos e sais farmaceuticamente aceitáveis descritos anteriormente, os seguintes agentes adicionais podem ser usados com composições de polinucleótidos e/ou polipéptidos. A. Polipéptidos

Um exemplo são polipéptidos que incluem, sem limitação: asialo-orosomucoide (ASOR); transferrina; asialoglicoproteínas; anticorpos; fragmentos de anticorpos; ferritina; interleucinas; interferões, factor estimulante de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colónias de granulócitos (G-CSF), factor estimulante de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de citoblastos e eritropoietina. Também podem ser usados antigénios virais, tais como proteínas do envelope. Portanto, proteínas de outros organismos invasivos tais como o péptido de 17 aminoácidos da proteína circumsporozoito de Plasmodium falciparum conocida como RI I. B. Hormonas, vitaminas, etc.

Outros grupos que podem ser incluídos são, por exemplo: hormonas, esteróides, andrógenos, estrógenos, hormona tiróidea ou vitaminas, ácido fólico. C. Polialquilenos, polissacáridos, etc. 58

Portanto, o polialquilenglicol pode ser incluído com os polinucleótidos/polipéptidos desejados. Numa forma de realização preferida, o polialquilenglicol é polietilenglicol. Além disso, podem ser incluídos mono-, di- ou polissacáridos. Numa forma de realização preferida deste aspecto, o polissacárido é dextrano ou DEAE-dextrano. portanto, quitosano e poli(lactido-co-glicolido). D. Lipidos e lipossomas 0 polinucleótido/polipéptido desejado também pode ser encapsulado em lipidos ou envolvido em lipossomas antes da administração ao indivíduo ou a células derivadas do mesmo. A encapsulação de lipidos se realiza geralmente usando lipossomas que podem se ligar de forma estável ou ser capturados e reter o ácido nucleico. A relação de polinucleótido condensado com respeito a preparação de lípido pode variar, mas geralmente será aproximadamente 1:1 (mg de ADNrmicromol de lípido), ou mais de lípido. Para uma revisão do uso de lipossomas como veículos para a administração de ácidos nucleicos veja-se Hug e Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1097:1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527.

As preparações lipossómicas para uso na presente invenção incluem preparações catiónicas (positivamente carregadas), aniónicas (negativamente carregadas) e neutras. Foi mostrado que os lipossomas catiónicos mediam na administração intracelular de ADN de plasmídeo (Felgner (1987) PNAS USA 84:7413-7416); ARNm (Malone (1989) PNAS USA 86:6077-6081); e factores de transcrição purificados (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:10189-10192), em forma funcional. Os lipossomas catiónicos estão facilmente disponíveis. Por exemplo, lipossomas de N[1,2,3-dioleiloxi)propil]-Ν,Ν,Ν-trietilamónio (DOTMA) estão disponíveis bajo a marca registrada Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand Island, NY, (veja-se, também, Felgner, anteriormente). Outros lipossomas comercialmente disponíveis incluem transfectace 59 (DDAB/DOPE) e DOTAP/DOPE (Boerhinger). Podem ser preparados outros lipossomas catiónicos a partir de materiais facilmente disponíveis usando técnicas muito conhecidas na técnica. Veja-se, por exemplo, Szoka (1978) PNAS USA 75:4194-4198; o documento WO90/11092 para uma descrição da síntese de lipossomas de DOTAP (1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamónio)propano) .

Similarmente, os lipossomas aniónicos e neutros estão facilmente disponíveis, tais como de Avanti Polar Lipids (Birmingham, AO), ou podem ser preparados facilmente usando materiais facilmente disponíveis. Tais materiais incluem fosfatidilcolina, colesterol, fosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), entre outros. Estes materiais também podem ser misturados com os materiais de partida de DOTMA e DOTAP em relações apropriadas. Os métodos para preparar lipossomas usando estes materiais são muito conhecidos na técnica.

Os lipossomas podem compreender vesículas multilamelares (MLV), vesículas unilamelares pequenas (SUV) ou vesículas unilamelares grandes (LUV). Os diversos complexos de

lipossoma-ácido nucleico são preparados usando métodos conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Straubinger (1983) Meth. Immunol. 101:512-527; Szoka (1978) PNAS USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:77); Deamer & Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraley (1979) PNAS USA 76:3348); Enoch & Strittmatter (1979) PNAS USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka &

Papahadjopoulos (1978) PNAS USA 75:145; e Schaefer-Ridder (1982) Science 215:166. E. Lipoproteinas

Além disso, as lipoproteinas podem ser incluídas com o polinucleótido/polipéptido a ser administrado. Exemplos de 60 lipoproteínas que van a utilizarse incluem: quilomicrones, HDL, IDL, LDL e VLDL. Também podem ser usados mutantes, fragmentos ou fusiones de estas proteínas. Portanto, podem ser usadas modificações de lipoproteínas que são produzidas naturalmente, tais como LDL acetilado. Estas lipoproteínas podem escolher como alvo a administração de polinucleótidos a células que expressam receptores de lipoproteínas. Preferivelmente, se as lipoproteínas estão incluídas com o polinucleótido a ser administrado, na composição não se inclui outro ligando que elige alvo.

As lipoproteínas que são produzidas naturalmente compreendem um lípido e uma porção de proteína. A porção de proteína é conhecida como apoproteínas. Na presente, as apoproteínas A, B, C, D e E foram isoladas e identificadas. Pelo menos duas destas contêm várias proteínas, designadas por número romanos, AI, AII, AIV; Cl, CII, CIII.

Uma lipoproteína pode compreender mais de uma apoproteína. Por exemplo, os quilomícrons que são produzidos naturalmente compreendem A, B, C e E, com o tempo estas lipoproteínas perdem A e adquirem C e E. VLDL compreende apoproteínas A, B, C e E, LDL compreende apoproteína B; e HDL compreende apoproteínas A, C e E. O aminoácido destas apoproteínas é conhecido e é descrito em, por exemplo, Breslow (1985) Annu Rev. Biochem 54:699; Law (1986) Adv. Exp Med. Biol. 151:162; Chen (1986) J Biol Chem 261:12918; Kane (1980) PNAS USA 77:2465; e Utermann (1984) Hum Genet 65:232.

As lipoproteínas contêm uma variedade de lípidos que incluem triglicéridos, colesterol (livre e ésteres) e fosfolípidos. A composição dos lípidos varia nas lipoproteínas que são produzidas naturalmente. Por exemplo, os quilomícrons compreendem principalmente triglicéridos. Uma descrição mais detalhada do conteúdo de lípidos de lipoproteínas que são produzidos naturalmente pode ser encontrada, por exemplo, em Meth. Enzymol. 128 (1986). A 61 composição dos lípidos é escolhida para ajudar na conformação da apoproteina para a actividade de ligação a receptores. A composição dos lipidos também pode ser escolhida para facilitar a interacção hidrófoba e a associação com a molécula de ligação a polinucleótidos.

As lipoproteinas que são produzidas naturalmente podem ser isoladas de soro, por exemplo, por meio de ultracentrifugação. Tais métodos são descritos em Meth. Enzymol. (anteriormente); Pitas (1980) J. Biochem. 255:5454-5460 e Mahey (1979) J Clin. Invest 64:743-750. As lipoproteinas também podem ser produzidas por métodos in vitro ou recombinantes por expressão dos genes de apoproteina numa célula hospedeiro desejada. Veja-se, por exemplo, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15:403 e Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30: 443. As lipoproteinas também podem ser comparadas de fornecedores comerciais, tais como Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, MA, U.S. Outra descrição de lipoproteinas pode ser encontrada no documento WO98/06437. F. Agentes policatiónicos

Os agentes policatiónicos podem ser incluídos, com ou sem lipoproteína, numa composição com o polinucleótido/polipéptido desejado a ser administrado.

Os agentes policatiónicos apresentam normalmente uma carga positiva líquida a pH fisiológico relevante e podem neutralizar a carga eléctrica de ácidos nucleicos para facilitar a administração a uma localização desejada. Estes agentes têm aplicações tanto in vitro, ex vivo como in vivo. Os agentes policatiónicos podem ser usados para administrar ácidos nucleicos a um indivíduo vivo tanto intramuscularmente, subcutaneamente, etc. O seguinte são exemplos de polipéptidos úteis como agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina, poliornitina e protamina. Outros exemplos incluem histonas, prolaminas, albumina de soro humano, proteínas de ligação a ADN, 62 proteínas cromossómicas de não histona, proteínas da envelope de vírus de ADN tais como cpX174, os factores de transcrição também contêm domínios que se ligam a ADN e, portanto, podem ser úteis como agentes de condensação de ácidos nucleicos. Brevemente, factores de transcrição tais como C/CEBP, c-jun, c-fos, AP-I, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP e TFIID contêm domínios básicos que se unen a sequências de ADN.

Agentes policatiónicos orgânicos incluem: espermina, espermidina e purtrescina.

As dimensiones e as propriedades físicas de um agente policatiónico podem ser extrapoladas da lista anterior para a construção de outros agentes policatiónicos de polipéptido ou para produzir agentes policatiónicos sintéticos.

Agentes policatiónicos sintéticos que são úteis incluem, por exemplo, DEAE-dextrano, polibreno. Lipofectin™ e lipofectAMINE™ são monómeros que formam complexos policatiónicos quando são combinados com polinucleótidos/polipéptidos.

Ensaios de imunodiagnóstico

As proteínas da invenção podem ser usados em imunoensaios para detectar níveis de anticorpos (ou, ao contrário, os anticorpos da invenção podem ser usados para detectar níveis de proteínas) . Os imunoensaios com base em antigénios recombinantes bem definidos podem ser desenvolvidos para substituir métodos de diagnóstico invasivos. Podem ser detectados anticorpos para proteínas dentro de amostras biológicas que incluem, por exemplo, amostras de sangue ou soro. 0 desenho dos imunoensaios está submetido a uma grande variação, e uma variedade destes são conhecidas na técnica. Os protocolos para o imunoensaio podem ser com base, por exemplo, na competição ou reacção directa, ou em ensaios de tipo sandwich. Portanto, os protocolos podem usar, por exemplo, suportes sólidos, ou 63 podem ser por imunoprecipitação. A maioria dos ensaios implica o uso de anticorpo marcado ou polipéptido; as marcas podem ser, por exemplo, fluorescentes, quimiluminescentes, radioactivas, ou moléculas de corante. Também são conhecidos ensaios que amplificam os sinais da sonda; exemplos dos quais são ensaios que utilizam biotina e avidina, e imunoensaios marcados e mediados por enzima, tais como ensaios de ELISA.

Kits adequados para imunodiagnóstico e que contêm os reagentes marcados apropriados são construídos embalando os materiais apropriados, que incluem as composições da invenção, em recipientes adequados, juntamente com os reagentes e materiais restantes (por exemplo, tampões adequados, soluções de sal, etc.) requeridos para a forma de realização do ensaio, além disso do conjunto adequado de instruções de ensaio.

