PT1372700E - Soluções aquosas estáveis do factor de estimulação de colónias de macrofagos granulócitos. - Google Patents

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Descrição EPÍGRAFE: "SOLUÇÕES AQUOSAS ESTÁVEIS DO FACTOR DE ESTIMULAÇÃO DE COLÓNIAS DE MACRÓFAGOS GRANULÓCITOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção fornece formulações estabilizadas de GM-CSF.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 factor de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos (GM-CSF) é um factor de crescimento hematopoiético (citoquina) que estimula a proliferação e a diferenciação de várias células progenitoras hematopoiéticas na linhagem mielóide e também activa ou potência muitas actividades funcionais de macrófagos e células de neutrófilos, monócitos, dendriticas maduras. 0 GM-CSF é uma glicoproteina que ocorre naturalmente produzida, por exemplo, pelas células T, macrófagos, fibroblastos e células endoteliais.

Esta citoquina tem um papel vital na capacidade do corpo para desencadear uma resposta imune, por isso, afecta tanto o fornecimento e a função dos neutrófilos, monócitos e células dendriticas. 0 GM-CSF também actua com outras citoquinas para promover a proliferação e diferenciação de progenitores megacariociticos e eritróides. 0 GM-CSF activa ou potência muitas actividades funcionais incluindo quimiotaxia, fagocitose e citotoxicidade dependente de anticorpos de 1 macrófagos e células dendríticas, neutrófilos, monócitos maduras. 0 cDNA que codifica o GM-CSF humano tem sido clonado e a proteína recombinante tem sido produzida em vários sistemas de expressão incluindo células de leveduras, bactérias (molgramostim) e ovário de hamster Chinês (regramostim). A LEUKINE® (Immunex Corporation, Seattle, Washington, U.S.A.) é uma forma variante de GM-CSF produzida em Saccharomyces cerevisiae. Esta forma variante de GM-CSF é denominada genericamente por "sargramostim." A LEUKINE® tem mostrado apresentar os mesmos efeitos hematopoiéticos daqueles induzidos pelo GMCSF endógeno, nomeadamente, a estimulação das células progenitoras aplicadas ao longo da via granulócito-macrófago para formar neutrófilos, monócitos, macrófagos e eosinófilos (Relatório Técnico do Produto: LEUKINE® Líquida, Immunex Corp., Seattle, WA, 1997, que é aqui incorporada por referência). A LEUKINE®, tal como o GM-CSF endógeno, também promove a diferenciação das células progenitoras promovendo a subida dos eritrócitos e megacariócitos (Ibid.) Adicionalmente à estimulação da hematopoiese, a LEUKINE® potência muitas das actividades funcionais dos neutrófilos, monócitos e macrófagos maduros, tais como quimiotaxia, secreção do factor de crescimento, actividade antitumoral, actividades antibacterianas e antifúngicas, entre outras (Ibid.).

As utilizações comuns de LEUKINE® incluem o tratamento de recipientes de transplantes de medula óssea autólogos (linfoma não hodgkiniano; tratamento da leucemia linfoblástica aguda; doença de Hodgkin); uso em pacientes com atraso de enxerto ou falha do enxerto após o transplante da medula óssea alogeneico ou autólogo; tratamento de recipientes de transplante alogeneico da medula óssea a 2 partir de um dador HLA compatível; e mobilização das células progenitoras sanguíneas periféricas em pacientes com linfoma não hodgkiniano, doença de Hodgkin e cancro da mama. 0 GM-CSF tem sido proposto como um tratamento eficaz para as doenças inflamatórias intestinais, incluindo a doença de Crohn (WO 00/47195).

As soluções estáveis de LEUKINE® ou outras formas biologicamente activas de GM-CSF são altamente desejáveis para uma variedade de utilizações.

RESUMO DA INVENÇÃO São aqui fornecidos métodos para a estabilização a longo prazo de GM-CSF armazenado em solução aquosa. A estabilização é realizada pela adição dum agente de quelação que é capaz de formar complexos com catiões bivalentes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Quando os estudos de estabilidade de longo termo foram realizados no GM-CSF que estava armazenado em seringas prontas a injectar, surpreendentemente, foi observado que após longos períodos de tempo a proteína ficava parcialmente degradada na sua extremidade amino (consultar o Exemplo 1) . Os testes in vitro usando uma linha celular sensível a GM-CSF indicaram que as preparações parcialmente degradadas mantinham um elevado nível de bioactividade (consultar o Exemplo 1) . Mesmo assim, as formas de GM-CSF com a extremidade N degradada podem ter alterações indesejáveis nas suas propriedades farmacológicas in vivo. Por exemplo, é possível que cada produto da degradação possa ser metabolizado de forma diferente no corpo do paciente. Por exemplo, o tempo de meia-vida in vivo das formas das extremidades N degradadas podem diferir do da proteína de 3 comprimento total. Num regime terapêutico, a dose e frequência de administração são geralmente ajustadas para garantir que se mantém um nível terapeuticamente eficaz do fármaco no corpo do paciente ao longo do curso do tratamento. No entanto, se as formas degradadas estão presentes, é possível que o nível necessário de fármaco não seja alcançado e a eficácia da terapia pode por isso ser reduzida. Além disso, é possível, teoricamente, que as formas degradadas da proteína possam induzir anticorpos contra GM-CSF. Assim, é vantajoso ter formulações de GM-CSF nas quais a degradação da extremidade N não ocorre. Para resolver este objectivo, foram realizados estudos para idealizar um dispositivo para a estabilização de preparações farmacêuticas de GM-CSF.

