PL80066B1

PL80066B1 -

Info

Publication number: PL80066B1
Application number: PL1969134122A
Authority: PL
Original assignee: Cibageigy Ag
Priority date: 1968-06-14
Filing date: 1969-06-11
Publication date: 1975-08-30
Also published as: DE1966849C3; CH510691A; YU139769A; NL6909057A; US3661901A; IT1047907B; CS172311B2; DE1966849B2; NL159714B; BE734565A; JPS5218275B1; DK126657B; DE1966849A1; FR2011520A1; GB1270448A; DE1928142A1; YU39103B

Description

Sposób wyodrebniania wytworzonej na drodze fermentacyjnej cefalosporyny C i Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodreb¬ niania, wytworzonej na drodze fermentacyjnej, ce¬ falosporyny C w postaci trudnorozpuszczalnych zwiazków z metalem, które to zwiazki nadaja sie do dalszego przeksztalcania w cefalosporyne C lub 5 kwas 7-aminocefalosporanowy.Jak wiadomo, przy wytwarzaniu cefalosporyny C droga fermentacji otrzymuje sie roztwór wodny, w którym rozpuszczona jest w malych ilosciach cefalosporyna C obok licznych innych rozpuszczo- 10 nych substancji, wykazujacych czesciowo podobne wlasciwosci fizyczne i chemiczne, na przyklad ta¬ kich, jak wystepujace w zmiennych ilosciach ce¬ falosporyna N, bedaca równiez hydrofilowym anty¬ biotykiem. Otrzymywanie cefalosporyny C w sta- 15 nie czystym z takich roztworów kulturowych lub z dajacego sie z nich otrzymac produktu surowego albo z bardzo rozcienczonych, np. 3% roztworów wodnych, jest bardzo trudne i skomplikowane Najczesciej otrzymuje sie surowy produkt jako 20 mazista niejednorodna mieszanine o zmiennym skladzie i zmiennych wlasciwosciach fizykoche¬ micznych, totez konieczne jest dostosowywanie spo¬ sobu prowadzenia procesu do wlasciwosci danej szalrzy. 25 Jako sposób wyodrebniania cefalosporyny C z roztworów fermentacyjnych proponowano np. ad¬ sorpcje cefalosporyny C na weglu aktywnym, wy¬ mywanie, adsorpcje wymytego produktu na tlenku glincwyim, ponowne wymywanie, adsorpcje na zy- 30 wicznym anionicie, eluowanie surowej cefalospo¬ ryny C wodnym roztworem buforowym o wartosci pH = 2,5—8, np. octanem pirydyny i ekstrahowa¬ nie jej rozpuszczalnikiem (opis patentowy RFN nr 1014 711).Wedlug innego znanego sposobu cefalosporyne C otrzymuje sie droga rozfrakcjonowania rozpusz¬ czalnikami, szczególnie woda i fenolem lub feno¬ lami z podstawnikami alkilowymi. Jako dalsza mo¬ zliwosc przewidziano poddawanie eluatów z kolum¬ ny z weglem aktywnym lub kolumny z tlenkiem glinu lub z kolumny amonitowej takim warunkom odnosnie temperatury i kwasowosci, ze otrzymana w przesaczu kulturowym cefalosporyna N zostaje przeprowadzona w kwas penicilmowy, natomiast cefalosporyna C praktycznie nie ulega przy tym zmianie. Cefalosporyne N mozna tez rozlozyc przez dzialanie penicylinazy i oddzielic cefalosporyne C przez frakcjonowana ekstrakcje rozpuszczalnikami lub chromatograficznie na wymieniaczach jono¬ wych. Usilowano takze adsorbowac cefalosporyne C bezposrednio z zakwaszonego srodowiska na wymieniaczu jonowym. Ta bezposrednia adsorpcja