Hibridação de ácidos nucleicos A "hibridação" refere-se à associação de duas sequências de ácidos nucleicos entre si por ligações de hidrogénio. Normalmente, uma sequência será fixada a um suporte sólido e a outra estará livre em solução. Então, as duas sequências serão postas em contacto entre si em condições que favoreçam os ligações de hidrogénio. Factores que afectam estas ligações incluem: o tipo e o volume de solvente; temperatura de reacção; tempo de hibridação; agitação; agentes para bloquear a ligação não específica da sequência em fase líquida ao suporte sólido (reagente de Denhardt ou BLOTTO); concentração das sequências; uso de compostos para aumentar a taxa de associação de sequências (sulfato de dextrano ou polietilenglicol); e a restringência das condições de lavagem após a hibridação. Veja-se Sambrook et al. [anteriormente] volume 2, capítulo 9, páginas 9,47 a 9,57. A "restringência" refere-se às condições numa reacção de hibridação que favorecem a associação de sequências muito 64 similares com respeito a sequências que se diferenciam. Por exemplo, a combinação de temperatura e concentração de sais deveria ser escolhida de aproximadamente 120 a 200 °C abaixo da Tm calculada do híbrido em estudo. As condições de temperatura e sal podem ser determinado frequentemente empiricamente em experiências preliminares nas quIA amostras de ADN genómico imobilizadas sobre filtros hibridam-se com a sequência de interesse e depois são lavadas em condições de diferentes restringências. Veja-se Sambrook et al. na página 9,50.

As variáveis a considerar quando se realiza, por exemplo, uma transferência Southern são (1) a complexidade do ADN que é transferido e (2) a homologia entre a sonda e as sequências que são detectadas. A quantidade total do (s) fragmento(s) que a ser estudado(s) pode variar uma magnitude de 10, de 0,1 a 1 pg para um plasmídeo ou digestão de fago a 10~9 a 10~8 g para um gene de uma única cópia num genoma eucariota altamente complexo. Para reduzir a complexidade de polinucleótidos podem ser usados tempos de transferência, hibridação e exposição substancialmente mais curtos, uma quantidade mais pequena de polinucleótidos de partida e menor actividade específica de sondas. Por exemplo, um gene de levedura de uma única cópia pode ser detectado com um tempo de exposição de somente 1 hora empezando com 1 pg de ADN de levedura, transferindo durante duas horas e hibridando durante 4-8 horas com uma sonda de 108 cpm/pg. Para um gene de mamífero de uma única cópia, uma abordagem conservativo começaria com 10 pg de ADN, transferência durante a noite e hibridação durante a noite em presença de 10% de sulfato de dextrano usando uma sonda de mais de 108 cpm/pg, produzindo um tempo de exposição de -24 horas. Vários factores podem afectar a temperatura de fusão (Tm) de um híbrido de ADN-ADN entre a sonda e o fragmento de interesse e, por conseguinte, as condições apropriadas para 65 hibridação e lavagem. Em muitos casos, a sonda não é 100% homóloga ao fragmento. Outras variáveis comummente encontradas incluem o comprimento e conteúdo de G+C total das sequências de hibridação e a força iónica e conteúdo de formamida do tampão de hibridação. Os efeitos de todos estes factores podem se aproximar por uma única equação:

Tm = 81 + 16,6(logi0Ci) + 0,4[% de (G+C)]-0,6(% de formamida) - 600/n-l,5(% de desemparelhamento) em que Ci é a concentração de sais (iões monovalentes) e n é o comprimento do híbrido em pares de bases (ligeiramente modificadas a partir de Meinkoth & Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284).

No desenho de uma experiência de hibridação, alguns factores que afectam a hibridação de ácidos nucleicos podem ser alterados convenientemente. A temperatura da hibridação e lavagens e a concentração de sais durante as lavagens são mais fácil de ajustar. Como a temperatura de hibridação aumenta (isto é, a restringência), é menos provável que a hibridação se produza entre cadeias que são não homólogas e, como resultado, diminua o ruído. Se uma sonda radiomarcada não é completamente homóloga ao fragmento imobilizado (como é frequentemente o caso na família do gene e em experiências de hibridação entre espécies), a temperatura de hibridação deve ser reduzida, e aumentará o ruído. A temperatura das lavagens afecta a intensidade da banda de hibridação e o grau de ruído de um modo similar. A restringência das lavagens também aumenta ao diminuir as concentrações de sais.

Em geral, temperaturas de hibridação convenientes em presença de 50% de formamida são 42 °C para uma sonda com 95% a 100% de homologia com o fragmento alvo, 37 °C para 90% a 95% de homologia, e 32 °C para 85% a 90% de homologia. Para menores homologias, o conteúdo de formamida deveria ser reduzido e consequentemente ajustar a temperatura usando a equação anterior. Se a homologia entre a sonda e o fragmento alvo não é conhecida, a abordagem mais simples é começar com condições de hibridação como de lavagem que são não restringentes. Se não são obsservadas bandas especificas ou alto ruido depois da autorradiografia, o filtro pode ser lavado a alta restringência e expor de novo. Se o tempo requerido para a exposição faz que esta abordagem seja pouco prática, deveriam provar em paralelo várias restringências de hibridação e/ou lavagem.

Ensaios de sondas de ácido nucleico Métodos tais como PCR, ensaios de sondas de ADN ramificadas ou técnicas de transferência que utilizam sondas de ácido nucleico de acordo com a invenção podem determinar a presença de ADNc ou ARNm. Diz-se que uma sonda se "hibrida" com uma sequência da invenção se pode formar um dúplex ou complexo de cadeia dupla que é suficientemente estável para ser detectado. As sondas de ácido nucleico serão hibridadas com o ácido nucleico da invenção (cadeia sense e/ou antisense). Embora muitas sequências de nucleótidos diferentes codificarão a sequência de aminoácidos, prefere-se a sequência natural devido a que é a sequência real presente em células. 0 ARNm representa uma sequência codificante e, portanto, uma sonda deveria ser complementar à sequência codificante; o ADNc de cadeia simples é complementar ao ARNm, e, portanto, uma sonda de ADNc deveria ser complementar à sequência não codificante. A sequência da sonda não necessita ser idêntica a uma sequência (ou seu complemento) - alguma variação na sequência e comprimento pode levar a um aumento da sensibilidade do ensaio se a sonda de ácido nucleico pode formar um dúplex com nucleótidos alvo, que podem ser detectados. Portanto, a sonda de ácido nucleico pode incluir nucleótidos adicionais para estabilizar o dúplex formado. A sequência adicional também pode ser útil como marca para detectar o dúplex formado. Por exemplo, uma 67 sequência de nucleótidos não complementar pode se ligar à extremidade 5' da sonda, sendo o resíduo da sequência da sonda complementar a uma sequência bacteriana. Alternativamente, bases não complementares ou sequências mais longas podem estar intercaladas na sonda, sempre que a sequência da sonda tenha complementaridade suficiente com uma sequência bacteriana com a finalidade de se hibridar com a mesma e assim formar um dúplex que possa ser detectado. 0 comprimento e a sequência exactas da sonda dependerão das condições de hibridação (por exemplo, temperatura, condição de sais, etc.)· Por exemplo, para aplicações de diagnóstico, dependendo da complexidade da sequência do analito, a sonda de ácido nucleico normalmente contém pelo menos 10-20 nucleótidos, preferivelmente 15-25, e mais preferivelmente pelo menos 30 nucleótidos, embora pode ser mais curta que isto. Iniciadores curtos geralmente requerem temperaturas mais frias para formar complexos híbridos suficientemente estáveis com o molde.

As sondas podem ser produzidas por meio de métodos de síntese tais como o método de triéster de Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185), ou de acordo com Urdea et al. [PNAS. USA (1983) 80: 7461], ou usando sintetizadores de oligonucleótidos automatizados comercialmente disponíveis. A natureza química da sonda pode ser seleccionada de acordo com preferência. Para certas aplicações, ADN ou ARN são apropriados. Para outras aplicações, as modificações podem incorporar, por exemplo, modificações do esqueleto tais como fosforotioatos ou metilfosfonatos, podem ser usados para aumentar a semivida in vivo, alterar a afinidade do ARN, aumentar a resistência a nuclease, etc. [por exemplo, Agrawal & lyer (1995) Curr. Opin. Biotechnol 6:12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14:376-3871; também podem ser usados análogos tais como PNA [por exemplo, veja-se Corey (1997) 68 TIBTECH 15:224-229; Buchardt et al. (1993) TIBTECH 11:384- 386] .

Alternativamente, a reacção em cadeia da polimerase (PCR) é outro meio muito conhecido para detectar pequenas quantidades de ácido nucleico alvo. 0 ensaio é descrito em Mullis et ai. [Meth. Enzymol. (1987) 155:335-350] e as patentes de U.S. 4.683.195 e 4.683.202. Dois nucleótidos do "iniciador" hibridam-se com os ácidos nucleicos alvo e utilizam-se para iniciar a reacção. Os iniciadores podem compreender sequências que não se hibridam com a sequência da amplificação alvo (ou seu complemento) para ajudar com a estabilidade do dúplex ou, por exemplo, para incorporar um local de restrição conveniente. Normalmente, tal sequência flanqueará a sequência bacteriana desejada.

Uma polimerase termoestável cria cópias de ácidos nucleicos alvo dos iniciadores usando os ácidos nucleicos alvo originais como molde. Depois de se gerar uma quantidade limite de ácidos nucleicos alvo pela polimerase, podem ser detectados por métodos mais tradicionais tais como transferências Southern. Se for usado o método de transferência Southern, a sonda marcada se hibridará com a sequência bacteriana (ou seu complemento).

Portanto, o ARNm ou ADNc pode ser detectado por técnicas de transferência tradicionais descritas em Sambrook et al. [anteriormente] . ARNm, ou ADNc gerado a partir de ARNm usando uma enzima polimerase, podem ser purificados e separados utilizando electroforese em gel. Então, os ácidos nucleicos sobre o gel são transferidos sobre um suporte sólido, tal como nitrocelulose. O suporte sólido é exposto a uma sonda marcada e depois é lavado para eliminar qualquer sonda sem hibridar. A seguir, os dúplex que contêm a sonda marcada são detectados. Normalmente, a sonda se marca com um resíduo radiactivo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra um alinhamento de domínios catalíticos de 69 diversas toxinas bacterianas que incluem a toxina de N. meningitidis da invenção (NMB1343). Resíduos importantes para a actividade catalítica são mostrados ampliados. A Figura 2 mostra um alinhamento múltiplo de sequências de regiões conservadas de LT e toxinas da invenção. Resíduos importantes para a actividade catalítica são mostrados sublinhados. Resíduos importantes para a conservação da estrutura têm um fundo sombreado. Outros resíduos conservados são indicados em negrito. A Figura 3 mostra a incorporação de NAD radiomarcada na toxina de N. meningitidis. Na Figura 3B, as pistas são: (Ll) 95 °C; (L2) novobiocina, 5 mMol; (L3) GTP, 10 mMol; (L4) ATP, 10 mMol; (L5) ADP-ribose, 10 mMol; (L6) nicotinamida (NAM), 10 mMol; (L7) controlo. A seta mostra a posição da toxina.

