Opis patentowy opublikowano: 15.09.1977 91607 MKP C07c 103/52 Int. Cl.2 C07C 103/52 CZYISLNIA Twórca wynalazku: Uprawniony z patentu: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT., Budapeszt (Wegry) Sposób wytwarzania nowych peptydów o aktywnosci ACTH oraz ich soli addycyjnych z kwasami amidów i estru benzylowego Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania no¬ wych peptydów o aktywnosci ACTH zawieraja¬ cych na obu koncach czasteczki kwasy a-amino- oksykarboksylowe o wzorze ogólnym H-O-OSer- -Tyr-Ser-Met-Glu-His-Fen-Arg-Trp-Gly-Lys - Pro- -Val-Gly-(Lys)n-X,w którym n oznacza liczbe cal¬ kowita 3 lub 4, a X oznacza grupy -OLys-OH, -O-OLys-OH lub -OGly-OH jak równiez ich soli addycyjnych z kwasami, amidów i estru benzylo¬ wego.Jak wiadomo, lancuch peptydowy hormonu adre- nokortykotropowego (ACTH) moze byc modyfiko¬ wany bez obawy zaniku jego adrenokortykotropo¬ wej aktywnosci. Z C-koncowej czesci lancucha aminokwasowego moze byc usunieta ponad jedna trzecia czesc czasteczki i nie powoduje to obnize¬ nia jego okreslonej aktywnosci, jednak odszczepie- nie dalszych aminokwasów prowadzi do wyrazne¬ go spadku aktywnosci. Peptyd z sekwencja amino¬ kwasów 1—9 hormonu ACTH wykazuje 30°/o aktywnosci oryginalnej czasteczki, podczas gdy aktywnosc fragmentu 1—16 ACTH wynosi tylko okolo l°/o w porównaniu z substancja wyjsciowa.Usuniecie natomiast pierwszego aminokwasu z N- -koncowej czesci czasteczki prowadzi do 50% spad¬ ku aktywnosci (E. Schroder, K. Lubke; The Pepti- des, Academie Press, New York, 1966, str. 246—9).Fragmenty ACTH, w których N-koncowa grupa seryny zastapiona jest D-aminokwasem, (nienatu¬ ralnym aminokwasem lub grupa acylowa otrzy- mana przez pominiecie grup funkcyjnych seryny np. grupy 'p-hydroksypropionylowej lub propiony- lowej wykazuja czasami aktywnosci przewyzsza¬ jace aktywnosc naturalnego ACTH. Przypuszczal¬ nie powodem tego jest fakt, ze te fragmenty ACTH zmodyfikowanych zwiazków sa odporne na dzia¬ lanie enzymów typu aminopeptydazy i szybkosc ich rozpadu w organizmie jest mniejsza w porów¬ naniu z naturalnym ACTH. Skutkiem tego zmody¬ fikowane fragmenty ACTH wykazuja silna adre- nokortykotropowa aktywnosc nawet w tych wa¬ runkach gdy modyfikujaca grupa nie moze calko¬ wicie spelniac roli N-koncowej czasteczki seryny naturalnego hormonu.Fakt, ze spadek aktywnosci pochodnych amido¬ wych w C-koncowej czesci czasteczki nastepuje wolniej 'niz w przypadku peptydów zawierajacych wolne grupy karboksylowe i zmniejszona ilosc ami¬ nokwasów, poczawszy od C-koncowego ugrupowa¬ nia czasteczki lancucha powodowany jest ta sama przyczyna, mianowicie, wiekszosc enzymów karbo- ksypeptydazy nie rozklada amidów peptydowych.Dlatego przypuszcza sie, ze podstawienie grupa amidowa C-koncowej grupy karboksylowej daje ten sam efekt ochraniajacy jak w przypadku za¬ stapienia N-koncowej czasteczki seryny. W toku ostatnio prowadzonych badan stwierdzono jednak, ze pewne enzymy typu karboksypeptydazy zdolne sa odszczepiac nawet G-koncowe czasteczki ami¬ nokwasów amidów peptydowych (J.D. Glass i wsp.; 916073 Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 63, 1426, 1969). Zgodnie z faktem, ze nawet te enzymy nie moga hydroli- zowac podstawionych amidów mozna przypusz¬ czac, ze fragmenty ACTH zawierajace podstawione grupy mjiidowe w C-koncowym ugrupowaniu cza- 5 steczki lancucha ulegac beda w organizmie wol¬ niejszemu rozpadowi i w zwiazku z tym wykaza zwiekszona czynnosc biologiczna w porównaniu z prostymi amidami. Potwierdzili to badacze nie¬ mieccy, którzy na drodze syntezy otrzymali pewne io pochodne heptadekapeptydoalkiloamidowe wyka¬ zujace silne dzialanie adrenokortykotropowe (opis patentowy RFN nr 1.954.794).Stwierdzono, ze w przypadku zastapienia oby¬ dwu kancowych aminokwasów 1—17, 1—18 lub 15 1—19 fragmentów czasteczki ACTH przez kwasy a-aminooksykarboksylowe otrzymuje sie zwiazki o zwiekszonym adrenokortykotropowym dzialaniu.Zwiazki o szczególnie wysokiej aktywnosci otrzy¬ muje sie przez zastapienie N-koncowej czasteczki 2o seryny 1—18 fragmentu ACTH przez kwas D-a- -aminooksy - (3 - hydroksypropionowy z równoczes¬ nym zastapieniem ,C-koncowej czasteczki argininy tego samego fragmentu kwasem L lub D-a-ami- nooksy-e-aminokapronowym. 25 Wynalazek dotyczy wiec sposobu wytwarzania nowych peptydów o aktywnosci ACTH, posiadaja¬ cych kompletna sekwencje hormonu ACTH od N- -koncowego aminokwasu przynajmniej do 17-go aminokwasu ale najwyzej do 19-go aminokwasu 30 i posiadajacych dowolne inne aminokwasy w miej¬ scu poszczególnych aminokwasów sekwencji ACTH i zawierajacych zawsze kwas a-aminooksykarbo- ksylowy w miejscu pierwszego i ostatniego amino¬ kwasu. 35 Wynalazek dotyczy równiez sposobu wytwarza¬ nia addycyjnych soli z kwasami oraz amidów i estru benzylowego.W wymienionych wyzej podstawionych pepty- dach poszczególne aminokwasy naturalnej sekwen- 40 cji moga byc zastapione innymi aminokwasami pod warunkiem, ze nie powoduja one wyraznego spad¬ ku aktywnosci ACTH, a zatem drugi aminokwas (tyrozyne) zastepuje sie fenyloalanina i/lub trzeci aminokwas (seryne) zastepuje sie glicyna iAub 45 czwarty aminokwas (metionine) zastepuje sie leu- cyna;, norwalima, norleucyna lub kwasem a-amino- maslowym i/hib piaty aminokwas (kwas glutami¬ nowy) zastepuje sie glutamina i/lub aminokwasy pietnasty i szesnasty (lizyny) zastepuje sie orni- 50 tyna iAub aminokwasy siedemnasty i osiemnasty (argininy) zastepuje sie lizyna lub ornityna.Najbardziej korzystnymi zwiazkami z uwagi na ich adrenokortykotropowe aktywnosci sa (D-OSer1.OLiz18)-a 1—18NH2-ACTH i (D-OSer^, D-OLiz18- 55 -al—18NH2-ACTH, w których OSer oznacza kwas a-aminooksy-p-hydroksypropionowy rózniacy sie od seryny tylko pojedynczym atomem tlenu po¬ miedzy atomem wegla w pozycji a i grupa amino¬ wa. W opisie wynalazku zastosowano skróty dla eo oznaczenia kwasów a-aminooksykarboksylowych posiadajacych budowe zblizona do aminokwasów np. OLiz oznacza kwas a-aminooksy-E-aminoka- pronowy itd.Wedlug wynalazku, nowe peptydy o aktywnosci 05 4 ACTH, jak równiez ich gole addycyjna* z frwasatmi, pochodne i kompleksy otrzymuje sie w ten sposób, ze w produkcie wyjsciowym bedacym podstawio¬ nym peptydem o wzorze ogólnym Q^D-OSer-Tyr- -Ser-Met-Glu - (OR) - His - Fen - Arg - Trp - Gly- -Lys(<^-Pro-Val-Gly-[Lys(Q)]-X', w którym n = 3 lub 4, X' oznacza grupy -OLys(Q)-Y, -D-OEys(Q)- -Y lub -OGly-Y, w których Y oznacza grupy -OR lub -NH2 przy czym R oznacza zwykla karboksy¬ lowa grupe chroniona korzystnie III rzed. grupa butylowa lub benzylowa, Q oznacza aminowa gru¬ pe chroniona korzystnie grupe benzyloksykarbony- lowa lub formylowa przy czym wystepujace w peptydzie grupy Q wzglednie R moga byc takie same lub rózne, usuwa sie grupy ochraniajace na drodze jednego lub wiecej etapów i ewentualnie przeprowadza w sole addycyjne z kwasami, amidy lub ester benzylowy o kompletnej sekwencji ACTH, poczawszy od N-koncowego aminokwasu przynajmniej do 17-go aminokwasu, najdalej do 19-go aminokwasu, lecz zawierajacym inne dowol¬ ne a-aminokwasy w miejsce poszczególnych ami¬ nokwasów sekwencji ACTH, przy czym zawsze zawierajacym kwas a-aniinooksykarboksylowy w miejscu pierwszego i ostatniego aminokwasu i za¬ wierajacy grupy chroniace przynajmniej na kon¬ cowej grupie oksyaminowej oraz na grupach ami^ nowych lancuchów bocznych i ewentualnie na koncowych grupach karboksylowych oraz grupach karboksylowych lancuchów bocznych, usuwa sie grupy ochraniajace na drodze jednego lub wiecej etapów i ewentualnie przeprowadza w sole addy¬ cyjne z kwasami, amidy lub ester benzylowy.Sposobem wedlug wynalazku chronione peptydy stosowane jako zwiazki wyjsciowe otrzymuje sie z odpowiednich kwasów a-aminooksykarboksylo¬ wych i aminokwasów droga czesciowej konden¬ sacji lub stopniowego wprowadzania poszczegól¬ nych aminokwasów we wlasciwej sekwencji. W wymienionych