PL223163B1 - Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych - Google Patents
Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowychInfo
- Publication number
- PL223163B1 PL223163B1 PL401061A PL40106112A PL223163B1 PL 223163 B1 PL223163 B1 PL 223163B1 PL 401061 A PL401061 A PL 401061A PL 40106112 A PL40106112 A PL 40106112A PL 223163 B1 PL223163 B1 PL 223163B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- unkn
- tet
- texas
- acinetobacter baumannii
- primers
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 title claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 claims description 6
- 241000568569 Acinetobacter baumannii ATCC 17978 Species 0.000 claims description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 101000893549 Homo sapiens Growth/differentiation factor 15 Proteins 0.000 description 5
- 101000692878 Homo sapiens Regulator of MON1-CCZ1 complex Proteins 0.000 description 5
- 102100026436 Regulator of MON1-CCZ1 complex Human genes 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 208000037815 bloodstream infection Diseases 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zestaw sond do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, zestaw oligonukleotydowych starterów, sposób oraz zestaw do analizy materiału genetycznego zawartego w próbkach medycznych i środowiskowych.
Acinetobacter baumannii jest oportunistycznym patogenem odpowiedzialnym za wywołanie infekcji szpitalnych takich jak zapalenie płuc, zakażenia krwi, ran czy oparzonych miejsc. Stanowi on coraz większe zagrożenie z uwagi na szybkie nabywanie wielolekooporności, co znacznie utrudnia skuteczne leczenie. Dlatego niezwykle ważna jest diagnostyka.
Obecnie stosowane testy, pozwalające stwierdzić obecność tej bakterii w badanej próbce, opierają się na metodach mikrobiologii klasycznej (hodowla na podłożach wybiórczych, różnicujących, testy biochemiczne). Wymagają one uzyskania czystej hodowli bakteryjnej przed przystąpieniem do oznaczenia, co powoduje że są bardzo czasochłonne. Standardowo na otrzymanie wyników analizy czeka się od 3 do 7 dni. Co więcej, z uwagi na to, iż powyższe testy opierają się na cechach fenotypowych, które są bardzo zmienne wśród mikroorganizmów, pozwalają na określenie przynależności gatunkowej badanego izolatu jedynie w pewnym przybliżeniu, nigdy nie dając 100% pewności.
Technika Real-Time PCR jest bardzo dobrze znana i dosyć powszechnie stosowana w nowoczesnych laboratoriach diagnostycznych. Reakcja Real-Time PCR jest reakcją wykorzystywaną do monitorowania ilości przyrostu kopii badanej sekwencji w czasie. Identyfikacja jest możliwa dzięki zastosowaniu sond znakowanych barwnikami fluoroscencyjnymi.
Z opisu US 2009/0291854 znamy metodę identyfikacji patogenów, w tym Acinetobacter baumannii, w badanej próbce. Metoda ta bazuje na mikromacierzach i hybrydyzacji DNA-DNA, a badana próbka wymaga wielu manipulacji przed właściwym oznaczeniem.
Dlatego istnieje potrzeba poszukiwania nowych, szybszych i bardziej wiarygodnych rozwiązań w kontekście oznaczania obecności Acinetobacter baumannii w próbkach szpitalnych i środowiskowych.
Przedmiotem wynalazku są nowe sondy oraz nowe oligonukleotydowe startery, stanowiące zestaw do wykrywania obecności bakterii Acinetobacter baumannii w próbach szpitalnych oraz środowiskowych. Sposób wykrywania oraz opracowany zestaw posiada szereg zalet w stosunku do stosowanych dotychczas metod mikrobiologii klasycznej. Nie wymaga on uzyskania czystej hodowli bakteryjnej przed przystąpieniem do oznaczania. Bakterie wykrywa się bezpośrednio na dostarczonej próbie, co zmniejsza ryzyko jej zanieczyszczenia, a także znacząco skraca czas potrzebny do otrzymania wyniku. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej oraz przeprowadzenie samej reakcji Real-Time PCR zajmuje około 2 godzin, jednorazowo można oznaczać wiele prób, co również przyśpiesza pracę. Cała procedura opiera się na amplifikacji (powielaniu) charakterystycznych, stałych (niezmiennych) fragmentów DNA chromosomalnego bakterii, dlatego daje ona wiarygodne wyniki. Jesteśmy w stanie odróżnić Acinetobacter baumannii od innych bardzo blisko spokrewnionych gatunków należących do rodzaju Acinetobacter, o bardzo podobnych cechach fenotypowych, jednak o odmiennym znaczeniu klinicznym, co jest prawie niemożliwe przy standardowych procedurach mikrobiologicznych.