jest o tyle niekorzystna, ze trzeba stosowac duze ilosci anionitu, a to ze wzgledu na obecnosc innych anionów oprócz cefalosporyny C i na wymywanie sie jonów chlorkowych, które powoduja trudnosci w dalszych etapach produkcji.Znany jest tez sposób, wedlug którego wyklaro¬ wany osrodek fermentacyjny zostaje nastawiony na 80 06680 066 wartosc pH = 2,8—4 za pomoca kationitu o silnych grupach kwasnych bedacych w formie H+. Na¬ stepnie oddziela sie kationit od zakwaszonego sro¬ dowiska i za pomoca silnego anionitu, w formie soli lotnego jednozasadowego slabego kwasu orga¬ nicznego, uwalnia sie sirodowisko od praktycznie wszystkich jonów chlorkowych i innych anionów nieorganicznych. Cefalosporyne C otrzymuje sie nastepnie z perkolatu, np. przez adsorpcje na amo¬ nicie w formie octanowej i eluacje buforem octa- no-pirydynowym (opis patentowy RFN nr 1126 564).Znane jest takze oczyszczanie surowej cefalospo- ryny C przez przeprowadzenie jej w sól sodowa luJb barowa,- zdolna*?do krystalizacji. Jednak sole te mcga byc krystalizowane tylko z dosc stezonego i' wstepnie oczyszczonego roztworu. Nalezy liczyc sie przy tym z duzymi stratami spowodowanymi dtór^ r^zpu^z^zajtoo^ia tych soli w wodzie. i3£ad«»-tyeh* *rrte~mlT sposób wedlug wynalazku, zgodnie z którym z roztworu, szczególnie takze z rozcienczonego i/lub zanieczyszczonego, np. z cie¬ czy fermentacyjnych, lub z eluatów, wyodrebnia sie droibnokrystaliczny kompleks metaliczny cefa¬ losporyny C z metalem ciezkim. Mozna go wydzie¬ lic w jednorodnej, dobrze saczalnej i trwalej po¬ staci z roztworu zanieczyszczonego innymi substan¬ cjami rozpuszczalnymi w wodzie. Kompleks ten mozna latwo przeprowadzac w cefalosporyne C lub w jej rozpuszczalne w wodzie sole lub stcsowac bezposrednio do dalszej przeróbki na kwas 7-ami- no-cefalosporanowy.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze roztwór wodny, zawierajacy cefalosporyne C, uzy¬ skana na drodze fermentacyjnej, poddaje sie re¬ akcji przy odczynie o wartosci pH = 3—7 z roz¬ puszczalna w wodzie scfla dwuwairtosciowego me¬ talu ciezkiego i oddziala sie trudnorozpuszczalny kompleks cefalosporyny C z metalem ciezkim. Jako metale ciezkie stosuje sie zwlaszcza dwuwartoscio¬ we metale ciezkie, takie jak miedz, nikiel, olów, kobalt, zelazo, mangan, rtec, kadm, a przede wszy¬ stkim cynk. Stracanie nastepuje z roztworu wod¬ nego za pomoca rozpuszczalnej w wodzie soli wy¬ mienionych metali ciezkich, np. siarczanów, halo¬ genków, szczególnie chlorków, a korzystnie za po¬ moca octanów.Metaliczny kompleks wytraca sie przy odczynie o wartosci pH okclo 3—7, a korzystnie 5—6. Cefa- losporyna C moze w roztworze wodnym znajdowac sie w postaci soli, np. soli metalu alkalicznego, me- 10 20 25 33 35 40 45 talu ziem' alkalicznych lub soli amonowej, np. sodowej lub wapniowej, lub soli zasady organicz¬ nej, takiej, jak trójetyloamina. Roztwór wodny moze zawierac takze rozpuszczalniki organiczne, mieszajace sie z woda, np. alkohole takie jak