procesach kondensacji stosuje sre metody z uzyciem bezwodników, azydków, aktyw¬ nych estrów lub prowadzi sie kondensacje z uzy¬ ciem dwueykloheksylokarbodwuimidu (DCC). Sta¬ suje sie równiez synteze w fazie^stalej polegajaca na tym, ze peptyd przylaczony do polimeru jego koncowa grupa karboksylowa ulega rozbudowie przez polaczenie C-koncowej grupy a-aminooksy¬ karboksylowej z polimerem zawierajacym amino¬ kwasy i z koncowym kwasem a^aminooksykar^bo- ksylowym w odpowiedniej sekwencji. " Grupy aktywne nie biorace udzialu w reakcji podstawione sa odpowiednimi grupami chroniacy¬ mi, latwo usuwalnymi droga hydrolizy, hydrolizy kwasowej, hydrazynolizy lub redukcji. Grupy kar¬ boksylowe zazwyczaj chronione sa grupami estro¬ wymi np. grupa metylowa, III rz-butylowa, ben¬ zylowa, p-chlorobenzylowa lub p-nitrobenzylowa lub droga przeksztalcenia ich w grupy amidowe.Grupy aminowe i oksyaminowe chronione sa korzystnie grupami — tozylowa, tritylowa, formy¬ lowa, trójfluoroacetyIowa, o-nitrosulfenylowa, fta- lilowa, benzylooksykarbonylowa, p-chlorofeenzylo- oksykarbonylowa, a szczególnie korzystnie grupa III rz-butoksykarbonylowa. Grupe guanidynowa czasteczki argininy ochrania sie grupa nitrowa lub5 przeprowadza w farme protonowana. Grupe ami¬ dowa histydyny ochrania sie grupa benzylowa, tri- tylowa lub grupa dwunitrofenylowa.Grupy hydroksylowe znajdujace sie w lancu¬ chach bocznych ochrania sie przeprowadzajac je 5 w ugrupowania eterowe, przy czym korzystne jest tworzenie eterów III rz-butylowych i benzylowych.Odpowiedni dobór grup chroniacych pozwala uzy¬ skac zwiazki ulegajace selektywnemu odbiciu, a wiec pozbawieniu grup ochraniajacych lub ulega- 10 jace odbiciu jednoetapowemu ogólnie znanymi spo¬ sobami, np. przez hydrolize, hydrolize kwasowa, hydrazynoiize lub redukcje.Sposobem wedlug wynalazku chronione kwasy a-aminooksykarboksylowe kondensuje sie z estrem 15 metylowym trójpeptydu o wzorze Tyr-Ser-Met- -OCH3, otrzymany podstawiony ester metylowy te- trapeptydu przeprowadza sie w hydrazyd, a na¬ stepnie w azydek, po czym zwiazkiem tym acyluje sie dekapeptyd o wzorze GlutOBu^-His-Fen-Arg- 20 Trp-Gli-Liz(BOC)-Pro-Wal-Gli. Otrzymany w ten sposób podstawiony tetradekapeptyd kondensuje sie z estrem chronianego peptydu utworzonego z aminokwasów w odpowiedniej sekwencji, a otrzy¬ many, podstawiony ester peptydu przeprowadza sie 25 w hydrazyd, nastepnie w azydek i zwiazkiem tym acyluje sie odpowiednio chroniona pochodna C- -koncowego kwasu a-aminooksybarkoksylowego, np. podstawiony tetradekapeptyd kondensuje sie z estrem 15—16 dwupeptydu,-estrem 15—17 trój- 39 peptydu lub estrem 15—18 tetrapeptydu i otrzymu¬ je sie odpowiednio podstawiony heptadekapeptyd, oktadekapeptyd lub nonadekapeptyd. W syntezie tej korzystne jest stosowanie reakcji z uzyciem dwucykloheksylokarbodwuimidu (DCC) lub aktyw- 35 nych estrów, np. estru pieciochlorofenylowego lub pieciofluorofenylowego, przy czym estry te- nie musza byc oddzielnie otrzymywane lecz tworzy sie je bezposrednio w srodowisku reakcji dzialajac na podstawiony tetradekapeptyd pieciochlorofenolem 40 lub pieeiofluorofenolem i DCC (brytyjski opis pa¬ tentowy nr 1.201.053).Inny sposób postepowania polega na tym, ze odpowiednio chroniona pochodna kwasu amino- oksykarbóksylowego acyluje sie odpowiednio chro- 45 nionym 15—16 dwupeptydem, 15—17 trójpeptydem lub 15—18 tetrapeptydem, Nnkoncowa grupe oehra-< niajaca selektywnie usuwa sie, a otrzymany zwia¬ zek kondensuje sie z podstawionym tetradekapep- tydem i otrzymuje sie odpowiednio chroniony pep- 50 tyd zawierajacy kwasy aminooksykarboksylowe na obydwu koncach czasteczki. W ostatnim etapie syntezy III rz-butoksykarbonylowe grupy, chro¬ niace N-koncowe grupy a-aminooksykarboksylowe i grupy aminowe lancuchów bocznych, estrowe 55 grupy III rz^butylowe chroniace grupy hydroksy¬ lowe lancuchów bocznych oraz C-koncowe grupy karboksylowe jesli nie zostaly one podstawione grupami amidowymi, jak równiez III rz-bulylowe grupy eterowe ochraniajace grupy hydroksylowe 60 lancuchów 'bocznych odbija sie równoczesnie me¬ toda hydrolizy"kwasowej np. dzialajac kwasem trójfluorooctowym.W przypadku gdy wyjsciowy, chroniony peptyd zawiera równiez grupy, których nie mozna usunac 65 6 dzialaniem kwasu trójfluorooctowego* np. grupy fermylowe, usuwa sie je przed lub po odbiciu po¬ zostalych grup chroniacych na odpowiednim eta¬ pie syntezy. Produkt koncowy, pozbawiony grup ochraniajacych oczyszcza sie metoda ekstrakcji przeciwpradowej lub za pomoca chromatografii kolumnowej np. na zywicach jonowymiennych z uzyciem róznych typów karboksymetylocehilozy.Zaleznie od metod syntezy i warunków reakcji nowe zwiazki otrzymuje sie w formie wolnych zasad lub soli, przy czym sole te przeprowadza sie w wolne zasady ogólnie znanymi sposobami.Zwiazki w postaci wolnych zasad przeprowadza sie w dopuszczalne w lecznictwie sole" addycyjne z kwasami dzialaniem kwasów organicznych lub mi¬ neralnych np. kwasu solnego, siarkowego, fosfo¬ rowego, mrówkowego, octowego, mlekowego, wi¬ nowego, cytrynowego, wyzszych kwasów tluszczo¬ wych i innych.Pochodnymi nowych zwiazków otrzymanymi spo¬ sobem wedlug wynalazku sa estry, amidy, N-pod- stawione amidy, a szczególnie amidy peptydów za¬ wierajace grupe amidowa w Cnkoncowej grupie karboiksylowej i posiadajace wolne grupy hydro¬ ksylowe w lancuchu bocznym. Dopuszczalnymi w lecznictwie kompleksami nowych peptydów, otrzy¬ manymi sposobem wedlug wynalazku sa zwiazki powstajace w wyniku dzialania na peptyd orga¬ nicznych lub mineralnych substancji powoduja¬ cych przedluzenie jego dzialania. Jako zwiazki or¬ ganiczne stosuje sie pewne rodzaje zelatyny, rózne rodzaje karboksymetylocelulozy, alginaty, poliflo- retynofosforany, spolimeryzowane aminokwasy oraz inne polimery lub kopolimery. Sposród zwiaz¬ ków mineralnych stosuje sie pochodne metali, zwlaszcza wodorotlenki i trudno rozpuszczalne sole np. fosforany i pirofosforany cynku. W celu prze¬ dluzenia dzialania stosuje sie pewne krzemiany, które tworza z peptydami nierozpuszczalne zwiaz¬ ki o dotychczas nieznanej budowie.Nowe peptydy oraz ich sole, pochodne lub kom¬ pleksy stosuje sie w lecznictwie w postaci form farmaceutycznych zawierajacych zwiazki biolo¬ gicznie czynne w mieszaninie z organicznymi lub mineralnymi nosnikami, korzystnymi przy stoso¬ waniu preparatów jelitowo lub pozajelitowo. W niektórych preparatach stosuje sie stale liofitfzaty zwiazków czynnych w mieszaninie z mannitolem, laktoza lub skrobia. Formy zawiesin lub emulsji oprócz skladnika czynnego i nosników zawieraja takze obojetne czynniki zabezpieczajace i stabili¬ zujace. Najbardziej korzystnymi formami farma¬ ceutycznymi sa wspomniane wyzej kompleksy wy¬ kazujace przedluzone dzialanie zwiazków czyn¬ nych.Preparaty farmaceutyczne zawieraja substancje czynne w ilosciach ogólnie stosowanych dla hor¬ monów adrenokortykotropowych, to znaczy 0,1— mg/ml. Podaje sie je 1—7 razy dziennie pod¬ skórnie, domiesniowo lub pozajelitowo.Dla oznaczenia pochodnych aminokwasów i pep¬ tydów w podanych nizej przykladach zastosowano skróty zalecane przez IUPAC-IUB (J. Biol. Chem. 247, 977, 1972). Kwasy a-aiminooksykarboksylowe oznaczono przez OSer, OLiz i jesli nie podano ina-91607 czej skróty te odnosza sie do L-konfiguracji z wyjatkiem glicyny. W przykladach zastosowano równiez nastepujace skróty: PCPOH — pieciochlo- rofenol, PFPOH — pieciofluorofenol, DCC — dwu- cykloheksylokarbodwuimid, DCU, — dwucyklohe- 5 ksylomocznik, BOC — III rz.-butoksykarbonyl, Bu* — III rz-butyl, For — formyl, ONSu — grupa N-oksysukcynimidylowa, Temperatury topnienia oznaczono przy uzyciu aparatu typu Dr Tottoly (Buchli,Szwajcaria). 