Esta invenção fornece formulações estáveis de GM-CSF que são altamente resistentes à degradação N-terminal no armazenamento a 2-8°C. É aqui demonstrado que a adição dum agente quelante a uma solução de GM-CSF previne a degradação N-terminal do GM-CSF durante períodos até 2 anos. As formulações da presente invenção são úteis para todos os propósitos de pesquisa ou médicos que envolvem o GM-CSF.

Se as formulações estabilizadas são para administração terapêutica a seres humanos ou outros mamíferos, o agente quelante usado para estabilizar o GM-CSF deve ser fisiologicamente aceitável, ou seja, deve ser seguro para ser usado em seres humanos nas concentrações requeridas para conseguir a estabilização. 0 agente quelante deve ser capaz de formar complexos com catiões bivalentes ou trivalentes, incluindo formas iónicas de cálcio, manganês, magnésio, ferro, zinco, chumbo, mercúrio, alumínio, cádmio, cobre e similares. Os agentes quelantes que são capazes de formar quelatos com catiões bivalentes são empregues num dos aspectos da invenção. Um agente adequado que forma quelatos 4 com catiões bivalentes é o ácido etilenodiaminotetraacético, também chamado "EDTA" ou "edetato." 0 EDTA é usado medicinalmente, por exemplo, como um agente terapêutico para tratar pacientes com intoxicação por chumbo. Outro agente quelante adequado é o dexrazoxano, que é um derivado do EDTA que penetra rapidamente nas membranas das células e é usado com um agente cardioprotector contra os efeitos colaterais da cardiomiopatia induzidos pela antraciclina. Os agentes quelantes adequados adicionais para uso nas formulações subordinadas incluem derivados de BAL-glicósido ou dimercaprol (BAL), mesilato de deferoxamina, deferiprona e penicilamina (dimetilcisteina). Alternativamente, podem ser usados EGTA ou citrato como quelantes para catiões bivalentes de acordo com a invenção.

As concentrações adequadas do agente quelante para as presentes formulações variam desde 0,05 a 50 mM. Intervalos adequados incluem 0,5 a 10 mM, 0,05 a 1 mM e 0,1 a 5 mM. Numa modalidade da invenção, o agente quelante é EDTA adicionado numa concentração de 5 mM. Alternativamente, uma concentração de 0,1 mM de EDTA pode ser usada. Qualquer forma de EDTA pode ser usada, por exemplo, a forma di-hidratada do sal dissódico de EDTA. Pode ser usado CaNa2EDTA.

As formulações aquosas da invenção podem ser armazenadas em frascos ou em seringas prontas para injectar. Numa modalidade, o GM-CSF em solução aquosa está contido num frasco padrão para injecção. Numa formulação adequada, os frascos contém 1 ml de liquido que compreende 500 μρ/πιΐ de GM-CSF (tal como LEUKINE Liquid®, Immunex Corporation), 1,2 mg/ml de TRIS-HCL (também chamado "trometamina"), 40 mg/ml de manitol e 10 mg/ml de sacarose a pH 7.4. A formulação pode também incluir álcool benzilico a 1,1% como conservante, se bem que este pode ser substituído por outro conservante 5 fisiologicamente aceitável se desejado. Noutra modalidade da invenção, o GM-CSF é empacotado para armazenamento numa seringa pronta a injectar, que contém uma formulação com GM-CSF (tal como LEUKINE®) a 500 μρ/πιΐ, TRIS-HCL 10 mM, 40 mg/ml de manitol e 10 mg/ml de sacarose a pH 7,4. O GM-CSF empacotado nas seringas também pode incluir álcool benzilico a 1,1% ou outro conservante farmacologicamente aceitável. Se desejado, a concentração de GM-CSF nestas formulações pode ser aumentada para uma concentração entre 500 e 1000 μρ/πιΐ ou superior. O agente quelante é adicionado às soluções de GM-CSF em qualquer estágio desejado da preparação das formulações. Por exemplo, uma solução concentrada de GM-CSF pode ser misturada para se conseguir a concentração final desejada através da adição de quantidades apropriadas de água, TRIS-HCL, manitol, sacarose e agente quelante mesmo antes do empacotamento em frascos individuais ou seringas, ou mesmo antes da liofilização. Podem ser usados métodos padrão de liofilização para este propósito. O GM-CSF usado na prática da invenção inclui qualquer GM-CSF humano farmaceuticamente seguro e eficaz, ou qualquer seu derivado com a actividade biológica do GM-CSF humano. A actividade biológica pode ser verificada, por exemplo, através do ensaio das células TF-1 descrito no Exemplo 1 ou outros bioensaios adequados conhecidos na arte. Preferivelmente, é usado o GM-CSF recombinante. Um GM-CSF adequado para uso nas formulações pretendidas é o GM-CSF humano cuja sequência de aminoácidos é fornecida na SEQ ID NO:l. Como aqui usado, o termo "GM-CSF recombinante" refere-se quer ao GM-CSF que é sintetizado numa célula na qual um ácido nucleico que codifica GM-CSF exógeno foi introduzido, 6 quer uma célula na qual o qene do GM-CSF endóqeno foi estimulado para a produção em excesso de GM-CSF através da introdução de elementos regulatórios que induzem uma taxa elevada de transcrição do gene do GM-CSF endógeno.

