PL98234B1 - Preparat antygenowy do przeprowadzania proby aglutynacyjnej na kile i inne choroby kretkowe - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest preparat antyge¬ nowy do przeprowadzania próby aglutynacyjnej na kife i inne choroby kretkowe.Wykorzystanie prób serologicznych do wykry¬ wania kily i innych chorób kretkowych stalo sie w ostatnich latach coraz czesciej stosowana prak¬ tyka. Próby te oparte sa zwykle na reakcji aglu¬ tynacji i przeprowadza sie je w klinikach i prak¬ tyce lekarskiej w celu dokladniejszego postawie¬ nia diagnozy co do choroby pacjenta- Najczesciej stosowana próba polega na wyko¬ rzystaniu rozdrobnionego ciala stalego, takiego jak wegiel drzewny, w polaczeniu z kartka papieru o kolorze powierzchni kontrastujacym z barwa stalego materialu (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki Nr 3074853). W praktyce w próbie wykorzystuje sie zwykly plyn antyge¬ nowy, który buforuje sie i do którego dodaje sie wegiel aktywny. Z kolei krople tak przygotowa¬ nej zawiesiny wegla drzewnego w roztworze anty¬ genowym umieszcza sie na kartce dodajac 1 krople osocza, po czym kartke potrzasa sie, a wyniki interpretuje wizualnie. Dalszy sposób wykrywania kily podany zostal przez Lockyera w Brit. Journal Vener. Dis., tom 46, strony 290—294, 1970. Próba ta wymaga uzycia czerwieni szkarlatnej w pola¬ czeniu z antygenem Kahna.Znane sposoby badan, jakkolwiek w wiekszosci przypadków daja wlasciwe wykrycie kily, nie sa zadna miara doskonale i kazda z nich posiada wlasne wady. Próba z weglem drzewnym jest np. bardzo trudna do interpretacji wskutek tego, ze w szeregu przypadków sklonnosc do wyników do¬ datnich i ujemnych jest podobna. Nie ma zadnych trudnosci tam, gdzie ma sie do czynienia z próba zdecydowanie dodatnia. Jednakze w przypadku, gdzie wyniki sa watpliwe, przed wyciagnieciem ostatecznego wniosku trzeba przeprowadzic dalsze szersze badania. Próba Lockyera daje rózowy klacz- kowaty material, którego barwe jest jednak bardzo trudno wykryc z powodu bardzo malej wielkosci czasteczek. Pojawiajacy sie rózowy kolor nie jest latwo wykryc, w przeciwienstwie do próby z we¬ glem drzewnym lub próby z zastosowaniem pre¬ paratu wedlug wynalazku. Ponadto stwierdzono ponad wszelka watpliwosc, ze inne powszechnie stosowane próby daja zupelnie bledne wyniki w 2;% serii doswiadczalnych oraz falszywe wyniki dodatnie w 20,% przypadków.Metoda przy uzyciu preparatu wedlug wynalazku stanowiaca nowa wizualna metode wykrywania kily i innych chorób kretkowych wykazuje istotne korzysci w porównaniu z innymi technikami, ta¬ kimi jak uzycie wegla drzewnego, bardzo slabo zabarwionych ukladów albo emulsji lateksowych.Wr metodzie stosujacej preparat wedlug wynalazku 98 23498 234 nie stosuje sie czastek ciala stalego, co eliminuje rozpraszanie swiatla i, jesli korzysta sie z osocza dodatniego, tworza sie czastki lepiej widoczne.Przy ciemnym zabarwieniu daje to nawet lepsza widocznosc. Z tego wynika, ze metoda stosujaca 5 preparat wedlug wynalazku