eta¬ nol lub izopropanol.Drobnokrystaliczny metaliczny kompleks moze byc latwo wydzielony z roztworu, np. przez sa¬ czenie, nuczowanie lub wirowanie. Osad przemywa sie wcda i/lub rozpuszczalnikiem organicznym.Celem przeprowadzenia kompleksu w cefalospo¬ ryne C lub w jej rozpuszczalne w wodzie sole, ta¬ kie jak sole metali alkalicznych lub amonowe, kompleks traktuje sia np. roztworem kwasnego weglanu sodowego lub rozcienczonym wodorotlen¬ kiem sodowym lub odpowiednim kationitem (np.„Amberlit" IRC-50 lub IR-120 lub „Dowex" zy¬ wica chelatujaca A-l w postaci sodowej). Mozna tez wytracac metal ciezki jako siarczek lub prze¬ prowadzac w trudnorozpuszczalny kompleks z or¬ ganicznymi zwiazkami kompleksotwórczymi, taki¬ mi jak 8-hydroksychinolina lub 8-hydroksychinal- dyna. Mozna takze stosowac kompleks bezposred¬ nio jako material wyjsciowy dq otrzymywania kwasu 7-aiminccefalosporanowego. Na przyklad mozna otrzymac z niego kwas 7-aminocefalospo- ranowy, pcstepujac w spcsób podany w belgijskich opisach patentowych nr nr 643 899 lub 720 185.Korzystne jest takze dalsze ., oczyszczanie kom¬ pleksu przez ponowne wytracenie lub ponowna krystalizacje. Postepuje sie na przyklad w ten spo¬ sób, ze kompleks rozpuszcza sit* w kwasie takim, jak kwas octowy, i wytraca z kwasnego roztworu przez dodatek zasad, jak rozcienczony wodorotlenek sodowy lub trójetyloamina.Kompleksy metali ciezkich i cefalosporyny C sa zwiazkami nowymi. Sa to kompleksy 1:1, to zna¬ czy, ze kompleks zawiera na jedna czasteczke ce¬ falosporyny C jeden atom metalu. W elektroforezie bibulowej kompleks wedruje jako jednolita plama.Rozpuszczalnosc tych kompleksów w wodzie i roz¬ puszczalnikach organicznych jest bardzo mala. W tablicy podano rozpuszczalnosc kompleksu w wo¬ dzie, nizszych alkanolach oraz w acetonie w gra¬ mach na 100 ml.W celu otrzymania roztworów zawierajacych ce¬ falosporyne C, stosowanych jako material wyjscio¬ wy, stosuje sie znane wyodrebniania z cieczy fer¬ mentacyjnych kwasnych, hydrofilowych produktów Rozpuszczalnik Woda destylo¬ wana Metanol Etanol Izopropanol Aceton Woda destylo¬ wana 2S°C T a b 1 i c a Cu-kompleks °C 0,058 0,019 0,027 0,022 0,016 23 °C 0,066 0,052 0,019 0,015 0,029 Cd- -kompleks 0,04 Zn-kompleks °C 0,106 0,037 0,034 0,010 0,005 Fe- 1 -kompleks 0,2 [ 1 23 °C 0,095 0,035 0,027 0,001 0,005 Hg-kompleks | °C — — — 0,014 Co- -kompleks 0,08 | 23 oC 0,059 0,015 0,006 0,006 — Ni- -kompleks 0,1480 066 5 naturalnych, np. antybiotyków, hormonów wzro¬ stowych lub witamin. Jako takie metody nalezy przede wszystkim wymienic: 1. adsorpcje wzglednie absorpcje, np. na weglu aktywnym, takim jak „Norit", na zasadowych srodkach adsorpcyjnych, takich jak tlenek gli¬ nowy, na zasadowych oraz adsorpcyjnych zywi¬ cach niejonowych, takich jak „Asmit" (produkt kondensacji aldehydu mrówkowego z fenyleno- dwuamina, firmy Imacti-Maatsch), „Amberlit" XAD-1, XAD-2, XAD-4 lub XAD-5 (polimer polistyrenu firmy Roehm and Haas), „Amberlit" XAD-7 lub XAD-8 (polimer