Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku s a preparat farmaceutyczny zawieraj acy inhibitor karboksypeptydazy U (CPU) i inhibitor trombiny, zestaw sk ladników i zastosowanie preparatu farmaceutycznego do wy- twarzania leku do leczenia stanu, w którym jest wymagane lub po zadane hamowanie CPU i/lub ha- mowanie trombiny. Proces krzepni ecia krwi jest kluczowym procesem zwi azanym zarówno z hemostaz a (to jest zapobieganiem utracie krwi z uszkodzonego naczynia), jak i zakrzepic a (to jest tworzeniem skrzepu krwi w naczyniu krwiono snym, co prowadzi do niedro zno sci naczynia). Krzepni ecie jest wynikiem z lo- zonej sekwencji reakcji enzymatycznych, w której jednym z ko ncowych etapów jest przemiana proen- zymu protrombiny w aktywny enzym trombin e. Trombina odgrywa kluczow a rol e w procesie krzepni ecia. Aktywuje ona p lytki krwi, przekszta lca fibrynogen w monomery fibryny, które samorzutnie polimeryzuj a tworz ac w lókna i aktywuje czynnik XIII, który z kolei powoduje usieciowanie polimerów z utworzeniem nierozpuszczalnej fibryny. Ponadto trombina aktywuje czynnik V i czynnik VIII w reakcji z dodatnim sprz ezeniem zwrotnym. Oczekuje si e zatem, ze inhibitory trombiny b ed a skutecznymi srodkami przeciwzakrzepowymi, powoduj acymi ha- mowanie aktywacji p lytek krwi, powstawanie fibryny i stabilizacj e fibryny. Oczekuje si e, ze dzi eki ha- mowaniu mechanizmu dodatniego sprzezenia zwrotnego b ed a one wywiera c dzia lanie hamuj ace na pocz atku lancucha zjawisk prowadz acych do krzepni ecia i zakrzepicy. Fibrynoliza zachodzi w wyniku szeregu reakcji enzymatycznych powoduj acych degradacj e fi- bryny przez plazmin e. Uaktywnienie plazminogenu jest kluczowym procesem w fibrynolizie. W rozsz- czepieniu plazminogenu z wytworzeniem plazminy uczestnicz a aktywatory plazminogenu, aktywator plazminogenu typu tkankowego (t-PA) lub aktywator plazminogenu typu urokinazowego (u-PA). W pocz atkowej plazminowej degradacji fibryny powstaj a reszty lizyny zako nczone grupami karboksy- lowymi, s lu zace jako miejsca o wysokim powinowactwie wi azania dla plazminogenu. Z uwagi na to, ze plazminogen zwi azany z fibryn a o wiele latwiej uaktywnia si e do plazminy ni z wolny plazminogen, mechanizm ten umo zliwia regulacj e fibrynolizy z dodatnim sprzezeniem zwrotnym. Jednym z endogennych inhibitorów fibrynolizy jest CPU. CPU jest okre slany równie z jako oso- czowa karboksypeptydaza B, aktywny inhibitor fibrynolizy uaktywniany przez trombin e (TAFIa), kar- boksypeptydaza R lub indukowalna aktywno sc karboksypeptydazowa. CPU powstaje z prekursora, prokarboksypeptydazy U (proCPU) w wyniku dzia lania enzymów proteolitycznych, np. trombiny, kom- pleksu trombina-trombomodulina lub plazminy. CPU rozszczepia zasadowe aminokwasy na karboksy- lowym ko ncu fragmentów fibryny. Ubytek zako nczonych grupami karboksylowymi lizyn, a tym samym lizynowych miejsc wi azania dla plazminogenu powoduje nast epnie hamowanie fibrynolizy. Nieoczekiwanie stwierdzono, ze w porównaniu z osobnym stosowaniem inhibitorów CPU i trombi- ny, stosowanie zgodnie z wynalazkiem po laczenia inhibitora CPU i inhibitora trombiny wzmaga dzia- lanie przeciwzakrzepowe, a tym samym zmniejsza ryzyko zakrzepicy i nadkrzepliwo sci we krwi