10 Badania za pomoca chromatografii cienkowar¬ stwowej prowadzono z uzyciem zelu krzemionko¬ wego wg Stania stosujac nastepujace mieszaniny rozpuszczalników: 1) octan etylu: (pirydyna : kwas octowy : woda — 15 : 6 :11) = 99 : 1 2) octan etylu: (pirydyna : kwas octowy : woda — : 6 :11) = 8 : 2 3) octan etylu: (pirydyna : kwas octowy : woda — : 6 :11) = 6 :4 20 Sposób wedlug wynalazku w szczególnosci wy¬ jasniaja nastepujace przyklady.Przyklad I. D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His- -Fen-Arg-TRp-Gli-Liz-Pro-Wal-Gli-Liz-Liz - OLiz- -NH2. 0,75 g (0,267 mola) BOC-D-OSer-Tyr-Ser- 25 -Met-Glu - (OBu*) - His-Fen-Arg - Trp - Gli - Liz- (BOC)-Liz(BOC)-Liz(BOC)-OLIz(For)-NH2 rozpusz¬ cza sie w mieszaninie 6 ml kwasu trójfluoroocto- wego, 0,75 iml wody i 0,75 ml anizolu i po uplywie godziny rozciencza sie 150 ml eteru. "Wydzielony 30 osad odsacza sie, przemywa eterem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem nad pieciotlenkiem fos¬ foru i wodorotlenkiem potasowym. Otrzymane 0,7 g (86%) podstawionego trójfluorooctanu formy- looktapeptydu rozpuszcza sie w 10 ml wody i do 35 roztworu dodaje sie 0,25 ml merkaptometanolu, po czym doprowadza sie pH mieszaniny reakcyjnej do 5,0 za pomoca 1 n roztworu wodorotlenku so¬ dowego. Nastepnie dodaje sie 11,5 ml 2 molarnego roztworu octanu hydrazyny i ogrzewa sie na laz- 40 ni wodnej o temperaturze 95°C przez 2 godziny.Po tym czasie roztwór zageszcza sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem,. po czym wprowadza na ko¬ lumne z zywica jonowymienna Whatman CM — 52. Substancje eluuje sie roztworem buforowym 45 sporzadzonym z 0,2 molarnego roztworu octanu amonowego o pH — 6,7 i 0,5 molarnego roztworu octanu amonowego o pH — 6,7. Zebrane odpo¬ wiednie frakcje poddaje sie procesowi liofilizacji i otrzymuje sie 0,275 g (38%) odpowiednio podsta- 50 wionego amidu oktadekspeptydu.Chroniony, podstawiony amid oktadekspeptydu stosowany jako zwiazek wyjsciowy otrzymuje' sie w sposób nastepujacy: Etap 1. Kwas L-a-t-butoksykarbonyloaminooksy- 55 -formyloamimokapronowy (BOC-OLiz/For). 23,2 g (60 mmoli) N-e-formylo-D-lizyny i 43,2 g (423 mmo- le) bromku sodowego rozpuszcza sie w 248 ml 2,5 n kwasu siarkowego po czym roztwór chlodzi sie do temperatury 0°C i przy mieszaniu dodaje 60 sie malymi porcjami w ciagu 30 minut T3,3 g (192 mmole) azotynu sodowego. Mieszanine reak¬ cyjna miesza sie w ciagu godziny w temperaturze 0°C oraz w ciagu nastepnej godziny w temperatu¬ rze pokojowej. Po tym czasie ekstrahuje sie trzy- 65 krotnie 200 ml porcjami eteru, a polaczone eks¬ trakty eterowe osusza sie i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem do sucha. Otrzymany surowy osad kwasu D-a-bromo-e-formyloaminokaprono- wego w ilosci 18,4 g rozpuszcza sie w 190 ml eta¬ nolu i do roztworu dodaje sie 8,4 g (150 mmoli) wodorotlenku potasowego oraz 10 g (76 mmoli) III rz^butoksykarbonylohydroksyloaminy. Miesza¬ nine reakcyjna ogrzewa sie pod chlodnica zwrot¬ na w ciagu 2 godzin, po czym pozostawia dó na¬ stepnego dnia w temperaturze pokojowej. Po tym czasie rozpuszczalnik odparowuje sie, a pozosta¬ losc rozpuszcza sie w 80 ml wody, doprowadza pH do wartosci 3 przy uzyciu 10%-owego kwasu sol¬ nego, wysyca roztwór chlorkiem sodowym, a na¬ stepnie ekstrahuje trzykrotnie 150 ml porcjami eteru i jednorazowo 150 ml octanu etylu. Polaczo¬ ne ekstrakty organiczne osusza sie i odparowuje do sucha. Krystaliczna pozostalosc w ilosci 16 g rekrystalizuje sie z 25 ml octanu etylu i otrzymuje sie 10,4 g (27%) kwasu L-a-t-butoksykarbonylo- aminooksy-E-formyloaminokapronowego o tempe¬ raturze topnienia 114—116°C, RF(2) = 0,31 i (a)D = = —52,5° (c = 1 w metanolu).Analiza elementarna: dla wzoru C12H22N206 (290,32) Obliczono: 0^19,6%; H — 7,65% Oznaczono: C — 49,9%; H — 7,6% Etap 2. Amid kwasu L-a-t-butoksykarbonylo- aminooksy - e - formyloaminokapronowego (BOC- -OLiz(For)-NH2). 5,0 g (17,2 mmola) BOC-OLiz(For) rozpuszcza sie w 107 ml suchego tetrahydrofuranu i do roztworu dodaje sie 1,9 ml (17,2 mmola) N- -metylomorfoliny, po czym mieszanine reakcyjna chlodzi sie do temperatury —10°C i przy miesza¬ niu dodaje sie kroplami 2,25 ml (17,2 mmola) chlo- romrówczanu izobutylu. Po mieszaniu w tej tem¬ peraturze w ciagu 10 minut ochladza sie do tem¬ peratury —20°C i ostroznie dodaje sie do roztwo¬ ru kroplami 10,7 ml (142 mmola) stezonego wo¬ dorotlenku amonowego, a nastepnie miesza przez godzine w temperaturze pokojowej. Tetrahydrofu- ran odparowuje sie nastepnie, a czesciowo krysta¬ liczna pozostalosc rozciencza sie 20 ml mieszaniny octanu etylu, pirydyny, kwasu octowego i wody w stosunku 900 : 54 : 16 : 30 i przenosi na kolumne wypelniona 250 ml zelu krzemionkowego. ETucje prowadzi sie przy uzyciu samej mieszaniny roz¬ puszczalników, a zebrane frakcje zawierajace pro¬ dukt odparowuje sie i otrzymuje 4,3 g (86%) lekko zóltego BOC-OLiz(For)-NH2 w formie bezpostacio¬ wej RF(2) = 0,54.Etap. 3. Kwas III rz.-butoksykarbonylo-D-a-ami- noksy-P-benzoksypropionowy. Mieszanine 48,4 g (0,364 mola) III rz.-butoksykarbonylohydroksyloa- mimy, 40,7 g (0,728 mola) wodorotlenku potasowe¬ go i 94,0 g (0,364 mola) kwasu DL-a-bromo-P-ben- zoksypropioinowego w 360 ml wody miesza sie w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, po czym roztwór zakwasza sie do pH —3 i ekstrahuje trzy¬ krotnie 720 ml porcjami eteru. Polaczone ekstrak¬ ty eterowe przemywa sie 720 ml wody, osusza i miesza z 78 ml (0,40 mola) dwucykloheksylokar- bodwiimidu. Otrzymuje sie 43,61 g dwucyklohe-9 ksyloaminowej soli kwasu III rz.-butoksykarbony- lq-DL-a - aininooksy - 0 - benzoksypropionowego o temperaturze topnienia 144—146°C, która zawiesza sie w 500 ml eteru i wytrzasa pieciokrotnie z 100 ml porcjami 0,2 n kwasu siarkowego. Oddzielony roz- 5 twór eterowy osusza sie i odparowuje do sucha.Otrzymana pozostalosc rozpuszcza sie w 700 ml etanolu, dodaje 6,56 g (48,5 mmola) zasady (+)-am- fetaminy i roztwór pozostawia w chlodni do na¬ stepnego dnia, po czym wydzielone krysztaly od- io sacza sie. (+)-amfetaminowa sól kwasu lii rz.- ^butoksykarbonylo-D-a-aminooksy - |3 - benzoksy¬ propionowego rekrystalizuje sie z etanolu i otrzy¬ muje sie 13,27 g czystego produktu o temperaturze topnienia 188—191°C, (a)D26 = +54° (c = 0,5 w me- l5 tamolu). Po rozlozeniu soli zwykla metoda otrzy¬ muje sie 7,9 g (14%) kwasu III rz.-butoksykarbony- lo-D-a-aminooksy-p-beinzoksypropionowego o tem¬ peraturze topnienia 96—98°C, (a)D80 = +38° (e = 1 wetanolu). 20 Etap 4. Kwas III rz.-butoksykarbonylo-D-a-ami- nooksy-|3-hydroksypriopionowy (BOC-D-OSer). 5,5 g <17,7 mmola) kwasu D-a-III rz.-butoksykarbonylo- aminooksy-P-benzoksypropionowego rozpuszcza sie w 110 ml metanolu i otrzymany roztwór uwodor- 25 nia sie wobec 2,75 g 10%-owego palladu na weglu jako katalizatora w ciagu 3 godzin, po czym ka¬ talizator odsacza sie i odparowuje rozpuszczalnik, a oleista pozostalosc zalewa sie eterem naftowym i pozostawia na kilka godzin. Wydzielona substan- 30 cje krystaliczna odsacza sie i suszy. Otrzymuje sie 3,65 g (96%) kwasu D-a-III rz.-butoksykarbonylo- aminooksy-P-hydroksypropionowego o temperatu¬ rze topnienia 94—95°C i RF(1) = 0,27.Etap 5. BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-N2H3. 4,4 g 35 <20 mmoli) BOC-D-OSer i 9,0 g (20 mmoli) Tyr- -Ser-Met-OCH3 rozpuszcza sie w 30 ml dwume- tyloformamidu, roztwór chlodzi sie do temperatury 0°C, po czym dodaje sie 2,22 ml (20 mmoli) N-me- tylomorfoliny i 3,8 g (18,4 mmola) DCC, a nastep- 40 nie miesza przez godzine w temperaturze 0°C i po¬ zostawia w temperaturze pokojowej do nastepne¬ go dnia. Wydzielony DCU odsacza sie, przesacz odparowuje do sucha, a pozostalosc rozpuszcza sie w 400 ml octanu etylu. Roztwór octanowy prze- 45 mywa sie dwukrotnie 200 ml porcjami 1 n kwasu solnego i dwukrotnie 200 ml porcjami 8%-owego wodnego roztworu wodoroweglanu sodowego, po czym osusza sie i odparowuje do sucha. Otrzymu¬ je sie 8,1 estru chronionego, podstawionego tetra- 50 peptydu, który rozpuszcza sie w 85 ml metanolu, dodaje sie 2,2 ml (46 mmoli) wodzianu hydrazyny i pozostawia w temperaturze pokojowej do na¬ stepnego dnia. Po tym czasie rozpuszczalnik od¬ parowuje sie, pozostalosc rozciera sie z octanem 55 etylu, odsacza, przemywa octanem etylu i eterem, a nastepnie suszy w eksykatorze prózniowym mad stezonym kwasem siarkowym. Otrzymuje sie 7,21 g <63%) hydrazydu chronionego podstawionego tetra- peptydu o temperaturze topnienia po rekrystaliza- 60 cji z wody 174—175°C i RF(1) = 0,30.Analiza elementarna: dla wzoru C25H4oN6010S <616,69) Obliczono: C — 48,7%; H — 6,55%; N — 13,6% Oznaczono: C — 48,3%; H — 6,6%; N — 13,8% 65 Etap 6. BOC-D-OSer/tyr-Ser-Met-Glu(OBut)-His- -Fen-Arg^Trp-Gli-Liz(BOC)- Pro - Wal - Gli. HC1. 