kwasu akrylowego), na zasadowych wymieniaczach jonowych jak „Amberlit" IR-4B (fenolopohamina z pierwszo- rzedowymi grupami lub drugorzedowymi gru¬ pami aminowymi, slabozasadowa), „Amberlit" IR-45, IRA-93 (polimer styrenu i dwuwinylo- benzenu, slabozasadowy), „Amberlit" XE-265 (poliamina, slabozasadowa), „Amberlit" 68 (po¬ limer kwasu metakrylowego, slabozasadowy), „Amberlit" IRA-400, IRA-401, IRA-402, IRA- -410 (polimer styrenu, dwuwinylobenzenu z czwartorzedowymi grupami aminowymi, slabo¬ zasadowy), „Amberlit" LA-1, LA-2 lub LA-3 (ciekle drugo- lub pierwszorzedowe aminy o wysokim ciezarze czasteczkowym) lub na od¬ powiednich wymieniaczach jonowych firm jak „Dowex" l-s-4 (Dow Chemical Co.), „De-Acidit" FF (The Permutit Co.), „imac" A 13, A 17, A 20, S. 5—40 (Imacti Maatsch); 2. podzial miedzy rozpuszczalniki, np. wode i fe¬ nol lub fenole podstawione alkilami, przy kwas^ nych lub slabo zasadowych wartosciach pH; 3. chemiczne lub biologiczne niszczenie produktów ubocznych, np. za pomoca kwasów, takich jak kwas siarkowy lub szczawiowy albo przy po¬ mocy kwasnych jonitów, np. „Amberlitu" IR- -120 (polimer styrenu i dwuwinylobenzenu z grupami kwasu sulfonowego, albo za pomoca enzymów, np. penicylinazy.Wynalazek jest blizej wyjasniony w podanych przykladach.Przyklad r. Do 156 ml roztworu o zawar¬ tosci okolo 7,7% cefalosporyny C i potrójnej lub poczwórnej ilosci zanieczyszczen pochodzacych z przesaczu pokulturowego dodaje sie, przy miesza¬ niu i ochladzaniu w kapieli lodowej, roztwór 44 g krystalicznego octanu cynku Zn(OOCCH3)2 2H20 w 88 ml wody. Mieszanina pozostaje przy tym kla¬ rowna. Nastepnie przy silnym mieszaniu i dalszym ochlodzeniu, dodaje sie z wkraplacza cienkim stru¬ mieniem 260 ml bezwodnego etanolu (w ciagu 10— 15 minut), zaszczepia roztwór sladowa iloscia kom¬ pleksu cynkowego cefalosporyny C i miesza jesz¬ cze w ciagu \lU godzimy. Powstale zmetnienie po okolo 15 minutach nasila sie i zaczyna wydzielac sie drobnokrystaliczny osad. Osad ten odsacza sie, przemywa niewielka iloscia mieszaniny etanolu i wcdy (6 :4), nastepnie 95% alkoholem i suszy po¬ zostalosc pod bardzo zmniejszonym cisnieniem.Otrzymuje sie 6,2 g prawie czystego kompleksu cynkowego cefalosporyny C. Widmo w ultrafiolecie: Xmax. 262 nri (e = 7300). Widmo w podczerwieni 6 w (bardzo czystym oleju parafinowym podano na fig. 1 rysunku.W elektroforezie bibulowej w roztworze buforo¬ wym fosforanu potasowo-sodowego (Vi5 molarne- go, wartosc pH = 5,5, w ciagu lVi godziny, 2000 V) kompleks wedruje na odleglosc 10 cm w kierunku anody jako jednolita plama, która mozna wykryc za pomoca widma ultrafioletowego lub wywola- czem ninhydryno-kolidynowym.Roztwór wyjsciowy mozna sporzadzic w naste¬ pujacy sposób. Wedlug metody podanej w brytyj¬ skim opisie patentowym nr 968 324 roztwór kul¬ tury zawierajacy cefalosporyne C saczy sie z do¬ datkiem srodka ulatwiajacego filtracje. Przesacz zakwasza sie do wartosci pH = 3, za pomoca siinie kwasnego jonitu. Nastepnie 'przesacz przepuszcza sie przez wymianiacz zasadowy w postaci octano¬ wej, aby wymienic nieorganiczne aniony na octan.Cefalosporyne C adsorbuje sie na „Amberlicie" IR-4B, wymywa octanem pirydyny jako roztwo¬ rem buforowym i z zatezonego eluatu wytraca sie suarowa cefalosporyne C za pomoca acetonu, saczy i suszy. 