i tkan- kach ssaków. Ponadto wynalazek umo zliwia podawanie mniejszych dawek substancji czynnych, a tym samym zmniejsza ryzyko potencjalnych dzia la n ubocznych inhibitorów trombiny. Zatem wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego cechuj acego si e tym, ze zawiera inhibi- tor karboksypeptydazy U, którym jest mergetpa lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, oraz inhi- bitor trombiny, inogatran, w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym srodkiem pomocniczym, rozcie nczalnikiem lub no snikiem; albo inhibitor karboksypeptydazy U, którym jest kwas 3-(6-aminopirydyn-3-ylo)-2-merkaptometylo- propanowy jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, oraz inhibitor trombiny, melagatran, w mieszani- nie z farmaceutycznie dopuszczalnym srodkiem pomocniczym, rozcie nczalnikiem lub no snikiem. Korzystnie preparat farmaceutyczny wed lug wynalazku cechuje si e tym, ze stosunek molowy inhibitora karboksypeptydazy U do inhibitora trombiny wynosi od oko lo 1000:1 do oko lo 1:1000, ko- rzystnie od 50:1 do 1:50. Ponadto wynalazek dotyczy zestawu sk ladników cechuj acego si e tym, ze zawiera: pojemnik zawieraj acy inhibitor karboksypeptydazy U, którym jest mergetpa lub jego farmaceu- tycznie dopuszczalna sól, oraz pojemnik zawieraj acy inhibitor trombiny, inogatran; albo pojemnik zawieraj acy inhibitor karboksypeptydazy U, którym jest kwas 3-(6-aminopirydyn-3- -ylo)-2-merkaptometylopropanowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, oraz pojemnik zawiera- jacy inhibitor trombiny, melagatran,PL 203 505 B1 3 a tak ze instrukcje dotycz ace podawania kolejno, osobno lub równocze snie inhibitorów karbo- ksypeptydazy U i trombiny potrzebuj acemu tego pacjentowi. Korzystnie zestaw wed lug wynalazku, cechuje si e tym, ze stosunek molowy inhibitora karboksypep- tydazy U do inhibitora trombiny wynosi od oko lo 1000:1 do oko lo 1:1000, korzystnie od 50:1 do 1:50. Ponadto wynalazek dotyczy zestawu sk ladników cechuj acego si e tym, ze zawiera: preparat farmaceutyczny zawieraj acy inhibitor karboksypeptydazy U, którym jest mergetpa lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym srodkiem pomocniczym, rozcie nczalnikiem lub no snikiem; oraz preparat farmaceutyczny zawieraj acy inhibitor trombiny, inogatran, w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym srodkiem pomocniczym, roz- cie nczalnikiem lub no snikiem; albo preparat farmaceutyczny zawieraj acy inhibitor karboksypeptydazy U, którym jest kwas 3-(6- -aminopirydyn-3-ylo)-2-merkaptometylopropanowy jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, w miesza- ninie z farmaceutycznie dopuszczalnym srodkiem pomocniczym, rozcie nczalnikiem lub no snikiem, oraz preparat farmaceutyczny zawieraj acy inhibitor trombiny, melagatran, w mieszaninie z farmaceu- tycznie dopuszczalnym srodkiem pomocniczym, rozcie nczalnikiem lub no snikiem, przy czym ka zdy z inhibitorów karboksypeptydazy U i trombiny jest w postaci odpowiedniej do podawania w po laczeniu z drugim. Korzystnie zestaw wed lug wynalazku, cechuje si e tym, ze inhibitory karboksypeptydazy U i trombiny s a odpowiednie do podawania kolejno, osobno lub równocze snie. Korzystnie zestaw wed lug wynalazku, cechuje si e tym, ze stosunek