Poszukiwanie ulepszonego i uproszczonego sposobu identyfikacji poprzez zastosowanie nowych sond i starterów doprowadziło obecnie do opracowania między innymi sposobu i zestawu do analizy próbek medycznych i środowiskowych pod kątem obecności Acinetobacter baumannii.
Przedmiotem wynalazku jest zestaw sond służących do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, gdzie są to oligonukleotydy o sekwencjach przedstawionych na Fig. 1 i Fig. 2.
Zestaw sond, które są zawarte w sekwencji powielanej przy pomocy starterów przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4.
Zestaw starterów oligonukleotydowych do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, gdzie są to startery o sekwencjach przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4.
Sposób wykrywania bakterii gatunku Acinetobacter baumannii w próbkach medycznych i/lub środowiskowych, w którym to fragment DNA powiela się w reakcji Real-Time PCR z zastosowaniem starterów, gdzie w reakcji Real-Time PCR powiela się konserwowane sekwencje z zastosowaniem starterów o sekwencjach przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4, po czym produkty wykrywa się za pomocą sond o sekwencjach przedstawionych na Fig. 1 i Fig. 2.
Sposób, gdzie produkty charakteryzuje się poprzez sygnały, wyemitowane są z sond wyznakowanych znacznikami fluoroscencyjnymi.
PL 223 163 B1
Zestaw do analizy materiału genetycznego zawartego w próbkach medycznych i/lub środ owiskowych do wykrywania bakterii gatunku Acinetobacter baumannii, zawierający startery o sekwencjach przedstawiono na Fig. 3 i Fig. 4 oraz znakowane sondy o sekwencjach przedstawiono na Fig. 1 i Fig. 2.
Zestaw, który dodatkowo zawiera wzorzec będący DNA chromosomalnym szczepu Acinetobacter baumannii ATCC 17978.
Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:
• Konserwowane sekwencje - to sekwencje nukleotydowe, które podczas ewolucji nie zmieniają się wcale lub zmieniają się w niewielkim stopniu i są podobne lub identyczne we wszystkich szczepach w obrębie danego gatunku.
• Próbka medyczna - materiał do analizy pochodzący z punktu opieki zdrowotnej. Jego źródło może stanowić infrastrukturę (np. wymaz z szafki) jak i pacjenci (np. wymaz z rany).
• Próbka środowiskowa - materiał pobrany ze środowiska naturalnego np.: gleba, woda itp. Opis rysunków:
Fig. 1 - sonda do wykrywania Acinetobacter baumannii MIC1,
Fig. 2 - sonda do wykrywania Acinetobacter baumannii IW10,
Fig. 3 - startery do sondy MIC1,
Fig. 4 - startery do sondy IW10,
Fig. 5 - schemat przygotowania rozcieńczeń seryjnych do posiewu na podłoże LAM,
Fig. 6 - zmiana zabarwienia pożywki LAM pod wpływem wzrostu bakterii Acinetobacter spp. Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia Przykład 1
POBRANE PRÓBKI
Pocieramy badaną powierzchnię jałową wymazówką zwilżoną solą fizjologiczną (0,85% NaCl), którą umieszczamy w jałowej, odpowiednio opisanej probówce (bez podłoża transportowego).
TRANSPORT
Próbka nie wymaga zachowania szczególnych warunków transportu, o ile jest dostarczona w ciągu 4h do miejsca badania. Jeżeli ten czas jest dłuższy, próbki należy przechowywać i transpo rtować w temp. 4°C.
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO TESTU
Wymazówkę płuczemy w 500 ąl pożywki LB (Luria Broth Medium), znajdującej się w nowej, jałowej probówce eppendorfa, pamiętając o dokładnym odsączeniu wacika. Średnio otrzymujemy 400-450 ąl roztworu stanowiącego próbkę.
PODZIAŁ PRÓBKI • Pobieramy 50 ąl roztworu z próbki do jałowej probówki, inkubujemy 10 min w 95°C wirujemy 12 000-15 000 g przez 5 min. Supernatant wykorzystujemy, jako matrycę do reakcji Real-Time PCR.
• Z pozostałej części próbki pobieramy 100 ąl i dodajemy do 10 ml pożywki LB. Inkubujemy przez noc w 37°C z wytrząsaniem, w celu namnożenia bakterii obecnych w próbce, na wypadek, gdyby ich liczba była niewystarczająca do wykonania oznaczeń. Pozwoli to również w razie potrzeby stwierdzić, czy w pierwotnej próbie znajdowały się żywe, czy martwe bakterie (tylko żywe komórki są w stanie dzielić się).