Numa modalidade da invenção, o GM-CSF usado nas formulações é GMCSF recombinante humano (GM-CSF rhu), tal como LEUKINE® (Immunex Corporation, Seattle, Washington). A LEUKINE® (genericamente denominado "sargramostim") é um GM-CSF recombinante humano, biossintético, derivado de levedura, que consiste numa glicoproteina única de 127 amino ácidos que difere do GM-CSF endógeno humano apresentado na SEQ ID N0:1 por ter uma leucina em vez de uma arginina na posição 23. A LEUKINE® é produzida na levedura Saccharomyces cerevisiae. Outros GM-CSF naturais e sintéticos e seus derivados, com a actividade biológica do GM-CSF natural humano, podem ser igualmente úteis na prática da invenção. A LEUKINE® Liquida é uma solução aquosa estéril injectável geralmente vendida em frascos de 1 ml que contêm 500 μg/ml (2,8 x 106 IU) de sargramostim; 40 mg/ml de manitol; 10 mg/ml de sacarose; 1,2 mg/ml de trometamina; água esterilizada; e álcool benzilico a 1,1 %. A LEUKINE® Liofilizada também é vendida (Immunex Corporation) e, tipicamente, é empacotada em frascos com um pó estéril liofilizado para reconstituição com 1 ml de água estéril. A LEUKINE® Liofilizada pode conter 250 μρ ou 500 μρ de sargramostim (1,4 ou 2,8 x 106 IU) ; 40 mg de manitol; 10 mg de sacarose; e 1,2 mg de trometamina. A LEUKINE® Liquida e as soluções reconstituídas de LEUKINE® Liofilizada são armazenadas refrigeradas a 2-8°C. Para estabilizar estas formulações, é adicionado um agente quelante como descrito acima. Por exemplo, o EDTA (ou outro agente quelante 7 adequado) é adicionado na concentração desejada à formulação liquida antes de ser empacotado nos frascos. 0 EDTA sólido ou outro agente quelante pode ser adicionado à formulação liofilizada em quantidades que fornecem a concentração final desejada quando o pó é hidratado para a injecção.

Num aspecto da invenção, é fornecida um processo para preparar uma solução aquosa estabilizada do factor de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos. Este processo envolve a mistura conjunta de EDTA na concentração de 0,1 a 50 mM, 500 μρ/ιηΐ de factor de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos, TRIS-HCL 10 mM, 40 mg/ml de manitol e 10 mg/ml de sacarose. Os vários ingredientes desta mistura podem ser adicionados simultaneamente ou sequencialmente na solução aquosa. A mistura pode incluir outros ingredientes fisiologicamente aceitáveis se for desejado. O GM-CSF, tal como LEUKINE® ou molgramostim, também pode ser formulado em hidrogéis para aplicação tópica, tais como os hidrogéis descritos na Patente U.S N°. 6,120, 807. Os polímeros usados para formular hidrogéis adequados incluem polissacáridos, ácidos poliacrílicos, polifosfazenos, copolímeros de polietilenoglicol-PLGA e outros polímeros sintéticos biodegradáveis. Para estabilizar o GM-CSF disperso dentro dum destes hidrogéis, é adicionado um agente quelante tal como EDTA numa concentração de 0,05 a 50 mM ou numa concentração de 0,1 a 5 mM. Em determinadas modalidades, é usada uma concentração de 0,1 ou 5 mM.

Numa modalidade do objectivo da invenção, o sargramostim é formulado como descrito acima para a LEUKINE® Líquida excepto que é adicionado EDTA numa concentração de 5 mM. Alternativamente, o sargramostim é formulado como descrito acima para a LEUKINE® Liofilizada, excepto que o EDTA 5 mM é 8 adicionado à solução antes da liofilização. Numa outra modalidade, o EDTA em pó seco em quantidades apropriadas pode ser misturado com a LEUKINE® liofilizada antes de ser empacotado.

As formulações estáveis de GM-CSF desta invenção incluem soluções aquosas que podem ser administradas através de qualquer meio desejado. Por exemplo, as formulações estabilizadas de GM-CAF são administradas por injecção. A injecção pode ser subcutânea, intramuscular ou por infusão intravenosa.

As formulações de GM-CSF que contêm EDTA também podem ser administradas por inalação dum spray aerossol. A formulação pode ser empacotada inicialmente dentro dum dispositivo de libertação de aerossol, ou pode ser transferida para dentro dum contentor compatível com esta forma de fornecimento. A libertação de aerossol pode ser usada para dispensar as formulações originalmente empacotadas numa forma líquida ou aquelas originalmente empacotadas como um pó liofilizado que requerem a reconstituição antes de ser administrado. A libertação por aerossol é especialmente eficaz para a distribuição de sargramostim para as passagens nasais ou pulmões, mas também pode ser usada para administração sistémica de GM-CSF estabilizado. Numa modalidade da invenção, o GM-CSF administrado por aerossol em spray é sargramostim.

