PL93401B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zeaksantyny przy pomocy hodowli drobnoustroju z rodzaju Flavobacter, produkujacego ten barwnik, a zwlaszcza sposobu prowadzenia hodowli drobno¬ ustroju z rodzaju Flavobacter, produkujacego zeak- santyne, na podlozu zawierajacym co najmniej je¬ den weglowodan jako zródlo przyswajalnego wegla, co najmniej jedno zródlo przyswajalnego azotu aminowego, zawierajace wolne aminokwasy, oraz sole mineralne, oligoelementy i witaminy.

Zólty barwnik, znany pod nazwa zeaksantyny lub S^-dwuhydroksy-B-karotenu mozna stosowac np. jako dodatek do paszy dla drobiu w celu in¬ tensyfikacji zóltego zabarwienia skóry zwierzat lub barwy zóltek ich jaj. Zwiazek ten jest takze uzy¬ teczny jako barwnik w przemysle kosmetycznym i spozywczym.

Znane jest zjawisko syntetyzowania barwników przez okreslone drobnoustroje, a w szczególnosci synteza barwników karotenoidowych przez bakterie rodzaju Flavobacter. Jednak wytwarzanie w skali przemyslowej barwników tego rodzaju jest, jak dotychczas, trudne do wykonania i ze wzgledu na uzyskiwanie bardzo niskich wydajnosci produktu konieczne jest stosowanie bardzo duzych objetosci podlozy hodowlanych w celu otrzymania znaczniej¬ szych ilosci zadanego zwiazku.

Znany jest równiez sposób wzmagania wzrostu drobnoustrojów i wytwarzania produktów ich me- tabolizmu, polegajacy na dodawaniu do podloza hodowlanego soli mineralnych, oligoelementów i witamin lub innych substancji odpowiednio dzia¬ lajacych. Jednakze w przypadku wytwarzania zeaksantyny uzycie nawet najbogatszych podlozy hodowlanych nie zapewnia wytwarzania zeaksanty¬ ny w ilosci, wystarczajacej do nadania metodzie charakteru metody przemyslowej uzasadnionej eko¬ nomicznie.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania zea¬ ksantyny metoda biosyntezy, zapewniajaca otrzy¬ mywanie tego barwnika z wydajnoscia znacznie przewyzszajaca wydajnosci dotychczas uzyskiwane, bez wzrostu kosztów procesu.

Wedlug wynalazku, sposób wytwarzania zeaksan¬ tyny polega na tym, ze prowadzi sie hodowle drobnoustroju z rodzaju Flavobacter, produkujace¬ go ten barwnik, na podlozu, zawierajacym co naj¬ mniej jeden weglowodan jako zródlo- przyswajal¬ nego wegla, co najmniej jedno zródlo przyswajal¬ nego azotu aminowego, zawierajace wolne amino¬ kwasy, oraz sole mineralne, oligoelementy i wita¬ miny, przy czym modyfikuje sie sklad aminokwa- sowy podloza, zwiekszajac w podlozu zawartosc co najmniej jednego z aminokwasów, zawierajacych siarke, a mianowicie metioniny, cystyny i cysteiny, do 3—10% zawartosci innych aminokwasów obec¬ nych w podlozu, nie przekraczajac jednak wartosci 1 mg/ml i ustala zawartosc co najmniej jednego z dwuwartosciowych jonów metali, takich jak 93 4013 93 401 4 Fe++, Co++, Mo++, Mn++, w granicach 0,001— 0,1 mola.

Sposób wedlug wynalazku umozliwia uzyskiwa¬ nie barwnika ze zwiekszona wydajnoscia w porów¬ naniu do wydajnosci procesów, prowadzonych w znany sposób. W sposób wedlug wynalazku mozna wytwarzac zeaksantyne z wydajnoscia nawet czterokrotnie wyzsza od wydajnosci, uzyskiwanej w procesach, prowadzonych w znany sposób, za¬ leznie od wykonania. Taki wzrost wydajnosci wplywa na znaczne obnizenie kosztów procesu.

W sposobie wedlug wynalazku odpowiednim zródlem przyswajalnego wegla jest taki weglowo¬ dan, jak gUiko^TSBTslcharoza, uzyta w ilosci 0,1— % wag/wag' podlozaf — a odpowiednim zródlem przyswajalnego azotu* aminowego moze byc taki produkt,"jak.^atrakj drozdzowy i/lub namok kuku- ry^s^lJ$£}^hydix)Uzat bialka, uzyty w ilosci 0,1—8% wag/wag "pocfioza.