• Kolejne 100 ąl wykorzystujemy do zrobienia posiewów na podłożu LAM (Leeds Acinetobacter Medium), w celu uzyskania izolatów, potwierdzających obecność szukanej bakterii w próbce. Przygotowujemy seryjne rozcieńczenia w soli fizjologicznej zgodnie z załączonym schematem:
PL 223 163 B1
Przygotowane rozcieńczenia oraz pozostałą część próbki wysiewamy na murawę na płytki z podłożem LAM i inkubujemy przez noc w 37°C. Następnego dnia sprawdzamy, czy na płytkach wyrosły kolonie. Szukamy tych o pożądanym fenotypie, tj. okrągłych, wypukłych, o wielkości nie przekraczającej 2 mm średnicy, koloru bladoróżowego lub przeźroczystych, które zabarwiają podłoże z pom arańczowego na różowy. Uzyskanie izolatów z próbek dających dodatni wynik w reakcji Real-Time PCR dodatkowo potwierdza poprawność wykonania oznaczenia. Co więcej, uzyskane w ten sposób kolonie mogą również posłużyć za źródło materiału genetycznego do wykonania reakcji Real-Time PCR w przypadku uzyskania wyników wątpliwych (Fig. 6).
• Do pozostałej próbki dodajemy 200 gl jałowego 50% glicerolu i zamrażamy (-80°C), na wypadek gdyby w przyszłości trzeba było powtórzyć oznaczenie.
REKACJA REAL-TIME PCR
Reakcję przeprowadzamy w termocyklerze płytkowym, zgodnie i następującym profilem termicznym typu one-step.
T a b e l a 1
| Temperatura °C | Czas [min] | Ilość cykli |
| 95,0 | 3:00 | 1 |
| 95,0 | 0:10 | 40 |
| 63,0 | 0:30 |
Reakcję przeprowadzamy w niskoprofilowych płytkach 96-dołkowych, w końcowej objętości 20 gl na dołek. Oznaczenie wykonujemy w dwóch powtórzeniach dla każdej badanej próbki oraz dla kontroli. Do wyznaczenia krzywej standardowej używamy DNA chromosomalnego o stężeniu 100 ng/gl szczepu referencyjnego Acinetobacter baumannii ATCC17978 (szczep pochodzący z American Type Culture Collection), przygotowanego w 6 rozcieńczeniach (10-1-10-6). Jako kontroli negatywnej używamy jałowej wody (Sigma).
Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną o składzie:
• 10 gl SuperMixu (Bio-Rad), zawierającego polimerazę, nukleotydy (dNTPs) bufor oraz jony magnezu (Mg2+), • startery o optymalnym stężeniu ustalonym doświadczalnie (przedstawionym w Tabeli 1), • sondy o optymalnym stężeniu ustalonym doświadczalnie (przedstawionym w Tabeli 1), • dopełniamy jałową wodą do 19 gl.
PL 223 163 B1
W celu ustalenia objętości niezbędnej mieszaniny reakcyjnej należy zsumować ilość próbek, standardów (zwykle 6) i kontroli negatywnych (zwykle 2). Uzyskaną liczbę mnożymy przez 2 (każda reakcja musi być duplikowana) oraz dodajemy 8% przeznaczone na niedokładność i straty podczas pipetowania.
Nanosimy dobrze wymieszaną mieszaninę reakcyjną na płytkę (po 19 pl do każdego dołka), następnie dodajemy matrycę (1 pl).
Przykład
Do przebadania jest 20 próbek.
Obliczenia do mieszaniny reakcyjnej:
(20 próbek + 6 rozcieńczeń standardu + 1 kontrola negatywna) razy 2 powtórzenia = 54, + 8% (z 54) = 58 (wszystkie objętości poszczególnych składników będziemy mnożyć przez 58).
