PL203894B1

PL203894B1 - Kompozycja szczepionki i sposób jej wytwarzania, oraz zastosowanie

Info

Publication number: PL203894B1
Application number: PL384581A
Authority: PL
Inventors: Martin Friede; Nathalie Garcon; Philippe Hermand
Original assignee: Smithkline Beecham Biolog
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 2000-04-04
Publication date: 2009-11-30
Also published as: EP1541170A1; CN1911443A; IL189736A0; KR20020067617A; JP2011241222A; NO20110994L; AR023536A1; IL145982A; PL205547B1; CN1739800A; JP5307859B2; ZA200108619B; MY127452A; GB9908885D0; CO5241279A1; EP1905449A2; SI1187629T1; EP1905449A3; CN100542606C

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki i sposób jej wytwarzania, oraz zastosowanie. Rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie osobników podatnych albo cierpiących na choroby nowotworowe przez pozajelitowe albo śluzówkowe podawanie szczepionek według wynalazku.

Immunostymulujące oligonukleotydy zawierające niemetylowane dinukleotydy CpG („CpG) są znane w dziedzinie jako adiuwanty przy podawaniu zarówno drogami ogólnoustrojowymi, jak i śluzówkowymi (WO 96/02555, EP 468520, Davis i wsp., J. Immunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskie i Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). CpG jest skrótem dla dinukleotydowego motywu cytozynaguanozyna obecnego w DNA. Historycznie zaobserwowano, że frakcja BCG DNA może wykazywać efekt przeciwnowotworowy. W dalszych badaniach pokazano, że syntetyczne oligonukleotydy pochodzące z sekwencji genu BCG mają zdolność do indukowania efektu immunostymulatorowego (zarówno in vitro, jak i in vivo). Autorzy tych badań wyciągnęli wniosek, że niektóre sekwencje palindromiczne, włączając w to centralny motyw CG niosą tę aktywność. Centralna rola motywu CG w immunostymulacji została dalej wyjaśniona w publikacji Krieg, Nature 374, str. 546, 1995. Szczegółowa analiza pokazała, że motyw CG musi być w pewnym kontekście sekwencji i takie sekwencje są powszechne w bakteryjnym DNA, ale rzadkie w DNA kręgowców. Sekwencją o właściwościach immunostymulujących jest często: puryna, puryna, C, G, pirymidyna, pirymidyna; przy czym motyw dinukleotydu CG jest niemetylowany, ale wiadomo, że również inne niemetylowane sekwencje CpG są immunostymulatorami i mogą być stosowane w niniejszym wynalazku.

W pewnych kombinacjach sześciu nukleotydów występuje sekwencja palindromiczna. Kilka z tych motywów, bądź jako powtórzenia jednego motywu, bą dź kombinacja różnych motywów, może być obecna w tym samym oligonukleotydzie. Obecność jednej albo większej liczby oligonukleotydów zawierających te sekwencje o właściwościach immunostymulujących może aktywować różne podzestawy immunologiczne, włączając w to komórki-naturalnych zabójców (tzw. komórki NK) (które wytwarzają interferon γ i mają aktywność cytolityczną) i makrofagi (Wooldrige i wsp., tom 89 (nr 8), 1977. Jednakże wykazano obecnie, że czynnikami immunostymulującymi są także inne sekwencje zawierające niemetylowane CpG, a niemające takiej zgodnej sekwencji.

Kiedy CpG wchodzi w skład szczepionek, podaje się go zazwyczaj w postaci wolnego roztworu razem z wolnym antygenem (WO 96/02555; McCluskie i Davis, jak wyżej) lub kowalencyjnie skoniugowany z antygenem (publikacja PCT nr WO 98/16247) albo formułowany z nośnikiem, takim jak wodorotlenek glinu ((powierzchniowy antygen wirusa zapalenia wątroby) Davis i wsp., jak wyżej; Brazolot-Millan i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).

Saponiny są omówione w Lacaille-Dubois, M i Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine tom 2 str. 363-386). Saponiny są glikozydami steroidowymi albo triterpenowymi szeroko rozpowszechnionymi w królestwach roślin i morskich zwierząt. Saponiny w charakterystyczny sposób tworzą koloidalne roztwory w wodzie, które pienią się w czasie wytrząsania, oraz powodują wytrącanie cholesterolu. Kiedy saponiny znajdują się w pobliżu błon komórkowych, tworzą struktury typu porów w błonie, które powodują rozerwanie błon. Hemoliza erytrocytów stanowiąca przykład tego zjawiska, jest właściwością niektórych, ale nie wszystkich saponin.

Saponiny są znane jako adiuwanty w szczepionkach do podawania ogólnoustrojowego. Aktywność adiuwantowa i hemolityczna poszczególnych saponin była intensywnie badana w stanie techniki (Lacaille-Dubois i Wagner, jak wyżej).

Przykładowo, Quil-A (pochodząca z kory południowoamerykańskiego drzewa Quillaja Saponaria Molina) i jego frakcje są opisane w US 5,057,540 oraz „Saponins as vaccine adjuvants Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (l-2):1-55; oraz EP 0362279 B1.

Struktury w postaci cząstek, nazwane kompleksami stymulującymi układ immunologiczny (ang. Immune Stimulating Complexes, ISCOM), zawierające frakcje Quil-A są hemolityczne i zostały zastosowane do wytwarzania szczepionek (Morein, B., EP 0 109 942 B1). Istnieją doniesienia o aktywności adiuwantowej tych struktur (EP 0 109 942 B1; WO 96/11711 ).

Saponiny hemolityczne QS21 i QS17 (frakcje Quil-A oczyszczone przez HPLC) opisano jako silne adiuwanty ogólnoustrojowe, a sposób ich wytwarzania jest ujawniony w patentach USA nr 5,057,540 i EP 0 362 279 B1. W tych pozycjach literaturowych opisane jest również zastosowanie QS7 (niehemolityczna frakcja Quil-A), która działa jako silny adiuwant w szczepionkach ogólnoustrojowych. Zastosowanie QS21 jest dalej opisane w Kensil i wsp. (1991, J. Immunology tom 146, 431-437). Znane są również kombinacje QS21 i polisorbatu albo cyklodekstryny (WO 99/10008). Cząstkowe systemy adPL 203 894 B1 iuwantowe zawierające frakcje Quil-A, takie jak QS21 i QS7 są opisane w WO 96/33739 i WO 96/11711.

Inne saponiny, które zostały zastosowane w badaniach nad szczepionkami ogólnoustrojowymi obejmują te pochodzące z innych gatunków roślin, takich jak Gypsophila i Saponaria (Bomford i wsp., Vaccine, 10(9):572-577, 1992).

Wiadomo, że saponiny stosowano również w badaniach nad szczepionkami stosowanymi przezśluzówkowo, które uwieńczone zostały w różnym stopniu sukcesem w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej. Wykazano uprzednio, że saponina Quil-A nie ma wpływu na indukcję odpowiedzi immunologicznej, kiedy antygen jest podawany donosowo (Gizurarson i wsp., 1994. Vaccine Research 3, 23-29). Jednakże inni autorzy stosowali ten adiuwant z sukcesem (Maharaj i wsp., Can. J. Microbiol, 1986, 32 (5):414-20; Chavali i Campbell, Immunobiology, 174 (3):347-59). ISCOM zawierające saponinę Quil-A zastosowano w preparatach dojelitowych oraz donosowych szczepionki i wykazywały one aktywność adiuwantową (Mci Mowat i wsp., 1991, Immunology, 72, 317-322; Mci Mowat i Donachie, Immunology Today, 12, 383-385).

QS21, nietoksyczna frakcja Quil-A została również opisana jako adiuwant doustny albo donosowy (Sumino i wsp., J. Virol, 1998, 72 (6):4931-9; WO 98/56415).

Opisano zastosowanie innych saponin w badaniach nad szczepieniem donosowym. Przykładowo, saponiny Chenopodium quinoa zostały zastosowane zarówno w szczepionkach donosowych, jak i dojelitowych (Estrada i wsp., Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 1998, 21(3):225-36).

Niniejszy wynalazek dotyczy zaskakującego ujawnienia, że kombinacje immunostymulujących oligonukleotydów (CpG) i saponiny są wyjątkowo silnymi adiuwantami. Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki zawierająca saponinę i immunostymulujący oligonukleotyd obejmujący niemetylowany motyw CpG oraz antygen związany z nowotworem, antygen odrzucania nowotworów lub antygen związany z mechanizmami podtrzymującym nowotwory. Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera ponadto nośnik w postaci cząstek wybrany z grupy obejmującej sole mineralne, emulsje, polimery, liposomy i ISCOM. Korzystniej będący w postaci cząstek nośnik w kompozycji według wynalazku jest emulsją oleju w wodzie lub liposomem, najkorzystniej liposomem zawierającym cholesterol, albo cząstką soli metalu, najkorzystniej wodorotlenkiem glinu lub fosforanem glinu.

