PL96804B1 - Sposob wytwarzania nowych podstawionych pochodnych pirazolu - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych podstawionych pochodnych pirazolu uzytecznych do zwalczania bakterii, grzybów i pier¬ wotniaków, zwlaszcza w medycynie i weterynarii.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie zwiaz¬ ki o wzorze 1, w którym R oznacza grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, R1 oznacza grupe NH2 a R2 oznacza grupe —CONH2.Przeprowadzono duza liczbe badan nad znale¬ zieniem srodków do zwalczania infekcji u drobiu, swin i bydla, spowodowanych bakteriami i pier¬ wotniakami. Tak wiec przedmiotem szerokich ba¬ dan od wielu lat, byly zwiazki i sposoby zwalczania Escherichia coli, Pasteurella multocida, Salmonella typhimurium oraz kokcydioza u kurczat, jak rów¬ niez Treponema hyodysenteriae u swin.W belgijskim^ opisie patentowym nr 75 145 3/4 opisano podstawione 5-nitrofurany i 5-amino-4-cy- jano-l-metylo-3-(5-nitro-2-furylo)-pirazol, sposoby ich wytwarzania oraz leki zawierajace podstawione nitrofurany jako skladnik czynny. Podano, ze zwiaz¬ ki te wykazuja aktywnosc w zwalczaniu bakterii, robaków i pierwotniaków, oraz dzialaja jako srodki kocydiostatyczne, przeciwswidrowcowe i srodki przeciwmalaryczne.Takze w belgijskim opisie patentowym nr 782 851 przedstawiono 2-(5-nitro-2-imidazolilo)-pirymidyny oraz sposoby ich otrzymywania. Zwiazki te sa czyn¬ ne jako srodki przeciwrzesistkowe bakteriobójcze i przeciwgrzybowe, jak równiez sa uzyteczne przy leczeniu infekcji pochwowych.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 452 034 znane sa podstawione 2-(l,3 4,-tiadiazolilo-2)-4(5)-nitroimidazole oraz ich otrzy¬ mywanie. Podaje sie, ze zwiazki te sa uzyteczne jako srodki przeciwbakteryjne i amebobójcze, prze¬ ciwrzesistkowe oraz kokcydiostatyczne.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3682942 znane sa sposoby wytwarzania 2-(2-amino-l,3,4-tiadiazolilo-5)-l- podstawionych 5- -nitroimidazoli. Produkty te sa uzyteczne do zwal¬ czania infekcji bakteryjnych pasozytniczych i wy¬ wolanych przez pierwotniaki u drobiu i zwierzat, zwlaszcza do zwalczania infekcji wywolanych przez Trichomonas vaginalis i Salmonella gallinarum, co opisal Berkelhammer i wspólpracownicy w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3452035.Podstawione w polozeniu 2 przez pierscieniowe uklady heterocykliczne 5-nitroimidazole ujawnia Rufer i wspólpracownicy, Progr. Antimikrob. Anti- caccer Chemother., Proc. Int. Conger. Chemother., 6-y 1969 (opublikowany 1970), 1,145—8, (Univ. Park Press: Baltimore, Maryland) Chem. Anstr. 74, 141632x (1971). Autorzy ci podaja, ze zwiazki te sa czynne przeciw Trichomonas vaginalis in witro.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3682953 znane sa pochodne 3-(5-nitro-2- -furylo) pirazolu oraz ich farmaceutycznie dopusz- 96 80496 804 3 czalne sole addycyjne z kwasami a takze zawiera¬ jace te zwiazki kompozycje farmaceutyczne i pa¬ szowe, jak równiez sposoby leczenia infekcji bakte¬ ryjnych u ssaków oraz posoby ochrony materialu organicznego przed atakiem bakterii, przy zastoso¬ waniu zastrzezonych zwiazków. Twierdzi sie, ze zwiazki te wykazuja czynnosc przeciwbakteryjna, przeciw-robakom, przeciwpierwotniakowa, kokcy- diostatyczna, przeciwswidrowcowa oraz przeciw- malaryczna.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3682956 znane jest, ze 5-amino-4-kar- bamylo-3-(5-nitro-2-fury1lo)pirazole wykazuja czyn¬ nosc przeciwbaktryjna. Zwiazki stosuje sie w taki sam sposób jak opisano w opisie patentowym Sta¬ nów Zjednoczonych Ameryki nr 3682953.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3716555 znane sa pochodne 3-(5-nitro- -2-furylo)pirazolu i to, ze zwiazki te posiadaja wlas¬ ciwosci przeciwbakteryjne.