jest dokladniejsza i bardziej wiarygodna.Zgodnie z metoda stosujaca preparat wedlug wynalazku gdy odczynnik antygenowy styka sie z osoczem zawierajacym przeciwciala, tworzy sie 10 kompleks w postaci koacerwatu ze skladnikami odczynnika antygenowego- Ciemno zabarwione klaczki na jasnym tle, np. na bialej kartce, wska¬ zuja na próbe dodatnia.Preparat wedlug wynalazku sklada sie z dwóch 15 skladników podstawowych, z których jeden jest zwyklym odczynnikiem antygenowym V.D.R.L. lub U.S.R-, znanym specjalistom i dokladnie opisanym w cytowanym wyzej opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki Nr 3564089. 2o Drugi skladnik preparatu antygenowego jest barwnikiem o wzorze 1, 2 lub 3, albo mieszanina barwnika o wzorze 1 i wzorze 2 lub barwnika p wzorze 1 i wzorze 3.Barwniki i ich mieszaniny wprowadza sie do 25 preparatów antygenowych w znany sposób, razem z rozpuszczalnikami, buforami itp. Te rozpuszczal¬ niki, bufory, itp., sa stosowane, jak opisano, w zna¬ nych ukladach antygenowych, takich jak omówio¬ ne w wyzej wymienionych amerykanskich opisach 30 patentowych.Skladniki preparatu antygenowego wedlug wy¬ nalazku stosuje sie w stezeniach okolo 0,5—25,0% wagowych standartowego odczynnika antygenowe¬ go V.D.R.L. luub U.S.R- i okolo 0,0001—0,2% wa- 35 gowego barwnika, przy czym ciezary odniesione sa do calkowitego ciezaru otrzymanej mieszaniny zawierajacej rozpuszczalniki, np. wode, alkohol, ipt., oraz bufor.Jesli stosuje sie mieszaniny barwników o wzo- 40 rze 1, 2 i 3, to calkowita ilosc mieszaniny powinna zawierac sie w wyzej okreslonych granicach, lecz stosunek jednego barwnika do drugiego moze zmie¬ niac sie odpowiednio od okolo 9 : 1 do okolo 1 : 9.Przez uzyty tu termin „standartowy antygen 45 V.D.R.L i U.S.R" nalezy rozumiec zestawy podane i omówione w Manual of Tests for Syphilis (1969) United States Departments of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Com- municable Disease Center. ' 50 W preparatach antygenowych moze byc obecny takze trzeci skladnik. Skladnik ten zaleca sie, lecz nie jest on najwazniejszy. Skladnik ten jest srod¬ kiem flokulacyjnym, który mozna stosowac w ilos¬ ciach okolo 0,0001—0,05% wagowego w odniesieniu 55 do calkowitego ciezaru preparatu antygenowego, wedlug wynalazku, tj. standartowego odczynnika antygenowego i barwnika, i zawiera takze znane flokulanty, jak winylimidazolina, akryloamid, kwas akrylowy, akrylonitryl, styren, bezwodnik maleino- 60 wy, itp., oraz ich polimery i kopolimery miedzy soba i z innymi znanymi kopolimeryzujacymi mo¬ nomerami.W praktyce srodek flokulacyjny ulatwia stra- 65 canie i koacerwacje kompleksu antygen-przeciw- cialo, a tym samym pomaga w wizualnym wykry¬ ciu próby dodatniej.Do przygotowania preparatów antygenowych we¬ dlug wynalazku mozna wykorzystac standartowy odczynnik antygenowy V.D.R.L. Barwnik lub bar¬ wniki mozna wprowadzic do alkoholowego roztwo¬ ru antygenu V.D.R.L. albo dodac po przygotowaniu antygenu w buforze. Jesli do podstawowego pre¬ paratu ma byc wprowadzony