43,5 g otrzymanego osadu (zawartosc vefa- losporyny C 27,5%) rozpuszcza sie w 156 ml wody.Przyklad II. 1,3 g osadu surowej cefalo¬ sporyny C (czystosc 213%), otrzymanej w sposób opisany w przykladzie I, rozpuszcza sie w 3,8 ml wcdy. Do roztworu dodaje sie roztwór 1,1 g oc¬ tanu cynku w 2,4 ml wody. Nastepnie dodaje sie 8,2 ml alkoholu izopropylowego i miesza w ciagu 5 godzin w temperaturze 0°C. Po odsaczeniu i wy¬ suszeniu otrzymuje sie 208,5 mg prawie bezbarw¬ nego produktu krystalicznego.Przyklad III. 4g surowej cefalosporyny C (czystosc 40%), otrzymanej sposobem opisanym w przykladzie I, rozpuszcza sie w 14,5 ml wody. Roz¬ twór zadaje sie 0,6 ml trójetyloaminy i 1,8 g uwod¬ nionego octanu miedziowego w 40 ml wody. Kla¬ rowny roztwór o barwie gleboko ciemnozielonej, zaszczepia sie krystalicznym kompleksem miedzio¬ wym cefailosporyny C i pozostawia na przeciag nocy w lodówce. Drobnokrystaliczny osad odsacza sie i kolejno przemywa porcjami po 100 ml wody z lodem, 95% alkoholem i eterem. Osad suszy sie pcd zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 1,298 g 88% kompleksu miedziowego cefalosporyny C.Widmo absorpcyjne w ultrafiolecie wykazuje mak¬ simum przy 266—267 m^ (e = 10 000), a minimum przy 232 mji.Z przesaczu, po dodaniu 2 czesci objetosciowych alkoholu, otrzymuje sie osad w ilosci 0,690 g, o czystosci okolo 60%.Zastosowany do zaszczepienia kompleks miedzio¬ wy cefalosporyny C mozna otrzymac nastepujaco: 3,184 g 89,5% cefalcsporyny C w postaci wolnego kwasu rozpuszcza sie mieszajac w 31,8 ml wody destylowanej i roztwór traktuje sie 1,5 ml trój¬ etyloaminy. Roztwór ten (wartosc pH okolo 7,5) zadaje sie natychmiast roztworem 1,685 g uwod¬ nionego octanu miedziowego w 73,8 ml wody (war¬ tosc pH = 4,8). Z klarownego ciemnozielonego roz¬ tworu zaczyna sie wytracac jasny niebieskozielony osad. Pozostawia sie go w ciagu nocy w tempera¬ turze 0°C i odsacza powstaly drobnokrystaliczny 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6080 066 8 osad. Osad ten przemywa sie 25 ml zimnej wody, 2 razy 25 ml 95°/o etanolu i 4 razy eterem, a na¬ stepnie suszy pod '.zmniejszonym cisnieniem. Otrzy¬ muje sie 3,227 g (okolo 94% wydajnosci teoretycznej) czystego kompleksu miedziowego cefalosporyny C.Daje on w widmie ultrafioletowym, w roztworze 0,1 n weglanu sodowego Jimax. = 266—267 mm (e = = 11300). W widmie podczerwonym w bardzo czys¬ tym oleju parafinowym produkt wykazuje naste¬ pujace pasma: 291 (zalamanie, w), 3,01 (m), 5,71 (s), 6,01 (s), 6,03 (s) 6,13 (zlamanie, m) 6,51 (m), 7,85 (wm), 8,15 (m), 8,38 (w), 8,55 (w), 8,75 (w), 8,96 (w), 9,28 (wm), 9,68 (wm)^ (fig. 2).Analiza elementarna produktu