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3719759 znane sa srodki przeciwpier- wotniakowe zawierajace nitroimidazole. Opisane ni- troimidazole obejmuja 1-podstawione 2-arylo 5-nit- roimidazole, w których aryl oznacza podstawiony lub niepodstawiony fenyl lub naftyl, a podstawnik -w polozeniu 1 oznacza nizsza grupe alkilowa. Po¬ daje sie ze zwiazki te sa skuteczne przeciw infek¬ cjom spowodowanym przez pierwotniaki, takim jak histomonioza, zakazenie rzesistkiem, amebioza i swidrowica, jak równiez przeciw robakom, takim jak szczepy Meterakis i Ascarid, oraz bakteriom, takim jak szczep Salmonella, Streptococcus i Es- cherichia coli, oraz przeciw organizmom czynnym przy zapaleniu pluc i oplucnej.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3399211 znane sa sposoby wytwarza¬ nia zwiazków stosowanych w srodkach przeciw- pierwotniakowych opisanych w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3719759.Opisane powyzej znane zwiazki róznia sie znacz¬ nie budowa od zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku.Stanowiaca podstawnik we wzorze 1 grupa alki¬ lowa o 1—3 atomach wegla oznacza prosty lub roz¬ galeziony nasycony rodnik weglowodorowy taki jak metylowy, etylowy, n-propylowy lub izopropylowy.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze zwiazek o wzorze 2, w którym R i R1 maja wyzej podane znaczenie a R2 oznacza grupe —GN podda¬ je sie hydrolizie do zwiazku o wzorze 1, w którym R2 oznacza grupe karbonamidowa.Nowe zwiazki o wzorze 1, wytwarza sie wycho¬ dzac z dostepnego w handlu 2-metylo-5-nitroimida- zolu, który poddaje sie reakcji ze srodkiem alkilu¬ jacym takim jak siarczan dwumetylowy w odpo¬ wiednim rozpuszczalniku, na przyklad w benzenie.W wyniku reakcji otrzymuje sie l,2-dwumetylo-5- -nitro-imidazol. Zwiazek ten poddaje sie reakcji z benzaldehydem w obecnosci zasady, na przyklad etanolanu sodowego w bezwodnym etanolu, otrzy¬ mujac l-metylo-5-nitro-styryloimidazol.Nastepny etap syntezy nowych zwiazków polega na utlenianiu wiazania styrylowego w l-metylo-5- -nitro-styryloimidazolu. Mozna tego dokonac przy pomocy szeregu utleniaczy nadajacych sie do utle¬ nienia tego typu wiazania do grupy aldehydowej (formylowej). ; Utlenianie przeprowadza sie przez potraktowanie l-metylo-5-nitro-2-styryloimidazolu, w postaci za¬ wiesiny w odpowiednim rozpuszczalniku, ozonem w temperaturze w przyblizeniu pokojowej. Do od¬ powiednich rozpuszczalników nalezy metanol, mie¬ szanina metanolu z woda albo mieszanina metano¬ lu lu, chlorku metylenu i wody oraz tym podobne.Utlenianie zwiazku styrylowego mozna prowadzic równiez sposobem podanym w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3472864. Zba¬ dano uklad utleniajacy skladajacy sie z nadjodanu metalu alkalicznego i czterotlenku osmu w odpo¬ wiednim srodowisku wodnym, zwlaszcza i.w;wodzie i 1,2-dwumetoksyetanie, w temperaturze okolo °—35°C, w czasie okolo 10—20 gddzin. l-metylo-5-nitroimidazolilo-2-karboksyaldehyd, u- zyskany jednym z dwóch wyzej wymienionych spo¬ sobów, jest podstawowym, glównym zwiazkiem wyjsciowym stosowanym do wytwarzania nowych zwiazków.Nastepny etap wytwarzania nowych zwiazków polega na reakcji l-metylo-5-nitroimidazolifo-2- -karboksyaldehydu, z podstawiona hydrazyna o wzorze H2N—NHR* w którym R oznacza grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla. Reakcje prowadzi sie w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak chlo- roform, w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna, uzyskujac alkilchydrazon l-metylo-5-ni- troimidazolilo-2-karboksyaldehydu. Do odpowied¬ nich podstawionych hydrazyn stosowanych w tej reakcji nalezy metylohydrazyna, etylohydrazyna, 3S n-propylohydrazyna, izopropylohydrazyna, i tym podobne. Warunki reakcji sa takie same dla wszy¬ stkich hydrazyn. Zatem na przyklad, jesli metylo- hydrazyne poddaje sie reakcji z l-metylo-5-nitro- imidazolilo-2-karboksyaldehydem w chloroformie, 40 otrzymuje sie metylohydraizon l-metylo-5-nitroimi- dazolilo-2-karboksyaldehydu.Utworzone w ten sposób hydrazony poddaje sie reakcji' z N-bromosukcynimidem w przyblizeniu w temperaturze pokojowej, w odpowiednim roz- 45 puszczalniku, takim