srodek flokulacyjny, to dodaje sie go takze w tym samym czasie z nie,- znacznym mieszaniem.Zestaw antygen U.S.R. — barwnik otrzymuje sie przygotowujac najpierw zawiesine antygenu V.D.R.L. w buforze. Taki uklad o ciezarze w przybli¬ zeniu 2,0 g odwirowuje sie przez 15 minut w nie¬ rdzewnym naczynku stalowym, przy czym ciecz dekantuje sie, a scianki naczynka wyciera do su¬ cha. Osad zawiesza sie w medium U.S.R, które sklada sie ze znanej i odpowiedniej mieszaniny fosforanu jednopotasowego, fosforanu dwusodo- wego, mertiolanu, chlorku choliny i kwasu etyleno- dwunitryloczterooctowego. Barwnik, lub barwniki mozna wprowadzic do alkoholowego roztworu antygenu V.D.R.L. albo antygenu U.S.R. po zawie¬ szeniu ich w medium U.S.R.Preparat wedlug wynalazku stosuje sie takze do wytworzenia karty doswiadczalnej z odlozo- onym na niej srodkiem flokulacyjnym. Karta po¬ winna byc gladka, aby wyniki byly latwo dostrze¬ galne. Chociaz juz uprzednio wskazywano, ze po¬ wierzchnia powinna byc zwilzalna, to obecnie usta¬ lono, ze nie jest to konieczne. Karta moze byc wy¬ konana z dobrze kalandrowanego papieru lub kar¬ tonu oraz moze byc nasiakliwa, chociaz zaleca sie male stopnie nasiakliwosci. Jedna z cech charak¬ terystycznych naszej próby jest jednakze to, ze moze ona byc odczytana niezaleznie od tego czy plamka jest mokra lub sucha. Pozwala to na szyb¬ sze ustalenie wyników niz przy korzystaniu z in¬ nych technik. Karta moze byc takze laminatem papieru lub tektury, który posiada na sobie prze¬ puszczalny lub nieprzepuszczalny do wody mate¬ rial, taki jak polietylen. Sam papier lub powle¬ czenie powinny jednak posiadac kolor kontrastu¬ jacy z barwnikiem lub barwnikami stosowanymi w próbie. Zasadniczo nasza karta jest podobna w konstrukcji i skladzie do karty ujawnionej w opi¬ sie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki Nr 3074853.Srodek flokulacyjny mozna osadzic na karcie przez proste odparowanie jego roztworu, po uprze¬ dnim umieszczeniu na niej tego roztworu, przy czym rozpuszczalnikiem moze byc albo woda, albo material organiczny, taki jak chlorek metylenu, itp. Jakkolwiek srodek flokulacyjny przywiera do karty w stopniu wystarczajacym, aby zapewnic do¬ skonale wyniki, to przedtem do karty mozna do¬ dac srodka klejacego w celu zabezpieczenia wlas¬ ciwego przylegania. Odpowiednim * srodkiem do tego celu jest metyloceluloza. Te same srodki flo- kulacyjne, jak wspomniano wyzej z punktu widze¬ nia bezposredniego ich dodania do zestawu floku- lacyjnego, osadza sie zwykle jedynie na wybra-5 98 234 6 nych obszarach karty doswiadczalnej, przy czym obszary te sa zwykle oznaczone jako kolo, itp., tj. jako obszar, na którym aktualnie prowadzi sie próbe. Jesli srodek flokulacyjny znajduje sie na karcie sam z siebie, to w celu przeprowadzenia próby nie trzeba dodawac dalszego srodka floku- lacyjnego do stosowania preparatu antygenowego.Próby przeprowadza sie zwykle droga wstrza¬ sania kart po wkropleniu na nia preparatu anty¬ genowego i osocza. Wstrzasanie