MODOS PARA LEVAR A CABO A INVENÇÃO

Gene da toxina de Neisseria meningitidis, serogrupo B

Uma proteína com a sequência de aminoácidos <SEC ID 1> foi identificado em N. meningitidis (serogrupo B, estirpe MC58). Esta está codificada por um gene que tem a sequência de nucleótidos <SEQ ID 2>. A proteína ('NMB1343') mostra 27% de identidade com CT-A [CAA41592] sobre a sobreposição de 127 aa 70

1343 MGNFLYRGISCQQDE-QNNGQLKPKGNKAEVAIRYDGKFKYDGKATHGPSVKNAV |||: | M :::| | |=|:: :| :| :| ::: :

CT-A MVKIIFVFFIFLSSFSYANDDKLYRADSRPPDEIKQSGGLMPRGQS-----EY-----FD----RGTQMNINL

1343 YAHQ- - IETGL- -YDGCYISTTTDKEIAKKFATS- -SGIENGYIYVLNR- -DLFGQYSIFEYEVEHPENPNEK I I Hl· : I hll· = = |: : : II : lllh ==l· -= ll· l·

CT-A YDHARGTQTGFVRHDDGYVSTSISLRSAHLVGQTILSGHSTYYIYVIATAPNMFNVNDVLGAYSPHPD---EQ 1343 EVTIRAEDCGCIPEEVIIAKELIEIN* ll·

CT-A EVSALGGIPYSQIYGWYRVHFGVLDEQLHRNRGYRDRYYSNLDIAPAADGYGLAGFPPEHRAWREEPWIHHAP

CT-A PGCGNAPRSSMSNTCDEKTQSLGVKFLDEYOSKVKRQIFSGYQSDIDTHNRIKDEL A proteína mostra 30% de identidade com LTA [P06717]sobre a sobreposição de 125 aa:

1343 MGNFLYRGISCQQDE-QNNGQLKPKGNKAEVAIRYDGKFKYDGKATHGPSVKNAV l· III: I II : : I I I: I : : : I : LT-A MKNITFIFF ILLASPLYANGDRLYRADSRPPDEIKRSGGLMPRGHNE----YFD----------RGTQMNINL·

1343 YAHQ- - IETGL- - YDGCYISTTTDKEIAKKFATS- -SGIENGYIYVLNR......- - DLFGQYS IPEYEVEHP

II : I I · II hll· : : 1= : I II : llll· h:| II : II I LT-A YDHARGTQTGFVRYDDGYVSTSLSLRSAHLAGQSILSGYSTYYIYVIATAPNMFNVNDVLGVYSPHPYEQEVS 1343 ENPNEKEVTIRAEDCGCIPEEVIIAKELIEIN* LT-A ALGGIPYSQIYGWYRVNFGVIADERLHRNREYRDRYYRNLNIAPAEDGYRLAGFPPDHQAWREEPWIHHAPQG LT-A CGNSSRTITGDTCNEETQNLSTIYLREYQSKVKRQIFSDYQSEVDIYNRIRDEL258

Portanto, a proteína de N. meningitidis somente mostra um baixo nível de identidade com estas toxinas. De facto, uma busca com GRASTA do genoma de N. meningitidis usando as sequências de CT-A ou LT-A não identifica esta proteína nos 50 sinais principais. Similarmente, a própria proteína se anota simplesmente como 'proteína hipotética'. Embora não seja sugerida actividade de ADP-ribosiltransferase para esta proteína por métodos algorítmicos, análise mais detalhadas do alinhamento de sequências nas regiões de resíduos catalíticos clave revelam bos conservação (Figura D ·

No foi identificado gene correspondente no serogrupo A de N. meningitidis (estirpe Z2491 [21]) ou em N. gonorrhoaeae. Gene da toxina de Streptomyces coelicolor A3(2) 71

Uma proteína com a sequência de aminoácidos <SEQ ID 3> [CAB76015] foi identificada em S. coelicolor: 1 MITTSLKRRT aaavlslsav lattaatapg aapapsaapa kaapaçpqfd drtkaaadrg 61 VDVDRITPEP VWRTTCGTLY RSDSRGPQW FEEGFHAKDV QNGQYDVEKY VLVNQPSPYV 121 sfsYDHDLYK TWYKSGYNYY VDAPGGIDVN KTIGDTHKWA DQVEVAFPGG IQRKYIIGVÇ 181 PVDRQTKTEI MSDCESNPHY QPWH “

Esta proteína mostra 27% de identidade com CT-A sobre a sobreposição de 136 aa: seqid3 pacpqfddrtkaaaergvdvdritpepvwrttcgtlyrsdsrgpqw- —........ IIUIM I :

ct.pep MVKI IFVFFIFLSSFSYAíJDDKLjYgADSRPPDEIXQSGGLMPRGQS

SEQID3 ..........FEEGPHAKPVQWGQYDVEKYVLVWQPSPYVSigYP----HDLYKTWYKSG II l· T|: :hl =1 = = I t T[T = I :

Ct. pep EYPDRGTQMNINLYDHARGTQTa--------F^RHDDGYVSMSXSLRSAHLVGQTILSGH SEQID3 ct.pep

YNYYV----DAPGGIDVNKTIGDTHKWADQVfVAFPGGIQRKYIIGVCPVDRGTKTEIHS

dl· ll· -II -I iríl= III = II I

STYYIYV lATAPNMFNVNDVLGAYSPKPDgCÍEVSALGG IPYSQIYGWYRVHFGVLDEQLH

SEQID3 DCESNPHYQPWH

ct. pep RNRGYRDRYYSNLDIAPAADGYGLAGFPPEHRAMREEPWIHHAPPGCGKAPRSSMSNTCD

Portanto, como para N. meningitidis, somente existe um

baixo nível de identidade global com toxinas conhecidas, mas os resíduos catalíticos chave são conservados. A anotação da base de dados de 'proteína segregada putativa' não sugere actividade de ADP-ribosiltransferase.

Gene da toxina de Mycoplasma pneumoniae M129 [22]

Uma proteína com a sequência de aminoácidos <SEQ ID 4> [P75409] foi identificado em M. pneumoniae: 1 mpnpvrfvíS vDLRSpeEIF EHGPSTLGDV rnfpehilst nfgrSYFiçt SETPTAAIRF 61 FGSWLREYVP EHPRRAYLYE IRADQHPYKA RATGENLLDL MRQRQWFDS GDREMAQMGI 121 RALRTSFAYQ RBWFTDGPIA AANVRSAWLV DAVPVEPGHA HHPAGRWET TRINEPEMHN 181 PHYQELQTQA NDQPWLPTPG TATPVHLSIP QAASVADVSE GTSASLSFAC PDWSPPSSNG 241 ENPLDKÇIAE KIDNYNLQSL PQYASSVKEL EDTPVYLRGI KTQKTFMLQA DPQNNNVFLV 301 EVNPXOKSSF PQTIFFWDVY QRICLKDLTG AQ1SLSLTAP TTQYAGQLKV HLSVSAVNAV 361 NQKHXMTPQD IAITOFRVSS ELLGQTENGL FHNTKSGGSO HDLYVCPLKN PPSDLEELQI 421 IVDEÇTTHAQ FVTMRAASTF FVDVQLGWYW RGYYYTPQLS GWSYQMKTPD GQIFYDLKTS 481 K1FFVQDNQN VFFLHNKLNK QTGYSWDWVE HLKHDMHBDK DENFKWYFSR DDLTIPSVEG 541 LNFRH1RCYA DNQQLKVIIS GSRWGGwYST ydkvesnved kilvkdgfdr f

Esta proteína mostra 29% de identidade com PT sobre a sobreposição de 243 aa: 72 seqid4

Pt.pep

MPHPVRFVgjlVDLRSPEEIFEHGPSTLGDVRN

pt.pep 8ôqid4 "" ™

Seqidí RADOHFYHARATGEMLLDLMROROWFDSGDREMAOMGIRALRTSFAYigSgWFTDOPIAA

pt.pep RADNNPYGAASSYFEYVDTYG......DNAGRILAG----ALAT---' iHRRIPP

seqid4 ATPVHLSIPQAASVADVSEGTSASLSFACPDWSPPSSNGENPLDKCIAEKIDNYNLQSLP h I - = I I * « :l I I II pt.pep ASIVG-TLVRMAPVIGACMARQAESSEAMAAWSERAGEAMVLVYYΕΞIAYSF seqid4

QYASSVKELEDTPVYLRGIKTQKTFMLQADPQNIINVFIjVEVNPKQKSSFPOTIFFWDVYQ

Portanto, como para N. meningitidis e S. coelicolor, somente existe um baixo nível de identidade global com uma toxina conhecida, mas os resíduos catalíticos chave são conservados. A anotação da base de dados de 'proteína hipotética' nao sugere actividade de ADP- ribosiltransferase.

Gene da toxina de Salmonella typhimurium LT2 (estirpe SGSC1412)

Uma proteína com a sequência de aminoácidos <SEQ ID 5> foi identificada em S. typhimurium:

1 MKKLIFLTLS IVSFWNYAVD FVJRVDSTPP DVIFRDGFSL LGYNRNFQQF 51 ISGRSÇSGGS SP'SRYIATT5 SVNQTYAIAR AYYSRSTFKG MLYRYQIRAD 101 NNFYSLLPSI TYLETQGGHF NAYEKTMMRL "Q^YVSTLSI LPENIQKAVA 151 LVYDSATGLV KDGVSTMNAS YLGLSTTSNP GVÍPFLPEPO TYTQQRIXAF 201 GPLISSCFSI GSVCHSHRGQ RADVYHWSFY DARPVIELIL SK

Esta proteína mostra 29% de identidade com PT sobre a sobreposição de 232 aa: 73

SEQIDS MKKLIFLTLSIVSFNNYAVDFVYRVDSTPPDVIFRDGFSLLGYNRNPQQPI lil II II: :|::||: 111=: pt. pep artgwltwlailavtapvtspawaddppatvyhydsrppedvfqngftawgnndnvlohl 20 30 40 SO 60 70

SEQIDS SGRSCSGGSSDSRYIAJTSS-----------VNQTYAIARAYYSRSTFKGNLYRYQIRAD 3lll· 1113 : = = 131 = = = = II : = || I I 311

pt. pep TGRSCOVGSSNSAFVgJgSSRRYTEVYLEHRMQEAVEAERAGRGTGHPIG- - YIYEVRAD SEQIDS pt.pep

NNFYSLLPS-ITYLETQGGHFN- AYEKTMMRLQREYVSTLSIL P ΕΝ IQKAVAL VYDSATG IIM: I : I : : I | : : :: ϊ M : = I I I I I | |

NHFYGAASSYPBYVDTYCDNAGRILAGALATYQSEYLAHRRIPPEHIRRVTRVYHKGITO

SEQIDS LVKDGVSTMNASYLGLSTTSNPGVIPFLPEPQTYTQQRIXAFGPLISSCFSIGSVCHSHR : : II |:: M MM I I :: 11= IM I = = :

pt. pep ETTTTEYS - NARYVSQQTRANPN-------PYTSRRSVASIVGTLVRMAPVIGA- CMARQ

SEQIDS GQRADVYMMSPYDARPVIELILSK = : 1= = = I =3

pt.pep AESSEA--MAAWSERAGEAMVLVYYBSIAYSF

Portanto, como foi descrito anteriormente, somente existe um baixo nivel de identidade global com uma toxina conhecida, mas os residuos catalíticos chave são conservados.