jak chloroform, otrzymujac al- kilohydrazony bromku l-metylo-5-nitroimidazoilo- -2-karbonylu. Reakcja z N-bromosukcynimidem na¬ daje sie do jakiegokolwiek podstawionego hydra- zonu i prowadzi do bromopodstawionych hydra- 50 zonów. Na przyklad jesli metylohydrazon 1-metylo- -5-nitroimidazolilo-2-karboksyaldehydu poddaje sie reakcji z N-bromosukcynimidem w temperaturze pokojowej w chloroformie, to otrzymuje sie mety¬ lohydrazon bromku l-metylo-5-nitroimidazolilo-2- 55 -karbonylu.Podstawiony bromem hydrazon jest nietrwaly i posiada wlasciwosci parzace i lzawiace. Z tego powodu wykorzystuje sie go bez wydzielania lub dokladniejszego oczyszczania. Z podstawionego 60 bromem hydrazonu wytwarza sie zawiesine w od¬ powiednim rozpuszczalniku, na przyklad bezwod¬ nym metanolu i dodaje nitrylu kwasu malonowego.Nastepnie do tak utworzonej mieszaniny dodaje sie trójetyloamine rozpuszczona w absolutnym meta- 65 nolu, przy czym mieszanine reakcyjna utrzymuje96 804 6 sie w temperaturze okolo 10—20°C, przy pomocy odpowiedniego srodka chlodzacego. Reakcja ta jest nieznacznie egzotermiczna i aby utrzymac zadana temperature potrzebne jest chlodzenie.W miare postepu reakcji poczatkowo zólta za¬ wiesina rozpuszcza Sie i w czasie okolo 1—2 godziny zostaje zastapiona przez inna zawiesine. Staly ma¬ terial w tej drugiej zawiesinie jest zadanym pro¬ duktem, który odsacza sie, przemywa metanolem, a nastepnie woda, i suszy. Jesli na przyklad sto¬ suje sie metylohydrazon bromku l-metylo-5-nitro- imidazolilo-2-karbonylu, to na podstawie analizy elementarnej i widma NMR staly produkt identy¬ fikuje sie jako 5-amino-l-metylo-3(l-metylo-5-nit- ro-2-imidazolilo(pirazolo-4-karbonitryl. Hemologicz- ne 5-amino-l-alkilo-3(l-metylo-5-nitro-2-imidazoli- lo)pirazolo-4-karbonitryle mozna zsyntezowac z od¬ powiednich bromopodstawionych alkilohydrazonów postepujac w taki sam sposób, jak przy reakcji z nitrylem kwasu malonowego.Grupe 4-karbonitrylowa mozna latwo zhydrolizo- wac do grupy karbonamidowej w reakcji karbo- nitrylu ze stezonym kwasem siarkowym w absolut¬ nym etanolu. Na przyklad, jesli 5-amino-1-metylo- -3-(l-metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-karbo- nitryl poddaje przez okolo 1 godzine reakcji ze stezonym kwasem siarkowym w absolutnym eta¬ nolu, i w temperaturze lazni parowej, otrzymuje sie 5-amino-1-metylo-3(l-metylo-5-nitro-2-imidazo- lilo)pirazolo-4-karbonamid.Zwiazki o wzorze 1 wykazuja in vitro aktywnosc przeciw nastepujacej grupie drobnoustrojów, z których wiele jest czynnikiem chorobotwórczym u zwierzat: Escherichia coli, Salmonella dublin, Arizona paracolon, Pseudomonas, Pasteurella mul- tocida (wydzielona z wolu), (wydzielona z ptaków), (wydzielona ze swin), Pasteurella hemolytica, Stre- ptococcus (zapalenie sutek) Staphylococcus (zapa¬ lenie sutek), Streptococcus grupy E, Spherophorus necrophorus, Bordetella bronchiseptica, Erysipelo- thrix rhusiopathiae, Mycoplasma gallisepticum, My- coplasma synoviae, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma Szczepu T (z wolu), Bacteroides fra- gilis. ' Stwierdzono, ze nowe zwiazki o wzorze 1, wy¬ kazuja takze czynnosc in vivo i sa uzyteczne przy zwalczaniu szeregu infekcji u zwierzat, takich jak Escherichia coli u drobiu, Pasteurella multocida u kurczat, indyków i myszy, oraz Salmonella ty- phimuarium u kurczat. Zwalczanie tych organizmów przeprowadza sie przez podawanie skutecznych da¬ wek zwiazku drobiu lub myszom w postaci zas¬ trzyków, doustnie lub w karmie. Ustalono, ze zwiaz¬ ki byly takze skuteczne jako promotory wzrostu, gdy podawano je kurczetom.Stwierdzono takze, ze nowe zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku wykazuja aktywnosc in vivo i in vitro przeciw Treponema hyodysente- riae, która powoduje biegunke u swin. Biegunka swinska jest zakazna choroba infeksyjna charakte¬ ryzujaca sie sluzowo-krwistym rozwolnieniem. Cho¬ roba ta powoduje duze straty ekonomiczne spo¬ wodowane zmniejszonym