Como o grau de glicosilação dos GM-CSF biossintéticos parece influenciar o tempo de meia-vida, distribuição e eliminação, a maior parte da dose efectiva de GM-CSF para os presentes métodos pode variar dependendo da fonte usada (Lieschke and Burgess, N. Engl. J. Med. 327:28-35, 1992; Dorr, R.T., Clin. Ther. 15:19-29, 1993; Horgaard et al., Eur. J. Hematol. 50:32-36, 1993). A maior parte da dose efectiva e 9 frequência de administração pode ser ajustada conforme necessário pelo médico do paciente de acordo com a prática médica e irá depender da idade do paciente, peso e da condição a ser tratada. As doses efectivas de GM-CSF podem variar desde cerca de 50 a 250 μρ por dose. Num aspecto da invenção, a dose é igual ou próxima de 100 μρ. Noutras modalidades, a dose usada está entre 100 e 125 μρ. Numa outra modalidade, é administrada uma dose fixa no intervalo de 125 a 250 μρ. As doses fixas adequadas incluem 100 μς, 150 \xq, 200 μρ e 250 μρ de GM-CSF. Se desejado, a dose pode ser calculada como uma função da área da superfície corporal, tal como, por exemplo, 125 a 250 μq/m2.

As formulações de GM-CSF melhoradas aqui descritas são úteis para o tratamento de qualquer condição médica para a qual a administração de GM-CSF é eficaz, causando uma melhoria visível em pelo menos um indicador que é normalmente usado para avaliar a gravidade dessa condição. Por exemplo, as formulações estabilizadas da invenção podem ser substituídas em qualquer regime terapêutico que utilize LEUKINE® (sargramostim), LEUCOMAX® (molgramostim), regramostim, GM-CSF peguilado ou qualquer formulação fisiologicamente aceitável de GM-CSF do tipo selvagem ou biologicamente activa. As doenças que podem ser tratadas com as formulações estabilizadas de GM-CSF aqui descritas incluem infecção por HIV ou outras infecções virais, infecções bacterianas, cancro, feridas ou úlceras de cicatrização lenta (tais como úlceras de decúbito ou úlceras diabéticas), doença inflamatória intestinal, incluindo doença de Crohn e proteinose alveolar. Os cancros também podem ser tratados com as referidas formulações, incluindo, mas não se limitando a, melanoma, cancro da mama, tumores cerebrais, leucemias, 10 linfornas, carcinoma e adenocarcinoma. Adicionalmente, as formulações da invenção podem ser usadas como um adjuvante de vacina que pode ser administrado, por exemplo, em conjugação com uma vacina contra uma doença infecciosa, ou em conjugação com uma vacina tumoral, incluindo vacinas de péptidos contra melanoma, cancro da mama, tumores cerebrais ou outros cancros.

Além disso, as referidas formulações estabilizadas de GM-CSF podem ser usadas para diminuir a incidência de infecção em pacientes com cancro que estejam a receber quimioterapia mielossupressora; para promover a recuperação das células mielóides em pacientes que têm recebido quimioterapia mieloablativa seguida por transplante de medula autóloga ou alogénica como tratamento para cancros tais como linfoma não hodgkiniano, leucemia linfoblástica aguda, doença de Hodgkin ou outros cancros; para promover a mobilização das células sanguíneas progenitoras periféricas para recolha por leucaferese antes do transplante; para reduzir a duração da neutropenia e sequelas clinicamente relacionadas com a neutropenia em pacientes com cancro que têm recebido transplante de medula autóloga ou alogénica; e para reduzir o tempo necessário para a recuperação de neutrófilos em pacientes com cancro, tais como pacientes com leucemia mielógena aguda, após quimioterapia. As formulações estabilizadas aqui descritas também podem ser usadas para estimulação da expansão extracorporal de cultura de células estaminais hematopoiéticas.