Saponina i oligonukleotyd w kompozycjach według wynalazku działają synergistycznie przy indukowaniu przeciwciała swoistego wobec antygenu i mają zdolność indukowania odpowiedzi immunologicznych zwykle związanych z układem immunologicznym typu Th1. A zatem, kompozycja według wynalazku jest odpowiednia nie tylko w immunoprofilaktyce chorób, ale również, ku zaskoczeniu, w immunoterapii chorób, takich jak nowotwory.

Korzystnie immunostymulujący oligonukleotyd w kompozycji według wynalazku zawiera sekwencję puryna, puryna, CG, pirymidyna, pirymidyna. Również korzystnie w kompozycji według wynalazku immunostymulujący oligonukleotyd jest wybrany z grupy obejmującej:

OL1GO1 (SEK NR ID: 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)

OL1GO 2 (SEK NR ID: 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

OLIGO 3 (SEK NR ID: 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

OL1GO 4 (SEK NR ID: 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

OLIGO 5 (SEK NR ID: 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

Ponadto korzystnie immunostymulujący oligonukleotyd w kompozycji według wynalazku zawiera co najmniej dwa niemetylowane powtórzenia CG oddzielone przez co najmniej 3 nukleotydy, a korzystniej co najmniej dwa niemetylowane powtórzenia CG oddzielone przez 6 nukleotydów.

Oligonukleotydy są typowo deoksynukleotydami, a nukleotydy rozdzielające w oligonukleotydzie to fosforoditionian, a korzystniej wiązanie fosforotionianowe, jakkolwiek wiązanie fosfodiestrowe i inne wiązania międzynukleotydowe są również możliwe, w tym również oligonukleotydy z mieszanymi wiązaniami miedzynukleotydowymi. Sposoby wytwarzania oligonukleotydów fosforotionianowych albo fosforoditionianowych są opisane w US 5,666,153, US 5,278,302 i WO95/26204.

Możliwe jest też zastosowanie oligonukleotydów CpG zawierających powyższe sekwencje z mało znaczącymi delecjami albo addycjami. Oligonukleotydy CpG zastosowane w rozwiązaniach we4

PL 203 894 B1 dług wynalazku można zsyntetyzować dowolną ze znanych w tej dziedzinie metod (np. EP 468520). Oligonukleotydy takie można zsyntetyzować przy zastosowaniu automatycznego syntetyzatora.

Oligonukleotydy są typowo deoksyrybonukleotydami. Wiązanie międzynukleotydowe w oligonukleotydzie jest wiązaniem fosforoditionianowym lub wiązaniem fosforotionianowym, jakkolwiek fosfodiestry również mogą znaleźć zastosowanie. Rozważane są również odmienne połączenia międzynukleotydowe, np. mieszane fosforotionianowe fosforodiestry. Można zastosować też inne wiązania międzynukleotydowe, które stabilizują oligonukleotyd.

Korzystnie saponiny stosowane w kompozycji według wynalazku obejmują te pochodzące z kory Quillaja Saponaria Molina, nazywane Quil A oraz ich frakcje opisane w US 5,057,540 i „Saponins as vaccine adjuvants, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; oraz EP 0362 279 B1. Korzystniej pochodną QuilA w kompozycji według wynalazku jest QS21. Innymi istotnymi frakcjami Quil A są QS7 i QS17.

β-escyna jest inną hemolityczną saponiną która może być stosowana w kompozycjach według wynalazku. Escyna jest opisana w indeksie Mercka (wyd. 12: pozycja 3737) jako mieszanina saponin występująca w nasionach kasztanowca (łac. Aesculus hippocastanum). Opisano jej wydzielanie przez chromatografię oraz oczyszczanie (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4,213 (1953)) oraz przez zastosowanie żywic jonowymiennych (Erbring i wsp., US 3,238,190). Frakcje escyny, a i p, oczyszczono i pokazano, że są aktywne biologicznie (Yoshikawa M, i wsp. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Sierpień; 44(8): 1454-1464). W języku angielskim β-escyna (β-escin) jest również znana pod nazwą „aescin.

Kolejną hemolityczną saponiną która może znaleźć zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku jest digitonina. Digitonina jest opisana w indeksie Mercka (wyd. 12: pozycja 3704) jako saponina pochodząca z nasion Digitalis purpurea i oczyszczana zgodnie z procedurą opisaną w Gisvold i wsp., J. Am. Pharm. Assoc, 1934, 23, 664; oraz Ruhenstroth-Bauer, Physiol.Chem., 1955, 301, 621. Opisano jej zastosowanie jako odczynnika chemicznego do oznaczania cholesterolu.

Saponina lub CpG, albo obydwa mogą być związane z nośnikiem w postaci cząstek w celu zwiększenia właściwości adiuwantowych kombinacji. W szczególności szczepionki ogólnoustrojowe mogą zawierać cząsteczkę nośnika.

CpG może być zastosowane w wolnym roztworze albo w kompleksie z nośnikiem w postaci cząstek, takim jak sole mineralne (na przykład, nieograniczająco, sole glinu albo wapnia), liposomy, ISCOM, emulsje (olej w wodzie, woda w oleju, woda w oleju w wodzie), polimery (na przykład, nieograniczająco, polikwas mlekowy, polikwas glikolowy, polifosfazyna, poliaminokwas, alginian, chitozan) albo mikrocząstki. W szczególności mogą być stosowane nośniki kationowe. Szczepionki według wynalazku zawierają ponadto antygen, który może być związany z kompleksem CpG-nośnik, albo może nie być związany z kompleksem CpG-nośnik. W tym przypadku, antygen może być wolną zawiesiną albo może być związany z odrębnym nośnikiem.

Antygen w kompozycji szczepionki według wynalazku obejmuje jeden lub więcej antygenów wybranych z grupy zawierającej: antygen MAGE, PRAME, BAGE, GAGE, swoiste wobec nowotworu gangliozydy, antygen swoisty wobec stercza, Her-2/Neu, KSA (GA733), PAP, mammaglobinę, MUC-1, antygen kanceroembrionalny, antygen błonowy swoisty wobec stercza (PSMA), antygen komórek macierzystych stercza (PSCA), tyrozynazę, surwiwinę, NY-ESOl, prostazę, PS 108, RAGE, LAGE, HAGE, własny hormon peptydowy lub GnRH.

Saponiny w opisanych niniejszym kompozycjach mogą być wyodrębnione w postaci miceli albo mogą być w postaci dużych uporządkowanych struktur, takich jak ISCOM (EP 0 109 942 BI) albo liposomy (WO 96/33739), kiedy zostaną zmieszane z cholesterolem i lipidem, albo w postaci emulsji olej w wodzie (WO 95/17210). Korzystne jest, jeżeli saponiny są związane z solami metali, takimi jak wodorotlenek glinu albo fosforan glinu (WO 98/15287). Alternatywnie saponina może być połączona z nośnikiem w postaci cząstek, takim jak chitozan. Saponina może być również w postaci suchej, takiej jak proszek. Korzystnie końcowe preparaty szczepionki w postaci, w której są one podawane na powierzchnię śluzówki, mają właściwości hemolityczne. Saponina może być związana fizycznie z antygenem przez bezpośrednie wiązanie, bądź współoddziaływanie z tą samą cząsteczką nośnika będącego w postaci cząstek (GB 9822712.7; WO 98/16247), lub też nie. CpG i saponina w adiuwantach albo szczepionkach mogą występować oddzielnie albo w postaci asocjatów. Przykładowo, CpG i saponina mogą być w wolnej zawiesinie albo mogą być połączone za pośrednictwem nośnika, przykładowo nośnika w postaci cząstek, takiego jak wodorotlenek glinu albo przez kationowy liposom albo ISCOM.

PL 203 894 B1

Kompozycja według wynalazku może składać się z jednego lub większej liczby oligonukleotydów CpG zawierających co najmniej 3, korzystnie co najmniej 6 nukleotydów pomiędzy dwoma sąsiednimi motywami CG, łącznie z QS21 i nośnikiem w postaci cząstek wybranym z grupy obejmującej emulsję oleju w wodzie lub DQ. Kompozycja może zawierać CpG 2006 (SEK NR ID: 4), lub CpG 1758 (SEK NR ID: 2) lub CpG 1826 (SEK Nr ID: 1) zmieszane z QS21 oraz nośnikiem w postaci cząstek wybranym z grupy obejmującej emulsję oleju w wodzie lub DQ. Szczepionka podawana osobnikowi drogą ogólnoustrojową jest przeznaczona do wytworzenia ogólnoustrojowych odpowiedzi immunologicznych.

Opisane niniejszym kombinacje adiuwantowe można zastosować zarówno jako adiuwanty ogólnoustrojowe, jak i śluzówkowe. Ogólnoustrojowa szczepionka może być podawana drogą ogólnoustrojową albo pozajelitową taką jak podawanie domięśniowe, doskórne, przezskórne, podskórne, dootrzewnowe i dożylne. Przykładem przezskórnej drogi podawania są plastry skórne.