Além disso, um gene na direcção 5' da proteína (SEQ ID 9) em S. typhimurium mostra homologia com a subunidade S2 da toxina pertussis:

Pontuação = 34,0 bits (77), esperado = 0,91

Identidades = 31/101 (30%), positivos 42/101 (40%), lacunas 7/101 (6%)

Query: 30 TNAYYSDEVISELHVGQIDTSPYFCIKrVKANGSGTPW-ACAVSKQStWAPSPKELLDQ 88 T+ YYS+ ♦ L T+ C V+ SG PV+ AC ♦ * L

SbjCt: 98 TDHYYSNVTATRLLS---STNSRLCAVFVR- - - SGQPVIGACTSPYDGKYWSMY5RL.RKM X51

Query: 89 ARYFYSTGQSVRIHVQKN1WTYPLFVNTFSANALVGLSSCS 129 Y G SVR+HV K Y TF AL G+S C+

Sbjct: 152 LYLIYVAGISVRVHVSKEEQYYDYEDATFETYALTGISICN 192

Gene da toxina de Salmonella paratyphi A (estirpe ATCC 9150)

Uma proteína com a sequência de aminoácidos <SEQ ID 6> foi identificada em S. paratyphi. Esta mostra boa homologia com a sequência de S. typhimurium mostrada anteriormente: Pontuação = 1231 (438,4 bits), esperado = l,6e-125, P = 1,6e-125

Identidades = 241/242 (99%), positivos 241/242 (99%) 74

Typili ; 1 HKKLiPí.TMSXVSFNHmVDFVYRVBSTPPDVTPROGFSM.OyNiaJPOQPISeSSCSGSS 60 M5CKL i FJUTW5 X VSPMSyAVDFVXRVDST PPOVIFRDGFSliLGYtmMFQQFX SG8SCSSGS Psrat: 1 MXKLXFbTLSXVSFI^ YAVDFWftVDSTPPD VíYt«yJF<3QPISGR3CSGCS «0

Ou«ry: «I SOSRyiíVrrSSVNOTyAX^RAYYSESTPKGHLYRYQIRftONKPYS^PSITYLETQCGH? 120 SDSR.Y1ATTSS VHQTYA íAJíAYYSRSTFKGNLYRYQ I RADNWFYSWbPS ITY LBTQGGHF SUjcti $% SSSRYIATTSSVNQTYMARAYYSRSTFKGmYSYQIRÃBNBPYStí^PSITOíETQGGKF 120

Qvery: 121 èJAYÉKTMKRIiQREYVSTLS I bPEHXQKftVALVYDS&TGLVKDGVSTMKASYLCI.S?TSNP 180 NÀ¥EKTMKÍl)UOREYVSTLSILP£}IIQKAVALVYDSATGLVlCDGVS'mNASYliOÍ»STTSHP SbjCCr 121 NAYEKTMMRLQRE YVSTLS l LPKHIÔKAVALVYDSATí:LVKIX;VSTWÍiA5¥I<GLSrrSN P 180 Oõory: 181 GVJPFkPEPQTYTQQRJXAPSPi-ISSCFSIGSVClíSHRCQftADWNMSFTOASPVIElIL 240 GVIPPLPEP0TYTQQR1 AF0P1,1SSC?S1GSVC SlWGQHÃJWYNMâFYDARPVIELiL Sbjct; 131 GyiPPLPEPQTYTOORlDAFGPLISSCFSJSSVGOSHRGGRA13V¥KMSFYBft8PVISl.n. 240 Ôoeifyí 241 SR* 242 SK*

Sbjct: 241 SK* 242

De nuevo, esta proteína mostra somente um baixo nível de identidade global com uma toxina conhecida, mas os resíduos catalíticos chave são conservados.

Como para S. typhimurium, existe um homólogo de PT-S2 na direcção 5', mas está desplazado no marco:

Pontuação = 387 (141,3 bits), esperado = 4,9e-36, P = 4,9e- 36

Identidades = 73/73 (100%), positivos = 73/73 (100%), quadro = +3

Qwsry ; 65 mr¥ACAVSK0SIWAPSPK£J.I£^ARYFYSTG0SVRIWQ5WXWTYPLÍWrFSANALVG 124 T P WACA VSKQSI «APS FKgl^DQWlt PY6TG0SVRIHVQKNIWTYPbFVHTir£AKAt.V<J Sb] Ct; 14802 TFWACAVSKQSIWAPSFKEUíDQARYPySTGQSVRXHVGKKIWTYPLfVNTrSRKALVG 14581

Oaery: 1.2S LSSCSATOCPGPSC 137

LSSCSAtOCFGPK

Sbjct: 14382 bSSCSATQCFGPK 1SD20

Puntuação = 327 (120,2 bits), esperado = l,le-29, P = l,le-29

Identidades = 65/96 (67%), positivos = 73/96 (76%), marco = +1

Ouery: 1 MYMSKYVPVYTbLILI¥SeMA£AEWYC^tmY¥SD£VIS£12fVeQIDTmFCIRTVKA $8 MV+t K+WVYTirali IYS FmSAÊWTGDSTOAY YSDEV1SE1MVGQIDTSPYFCIKTVKA Sbjct. 14611 «YlSKFVPVYTIíLILlYSFmSÍ^WTG]SmiA¥YSOeVISELHVGQIDTSPYPClKTVKA 14790

Oueryi 61 ÍÍCSGTPWACAVS KGE IKAPSFKEkbDQ AfíY FYSTS 96 BGS ** +* P K L 4· P G

SbjCt: 14791 HGS VHQUbHV» YQSRAYGRPPX.KH FJUl ftOOI PYVQG 1489«

Gene da toxina de Streptococcus pyogenes

Uma proteína com a sequência de aminoácidos <SEQ ID 7> foi identificada em S. pyogenes. Esta está codificada por um gene que tem a sequência de nucleótidos <SEQ ID 8>. 75

Esta proteína mostra 24% de identidade com a toxina C3 de Clostridium llmosum:

SEQID7 MLK.KRYQLAIVLLLSCFSLIWQTEGLVELFVCEHYERAVCEGTP-- -AYPTFSDQKGA | : | =| | | | t : : | , : t : | | : | ' : : | : : j

exoc3 cloli. MNKLTERVLCVGVSGLILFSVAALVQGTKKCYANPVRNRAASRVKPYADS PKEFTNIDEA SEOID7 exoc3 cloli. SEQID7 exoc3 cloli. SEQID7 exoe3 cloli.

ETLIKKRWGKGLIYPRAEQEAMAAYTCQQAGPINTSLDKAKGELSQLTPELRDQVAQLDA :: || ::|r || | | ::| :| hl

RAWGDKQPAKYKL-SSSEKNALTIYT-RNAARINGPLRANQGNTNGI-PADIRKEVEQIDK

ATHRLVIPWNIWYRYVYETFLRDIGVSHADL--TSYYRNHQFDPHILCKIKL- - -GTRY = I ||:::| II h I h = = :: :=11 |

SFTKMQTPENIILFRG------DDPGYLGPDPEKTILNRDGTINKAVFEQVKLRFK.GKDR

TKHSFMSTTALKNGAMTHRPVEVRICVKKGAKAAFVEPYSAVPSEVELLPPRGCQLEWG ::::1:: ||: ::: | |:||::: I h ^hhlh keygyistslvngsapagrpiitkfkvldgskagyiepistpkgqlevllprsstytisd SEQID7 AYVSQDQKKLHIEAYFKGSL· II d

exoc3_ClolÍ. MQIAPNNKQIIITALLKR

Também mostra 29% de identidade com a transferase EDIN [M63917; ref. 23] de S. aureus:

Identidades = 58/195 (29%), positivos = 106/195 (53%),

Lacunas = 13/195 (6%) cuery: 67 RWGKGLI-----YPRAEQEAMAAYTCQQAGPIKtSU>KAKGELSQt*TPELRaQVAQIiQAAT X22 +WG bX Y +♦ A.+ Yt + + IÍJ X. A G++++L +D+V *LI>+*

Sbjct: 49 K»GNKiIíCiQAK.YSSDDXIALYEYT-}a>SSÍCIKGPLRLAGGOIUKUJSTX0SKVRRl<l>3SI 107

Query; {23 HRLV1PSWIWYRYVYRTRLRDI-GVSKADLTSYYR--NKQÍT5PHIECKIK--LGTR-YT 17« + p +♦ vnm + +t i g «-♦ dl *s Q+o k» + ♦» y Sbjct: 109 SKSTTPSS{nonfRLLHU3Y1.7S3VGrrHEDbYiaiQ0TNSGQYDEÍU.VRXLÍlNVKÍitSSiIYR 167

Query: 177 KHS.^TTALKSSAHTHKPVEVRICVRKGAKAAPV-EPY;SAVPSEVEU,?PRGCQLEVV 234 * * ST + A+ RP+E+S+- + KG KAA++ * *A + E*b PRG + V

Sbjct: 16β EDGYSStXíLVSGAAVGGRPIELRbELPKtnTaUlYUiíSISILTAirYGQaEVLLPftGTBYAW 227

Query; 235 GAYVSQDOKKLKIEA 249 +S D+KK* I A

Sbjct: 239 SVELSNOXKKXUTA 343

Estudos enzimáticos A proteína de N. meningitidis foi expressa e purificada em E. coli como um produto marcado com His. Os anticorpos policlonais de ratinho produzidos contra a proteína recombinante foram usados em análise de transferência Western e mostraram uma banda repentina a 20 kDa num lisado celular da estirpe MC58 de N. meningitidis. Uma preparação de vesículas de membrana externa não mostrou tal banda.

Como ensaio preliminar para a actividade de NAD- 76 glicohidrolase foi usada agmatina como aceptor de ADP-ribose. A proteína purificada foi incubada em presença de agmatina 0 mM, 20 mM ou 75 mM em fosfato de potássio 50 mM, [carbonil-14C] NAD 0,01 mM (0,05 pCi) , pH 7,5, num volume total de 0,3 ml. Depois das incubações a 30 °C durante 18 h, as amostras (100 μΐ) foram aplicadas a uma coluna de 1 ml de Dowex AG 1-X2. A [14C] nicotinamida foi eluída com 5 ml de H2O para radioensaio. A actividade enzimática foi do seguinte modo:

Concentração de agmatina (mM) Actividade enzimática (pmol/h) 0 34 20 62 75 72

Foram realizados outros estudos de actividade de NAD-glicohidrolase e ADP-ribosiltransferase usando agmatina como aceptor. O ensaio de NAD-glicohidrolase usou [carbonil-14C] NAD 0,1 M, gue foi substituído com [adenina-0-14C]NAD para o ensaio de ADP-ribosiltransferase. Depois da incubação a 30 °C durante 1 hora, as amostras foram testadas como antes. Os resultados foram do seguinte modo: [Agmatina] (mM) ADP-ribosilagmatina formada (nmol/hora) Nicotinamida libertada (nmol/hora) 0 - co 20 6,3 15, 4 75 18,1 25, 9

Foram testados outros aminoácidos como aceptores de ADP-ribose à concentração 20 mM. Os resultados foram:_

Aminoácido Nicotinamida libertada (nmol/hora) Controlo 8, 2 Agmatina 15, 6 Arginina 14, 6 77

Glicina 8, 5 Cisteína 11, 7 Serina 8, 6 Lisina co Histidina 8, 8 Prolina 8, 6

Auto ADP-rlbosilação de toxina de N. meningitidis NMB1343 purificado (5,7 yg) foi incubado em fosfato de potássio 50 mM (pH 7,5) com [adenilato-32P] NAD 10 μΜ (10 yCi por ensaio) num volume total de 50 μΐ durante 1 h a 30 °C. A proteína foi precipitada com a adição de 50 μΐ de ácido tricloroacético frio em gelo (concentração final de 25%) e, após uma incubação durante a noite a 4 °C, foi colhido por centrifugação (10.000 x g durante 30 min). O sedimento foi suspenso em LDS e foi aquecido a 70 °C durante 5 min. Então, as amostras foram submetidas a electroforese em (4-12% ou 10%) de geles NuPAGE usando MES como tampão de electroforese e foram electrotransferidas a membranas de nitrocelulose que foram expostas à película X-Omat durante 5 dias a temperatura ambiente.