przyrostem, gorszym wy¬ korzystaniem paszy oraz padnieciami. Wystepowa¬ nie choroby jest czeste zarówno w Stanach Zjed¬ noczonych, jak i w tych krajach gdzie istnieje intensywna hodowla swin.Nowe zwiazki wykazuja ponadto aktywnosc in vitro przeciw szeregowi bakterii beztlenowych, ta¬ kich jak: Actinomyces bovis 13684; Clostridium in- ocuum 1373, Clostridium perfringens 81, Clostri¬ dium ramosum 1313, Clostridium epeticum 1128, Clostridium septicum bovine, Eubaeterium aerofa- ciens 1235, Peptococcus anaerobius 1428, Peptostrep- tococcus intermedius 1264, Propionibacterium acnes 44, Propionibacterium acnes 79, Bacteroides fragi¬ lis sp. fragilis 1877, Bactoroides fragilis sp. fragilis 1936B, Bacteroides fragilis sp. thetaiotaomicron 1438, Bacteroides fragilis sp. vulgatus 1563, Bac¬ teroides fragilis sp. vulgatus 1211, Fusobacterium symbiosum 1470, Fusobacterium neerophOrum 13859, Veillonella alcalescens 1., Nowe zwiazki otrzymane sposobem wedlug wy¬ nalazku posiadaja wlasciwosci przeciwdrobnoustro- jowe, a zwlaszcza wykazuja uzyteczna w wetery¬ narii czynnosc przeciwbakteryjna, przeciwgrzybowa i przeciwpierwotniakowa. Zwiazki te sa szczególnie cenne przy leczeniu infekcji u drobiu, spowodowa¬ nych przez Escherichia coli, Pasteurella multocida i Salmonella typhimurium, a takze sa czynne jako promotory wzrostu u pisklat.Zatem przy leczeniu infekcji u pisklat, spowo¬ dowanej przez Escherichia coli, skuteczne jest po¬ dawanie w karmie zwiazku o wzorze ogólnym 1, w ilosci okolo 50—200 g na tone karmy.Infekcje u kurczat i indyków, spowodowane przez Pasteurella multocida, opanowuje sie skutecznie przez podawanie jednego z nowych zwiazków w ilosci okolo 100 g na tone karmy.Takze u kurczat opanowanie infekcji spowodo¬ wanych przez Salmonella typhimurium przeprowa¬ dza sie droga doustnego podawania jednego z no¬ wych zwiazków w ilosci okolo 25—100 g zwiazku na 1 tone karmy. Zatem infekcje u kurczat i in¬ dyków, spowodowane przez Escherichia coli, Pas¬ teurella multocida i Salmonella typhimurium, opa¬ nowuje sie przez doustne podawanie jednego z no¬ wych zwiazków, w ilosci okolo 25—200 g na 1 tone karmy.Opanowanie infekcji u kurczat, spowodowanych przez Salmonella typhimurium, mozna przeprowa¬ dzic przez podskórne podawanie nowych zwiazków, w dawkach okolo 3—60 mg na kilogram wagi ciala.Infekcje u myszy spowodowana przez Pasteurel¬ la multocida, opanowac mozna przez dootrzewnowe wstrzykiwanie zwiazku w ilosci 2,5 mg na kilo¬ gram ciala zwierzecia. Infekcje te mozna równiez opanowac przez podanie doustne okolo 100 g zwiaz¬ ku na 1 tone pozywienia.Badano jeden z nowych zwiazków, 5-amino-1-me- tylo-3-(l-metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4- -karbonitryl, i stwierdzono, ze jest on skuteczny jako hormon wzrostu, £dy podawany jest doustnie piskletom w dawkach okolo 50 g na 1 tone karmy.Wyzej opisana czynnosc przeciwdrobnoustrojowa zwiazków stwierdzono w szeregu wielostronnych prób, przedstawionych ponizej.Doswiadczenie 1. Badano skutecznosc nowych zwiazków przeciw infekcjom u myszy spowodo- 40 45 50 55 60W 804 7 S wanym przez Pasteurella multocida, przy podawa¬ niu droga wstrzykiwania.Do badan wykorzystano szwajcarskie myszy plci zenskiej o ciezarze 15—20 g Po odwazeniu 5 mg badanego zwiazku rozpuszczono go w 0,5 ml dwu- metylosulfotlenku i tak przygotowany roztwór do¬ dano do 9,5 ml zawiesiny soli sodowej karboksy- metyloeelulozy. Myszom, w grupach po 5 sztuk wstrzykiwano dootrzewnowe 0,1 ml w powyzszy sposób przygotowanej kompozycji doswiadczalnej, co odpowiada dawce 2,3 mg na 1 kilogram cie¬ zaru ciala myszy. Zwiazki badane byly w daw¬ kach 2,5, 5,0 i 7,5 mg na 1 kilogram ciezaru ciala myszy, przy czym sposób przygotowania dawek 5,0 i 7,5 mg/kg byl taki sam jak dawki 2,5 mg/kg.Bezposrednio po otrzymaniu badanego zwiazku my¬ szy byly zakazone podskórnie przy pomocy 16- i 20- -godzinnej tryfctozowej hodowli Pasteurella mul¬ tocida, stosujac rozcienczenia równe dziesietnemu