W sposobie wedlug wynalazku sklad podloza uzupelnia sie dodatkiem siarczanu magnezowego, uzytego w ilosci 04—2% wag/wag podloza.

Wszystkie substancje wyzej wymienione roz¬ ciencza sie woda wodociagowa, uzyta w ilosci ta¬ kiej, jaka jest konieczna do zrównowazenia skla¬ du podloza do 100% wag/wag.

Sklad aminokwasowy podloza mozna modyfiko¬ wac -przy pomocy dodawania ustalonych ilosci metioniny i/lub cystyny i/lub cysteiny w odmianie Lr i/lub D i/lub DL. Korzystnie zawartosc metioni¬ ny i/lub cystyny ,i/lub cysteiny w podlozu dopro¬ wadza sie do wartosci 3—10% zawartosci innych aminokwasów w podlozu.

Do tak przygotowanego podloza wprowadza sie inokulum drobnoustroju z rodzaju Flavobacter, produkujacego zeaksantyne. W sposobie wedlug wynalazku stosuje sie drobnoustrój z rodzaju Fla- vobacter, stanowiacy szczep wyselekcjonowany sposr'd bakterii tego rodzaju i mutantów tego drobnoustroju. Proces biosyntezy moze zachodzic przy mieszaniu i napowietrzaniu, przy odpowied¬ niej wartosci pH i we wlasciwej temperaturze, w okresie czasu, koniecznym do wytworzenia we¬ wnatrz komórek drobnoustroju znacznej ilosci zea¬ ksantyny.

^Nastepnie hodowle suszy sie, ewentualnie po natezeniu, po czym zeaksantyne ekstrahuje sie z komórek przy pomocy polarnego rozpuszczalnika . organicznego, takiego jak aceton, alkohol etylowy lub rozpuszczalnik, zawierajacy chlor, taki jak chloroform. Mozna tez biomase wydzielic z pod¬ loza hodowlanego przy pomocy wirowania, dekan- tacji lub saczenia i uzyc bezposrednio jako doda¬ tek do paszy dla drobiu.

Stwierdzono, ze w tak otrzymanej biomasie ste¬ zenie zeaksantyny jest o okolo 50% wyzsze od stezenia, uzyskiwanego w przypadku wzrostu tego jsamego drobnoustroju na zwyklym podlozu. Stwier¬ dzono takze, ze wzrost ten nie zalezy od bez¬ wzglednej ilosci metioniny i/lub cystyny i/lub cy- . steiny, dodanej do podloza wyjsciowego, natomiast zalezy od wzglednej ilosci metioniny i/lub cysty¬ ny i/lub cysteiny w stosunku do ilosci aminokwa¬ sów, obecnych w podlozu wyjsciowym lub hodow¬ lanym.

Stwierdzono równiez wystepowanie hamujacego wplywu, wywieranego przez aminokwasy zawie¬ rajace siarke, obecne w podlozu w ilosci, przekra¬ czajacej okreslony poziom, na wzrost ilosci zea- ksantyny w komórkach drobnoustroju. Z tego po¬ wodu ilosc dodawanej do podloza metioniny i/lub cystyny i/lub cysteiny nie moze przekraczac war¬ tosci 1 mg/ml.

Stwierdzono takze wystepowanie zjawiska, po- dobnego do wyzej opisanego, w przypadku doda¬ nia do podloza wyjsciowego co najmniej jednego rodzaju jonów metali dwuwartosciowych, a mia¬ nowicie Fe++, Co++, Mn++ i Mo++, przy jedno¬ czesnym, nie dodaniu do podloza co najmniej jed- nego z aminokwasów, zawierajacych siarke, a mia¬ nowicie metioniny i/lub cystyny i/lub cysteiny.

Wplyw wyzej opisanych jonów w tych warunkach przejawia sie zwiekszeniem stezenia zeaksantyny w biomasie o okolo 50%, oraz wzrostem ilosci Ipio- M masy równiez o okolo 50%, a wiec lacznie okolo dwukrotnym zwiekszeniem wydajnosci zeaksantyny w stosunku do wydajnosci uzyskiwanej w przy¬ padku wzrostu tego samego 'drobnoustroju na zwyklym podlozu.

Sklad podloza pod wzgledem zawartosci oligo- elementów mozna modyfikowac przy pomocy do¬ dawania co najmniej jednego rodzaju jonów metali dwuwartosciowych, a mianowicie Fe++ i/lub Co++ i/lub Mn++ i/lub Mo++, w ilosci, nie przekracza- J3ceJ °>2 mola w celu unikniecia wywarcia wply¬ wu hamujacego wzrost ilosci zeaksantyny w ko¬ mórkach drobnoustroju.