Os exemplos seguintes ilustram aspectos úteis da invenção. EXEMPLO 1

Degradação N-terminal de GM-CSF Armazenado 11

Reparou-se nas variações no perfil de HPLC de fase reversa de GM-CSF após cerca de seis meses de armazenamento de LEUKINE® em seringas prontas a injectar CARPUJECT® (AMTEST Laboratories, Redmond, WA) que estiveram carregadas com 1 ml de LEUKINE® Liquida. 0 HPLC de fase reversa para esta análise foi realizado usando uma coluna C18 Vydac Protein and Peptide (#218TP54), 5 μιη, 4,6 x 250 mm. O tampão A para a cromatografia de fase reversa foi água/TFA a 0,1%; o tampão B foi acetonitrilo/TFA a 0,1%; e o tampão C foi NaCl 1M/água/TFA a 0,1%. 0 gradiente usado no desenvolvimento da coluna foi: B a 1%/min para 25-65%, B com uma constante a 20% e C durante 40 minutos a 1 ml/min. O volume de injecção foi 50 μΐ. O perfil de eluição para a LEUKINE® armazenada apresentou um cotovelo descendente no pico principal deste perfil. A espectrometria de massa identificou este cotovelo como o GM-CSF que foi cortado em vários graus na extremidade N. A espectrometria de massa (Sciex API 350) foi realizada através do desenvolvimento de amostras em colunas C18 de fase reversa como descrito acima excepto que foi omitido o cloreto de sódio dos tampões. O eluato a partir da coluna C18 foi electro-pulverivado num espectrómetro de massa. Para a análise do espectro de massa, espectro de massa/carga (m/z) foram recolhidos o pico complete de GM-CSF e desenrolado em massas através da utilização do software BioMultiView. LEUKINE® na sua formulação não modificada é heterogénea na sua extremidade amino, que tipicamente compreende 65% do comprimento total da proteina e 35% duma forma ligeiramente menor em Ala3. Os resultados do espectro de massa para os produtos armazenados em seringa indicaram a presença de espécies Alai maduras bem como espécies adicionais cortadas 12 para Ala3, Arg4, Ser5, Ser7, Ser9 e ThrlO. Em produtos armazenados a 2-8°C, a proporção do comprimento complete da proteína (Alai) permanece inalterada, indicando que apenas as espécies susceptíveis à degradação induzida pelo armazenamento nesta temperatura é a espécie Ala3. No entanto, a 30°C, mesmo as espécies Alai degradam-se. Deve-se notar que estas análises de espectro de massa focaram-se apenas nas espécies não glicosiladas, contudo o trabalho posterior mostrou que as formas glicosiladas também estão cortadas. 0 limite da quantificação na determinação da percentagem das espécies com comprimento completo e cortadas por este método (LOQ) está estimado em cerca de 5%.

Outras caracterizações sugerem que este corte deve-se a um processo catalisado por um ião metálico. As seguintes observações suportam esta conclusão. Primeiro, a degradação foi isolada à extremidade N. Segundo, o cotovelo da fase reversa pode ser simulado pela adição de uma a-aminopeptidase exógena. Para esta simulação, foram adicionadas 5 unidades de α-aminopeptidase (Sigma A8299) a LEUKINE® Líquida e isto foi incubado durante 3 dias a 37°C. Descobriu-se que as formulações com α-aminopeptidase adicionada na espectrometria massa continham as seguintes extremidades N: Ser5, Glnll e pGlnll (o produto de ciclização estável de Glnll). Quando a incubação foi estendida ao longo de 7 dias, a degradação não prosseguiu para além do Glnll. A degradação adicional pode ter sido detida pela ciclização de Glnll. Terceiro, é possível deter a degradação N-terminal observada de GM-CSF através da adição de EDTA mM às formulações. 0 catião que catalisa esta degradação amino-terminal não foi definitivamente identificado. Num esforço para identificar este catião, foram exaustivamente extraídos iões 13 metálicos a partir rolhas de borracha tomadas a partir de seringas CARPUJECT® usando extracção soxhelet. 0 catião bivalente mais abundante que foi extraído foi o zinco, sugerindo assim que este pode ser o ião catalítico. As experiências foram conduzidas em que foi adicionado Zn2+ às formulações de LEUKINE® num esforço para acelerar a degradação N-terminal, mas o zinco adicionado não teve um efeito significativo quando comparado com uma amostra de controlo. No entanto, estas amostras foram armazenadas durante apenas um mês antes da análise, por isso os resultados não foram considerados conclusivos. De acordo com a informação fornecida pelo fabricante das seringas CARPUJECT®, muitos iões metálicos diferentes estão presentes em pequenas quantidades nas rolhas de borracha, incluindo cálcio, cobre, ferro, chumbo, crómio, magnésio, manganês, molibdénio e outros.

Os bioensaios foram realizados usando a linha celular TF-1, que é sensível ao GM-CSF humano e prolifera mais depressa quando esta citoquina é adicionada ao meio de cultura (consultar, por exemplo, Kitamura et al., J Cell Physiol 140:323-334 (1989)). A bioactividade é ensaiada pela adição de quantidades conhecidas de GM-CSF (1 ng/ml) às células na presença de H3-timidina. A proliferação celular como resposta ao GM-CSF é quantificada pela medição da quantidade de timidina tritiada incorporada dentro do DNA pelas células. Os resultados dos bioensaios nas formas cortadas de sargramostim indicaram que quando esta é cortada para as posições intermediárias (combinações de Arg4, Ser5, Ser7, Ser9 e ThrlO) bem como quando esta é completamente cortada para Glnll, não foi observada uma variação significativa na actividade biológica. 14 EXEMPLO 2

Teste de estabilidade de longa duração

Para testar os efeitos de longa duração de armazenagem na presença de EDTA, foram carregados um total de7 lotes de LEUKINE® em seringas CARPUJECT® com e sem a adição de EDTA 5 mM. As seringas foram armazenadas quer a 2-8°C (temperatura normal de armazenamento) quer a 30°C (para induzir a degradação acelerada). Cada seringa continha 1 ml de liquido com 500 μg de LEUKINE® e TRIS-HCL 10 mM (1,2 mg/ml), 40 mg/ml de manitol e 10 mg/ml de sacarose a pH 7,4. Após a incubação a vários tempos, as amostras armazenadas foram analisadas quanto à degradação no N-terminal.