Rozwiązania według wynalazku można stosować do ochrony albo leczenia ssaka podatnego albo cierpiącego na chorobę, przez podawanie szczepionki ogólnoustrojowej drogą domięśniową dootrzewnową doskórną przezskórną dożylną lub podskórną. Sposoby podawania ogólnoustrojowego preparatów szczepionek mogą obejmować konwencjonalne strzykawki i igły albo urządzenia zaprojektowane do podawania balistycznego szczepionek stałych (WO 99/27961) albo urządzenia do bezigłowego wstrzykiwania płynu pod ciśnieniem (US 4,596,556; US 5,993,412) albo plastrów skórnych (WO 97/48440; WO 98/28037). Rozwiązania według wynalazku można również zastosować do wzmacniania immunogenności antygenów stosowanych na skórę (podawanie przezskórne albo przez naskórkowe WO 98/20734; WO 98/28037). Zatem niniejszym opisano urządzenia do dostarczania ogólnoustrojowego, wstępnie wypełnionych kompozycją szczepionki według wynalazku. Zatem rozwiązania według wynalazku umożliwiają indukowanie odpowiedzi immunologicznej u osobnika przez podawanie osobnikowi szczepionki zawierającej antygen i immunostymulujący oligonukleotyd, saponinę oraz nośnik, przy czym szczepionka jest podawana drogą pozajelitową albo ogólnoustrojową. Niniejszym opisano sposoby indukowania odpowiedzi immunologicznej obejmujące podawanie szczepionki zawierającej oligonukleotyd o SEK NR ID: 1, 2, 3, 4, lub 5 z saponiną pochodzącą z Quil A, taką jak QS21, oraz nośnik taki, jak emulsja oleju w wodzie, liposom zawierający cholesterol albo alum.

Alternatywnie, rozwiązania według wynalazku można stosować do ochrony albo leczenia ssaka podatnego albo cierpiącego na chorobę, przez podawanie szczepionki drogą śluzówkową taką jak droga doustna/pokarmowa albo donosowa. Alternatywnymi drogami śluzówkowymi są droga dopochwowa i doodbytnicza. Śluzówkową drogą podawania jest droga donosowa, nazywaną szczepieniem donosowym. Sposoby szczepienia donosowego są dobrze znane w dziedzinie, włączając w to podawanie szczepionki w kroplach, rozpylaczu albo w postaci suchego proszku do nosogardzieli osobnika, który ma być immunizowany. Kompozycje według wynalazku mogą być rozpylane albo formułowane w aerozolu, albo w postaci kompozycji dojelitowych, takich jak oporne na soki żołądkowe kapsułki i granulki do podawania doustnego, oraz czopków do podawania doodbytniczego albo dopochwowego.

Ujawnione niniejszym kombinacje adiuwantów reprezentują klasę adiuwantów śluzówkowych odpowiednich do podawania ludziom w celu zastąpienia szczepienia ogólnoustrojowego przez szczepienie śluzówkowe. Tak więc, czyste saponiny, takie jak Quil A i ich pochodne, włączając w to QS21, escynę, digitoninę lub saponiny z Gypsophila i Chenopodium quinoa w kombinacji z immunostymulującymi oligonukleotydami można zastosować jako adiuwanty do podawania śluzówkowego antygenów w celu uzyskania ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej.

Kompozycje szczepionek według wynalazku mogą być podawane drogą ogólnoustrojową albo śluzówkową. W szczególności szczepionki stosowane do podawania drogą śluzówkową zawierają saponinę hemolityczną. Korzystnie w szczepionce według wynalazku saponina jest saponiną hemolityczną.

Hemolityczność saponiny albo preparatu saponiny w znaczeniu tego wynalazku ustala się na podstawie następującego testu.

1. Świeżą krew od świnki morskiej przepłukuje się trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w wirówce stołowej. Po ponownym zawieszeniu w wyjściowej objętości krew rozcieńcza się 10-krotnie w PBS.

2. 50 μΐ zawiesiny krwi dodaje się do 800 μΐ PBS zawierającego dwukrotne rozcieńczenia związku powierzchniowo czynnego albo saponiny.

PL 203 894 B1

3. Po 8 godzinach hemolizę ocenia się wizualnie albo przez pomiar gęstości optycznej supernatantu. Obecność czerwonego supernatantu, który adsorbuje światło o długości 570 nm wskazuje na obecność hemolizy.

4. Wyniki wyraża się jako stężenie pierwszego rozcieńczenia saponiny, przy którym hemoliza już nie następuje.

Dla celów niniejszego wynalazku preparat adiuwantowy saponiny jest hemolityczny, jeżeli lizie poddawane są erytrocyty w stężeniu mniejszym niż 0,1%. Zasadniczo czyste próbki QuilA, QS21, QS7, digitoniny oraz β-escyny wszystkie są hemolitycznymi saponinami jak zdefiniowano w tym teście. Uwzględniając nieodłączną zmienność eksperymentalną takiego testu biologicznego, saponiny do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku mają korzystnie aktywność hemolityczną wynoszącą w przybliżeniu pomiędzy 0,5-0,00001%, korzystniej pomiędzy 0,05-0,00001%, jeszcze korzystniej pomiędzy 0,005-0,00001%, a najkorzystniej pomiędzy 0,001-0,0004%. Idealnie, takie saponiny będą miały aktywność hemolityczną podobną (tj. w zakresie 10-krotnej różnicy) do aktywności hemolitycznej QS21.

Szczepionki według wynalazku można również podawać drogą doustną. W takich przypadkach farmaceutycznie dopuszczalna zaróbka może również obejmować bufory alkaliczne albo kapsułki lub mikrogranulki jelitowe. Szczepionki można również podawać drogą dopochwową. W takich przypadkach farmaceutycznie dopuszczalne zarobki mogą również obejmować emulgatory, polimery takie jak CARBOPOL® i inne znane stabilizatory kremów i czopków dopochwowych. Szczepionki według wynalazku można również podawać drogą doodbytniczą. W takich przypadkach farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki mogą również obejmować woski i polimery znane w tej dziedzinie do formowania czopków doodbytniczych.

Niniejszym ujawnione zostały również kompozycje więcej niż jednej saponiny. Przykładem jest tu kombinacja co najmniej dwóch z grupy obejmującej QS21, QS7, Quil A, β-escynę i digitoninę. Dodatkowo, kompozycje szczepionki mogą zawierać kombinację więcej niż jednego immunostymulującego oligonukleotydu.

Kombinacja CpG/saponina do podawania ogólnoustrojowego i śluzówkowego może być ponadto łączona z innymi adiuwantami. Korzystnie kompozycja szczepionki według wynalazku obejmuje monofosforylolipid A lub jego nietoksyczną pochodną 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A. Alternatywne preparaty saponin można łączyć z nośnikami szczepionkowymi składającymi się z chitozanu lub innych polimerów polikationowych, cząstek polilaktydowych i kopolimeru polilaktydu i glikolidu, podłóż polimerowych z poli-N-acetyloglukozaminy, cząstek składających się z polisacharydów albo chemicznie modyfikowanych polisacharydów, liposomów i cząstek wytworzonych z lipidów, cząstek składających się z monoestrów glicerolowych itd. Saponiny można również przygotowywać w obecności cholesterolu w celu wytworzenia struktur cząstkowych, takich jak liposomy albo ISCOM. Ponadto, saponiny można preparować z eterem lub estrem polioksyetylenowym zarówno w roztworze niecząstkowym, jak i zawiesinie, albo strukturami w postaci cząstek, takimi jak liposomy paucilamelarne lub ISCOM. Ponadto saponiny można również preparować z zaróbkami, takimi jak Carbopol® w celu zwiększenia lepkości albo można wytwarzać jako suchy proszek z zaróbką w proszku, takąjak laktoza.

3-de-O-acylowany monofosforylolipid A jest dobrze znanym adiuwantem wytwarzanym przez Ribi Immunochem, Montana. Można go wytworzyć przy zastosowaniu metody przedstawionej w GB 2122204B. Korzystną postacią 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A jest postać emulsji o niewielkich rozmiarach cząstek i średnicach mniejszych niż 0,2 nm (EP 0 689 454 B1). Szczególnie korzystnymi adiuwantami są kombinacje 3D-MPL i QS21 (EP 0 671 948 B1), emulsje olej w wodzie zawierające 3D-MPL i QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414) lub 3D-MPL spreparowany z innymi nośnikami (EP 0 689 454 B1).