1,25 g (2,13 mmola) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met- -N2H3 rozpuszcza sie w 15 ml dwumetyloformami- du, roztwór chlodzi sie do temperatury — 20°C, po czym przy mieszaniu dodaje sie kroplami 2,08 ml (8,32 mmola) 4n roztworu kwasu solnego w octanie etylu i 0,32 ml (2,7 mmola) azotynu III rz.-butylu. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 5 minut w temperaturze —10°C, ochladza do temperatury —20°C, a nastepnie dodaje sie roztwór 2,78 g Glu(OBut)-His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz BOC-Pro-Wal-Gli i 1,4 ml (8,13 mmola) dwuizo- propyloetyloaminy w 23 ml dwumetyloformamidu, po czym miesza sie godzine w temperaturze od —5 do 0°C, a nastepnie pozostawia w tempera¬ turze 0°C do nastepnego dnia. Po odparowaniu do sucha pozostalosc rozciera sie z 8%-owym wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego, osad odsa¬ cza sie, przemywa woda i suszy. Otrzymuje sie 3,49 g (94%) chronionego, podstawionego tetra- dekapeptydu, który zawiesza sie w 24 ml metano¬ lu i otrzymana zawiesine dodaje sie do mieszaniny 4,75 ml stezonego kwasu solnego i 4,75 ml pirydy¬ ny. Powstaly roztwór rozciencza sie 240 ml wody, wydzielony osad odsacza sie, przemywa woda i su¬ szy. Otrzymuje sie 2,95 g (73%) chlorowodorku chronionego, podstawionego tetradekapeptydu o temperaturze topnienia 200—202°C i Rf(2) = 0,25.Etap 7. Szczawian Liz(BOC)-Liz(BOC)-OCHs. 11,0 g (17,7 mmola) Z-Liz(BOC)-Liz(BOC)-OCH3.(K. Hofman i wsp. J. Am. Chem. Soc. 86, 4991, 1964) rozpuszcza sie w 200 ml metanolu, dodaje sie 2,0 g (22,2 mmola) bezwodnego kwasu szczawiowego i mieszanine reakcyjna uwodornia sie w obecnosci 2,0 g 10%-owego palladu na weglu jako kataliza¬ tora. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, przesacz odparowuje, a uzyskana pozostalosc rozciera sie z eterem. Otrzymuje sie 9,1 g (89%) szczawianu estru dwupeptydu, który po rekrysta¬ lizacji z mieszaniny izopropanolu i eteru dwuizo- propylowego wykazuje temperature topnienia 65— 67°C, RF(2) = 0,34 i (a)D = +3,79° (c = 1 w meta¬ nolu).Analiza elementarna: dla wzoru C25H48N4On (578,65) ¦ Obliczono: C — 51,9%; H — 8,9%; N — 9,7% Oznaczono: C — 51,5%; H — 7,9%; N — 9,9% Etap 8. Z - Liz (BOC) - Liz (BOC) - OCH3. 8,1 g (14,0 mmoli) Liz(BOC)-Liz(BOC)-OCH3 w postaci szczawianu zawiesza sie w 60 ml octanu etylu, do zawiesiny dodaje sie 3,1 ml (28,0 mmoli) N-metylo- morfoliny i 6,7 g (14,0 mmoli) Z-Liz(BOC)-ONSu, po czym miesza sie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Mieszanine reakcyjna rozciencza sie nastepnie 200 ml octanu etylu i 40 ml wody, faze wodna oddziela sie, a roztwór organiczny przemywa sie dwukrotnie 40 ml porcjami In kwa¬ su solnego i dwukrotnie 40 ml porcjami 8%-owego wodnego roztworu wodoroweglanu sodowego, po czym osusza sie siarczanem sodowym i odparo¬ wuje, a otrzymana pozostalosc rozciera sie z ete¬ rem dwuizopropylowym. Otrzymany surowy pro¬ dukt rekrystalizuje sie z mieszaniny izopropanolu i eteru dwuizopropylowego i otrzymuje sie 8,0 g( 9l« 11 (67%) estru metylowego chronionego trójpeptydu o temperaturze topnienia 117^118°C, RF(1) = 0,58 i (<*)D = —17,47° (c = 1 w metanolu).Analiza elementarna: dla wzoru C42H7#N6012 (851,03) 5 Obliczono: C —59,3%; H —8,3% Oznaczono: C — 59,7%; H — 8,2% Etap 9. BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBut)- -His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz(BOC)-Pro - Wal - Gli- -Liz(BOC) - Liz(BOC) - Liz(BOC) - OCH3. HC1 1,25 g 10 Z-Liz(BOC)-Liz(BOC)-Liz(BOC) - OCH3 rozpuszcza sie w 25 ml metanolu i mieszanine reakcyjna uwo¬ dornia sie w obecnosci 0,2 g 10%-owego palladu na weglu jako katalizatora. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, z przesaczu odparowuje 15 sie rozpuszczalnik, a pozostaly ester trójpeptydu i 2,42 g (1,24 mmola) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu (OBu*) - His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz(BOC)- Pro-Wal- -Gli. HC1 rozpuszcza sie w 12 ml dwumetylcforma- midu, po czym do roztworu dodaje sie 0,97 g 20 (3,64 mmola) PCPOH i 0,255 g (1,24 mmola) DCC i pozostawia mieszanine reakcyjna w temperaturze pokojowej na okres dwóch dni. Po tym czasie wydzielony osad DCU odsacza sie, przesacz zage¬ szcza sie pod zmniejszonym cisnieniem i wydzie- 25 la sie produkt przez dodanie eteru. Osad odsacza sie i suszy. Otrzymuje sie 3,4 g surowego produk¬ tu o temperaturze topnienia 177°C z rozkladem, który oczyszcza sie przez wytracenie eterem z me¬ tanolu i otrzymuje sie 2,6 g (80%) chlorowodorku 30 estru metylowego chronionego, podstawionego hep- tadekapeptydu o temperaturze topnienia 191 °C z rozkladem i RF(3) = 0,54.Etap 10. BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(ONut)- -His-Fen-ARG-Trp-Gli-Liz(BOC) - Pro - Wal-Gli- 35 -Liz(BOC) - Liz(BOC)-Liz(BOC)-N2H3. 2,5 g (0,93 mmole) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBut)-His- -Fen-Arg-Trp-Gli- Liz(BOC) - Pro - Wal- Gli - Liz (BOC)-Liz(BOC)-Liz w 75 ml goracego metanolu, roztwór chlodzi sie do 40 temperatury pokojowej i dodaje 0,91 ml (18,7 mmo¬ la) wodzianu hydrazyny, po czym mieszanine re¬ akcyjna pozostawia sie w temperaturze pokojowej na okres 2 dni. Po tym czasie metanol oddestylo- wuje sie, a pozostalosc rozciera sie z eterem. Otrzy- 45 mujesie 2,15 g surowego produktu o temperaturze topnienia 199°C,z rozkladem, który oczyszcza sie przez wytracenie woda z dwumetyloformamidu.Otrzymuje sie 2,0 g (81%) hydrazydu chronionego, podstawionego heptadekapeptydu o temperaturze 50 topnienia 205°C z rozkladem i RF(3) = 0,49.Etap 11. BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBut)- -His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz(BOC)- Pro-Wal-Gli-Liz (BOC)Liz-(BOC)-Liz(BOC)-OLiz(For)-NH2. a) 0,57 g (1,97 mmola) BOC-OLiz(For)NH2 roz- 55 puszcza sie w 7,5 ml kwasu trójfluorooctowego i po 0,5 godzinie stania roztwór odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, a otrzymana' pozo¬ stalosc rozpuszcza sie w 4 ml dwumetyloformami¬ du i zobojetnia roztwór dwuizopropyloetyloamina. 60 b) 1,0 g (0,377 mmola) BOC-D-OSer-Tyr-Ser- -Met-Glu(OBut) - His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz(BOC)- -Pro-Wal-Gli - Liz(BOC) - Liz(BOC) - Liz(BOC)- -N2H3 rozpuszcza sie w 5 ml dwumetyloformamidu przy lagodnym ogrzewaniu, a nastepnie roztwór M 12 chlodzi sie do temperatury —20°C i ptzy miesza¬ niu dodaje sie kroplami 0,54 ml (1,52 ifcmola), 2,8 n roztworu kwasu solnego w octanie etyltt i 0,05 ml (0,42 mmola) azotynu III rz.-butylu. Po 5 minu¬ tach mieszania w temperaturze —10°C roztwór chlodzi sie do temperatury —20°C i dodaje sie obojetny roztwór trójfluorooctanu OLiz(For)-NH2 otrzymany wyzej opisanym sposobem (razem z 0,2 ml (1,17 mmola) dwuizopropyloetyloaminy. Po godzinnym mieszaniu w temperaturze od —5 do 0°C mieszanine reakcyjna pozostawia sie w tempe¬ raturze 0°C do nastepnego dnia, po czym oddesty- lowuje sie 50% rozpuszczalnika i otrzymany ste¬ zony roztwór rozciencza sie 20 ml wody. Wydziela sie substancja zestalajaca sie po pewnym czasie, która odsacza sie i suszy, po uprzednim jej roz¬ drobnieniu w zawiesinie wodnej. Otrzymuje " sie 0,80 g (75,5%) amidu chronionego, podstawionego oktadekapeptydu o temperaturze topnienia 140— 145°C i RF(3) = 0,47.Przyklad II. D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His- -Fen-Arg-TRp-Gli-Liz-Pro-Wal-Gli-Liz-Liz-Liz-D- -OLiz-NH2. 