molowy inhibitora karboksypep- tydazy U do inhibitora trombiny wynosi od oko lo 1000:1 do oko lo 1:1000, korzystnie od 50:1 do 1:50. Wynalazek równie z dotyczy powy zej zdefiniowanego preparatu do stosowania w terapii medycznej. Wynalazek równie z dotyczy zestawu sk ladników zawieraj acego: pojemnik zawieraj acy inhibitor karboksypeptydazy U, którym jest mergetpa lub jego farmaceu- tycznie dopuszczalna sól, oraz pojemnik zawieraj acy inhibitor trombiny, inogatran; albo pojemnik zawieraj acy inhibitor karboksypeptydazy U, którym jest kwas 3-(6-aminopirydyn-3- -ylo)-2-merkaptometylopropanowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, oraz pojemnik zawiera- jacy inhibitor trombiny, melagatran, a tak ze instrukcje dotycz ace podawania kolejno, osobno lub równocze snie inhibitorów karbo- ksypeptydazy U i trombiny potrzebuj acemu tego pacjentowi, do stosowania w terapii medycznej. Korzystne cechy podane powy zej odno snie tego zestawu sk ladników odnosz a si e równie z do powy zszego rozwi azania. Wynalazek równie z dotyczy zestawu sk ladników zawieraj acego: preparat farmaceutyczny zawieraj acy inhibitor karboksypeptydazy U, którym jest mergetpa lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym srodkiem pomocniczym, rozcie nczalnikiem lub no snikiem; oraz preparat farmaceutyczny zawieraj acy inhibitor trombiny, inogatran, w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym srodkiem pomocniczym, roz- cie nczalnikiem lub no snikiem; albo preparat farmaceutyczny zawieraj acy inhibitor karboksypeptydazy U, którym jest kwas 3-(6- -aminopirydyn-3-ylo)-2-merkaptometylopropanowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, w mie- szaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym srodkiem pomocniczym, rozcie nczalnikiem lub no snikiem, oraz preparat farmaceutyczny zawieraj acy inhibitor trombiny, melagatran, w mieszaninie z farmaceu- tycznie dopuszczalnym srodkiem pomocniczym, rozcie nczalnikiem lub no snikiem, przy czym ka zdy z inhibitorów karboksypeptydazy U i trombiny jest w postaci odpowiedniej do podawania w po laczeniu z drugim, do stosowania w terapii medycznej. Korzystne cechy podane powy zej odno snie tego tego zestawu sk ladników odnosz a si e równie z do powy zszego rozwi azania. Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania powy zej zdefiniowanego preparatu do wytwarzania leku do leczenia zakrzepicy i nadkrzepliwo sci we krwi i tkankach ssaków, w tym ludzi. Okre slenie „podawanie w po laczeniu z" oznacza podawanie kolejno, osobno i/lub równocze snie odpowiednich preparatów zawieraj acych dany inhibitor CPU i dany inhibitor trombiny, w trakcie lecze- nia odpowiedniego stanu, który to stan mo ze by c stanem ostrym lub przewlek lym. Korzystnie okre sle- nie to oznacza podawanie dwóch preparatów (ewentualnie w powtórzeniach) w wystarczaj aco bliskich odst epach czasu, aby wyst api lo korzystne dzia lanie na pacjenta, silniejsze w trakcie leczenia odpo- wiedniego stanu ni z w przypadku podawania (ewentualnie w powtórzeniach) któregokolwiek z dwóchPL 203 505 B1 4 preparatów oddzielnie, bez podawania drugiego preparatu w danym trakcie leczenia. Oszacowanie czy po laczenie zapewnia silniejsze, korzystne dzia lanie ogólnie w odniesieniu do