Kompozycje według wynalazku zawierają antygen przeciwnowotworowy i mogą być przydatne do immunoterapeutycznego traktowania nowotworów. Przykładowo, kompozycja według wynalazku zawiera antygeny odrzucania nowotworów, takich jak nowotwory prostaty, sutka, okrężnicy i odbytnicy, płuc, trzustki, nerki i czerniaka. Przykładowe antygeny obejmują antygeny MAGE 1 i MAGE 3 lub inne antygeny MAGE (do leczenia czerniaka), PRAME, BAGE lub GAGE (Robbins i Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, str. 628-636; Van den Eynde i wsp., International Journal of Clinical & Laboratory Research (wysłany do druku 1997); Correale i wsp., (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, str. 293). Rzeczywiście, antygeny te są wyrażane w znacznej liczbie nowotworów, takich jak czerniak, rak płuc, mięsak i mięsak pęcherza. Inne antygeny swoiste wobec nowotworów, odpowiednie do użycia w kompozycji według wynalazku, obejmują miedzy innymi swoiste wobec noPL 203 894 B1 wotworu gangliozydy, antygen swoisty wobec prostaty (PSA) lub Her-2/neu, KSA (GA733), PAP, mammaglobinę, MUC-1, antygen kanceroembrionalny (ang. carcinoembryonic antigen, CE A). Tak więc dostarczona szczepionka może zawierać kompozycję adiuwantową i antygen odrzucania nowotworu.

Szczepionki zawierające antygen nowotworowy są zaskakująco silne w terapii nowotworów, takich jak nowotwory prostaty, sutka, okrężnicy i odbytnicy, płuc, trzustki, nerek, jajników i czerniaka. Zatem preparaty mogą zawierać antygen związany z nowotworem, jak również antygeny związane z mechanizmami podtrzymującymi nowotwory (np. angiogenezą inwazją nowotworu). Dodatkowo, antygeny szczególnie odpowiednie do szczepionek w terapii nowotworu zawierają również antygen błonowy swoisty dla prostaty (ang. Prostate-specific membranę antigen, PSMA), antygen komórek macierzystych prostaty (ang. Prostatę Stern Cell Antigen, PSCA), tyrozynazę, surwiwinę, NY-ESOl, prostazę, PS 108 (WO 98/50567), RAGE, LAGE, HAGE. Dodatkowo, taki antygen może być własnym hormonem białkowym, takim jak pełnej długości hormon uwalniający gonadotropinę (ang. Gonadotrophin hormone releasing hormon, GnRH, WO 95/20600), krótki 10 aminokwasowy peptyd przydatny w leczeniu wielu nowotworów albo immunokastracji.

Ilość białka w każdej dawce szczepionki jest wybrana z ilości, która w typowych szczepionkach indukuje ochronną odpowiedź immunologiczną bez znaczących szkodliwych skutków ubocznych.

Takie ilości będą różnić się zależnie od tego, który konkretny immunogen został użyty i jak jest on prezentowany. Ogólnie oczekuje się, że każda dawka będzie zawierała 1-1000 μg białka, korzystnie 1-500 pg, korzystniej 1-100 μg, najkorzystniej 1 do 50 μg. Optymalna ilość dla konkretnej szczepionki może zostać ustalona przez standardowe badania obejmujące obserwacje odpowiednich odpowiedzi immunologicznych w szczepionych osobnikach. Po wstępnym szczepieniu, osobnik może otrzymać jedną albo większą liczbę immunizacji przypominających w odpowiednich odstępach czasowych. Taka kompozycja szczepionki może być podawana na powierzchnię śluzówkową ssaka zarówno w przypadku pierwszego, jak i przypominającego szczepienia, albo alternatywnie może być podawana ogólnoustrojowo, na przykład drogą przezskórną podskórną albo domięśniową.

Ilość CpG albo immunostymulujących oligonukleotydów w kompozycji szczepionki według wynalazku jest generalnie bardzo mała, ale w zależności od preparatu szczepionki może być w zakresie 1-1000 pg na dawkę, korzystnie 1-500 μg na dawkę, a korzystniej między 1-100 μg na dawkę.

Ilość saponiny do zastosowania w adiuwantach według wynalazku może być w zakresie 1-1000 pg na dawkę, korzystnie 1-500 pg na dawkę, korzystniej 1-250 pg na dawkę, a najkorzystniej pomiędzy 1 a 100 pg na dawkę. Proporcja CpG:saponina (wag./wag.) będzie zatem w zakresie od 1:1000 do 1000:1, a typowo będzie w zakresie od 1:100 do 100:1, a korzystnie w zakresie 1:10 do 1:1 lub 1:1 do 10:1, a najkorzystniej 1:1, 4:1 lub 10:1.

Kompozycje według wynalazku można stosować zarówno w celach profilaktycznych jak i leczniczych. Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie (i) saponiny, (ii) immunostymulującego oligonukleotydu zawierającego niemetylowany motyw CpG oraz (iii) antygenu związanego z nowotworem, antygenu odrzucania nowotworów lub antygenu związanego z mechanizmami podtrzymującymi nowotwory do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia raka. Niniejszym opisane zostały sposoby leczenia ssaka podatnego na albo cierpiącego na chorobę nowotworową. Wytwarzanie szczepionki jest generalnie opisane w New Trends and Developments in Vaccines, pod red. Voller i wsp., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA 1978.

Przewiduje się, że kompozycje według wynalazku będą zawierały antygeny pochodzące z rozmaitych źródeł. Przykładowo, antygeny mogą obejmować ludzki, bakteryjny, albo wirusowy kwas nukleinowy, antygen albo preparaty antygenowe pochodzące z patogenu, antygen albo preparaty antygenowe pochodzące z nowotworu, antygeny pochodzące z gospodarza, włączając w to peptydy pochodzące z IgE, takie jak dekapeptyd IgE uwalniający histaminę (znany jako dekapeptyd Stanworth), białka i peptydy wytwarzane przez rekombinowanie DNA oraz chimerowe białka fuzyjne.

Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję szczepionki ogólnoustrojowej zawierającej antygen, saponinę i immunostymulujący oligonukleotyd. A zatem rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie osobnika podatnego na albo cierpiącego na chorobę przez podawanie osobnikowi kompozycji zasadniczo tu opisanej drogą ogólnoustrojową. Możliwe jest również zapobieganie nabywaniu przez osobnika choroby wybranej z grupy obejmującej nowotwory prostaty, sutka, okrężnicy i odbytnicy, płuc, trzustki, nerek, jajników i czerniaka obejmujące podawanie osobnikowi kompozycji zasadniczo tu opisanej drogą ogólnoustrojową.

Alternatywnie, niniejszy wynalazek dostarcza dośluzówkowej kompozycji szczepionki zawierającej antygen i hemolityczną saponinę. A zatem rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie

PL 203 894 B1 osobnika podatnego albo cierpiącego na chorobę przez podawanie osobnikowi kompozycji zasadniczo tu opisanej na powierzchnię śluzówkową tego osobnika.

Niniejszym opisany jest sposób indukowania ogólnoustrojowej, swoistej wobec antygenu odpowiedzi immunologicznej u ssaka, obejmujący podawanie na powierzchnię śluzówkową tego osobnika kompozycji szczepionki zawierającej antygen i hemolityczną saponinę.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania kompozycji szczepionki według wynalazku obejmujący zmieszanie (i) saponiny, (ii) immunostymulującego oligonukleotydu zawierającego niemetylowany motyw CpG oraz (iii) antygenu związanego z nowotworem, antygenu odrzucania nowotworów lub antygenu związanego z mechanizmami podtrzymującymi nowotwory.

Przykłady odpowiednich farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku obejmują wodę, buforowaną fosforanem sól fizjologiczną i buforowane roztwory izotoniczne.

Opis figur

Fig. 1: Miana IgG swoistych wobec OspA 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.

Fig. 2: Miana LA2 swoistych wobec OspA 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.

Fig. 3: Miana IgG swoistych wobec szczepu wirusa grypy w surowicy 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.

Fig. 4: Miana HAI (hamowania hemaglutynacji) w surowicy swoistego wobec szczepu wirusa grypy 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.

Fig. 5: Miana LA2 swoistych wobec OspA u myszy

Fig. 6: Aktywność komórek śledziony powodująca proliferację limfocytów swoista wobec gp120 u immunizowanych myszy. Aktywność swoista wobec antygenu wyraż ono jako SI dla róż nych stęże ń antygenów we wszystkich 4 grupach eksperymentalnych.

Fig. 7: Aktywność CTL komórek śledziony swoista wobec HBsAg u immunizowanych myszy. Aktywność komórek efektorowych badano w teście wykorzystującym uwalnianie ⁵¹Cr w komórkach P815 (pokazane jako niewypełnione kółka) oraz w s-transfekowanych komórkach P815 (pokazane jako zaciemnione kółka).

Fig. 8: Odpowiedzi przeciwciał swoiste wobec HBsAg u immunizowanych myszy. Miana swoistych przeciwciał (wyrażone jako EU/ml) oraz profile izotypowe określono w testach ELISA. Wartości dla zlanych surowic pokazano w tabeli; rozkład izotypów przedstawiono również w postaci graficznej.

Fig. 9: Aktywność komórek śledziony powodująca proliferację limfocytów swoista wobec gp120 i HBSAg u immunizowanych myszy. Aktywność swoista wobec antygenów wyraż ono jako SI dla róż nych ich stężeń antygenu we wszystkich 4 grupach eksperymentalnych.