Aos 6 meses, as amostras foram analisadas por SDS-PAGE, HPLC de fase reversa, bioensaios de TF-1, mapeamento do péptido triptico reduzido e não reduzido e espectrometria de massa (Sciex API 350) . Para o SDS-PAGE, os carregamentos de amostra foram de 1 μg/linha em 2X tampão de fosfato não redutor de amostra em géis Novex de TRIS-glicina a 16%. Os géis foram postos a correr a 30 mA em tampão de corrida TRISglicina SDS e corados usando o kit corante Novex silver Xpress. Para o HPLC de fase reversa, usou-se uma coluna C18 Vydac Protein and Peptide (#218TP54), 5 μιη, 4, 6 x 250 mm. O tampão A foi: Água/TFA a 0,1%, e o tampão B foi: acetonitrilo/TFA a 0,1%, o tampão C: NaCl ΙΜ/água/TFA a 0,1%. O gradiente foi: B a 1%/min para 25-65%, B numa constante de 20%, e C durante 40 minutos a 1 mL/min. O volume de injecção foi 50 μΐ. Os ensaios de TF-1 foram realizados como descrito para o Exemplo 1. Para a espectrometria de massa, as amostras foram desenvolvidas em colunas C18 de fase reversa desenvolvidas como acima mas sem cloreto de sódio, depois electro-pulverizado para dentro dum espectrómetro de 15 massa. Os espectros de massa resultantes foram usados para fornecer dados semi-quantitativos do grau de degradação N-terminal, contudo este método não foi validado. 0 limite da quantificação na determinação da percentagem das espécies com comprimento completo e cortadas por este método está estimado em cerca de 5%. 0 mapeamento do péptido tríptico reduzido identifica os péptidos C-terminal que estão ligados por dissulfureto. 0 mapeamento do péptido foi feito por análise de fase reversa com C18 de proteína tripsinizada.

Os resultados das análises dos 6 meses demonstraram uma clara degradação N-terminal quando a LEUKINE® foi armazenada em seringas quer a 2-8 °C quer a 30 °C durante 6 meses na ausência de EDTA. A extensão da degradação varia consideravelmente de lote para lote. Para amostras incubadas a 2-8 °C na presença quer de 0,1 quer EDTA 5 mM, degradação N-terminal foi eliminada. Para amostras incubadas a 30 °C na presença quer de 0,1 quer EDTA 5 mM, degradação N-terminal foi significativamente reduzida. Também se notou que para um único lote de LEUKINE®, as amostras incubadas a 30 °C na presença de altas concentrações de EDTA (5 mM) demonstraram uma perda de massa inexplicável de aproximadamente 17 Da, mas não ocorreu em qualquer dos 6 outros lotes que foram testados.

Aos 12 meses, as amostras a partir de 7 lotes armazenados com ou sem EDTA a 2-8°C ou com ou sem EDTA 5 mM a 30°C foram analisadas. Esta sequência de amostras também incluiu um lote que foi formulado com EDTA 0,1 mM. Estas amostras foram analisadas por SDS-PAGE (géis Novex a 4-20% que usam tampão de amostra não redutor e corridos a 34 mA), HPLC fase reversa com corrida para as amostras com 6 meses, bioensaio TF-1 (ver abaixo) e espectrometria de massa. Os resultados indicaram que quando comparado com os resultados 16 dos 6 meses, a degradação N-terminal continuou nas duas temperaturas nas amostras armazenadas durante 12 meses sem EDTA. As formulações com EDTA numa das duas concentração (0,1 ou 5 mM) ficaram protegidas da degradação quando armazenadas a 2-8°C. A degradação N-terminal ocorreu nas amostras com 12 meses armazenadas a 30°C com ou sem EDTA adicionado.

Um dos lotes de teste foi analisado aos 1, 3, 6 e 12 meses. Neste lote particular, as amostras armazenadas a 2-8°C sem EDTA apresentaram um percurso de degradação dependente do tempo e a espécie Ala3 foi desapareceu completamente em 12 meses. Num dos 7 lotes testados, não foi observada a perda da espécie Ala3 na ausência de EDTA, embora a razão para tal seja desconhecida. Resumidamente, 6 dos 7 lotes testados exibiram degradação N-terminal quando armazenados em seringas a 2-8°C na ausência de EDTA.

Para o ponto dos 24 meses, foram analisados 4 lotes armazenados com ou sem EDTA a 2-8°C e 4 lotes armazenados com EDTA a 30°C. Estas amostras foram analisadas por SDS-PAGE, RP-HPLC, SEC, bioensaio de TF-1 e espectrometria de massa como descrito acima no Exemplo 1 ou para as amostras com 6 meses. Para as amostras armazenadas durante 24 meses a 2-8°C, foi observada a degradação N-terminal completa da espécie Ala3 na ausência de EDTA. As amostras armazenadas a 2-8°C na presença de EDTA 5 mM não apresentaram esta degradação. A degradação da espécie de comprimento total (Alai) foi observada quando as amostras foram armazenadas a 30 °C com EDTA. Conclui-se que as formulações de LEUKINE® com EDTA 5 mM podem permanecer estáveis durante 2 anos quando armazenadas a 2-8 °C. 17 EXEMPLO 3

Efeito da concentração de EDTA na estabilização de GM-

CSF A Leukine foi armazenada a 2-8°C ou 30°C durante 14 meses em seringas CARPUJECT® com EDTA 0, 0,1, 1,5, 5, 10, ou 50 mM.