logarytmowi 10^*, 10-*, 10"* 10^7, przy uzyciu 0,1 ml na mysz. Zakazano takze podobne grupy my¬ szy kontrolnych, których przedtem nie traktowano nowymi zwiazkami, przy czym szczepionke zaka¬ zajaca podawano podskórnie. Badane grupy myszy obserwowano codziennie porównujac smiertelnosc w grupach traktowanych nowymi zwiazkami ze smiertelnoscia w grupach kontrolnych nie trak¬ towanych nowymi zwiazkami.Wyniki badan zebrano w tablicy I, w której ba¬ dany zwiazek jest zidentyfikowany numerem przy¬ kladu, w którym opisano jego synteze. W kolumnie 1 wyszczególniono badany zwiazek, w kolumnie 2 dawke badanego zwiazku w mg/kg ciezaru ciala myszy, w kolumnie 3 rozcienczenie organizmu za¬ kazajacego, a w kolumnie 4 przezycie wzgledne tj. stosunek liczby myszy, które przezyly próbe, przy danej dawce i rozcienczeniu, do liczby myszy poddanych próbie.Tablica I Zwiazek i 3 Hawka w mg/kg 2,5 2,5 Grupy kontrolne zakazone Rozcien¬ czenie -4 -5 io-« -7 -4 -5 -« -4 -5 -6 Przezycie wzgledne 1/10 8/20 24/30 19/20 /10 9/10 /10 0/10 2/10 8/10 Doswiadczenie 2. W podobny sposób oceniano skutecznosc nowych zwiazków przy zwalczaniu in¬ fekcji u kurczat, spowodowanych przez Salmonella typhimurium.Doswiadczenie przeprowadzono na 1-dniowych piskletach o ciezarze okolo 33 g kazde. Z uwagi na wielkosc dawki piskleta podzielono na grupy po 5 sztuk. Czesc pisklat otrzymala badany zwia¬ zek, w postaci zawiesiny w 0,2 ml gilkolu poliety¬ lenowego 200, droga podskórnego zastrzyku w szyje.Grupa kontrolna zwiazku nie otrzymala. Wszystkie piskleta zakazano przy pomocy kultury bakterii w rozcienczeniu 1: 200, przez domiesniowe wstrzyknie¬ cie 0,1 ml w noge kazdego pisklecia. Piskleta ob¬ serwowano przez 6 dni, przy czym liczbe przypad¬ ków smiertelnych w. grupie kontrolnej porówny¬ wano z liczba przypadków smiertelnych u pisklat, które otrzymaly badany zwiazek. Wyniki badan zebrano w tablicy II, W tablicy II w kolumnie 1 wyszczególniono ba¬ dany zwiazek, w kolumnie 2 dawke badanego zwiazku w mg/kg, a w kolumnie 3 przezycie wzgledne.Tablica II Zwiazek 3 Dawka mg/kg 60 ia 7.5 Przezycie wzgledne 7/15 U/25 6/15 0/10 Doswiadczenie 3. Oznaczono wrazliwosc bakterii w beztlenowych, zarówno gram-dodatnich, jak i gram- -ujemnych, na reprezentatywna liczbe nowych zwiazków, korzystajac z agarowej metody rozcien- czen. Bakterie wyizolowano z pacjentów przebywa¬ jacych na leczeniu w Osrodku Medycznym Uni- wersytetu w Indianie. Wyizolowane bakterie zi¬ dentyfikowano w laboratorium anaerobowym Cen¬ trum Medycznego przy pomocy kryteriów opraco¬ wanych przez Dowella i wspólpracowników, Labo- ratory Methods in Anaerobic Bacteriology, Public 40 Health Serv, Publ. nr 1803 (1968) {Center for Disea- se Control, Atlanta, Ca.]; oraz przez Smitha i wspól¬ pracowników, The Pathogenic Anaerobic Baeteria, strony 96—136 (1968) {Charles C. Thomas, Publis¬ her, Springfield, Iii], Wszystkie drobnoustroje prze- 45 chowywano w srodowisku glukozowym z posieka¬ nym miesem (Scott Laba) w temperaturze poko¬ jowej.Metoda stosowana w próbach z rozcienczeniem agarowym oparta byla na badaniach Suttera i 59 wspólpracowników Antimicrob. Ag. Chemother. 3,188—193 (1973). Rasy bakterii anaerobowyeh. ho¬ dowano w rurkach o wymiarach 16X120 mm w ciagu 16—18 godzin w srodowisku tioglikolanu bez wskaznika 135C (Becton, Dickinson and Co.), do 55 którego przed autoklawowaniem dodano 5 pg he- miny na 1 mililitr oraz po autoklawowaniu 1 mg wodoroweglanu sodowego i 0,ljjig menadionu ste¬ rylizowanego przez filtr. Rurki wzrostowe dla bak¬ terii Veillonella alcalescens zaopatrzono w 5 mg 60 mleczanu sodowego na 1 mililitr. Szczepy bakterii zostaly wyskalowane na zmetnienie zgodnie ze wzorcem nr 1 Mc Farlanda w srodowisku tiogli¬ kolanu bez wskaznika 135C, zawierajacym dodat¬ kowo 0,13% Bacto-agaru (Difco). Kazdy szczep u^ 65 mieszczano nastepnie na powierzchni plytki Pe¬ le W »0 40 45 50 55 6096 864 triego (o wymiarach 100X15 mm) przy pomocy re- plikatora.Do badan z rozcienczeniem