Fig. 10: Aktywność CTL komórek śledziony swoista wobec HBsAg i gp120 u immunizowanych myszy. Aktywność komórek efektorowych badano w teście wykorzystującym uwalnianie ⁵¹Cr w kontrolnych komórkach P815 (pokazane jako niewypełnione symbole) lub w komórkach P815 prezentujących epitopy dla HBsAg i gp120 (pokazane jako wypełnione symbole).

Fig. 11: Odpowiedzi przeciwciał swoiste wobec HBsAg i gp120 u immunizowanych myszy. Miana swoistych przeciwciał (wyrażone jako μg/ml) (fig. 11 A) oraz profile izotypowe określono w testach ELISA. Wartości dla zlanych surowic pokazano w tabeli; rozkład izotypów przedstawiono również w postaci graficznej. Fig 11B przedstawia wzór izotypowy przeciwciał swoistych dla gp120.

Fig. 12: Rozwój średniego wzrostu nowotworu w czasie w grupie 10 zwierząt.

Niniejszy wynalazek będzie zilustrowany nieograniczająco przez następujące przykłady.

P r z y k ł a d 1

Zastosowanie QS21 oraz CpG do donosowego szczepienia pobudzającego ogólnoustrojowe przeciwciała skierowane przeciw Lipo-OspA

W niniejszym przykładzie badano, czy lityczne saponiny, takie jak QS21, oraz czynniki immunostymulujące takie, jak CpG, są zdolne do wzmocnienia w sposób synergiczny ogólnoustrojowych odpowiedzi immunologiczych na donosowe szczepienie przypominające u myszy. Samice myszy Balb/c (po 5 zwierząt w grupie) w wieku 8 tygodni, immunizowano domięśniowo lipo-OspA (1 μg) przygotowanym w alumie (50 μg). Po 3 miesiącach myszy poddawano donosowemu szczepieniu przypominającemu (pod narkozą) 10 μl roztworu (po 5 μl na nozdrze, podawane kropelkowo pipetą), zawierającego 5 μg lipo-OspA w A: PBS; B: 20 μg CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT, Krieg 1826); C: 5 μg QS21 (otrzymane z Cambridge Biotech, USA); D: 20 μg CpG 1001 + 5 μg QS21 lub E: domięśniowemu zastrzykowi 1 μg lipo-OspA zaadsorbowanemu na alumie (50 μg). Fig. 1 i fig. 2 przedstaPL 203 894 B1 wiają miana IgG swoistych wobec OspA oraz miana LA2 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.

Sposoby

Test ELISA do pomiaru IgG swoistych wobec OspA w surowicy myszy

Płytki immunologiczne Maxisorp Nunc opłaszczono przez noc w 4°C, 50 μl na studzienkę, roztworu 1 μg/ml OspA rozcieńczonego w PBS (w rzędach od B do H płytki) lub 50 μl roztworu 5 μg/ml oczyszczonych kozich anty-mysich Ig (Boerhinger) w PBS (rząd A). Wolne miejsca tych płytek blokowano (1 godzina, 37°C) wykorzystując roztwór nasycający: PBS zawierający 1% BSA, 0,1% TWEEN 20 oraz 4% normalnej surowicy bydlęcej (NBS). Następnie, seryjne dwukrotne rozcieńczenia mieszaniny izotypowej IgG, rozcieńczonej w buforze nasycającym (50 μl na studzienkę), stosując je jako krzywą standardową (mieszanina mysich monoklonalnych przeciwciał IgG1, IgG2a i IgG2b z Sigma, począwszy od 200 ng/ml - rząd A) oraz próbki surowicy (począwszy od rozcieńczenia 1:100 - rzędy od B do H) inkubowano przez godzinę i 30 minut w 37°C. Następnie płytki przemywano (trzy razy) w roztworze do płukania (PBS, 0,1% TWEEN 20). Po czym inkubowano z biotynylowanymi kozimi przeciwciałami anty-mysimi IgG (Amersham), rozcieńczonymi 1:5000 w buforze nasycającym (50 μl na studzienkę) przez jedną godzinę i 30 minut w 37°C. Następnie po trzech płukaniach oraz dodaniu koniugatu streptawidyny z peroksydazą chrzanową (Amersham), płytki płukano pięciokrotnie i inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej z 50 fal na studzienkę buforu do wywoływania o składzie: OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) i H2O2 0,03% w 50 mM pH 4,5 buforze cytrynianowym. Wywoływanie zatrzymywano przez dodanie 50 μl na studzienkę 2N H₂SO₄. Gęstość optyczną odczytywano przy 492 i 630 nm przy zastosowaniu immunoczytnika Biorad 3550. Miana przeciwciał obliczano metodą matematyczną z 4 parametrami, stosując oprogramowanie SoftMaxPro.

Test hamowania do pomiaru miana przeciwciał LA2-podobnych przeciw lipo-OspA w surowicy

Miana przeciwciał w szczepionkach badano pod kątem ich swoistości do przeciwciał LA2-podobnych. LA2 jest monoklonalnym mysim przeciwciałem, które rozpoznaje konformacyjny epitop OspA na powierzchni bakterii. Przeciwciało to ma zdolność do zabijania B. burgdorferi in vitro, jak również do ochrony myszy przed prowokowaniem laboratoryjnymi krętkami (Schaible UE i wsp. 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87:3768-3772). Dodatkowo, udowodniono, że monoklonalne przeciwciała LA2 korelują z bakteriobójczymi przeciwciałami, poza tym w badaniach ludzkich surowic wykazano korelacje pomiędzy mianami IgG anty OspA oraz mianami LA2 (w testach ELISA).

Płytki immunologiczne Maxisorp Nunc opłaszczano przez noc w 4°C 50 μl na studzienkę 0,5 μg/ml lipo OspA w PBS. Wolne miejsca płytek blokowano buforem nasycającym (100 μ!/ studzienkę) przez 1 godzinę, w 37°C (bufor nasycający: PBS zawierający 1% BSA, 0,1% TWEEN 20 oraz 4% normalnej surowicy bydlęcej (NBS)). Następnie seryjne dwukrotne rozcieńczenia monoklonalnych przeciwciał LA2, począwszy od stężenia 4 ąg/ąl przygotowano w buforze nasycającym (50 ąl na studzienkę), aby uzyskać krzywą standardową. Następnie dodano rozcieńczenia próbek surowicy ze szczepionych zwierząt (począwszy od rozcieńczenia 1:10) i inkubowano przez 2 godziny w 37°C. Po inkubacji płytki płukano trzykrotnie w PBS/TWEEN 20 (0,1%). Następnie do każdej studzienki dodano koniugat monoklonalnego przeciwciała LA2 z peroksydazą rozcieńczone (1:10000) w roztworze nasycającym (50 ąl na studzienkę) i inkubowano przez godzinę w 37°C. Po pięciu płukaniach płytki inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej (w ciemności) z 50 ąl na studzienkę buforu do wywoływania o składzie: OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) i H2O2 0,03% w 50 mM bufor cytrynianowy pH 4,5. Wywoływanie zatrzymywano przez dodanie 50 ąl na studzienkę 2N H2SO4. Gęstość optyczną odczytywano przy 492 i 630 nm przy zastosowaniu immunoczytnika Biorad 3550. Miana LA-podobnych monoklonalnych przeciwciał obliczano metodą matematyczną z 4 parametrami stosując oprogramowanie SoftMaxPro, porównując z krzywą standardową.

Wyniki

Zarówno CpG, jak i QS21 w znaczący sposób poprawiały doszczepianie w przypadku ogólnoustrojowych przeciwciał przeciw Lipo-IspA przy szczepieniu donosowym. Dodatkowo przy zastosowaniu obu adiuwantów obserwowano efekt synergiczny, w szczególności w przypadku odpowiedzi przeciwciał LA2. Odpowiedzi humoralne wywołane w obecności QS21 i CpG były znacząco wyższe niż te indukowane przez rodzicielskie szczepienie przypominające. Podsumowując, uzyskane wyniki pokazują możliwości donosowych mieszanin zawierających lityczną saponinę oraz czynnik immunostymulujący.

P r z y k ł a d 2

Synergiczna kombinacja QS21 i CpG, wspomagająca donosowe szczepienie pobudzające ogólnoustrojowe przeciwciała skierowane przeciwko wirusowi grypy

PL 203 894 B1

W niniejszym przykł adzie badano, czy hemolityczne saponiny, takie jak QS21, oraz czynniki immunostymulujące, takie jak CpG, są zdolne do wzmocnienia w sposób synergiczny (współdziałający) donosowego szczepienia przypominającego w przypadku ogólnoustrojowych przeciwciał u myszy traktowanych donosowo całym, nieaktywnym wirusem grypy.