mozna przepro¬ wadzic np. na poziomie tarczy o powierzchni oko¬ lo 25,4 cm kwadratowych i okolo 80—240 skokami na minute, z nieznacznym ruchem mimosrodowym.Jednak skuteczne jest takze i wstrzasanie reczne Nizej podano przyklady ilustruja wynalazek nie ograniczajac jego zakresu. Jesli nie wskazano ina¬ czej, czesci i procenty sa czesciami i procentami wagowymi.Przyklad I. Próba U.S.R. W próbie tej jako antygen stosuje sie alkoholowy roztwór 0,03% kar- diolipiny, 0,9:% cholesterolu i 0,21% + 10,01%. lecy¬ tyny. Taki standartowy antygen V.D.R.L. oraz stan¬ dartowy buforowany rozcienczalnik solny do przy¬ gotowania odczynnika antygenowego V.D.R.L. do¬ stepne sa na rynku handlowym.Próba (U.S.R.) Reaginy z niegrzanym osoczem.Przygotowanie reagenta U.S.R. ze zwiazkiem anty- gen-barwnik A.EDTA (0,1M) 3,72 g soli sodowej kwasu etylenodwunitrylocztero- octowego (EDTA) rozpuscic do objetosci 100 ml.B. Roztwór chlorku choliny (40%) Zawartosc 250 g flaszki chlorku choliny rozpuscic w wodzie destylowanej do koncowej objetosci 625 ml, po czym przesacz i przechowywac w tem¬ peraturze pokojowej.C. Fosforan (0,02M). Mertiolan (0,2%) Roztwór 1,42 g Na2HP04, 1,36 g KHaPO,,, 1,0 g mertiolanu rozpuscic w wodzie destylowanej do koncowej ob¬ jetosci 500 ml przy pH 6,9.Roztwór zawiesinowy RoztwórA 1 czesc RoztwórB 2 czesci RoztwórC 4 czesci Woda destylowana 1 czesc Przygotowanie zawiesiny antygenowej 1,6 ml handlowego buforowanego roztworu sol¬ nego V.D.R.L. odpipetowuje sie na dno 30 ml pla¬ skodennego naczynia zamykanego korkiem szkla¬ nym. Z kolei bezposrednio do roztworu solnego dodaje sie po kropli w ciagu okolo 6 sekund 2,0 ml antygenu, przy czym podczas dodawania antygenu naczynie lagodnie sie obraca na plaskiej powierzchni. Ostatnia krople wydmuchuje sie bez dotykania pipety do ro*ztworu solnego. Naczynie obraca sie jeszcze przez dodatkowe 10 sekund, do¬ daje 16,4 ml standardowego buforowanego roz¬ tworu soli, a nastepnie wstrzasa dnem do góry i odwrotnie 30 razy w czasie okolo 10 sekund.Uzyskany produkt jest stosowana nizej zawiesina antygenowa V.D.R.L.Wyzej przygotowana zawiesine antygenowa V.D.R.L. odwirowuje sie w wirówce katowej w tem¬ peraturze pokojowej przy wzglednej sile osrod¬ kowej okolo 2,000 x g przez 15 minut. Górna war¬ stwe cieczy dekantuje sie od osadu przez odwró- cenie rurki. Wnetrze naczynia wyciera sie gaza bawelniana nie naruszajac osadu i utrzymujac jednoczesnie rurke w odwróconym polozeniu. Z kolei osad zawiesza sie ponownie w powyzszym roztworze zawiesinowym o objetosci równej orgir io nalnej objetosci zawiesiny antygenowej, która pod¬ dano odwirowywaniu. Jesli do odwirowywania sto¬ suje sie wiecej niz jeden pojemnik, to zawartosci zlewa sie i lagodnie miesza, otrzymujac w wyniku antygen U.S.R. Z kolei do antygenu U.S.R., lagod- nie mieszajac, dodaje sie powoli 0,07 ml 1% roz¬ tworu czerni sudanskiej o podanym wyzej wzorze 1 i zidentyfikowanej jako. Sudan Black-C.I. Nr 26150. W wyniku otrzymuje sie preparat antyge¬ nowy gotowy do prób.Sposób