agarowym przygo¬ towano 2-krotne rozcienczenie badanych zwiazków w odmineralizowanej wodzie, do których nastepnie dodano zhemolizowanej krwi owczej i sterylizowa¬ nego przez filtr menadionu, tak ze stezenia po roz¬ cienczeniu agarowym wyniosly odpowiednio 5% i 10 jig/ml. Do kazdego rozcienczenia dodano równa objetosc agaru Brucella o podwójnej mocy (Bec- ton, Dickinson and Co.), na lazni wodnej utrzymy¬ wanej w temperaturze 50°C, a nastepnie wylano je na szalki Petriego.Wszystkie operacje wykonywano wewnatrz plas¬ tikowej komory rekawicowej, z wyjatkiem inkuba¬ cji rurek wzrostowych i wylania na plytki. Po stwardnieniu plytki umieszczono w komorze re¬ kawicowej przynajmniej na dwie godziny przed szczepieniem. Operacje w komorze rekawicowej przeprowadzono glównie wedlug Aranki i wspól¬ pracowników, Applied Microbiology, 17, 568—576 (1969), lecz wprowadzajac nastepujace zmiany. Su¬ che materialy wprowadzano do komory rekawico¬ wej droga opróznienia sluzy do 71 cm slupa rteci i wypelnienia jej azotem, a nastepnie przez ko¬ lejne opróznienie w ten sam sposób i napelnienie jej mieszanina 80% azotu, 10% C02 i 10% wodoru.Plyny i plytki agarowe wprowadzano do komory rekawicowej droga opróznienia sluzy do 25 cm slupa rteci i czterokrotne napelnienie gazem. Do wypelnienia sluzy po pierwszych dwóch opróznie¬ niach wykorzystano azot, natomiast do dwóch na¬ pelnien koncowych — wyzej opisana mieszanine gazów.Wszystkie plytki poddano inkubacji w tempera¬ turze 37°C w slojach typu Gas Pak (Becton, Dic¬ kinson and Co.) zawierajacych katalizatory glinowe pokryte palladem (reaktywowane po kazdym uzy¬ ciu). Wyniki prób sposobem rozcienczenia agaro¬ wego odczytywano okolo 24 godziny od rozpocze¬ cia inkubacji. Jako minimalne stezenie hamujace rozwój (MIC) przyjeto najnizsze stezenie badanego zwiazku, przy którym nie zaobserwowano rozwoju bakterii.Wyniki tych badan in vitro zebrano w tablicy III i IV, przy czym badane zwiazki oznaczono w taki sam sposób jak w poprzednich doswiadcze¬ niach. Dla celów porównawczych równolegle próby przeprowadzono takze z antybiotykami cefa- lotyna i erytromycyna i wyniki wlaczono do tab¬ licy III i IV.Przyklady I i II przedstawiaja synteze zwiazków wyjsciowych., Przyklad I. Synteza l-metylo-5-nitroimidazo- lilo-2-karboksyaldehydu.Do roztworu 5 g (0,0394 mola) 2-metylo-5-nitro- imidazolu w 100 ml wrzacego benzenu wkrapla sie roztwór 5 g (0,0394 mola) siarczanu dwumetyluwlO ml benzenu, po czym calosc ogrzewa sie pod chlod¬ nica zwrotna przez noc. Z kolei mieszanine reak¬ cyjna chlodzi sie wkrapla do niej roztwór 6 g we¬ glanu potasowego w 6 ml wody. Calosc miesza sie przez 1..godzine i saczy. Po rozdzieleniu fazy or¬ ganicznej i wodnej przesaczu, czesc wodna przemy¬ wa sie 2 razy po 50 ml benzenu. Benzenowy eks- trat laczy sie z pierwotna warstwa organiczna i calosc suszy nad bezwodnym siarczanem magne¬ zowym. Po odsaczeniu srodka suszacego przesacz zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem uzyskujac produkt o temperaturze topnienia okolo 135—138°C, który zidentyfikowano jako l,2-dwumetylo-5-nitro- imidazol. Ciezar produktu wynosil 4 g.W 10 litrowej okraglodennej kolbie, zaopatrzo¬ nej w mieszadlo mechaniczne, chlodnice zwrotna i wkraplacz, umieszczono 705 g (5,0 moli) 1,2-dwu- metylo-5-nitroimidazolu i 3,75 litrów absolutnego etanolu, po czym calosc mieszano do czasu pelnego rozpuszczenia. Do tak przygotowanego roztworu do¬ dano szybko 685 g (6,5 moli) benzaldehydu. Z kolei do mieszaniny dodano szybko 150 g sodu rozpusz¬ czonego w 2,5 1 metanolu, przy czym dodawanie przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Calosc mieszano i ogrzewano w temperaturze okolo 70°C przez okolo 90 minut. Po osiagnieciu temperatury 40°C barwa roztworu zmienila sie na ciemnobra- Badany zwiazek 3 erytro¬ mycyna cefalo- tyna co 1 3 oo G co O ^ C co < 0,125 1,0 2 Tablica III Wrazliwosc wyodrebnionych bakterii anaerobowych Minimalne stezenie wstrzymujace