Durante a incubação com [32P]NAD, a radiomarcação de NMB1343 aumenta de um modo dependente da concentração (Figura 3A) . Para confirmar que a modificação de proteína era enzimática (isto é, não participava essa adição química de ADP-ribose reactiva), as experiências de marcado foram levadas a cabo em presença de Nam, um inibidor de NADase conhecido, e em presença de um grande excesso de ADP-ribose fria. Ambas as experiências deram uma quantidade idêntica de proteína radiomarcada (Figura 3B, L5 e L6) . A incorporação enzimática também foi suportada pela descoberta de que a pré-incubação de NMB 1343 a 95 °C durante 5 minutos abole completamente a marcação (Ll) e que a marcação não é produzida em presença de novobiocina (L2), um conhecido inibidor de ADPRT. 78Toxinas mutantes Com base em homologia com toxinas conhecidas e a predição de resíduos catalíticos foram gerados quatro mutantes de SEQ ID 1, contendo cada um uma substituição de um único aminoácido. A arginina na posição 7 e os ácidos glutâmicos nas posições 109, 111 e 120 foram substituídos com resíduos de lisina e glicina, respectivamente, usando mutagénese dirigida a local (SDM) com base em PCR. Foram desenhados iniciadores internos que contêm uma mudança de codão de Arg a Lys, e de Glu a Gly:_

Iniciador Sequência {SEQ ID} Mudança de codão WT- CGCGGATCCCATATGGGAAATTTCTTATATAGAGGCATTAGTTGC {18} directo WT- CCCGCTCGAGGTTAATTTCTATCAACTCTTTAGCAAT {19} reverso R7K- CGCGGATCCCATATGGGAAATTTCTTATATAaAGGCATTAGTTGC {20} AGA directo AaA E109G- AT T T T T GAAT ATGgGGTT GAACAT C CAGAAAAG {21} GAG directo GgG E109G- TTCTGGATGTTCAACCcCATAITCAAAAATAGA {22} reverso E111G- TATGAGGTTGgACATCCAGAAAACCCA {23} GAA -> directo GgA E111G- GTTTTCTGGATGTcCAACCTCATATTC {24} reverso E120G- CCAAAT GAGAAGgAGTAACAAT CAGAG {25} GAA directo GgA E120G- GATTGTTACTcCCTTCTCATTTGGGTT {26} reverso Os nucleótidos sublinhados codificam lisina ou glicina, e os nucleótidos mutados estão em minúscula.

Para gerar o mutante de R7K foi realizada uma única etapa 79 de PCR. 0 molde foi 20 ng de ADN que codifica NMB 1343 marcado com His. Os iniciadores foram R7K-directo e WT-reverso.

Para gerar os restantes mutantes, a PCR foi realizado usando 20 ng de ADN de pET 21b+ como molde, e os seguintes pares de iniciadores: (1) WT-directo / E109G-reverso; (2) E109G-directo / WT-reverso; (3) WT-directo / ElllG-reverso; (4) ElllG-directo / WT-reverso; (5) WT-directo/ E120G-reverso; (6) E120G-directo / WT-reverso. A segunda rodada de PCR foi realizada usando o produto de PCR 1-2, 3-4 ó 5-6 como molde, e WT-directo e WT-reverso como iniciadores directo e reverso, respectivamente.

Os fragmentos de PCR que contêm cada mutação foram processados seguindo o método convencional, foram digeridos com enzimas de restrição NdeI e XhoI e foram clinado no vector pET-21b+. A presença de cada mutação foi confirmada por análise de sequências.

Depois de clonar cada gene no vector de expressão, os plasmideos recombinantes foram transformados em estirpes de E. coli adequadas para a expressão da proteína recombinante como marca de His. Foram usados 1,5 μΐ de cada construção para transformar BL21-DE3 de E. coli. As colónias recombinantes individuais foram inoculadas em 4 ml de LB+Amp (100 pg/ml), fora incubadas a 37 °C durante a noite, depois foram diluídas 1:30 em 20 ml de LB+Amp (100 pg/ml) em balões de 125 ml dando uma D060o entre 0,1 e 0,2. Os balões foram incubados a 37 °C num agitador com banho de água giratório até que a D060o indicou o crescimento exponencial adequado para a indução de expressão (DO 0,4-0,8) . A expressão de proteínas foi induzida por meio da adição de IPTG 1,0 mM. Depois de 3 horas de incubação a 37 °C, a ϋΟεοο foi medida e a expressão foi examinada. 1,0 ml de cada mostra foi centrifugada numa microcentrífuga, o sedimento foi ressuspenso em PBS e foi analisado por SDS-PAGE e coloração com azul de Coomassie. Todos os mutantes 80 foram expressos tão eficientemente como os naturais, e foram purificados como formas solúveis. As actividades de ADP-ribosiltransferase e NAD- glicohidrolase foram determinadas como foi descrito anteriormente. As mutações de Lys e Gly foram estudadas por separado. Os resultados foram do seguinte modo;_

Mutante Actividade de ADP-ribosiltransferase (pmol/hora) Actividade de NAD-glicohidrolase (nmol/hora) Natural 1,8 2,6 R7K 0,1 0, 08 Natural 305 680 EI09 g 30 315 EI 11 g 116 289 EI20 g 36 100

Portanto, a actividade enzimática da toxina de N. meningitidis pode ser eliminada racionalmente e eficientemente por mutagénese dirigida a local.

Se entenderá que a invenção somente foi descrita como forma de exemplo e que podem ser feitas modificações enquanto estejam dentro do alcance e espírito da invenção. QUADRO 1 - Mutações preferidas (Δ = deleção do resíduo) 81

82 SEQ ID Local para mutação (mutações) Resíduo de substituição Asp-6 4 Glu, Tyr Arg-81 Lys, Gly, Trp, Δ Asp-83 Glu, Tyr, Ser Arg-85 Lys, His, Leu Gly-86 Arg, Asp His-96 Asn, Tyr, Gin, Gln-101 Vai, Ser, Pro Tyr-110 Ala Val-113 Met Tyr-119 Asp, Glu, Tyr 3 Ser-121 Glu Ser-123 Phe His-126 Lys, Tyr Gly-136 Asn, Tyr, Gin, Val-149 Vai His-157 Lys Gln-162 Lys, Tyr Glu-164 Glu Asp, Ser, Δ Ala, Gly, Lys, Asp, Gin, Δ Arg-10 Lys, Δ Asp-12 Glu, Tyr, Ser Arg-14 Lys, His, Leu Ile-19 Ala 4 His-36 Asn, Tyr, Gin, Thr-40 Vai, Ser, Pro Arg-44 Gly Ala, Lys 83 SEQ ID Local para mutação (mutações) Resíduo de substituição Phe-4 7 Met, Glu Ser-49 Phe Ser-51 Lys, Tyr Ala-57 Arg Gln-130 Asp, Ser, Δ Glu-132 Ala, Gly, Lys, Trp-133 Asp, Gin, Δ Gly Arg-2 4 Lys, Δ Asp-26 Glu, Tyr, Ser Ile-33 Ala Tyr-43 Trp, Ala, His Arg-46 Ala, Lys Cys-56 Δ Ser-61 Phe Ser-63 Lys, Tyr Tyr-65 Met, Glu 5/6 Thr-6 8 Phe Thr-6 9 Phe Ser-70 Lys, Tyr Ser-8 4 Phe Ser-86 Lys, Tyr Gln-131 Asp, Ser, Δ Glu-133 Gly, Ala, Lys, Tyr-134 Asp, Gin, Δ Gly 84

REFERENCIAS (cujo conteúdo se incorpora por completo neste documento) [1] Rappuoli & Pizza (1991) Chapter 1 of Sourcebook of Bacterial Protein Toxins (Alouf & Freer, eds). ISBN 0-12-053078-3 .

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[3] Sixma et al. (1991) Nature 351:371-377.

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[5] Stein et al. (1994) Structure 2:45-57.

[6] Pedido de patente internacional WO93/13202.

[7] Pedidos de patente europeias 0306618, 0322533 and 0322115.

[8] Del Guidice & Rappuoli (1999) Vaccine 1999 17 Suppl 2:544-52 [9] Patente europeia 0396964.

[10] Northrup & Fauci (1972) J. Infect. Dis. 125:672ff.

[11] Elson & Ealding (1984) J. Immunol. 133:2892ff and 132 : 2736ff.

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[15] Pedido de patente internacional W099/36544.

[16] Pedido de patente internacional WO99/57280. 85 [17] Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815.

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[22] Himmelreich et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:4420-4449 .