0,75 g (0,267 mmola) BOC-D-OSer-T^r- -Ser-Met-Glu(OBut)-His-Fen-Arg - Trp - Gli-Liz (BOC)-Pro-Wal-Gli-Liz(BOC) - Liz(BOC)-Liz(BOC)- . -D-OLiz(For) - NH2 rozpuszcza sie w mieszaninie 6 ml kwasu trójfluorooctowego, 0,75 ml wody i 0,75 ml anizolu i po godzinnym staniu roztwór rozciencza sie 150 ml eteru. Wydzielony osad odsacza sie, prze¬ mywa eterem i suszy w eksykatorze prózniowyit pod zmniejszonym cisnieniem nad pieciotlenkiem fosforu wodorotlenkiem potasowym. Otrzymane w ten sposób 0,65 g (80%) trófluorooctanu podsta¬ wionego formylooktadekspeptydy rozpuszcza sie w ml wody i dodaje sie 0,25 ml merkaptoetanolu.Roztwór zobojetnia sie 1 n roztworem wodorotlen¬ ku sodowego do pH —5, po czym dodaje sie 10,6 ml 2n molarnego roztworu octanu hydrazyny i mie¬ szanine reakcyjna ogrzewa sie w ciagu 2 godzin na lazni wodnej o temperaturze 95°C, po czym za¬ geszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem i otrzy¬ many stezony roztwór wprowadza sie na kolumne z wymieniaczem jonowym Whatman CM-52. Sub¬ stancje eluuje sie roztworem buforowym sporza¬ dzonym z 0,2 molarnego (pH-6,7) i 0,5 molarnego (pH-6,7) octanu amonowego, a zebrane odpowied¬ nie frakcje laczy sie i poddaje procesowi liofiliza¬ cji. Otrzymuje sie 0,28 g (41%) amidu podstawio¬ nego oktadekapeptydu.Amid chronionego, podstawionego oktadekapep¬ tydu stosowany jako produkt wyjsciowy otrzymuje sie w nastepujacy sposób: Etap 1. Kwas D-a-III rz-butoksykarbonyloami- nooksy-e-formyloaminokapronowy (BOC) - D - OLiz (For)). Produkt ten otrzymuje sie z N-e-formylo-L- -Lizyny sposobem podanym w przykladzie I, etap 1.Zwiazek posiada temperature topnienia 114—116°C, RF(2) = 0,31 i (a)D = +58,6° (c = 1 w metanolu).Analiza elementarna: dla wzoru C12H22N203 (290,32) Obliczono: C — 49,6%; H — 7,65% Oznaczono: C — 50,0%; H — 7,6% Etap 2. Amid kwasu D-a-III rz-butoksykarbony- loaminooksy-e-formyloaminokapronowego (BOC-D- -OLiz(For)-NH2). Produkt ten otrzymuje sie z 5,0 g91*87 13 (17,2 mmola) BOC-D-OLiz(For) sposobem podanym w przykladzie I, etap 2. Otrzymuje sie 4,4 g (88%) zwiazku o Rf(2) = 0,54.Etap 3. BOC-D-OSer-Tyr- Ser - Met - Glu(OBut)- -His-Fen-Arg-TRp-Gli-Liz(BOC) - Pro - Wal - Gli- 5 -Liz Produkt ten otrzymuje sie z 0,57 g (1,97 mmola) BOC-D-OLiz(For)-NH2 sposobem podanym w przy¬ kladzie I, etap 11. Otrzymuje sie 0,90 g (85%) ami¬ du chronionego, podstawionego oktadekapeptydu o 10 temperaturze topnienia 140—145°C i RF(3) = 0,47.Przyklad III. H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu- -His-Fen-Srg-Trp-Gly-Lys-Pro - Val-Gly-Lys/Lys- -Lys-OLys-NH2. 1,2 g (0,417 mmola) BOC-D-OSer- -Tyr-Ser-Met-GlutOBu^His-Fen - Srg - Trp - Gly- 15 -Lys(BOC)-Pro - Val - Gly - Lys(BOC) - Lys(BOC)- -Lys(BOC)-OLys(BOC)-NH2 rozpuszcza sie w mie¬ szaninie 9,6 ml kwasu trójfluorooctowego, 1,2 ml wody i 1,2 ml anizelu. Roztwór pozostawia sie do odstania w ciagu godzimy, nastepnie rozciencza 2o 240 ml eteru. Wytracony osad odsacza sie, prze¬ mywa eterem i suszy pod próznia nad pieciotlen¬ kiem fosforu i wodorotlenkiem potasu. Otrzymuje - sie 1,10 g (84%) trójfluorooctanu oktadekapeptydo- amidu podstawionego kwasem aminooksykarboksy- 25 lowym. Surowy trójfluorooctan rozpuszcza sie w ml wody i jony trójfluorooctanu wymienia za pomoca cyklicznego octanu wymieniacza jonowego marki Dowex 1X8 (Firma Rohm i Haas). Nastep¬ nie tak otrzymany roztwór wprowadza sie do ko- 30 lumny wypelnionej wymieniaczem jonowym marki Khatman CM-52 (4,5X65 cm). Eluuje sie buforem o liniowym gradiencie przygotowanym z 2 1 0,2 n (pH = 6,7) i 2 1 0,5 m (pH = 6,7) buforu octanu amonowego z predkoscia 80 ml/godz, zbierajac za- 35 wierajace produkt frakcje 98—115 i liofilizuje je.Otrzymuje sie 0,49 g (41%) oktadekapeptydoamidu podstawionego kwasem aminooksykarboksylowym.Zawartosc peptydu: 78% (widmo HV) zawartosc met-sulfotlenku: 2,3%; stosunek Tyr/Trp 1 : 10. 40 Analiza aminokwasów: Lys 3,5 (4), His 0,9 (1), Srg 1,0 (1), Ser 0,85 (1), Glu 1,0 (1), Pro 1,0 (1), Gly 1,9 (2), Val 0,9 (1), Met 0,7 (1), Tyr 0,9 (1), Fen 1,0 (1), Rt5 = 0,18.Stosowane jako produkty wyjsciowe oktadeka- 45 peptydoamidy podstawione grupami ochronnymi kwasu aminooksykarboksylowego otrzymuje sie w nastepujacy sposób.Etap 1: Sól dwucykloheksyloamonowa kwasu L-a - IH-rzed/ - butyloksykarbonylo-aminoksy-E- 50 -benzyloksy-karbonylo-amino-kapronowego (BOC- -OLys(Z)-OH DCHA) otrzymuje sie w sposób opi¬ sany w etapie 1 z N-e-benzyloksykarbonylo-D-li- zyny. Otrzymany oleisty kwas L-a-III rzed-butylo- ksykarbonylo - aminoksy - e - benzyloksykarbonylo- 55 -amino-kapronowy rozpuszcza sie w eterze i pod¬ daje reakcji z dwucykloheksyloamima w celu otrzy¬ mania soli dwucykloheksyloaminowej.Temperatura topnienia: 156—161°C (po przekry- stalizowaniu z mieszaniny etanolu—woda), Rt! = 60 = 0,1 [a]u = —34,6° (c = 1, etanol).Etap 2. Amid kwasu L-a-III rzed-butyloksykar- bonyloaminoksy - e - benzyloksy-karbonylo-ami- no-kaipronowego (BOC-OLys(Z)-NH2).Sól dwucykloheksyloamonowa kwasu L-a-III 65 14 rzed-butyloksykarbonylo-aminoksy - e - benzylo- ksykarbonylo-amino-kapronowego wytrzasa sie z eterem i 1 n kwasem siarkowym i odparowuje roz¬ twór eterowy. Otrzymany kwas przeprowadza sie w amid sposobem opisanym w etapie 2 przykla¬ du I. Po odparowaniu mieszaniny reakcyjnej su¬ rowy produkt oczyszcza sie zamiast na kolumnie chromatograficznej, przez rozpuszczenie w octa¬ nie etylu i przemywanie woda, 1 n kwasem siar¬ kowym i wreszcie 8%-owym roztworem kwasne¬ go weglanu sodu. Po czym odparowuje sie faze octanu- etylu. Otrzymuje sie amid kwasu L-a-III rzed-butyloksy-karbonylo-aminoksy - e - benzylo- ksykarbonyloamino-kapronowego w postaci geste¬ go oleju.Temperatura topnienia: 93—95°C (po przekrysta- lizowaniu z mieszaniny metanol—woda) Rt1 = 0,42 [a]D = —27,5° (c = 1, metanol).Etap 3. Amidoszczawian kwasu L-a-III-rzed-bu- tyloksy-karbonylo-aminoksy - e - amino-kaprono- wego (BOC-OLys-NH2 szczawian). 12,0 g (30,4 mmola) BOC-OLys(Z)-NH2 rozpusz¬ cza sie w 240 ml metanolu, zadaje 3,0 g (33,3 mmo¬ la) bezwodnego kwasu szczawiowego i redukuje w obecnosci 2,0 g 10%-owego palladu na weglu aktywnym, jako katalizatora. Po zakonczeniu re¬ akcji katalizator odfiltrowuje sie, przesacz odpa¬ rowuje i pozostalosc rozciera z eterem. Po prze- krystalizowaniu surowego szczawianu (9,-3 g) z mie¬ szaniny 45 ml metanolu i 95 ml eteru otrzymuje sie 8,7 g (81,5%) amido-szczawianu L-a-III rzed- -butyloksykarbonylo-aminoksy - e - amino-kapro- nowego.Temperatura topnienia: 153—155°C, Rt = 0,30 [a]D = —38,1° (c = 1, metanol).Etap 4: Amid kwasu L-a-aminoksy-E-III rzed- -butyloksykarbonylo-amino-kapronowego (H-OLys (BOC)-NH2). 