okre slonego stanu, a tak ze w odniesieniu do przebiegu leczenia tego stanu, b edzie zale za lo od samego stanu, który si e leczy lub któremu si e zapobiega, przy czym mo ze to okre sli c rutynowo fachowiec. Zatem okre slenie „w po laczeniu z" oznacza, ze jeden lub drugi z dwóch preparatów mo ze by c podawany (ewentualnie w powtórzeniach) przed podaniem, po podaniu i/lub w tym samym czasie, w którym jest podawany drugi sk ladnik. Stosowane w tym kontek scie okre slenia „podawany równo- cze snie" i „podawany w tym samym czasie, w którym" oznaczaj a, ze poszczególne dawki inhibitora CPU i inhibitora trombiny s a podawane w ci agu 48 godzin, np. w ci agu 24 godzin. Zestaw sk ladaj acy si e z wymienionych cz esci wytwarza si e sposobem polegaj acym na pola- czeniu okre slonego powy zej jednego sk ladnika (a) z okre slonym powy zej drugim sk ladnikiem (b), tak ze te dwa sk ladniki s a odpowiednie do podawania w po laczeniu ze sob a. Okre slenie „polaczenie" dwóch sk ladników ze sob a oznacza, ze te sk ladniki (a) i (b) mog a by c: (i) dostarczone w postaci odr ebnych preparatów (czyli niezale znie od siebie), które nast epnie laczy si e w celu zastosowania w po laczeniu jeden z drugim w leczeniu skojarzonym; albo (ii) pakowane i oferowane razem w postaci oddzielnych sk ladników „z lo zonego opakowania" do stosowania w po laczeniu jeden z drugim w leczeniu skojarzonym. W celu unikni ecia w atpliwo sci stosowane w opisie okre slenie „leczenie" obejmuje stosowanie terapeutyczne i/lub profilaktyczne. Zakresem wynalazku s a obj ete zarówno czyste enancjomery, mieszaniny racemiczne, jak i miesza- niny dwóch enancjomerów w nierównych ilo sciach. Nale zy zdawa c sobie spraw e, ze wszystkie mo zli- we postacie diastereoizomeryczne s a równie z obj ete zakresem wynalazku. W zale zno sci od warunków procesu zwi azki okre slane jako inhibitory CPU mo zna wytwarza c w postaci oboj etnej, jako sole, np. jako farmaceutycznie dopuszczalne sole, lub jako solwaty, np. jako hydraty, przy czym wszystkie takie postacie s a obj ete zakresem wynalazku. Inhibitory trombiny obejmuj a HOOC-CH 2 -(R)Cha-Pic-Nag-H (znany jako inogatran) i HOOC- -CH 2 -(R)Cgl-Aze-Pab-H (znany jako melagatran) (patrz odpowiednio publikacje mi edzynarodowego zg loszenia patentowego nr WO 93/11152 i WO 94/29336, oraz zestawienia zamieszczonych tam skrótów). W publikacji mi edzynarodowego zg loszenia patentowego nr WO 97/23499 ujawniono szereg zwi azków, które, jak to stwierdzono, s a u zyteczne jako proleki inhibitorów trombiny. Takie proleki s a okre slone ogólnym wzorem R a OOC-CH 2 -(R)Cgl-Aze-Pab-R b w którym R a oznacza atom wodoru, benzyl lub C 1-10 alkil, R b (który zast epuje jeden z atomów wodoru grupy amidynowej w Pab-H) oznacza OH, OC(O)R c lub C(O)OR d , gdzie R c oznacza C 1-17 alkil, fenyl lub 2-naftyl, a R d oznacza C 1-12 alkil, fenyl, C 1-3 alkilofenyl lub 2-naftyl. Do korzystnych zwi azków nale za zwi azki o wzorze R a OOC-CH 2 -(R)Cgl-Aze-Pab-OH, w którym R a oznacza benzyl lub C 1-10 alkil, np. etyl lub izopropyl, a zw laszcza EtOOC-CH 2 -(R)Cgl-Aze-Pab-OH. Same aktywne inhibitory trombi- ny ujawniono w publikacji WO 94/29336. Preparaty farmaceutyczne Jak podano powy zej, wynalazek dotyczy preparatów