Após 6 semanas, algumas das amostras foram analisadas por SDS-PAGE não reduzido, HPLC de fase reversa, espectrometria de massa e mapeamento de péptido reduzido e não reduzido como descrito nos exemplos prévios. Após 14 meses, as amostras restantes foram analisadas por SDS-PAGE, cromatografia de exclusão molecular (SEC) em colunas Biosil da BIORAD®, HPLC de fase reversa usando uma coluna Cl8 Vydac Protein and Peptide, bioensaio de TF-1 e espectrometria de massa com descrito acima, excepto gue para a cromatografia de exclusão molecular (SEC), de cada amostra foram injectados 20 μΐ para dentro duma coluna Biosil 125 da Biorad e eluidos isocraticamente usando fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 6,8 a 1 ml/min como a fase móvel. As análises dos 14 meses incluíram as amostras armazenadas a 2-8°C com e sem EDTA e armazenadas a 30°C sem EDTA.

Os resultados confirmaram que o EDTA actua para preservar LEUKINE® contra o corte N-terminal em amostras armazenadas a 2-8°C durante 14 meses. Neste ponto de tempo, as amostras armazenadas a 30°C com EDTA 10 mM já não estavam disponíveis para análise, mas todas as outras amostras foram analisadas por todos os métodos descritos acima excepto para a análise de mapeamento de péptido. As amostras armazenadas a 30°C apresentaram uma diminuição na proporção da espécie de comprimento completo (Alai) comparada com as amostras armazenadas a 2-8°C e a degradação N-terminal foi pior na amostra armazenada sem EDTA a 30°C. As amostras armazenadas a 18 30°C também apresentaram uma extensa oxidação, evidenciada por uma grande porção de material nas primeiras eluições verificado por HPLC de fase reversa. Para as amostras armazenadas a 2-8°C, concentrações de EDTA tão baixas como 0,1 mM foram eficazes na inibição da degradação N-terminal de GM-CSF. A Tabela 1 abaixo apresenta estimativas baseadas na espectrometria de massa após 14 meses de armazenamento. Os números na Tabela 1 indicam a percentagem da proteína total analisada que foi representada por cada uma das espécies listadas na tabela. Sem EDTA, 24% do GM-CSF armazenado a 2-8°C foi encurtado para Arg4 ou Ser5. Em todas as amostras armazenadas com EDTA a 2-8°C, independentemente da concentração de EDTA, não foram observadas espécies menores do que Arg4 e apenas 5% ou menos da Leukine terminou em Arg4. As amostras armazenadas na presença de EDTA a 2-8°C consistiam em 57-71% do comprimento total (Alai) de GM-CSF. Uma vez que o EDTA 0,1 mM foi tão protector como as concentrações mais elevadas testadas, é possível que as concentrações de EDTA inferiores a 0,1 mM também possam ser eficazes na prevenção da degradação N-terminal.

Em todas as amostras armazenadas a 30°C houve uma grande quantidade de corte N-terminal quer o EDTA esteja ou não presente (consultar a Tabela 1) . Por exemplo, na amostra armazenada sem EDTA a 30°C, 61% da proteína foi cortada para Arg4 ou mais. Foram encontradas espécies cortadas para Trpl3. Pelo contrário, as amostras armazenadas nesta temperatura com EDTA apresentaram apenas 20-30% de espécies cortadas para Arg4 ou para trás, sem cortes para trás de ThrlO. A degradação incluiu uma redução substancial no comprimento total da espécie (Alai), com apenas 28-39% do comprimento total das espécies que resta após 14 meses a 30°C. 19

As amostras foram analisadas nos dados do bioensaio de TF-1 para avaliar a bioactividade comparada com uma amostra de referência de GM-CSF. As amostras armazenadas sem EDTA a 30°C apresentaram uma actividade anormalmente elevada. Os resultados indicaram que pode ter havido um ligeiro decréscimo na bioactividade nas amostras armazenadas a 30°C na presença de EDTA, mas em qualquer caso não houve uma tendência clara que mostre que a bioactividade aumentada neste grupo de amostras com o aumento de quantidades de EDTA. Todas as amostras armazenadas a 2-8°C com ou sem EDTA mostraram bioactividade comparável com a amostra de referência de LEUKINE®.

Os estudos acima confirmaram que o EDTA em concentrações no intervalo de 0,1 a 50 mM actua para proteger o GM-CSF contra o corte N-terminal em amostras armazenadas a 2-8°C durante pelo menos 14 meses. As amostras armazenadas a 30°C apresentaram uma diminuição na proporção das espécies de comprimento total (Alai) comparada com as amostras armazenadas a 2-8°C, e a degradação N-terminal foi mais extrema na amostra armazenada sem EDTA a 30°C. As amostras armazenadas a 30°C também apresentaram extensa oxidação, como evidenciado por uma grande porção de nos primeiros materiais de eluição vistos no HPLC de reversa fase.