wykrywania przeciwcial reaginy (próba U.S.R.).Próbe mozna przeprowadzic na nienagrzewanych próbach osocza lub plazmy, chociaz próbki zakty- wowane cieplem sa równiez zadowalajace.Na dostepnej w handlu bialej karcie doswiad¬ czalnej umieszcza sie 50 1 osocza i 1/60 ml powy*- szego preparatu antygenowego, po czym miesza¬ nine miesza sie krótko przy pomocy paleczki luk innego podobnego narzedzia. Z kolei karte umiesz- cza sie w klinicznym rotatorze i poddaje wiro¬ waniu z szybkoscia 130 obrotów na minute w prze¬ ciagu 6 minut. Po naswietleniu wiazka swiatla za¬ rowego widoczne sa czarne skupiska czastek anty- gen-barwnik, wskazujace na próbe dodatnia kily. przy próbie ujemnej odczynniki nie lacza sie w oddzielne czastki, lecz pozostaja w postaci jed¬ norodnej zawiesiny.Przyklad II. Preparat antygenowy. Do za¬ wiesiny antygenowej V.D.R.L. (patrz wyzej) dodaje 40 sie 0,04 ml 0,1;% alkoholowych roztworów brunatu zasadowego i czerni sudanskiej (w stosunku 1:1) o podanym wyzej wzorze 2 i 1, Oznaczonych od¬ powiednio jako Basic-C.I. Nr 21-030 i Sudan Black Nr 26150, otrzymujac gotowy do uzytku preparat. 45 Sposób wykrywania przeciwcial reaginy . (próba Y.D.R.L.).Z krwinek pacjenta podejrzanego o chorobe od¬ dziela sie plazme, która nastepnie ogrzewa sie przez 30 minut w temperaturze 56°C. Na dostep¬ nej w handlu bialej karcie doswiadczalnej umie¬ szcza sie 50 1 próbki i 1/60 ml powyzszego pre¬ paratu antygenowego V.D.R.L. Po wymieszaniu karte umieszcza sie w rotatorze klinicznym i pod¬ daje wirowaniu jak w przykladzie I. Czarne sku¬ piska czastek, widoczne w podajacym swietle za¬ rowym, wskazuja na dodatnia próbe kily. Pracy próbie ujemnej- odczynniki nie lacza sie w od¬ dzielne czastki, lecz pozostaja w postaci jedno¬ rodnej. 60 Przyklad III. Preparat antygenowy przygo¬ towuje sie w sposób opisany w przykladzie I.Próbe przeprowadza sie w ten sam sposób, jak próbe U.S.R., z tym, ze na karcie doswiadczalnej 65 umieszcza sie 1 1 0,1% wodnego roztworu poliwi-98 234 8 nyloimidazoliny i przed wirowaniem suszy w tem¬ peraturze pokojowej. W ten sposób uzyskuje sie znaczne polepszenie widocznosci skupisk czastek w stosunku do kart, w których nie stosowano po¬ limeru imidazolinowego. 5 . Przyklad IV. Preparat antygenowy przygo¬ towuje sie w sposób opisany w przykladzie II, a próbe przeprowadza sie w taki sam sposób jak próbe V.D.R.L., z tym, ze na karcie doswiadczal¬ nej umieszcza sie 1 1 0,1%: wodnego roztworu po- 10 liwinyloimidazoliny i suszy jak w przykladzie III.I w tym przypadku uzyskuje sie^ polepszenie wi¬ docznosci skupisk czastek.Przyklad V. Powtarza sie postepowanie z przykladu II, z tym, ze nie stosuje sie barwnika ]5 Basic Brown-C.I. Nr 21030. I znów uzyskuje sie dobrze widoczne, lecz jasniejsze skupiska czastek, wskazujace na dodatnia próbe kily.Przyklad VI. Ponownie powtarza sie poste¬ powanie jak w przykladzie I, z tym, ze do anty- 20 genu U.S.R. dodaje sie raczej mieszanine barwni¬ ków z przykladu II, a nie barwnik pojedynczy.Ciemne skupiska