farmaceutycznych, zawieraj acych jako substancje czynne inhibitor CPU (mergetp e lub kwas 3-(6-aminopirydyn-3-ylo)-2-merkaptometylo- propanowy) i inhibitor trombiny (inogatran lub melagatran) lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. Odpowiednie preparaty, w których stosuje si e HOOC-CH 2 -(R)Cgl-Aze-Pab-H (melagatran) opi- sano w literaturze, mi edzy innymi np. w publikacjach mi edzynarodowych zg losze n patentowych nr WO 94/29336, WO 96/14084, WO 96/16671, WO 97/23499, WO 97/39770, WO 97/45138, WO 98/16252, WO 99/27912 i WO 99/27913. Do stosowania klinicznego inhibitor CPU i inhibitor trombiny formu luje si e w preparat farmaceu- tyczny do podawania doustnego, do zylnego, podskórnego, dotchawiczego, dooskrzelowego, donoso- wego, dop lucnego, przezskórnego, podpoliczkowego, doodbytniczego, pozajelitowego lub pewnymi innymi drogami podawania. Preparat farmaceutyczny zawiera inhibitory w mieszaninie z farmaceu- tycznie dopuszczalnym srodkiem pomocniczym, rozcie nczalnikiem i/lub no snikiem. Ca lkowita zawarto sc substancji czynnych w preparacie wynosi dogodnie oko lo 0,1-95% wag., zwykle 0,5-50% wag., korzystnie 1-25% wag.PL 203 505 B1 5 Stosunek molowy inhibitora CPU do inhibitora trombiny mo ze wynosi c od oko lo 1000:1 do oko lo 1:1000. Dogodnie stosunek molowy inhibitora CPU do inhibitora trombiny wynosi od 300:1 do 1:300, korzystnie od 50:1 do 1:50. W procesie wytwarzania preparatów farmaceutycznych wed lug wynalazku substancje czynne mo zna zmiesza c ze sta lymi, sproszkowanymi sk ladnikami, takimi jak laktoza, sacharoza, sorbitol, mannitol, skrobia, amylopektyna, pochodne celulozy, zelatyna lub inny odpowiedni sk ladnik, a tak ze ze srodkami rozsadzaj acymi lub srodkami smaruj acymi, takimi jak stearynian magnezu, stearynian wapnia, stearylofumaran sodu i glikole polietylenowe w postaci wosków. Mieszanin e mo zna nast epnie podda c granulowaniu lub sprasowa c w tabletki. Substancje czynne mo zna osobno wst epnie zmiesza c z innymi sk ladnikami nie b ed acymi sub- stancjami czynnymi, przed zmieszaniem dla otrzymania preparatu. Mo zna tak ze zmiesza c ze sob a substancje czynne, przed zmieszaniem ze sk ladnikami nie b ed acymi substancjami czynnymi, dla otrzymania preparatu. Mo zna wytwarza c mi ekkie kapsu lki zelatynowe zawieraj ace mieszanin e substancji czynnych wed lug wynalazku, oleju ro slinnego, t luszczu lub innego odpowiedniego no snika stosowanego w mi ekkich kapsu lkach zelatynowych. Twarde kapsu lki zelatynowe mog a zawiera c granulki substancji czynnych. Twarde kapsu lki zelatynowe mog a równie z zawiera c substancje czynne w polaczeniu ze stalymi sproszkowanymi sk ladnikami, takimi jak laktoza, sacharoza, sorbitol, mannitol, skrobia ziem- niaczana, skrobia kukurydziana, amylopektyna, pochodne celulozy lub zelatyna. Jednostkowe postacie dawkowane do podawania doodbytniczego mo zna wytwarza c (i) w po- staci czopków zawieraj acych substancj e czynn a zmieszan a z oboj etnym pod lo zem t luszczowym; (ii) w postaci zelatynowej kapsu lki doodbytniczej, która zawiera substancj e czynn a w mieszaninie z ole- jem ro slinnym, olejem parafinowym lub innym odpowiednim no snikiem stosowanym w zelatynowych kapsu lkach doodbytniczych; (iii) w postaci gotowego do u zycia