rozwój, po 24 godzinach (^ig/ml) co S 2 ostridiu ocuum G.S < 0,125 128 8 ostridium rfringens 81 . i—t Ci) O a < 0,126 <0,5 2 co I-i £ «-¦ ostridiu mosum U U < 0,125 < 128 8 00 CM £ 2 ostridiu pticum U co < 0,125 1,0 1,0 m bovine ostridiu pticum urn kns 1235 ibacteri orofacie O w ' W cd < 0,125 <0,5 4 < 0,125 1,0 2 us s 1428 ptococc aerobiu & 3 < 0,125 1.0 2 ptocóccus us 1264 ptostre] termedi PL, .5 1,0 8 1,0 acterium opionib nes 44 PL( Cd 0,5 <0,5 211 96 804 Tablica IV 12 Badany. zwiazek 3 erytro- rnycyna Mcefalo- tyna 6 2 actei C3 c- o Propi< acnes < 0,126 <0,5 1,0 Wrazliwosc wyodrebnionych bakterii anaerobowych Minimalne stezenie wstrzymujace rozwój, po godzinach (ng/ml) i 'Sb cd es fr gilis 2 2 u Bacte lis sp. 1877 <0,125 4 128 , ' W cd es fr gilis 2 2 U Bacte lis sp 1936B < 0,125 4 128 «fH U) cd , co •fi .2 3 w «S H u . o i Bacte lis sp taomi < 0,125 4 64 i •r4 &D cd co es fr Igatu 2 * o u Bacte lis sp. 1563 < 0,125 2 8 j 'Sb cd co za 2 s o »-i Bacte lis sp. 1211 < 0,125 2 4 24 q ^ r«» icterium •sum 14' co o Fusob symbi < 0,125 <0,5 64 8 ^ .2 S o u -*- O 8 -S Cd rv Fusob necro] 13859 < 0,125 2 <0,5 cd 22 3 § 2 w G CO Veillo alcale < 0,125 1 <0,5 zowa. Po uplywie 90 minut mieszanine poreakcyjna oziebiono zanurzajac naczynie reakcyjne na 90 mi¬ nut w lazni lodowo-wodnej. Wytracil sie osad, któ¬ ry oddzielono od brazowej mieszaniny. Krystaliczny produkt przemyto 4 razy mieszanina lodu, wody i etanolu w stosunku 1:1:1, wykorzystujac do tego celu 1 litr mieszaniny. Produkt suszono na powietrzu w temperaturze 100°C i zidentyfikowano jako l-metylo-5-nitro-2-styryloimidazol. Posiadal on temperature topnienia okolo 191—192°C, ciezar 582 g.W trójszyjnej okraglodennej 5-litrowej kolbie, zaopatrzonej w mieszadlo i rurke do wprowadzania gazu, przygotowano roztwór 454 g (2,0 mole) 1-me- tylo-5-nitro-2-styryloimidazolu w mieszaninie 2,5 litrów metanolu, 1,5 litrów dwuchlorometanu i 200 ml wody. Kolbe utrzymywano w temperaturze po¬ kojowej za pomoca lazni wodnej. Przez roztwór przepuszczono mieszanine ozonu i tlenu (3*/© 03 w 1,1 litrze na minute). Tworzenie sie ózonku kontro¬ lowano w pewnych przedzialach czasu za pomoca chromatografii gazowo-cieczowej i chromatografii cienkowarstwowej. Calkowity czas trwania ozono- lizy wynosil okolo 25 godzin i po uplywie tego czasu barwa roztworu zmienila sie na jasnozólta.Roztwór 594 g jodku sodowego w 2 litrach wody i 400 ml kwasu octowego mieszano w okragloden¬ nej, 10-litrowej kolbie, do którego stosunkowo szyb¬ ko wlano roztwór po ozonolizie, utrzymujac tem¬ perature ponizej 40°C za pomoca lazni lodowo-wod¬ nej. Po okolo 10 minutach mieszania dodano roz¬ twór pirosiarczynu sodowego (192 g w dwóch lit¬ rach wód*") w celu usuniecia wolnego jodu i przy¬ wrócenia zóltej barwy roztworu. Z kolei mieszanine mieszano jeszcze przez okolo 1 godzine, a nas¬ tepnie przesaczono odrzucajac zólte krysztaly. Prze¬ sacz zatezono pod próznia do okolo 1/3 objetosci i zobojetniono , do wartosci pH 6,5 przez dodanie, z mieszaniem, stalego wodoroweglanu sodowego, w ilosci okolo 300 g. Mieszanine ekstrahowano 4 por¬ cjami po 700 ml octanu etylu, po czym polaczone wyciagi suszono nad bezwodnym siarczanem mag¬ nezowym przez okolo pól godziny. Po odsaczeniu srodka suszacego przesacz odparowano pod zmniej¬ szonym cisnieniem otrzymujac kleista pozostalosc.Pozostalosc rozpuszczono w okolo 2,5 1 n-heksanu, po czym roztwór ogrzewano pod chlodnica zwrotna przez okolo 15 minut, a resztki brazowego stalego materialu usunieto przez saczenie.Po ochlodzeniu z przesaczu wytracily sie zólte 3i krysztaly, które odsaczono i wysuszono pod próznia w temperaturze 40°C. Przesacz wykorzystano po¬ nownie ogrzewajac pod chlodnica zwrotna wyzej wymieniony brazowy material resztkowy i prze¬ prowadzajac cztery takie ektrakcje. W ten sposób uzyskano ogólem okolo 146 g produktu o tempera¬ turze topnienia okolo 81—83°C, który zidentyfiko¬ wano jako l-metylo-5-nitroimidazolo-2-karboksy- aldehyd.Przyklad