T a b e l a 2
Skład mieszaniny reakcyjnej
| Mieszanina reakcyjna | Objętość na 1 reakcję [pl] | Końcowa objętość (x58) [pl] | |
| SuperMix | 10 | 580 | |
| Startery (korzystamy z roztworów podstawowych o stężeniu 10 nM) | MIC1 górny | 0,9 | 52,2 |
| MIC1 dolny | 0,5 | 29 | |
| IW10 górny | 0,6 | 34,8 | |
| IW10 dolny | 0,9 | 52,2 | |
| Sondy (korzystamy z roztworów podstawowych o stężeniu 10 mM) | S1 | 0,2 | 11,6 |
| S10 | 0,2 | 11,6 | |
| dH2O | 5,7 | 330,6 | |
| Razem | 19 | 1102 |
T a b e l a 3
Stężenia sond i starterów w mieszaninie reakcyjnej
| Nazwa startera | MIC1 | IW10 |
| Sekwencja startera Górny: Dolny: | 5'GGTTAGAGCACACGCTTGATAAG3' 5'AGTTCTGGTGGACTAGGAGAG3' | 5'GGTGAAGTGCCAATGCAACG3' 5'TCCCGGATTTCATTCAAAGCATTC3' |
| Końcowe stężenie do reakcji Real-Time PCR | Górny: 450 pM Dolny: 250 pM | Górny: 300 pM Dolny: 450 pM |
| Nazwa sondy | S1 | S10 |
| Sekwencja sondy (5'-3') | 5'CGAACTCCTGACCTCCTGCGTGC3' | 5'CACGCCTTCTTGCTCGGCTATGGC3' |
| Końcowe stężenie do reakcji Real-Time PCR | 100 pM | 100 pM |
Wyniki reakcji Real-Time PCR można uznać za wiarygodne, jeśli mieszczą się w zakresie wyznaczonej przez standardy krzywej kalibracyjnej. Rozrzut między powtórzeniami dla danej próbki, jak i standardów, czy kontroli nie może przekraczać 0,5 Cq (0,5 cyklu reakcji Real-Time PCR). Wynik badania próbki można uznać za dodatni (wykryto bakterie Acinetobacter baumannii), gdy wartości Cq uzyskane w reakcji Real-Time PCR na obu sondach mieszczą się w zakresie wyznaczonym przez krzywą kalibracyjną.
W przypadku, gdy wyniki reakcji Real-Time PCR nie są miarodajne, materiał genetyczny jest izolowany z kolonii uzyskanych na podłożu LAM i procedura Real-Time PCR jest powtarzana.
PL 223 163 B1
Przykłady wyników i ich interpretacji po reakcji Real-Time PCR
Objaśnienia:
Well - studzienka (miejsce na płytce)
Fluor - fluorofor (osobno otrzymujemy wyniki dla każdej sondy, wyznakowanej odpowiednim fluoroforem)
Content - określamy, czy jest to standard (Std-), badana próbka (Unkn-), czy kontrola (Neg Ctrllub Pos Ctrl-)
| Well | Fluor | Content | Cq | Cq Mean | KOMENTARZ |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A01 | TET | Std-01 | 16,13 | 16,17 | Wartości Cq dla rozcieńczeń wzorca (10_1-10“6) na sondzie wyznakowanej znacznikiem fluorescencyjnym TET. Najwyższa wartość Cq to 34,58. Wszystko powyżej tej wartości traktujemy jako wynik ujemny. |
| A02 | TET | Std-01 | 16,21 | 16,17 | |
| A03 | TET | Std-02 | 19,39 | 19,27 | |
| A04 | TET | Std-02 | 19,15 | 19,27 | |
| A05 | TET | Std-03 | 22,92 | 23,01 | |
| A06 | TET | Std-03 | 23,09 | 23,01 | |
| A07 | TET | Std-04 | 26,88 | 26,99 | |
| A08 | TET | Std-04 | 27,09 | 26,99 | |
| A09 | TET | Std-05 | 30,11 | 30,11 | |
| A10 | TET | Std-05 | 30,11 | 30,11 | |
| A11 | TET | Std-06 | 33,96 | 34,27 | |
| A12 | TET | Std-06 | 34,58 | 34,27 | |
| B01 | TET | Unkn-01 | 16,54 | 16,67 | Wynik dodatni. Wynik w obu powtórzeniach jest wiarygodny, gdyż różnica między wartościami Cq jest mniejsza niż 0,5. |
| B02 | TET | Unkn-01 | 16,81 | 16,67 | |
| B03 | TET | Unkn-02 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. Brak sygnału w obu powtórzeniach. |
| B04 | TET | Unkn-02 | N/A | 0,00 | |
| B05 | TET | Unkn-03 | N/A | 0,00 | Uznajemy, że jest to próbka negatywna. Brak sygnału w pierwszym powtórzeniu. Wartość Cq dla drugiego powtórzenia jest większa niż rozcieńczenia wzorca 10-6. |
| B06 | TET | Unkn-03 | 36,29 | 36,29 | |
| B07 | TET | Unkn-04 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. |
| B08 | TET | Unkn-04 | N/A | 0,00 | |
| B09 | TET | Unkn-05 | 20,53 | 20,52 | Wynik dodatni. |
| B10 | TET | Unkn-05 | 20,50 | 20,52 | |
| B11 | TET | Unkn-06 | 17,52 | 17,77 | Wynik dodatni. |