Samice myszy Balb/c (po 10 zwierząt w grupie) w wieku 8 tygodni, immunizowano donosowo nieaktywnym (traktowanym β-propiolaktonem) wirusem grypy (A/Beijing/262/95; A/Johannesburg/33/94; B/Panama/45/90; 5 μg HA/szczep) w celu naśladowania naturalnego występowania u ludzi. Po 28 dniach myszy poddawano donosowemu szczepieniu przypominającemu (pod narkozą) 20 μl roztworu (po 10 μl na nozdrze, podawane kropelkowo pipetą) zawierającego 1,5 μg HA/nieaktywnego, całego wirusa grypy (te same szczepy, co w pierwotnych immunizacjach) w: A. PBS; B. 50 μg CpG (TCG TCG TTT TGT CGT TTT, GTC, GTT Krieg 2006); C. 4,5 μg QS21 (otrzymane z Cambridge Biotech, USA); D. 50 μg CpG 1001 + 4,5 μg QS21 lub E. oraz domięśniowy zastrzyk 1,5 μg HA/szczep nieaktywnego, rozdzielonego wirusa grypy (te same szczepy, co w immunizacjach pierwotnych). Antygeny grypy otrzymano z SSD GmBH (Drezno, Niemcy).

Fig. 3 i fig. 4 przedstawiają miana IgG swoistych wobec szczepów wirusa grypy oraz miana HAI (hamowanie hemaglutynacji) 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.

Sposoby

Test ELISA do pomiaru miana IgG skierowanych przeciw wirusowi grypy u myszy

Płytki immunologiczne Maxisorp Nunc opłaszczano przez noc w 4°C, 50 μl na studzienkę antygenem całego wirusa grypy (1 μg/ml) w PBS (w rzędach od B do H płytki) oraz 50 μl roztworu 5 μg/ml oczyszczonych kozich anty-mysich Ig (Boerhinger) w PBS (rząd A). Wolne miejsca tych płytek blokowano (1 godzina, 37°C) wykorzystując roztwór nasycający: PBS zawierający 1% BSA, 0,1% TWEEN 20 oraz 4% normalnej surowicy bydlęcej (NBS). Następnie, seryjne dwukrotne rozcieńczenia mieszaniny izotypowej IgG, rozcieńczone w buforze nasycającym (50 μl na studzienkę) - stosowane jako krzywa standardowa (mieszanina mysich monoklonalnych przeciwciał IgG1 IgG2a i IgG2b z Sigma, począwszy od 200 ng/ml - rząd A) oraz próbki surowicy (począwszy od rozcieńczenia 1:100 - rzędy od B do H) inkubowano przez godzinę i 30 minut w 37°C. Następnie płytki przemywano (trzy razy) w buforze do płukania (PBS, 0,1% TWEEN 20). Po czym inkubowano z biotynylowanymi kozimi przeciwciałami anty-mysimi IgG (Amersham) rozcieńczonymi 1:5000 w buforze nasycającym (50 μl na studzienkę) przez godzinę i 30 minut w 37°C. Następnie, po trzech płukaniach oraz dodaniu koniugatu streptawidyny z peroksydazą chrzanową (Amersham), płytki płukano pięciokrotnie i inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej z 50 μl na studzienkę buforu do wywoływania o składzie: OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) i H2O2 0,03% w 50 mM buforze cytrynianowym pH 4,5. Wywoływanie zatrzymywano przez dodanie 50 ul na studzienkę 2N H2SO4. Gęstość optyczną odczytywano w 492 i 630 nm przy zastosowaniu immunoczytnika Biorad 3550. Miana przeciwciał obliczano metodą matematyczną z 4 parametrami stosując oprogramowanie SoftMaxPro. Całe wirusy grypy zastosowane do pokrycia płytek (szczep A/Beijing/262/95), nieaktywny - po traktowaniu β-propiolaktonem (BPL) otrzymano z SSD GmBH (Drezno, Niemcy).

Aktywność hamowania hemaglutynacji (HAI) przeciwciał przeciw wirusowi grypy w surowicy myszy

Surowicę (25 μβ początkowo traktowano w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut 100 μl buforu boranowego 0,5 M (pH 9) oraz 125 ml kaolinu, zakupionej w Dade Behring. Po odwirowaniu (30 minut, 3000 RPM lub 860 g), 100 μl supernatantu (odpowiadającego 1:10 rozcieńczenia surowicy) pobrano i inkubowano przez 1 godzinę w 4°C w 0,5% czerwonych krwinkach kurczaka. Następnie, pobrano supernatant po uprzednim wirowaniu przez 10 minut przy 3200 RPM (970 g). Obie procedury stosowano w celu wyeliminowania naturalnych czynników hemaglutynujących zawartych w surowicach. Następnie, 25 μl tak traktowanych surowic rozcieńczano w 25 μl PBS (seryjne dwukrotne rozcieńczenia począwszy od 1:20) na 96-studzienkowych płytkach Greiner. W następnym etapie dodano cały wirus grypy zinaktywowany BPL (25 μl na studzienkę) w stężeniu 4 jednostki hemaglutynacji (tj. w rozcieńczeniu 4-krotnie niższym niż ostatnie wywołujące aglutynację czerwonych krwinek) i inkubowano wytrząsając przez 30 minut w RT. W kolejnym kroku, dodawano czerwone krwinki kurczęcia (25 μl na studzienkę) i inkubowano godzinę w temperaturze pokojowej. Ostatecznie, płytki przed odczytaniem trzymano przez noc w 4°C. Miano HAI odpowiadało ostatniemu rozcieńczeniu surowicy, które hamowało indukowaną przez wirus hemaglutynację.

Wyniki

Zarówno CpG, jak i QS21 nie poprawiały przypominania w przypadku IgG oraz przeciwciał HAI przeciw szczepom grypy przy szczepieniu donosowym. Jednakże, przy zastosowaniu obu adiuwantów

PL 203 894 B1 obserwowano efekt synergiczny, wywołujący powyższe odpowiedzi przeciwciał. Odpowiedzi HAI wywołane w obecności QS21 i CpG były podobne do tych indukowanych przez rodzicielskie szczepienie. Podsumowując, uzyskane wyniki pokazują możliwości donosowych mieszanin zawierających lityczną saponinę oraz czynnik immunostymulujący. Pokazują one również, że różne sekwencje CpG mogą być wydajne w tym zastosowaniu (Krieg 2006 w niniejszym przykładzie oraz Krieg 1826 w przykładach 3 i 5).

P r z y k ł a d 3

Synergiczna kombinacja β-escyny i CpG do wzmacniania donosowego szczepienia pobudzającego ogólnoustrojowe przeciwciała przeciw Lipo-OspA

W niniejszym przykładzie zbadano, czy współdziałanie podobne do zaobserwowanego pomiędzy QS21 i CpG może zachodzić z innymi saponinami hemolitycznymi (patrz przykład) takimi jak β-escyna. Badane są również niehemolityczne saponiny, takie jak kwas glicyryzynowy.

Samice myszy Balb/c (po 6 zwierząt w grupie) w wieku 8 tygodni, immunizowano domięśniowo lipo-OspA (1 μg) przygotowanym w alumie (50 μg). Po 3 miesiącach myszy poddawano donosowemu szczepieniu przypominającemu (pod narkozą) 10 μl roztworu (po 5 μl na nozdrze, podawane kropelkowo pipetą) zawierającego 5 μg lipo-OspA w: A. PBS; B. 50 μg CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT, Krieg 1826); C. 5 μg p-escyny (otrzymane z Sigma); D. 50 μg CpG 1001 + 5 μg β-escyny; E. 5 μg kwasu glicyryzynowego (zakupione z Sigma); F. 50 μg CpG 1001 + 5 μg kwasu glicyryzynowego i G. domięśniowemu zastrzykowi 1 μg lipo-OspA zaadsorbowanemu na alumie (50 μg). Fig. 5 przedstawia miana LA2 swoistych wobec OspA w 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.

Sposoby

W niniejszym przykładzie stosowano sposoby takie same, jak w przykładzie 1.

Wyniki β-Escyna i CpG działają synergicznie przy wzmacnianiu donosowego szczepienia przypominającego w przypadku ogólnoustrojowych przeciwciał LA2. Odpowiedzi przeciwciał wywołane w obecności β-escyny i CpG są znacząco wyższe niż te indukowane przez rodzicielskie szczepienie przypominające. Jednocześnie, nie zaobserwowano współdziałania w przypadku kombinacji CpG i kwasu glicyryzynowego.

Powyższe wyniki, jak i przedstawione wcześniej w ramach patentu, pokazują zdolność CpG oraz różnych saponin hemolitycznych do wzmacniania odpowiedzi immunologicznych w sposób synergiczny.

P r z y k ł a d 4

Badanie immunogenności przy zastosowaniu P. falciparum RTS,S i HIV-1 gp120 przygotowanym z CpG i/lub DQS21

1. Plan eksperymentu

Przeprowadzono dwa badania immunogenności myszy w celu ustalenia potencjalnego addytywnego lub synergicznego efektu oligonukleotydów CpG i QS21. Grupy mysz immunizowano RTS,S oraz gp120, przygotowanymi z CpG lub QS21 oddzielnie lub w kombinacji. Wymienione adiuwanty badano również w obecności nośnika Al(OH)3 lub emulsji olej-woda (emulsja o/w).