8,0 g (22,8 mmola) szczawianu BOC-OLys-NH, rozpuszcza sie w 40 ml kwasu trójfluorooctowego i roztwór po 1k godzinie odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Oleista pozostalosc prze¬ mywa eterem, po czym dodaje 24 ml dioksanu i tyle 2n wodorotlenku sodu, ze powstaje slaba zasada (pH = 8—9). Po dodaniu 6,6 g (45,6 mmola) azydku III rzed-butyloksykarbonylowego i 2,3 g (57,5 mmola) tlenku magnezu miesza sie miesza¬ nine reakcyjna w ciagu 16 godzin w temperaturze pokojowej, po czym odfiltrowuje i przesacz odpa¬ rowuje. Pozostalosc rozpuszcza sie w 50 ml wody i trzykrotnie wytrzasa z 70 ml octanu etylu. Po odparowaniu fazy octanu etylu, pozostalosc roz¬ ciera sie z eterem, odfiltrowuje po czym surowy produkt (6,35 g) przekrystalizowuje z octanu etylu.Otrzymuje sie 3,6 g (60,5%) amidu kwasy L-a-ami- noksy - e - III rzed - butyloksykarbonylo-amino-ka- pronowego.Temperatura topnienia: 118—120°C Rt4 = 0,30 [a]D = —39,5° (c = 1, metanol).Etap 5: Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-N2Ha ,15 g (29,5 mmola) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys (BOC)-OCH3 rozpuszcza sie w 500 ml metanolu i uwodornia w obecnosci 5,0 g 10%-go katalizatora palladowego na weglu aktywnym. Po zakonczeniu reakcji katalizator odfiltrowuje sie, przesacz odpa-91607 rowuje, a pozostalosc rozpuszcza sie w 180 ml dwuchlorometanu. Roztwór zadaje sie 5,72 ml (41,0 mmola) trójetyloaminy i 10,26 g (36,8 mmola) chlorku tritylu. Mieszanine reakcyjna odstawia sie w temperaturze pokojowej na 16 godzin, po czym roztwór odfiltrowuje, a pozostalosc rozpuszcza w 300 ml octanu etylu. Roztwór wytrzasa sie z 50 ml wody, trzykrotnie z 50 ml 5°/o-owego roztworu kwasu cytrynowego i trzykrotnie z 50 ml 8%-owe- go roztworu kwasnego weglanu sodu, nastepnie suszy sie i wreszcie odparowuje. Pozostalosc prosz¬ kuje sie pod elesem naftowym. Po przesaczeniu i wysuszeniu otrzymuje sie 28,0 g surowego Tri- -Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH3. Surowa sub¬ stancje bez dalszego oczyszczania rozpuszcza sie w 170 ml metanolu. Dodaje sie 7,25 ml (150 mmola) wodzianu hydrazyny i mieszanine reakcyjna pozo¬ stawia do odstania w temperaturze pokojowej. Po trzech dniach metanol odfiltrowuje sie i pozosta¬ losc rozciera z eterem. Surowy produkt (17,65 g) przekrystalizowuje sie z mieszaniny 35 ml meta¬ nolu i 350 ml eteru. Otrzymuje sie 13,85 g (49%) chronionego tetrapeptydahydrazydu.Temperatura topnienia: 197—199°C Rt1 = 0,13 [a]D = —7,1 (c = 1, metanol).Etap 6: Tri-Lys(BOC)-L,ys-(BOC)-Lys(BOC)-OLys (BOC)-NH2 4,1 g (4,27 mmola) Tri-Lys(BOC)-Lys (BOC)-Lys(BOC)-N2H3 rozpuszcza sie w 14 ml dwumetyloformamidu. Roztwór oziebia sie do —20°C i podczas mieszania wkrapla najpierw 6,5 ml (17,0 mmola) '2,611 roztworu kwasu solnego w oc¬ tanie etylu, a nastepnie 0,65 ml (5,45 mmola) III rzed butylo azotynu. Mieszanine reakcyjna miesza sie przez 5 minut w temperaturze —10°C, nastep¬ nie oziebia do —20°C i dodaje toztwór 1,42 g (5,45 mmola) H-OLys-(BOC)-NH2 i 2,2 ml (12,8 mmola) dwuizopropyloetyloaminy w 7 ml dwumetylofor- mamidu. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu godziny w temperaturze —5°—0°C, nastepnie po¬ zostawia do nastepnego dnia w temperaturze 0°.Nastepnie roztwór odparowuje sie, pozostalosc roz¬ puszcza sie w 140 ml octanu etylu i roztwór wy¬ trzasa z 40 ml wody, trzykrotnie z 40 ml 5%-owego roztworu kwasu cytrynowego, nastepnie dwukrot¬ nie z 40 ml 8%-owego roztworu kwasnego weglanu sodu. Po wysuszeniu octan etylu oddestylowuje sie i stala pozostalosc rozciera z eterem. Po odsaczeniu i wysuszeniu otrzymuje sie 2,75 g (54%) chronio¬ nego, podstawionego kwasem aminoksykarboksylo- wym tetrapeptydoamidu.Temperatura topnienia 137—140°C Rt1 = 0,26 [o]D = —24,4° (c = 1, metanol).Etap 7. H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLys (BOC)-NH2HCl 5,0 g (4,22 mmola) Tri-Lys(BOC)- Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLys(BOC)-NH2 rozpuszcza sie w 50 ml metanolu i zadaje roztworem chlorowo¬ dorku pirydyny uzyskanym z 1,7 ml pirydyny i 1,7 ml stezonego kwasu solnego. Mieszanine odsta¬ wia sie na 20 godzin w temperaturze pokojowej, nastepnie oddestylowuje metanol i pozostala ge¬ sta mase ugniata ze 150 ml wody, suszy pod próz¬ nia po odlaniu wody i pod eterem proszkuje. Po odfiltrowaniu i wysuszeniu otrzymuje sie 3,7 g 16 (82%) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)OLys(BOC)- -NH2.Temperatura topnienia 120—123°C Rt3 = 0,72 [a]D = +17°C (c = 1, metanol).Etap 8: BOC - D - OSer-Tyr-Ser-Met-GlufOBu*)- -His-Fen-Srg-Trp-Gly-Lys(BOC)- Pro - Val-Gly- -Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLys(BOC) - NH2. 0,9995 g (0,5 mmola) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met- -GlutOBu^-His-Fen-Srg-Trp-Gly - Lys(BOC)-Pro- -Val-Gly-OH.HCl, 0,491 g (0,5 mmola) H-Lys(BOC)- -Lys(BOC) - Lys(BOC) - OLys(BOC) - NH2. Ha i 0,800 g (3,0 mmola) PCPOM rozpuszcza sie w ml dwumetyloformamidu i dodaje najpierw 0,055 ml (0,5 mmola) N-metylomorfoliny, nastep¬ nie 0,210 g (1,0 mmola) DCC. Mieszanine reakcyjna, odstawia sie na jeden dzien w temperaturze po¬ kojowej, nastepnie odsacza DCV i przesacz roz¬ ciencza 100 ml eteru. Wydzielony produkt odsacza sie, przemywa eterem i suszy. Otrzymuje sie 1,30 g (90%) chronionego podstawionego kwasem amino- ksykarboksylowym oktadekapeptydoamidu Rt6 = = 0,50.Przyklad IV. D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Fen- -SRg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys- Lys - Lys- -D-OLys-NH2. 1,2 g (0,417 mmola) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met- -Glu(OBut)-His-Fen-Srg-Trp-Gly - Lys(BOC)-Pro- -Val - Gly - Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC) - D- -OLys(BOC)-NH2 rozpuszcza sie w mieszaninie 9,6 ml kwasu trójfluorooctowego, 1,2 ml wody i 1,2 ml anizolu. Roztwór odstawia sie na godzine nastepnie rozciencza sie, 240 ml eteru. Wytracony osad odsacza sie, przemywa eterem i suszy pod próznia nad pieciotlenkiem fosforu i wodorotlen¬ kiem potasu. Otrzymuje sie 1,05 g (80%) podsta¬ wionego trójfluorooctanu oktadekapeptydoamidu.Surowy trójfluorooctan rozpuszcza sie w 20 ml wody i jony trójfluorooctanowe wymienia na jony octanowe za pomoca cyklicznego octanu wymie¬ niacza jonowego marki Dowex 1X8 (firma Rohm i Haas). Nastepnie tak otrzymany roztwór wpro¬ wadza sie na kolumne wypelniona wymieniaczem jonowym marki Whatman CM-52 (4,5X65 cm).Eluuje sie buforem o liniowym gradiencie otrzy¬ manym z 2 1 0,2 n (pH = 6,7) i 2 1 0,5 m (pH = 6,7) buforu octanu amonu z predkoscia 80 ml/godz zbie¬ rajac zawierajace produkt frakcje 103—112 i lio¬ filizuje je. Otrzymuje sie 0,42 g (37%) podstawio¬ nego kwasem aminooksykarboksylowym oktadeka¬ peptydoamidu. Zawartosc peptydu: 82% (w widmie U.V); Zawartosc Met-sulfotlenku 1,8%: stosunek Tyr/Trp1,07.Analiza aminokwasów: Lys 3,4 (4), His 1,0 (1), Arg 0,9 (1), Ser 0,8 (1), Glu 0,9 (1), Pro 1,0 (1), Gly 2,05 (2), Val 0,9 (1), Met 0,75 (1), Tyr 0,9 (1), Fen 1,0 (1), Rt5 = 0,18.Stosowany jako produkt wyjsciowy, podstawiony kwasem aminooksykarboksylowym oktadekapepty- doamid otrzymuje sie w nastepujacy sposób.Etap 1: Sól dwucykloheksyloamonowa kwasu D- -a - III rzed-butyloksykarbonylo-aminooksy - e- -benzyloksykarbonylo-amino-kapronowego (BOC- -D-OLys(Z)-OH DEHA) otrzymuje sie w sposób opisany w etapie 1 przykladu I z N-E-benzyloksy- 40 45 50 55 6091607 17 karbonylo-L-lizyny. Otrzymany oleisty kwas D-a- -III rzed-butylooksy-karbonylo-aminooksy-e-benzy- loksykarbonylo-amino kapronowy rozpuszcza sie w eterze i poddaje reakcji z dwucykloheksylo-ami- na otrzymujac sól dwucykloheksyloaminy. ~~5 Temperatura topnienia 159—162°C (po przekry- stalizowaniu z mieszaniny etanol—woda) Rt1 = = 0,15 [a]D = +35,4° (c = 1, etanol).Etap 2: amid kwasu D-a-III rzed-butyloksykar- bonylo-aminoksy - e - benzyloksykarbonylo-ami- *o no-kapronowego (BOC-D-OLys(Z)-NH2 otrzymuje sie sposobem opisanym w etapie 2 przykladu III z soli dwucykloheksyloaminowej kwasu D-a-III rzed - butyloksykarbonylo/aminoksy - e - benzylo- ksykarbonylo-amino-kapronowego. Rt1 = 0,42. 