mikrowlewu; albo (iv) w postaci suche- go preparatu do mikrowlewu, do roztwarzania w odpowiednim rozpuszczalniku tu z przed podaniem. Ciek le preparaty mo zna wytwarza c w postaci syropów lub zawiesin, np. roztworów lub zawiesin zawieraj acych substancje czynne i pozosta le sk ladniki, np. cukier lub alkohole cukrowe oraz miesza- nin e etanolu, wody, gliceryny, glikolu propylenowego i glikolu polietylenowego. Je sli zachodzi potrzeba takie ciek le preparaty mog a zawiera c srodki barwi ace, srodki smakowo-zapachowe, srodki konserwu- jace, sacharyn e i karboksymetyloceluloz e lub inne srodki zag eszczaj ace. Ciek le preparaty mo zna równie z wytwarza c w postaci suchych proszków do roztwarzania w odpowiednim rozpuszczalniku przed u zyciem. Roztwory do podawania pozajelitowego mo zna wytwarza c jako roztwory preparatu wed lug wy- nalazku w farmaceutycznie dopuszczalnym rozpuszczalniku. Takie roztwory mog a równie z zawiera c srodki stabilizuj ace, srodki konserwuj ace i/lub sk ladniki buforuj ace. Roztwory do podawania pozajeli- towego mo zna równie z wytwarza c w postaci suchych preparatów do roztwarzania w odpowiednim rozpuszczalniku przed u zyciem. Dawka podawanego zwi azku b edzie zale ze c od konkretnych wskaza n, wieku, wagi i p lci pa- cjenta i mo ze by c ustalana przez lekarza. Dawka b edzie korzystnie wynosi c 0,01-10 mg/kg. Typowa dzienna dawka substancji czynnych zmienia si e w szerokim zakresie i b edzie zale ze c od ró znych czynników, takich jak konkretne wskazania, droga podawania, wiek, waga i p le c pacjenta i mo ze by c ustalana przez lekarza. Zazwyczaj dzienne dawki doustne lub pozajelitowe b ed a wynosi c 0,1-1000 mg substancji czynnych lacznie. W opisie „terapeutycznie skuteczna laczna ilo sc" dotyczy ca lkowitej ilo sci inhibitora CPU i inhibitora trombiny, która po podaniu tych substancji w po laczeniu zapewnia dzia lanie terapeutyczne, nawet je sli ilo sc danej substancji przy podawaniu odr ebnym mo ze by c mniejsza od ilo sci terapeutycznie skutecznej. Zastosowanie medyczne i farmaceutyczne Jak podano powy zej, wynalazek dotyczy równie z preparatów i zestawów do stosowania w tera- pii medycznej; zastosowania preparatów wed lug wynalazku do wytwarzania leków do stosowania w leczeniu stanu, w którym jest wymagane lub po zadane hamowanie trombiny i/lub hamowanie CPU, tj. zakrzepicy i nadkrzepliwo sci we krwi i tkankach ssaków, w tym ludzi. Wynalazek znajduje zatem zastosowanie do leczenia zgodnie z którym podaje si e terapeutycz- nie skuteczn a laczn a ilosc inhibitora CPU i inhibitora trombiny wed lug wynalazku pacjentowi cierpi a- cemu lub podatnego na stan, w którym jest wymagane lub po zadane hamowanie trombiny i/lub ha- mowanie CPU.PL 203 505 B1 6 Inhibitor CPU i inhibitor trombiny mo zna podawa c kolejno, osobno i/lub równocze snie. Ponadto inhibitor CPU mo zna podawa c przed podaniem inhibitora trombiny lub vice versa. Stosowane tu okre slenie „terapia medyczna" obejmuje profilaktyczny, diagnostyczny i terapeu- tyczny tryb leczenia prowadzony in vivo lub ex vivo w odniesieniu do ludzi i innych ssaków. Preparaty wed lug wynalazku zawieraj a inhibitor CPU i inhibitor trombiny, jako takie lub, w przy- padku proleków, po podaniu. Zatem oczekuje si e, ze preparaty