wykazala: N = = 8,5% (obliczono 8,8%), S = 6,7% (obliczono 6,7%), Cu (oscylograficznie) = 14,1% (obliczono 13,7%), Przyklad IV. 0,50 g okolo 85% dwuwodnej soli sodowej cefalosporyny C (Xmax. = 260 nm, e = — 7350 w H20) rozpuszcza sie w 8 ml wody desty¬ lowanej. Zólty roztwór zadaje sie 0,27 g bezwod¬ nego chlorku niklawego w 2 ml wody, przy czym wartosc pH roztworu obniza sie z 5,5 do 4,0. Zie¬ lony, klarowny roztwór traktuje sie etanolem az do pojawienia zmetnienia i pozostawia na noc w lodówce. Drobne krysztaly odsacza sie, przemywa woda, mieszanina alkoholu i wody oraz alkoholem i suszy. Bladozielony produkt wykazuje w 0,01 n kwasie octowym wspólczynnik ekstynkcji cd war¬ tosci 8,650 przy 260 nm [a]^= +82° ±1° (C = = 0,996% w 0,5 n roztworze HaHCOg). Ilosciowe oznaczanie metoda hydroksylaminowa daje zawar¬ tosc równa 100%. Widmo w podczerwieni w bardzo czystym oleju parafinowym podano na fig. 3 .Przyklad V. Kompleks kobaltawy cefalo¬ sporyny C sporzadza sie analogicznie, jak w przy¬ kladzie IV, z 0,50 g dwuwodnej soli sodowej cefa¬ losporyny C i 0,525 g czterowodnego octanu ko- 25 baltawego z dodatkiem 0,1 ml lodowatego kwasu octowego. Drobnokrystaliczny rózowy osad prze¬ chodzi w czasie suszenia nad pieciotlenkiem fosfo¬ ru w niebieskofioletowy.Przyklad VI. Kompleks kadmowy cefalo¬ sporyny C o zabarwieniu lekko bezowym sporzadza sie analogicznie, jak w przykladzie IV, z 0,50 g dwuwodnej soli sodowej cefalosporyny C i 0,560 g octanu kadmowego i(dwuwodnego) z dodatkiem 0,1 ml lodowatego kwasu octowego. Skrecalnosc op¬ tyczna w 0,1 m roztworze kompleksonu (EDTA.Na2) wynosi +79° ±1° (c = 0,958%).Przyklad VII. Kompleks zelazawy cefalo¬ sporyny C sporzadza sie analogicznie, jak w przy¬ kladzie IV, z 0,5 g dwuwodnej soli sodowej cefa¬ losporyny C i 0,342 g dwuwodnego chlorku zela¬ zawego. Otrzymuje sie go w postaci drobnych krysztalów o zabarwieniu popielatobrazowym. PL PL

Claims

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wyodrebniania wytworzonej na drodze fermentacyjnej cefalosporyny C w postaci trudno rozpuszczalnych zwiazków z metalem, znamienny tym, ze roztwór wodny, zawierajacy cefalosporyne C uzyskana na drodze fermentacyjnej, poddaje sie reakcji przy odczynie o wartosci pH = 3—7 z roz¬ puszczalna w wodzie sola dwuwartosciowego me¬ talu ciezkiego i oddziela sie trudno 'rozpuszczalny kompleks cefalosporyny C z metalem ciezkim.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako metal kcmpleksotwórczy stosuje sie cynk.

3. Sposób wedlug zastrz. 1 lub 2, znamienny tym. ze kompleks straca sie w obecnosci rozpuszczalni¬ ków organicznych mieszajacych sie z woda.

4. Sposób wedlug zastrz. 1—3, znamienny tym, ze kompleks straca sie w obecnosci nizszych alka- noli mieszajacych sie z woda. 4000 3000 2000 1500 00 900 800 700 cm"' 0 11 12 13 U 15;KI. 30h,6 80 066 MKP C12d 9/12 4000 3000 2000 100 ¦ f •¦ ' 1500 1000 900 800 700 cm"i 4000 3000 2000 1500 00 900 800 700 cm"* CZ^ iLLulA Urzedu Patentóweg n PL PL