[23] Wilde et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:9537-9542. 86

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> CHIRON SpA

<120> TOXINAS BACTERIANAS DE RIBOSILAÇÃO DE ADP

<130> P02696SWO <150> GB-0108024.1 <151> 30/03/2001 <160> 26 <170> SeqWin99, versão 1.02

<210> 1 <211> 145 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 1 87

Met 1 Gly Aen Phe Leu Tyr Arg 5 Gly Ile Ser 10 Cys Gin Gin Asp Glu 15 Gin Asn Asn Gly Gin 20 Leu Lys Pro Lys Gly 25 Asn Lys Ala Glu Vai 30 Ala Ile Arg Tyr Asp Gly Lys Phe Lys 35 Tyr Asp 40 Gly Lys Ala Thr 45 His Gly Pro Ser Vai Lys 50 Asn Ala Vai Tyr 55 Ala His Gin Ile Glu 60 Thr Gly Leu Tyr Asp 65 Gly Cys Tyr Ile Ser Thr 70 Thr Thr Asp Lys 75 Glu Ile Ala Lys Lys 80 Phe Ala Thr Ser Ser Gly Ile 85 Glu Asn Gly 90 Tyr Ile Tyr Vai Leu 95 Asn Arg Asp Leu Phe Gly Gin Tyr 100 Ser Ile 105 Phe Glu Tyr Glu Vai 110 Glu His Pro Glu Asn 115 Pro Asn Glu Lys Glu 120 Vai Thr ile Arg Ala 12S Glu Asp Cys Gly Cys Ile 130 Pro Glu Glu Vai 135 Ile Ile Ala Lys Glu 140 Leu Ile Glu Ile

Asn 145

<210>2 <211>435 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis <400> 2 .atgggaaatt tcttatatag aggcattagt tgccaacaag atgagcaaaa taatggacag ttaaaaccta aaggtaataa agctgaagtt gcaattcgtt atgatggtaa gtttaaatat gatggtaaag ctacacatgg tccaagtgtg aagaatgcag tttacgccca tcaaattgaa acaggtctat atgacggatg ttatatatct acgacaacag acaaggaaat tgccaagaaa tttgcaacaa gttccggcat cgaaaatggc tatatatatg ttttaaatag ggatttgttt ggtcaatatt ctatttttga atatgaggtt gaacatccag aaaacccaaa tgagaaggaa gtaacaatca gagctgaaga ttgtggctgt attcctgaag aagtgattat tgctaaagag ttgatagaaa ttaac

<210>3 <211>2 0 4 <212> PRT 60 120 180 240 300 360 420 435 88 <213> Streptomyces coelicolor <400> 3

Met Ile Thr Thr Ser Leu Arg Arg Arg Thr Ala Ala Ala Val Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ser Ala Val Leu Ala Thr Thr Ala Ala Thr Ala Pro Gly Ala Ala 20 25 30 Pro Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Pro Ala Cys Pro Gin 35 40 45 Phe Asp Asp Arg Thr Lys Ala Ala Ala Asp Arg Gly Val Asp Val Asp 50 55 60 Arg Ile Thr Pro Glu Pro Val Trp Arg Thr Thr Cys Gly Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Arg Ser Asp Ser Arg Gly Pro Gin val Val Phe Glu Glu Gly Phe His 85 90 95 Ala Lys Asp Val Gin Asn Gly Gin Tyr Asp Val Glu Lys Tyr Val Leu 100 105 110 Val Asn Gin Pro Ser Pro Tyr Val Ser Thr Ser Tyr Asp His Asp Leu 115 120 125 Tyr Lys Thr Trp Tyr Lys Ser Gly Tyr Asn Tyr Tyr Val Asp Ala Pro 130 135 140 Gly Gly Ile Asp Val Asn Lys Thr Ile Gly Asp Thr His Lys Trp Ala 145 150 155 160 Asp Gin Val Glu Val Ala Phe Pro Gly Gly lie Gin Arg Lys Tyr Ile 165 170 175 Ile Gly val Cys Pro Val Asp Arg Gin Thr Lys Thr Glu Ile Met Ser 180 185 190 Asp Cys Glu Ser Asn Pro His Tyr Gin Pro Trp His 195 200

<210>4 <211> 591 <212> PRT <213> Mycoplasma pneumoniae <400> 4 89

Met Pro Asn Pro Vai Arg Phe Vai Tyr Arg Vai Asp Leu Arg Ser Pro 15 10 15

Glu Glu Ile Phe Glu His Gly Phe Ser Thr Leu Gly Asp Vai Arg Asn 20 25 30 90

Phe Phe Glu His Ile Leu Ser Thr 35 40

Ser Thr Ser Glu Thr Pro Thr Ala S0 55

Leu Arg Glu Tyr vai Pro Glu His 65 70

Ile Arg Ala Asp Gin His Phe Tyr 85

Leu Leu Asp Leu Met Arg Gin Arg 100

Arg Glu Met Ala Gin Met Gly Ile 115 120

Tyr Gin Arg Glu Trp Phe Thr Asp 130 135

Arg Ser Ala Trp Leu Vai Asp Ala 145 150

His His Pro Ala Gly Arg Vai Vai 165

Glu Met His Asn Pro His Tyr Gin 180

Gin Pro Trp Leu Pro Thr Pro Gly 195 200

Ile Pro Gin Ala Ala Ser Vai Ala 210 215

Ser Leu Ser Phe Ala Cys Pro Asp 225 230

Glu Asn Pro Leu Asp Lys Cys Ile 245

Leu Gin Ser Leu Pro Gin Tyr Ala 260

Thr Pro Vai Tyr Leu Arg Gly Ile 275 280

Gin Ala Asp Pro Gin Asn Asn Asn 290 29S

Lys Gin Lys Ser Ser Phe Pro Gin 305 310

Gin Arg Ile Cys Leu Lys Asp Leu 325

Leu Thr Ala Phe Thr Thr Gin Tyr 340

Aen Phe Gly Arg Ser Tyr Phe ile 45

Ala Ile Arg Phe Phe Gly Ser Trp 60

Pro Arg Arg Ala Tyr Leu Tyr Glu 75 80

Asn Ala Arg Ala Thr Gly Glu Asn 90 95

Gin Vai Vai Phe Asp Ser Gly Asp 105 110

Arg Ala Leu Arg Thr Ser Phe Ala 125

Gly Pro Ile Ala Ala Ala Asn Vai 140

Vai Pro Vai Glu Pro Gly His Ala 155 ’ 160

Glu Thr Thr Arg Ile Asn Glu Pro 170 175

Glu Leu Gin Thr Gin Ala Asn Asp 185 190

Ile Ala Thr Pro Vai His Leu Ser 205

Asp Vai Ser Glu Gly Thr Ser Ala 220

Trp Ser Pro Pro Ser Ser Asn Gly 235 240

Ala Glu Lys Ile Asp Asn Tyr Asn 250 255

Ser Ser Vai Lys Glu Leu Glu Asp 265 270

Lys Thr Gin Lys Thr Phe Met Leu 285

Vai Phe Leu Vai Glu Vai Asn Pro 300

Thr Ile Phe Phe Trp Asp Vai Tyr 315 320

Thr Gly Ala Gin Ile Ser Leu Ser 330 335

Ala Gly Gin Leu Lys Vai His Leu 345 350 91

Ser Vai Ser Ala Vai Asn Ala Vai 3SS 360

Gin Asp Ile Ala Ile Thr Gin Phe 370 375

Gin Thr Glu Asn Gly Leu Phe Trp 385 390

His Asp Leu Tyx Vai Cys Pro Leu 405

Glu Leu Gin Ile Ile Vai Asp Glu 420

Thr Met Arg Ala Ala Ser Thr Phe 435 440

Tyr Trp Arg Gly Tyr Tyr Tyr Thr 450 455

Gin Met Lys Thr Pro Asp Gly Gin 465 470

Lys ile Phe Phe Vai Gin Asp Asn 485

Lys Leu Asn Lys Gin Thr Gly Tyr SOO

Lys His Asp Met Asn Glu Asp Lys 515 520

Ser Arg Asp Asp Leu Thr ile Pro 530 535

His Ile Arg Cys Tyr Ala Asp Asn 545 550

Gly Ser Arg Trp Gly Gly Trp Tyr 565

Asn Vai Glu Asp Lys Ile Leu vai 580

Asn Gin Lys Trp Lys Met Thr Pro 365

Arg Vai Ser Ser Glu Leu Leu Gly 380

Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser Gin 395 400

Lys Asn Pro Pro Ser Asp Leu Glu 410 415

Cys Thr Thr His Ala Gin Phe vai 425 430

Phe Val Asp Vai Gin Leu Gly Trp 445

Pro Gin Leu Ser Gly Trp Ser Tyr 460

Ile Phe Tyr Asp Leu Lys Thr Ser 475 460

Gin Asn Val Phe Phe Leu His Asn 490 495

Ser Trp Asp Trp Val Glu Trp Leu 505 510

Asp Glu Asn Phe Lys Trp Tyr Phe 525

Ser val Glu Gly Leu Aen Phe Arg 540

Gin Gin Leu Lys Val Ile Ile Ser 555 560

Ser Thr Tyr Asp Lys Val Glu Ser 570 575

Lys Asp Gly Phe Asp Arg Phe 585 590

<210>5 <211>2 42 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium <400> 5 92

Met Lys Lys Leu Xle Phe Leu Thr Leu Ser Ile Vai Ser Phe Asn Asn 15 10 15

Tyr Ala Vai Asp Phe Vai Tyr Arg Vai Asp Ser Thr Pro Pro Asp Vai 20 25 30

Ile Phe Arg Asp Gly Phe Ser Leu Leu Gly Tyr Asn Arg Asn Phe Gin 35 40 45

Gin Phe Ile Ser Gly Arg Ser Cys Ser Gly Gly Ser Ser Asp Ser Arg 50 55 60

Tyr Ile Ala Thr Thr Ser Ser Vai Asn Gin Thr Tyr Ala Ile Ala Arg 65 70 75 60

Ala Tyr Tyr Ser Arg Ser Thr Phe Lys Gly Asn Leu Tyr Arg Tyr Gin S5 90 95

Ile Arg Ala Asp Asn Asn Phe Tyr Ser Leu Leu Pro Ser Ile Thr Tyr 100 105 110

Leu Glu Thr Gin Gly Gly Hie Phe Asn Ala Tyr Glu Lys Thr Met Met 115 120 125

Arg Leu Gin Arg Glu Tyr Vai Ser Thr Leu Ser Ile Leu Pro Glu Asn 130 135 140

Ile Gin Lys Ala Vai Ala Leu vai Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Leu Vai 145 150 155 160

Lys Asp Gly Vai Ser Thr Met Asn Ala Ser Tyr Leu Gly Leu Ser Thr 165 170 175

Thr Ser Asn Pro Gly Vai Ile Pro Phe Leu Pro Glu Pro Gin Thr Tyr 180 165 190

Thr Gin Gin Arg Ile Xaa Ala Phe Gly Pro Leu Ile Ser Ser Cys Phe 195 200 205

Ser Ile Gly Ser Vai Cys His Ser His Arg Gly Gin Arg Ala Asp Vai 210 215 220

Tyr Asn Met Ser Phe Tyr Asp Ala Arg Pro Vai Ile Glu Leu Ile Leu 225 230 235 240

Ser Lys

<210>6 <211>242 <212> PRT <213> Salmonella paratyphi 93 <400> 6

Met 1 Lys Lys Leu Ile 5 Phe Leu Thr Leu Ser 10 Ile Val Ser Phe Asn 15 Asn Tyr Ala Vai Asp 20 Phe Vai Tyr Arg Val 25 Asp Ser Thr Pro Pro 30 Asp Val Ile Phe Arg 35 Aep Gly Phe Ser Leu 40 Leu Gly Tyr Asn Arg 45 Asn Phe Gin Gin Phe SO Ile Ser Gly Arg Ser 55 Cys Ser Gly Gly Ser 60 Ser Asp Ser Arg Tyr 65 Ile Ala Thr Thr Ser 70 Ser Val Asn Gin Thr 75 Tyr Ala Ile Ala Arg 80 Ala Tyr Tyr Ser Arg 85 Ser Thr Phe Lys Gly 90 Asn Leu Tyr Arg Tyr 95 Gin