Tabela 1. Análises de Espectrometria de Massa de LEUKINE® armazenada durante 14 meses a 2-8°C ou 30°C EDTA EDTA EDTA EDTA EDTA EDTA 0 mM 0,1 mM 1,5 mM 5 mM 10 mM 50 mM 2-8°C % AI 57 65 63 71 62 62 % A3 19 35 32 29 34 33 20 % R4 15 0 5 0 4 5 % S5 9 0 0 0 0 0 % S7 0 0 0 0 0 0 % S9 0 0 0 0 0 0 % TIO 0 0 0 0 0 0 % P12 0 0 0 0 0 0 EDTA EDTA EDTA EDTA EDTA EDTA 0 mM 0,1 mM 1,5 mM 5 mM 10 mM 50 mM 30°C % AI 28 35 39 32 - 34 % A3 11 43 39 43 - 35 % R4 13 9 0 0 - 0 % S5 11 7 6 8 - 11 % S 7 13 6 6 6 - 10 % S9 8 0 6 6 - 9 % TIO 8 0 4 5 - 0 % P12 4 0 0 0 0 0 % W13 4 0 0 0 - 0 - : sem amostra

Embora modalidades exemplificativas da invenção tenham sido ilustradas e descritas acima, será entendido que várias variações podem ser feitas dentro da invenção sem o afastamento do espírito e âmbito da invenção.

LISTAGEM DA SEQUÊNCIA <110> IMMUNEX CORPORATION PETTIT, Dean, K. JOCHHEIM, Claudia, M. 21

< 12Ο> AQUOSAS SOLUÇÕES ESTÁVEIS DO FACTOR DE ESTIMULAÇÃO DE MACRÓFAGOS GRANULÓCITOS <130> 3253-WO <140> --para ser atribuído— <141> 2002-03-04 <150> 09/800,016 <151> 2001-03-05 <16 0> 1

<170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 22

Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro 1 5 ser Thr Gin· Pro Trp Glu His Vai 10 15

Asn Ala Ile Gin Glu Ala Arg Arg 20

Leu Léu Ásn Leu Ser Arg Asp Thr 25 · 30

Ala Ala Glu Met As» Glu Thr Vai 35 40

Glu Vai Ile Ser Glu Met Phe Asp 45

Leu Gin Glu Pro Thr Cys Leu Gin 50 5 5

Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gin 50

Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys 65 70

Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 75 80

Ala Ser His Tyr Lys Gin His Cys 85

Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 90 95

Ala Thr Gin lie Ile Thr Phe Glu 100 ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp 105 110

Phe Leu Leu Vai Ile Pro Phe Asp 115 120

Cys Trp Glu Pro Vai Gin Glu 125

Lisboa, 14 de Agosto de 2007 23

Claims (14)

1. Uma solução aquosa fisiologicamente aceitável que compreende o factor recombinante de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos e com EDTA desde 0,1 mM a 50 mM.

2. A solução aquosa da reivindicação N°.l, caracterizada por a concentração de EDTA ser de 0,1 a 5 mM.

3. A solução aquosa da reivindicação N°.l, caracterizada por o factor recombinante de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos ser sargramostim.

4. A solução aquosa de qualquer uma das reivindicações N°.l a N°.3, caracterizadas por a concentração de EDTA ser 5 mM e ainda caracterizada por a solução ter um pH de 7,4 e compreende TRIS-HCL 10 mM, 40 mg/ml de manitol e 10 mg/ml de sacarose.

5. A solução aquosa de qualquer uma das reivindicações N°.l a N°.3, caracterizadas por que compreende GM-CSF a 500 μρ/ηιΐ, TRIS-HCL 10 mM, 40 mg/ml de manitol, 10 mg/ml de sacarose a pH 7,4 e álcool benzilico a 1,1%.

6. Um processo para a preparação duma solução aquosa estabilizada, fisiologicamente aceitável, do factor de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos, que compreende a mistura de EDTA para uma concentração de 0,1 a 50 mM com uma solução aquosa que compreende 500 μρ/ιηΐ de factor de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos, TRIS-HCL 10 mM, 40 mg/ml de manitol e 10 mg/ml de sacarose.

7. Um processo para a preparação duma formulação liofilizada do factor recombinante de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos, que compreende: 1 a) preparar a solução aquosa de qualquer uma das reivindicações 1 a 5; e b) liofilizar a solução aquosa.

8. Um processo para preparar uma formulação liofilizada do GM-CSF recombinante, que compreende: a) liofilizar uma solução aquosa de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, mas sem EDTA; e b) adicionar uma quantidade apropriada de EDTA para formar uma formulação liofilizada que quando hidratada, produz a solução aquosa de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

9. 0 processo de qualquer uma das reivindicações N°.6 a N°.8, caracterizado por o factor recombinante de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos ser sargramostim.

10. A solução aquosa de qualquer uma das reivindicações N°.l a N°.5, para ser usada em terapia.

11. Uso da solução aquosa de qualquer uma das reivindicações N°.l a N°.5 na preparação dum medicamento para tratar a doença inflamatória intestinal.

12. Uso da reivindicação N°.ll caracterizado por a doença inflamatória intestinal ser a doença de Crohn.

13. Uso da solução aquosa de qualquer uma das reivindicações N°.l a N°.5 na preparação dum medicamento para tratar úlceras.

14. Uma formulação liofilizada do factor recombinante de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos que pode ser obtido de acordo com o processo da reivindicação N°.7 ou da reivindicação N°.8. Lisboa, 14 de Agosto de 2007 2