Immunogenność powyższych kompozycji badano po dwóch immunizacjach pozajelitowych. Surowice analizowano pod kątem obecności przeciwciał swoistych wobec antygenu oraz pod kątem rozkładu izotypów przeciwciał. Komórek śledziony używano do określenia komórkowych odpowiedzi immunologicznych. Te komórki badano pod kątem obecności cytotoksycznych limfocytów T (CTL) i komórek limfoproliferacyjnych (proliferacja limfocytów).

T a b e l a 1

Grupy myszy w eksperymencie 1

Grupa	Antygen	Ad i u want
1	RTS,S/gp120	CpG/DQS21
2	RTS,S/gp120	DQS21
3	RTS,S/gp120	CpG/DQS21/Al(OH)3
4	RTS,S/gp120	CpG/Al(OH)3

PL 203 894 B1

T a b e ΐ a 2

Grupy myszy w eksperymencie 2

Grupa	Antygen	Ad i u want
1	RTS,S/gp120	CpG
2	RTS,S/gp120	CpG/DQS21
3	RTS,S/gp120	CpG/QS21/emulsja o/w

2. Przygotowanie próbek

2.1 Eksperyment 1

Proces przygotowywania próbek:

Próbki przygotowywano na 3 dni przed wstrzyknięciem. W razie konieczności RTS,S (10 μg) oraz gp120 (10 μg) adsorbowano na 100 μg Al(OH)₃. W razie konieczności, dodawano MPL (5 μg) i inkubowano 30 minut przed dodaniem roztworu w postaci 10-krotnie stężonego PBS pH 7,4 i H2O, z wyjątkiem grup bez DQ, dla których roztworem był PO₄, NaCl 10:150 pH 6,8. Po 30 minutach, w razie konieczności, mieszano QS21 (5 μg) z liposomami w stosunku wagowym QS21 :cholesterol wynoszącym 1:5 (zwanym DQ) i dodawano do przygotowanej próbki. 30 minut później, dla próbek zawierających oligonukleotyd, dodawano 100 μg CpG, a następnie po 30 minutach dodawano tiomersal do stężenia 50 μg/ml - środek konserwujący.

Al(OH)₃+RTSS+gp120-1h-MPL-30min-premix-30min-DQ-30min-CpG-30min-Thio

Wszystkie inkubacje przeprowadzono w temperaturze pokojowej z mieszaniem.

2.2. Eksperyment 2

Proces przygotowania próbek:

Próbki przygotowywano jednocześnie dla dwóch zastrzyków. Zastrzyki podawane jednej myszy miały objętość 100 μ], Do próbek dodawano tiomersal do stężenia 50 μg/ml -środek konserwujący.

Grupa 1: RTS,S (10 μg) i gp120 (10 μg) rozcieńczano w H₂O i PBS pH 6,8, aby osiągnąć izotoniczność. Po 5 minutach próbkę adsorbowano na CpG 1856 (100 μg).

Grupa 2: RTS,S (10 μg) i gp120 (10 μg) rozcieńczano w H₂O i PBS pH 7,4, aby osiągnąć izotoniczność. Po 30 minutach RTS,S i gp120 adsorbowano na DQ (5 μg). Następnie, po 30 minutach adsorpcji, próbkę adsorbowano na CpG 1856 (100 μg).

Grupa 3: RTS,S (10 μg) i gp120 (10 μg) rozcieńczano w H₂O i PBS pH 6,8, aby osiągnąć izotoniczność. Po 5 minutach próbkę adsorbowano na emulsji o/w. Po 5 minutach adsorpcji próbkę adsorbowano na QS21 (5 μg) przed dodaniem CpG (100 μg).

3. Sposoby immunologiczne myszy (pokolenie F1 krzyżówki Balb/C x C57B1/6) w grupie otrzymało w tyle łapy po 2 zastrzyki (2 x 50 μθ w odstępach dwu tygodniowych. Po dwóch tygodniach pobrano próbki surowicy w celu określenia odpowiedzi przeciwciał, pobrano również komórki śledziony w celu określenia immunologicznej odpowiedzi komórkowej.

W celu przeprowadzenia analizy proliferacji limocytów, komórki wysiano w 4-krotnych powtórzeniach w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania ze studzienkami o okrągłych dnach w zagęszczeniu 2x10⁶/ml. Komórki hodowano przez 72 lub 96 godzin w pożywce RPMI-1640, uzupełnionej antybiotykami, glutaminą oraz 1% (obj./obj.) zwykła surowicą mysią w obecności różnych stężeń RTS,S lub antygenu gp120. Komórki kontrolne hodowano bez antygenu. Następnie, komórkom podano przez noc 1 μCi/studzienkę [³H]-tymidynę, zebrano je i obliczono włączenie radioaktywności odpowiednim licznikiem. Wyniki przedstawiono jako średnią zliczeń na minutę (cpm).

W celu przeprowadzenia analizy CTL, komórki hodowano przez 7 dni na 6-studzienkowych płytkach, w obecności 10 μ9/μ! sztucznego peptydu pCMI003 (IPQSLDSWWTSL), który odpowiadał epitopowi HbsAg CTL (Schirmbeck i wsp., 1995), lub peptydu pCMI007 (GIHIGPGRAFYAARK), odpowiadającemu epitopowi gp120 CTL (Casement i wsp., 1995). Po hodowli, komórki efektorowe badano (w dwóch powtórzeniach) pod kątem aktywności cytolitycznej, swoistej dla HBsAg, w standardowym teście wykorzystującym uwalnianie [⁵¹Cr], wykorzystując komórki kontrolne i S-transfekowane komórki P815. Cytotoksyczność swoistą wobec gp120 mierzono wykorzystując komórki docelowe P815, nie traktowane oraz traktowane przez jedną godzinę peptydem pCMI007. Minimalne i maksymalne uwalnianie określano odpowiednio dla komórek docelowych bez komórek efektorowych oraz przez dodanie 3% (obj./obj.) Triton X-100. Wyniki przedstawiono jako % uwolnionego

PL 203 894 B1

[⁵¹Cr] (cpm dla hodowli - cpm uwalniania spontanicznego / cpm uwalniania maksymalnego - cpm uwalniania spontanicznego).

Miareczkowanie oraz określanie izotypów zlanych surowic przeprowadzano w standardowym teście ELISA, wykorzystując płytki pokryte HBsAg. Surowice rozcieńczano w PBS/BSA począwszy od 1:400. Biotynylowane przeciwciała drugorzędowe swoiste Ig lub izotypów IgG1, IgG2a i IgG2b oraz koniugatu streptawidyny z peroksydazą chrzanową używano przy wykrywaniu związanych przeciwciał. Miana ELISA obliczano względem standardu, wykorzystując SoftmaxPro, i wyrażano w jednostkach ELISA (EU/ml). Miana przeciwciał swoistych wobec gp120 określano w standardowym teście ELISA, wykorzystując płytki pokryte białkiem gp120. Surowice rozcieńczano w PBS/TWEEN20/BSA począwszy od 1:100. Biotynylowane przeciwciała drugorzędowe swoiste wobec Ig lub izotypów IgG1, IgG2a i IgG2b oraz koniugatu streptawidyny z peroksydazą chrzanową używano przy wykrywaniu związanych przeciwciał. Miana obliczano odnosząc się do standardu mysich Ig i wyrażano jako pg/ml.

4. Wyniki

Eksperyment 1

Analiza odpowiedzi powodującej proliferację limfocytów nie wykazała znaczących różnic w reaktywności na RTS,S pomiędzy grupami. Jednakże, grupy 1 i 3, zawierające zarówno CpG jak i DQ21, wykazywały lepszą odpowiedź limfoproliferacyjną swoistą wobec gp120 w porównaniu z grupami, zawierającymi oddzielnie CpG i DQS21 (fig. 6).

W opisywanym eksperymencie mierzono tylko CTL swoiste wobec HBsAg. Nie zaobserwowano znaczącej różnicy w indukcji CTL pomiędzy grupami 1 i 3, które otrzymały CpG i DQS21 w kombinacji, a grupami 2 i 4, immunizowanymi tylko jednym z dwóch adiuwantów, podczas gdy obecność Al(OH)3 obniżyła aktywność CTL zaobserwowanej w przypadku kombinacji CpG i DQS21 w grupie pierwszej (fig. 7). Jednakże, zaobserwowano tendencję polegającą na tym, że CpG i DQS21 działało lepiej niż samo DQS21, oraz fakt, że kombinacja indukowała więcej CTL w obecności Al(OH)3, w porównaniu z samym CpG (fig. 7).

Humoralną odpowiedź immunologiczną myszy badano tylko pod kątem obecności przeciwciał swoistych wobec HBsAg. Miana były takie same we wszystkich grupach, z wyjątkiem grupy trzeciej, gdzie zaobserwowano około 3-krotny wzrost, co świadczyło o tym, że w obecności Al(OH)3, kombinacja DQS21 i CpG jest bardziej immunogenna niż samo CpG (fig. 8). Rozkład izotypów był taki same dla grup 3 i 4 (zawierających Al(OH)3), podczas gdy przy braku Al(OH)3 kombinacja CpG i DQS21 powodowała lepszy wzór charakterystyczny dla izotypu TH1 niż samo DQS21 (fig. 8).