II. Synteza 5-amino-l-metylo-3-(l- 40 -metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-karbonitry- lu.Mieszanine 23,5 g (0,152 mola) l-metylo-5-nitro- imidazolilo-2-karboksyaldehydu i 7,0 g (0,152 mola) metylohydrazyny w 300 ml chloroformu ogrzewano 45 w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna przez okolo 2 godziny, po ozym mieszanine poreakcyjna odparo¬ wano do sucha otrzymujac okolo 25,5 jasnozóltego ciala stalego. Mala próbka tej substancji po prze- krystalizowaniu z etanolu posiadala temperature 50 topnienia okolo 175°C i zidentyfikowano ja jako metylohydrazon l-metylo-5-nitroimidazolilo-2-kar- boksyaldehyd.Do mieszanego roztworu 23,5 g (0,128 mola) me- tylohydrazonu l-metylo-5-nitroimidazolilo-2-karbo- 55 ksyaldehydu w 200 ml chloroformu dodano powoli, w temperaturze pokojowej, 22,9 g (0,128 mola) N- -bromosukcynimidu. Reakcja byla nieznacznie izo- termiczna i temperature roztworu utrzymywano po¬ nizej 30°C za pomoca dorywczego chlodzenia zew- 60 netrznego. Po mieszaniu przez okolo 2 godziny chlo¬ roform usunieto pod próznia, a pozostalosc ekstra¬ howano za pomoca 5 porcji po 100 ml goracego czterochlorku wegla. Nierozpuszczalna pozostalosc usunieto, a polaczone wyciagi w czterochlorku we- 65 gla zatezono otrzymujac jasnozólte cialo stale, które96 804 13 14 zidentyfikowano jako metylohydrazon bromku 1- metylo-5-nitroimidazolilo-2-karbonylu z wydajnos¬ cia 31,0 g. Chromatografia cienkowarstwowa wyka¬ zala, ze zwiazek byl prawie czysty.Poniewaz zwiazek byl nietrwaly i posiadal wlas¬ ciwosci lzawiace i parzace, to wykorzystano go na¬ tychmiast w nastepnym etapie syntezy.Tak otrzymany bromohydrazon, w ilosci 31,0 g (0,118 mola), zawieszono w 250 ml bezwodnego me¬ tanolu i dodano 7,80 g (0,118 mola) swiezo przedes- tylowego nitrylu kwasu malonowego. Utrzymujac temperature okolo 10—20°C do mieszaniny reak¬ cyjnej wkroplono roztwór 12 g (0,118 mola) tróje- tyloaminy w 25 ml metanolu. Reakcja przebiegala lekko egzotermicznie.Poczatkowo zólta zawiesina rozpuscila sie a na jej miejsce po uplywie okolo 1—2 godzin utwo¬ rzyla sie inna zawiesina. Wtedy mieszanine reak¬ cyjna przesaczono i zebrano staly produkt, który przemyto metanolem, a nastepnie woda i wysu¬ szono. Produkt ten wazyl okolo 23 g, posiadal tem¬ perature topnienia powyzej 300°C i zidentyfikowa¬ no go jako 5-amino-l-metylo-3-(l-metylo-5-nitro-2- -imidazolilo)pirazolo-4-karbonitryl. Po wydzieleniu produkt byl analitycznie czysty.Przyklad III. Synteza 5-amino-l-metylo-3-(l- -metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-karbona- mid.Do mieszaniny 3 ml stezonego kwasu siarkowego i 2 ml absolutnego etanolu dodano 1,0 g 5-amino- -l-metylo-3-(l-metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo- -4-karbonitrylu, po czym calosc ogrzewano na lazni parowej przez okolo 1 godzine. Po uplywie tego czasu do mieszaniny dodano 10 ml wody i pozos¬ tawiono ja przez noc w temperaturze otoczenia.Wytracil sie osad, który odsaczono i przekrystali- zowano z handlowego absolutnego etanolu uzys¬ kujac produkt w postaci stalej o temperaturze top- nienia 255—256°C. Na podstawie widma NMR pro¬ dukt ten zidentyfikowano jako 5-amino-l-metylo- -3-(l-metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-kairbo- namid. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych podstawionych pochodnych pirazolu o wzorze 1, w którym R oz¬ nacza grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, R1 20 oznacza grupe —NH2, a R2 oznacza grupe —CONH* znamienny tym, ze poddaje sie hydrolizie zwiazek o wzorze 2, w którym R i R1 maja wyzej podane znaczenie, a R2 oznacza grupe —CN.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 25 w przypadku wytwarzania 5-amino-l-metylo-3-(l- -metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-karbonami- du, 5- amino-1- metylo-3-(l-metylo-5-nitro-2-imida- zolilo)pirazolo-4-karbonitryl poddaje sie reakcji z kwasem siarkowym w obecnosci etanolu. CH3 W20H GH, Wzdr2 PL