Ile Arg Ala Asp Asn Asn Phe Tyr Ser Leu Leu Pro Ser Ile Thr Tyr 100 105 110 Leu Glu Thr Gin Gly Gly His Phe Asn Ala Tyr Glu Lys Thr Met Met 115 120 125 Arg Leu Gin Arg Glu Tyr Val Ser Thr Leu Ser Ile Leu Pro Glu Asn 130 135 140 Ile Gin Lys Ala Val Ala Leu Val Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Leu Val 14S 150 155 160 Lys Asp Gly Val Ser Thr Met Asn Ala Ser Tyr Leu Gly Leu Ser Thr 165 170 175 Thr Ser Asn Pro Gly Val Ile Pro Phe Leu Pro Glu Pro Gin Thr Tyr 180 185 190 Thr Gin Gin Arg Ile Asp Ala Phe Gly Pro Leu Ile Ser Ser Cys Phe 195 200 205 Ser Ile Gly Ser Val Cys Gin Ser His Arg Gly Gin Arg Ala Asp Val 210 215 220 Tyr Asn Met Ser Phe Tyr Asp Ala Arg Pro Val Ile Glu Leu Ile Leu 225 230 235 240

Ser Lys

<210>7 <211>250 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes 94 <400> 7

Met Leu Lys Lye Arg Tyr Gin 1 5 Phe Ser Leu Ile Trp Gin Thr 20 Glu His Tyr Glu Arg Ala Val 35 Phe Ser Asp Gin Lys Gly Ala 50 55 Lys Gly Leu Ile Tyr Pro Arg 65 70 Thr Cys Gin Gin Ala Gly Pro 85 Gly Glu Leu Ser Gin Leu Thr 100 Leu Asp Ala Ala Thr His Arg 115 Tyr Arg Tyr Val Tyr Glu Thr 130 135 Ala Asp Leu Thr Ser Tyr Tyr 145 150 Leu Cys Lys Ile Lys Leu Gly 165 Ser Thr Thr Ala Leu Lys Asn 180 Val Arg Ile Cys Val Lys Lys 195 Tyr Ser Ala Val Pro Ser Glu 210 215 Gin Leu Glu Val val Gly Ala 225 230 His ile Glu Ala Tyr Phe Lys

Ala Ile Vai Leu Leu Leu Ser Cys 10 IS

Gly Leu Vai Glu Leu Phe Vai Cys 25 30

Glu Gly Thr Pro Ala Tyr Phe Thr 45

Thr Leu Ile Lys Lys Arg Trp Gly 60

Glu Gin Glu Ala Met Ala Ala Tyr 75 80

Asn Thr Ser Leu Asp Lys Ala Lys 90 95

Glu Leu Arg Asp Gin Vai Ala Gin 10S 110

Vai Ile Pro Trp Asn Ile vai Vai 125

Leu Arg Asp Ile Gly Vai Ser His 140

Asn His Gin Phe Asp Pro His Ile 155 160

Arg Tyr Thr Lys His Ser Phe Met 170 175

Ala Met Thr His Arg Pro Vai Glu 185 190

Ala Lys Ala Ala Phe Vai Glu Pro 205

Glu Leu Leu Phe Pro Arg Gly Cys 220

Vai Ser Gin Asp Gin Lys Lys Leu 235 240

Ser Leu 250

<210>8 <211>765 <212> ADN 245 95 <213> Streptococcus pyogenes <400> 8 gtgtcagggg gaactatgct aaaaaagcgc tatcaactgg ctattgtcct tcttcttagc 60 tgttetagtc tgatctggca aactgagggc ttggtcgagc tttttgtctg tgagcactat 120 gagcgggcgg tttgtgaggg gacgcctgct tattttacct tttcggatca aaagggcgct 180 gagacactga ttaaaaagcg atggggcaag ggtctcatct acccaagggc tgagcaagag 240 gcgatggctg cttatacctg tcagcaggca ggccctatca acaccagcct agacaaagcc 300 aaaggtgagc tcagccaact cacgccCgag ctaagggatc aggtggccca gctcgatgct 360 gcgactcacc ggctagtcat cccgtggaac attgtagtat accgctatgt atacgagacg 420 tttttgcgtg atatcggtgt ttcacatgct gatctcacgt cttaccaccg eaaccatcag 480 tttgaccctc atatcctttg taagatcaag cttggtacac gctacaccaa gcacagtttt 540 atgagcacga cagccttgaa aaacggcgcc atgacccatc gaccggtgga ggtgcgcatc 600 tgtgtcaaaa aaggggccaa ggcagccttt gtcgagcctt attcggctgt gccttcagag 660 gttgagctct Cgtttccaag aggctgtcag ctggaggtcg ttggagctta cgtgtcacag 720 gaccaaaaaa agctccacat agaagcgtat ttcaagggca gtttg 765

<210>9 <211> 137 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium <400> 9 96

Met 1 Tyr Met Ser Lys 5 Tyr Vai Pro val Tyr 10 Thr Leu Leu ile Leu 15 Ile Tyr Ser Phe Asn 20 Ala Ser Ala Glu Trp 25 Thr Gly Asp Asn Thr 30 Asn Ala Tyr Tyr Ser Asp 35 Glu vai He Ser 40 Glu Leu His Val Gly 45 Gin Ile Asp Thr Ser 50 Pro Tyr Phe Cys lie 55 Lys Thr Val Lys Ala 60 Asn Gly Ser Gly Thr 65 Pro Vai Vai Ala Cys 70 Ala Val Ser Lys Gin 75 Ser Ile Trp Ala Pro 80 Ser Phe Lys Glu Leu 85 Leu Asp Gin Ala Arg Tyr 90 Phe Tyr Ser Thr 95 Gly Gin Ser Vai Arg 100 Ile Hls vai Gin Lys 105 Asn Ile Trp Thr Tyr 110 Pro Leu Phe Vai Asn Thr 115 Phe Ser Ala Asn 120 Ala Leu Val Gly Leu 125 Ser Ser Cys Ser Ala Thr Gin Cys Phe Gly Pro Lys 130 135

<210> 10 <211>145 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <4 0 0> 10 97

Met Gly Asn 1 Phe Leu Tyr 5 Lys Gly Ile Ser 10 Cys Gin Gin Asp Glu 15 Gin Asn Asn Gly Gin 20 Leu Lys Pro LyS Gly Asn 25 Lys Ala Glu Vai 30 Ala Ile Arg Tyr Asp Gly Lys Phe 35 Lys Tyr Asp Gly 40 Lys Ala Thr 4S His Gly Pro Ser Vai Lys 50 Asn Ala Vai Tyr 55 Ala His Gin Ile Glu 60 Thr Gly Leu Tyr Asp Gly Cys 65 Tyr lie Ser 70 Thr Thr Thr Asp Lys 75 Glu Ile Ala Lys Lys 80- Phe Ala Thr Ser Ser Gly 85 Ile Glu Asn Gly 90 Tyr Ile Tyr Vai Leu 95 Asn Arg Asp Leu Phe 100 Gly-Gltl Tyr Ser Ile Phe 105 Glu Tyr Glu Vai 110 Glu HlS Pro Glu Asn 115 Pro Asn Glu Lys Glu 120 Vai Thr Ile Arg Ala 125 Glu Asp Cys Gly Cys Ile 130 Pro Glu Glu Vai 135 Ile Ile Ala Lys Glu 140 Leu Ile Glu He

Asn 145

<210> 11 <211>435 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis 60 120 180 <400> 11 atgggaaatt tcttatataa ttaaaaccta aaggtaatáa gatggtaaag ctacacatgg aggcattagt tgccaacaag agctgaagtt gcaattcgtt tccaagtgCg aagaatgcag atgagcaaaa taatggacag atgatggtaa gtttáaatat tttacgccca tcaaattgaa 240 300 360 420 435 acaggtctat atgacggatg tttgcaacaa gttccggcat ggtcaatatt ctatttttga gtaacaatca gagctgaaga ttgatagaaa ttaac ttatatatct acgacaacag cgaaaatggc tatatatatg atatgaggtt gaacatccag ttgtggctgt attcctgaag acaaggaaat tgccaagaaa ttttaaatag ggatttgttt aaaacccaaa tgagaaggaa aagtgattat tgctaaagag

<210> 12 <211>145 <212> PRT 98 <213> Neisseria meningitidis <400> 12

Met 1 Gly Asn Phe Leu Tyr Arg 5 Gly Ile Ser 10 Cys Gin Gin Asp Glu 15 Gin Asn Asn Gly Gin 20 Leu Lys Pro Lys Gly Asn 25 Lys Ala Glu Val 30 Ala Ile Arg Tyr Asp 35 Gly Lys Phe Lys Tyr Asp Gly 40 Lys Ala Thr His 45 Gly Pro Ser Val 50 Lys Asn Ala Val Tyr 55 Ala His Gin Ile Glu 60 Thr Gly Leu Tyr Asp 65 Gly Cys Tyr Ile Ser Thr 70 Thr Thr Asp Lys 75 Glu Ile Ala Lys Lys 80 Phe Ala Thr Ser Ser Gly Ile 85 Glu Asn Gly 90 Tyr Ile Tyr Val Leu 95 Asn Arg Asp Leu Phe 100 Gly Gin Tyr Ser Ile Phe 105 Glu Tyr Gly val 110 Glu His Pro Glu Asn 115 Pro Asn Glu Lys Glu 120 Val Thr Ile Arg Ala Glu 125 Asp Cys Gly Cys 130 Ile Pro Glu Glu Val 135 Ile Ile Ala Lys Glu 140 Leu Ile Glu Ile

Asn 145

<210> 13 <211>435 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis <400> 13 atgggaaatt tcttatatag aggcattagt tgccaacaag atgagcaaaa taatggacag 60 ttaaaaccta aaggtaataa agctgaagtt gcaattcgtt atgatggtaa gtttaaatat 120 gatggtaaag ctacacatgg tccaagtgtg aagaatgcag tttacgccca tcaaattgaa 180 acaggtctat atgacggatg ttatatatct acgacaacag acaaggaaat tgccaagaaa 240 tttgcaacaa gttccggcat cgaaaatggc tatatatatg ttttaaatag ggatttgttt 300 ggtcaatatt ctatttttga atatggggtt gaacatccag aaaacccaaa tgagaaggaa 360 gtaacaatca gagctgaaga ttgtggctgt attcctgaag aagtgattat tgctaaagag 420 ttgatagaaa ttaac 435 <210> 14 <211> 145 99

<212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 14

Mac Gly Asn Phe Leu Tyr Arg Gly Ile ser Cys Gin Gin Asp Glu Gin 1 5. . 10 15 Asn Asn Gly Gin Leu Lys Pro Lys Gly Asn Lys Ala Glu Vai Ala Ile 20 25 30 Arg Tyr Asp Gly Lys Phe Lys Tyr Asp Gly Lys Ala Thr Kis Gly Pro 35 40 45 Ser Vai Lys Asn Ala vai Tyr Ala His Gin Ile Glu Thr Gly Leu Tyr 50 55 60 Asp Gly Cys Tyr Ue Ser Thr Thr Thr Asp Lys Glu Ile Ala Lys Lys 65 70 75 B0 Phe Ala Thr Ser Ser Gly lie Glu Asn Gly Tyr Ile Tyr Vai Leu Asn 65 90 95 Arg Asp Leu Phe Gly Gin Tyr Ser Ile Phe Glu Tyr Glu Vai Gly His 100 105 110 Pro Glu Asn Pro Asn Glu Lys Glu Vai Thr Ile Arg Ala Glu Asp Cys 115 120 125 Gly Cys Ile Pro Glu Glu Vai Ile Ile Ala Lys Glu Leu Ile Glu Ile 130 135 140