Eksperyment 2

Odpowiedzi polegające na proliferacji limfocytów swoiste wobec RTS,S i gp120 były bardzo podobne w opisywanym eksperymencie. Wyniki pokazują, że dodanie DQS21 (zarówno same, jak i z emulsją o/w) powoduje wzmocnione odpowiedzi limfoproliferacyjnej na oba antygeny (fig. 9).

Odpowiedzi CTL badano wykorzystując zarówno HBsAg, jak i gp120 peptydy epitopów CTL. W obu przypadkach wykryto odpowiedź CTL po immunizacji grupy 1 samym CpG (fig. 10). Jednakże, dodanie DQS21 powodowało znaczny wzrost odpowiedzi CTL dla obu antygenów (fig. 10). Obecność emulsji o/w neutralizowała pozytywny efekt DQS21 ( gp120) lub zwiększała tło testu in vitro (HBsAg).

Odpowiedź przeciwciałowa na HBsAg i gp120 była wzmożona przez dodanie DQS21 do adiuwanta CpG (fig. 11 A). Dodatkowy wzrost obserwowano po dodaniu emulsji o/w do badanej próbki (fig. 11 A). Dodanie DQS21 do CpG powodowało przesunięcie profili izotypu gp120 w stronę bardziej widocznego TH1 (fig. 11B), podczas gdy wpływ na profile izotypu HBsAg był mniej widoczny w niniejszym eksperymencie.

5. Wnioski

Immunizacja RTS,S i gp120 przygotowanym z kombinacją CpG i DQS21 powodowała silną odpowiedź immunologiczną swoistą wobec antygenu. Kombinacja adiuwantów CpG i DQS21:

- wzmacnia odpowiedzi limfoproliferacyjne

- wzmacnia aktywność CTL

- podnosi miana przeciwciał i wzór izotypu TH1 w porównaniu z zastosowaniem pojedynczych związków.

P r z y k ł a d 5

Potencjał terapeutyczny CpG i/lub DQS21 w modelu nowotworu TC1

1. Plan eksperymentu grupy po 10 myszy C57M/6 w dniu 0 otrzymały podskórnie w bok 10⁶ (200 pl) komórek TC1 (komórki nowotworowe wyrażające E7).

PL 203 894 B1

Następnie myszy szczepiono dwukrotnie, w dniu 14 i 21 po prowokacji nowotworem, 5 μg PD1/3E7 HPV16, przez zastrzyk w poduszkę łapy. Rozwój nowotworu mierzono indywidualnie dwa razy w tygodniu.

Grupy myszy:

1. Nie szczepione

2. PD1/3E7 + CpG(10 μg ODN2006)

3. PD1/3E7 + DQS21 (0,5 pg)

4. PDl/3E7 + CpG + DQS21

Rozwój nowotworu mierzono indywidualnie dwa razy w tygodniu.

2. Przygotowanie próbek

Próbki przygotowywano w dniu szczepienia. Objętość zastrzyku dla jednej myszy wynosiła 100 pl. W razie konieczności, PD1/3E7 (5 pg) rozcieńczano w H₂O i PBS pH 7,4, w celu osiągnięcia izotoniczności. Po 5 minutach, w razie konieczności, QS21 (0,5 pg) mieszano z liposomami w stosunku wagowym QS21:cholesterol wynoszącym 1:5 (zwane DQ) i dodawano do próbki. Po 30 minutach w przypadku próbek z oligonukleotydami dodawano 10 pg CpG (ODN 2006), a następnie po 30 minutach dodawano tiomersal do stężenia 1 pg/ml jako środek konserwujący.

H₂O + PBS pH7,4 + PD1/3E7 - 5 min + DQ - 30 min + CpG - 30min - Thio

3. Wyniki

Średni wzrost nowotworu w grupach złożonych z 10 zwierząt w czasie jest pokazany na fig. 12. U 100% zwierząt, które prowokowano nowotworem (10⁶ komórek TC1), nastąpił postępujący rozwój nowotworu.

70-80% nieszczepionych zwierząt lub zwierząt szczepionych białkiem E7 w DQS21 zdechło przed 35 dniem eksperymentu.

Podwójne szczepienie białkiem E7 z DQS21 prawie nie miało wpływu na rozwój nowotworu. Z drugiej strony, 2 szczepienia (IFP, w dniach 14 i 21) 5 pg ProtD 1/3 E7 HPV16 z adiuwantem CpG powodowały regresję nowotworów i chroniły przed śmiercią: 70-80% myszy pozostało przy życiu w 35 dniu. Kombinacja dwóch czynników immunostymulujących (CpG i DQS21) w niewielkim stopniu poprawiała efekt działania samego CpG.

PL 203 894 B1 <110> Friede, Martin

Garcon, Nathalie Hermand Philippe <120> Preparaty adiuwantowe <130> B45181 <160> 5 <!70>FastSEQ dla Windows wersja 3.0 λ ' <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> ludzkie <400> 1 tccatgacgt tcctgacgtt <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> ludzkie <400> 2 tctcccagcg tgcgccat

<210>	3
<211>	30
<212>	DNA
<213>	ludzkie
<400>	3

acogatgacg tcgccggtga cggcaccacg

<210>	4
<211>	24
<212>	DNA
<213>	ludzkie
<400>	4

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt

<210>	5
<211>	20
<212>	DNA
<213>	ludzkie
<400>	5

tccatgacgt tcctgatgct

Claims

1. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera saponinę i immunostymulujący oligonukleotyd obejmujący niemetylowany motyw CpG oraz antygen związany z nowotworem, antygen odrzucania nowotworów lub antygen związany z mechanizmami podtrzymującym nowotwory.

2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że immunostymulujący oligonukleotyd zawiera sekwencję puryna, puryna, C, G, pirymidyna, pirymidyna.

3. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że immunostymulujący oligonukleotyd jest wybrany z grupy obejmującej: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEK NR ID: 1); TCT CCC AGC GTG CGC CAT (SEK NR ID: 2); ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG (SEK NR ID: 3); TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (SEK NR ID:4); TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEK NR ID: 5).

4. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że immunostymulujący oligonukleotyd zawiera co najmniej dwa niemetylowane powtórzenia CG oddzielone przez co najmniej 3 nukleotydy.

5. Kompozycja szczepionki według zastrz. 4, znamienna tym, że immunostymulujący oligonukleotyd zawiera co najmniej dwa niemetylowane powtórzenia CG oddzielone przez 6 nukleotydów.

6. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że saponina jest otrzymana z QuilA.

7. Kompozycja szczepionki według zastrz. 6, znamienna tym, że pochodną QuilA jest QS21.

8. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że ponadto zawiera nośnik w postaci cząstek wybrany z grupy obejmującej sole mineralne, emulsje, polimery, liposomy i ISCOM.

9. Kompozycja szczepionki według zastrz. 8, znamienna tym, że nośnik w postaci cząstek jest emulsją oleju w wodzie.

10. Kompozycja szczepionki według zastrz. 8, znamienna tym, że nośnik w postaci cząstek jest liposomem.

11. Kompozycja szczepionki według zastrz. 10, znamienna tym, że liposom zawiera cholesterol.

12. Kompozycja szczepionki według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera cząstkę soli metalu.

13. Kompozycja szczepionki według zastrz. 12, znamienna tym, że cząstką soli metalu jest wodorotlenek glinu lub fosforan glinu.

14. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że ponadto obejmuje monofosforylolipid A lub 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A.

15. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1-14, znamienna tym, że antygen związany z nowotworem, antygen odrzucania nowotworów lub antygen związany z mechanizmami-podtrzymującymi nowotwory obejmuje jeden lub więcej antygenów wybranych z grupy zawierającej: antygen MAGE, PRAME, BAGE, GAGE, swoiste wobec nowotworu gangliozydy, antygen swoisty wobec stercza, Her2/Neu, KSA (GA733), PAP, mammaglobinę, MUC-1, antygen kanceroembrionalny, antygen błonowy swoisty wobec stercza (PSMA), antygen komórek macierzystych stercza (PSCA), tyrozynazę, surwiwinę, NY-ESOl, prostazę, PS 108, RAGE, LAGE, HAGE, własny hormon peptydowy lub GnRH.

16. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że saponiną jest saponina hemolityczną.

17. Zastosowanie kombinacji (i) saponiny, (ii) immunostymulującego oligonukleotydu zawierającego niemetylowany motyw CpG oraz (iii) antygenu związanego z nowotworem, antygenu odrzucania nowotworów lub antygenu związanego z mechanizmami podtrzymującymi nowotwory do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia raka.

18. Sposób wytwarzania kompozycji szczepionki określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje zmieszanie (i) saponiny, (ii) immunostymulującego oligonukleotydu zawierającego niemetylowany motyw CpG oraz (iii) antygenu związanego z nowotworem, antygenu odrzucania nowotworów lub antygenu związanego z mechanizmami podtrzymującymi nowotwory.