Korzystnie dodaje sie opisane wyzej jony metali w ilosci O,O0Q5-^fl,l mola. Szczególnie korzystnie dodaje sie jony metali w ilosci Q,*K)1—0,05 mola.

Opisane wyzej jony metali dodawac mozna w po¬ staci rozpuszczalnych soli, takich jak siarczan zela¬ zowy, chiorek zelazawy, chlorek kobaltawy, molib- deisian sodu lub siarczan manganu. 40 Korzystnie dodaje sie aminokwas taki, jak me¬ tionina, oraz jon metalu taki, jak Fe++.

Stwierdzono wystepowanie efektu synergicznego w przypadku jednoczesnego dodania do podloza co najmniej jednego sposród wyzej opisanych amino- 45 kwasów, zawierajacych siarke i co najmniej jed¬ nego sposród wyzej opisanych rodzajów jonów metalu. Wydajnosc zeaksantyny moze wtedy byc nawet czterokrotnie wyzsza od wydajnosci, uzyski¬ wanej w przypadku wzrostu tego samego drobno- 50 ustroju na zwyklym podlozu.

W uzyskanym w sposób wedlug wynalazku wzroscie wydajnosci zeaksantyny, udzial wzrostu stezenia zeaksantyny w biomasie jest niemal dwu¬ krotnie wiekszy od udzialu wzrostu ilosci biomasy. 55 Wynalazek objasniaja nastepujace przyklady: Przyklad I. Sporzadzono podloze o naste¬ pujacym skladzie: Glukoza 3 % Hydrolizat kazeiny (Trypton) 1 % 60 Ekstrakt drozdzowy 1 %^ Siarczan magnezowy 0,5% Woda wodociagowado 100 % Otrzymane podloze rozlano do kolb, wysterylizo- wano w ciagu 20 minut w temperaturze 120°C, 65 po czym oziebiono do temperatury 25°C. Wartosc93 401 6 pH podloza po sterylizacji wynosila 7,3. Nastep¬ nie sterylne podloze posiano inokulum mutanta szczepu ATCC nr 21588 rodzaju Flavobacter, otrzymanego w sposób jak opisano w patencie RFN nr 2 252 364. Hodowle inkubowano w ciagu 48 godzin w temperaturze 25°C, przy stalym na¬ powietrzaniu podloza przy pomocy wytrzasania kolb na trzesawkach obrotowych o 200 obro¬ tach/minute. Nastepnie zawartosc kolb odwirowa¬ no, wydzielajac biomase, która zawiera 10,5 g su¬ chej substancji/l litr brzeczki fermentacyjnej.

Ilosc zeksantyny, zawartej w komórkach, ozna^ czono przy pomocy pomiaru gestosci optycznej eks¬ traktu z komórek. W celu uzyskania ekstraktu sporzadzono zawiesine komórek w 5 ml roztworu chlorku sodowego, dodano do niej taka sama ilosc acetonu, nastepnie otrzymana mieszanine wytrza¬ sano w ciagu kilku minut, po czym przesaczono.

Optyczna gestosc przesaczu mierzono spektrofoto¬ metrem w swietle o dlugosci fali 450 nanometrów.

Ilosc zeaksantyny ustalono przez porównanie zmie¬ rzonej wartosci gestosci optycznej z krzywa stan¬ dardowa, wykreslona na podstawie pomiaru ge¬ stosci optycznej serii roztworów, zawierajacych rózne ilosci czystej zeksantyny.

W opisany wyzej sposób dokonano ekstrakcji i pomiaru gestosci optycznej kilku próbek, pobra¬ nych z tej samej hodowli i z otrzymanych wyrii- ków wyciagnieto srednia arytmetyczna. Ilosc zek¬ santyny, zawartej w kom'rkach, albo stezenie wlasciwe zmierzone w sposób, jak wyzej opisano, wynosi 5,16 mg zeksantyny/g biomasy, co odpo¬ wiada wydajnosci 54,2 mikrograma zeksantyny/ml brzeczki. Dokladnosc oznaczen wynosi okolo 3—5%.

Nastepne przyklady podano w postaci tablicy.

W ponizszej tablicy w kolumnie, zatytulowanej „sposób postepowania", wykazano rodzaj i ilosc substancji, dodanych do podloza hodowlanego.