| B12 | TET | Unkn-06 | 18,01 | 17,77 | |
| C01 | TET | Unkn-07 | 18,32 | 18,40 | Wynik dodatni. |
| C02 | TET | Unkn-07 | 18,48 | 18,40 | |
| C03 | TET | Unkn-08 | 36,14 | 36,08 | Wynik negatywny. |
| C04 | TET | Unkn-08 | 36,03 | 36,08 | |
| C05 | TET | Unkn-09 | 35,50 | 35,50 | Wynik negatywny. |
| C06 | TET | Unkn-09 | N/A | 0,00 |
PL 223 163 B1 cd. tabeli
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| C07 | TET | Unkn-10 | 40,79 | 37,76 | Wynik negatywny. Dla pewności można powtórzyć oznaczenie. |
| C08 | TET | Unkn-10 | 34,74 | 37,76 | |
| C09 | TET | Unkn-11 | 32,82 | 32,96 | Wynik dodatni. Dla pewności należałoby powtórzyć oznaczenie z hodowli nocnej, aby zobaczyć, czy w próbce znajdowały się żywe, namnażające się bakterie (wtedy wartość Cq powinna być niższa, wskazując na zwiększenie się liczby bakterii w próbce). |
| C10 | TET | Unkn-11 | 33,11 | 32,96 | |
| C11 | TET | Unkn-12 | 28,11 | 27,92 | Wynik dodatni. |
| C12 | TET | Unkn-12 | 27,73 | 27,92 | |
| D01 | TET | Unkn-13 | 31,80 | 33,52 | Wynik wątpliwy. Należy powtórzyć oznaczenie ze względu na skrajne wartości Cq oraz ich dużą rozbieżność. |
| D02 | TET | Unkn-13 | 35,23 | 33,52 | |
| D03 | TET | Unkn-14 | 40,38 | 40,38 | Wynik negatywny. |
| D04 | TET | Unkn-14 | N/A | 0,00 | |
| D05 | TET | Unkn-15 | 34,84 | 34,81 | Wynik wątpliwy. Należy powtórzyć oznaczenie ze względu na skrajne wartości Cq. |
| D06 | TET | Unkn-15 | 34,78 | 34,81 | |
| D07 | TET | Unkn-16 | 36,66 | 36,95 | Wynik negatywny. |
| D08 | TET | Unkn-16 | 37,24 | 36,95 | |
| D09 | TET | Unkn-17 | 38,23 | 38,23 | Wynik negatywny. |
| D10 | TET | Unkn-17 | N/A | 0,00 | |
| D11 | TET | Unkn-18 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. |
| D12 | TET | Unkn-18 | N/A | 0,00 | |
| E01 | TET | Unkn-19 | 34,58 | 33,94 | Wynik wątpliwy. Należy powtórzyć oznaczenie ze względu na skrajne wartości Cq. |
| E02 | TET | Unkn-19 | 33,30 | 33,94 | |
| E03 | TET | Unkn-20 | 20,71 | 20,87 | Wynik dodatni. |
| E04 | TET | Unkn-20 | 21,03 | 20,87 | |
| E05 | TET | Unkn-21 | 17,85 | 17,76 | Wynik dodatni. |
| E06 | TET | Unkn-21 | 17,67 | 17,76 | |
| E07 | TET | Unkn-22 | 38,02 | 37,91 | Wynik negatywny. |
| E08 | TET | Unkn-22 | 37,79 | 37,91 | |
| E09 | TET | Unkn-23 | 29,03 | 28,98 | Wynik dodatni. |
| E10 | TET | Unkn-23 | 28,93 | 28,98 | |
| E11 | TET | Neg Ctrl-01 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. Kontrola na wodzie. Czasami zdarzają się zanieczyszczenia podczas nakładania próbek na płytkę, ale wtedy wartość Cq jest powyżej wartości dla rozcieńczenia wzorca 10-6. |
| E12 | TET | Neg Ctrl- 01 | 37,23 | 37,23 | |
| F01 | TET | Neg Ctrl-02 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. |
| F02 | TET | Neg Ctrl-02 | N/A | 0,00 |
PL 223 163 B1 cd. tabeli
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A01 | Texas Red | Std-01 | 16,04 | 16,10 | Wartości Cq dla rozcieńczeń wzorca (101-106) na sondzie wyznakowanej znacznikiem fluorescencyjnym Texas Red. Najwyższa wartość Cq to 34,26. Wszystko powyżej tej wartości traktujemy, jako wynik ujemny. Przy rozcieńczeniu 106 zdarzają się większe rozbieżności niż 0,5, ze względu na niskie stężenie materiału genetycznego. |
| A02 | Texas Red | Std-01 | 16,16 | 16,10 | |
| A03 | Texas Red | Std-02 | 19,20 | 19,09 | |
| A04 | Texas Red | Std-02 | 18,98 | 19,09 | |
| A05 | Texas Red | Std-03 | 22,76 | 22,89 | |
| A06 | Texas Red | Std-03 | 23,01 | 22,89 | |
| A07 | Texas Red | Std-04 | 26,55 | 26,83 | |
| A08 | Texas Red | Std-04 | 27,11 | 26,83 | |
| A09 | Texas Red | Std-05 | 30,63 | 30,49 | |
| A10 | Texas Red | Std-05 | 30,35 | 30,49 | |
| A11 | Texas Red | Std-06 | 33,08 | 33,67 | |
| A12 | Texas Red | Std-06 | 34,26 | 33,67 | |