Asn

14S

<210> 15 <211>435 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis <400> 15 60 120 160 240 300 360 420 435 atgggaaatt tcttatatag aggcattagt tgccaacaag atgagcaaaa taatggacag ttaaaaccta aaggtaataa agctgaagtt gcaattcgtt atgatggtaa gtttaaatat gatggtaaag ctacacatgg tccaagtgtg aagaatgcag tttacgccca tcaaattgaa acaggtctat atgacggatg ttatatatct acgacaacag acaaggaaat tgccaagaaa tttgcaacaa gttccggcat cgaaaatggc tatatatatg ctttaaatag ggatttgttt ggtcaatatt ctatttttga atatgaggtt ggacatccag aaaacccaaa tgagaaggaa gtaacaatca gagctgaaga ttgtggctgt attcctgaag aagtgattac tgctaaagag ttgatagaaa ttaac 100

<210> 16 <211>145 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <4 0 0> 16 Met Gly Asn Phe Leu Tyr Arg 1 5 Asn Asn Gly Gin Leu Lys Pro 20 Arg Tyr Asp Gly Lys Phe Lys 35

Gly Ile Ser Cys Gin Gin Asp Glu Gin 10 15

Lys Gly Asn Lys Ala Glu Vai Ala lie 25 30

Tyr Asp Gly Lys Ala Thr His Gly Pro 40 45

Ser Vai Lys Asn Ala Vai Tyr Ala His Gin lie Glu Thr Gly Leu Tyr 50 55 60

Asp Gly Cys Tyr Ile Ser Thr Thr 65 70 Phe Ala Thr Ser Ser Gly Ile Glu 65 Arg Asp Leu Phe Gly Gin Tyr Ser 100 Pro Glu Asn Pro Asn Glu Lys Gly 11S 120 Gly Cys Ile Pro Glu Glu Vai Ile 130 135

Thr Asp Lys Glu Ile Ala Lys Lys 75 80 Asn Gly Tyr Ile Tyr Vai Leu Asn 90 95 Ile Phe Glu Tyr Glu Vai Glu His 105 no Vai Thr lie Arg Ala Glu Asp cys 125 Ile Ala Lys Glu Leu Ile Glu Ile 140

Asn 145

<210> 17 <211>435 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis <400> 17 101 atgggaaatt tcctatatag aggcattagt ttaaaaccta aaggtaataa agctgaagtt gatggtaaag ctacacatgg tccaagtgtg acaggtctat atgacggatg ttatatatct tCtgcaacaa gttccggcat cgaaaatggc ggtcaatatt ctatttttga atatgaggtt gtaacaatca gagctgaaga ttgtggctgt CCgatagaaa ttaac tgccaacaag atgagcaaaa Caatggacag gcaattcgtt atgatggtaa gtttaaatat aagaatgcag tttacgccea ccaaattgaa acgacaacag acaaggaaat tgccaagaaa tatatatatg ttttaaatag ggatttgttt gaacatccag aaaacccaaa tgagaaggga attcctgaag aagtgattat tgctaaagag 60 120 180 240 300 360 420 435 <210> 18 <211> 45 <212> ADN <213> iniciador de PCR <220> 37 <223> iniciador de PCR <400> 18 cgcggatccc atatgggaaa tttcttatat aaaggcatta gttgc 45

<210> 19 <211> 37 <212> ADN <213> iniciador de PCR <400> 19 cccgctcgag gttaatttct atcaactctt tagcaat 37

<210> 20 <211> 45 <212> ADN <213> iniciador de PCR <400> 20 cgcggatccc atatgggaaa tttcttatat aaaggcatta gttgc 45 <210> 21 <211> 33 102

<212> ADN <213> iniciador de PCR <400> 21 atttttgaat atggggttga acatccagaa aac 33

<210> 22 <211> 33 <212> ADN <213> iniciador de PCR <400> 22 ttctggatgt tcaaccccat attcaaaaat aga 33

<210> 23 <211> 27 <212> ADN <213> iniciador de PCR <400> 23 tatgaggttg gacatcoaga aaaccca 27

<210> 24 <211> 27 <212> ADN <213> iniciador de PCR <400> 24

gttttctgga tgtccaacct catattc 27 210> 25 <211> 28 <212> ADN

<213> iniciador de PCR 103 <400> 25 ccaaatgaga agggagtaac aatcagag 28

<210> 26 <211> 27 <212> ADN <213> iniciador de PCR <400> 26 gttttctgga tgtccaacct catattc 27 104

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente Europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente citados na descrição • US 5753235 A [0040] • EP 127839 A [0057] • EP 155476 A [0057] wo 89046699 A [0063] US 5693506 A [0067] US 5659122 A [0067] US 5608143 A [0067] US 4738921 A [0078] EP 0036776 A [0078] [0089] EP 0121775 A [0078] US 4689406 A [0078] US 4551433 A [0079] EP 0267851 A [0079] EP 0219237 A [0081] EP 0324647 A, Chey [0082] US 4336336 A [0082] EP 0244042 A [0083] EP 0127328 A [0086] EP 0036259 A [0089] [0090] EP 0063953 A [0089] [0090] WO 8404541 A [0089] [0090] EP 0136829 A [0089] EP 0136907 A [0089] US 4745056 A [0089] EP 0284044 A [0092] 105 EP 0329203 A [0092] US 4876197 A [0093] US 4880734 A [0093] EP 0164556 A [0093] EP 0196056 A [0095] WO 88024066 A [0095] EP 0012873 A [0096] JP 062096086 B [0096] US 4588684 A [0096] EP 0060057 A [0096] US 4546083 A [0097] US 4870008 A [0097] EP 0324274 A [0097] WO 8902463 A [0097] US 4837148 A [0103] [0104] US 4929555 A [0103] [0104] WO 9820734 A [0117] [0125] WO 9014837 A [0120] US 5591624 A [0130] [0133] WO 9637626 A [0130] WO 9530763 A [0131] WO 9205266 A [0131] GB 2200651 A [0133] EP 0415131 A [0133] EP 0345242 A [0133] EP 0334301 A [0133] WO 8902468 A [0133] WO 8905349 A [0133] WO 8909271 A [0133] WO 9002806 A [0133] WO 9007936 A [0133] WO 9403622 A [0133] WO 9325698 A [0133] WO 9325234 A [0133] [0145] • WO 930230 A [0133] [0137] 106

wo 9310218 A wo 9102805 A wo 9102825 A wo 9507994 A us 5219740 A us 4405712 A us 4861719 A us 4980289 A us 4717127 A wo 9307283 A wo 9306223 A wo 9307282 A wo 9412649 A wo 9303769 A wo 9319191 A wo 9428938 A wo 9511984 A wo 9500655 A wo 9527071 A wo 9529993 A wo 953467 A wo 9605320 A wo 9408026 A wo 9411506 A wo 9424299 A wo 9514102 A wo 9524297 A wo 9502697 A wo 9428152 A wo 9509241 A wo 9525807 A wo 9505835 A wo 9418922 A wo 9509654 A wo 9309239 A

[0133] [0133] [0133] [0133] [0136] [0133] [0133] [0133] [0133] [0133] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] [0134] 107

107 US 5478745 US 479736 US 5139941 A, US 5474935 A, WO 94288157 A US 5354678 A US 5173414 A US 5252479 A US 5288641 A EP 0176170 A WO 9504139 A WO 9009441 A WO 9207945 A EP 0453242 A US 5091309 A US 5217879 A WO 9210578 A US 08405627 B WO 9421792 A WO 9210518 A US SN0 86 7 9 6 4 0 US 4603112 A US 4769330 A WO 8901973 A US 5166057 A EP 0386882 A EP 0440219 A US SN08366787 US SN08240030 US SN08404796 US 5149655 A US 5206152 A WO 9211033 A US 60023867 B WO 9011092 A

A [0134] 8 A Cárter [0134] Muzyczka [0134] Chartejee [0134] , Kotin [0134] [0134] [0134] [0134] [0135] [0135] [0135] [0135] [0135] [0135] [0136] [0136] [0136] [0136] [0136] [0136] A [0136] [0138] [0138] [0138] [0138] [0138] [0138] A [0139] A [0139] A [0139] [0139] [0141] [0139] [0141] [0139] [0141] [0140] [0140] [0154] 108 us 5580859 A [0140] us 5422120 A [0141] [0142] wo 9513796 A [0141] [0142] wo 9423697 A [0141] [0142] wo 9114445 A [0141] [0142] EP 524968 A [0141] us SN6 0 0 2386' 7 P [0141] us 4762915 A [0142] EP 0524968 A [0142] WO 9314778 A [0145] WO 9806437 A [0162] us 4683195 A [0182] us 4683202 A [0182] wo 9313202 A [0222] EP 0306618 A [0222] EP 0322533 A [0222] EP 0322115 A [0222] EP 0396964 A [0222] WO 9517211 A [0222] WO 9924578 A [0222] WO 9936544 A [0222] WO 9957280 A [0222] WO 0164920 A [0222] WO 0164922 A [0222] GB 0108024 A [0223] na 2001

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína que consiste numa sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, excepto que a sequência de aminoácidos contém entre uma e vinte mutação(ões), em que cada mutação envolve um único aminoácido e em que a(s) mutação(ões) reduzem ou eliminam actividade ribosilante do ADP da proteína.

2. A proteína de acordo com a reivindicação 1, em que cada mutação é independentemente uma substituição, uma inserção ou uma deleção.

3. A proteina de acordo com a reivindicação 2, em que cada mutação é uma substituição ou uma deleção.

4. A proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a proteína compreende uma ou mais das mutações listadas no Quadro 1.

5. A proteína de acordo com a reivindicação 4, que consiste na SEQ ID NO: 10, 12, 14 ou 16.

6. Uma proteina que compreende a sequência de aminoácidos de uma proteina de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.

7. A proteína de qualquer uma das reivindicações anteriores, para uso como um adjuvante.

8. A proteína de acordo com a reivindicação 7, para uso como um adjuvante na mucosa.

9. Uma composição imunogénica que compreende a proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em 2 mistura com um antigénio.

10. Anticorpo que liga à proteína de acordo com a reivindicação 3.

11. Ácido nucleico que codifica a proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

12. Um vector que compreende uma sequência de ácido nucleico do ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11 .

13. Uma célula hospedeira transformada com o vector de acordo com a reivindicação 12.

14. Uma composição que compreende a proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o anticorpo de acordo com a reivindicação 10, e/ou o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11.

15. Uma composição que compreende a proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e/ou o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11, para uso como um adjuvante.

16. Utilização da composição de acordo com a reivindicação 15, no fabrico de um medicamento para tratar ou prevenir infecção bacteriana.

17. A utilização de acordo com a reivindicação 16, em que a infecção bacteriana é causada por Neisseria meningitidis.

18. Uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, para uso como um adjuvante. 3

19. Um anticorpo que liga à proteína da SEQ ID NO: 1, para uso como um medicamento.

20. Uma composição que compreende a proteína de acordo com a reivindicação 18, e/ou o anticorpo de acordo com a reivindicação 19, para uso como um adjuvante.

21. Uma composição imunogénica que compreende uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 em mistura com um antigénio.

22. Ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleótido seleccionada a partir da SEQ IDs 11, 13, 15, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26.