Ilosc wyrazono, w przypadku aminokwasu w g/litr podloza, a w przypadku jonów, w stezeniu molo¬ wym w podlozu. W kolumnie, zatytulowanej „zeksantyna", podano ilosc zeksantyny, otrzymy¬ wana w mikrogramach/ml brzeczki fermentacyj¬ nej. Kolumna, zatytulowana „masa komórkowa", zawiera ilosci suchej substancji, wytwarzanej w gra¬ mach/litr brzeczki. W kolumnie, zatytulowanej „stezenie wlasciwe", zamieszczono ilosci zeaksanty¬ ny, obecnej w komórkach w mg/g suchej substan¬ cji.

W kazdym przykladzie proces prowadzono w Przyklad Nr 1 I II III IV V VI VII 1 VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX XXI XXII Tablica Sposób postepowania Rodzaj substancji dodanej 2 Bez dodatku Metionina Metionina Metionina Metionina Cystyna Cysteina Fe++ Fe++ Co+ + Mo+ + Mn+ + Metionina Fe+ + Metionina Fe++ Cysteina Fe+ + Cystyna Metionina Mn+ + Metionina Co+ + Cystyna Mn+ + Metionina Fe++ Metionina Fe++ • Metionina Fe++ Ilosc sub. dod. g/l 3 0,06 0,12 0,24 0,48 0,12 '. 0,12 - — — - — 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 — 0,12 0,12 0,12 - 0,12 0,12 M 4 _ - — — - .. — — 0,002 0,01 0,001 0,002 0/102 0,002 0,01 0,002 — 0,002 0,001 0,002 — 0,002 0,002 0,002 Zeaksantyna F-g/ml 54,2 65,8 77,0 72.0 50,3 71,4 730 118,8 124,4 91,4 88,0 86,0 168 188 151,4 143,2 146,2 131,1 134,6 156,4 165,0 168,0 \ Masa komórkowa g/l 6 ,5 ,7 8,3 7,6 6,1 11,5 ,8 14,5 13,8 9,9 ,5 11,6 11,6 9,6 13,9 14,0 14,8 11,6 12,6 13.4 • 13,2 12,7 Stezenie wl. mg/g 7 ,16 6,14 9,27 9,47 8,24 6,2 6,75 8,19 9,01 9,23 8,38 7,41 14,48 19,5 ,8 ,3 9,8 11,3 ,6 11,67 12,5 13,27 93 401 8 sposób, jak opisano powyzej w przykladzie I. Ope¬ racja dodania do podloza aminokwasu, zawieraja¬ cego siarke i/lub jonu metalu dwuwartosciowe- go odbywa sie tuz przed posianiem podloza inoku- lum, albo przed sterylizacja podloza. Dokladnosc danych, zamieszczonych w rubrykach, zatytulo¬ wanych „zeaksantyna" i „masa komórkowa", jest taka sama, jak opisano powyzej w przykladzie I i wynosi 3—5%. Dane te stanowia srednie arytme¬ tyczne, wyciagniete z wyników badania 3—6 pró¬ bek, pobranych z tej samej hodowli.

W ostatnich przykladach wprowadzono zmiany do skladu podloza wyjsciowego oraz zmieniono typ. inokulum, w celu wykazania niezaleznosci wyni¬ ków procesu od odchylen w skladzie podloza oraz od wydajnosci poszczególnych mutantów. Np. w przykladzie XX podloze wyjsciowe zawiera 2% ekstraktu drozdzowego i 1% hydrolizatu kazeiny, a w przykladzie XXI podloze wyjsciowe zawiera 1% ekstraktu drozdzowego i 2% hydrolizatu ka¬ zeiny.

Claims (2)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania zeaksantyny poprzez ho¬ dowle drobnoustroju z rodzaju Flavobacter, pro¬ dukujacego zeaksantyne, w srodowisku odzywczym, zawierajacym co najmniej jeden weglowodan, wol¬ ne aminokwasy, sole mineralne, oligoelementy i witaminy, znamienny tym, ze stosuje sie sro¬ dowisko o zawartosci co najmniej jednego z zawie¬ rajacych, siarke aminokwasów, takich jak metio¬ nina, cystyna lub cysteina, w granicach 3—10% zawartosci innych zawartych w srodowisku amino¬ kwasów, nie przekraczajac jednak zawartosci 1 mg/ml i o zawartosci co najmniej jednego z dwu- wartosciowych jonów metali, takich jak Fe++, Co++, Mo++ i Mn++, w granicach 0,001—0,1 mola.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako aminokwas stosuje sie metionine, a jako jon metalu Fe+ + . OZGraf. Lz. 1109 (105+25 egz.) Cena 10 zl