czastek wskazuja na dodatnia próbe kily.Przyklad VII. Jesli przed dodaniem prepa- 25 ratu antygenowego, do karty doswiadczalnej jak w przykladzie V doda sie handlowo dostepny poli- akrylanawy srodek flokulacyjny (w ilosci 0,0015^) w postaci 0,1% wodnego roztworu, to w wyniku tworza sie wieksze skupiska czastek o ciemnym 30 zabarwieniu, co zwieksza latwosc interpretacji, a tym samym i dokladnosc próby. Takie wyniki wskazuja na próbe dodatnia.P r z y k lad VIII. Do bialej karty na próbe ki¬ lowa dodaje sie dostepny w handlu' srodek flo- 35 kulacyjny na podstawie polimeru akryloamidowe- go i suszy w temperaturze pokojowej. Wykorzy¬ stujac tak przygotowana karte powtarza sie po¬ stepowanie z przykladu II. Obserwuje sie duze, ciemne skupiska czastek, których wielkosc jest co- 40 kolwiek wieksza niz wielkosc czastek w przykla¬ dzie VI.Przyklad IX. Powtarza sie postepowanie jak w przykladzie I, z tym, ze zamiast uzytego tam barwnika stosuje sie barwnik Basic Brown-C.I. Nr 45 21010 o podanym wyzej wzorze 3. Uzyskuje sie po¬ dobne wyniki.Przyklad X. W przykladzie II zamiast barw¬ nika dodaje sie równowazna ilosc barwnika Basic Brown-C.I. Nr 21010 (wzór 3). I znów obserwuje 50 sie ciemne skupiska czastek wskazujace na do¬ datnia próbe kily.Przyklad XI. Powtarza sie postepowanie jak w przykladzie II, z tym, ze stosuje sie równowaz¬ na ilosc mieszaniny (w stosunku 9:1) barwnika Sudan Elack-C.I. Nr 26150 i barwnika Basic Brown-C.I. Nr 21010. Na próbe dodatnia wskazuja duze, czarne skupiska czastek.Przyklad XII. Mieszanine barwników z przy¬ kladu XI wykorzystuje sie w przykladzie I za¬ miast stosowanego tam barwnika pojedynczego.Wynik dodatni stwierdza sie latwo.Przyklad XIII. Zamiast barwnika Sudan Black w przykladzie I stosuje sie barwnik Basic Brown-C.I. Nr 21030 o podanym wyzej wzorze 2.Uzyskuje sie podobne wyniki, z tym, ze czastki sa brazowe, a nie czarne.Przyklad XIV. Powtarza sie ponownie po¬ stepowanie jak w przykladzie II, z tym, ze stosuje sie podwójna ilosc barwnika Basic Brown-C.I.Nr 21030, a nie dodaje sie wcale barwnika Sudan Black-C.I. Nr 26150. I znów doswiadczony specja¬ lista moze latwo stwierdzic próbe dodatnia obser¬ wujac brazowawe skupiska czastek.Przyklady XV—XVIII. Karte doswiadczalna przygotowana w przykladzie VII wykorzystuje sie do przeprowadzania prób jak w przykladzie XI, XII, XIII i XIV. Umieszczony na kartach doswiad¬ czalnych srodek flokulacyjny zwieksza w kazdym przypadku wielkosc skupisk czastek, przez co dalej ulatwia analize wyników. Wszystkie karty wyka¬ zuja próbe dodatnia.Przyklad XIX. Do dostepnej w handlu, bia¬ lej karty doswiadczalnej dodaje sie 1,5% 1,0% wodnego roztworu srodka flokulacyjnego na pod¬ stawie bezwodnika styrenowo-meleinowego, po czym karte suszy sie w temperaturze pokojowej.Przy przeprowadzeniu w znany sposób próby na kile, skupiska czastek wskazujace na wynik do¬ datni sa wieksze i latwiej dostrzegalne, niz w przy¬ padku braku srodka flokulacyjnego. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1.