| B01 | Texas Red | Unkn-01 | 17,01 | 17,01 | Wynik dodatni. Wynik był dodatni również na sondzie znakowanej TET, więc próbkę uznajemy jako dodatnią. Itd. |
| B02 | Texas Red | Unkn-01 | 17,01 | 17,01 | |
| B03 | Texas Red | Unkn-02 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. |
| B04 | Texas Red | Unkn-02 | N/A | 0,00 | |
| B05 | Texas Red | Unkn-03 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. |
| B06 | Texas Red | Unkn-03 | N/A | 0,00 | |
| B07 | Texas Red | Unkn-04 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. |
| B08 | Texas Red | Unkn-04 | N/A | 0,00 | |
| B09 | Texas Red | Unkn-05 | 21,91 | 21,83 | Wynik dodatni. |
| B10 | Texas Red | Unkn-05 | 21,75 | 21,83 |
PL 223 163 B1 cd. tabeli
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| B11 | Texas Red | Unkn-06 | 17,78 | 17,89 | Wynik dodatni. |
| B12 | Texas Red | Unkn-06 | 18,00 | 17,89 | |
| C01 | Texas Red | Unkn-07 | 18,58 | 18,67 | Wynik dodatni. |
| C02 | Texas Red | Unkn-07 | 18,75 | 18,67 | |
| C03 | Texas Red | Unkn-08 | 36,88 | 36,71 | Wynik negatywny. |
| C04 | Texas Red | Unkn-08 | 36,53 | 36,71 | |
| C05 | Texas Red | Unkn-09 | 36,01 | 38,38 | Wynik negatywny. |
| C06 | Texas Red | Unkn-09 | 40,74 | 38,38 | |
| C07 | Texas Red | Unkn-10 | 38,33 | 38,24 | Wynik negatywny. |
| C08 | Texas Red | Unkn-10 | 38,15 | 38,24 | |
| C09 | Texas Red | Unkn-11 | 32,27 | 32,85 | Wynik niepewny, należałoby powtórzyć oznaczenie. |
| C10 | Texas Red | Unkn-11 | 33,44 | 32,85 | |
| C11 | Texas Red | Unkn-12 | 28,60 | 28,56 | Wynik dodatni. |
| C12 | Texas Red | Unkn-12 | 28,52 | 28,56 | |
| D01 | Texas Red | Unkn-13 | 32,06 | 32,61 | Wynik niepewny, należałoby powtórzyć oznaczenie. |
| D02 | Texas Red | Unkn-13 | 33,15 | 32,61 | |
| D03 | Texas Red | Unkn-14 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. |
| D04 | Texas Red | Unkn-14 | 38,82 | 38,82 | |
| D05 | Texas Red | Unkn-15 | 35,74 | 35,55 | Wynik negatywny. |
| D06 | Texas Red | Unkn-15 | 35,36 | 35,55 | |
| D07 | Texas Red | Unkn-16 | 37,15 | 36,94 | Wynik negatywny. |
| D08 | Texas Red | Unkn-16 | 36,72 | 36,94 |
PL 223 163 B1 cd. tabeli
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| D09 | Texas Red | Unkn-17 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. |
| D10 | Texas Red | Unkn-17 | N/A | 0,00 | |
| D11 | Texas Red | Unkn-18 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. |
| D12 | Texas Red | Unkn-18 | 37,06 | 37,06 | |
| E01 | Texas Red | Unkn-19 | 35,00 | 34,29 | Wynik niepewny, należałoby powtórzyć oznaczenie. |
| E02 | Texas Red | Unkn-19 | 33,58 | 34,29 | |
| E03 | Texas Red | Unkn-20 | 21,11 | 21,13 | Wynik dodatni. |
| E04 | Texas Red | Unkn-20 | 21,14 | 21,13 | |
| E05 | Texas Red | Unkn-21 | 18,17 | 18,07 | Wynik dodatni. |
| E06 | Texas Red | Unkn-21 | 17,96 | 18,07 | |
| E07 | Texas Red | Unkn-22 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. |
| E08 | Texas Red | Unkn-22 | N/A | 0,00 | |
| E09 | Texas Red | Unkn-23 | 29,51 | 29,39 | Wynik dodatni. |
| E10 | Texas | Unkn-23 | 29,28 | 29,39 | |
| E11 | Texas Red | Neg Ctrl-01 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. |
| E12 | Texas Red | Neg Ctrl-01 | 37,34 | 37,34 | |
| F01 | Texas Red | Neg Ctrl-02 | N/A | 0,00 | Wynik negatywny. |
| F02 | Texas Red | Neg Ctrl-02 | N/A | 0,00 |
Jak widać, wyniki dla obu sond pokrywają się ze sobą, pomimo iż wykrywane są za ich pomocą odmienne fragmenty DNA, Przeprowadzanie reakcji w duplexie (dodając dwie sondy i odpowiadające im pary starterów do jednej mieszaniny reakcyjnej) pozwala na eliminację próbek dających wynik fałszywie pozytywny, gdyż za dodatnie uznajemy wyłącznie próbki, gdzie wykrywamy sygnał fluorescencji pochodzący z obu sond.