15 Temperatura topnienia 95—97°C [a]D = +28,9° (c = 1, metanol).Etap 3: Szczawian aminokwasu D-a-III rzed- -butyloksykarbonylo-aminoksy - e - amino-kapro- nowego (BOC-D-OLys-NH2 szczawian otrzymuje sie w sposób opisany w etapie 3 przykladu III z amidu kwasu D-a-III rzed-butyloksykarbonylo- -aminoksy - e - benzyloksykarbonylo-amino-kapro- nowego.Temperatura topnienia 155—157°C Rt3 = 0,30 [oi]d = +39,0° (c = 1, metanol).Etap 4: Amid kwasu D-a aminoksy-e-III rzed- -butyloksy-karbonylo-amino-kapronowego (N-D- -OLys(BOC)-NH2) otrzymuje sie w sposób opisany w etapie 4 iprzyikladu III ze szczawianu amino¬ kwasu D-a-III rzed-butyloksykarbonylo-aminoksy- -e-aminokapronowego.Temperatura topnienia 118—120°C Rt4 = 0,28 [a]D = +40,4° (c = 1, metanol).Etap 5: Tri-Lys(BOC)- Lys(BOC) - Lys(BOC)-D- -OLys-(BOC)-NH2 otrzymuje sie w sposób opisany w etapie 6 przykladu III z 8,7 g (1,0 mmola) Tri Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(EOC)-N2H3 i 3,0 g (11,5 mmola) H-D-OLys(BOC)-NH2. Po odparowaniu fazy 4Q octanu etylu pozostaly surowy produkt wprowa¬ dza sie razem z 20 ml mieszaniny octanu etylu: (pirydyna: kwas octowy: woda = 20 : 6 :11 = 99 : 1 na kolumne z zelem krzemionkowym i chromato- grafuje. Eluat zbiera sie we frakcje po 15 ml 45 i bada za pomoca chromatografii cienkowarstwo¬ wej. Zbiera sie frakcje 85—192 zawierajace czysty produkt i oddestylowuje rozpuszczalnik. Otrzymu¬ je sie 3,70 g (34,5%) chronionego kwasem amimo- oksykarbonylowym podstawionego tetrapeptydo- 50 amidu.Temperatura topnienia 132—136°C R*t = 0,23.Etap 6: H - Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC) - D- -OLys(BOC)-NH2. HC1 2 g (2,10 mmola) Tri-Lys (BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)D-OLys(BOC)- NH2 roz- 55 puszcza sie w 20 ml 80°/o kwasu octowego. Roz¬ twór odstawia sie w temperaturze pokojowej na minut, nastepnie odparowuje i pozostalosc roz¬ ciera z eterem. Otrzymuje sie 1,68 g podstawio¬ nego kwasem aminoks^karboksylowym amido oc- 60 tan tetrapeptydu (temperatura topnienia 94—95°C) który rozpuszcza sie w 17 ml metanolu, nastepnie dodaje sie roztworu chlorowodorku pirydyny otrzy¬ manego przez zadanie 1,35 ml pirydyny, 1,35 ml stezonego kwasu solnego i oddestylowuje metanol. 65 18 Pozostalosc rozciera sie z 50 ml wody. Po prze¬ saczeniu, przemyciu woda i wysuszeniu otrzymuje sie 1,2 g (72%) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-D- -OLys(BOC)-NH2. HC1.Temperatura topnienia 122—125°C Rt3 = 0,70.Etap 7: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBut)- -His-Fen-Arg-Trp-Gly - Lys(BOC) - Pro-Val-Gly- -Lys(BOC)-Lys(BOC)- Lys(BOC) - D - OLys(BOC)- -NH2. 0,995 g (0,5 mmol) BOC - D-OSer-Tyr-Ser-Met- -Glu(OBut)-His-Fen-Arg-Trp-Gly - Lys(BOC)-Pro- -Val-Gly-OH. HC1, 0,491 g (0,5 mmola) H-Lys (BOC)-Lys(BOC)Lys(BOC)-D-OLys(BOC)-NH2 HC1 i 0,800 g (3,0 mmole) PCPOH rozpuszcza sie i do¬ daje najpierw 0,055 ml (0,5 mmola (N-metylomór- foliny nastepnie 0,212 g (1,0 mmola) DCC. Mie¬ szanine reakcyjna odstawia sie w temperaturze pokojowej na 1 dzien, nastepnie odsacza DCV i przesacz rozciencza sie 100 ml eteru. Wydzielony produkt odsacza sie, przemywa eterem i suszy.Otrzymuje sie 1,40 g (97%) chronionego, podsta¬ wionym kwasem aminooksykarboksylowym okta- dekaipeptydoamidu. Temperatura topnienia 170— 178°C Rt6 = 0,52.Przyklad V. H - D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His- -Fen-Arg-Trp'(-Gly-Lys-Pro-Val- Gly - Lys) Lys- -Lys-Lys-OGly-NH2. 0,400 g (0,134 mmola) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met- -Glu(OBut)-His-Fen-Arg-Trp-Gly - Lys(BOC)-Pro- -Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC) - Lysi(BOC) - OGly- -NH2. HC1 rozpuszcza sie w mieszaninie 3,2 ml kwasu trójfluorooctowego, 0,4 ml wody. Roztwór odstawia sie na 1 godzine, nastepnie rozciencza 80 ml eteru i odfiltrowuje wydzielony osad. Suro¬ wy nonadekapeptydo-amid-trójfluorooctan rozpusz¬ cza sie w 5 ml wody i wprowadza na kolumne wy¬ mieniacza jonowego wypelniona karboksymetyloce- luloza (Whatman CM-52) (3,5X56 m) i chromato- grafuje buforem o liniowym gradiencie przygoto¬ wanym z 1,5 1 0,5 m (pH = 6,7) i 1,5 1 z 0,6 m (pH = 6,7). Zbiera sie frakcje 78—86 zawierajace produkt i liofilizuje. Otrzymuje sie 0,166 g (41,5%) podstawionego kwasem aminooksykarboksylowym nonadekapeptydoamidu Rt5 = 0,22. Zawartosc pep- tydu 76%; zawartosc mieszanina — sulfotlenek 2,3%.Analiza aminokwasów: Lys 4,5 (5), His 1,0 (1), Arg 0,9 (1), Ser 0,85 (1), Glu 1,0 (1), Pro 1,0 (1), Gly 1,9 (2), Val 0,85 (1), Met 0,75 (1), Tyr 0,95 (1), Fen 1,0 (1) Stosowany jako produkt wyjsciowy chroniony przez podstawienie kwasem aminooksykarboksylo¬ wym chlorowodorek nonadekapeptydoamidu otrzy¬ muje sie w nastepujacy sposób.Etap 1: Z - Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC)-Lys (BOO-OCH3 51 g (60 mmoli) Z - Lys(BOC) - Lys (BOC)-Lys(BOC)-OCH3 rozpuszcza sie w 100 ml metanolu i w obecnosci 10 g 10%-owego kataliza¬ tora palladowego na weglu aktywnym uwodornia.Po zakonczeniu reakcji katalizator odfiltrowuje sie i roztwór odparowuje pod próznia. Pozostalosc roz¬ puszcza sie w 240 ml octanu etylu, dodaje 28,5 g (60 mmola) Z-Lys(BOC)-OSu i pozostawia w tem¬ peraturze pokojowej. Po dwóch godzinach do mie-91 607 19 szaniny reakcyjnej dodaje sie 1000 ml octanu ety¬ lu i 200 ml wody. Po wstrzasnieciu oddziela sie faze wodna, a faze octanu etylu przemywa dwu¬ krotnie 200 ml 1 n kwasu solnego, dwukrotnie 200 ml 8%-owego roztworu kwasnego weglanu so- 5 du i po wysuszeniu odparowuje. Pozostalosc roz¬ ciera sie z eterem, odfiltrowuje i przemywa ete¬ rem. Surowy produkt przekrystalizowuje z octa¬ nu etylu. Otrzymuje sie 52,05 g (81%) Z-Lys(BOC)- -Lys.(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH3. Tempera- 10 tura topnienia 122—123°C.Etap 2: H - Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC)-Lys (BOO-OCH3. 35 g (32,4 mmola) Z-Lys(BOC)-Lys (BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH3 rozpuszcza sie w 700 ml metanolu i uwodarnia w obecnosci 7 g 15 %-owego katalizatora palladowego na weglu aktywnym. Po zakonczeniu reakcji katalizator od¬ filtrowuje sie, roztwór odparowuje, a pozostalosc stabilizuje mieszanina eter—eter dwuizopropylowy.Po odsaczeniu i wysuszeniu surowy produkt prze- 20 krystalizowuje sie z mieszaniny eter—eter dwuizo¬ propylowy. Otrzymuje sie 24,8 g (81°/o) H - Lys (BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(60C)-OCH3. Tem¬ peratura topnienia 101—103°C.Etap 3: Tri- Lys(BOC) - Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys 25 (BOC)-OCH3 24 g (25,4 mmola) H-Lys(BOC)-Lys (BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC) - OCH3 i 4,7 ml (33,6 mmola) trójetyloaminy rozpuszcza sie w 180 ml dwuchlorometanu, dodaje 8,5 g (30,5 mmola) chlor¬ ku tritylu i pozostawia w temperaturze pokójo- 30 wej. Po 24 godzinach oddestylowuje dwuchlorome- tan i do pozostalosci dodaje 500 ml octanu etylu i 100 ml wody. Po wytrzasnieciu oddziela sie faze wodna i wytrzasa faze octanu etylu trzykrotnie ze 100 ml 5%-owego kwasu cytrynowego i trzy- 35 krotnie ze 100 ml 8%-owego roztworu kwasnego weglanu sodu, suszy i nastepnie odparowuje. Po¬ zostalosc rozciera sie z eterem, odsacza i przemy¬ wa eterem dwuizopropylowym i eterem naftowym.Otrzymuje sie 23,6 g (78,5%) Tri- Lys(BOC) - Lys 40 (BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC)-OCH3. Temperatura topnienia 166—168°C.Etap 4: Tri- Lys(BOC)- Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys (BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OH3 rozpuszcza sie w 45 230 ml metanolu. Dodaje sie 5,7 ml (117 mmoli) wodzianu hydrazyny i pozostawia w temperaturze pokojowej. Po czterech dniach oddestylowuje sie metanol, pozostalosc rozciera z eterem, odsacza i suszy pod próznia. Otrzymuje sie 23,0 g (98%) 50 Tri-Lys(BOC)- Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC)- -N2H3. Temperatura topnienia 217—219°C.Etap 5: Tri- Lys(BOC) - Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys (BOC) - OGly - NH* 2,37 g (2,0 mmola) Tri-Lys (BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC)- N2H3 roz- 55 puszcza sie w 12-ml dwumetyloformamidu. Roztwór oziebia sie do —20°C i podczas mieszania wkrapla najpierw 2 ml (8,0 mmoli) roztworu kwasu solnego w 4 n octanie etylu, a nastepnie 0,28 ml (2,35 mmo¬ la) III rzed azotynu butylu. Mieszanine reakcyjna 60 utrzymuje sie w ciagu 5 minut w temperaturze —10°C i nastepnie oziebia do —20°C i dodaje 0,216 g (2,4 mmola) H-OGly-NH2 [Riedl. Frank.Nonatshefle 92 730 (1961) i 1,03 ml (6,0 mmola) dwuizopropyloetyloaminy w 8,0 ml dwumetylofor- 65 mamidu. Mieszanine reakcyjna pozostawia sie na 2 godz. w temperaturze —5—0°C, a nastepnie w 0°C do nastepnego dnia. Nastepnie roztwór odpa¬ rowuje sie. Pozostalosc rozciera sie z woda, odsa¬ cza i przemywa woda. Otrzymuje sie 2,35 g {94%) Tri-Lys(BOC) - Lys(BOC) - LyB(BÓC) - Lys(BOC) OGiy-NH2. Rt4 = 0,72.Etap 6: H-Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys (BOC)-OGly-NH2. HC1. [1,75 g (1,4*mmola) Tri-Lys (BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OGly - NH2 rozpuszcza sie w 35 ml 80%-owego wodnego roztworu kwasu octowego. Po godzinie roztwór odparowuje sie, a pozostalosc rozciera z eterem.Po odfiltrowaniu, przemyciu eterem i wysuszeniu surowy produkt z mieszanina octanu etylu — (pi¬ rydyna: kwas octowy: woda = 20,6 :11) w stosun¬ ku 4:1 wprowadza sie na kolumne z zelem krze¬ mionkowym (3,2X52 cm) i chromatografuje. Eluat zbiera sie we frakcjach po 15 ml i oznacza ich sklad za pomoca chromatografii cienkowarstwowej.Zbiera sie frakcje 1C5—112 zawierajace czysty pro¬ dukt, odparowuje rozpuszczalnik, pozostalosc roz¬ ciera z etereni, odfiltrowuje i po wysuszeniu roz¬ puszcza w 20 ml metanolu. Do roztworu dodaje sie roztworu chlorowodorku pirydyny otrzymane¬ go przez zadanie 0,22 ml pirydyny 0,22 ml stezo¬ nego kwasu solnego. Nastepnie oddestylowuje sie metanol, pozostalosc rozciera sie z eterem, odsacza i suszy pod próznia. Otrzymuje sie 0,95 g (65%) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)- OGly NK2. HC1. Rt2 = 0,18.Etap 7: BOC-D-ÓSer-Tyr-Ser - Met - Glu(OBu*)- -His-Fen-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC) - Pro - Val - Gly- -Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC) - OGly- -itc^. hci. 0,398 g (0,20 mmola) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met- -Glu(OBut)-His-Fen-Arg-Trp-Gly-ON. HCI, 0,208 g (0,20 mmola) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys (BOC)-OGly-NH2. HCI i 0,165 g (0,90 mmola) pen- tafluorofenolu rozpuszcza sie w 4 ml dwumetylo¬ formamidu i dodaje najpierw 0,22 ml (0,20 mmola) N-metylomorfoliny, nastepnie 0,063 g (0,30 mmola) DCC. Mieszanine reakcyjna podstawia sie w tem¬ peraturze pokojowej na 16 godzin, nastepnie od¬ filtrowuje DCV i przesacz rozciencza eterem. Wy¬ dzielony produkt odsacza sie, przemywa eterem i suszy pod próznia. Otrzymuje sie 0,540 g (91%) chronionego chlorowodorku nonadekapeptydoami- du Rt6 = 0,63.Przyklad VI. H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu- -His-Fen-Arg-Trp-Glu-Lys- Pse - Val - Gly-Lys- -Lys-Lys-Lys-OGly-Bzl. 0,400 g (0,130 mmola) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met- -GkKOButJ-His-Fen-Arg-Trp-Gly - Lys(BOC)-Pro- -Val-Gly - Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys (BOC)-OGly-OBzl. HCI rozpuszcza sie w mieszani¬ nie 3,2 ml kwasu trójfluorooctowego, 0,4 ml ani- zolu i 0,4 ml wody. Po godzinie zadaje sie 80 ml eteru i odfiltrowuje wydzielony osad. Surowy trój- fluorooctanu nonadekapeptydoamidu rozpuszcza sie w 5 ml wody i wprowadza na kolumne wymienia¬ cza jonowego wypelniona karboksymetyloceiuloza (Whatman CM-52) (3,5X52 cm) i chromatografuje buforem o liniowym gradiencie przygotowanym z 1,5 1 i 0,2 m (pH = 6,7) i 1,5 1 0,5 m (pH = 6,7).21 Zbiera sie frakcje 80—93 zawierajace produkt i liofilizuje. Otrzymuje sie 0,151 g (30%) podstawia¬ nego kwasem aminooksykarboksylowym nonade- kapeptydoamidu. Rt5 = 0,28. Zawartosc peptydu: 80%; zawartosc sulfotlenku metieniny 1,9%; sto¬ sunek Tyr-Trp 1,05.Analiza aminokwasów: Lys 4,5 (5), His 0,95 (1), Arg 1,0 (1), Ser 0,8 (1), Glu 1,0 (1), Pro 1,0 (1), Gly 1,95 (2), Val 0,95 (1), Met 0,8 (1), Tyr 0,95 (1), Fen 1,0 (1).Stosowany jako produkt wyjsciowy chroniony przez podstawienie kwasem aminooksykarboksylo¬ wym chlorowodorem nonadekapeptydoamidu otrzy¬ muje sie w nastepujacy sposób.Etap 1: BOC-OGly-OBzl 3,8 g (20 mmoli) BOC-OGly-OH (wegierski opis patentowy nr 165 117) rozpuszcza sie w 5 ml dwu- metyloformamidu i dodaje 4,44 ml (40 mmoli) trój- etyloaminy i 7,8 ml (66 mmoli) bromku benzylu.Mieszanine ogrzewa sie na lazni wodnej w ciagu 8 godzin, a nastepnie odstawia do nastepnego dnia.Po czym rozciencza sie 100 ml octanu etylu i prze¬ mywa 50 ml wody i .trzykrotnie po 20 ml 8%- -owego roztworu kwasnego weglanu sodu. Po wy¬ suszeniu oddestylowuje sie octan etylu i pozosta¬ losc przekrystalizowuje z eteru. Otrzymuje sie 4,5 g (80%) BOC-OGly-OBzl. Temperatura topnienia 79— 80°C.Etap 2: H-OGly-OBzl. HC1. 11,2 g (40 mmola) BOC-OGly-OBzl rozpuszcza sie w 22 ml octanu etylu i dodaje 22 ml 4 n roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Po 30 minutach mieszanine reakcyjna odparowuje sie, a pozosta¬ losc rozciera z eterem. Po przesaczeniu i wysu¬ szeniu surowy produkt przekrystalizowuje sie z octanu etylu. Otrzymuje sie 5,7 g (66%) OGly- -OBzl. HC1. Temperatura topnienia 85—87°C.Etap 3: Tri- Lys(BOC) - Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys (BOC)-OGly-OBzl. 7,11 g (6,0 mmoli) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys (BOC)-Lys(BOC)-N2H3 rozpuszcza sie w 36 ml dwu- metyloformamidu. Do oziebienia do —20°C roz¬ tworu wkrapla sie podczas mieszania najpierw 6 ml (24 mmola) 4 n roztworu kwasu solnego w octanie etylu, nastepnie 0,84 ml (7,1 mmola) III rzed-butylu. Mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w ciagu 5 minut w temperaturze —10°C, nastep¬ nie oziebia do —20°C i dodaje mieszaniny 1,45 g (6,6 mmola) H-OGly-OBzl. HC1 i 4,24 ml (24,6 mmola) dwuizopropyloetyloaminy w 24 ml dwu- metyloformamidu. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 2 godzin w temperaturze —5 do 0°C i w temperaturze 0°C odstawia do nastepnego dnia.Nastepnie roztwór odparowuje sie, pozostalosc roz¬ ciera z woda, odsacza i przemywa woda. Surowy produkt przekrystalizowuje sie z mieszaniny me¬ tanol—woda '(1 : 1). Otrzymuje sie 6,95 g (87%) Tri- -Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OGly-OBzl. Rt4 = = 0,85.Etap 4: H-Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys (BOC)-OGly-OBzl. HC1. 1,87 g (1,4 mmola) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys (30C)-Lys(B0C)-0Gly-0Bzl rozpuszcza sie w 37 ml 80%-owego wodnego roztworu kwasu octowego. Po godzinie roztwór odparowuje sie, a pozostalosc roz- tfOT 22 ciera z eterem. Po przesaczeniu, przemyciu eterem i wysuszeniu, surowy produkt wprowadza sie na kolumne zawierajaca zel krzemionkowy (3,2X49 cm) i chromatografuje mieszanine octanu etylu — (pi- rydyno: kwas octowy: woda = 20 : 6 :11) w stosun¬ ku 4:1. Eluat zbiera sie we frakcjach po 15 ml, których sklad oznacza sie za pomoca chromato¬ grafii cienkowarstwowej. Zbiera sie frakcje 83— 97 zawierajace czysty produkt, rozpuszczalnik od- destylowuje sie, a pozostalosc rozciera z eterem.Po odsaczeniu i wysuszeniu rozpuszcza sie w 20 ml metanolu i dodaje roztwór chlorowodorku pirydy¬ ny. Roztwór ten otrzymuje sie uprzednio z 0,22 ml pirydyny i 0,22 ml stezonego kwasu solnego. Na- stepnie odfiltrowuje sie metanol, pozostalosc roz¬ ciera z eterem, odsacza i suszy pod próznia.Otrzymuje sie 0,905 g (57%) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)- -LyS{BOC) - Lys(BOC)-OGly-OBzl. HC1. Rt2 = 0,23.Etap 5: BOC - D - OSer-Tyr-Ser-Met-GlutOBu*)- -His-Fen-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro- Val - Gly- -Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC)- -OGly-OBzl. HC1. 0,398 g (0,20 mmola) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met- -GluCOBu^His-Fen-Arg-Trp-Gly-OB. HC1, 0»226 g (0,20 mmola) H - Lys(BOC)-Lys(BOC)- Lys(BOC)- -Lys(BOC)-OGly-OBzl. HC1 i 0,165 g (0,90 mmola) pieciofluorofenolu rozpuszcza sie w 4 ml dwumety- loformamidu i dodaje najpierw 0,022 ml (0,20 mmola) N-metylomorfoliny, nastepnie 0,063 g (0,30 mmola) DCC. Mieszanine reakcyjna pozostawia sie w temperaturze pokojowej, nastepnie odfiltrowuje DCU, a przesacz rozciencza eterem. Wydzielony produkt odfiltrowuje sie, przemywa eterem i su¬ szy pod próznia. Otrzymuje sie 0,502 g (82%) chlo- rowodorku nonadekapeptydoamidu. Rt6 = 0,68. PL