PL 223 163 B1
P r z y k ł a d 2
Próby środowiskowe pobierane z obiektów służby zdrowia cywilnej oraz wojskowej.
| Miejsce i data pobrania próbek | Ilość próbek | Pozytywne wyniki | Ilość uzyskanych izolatów |
| SZPITAL 1 | 60 próbek środowiskowych 15 próbek gleby 10 próbek wody Razem: 85 próbek | 8 | 8 |
| SZPITAL 2 | 30 | 3 | 3 |
| SZPITAL 3 | 20 | 6 | 6 |
| SZPITAL 4 | 20 | 6 | 2 |
| SZPITAL 5 | 20 | - | - |
| RAZEM | 175 | 23 | 19 |
Literatura
1. Real-Time PCR Current Technology and Applications, edited by J. Logan, K. Edwards, N. Saunders, wyd. Caister Academic Press 2009, Norfolk, UK.
2. Jawad A., Hawkey P. M., Heritage J., Snelling A. M., Description of Leeds Acinetobacter medium, a new selective and differential medium for isolation of clinically important Acinetobacter spp., and comparison with Herellea agar and Holton's agar., Journal of Clinical Microbiology, 1994 32:2353-2358
3. Peleg A. Seifert H., Paterson D. L., Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen, Clinical Microbiology Reviews, 2008, p, 538-582
4. Gerner-Smidt P., Tjernberg J., Ursing J., Reliability of phenotypic tests for identification of Acinetobacter species, J. Clin Microbiol. 1991 29; 277-282.
Claims (7)
- Zastrzeżenia patentowe1. Zestaw sond służących do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, znamienny tym, że są to oligonukleotydy o sekwencjach przedstawionych na Fig. 1 i Fig. 2.
- 2. Zestaw sond według zastrz. 1, znamienny tym, że są zawarte w sekwencji powielanej przy pomocy starterów przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4.
- 3. Zestaw starterów oligonukleotydowych do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, znamienny tym, że są to startery o sekwencjach przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4.
- 4. Sposób wykrywania bakterii gatunku Acinetobacter baumannii w próbkach medycznych i/lub środowiskowych, w którym to fragment DNA powiela się w reakcji Real-Time PCR z zastosowaniem starterów, znamienny tym, że w reakcji Real-Time PCR powiela się konserwowane sekwencje z zastosowaniem starterów o sekwencjach przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4, po czym produkty wykrywa się za pomocą sond o sekwencjach przedstawionych na Fig. 1 i Fig. 2.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że produkty charakteryzuje się poprzez sygnały wyemitowane z sond wyznakowanych znacznikami fluoroscencyjnymi.
- 6. Zestaw do analizy materiału genetycznego zawartego w próbkach medycznych i/lub środowiskowych do wykrywania bakterii gatunku Acinetobacter baumannii, znamienny tym, że zawiera startery o sekwencjach przedstawionych na Fig. 3 i Fig. 4 oraz znakowane sondy o sekwencjach przedstawionych na Fig. 1 i Fig. 2.
- 7. Zestaw według zastrz. 6, znamienny tym, że dodatkowo zawiera wzorzec będący DNA chromosomalnym szczepu Acinetobacter baumannii ATCC 17978.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL401061A PL223163B1 (pl) | 2012-10-04 | 2012-10-04 | Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych |
| PCT/PL2013/000130 WO2014054956A1 (en) | 2012-10-04 | 2013-10-02 | New probes for the detection of acinetobacter baumannii, oligonucleotide primers, and the method and kit for the analysis of medical and environmental samples |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL401061A PL223163B1 (pl) | 2012-10-04 | 2012-10-04 | Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL401061A1 PL401061A1 (pl) | 2014-04-14 |
| PL223163B1 true PL223163B1 (pl) | 2016-10-31 |
Family
ID=49486639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL401061A PL223163B1 (pl) | 2012-10-04 | 2012-10-04 | Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL223163B1 (pl) |
| WO (1) | WO2014054956A1 (pl) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109266658B (zh) * | 2018-10-17 | 2022-08-19 | 昆明理工大学 | 一种鲍曼不动杆菌的特异基因及其引物和应用 |
| CN111876507A (zh) * | 2020-08-24 | 2020-11-03 | 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） | 一种快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒及使用方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2924695A (en) * | 1994-06-24 | 1996-01-19 | Innogenetics N.V. | Simultaneous detection, identification and differentiation of eubacterial taxa using a hybridization assay |
| US6562958B1 (en) * | 1998-06-09 | 2003-05-13 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid and amino acid sequences relating to Acinetobacter baumannii for diagnostics and therapeutics |
| WO2002077183A2 (en) * | 2001-03-21 | 2002-10-03 | Elitra Pharmaceuticals, Inc. | Identification of essential genes in microorganisms |
| DE10201923B4 (de) | 2002-01-19 | 2006-05-24 | Deutsche Carbone Ag | Verfahren zur Herstellung eines Gleitkontaktstücks für mittlere bis hohe Stromdichten |
| US20090253128A1 (en) * | 2008-04-03 | 2009-10-08 | Centers For Disease Control Department Of Healthy | Nucleotide sequence for identifying of acinetobacter bacteria, and method and kit of identification of acinetobacter bacteria |
-
2012
- 2012-10-04 PL PL401061A patent/PL223163B1/pl unknown
-
2013
- 2013-10-02 WO PCT/PL2013/000130 patent/WO2014054956A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL401061A1 (pl) | 2014-04-14 |
| WO2014054956A1 (en) | 2014-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Maukonen et al. | Methodologies for the characterization of microbes in industrial environments: a review | |
| Zeng et al. | The oral cancer microbiome contains tumor space–specific and clinicopathology-specific bacteria | |
| CN107022644A (zh) | 果蔬中六种食源性致病菌多重lamp检测引物、检测试剂盒及检测方法 | |
| Atieh | Accuracy of real‐time polymerase chain reaction versus anaerobic culture in detection of Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis: a meta‐analysis | |
| Van Lint et al. | Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples | |
| Lopes et al. | Multiplex real‐time polymerase chain reaction for simultaneous quantification of Salmonella spp., Escherichia coli, and Staphylococcus aureus in different food matrices: Advantages and disadvantages | |
| Vignaud et al. | MLVA for Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin: development of a method suitable for inter-laboratory surveillance and application in the context of a raw milk cheese outbreak in France in 2012 | |
| Ramalho et al. | Improved methods for the enumeration of heterotrophic bacteria in bottled mineral waters | |
| Butcher et al. | Reduced-cost Chlamydia trachomatis-specific multiplex real-time PCR diagnostic assay evaluated for ocular swabs and use by trachoma research programmes | |
| Singh et al. | Label-free, non-invasive light scattering sensor for rapid screening of Bacillus colonies | |
| EP3362927B1 (en) | Methods associated with a database that stores a plurality of reference genomes | |
| Vasavada et al. | Conventional and novel rapid methods for detection and enumeration of microorganisms | |
| Śliwa‐Dominiak et al. | Flow Cytometry in Microbiology: A Review of the Current State in Microbiome Research, Probiotics, and Industrial Manufacturing | |
| Teles et al. | RNA‐oligonucleotide quantification technique (ROQT) for the enumeration of uncultivated bacterial species in subgingival biofilms | |
| Müştak et al. | Detection and differentiation of Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium by multiplex quantitative PCR from different poultry matrices | |
| Leblanc-Maridor et al. | Quantification of Campylobacter spp. in pig feces by direct real-time PCR with an internal control of extraction and amplification | |
| Woron et al. | Development and evaluation of a 4-target multiplex real-time polymerase chain reaction assay for the detection and characterization of Yersinia pestis | |
| PL223163B1 (pl) | Zestaw sond i starterów do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych | |
| Juzwa et al. | Identification of microbes from the surfaces of food-processing lines based on the flow cytometric evaluation of cellular metabolic activity combined with cell sorting | |
| Öncül et al. | Detecting gram-positive anaerobic cocci directly from the clinical samples by multiplex polymerase chain reaction in odontogenic infections | |
| Alnimr et al. | Potential of two nucleic acid amplification assays for quantifying mycobacterial load in respiratory and non-respiratory specimens: a prospective study | |
| Jin et al. | Rapid detection of antibiotic resistance genes in lactic acid bacteria using PMMA-based microreactor arrays | |
| Frank | Microbiology in clinical pathology | |
| Lieske et al. | Laboratory concordance study for the molecular detection of Mycoplasma ovipneumoniae | |
| Martínková et al. | Modelling invasive pathogen load from non-destructive sampling data |