wed lug wynalazku b ed a u zyteczne w leczeniu zakrzepicy i nadkrzepliwo sci we krwi i tkankach ssaków, w tym ludzi. Wiadomo, ze nadkrzepliwosc mo ze prowadzi c do chorób zakrzepowo-zatorowych. W sród sta- nów zwi azanych z nadkrzepliwoscia i chorobami zakrzepowo-zatorowymi mo zna wymienic dzie- dziczn a lub nabyt a oporno sc na uaktywnione bia lko C, tak a jak mutacja czynnika V (czynnik V Leiden) i dziedziczne lub nabyte niedobory antytrombiny III, bia lka C, bia lka S, kofaktora heparyny II. Wiado- mo, ze inne stany zwi azane z nadkrzepliwo sci a i chorobami zakrzepowo-zatorowymi obejmuj a kraz a- ce przeciwcia la antyfosfolipidowe (antykoagulant tocznia), homocysteinemi e, indukowan a heparyn a trombocytopeni e i zak lócenia w fibrynolizie. Leczenie stanów, w których wyst epuje niepo zadany nadmiar trombiny bez oznak nadkrzepliwo- sci, np. chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera. Okre slone stany chorobowe, które mo zna wymienic obejmuj a leczenie i/lub profilaktyk e zakrze- pic naczy n (np. zakrzepicy zy l g lebokich) i zatorów t etnicy p lucnej, zakrzepicy t etniczej (np. przy zawa- le miesnia sercowego, niestabilnej dusznicy bolesnej, udarze wskutek zakrzepicy i obwodowej za- krzepicy t etniczej) i ogólnoustrojowych zatorów zwykle odprzedsionkowych przy zw lóknieniu t etniczym lub od lewej komory przy pe lno sciennym zawale miesnia sercowego lub spowodowanych przez zasto- inow a niewydolno sc serca; profilaktyk e nawrotów niedro zno sci (czyli zakrzepicy) po rozpuszczeniu skrzepu, przezskórnej transluminalnej angioplastyce (PTA) i zabiegów zwi azanych z wykonaniem po laczenia omijaj acego zw ezenia t etnicy wie ncowej; profilaktyk e nawrotów zakrzepicy po zabiegach mikrochirurgicznych i ogólnie zabiegach chirurgii naczyniowej. Inne wskazania obejmuj a leczenie i/lub profilaktyk e rozsianego krzepni ecia wewn atrznaczynio- wego spowodowanego przez bakterie, liczne urazy, zatrucie lub o innych mechanizmach; leczenie srodkiem przeciw krzepni eciu przy kontakcie krwi z powierzchniami cia l obcych w organizmie, takimi jak przeszczepy naczyniowe, rurki umieszczone w naczyniu dla utrzymania jego dro zno sci, cewniki naczyniowe, mechaniczne i biologiczne zastawki protetyczne lub jakiekolwiek inne narz edzia medycz- ne; oraz leczenie srodkiem przeciw krzepni eciu przy kontakcie krwi z narz edziami medycznymi poza organizmem, takimi jak podczas zabiegów chirurgii sercowo-naczyniowej przy u zyciu aparatu p luco- -serce lub przy hemodializie; leczenie i/lub profilaktyk e zespo lu ostrego wyczerpania oddechowego idiopatycznego i u doros lych, zw lóknienia p lucnego po leczeniu na swietlaniem lub chemioterapi a, wstrz asu septycznego, posocznicy, odpowiedzi zapalnych, które obejmuj a, lecz nie wy lacznie obrz eki, ostr a lub przewlek la mia zd zyc e t etnic, tak a jak choroba t etnic wie ncowych, choroba t etnic mózgo- wych, choroba t etnic obwodowych, uszkodzenie reperfuzyjne i nawrót zw ezenia po przezskórnej transluminalnej angioplastyce (PTA). P r z y k l a d y Wynalazek ilustruj a poni zsze przyk lady. Materia ly i metody Materia ly Batroksobin e nr 520 CRY (American Diagnostica Inc., Greenwich, CT, USA) przechowywano w 8°C, zarówno w stanie zliofilizowanym, jak i po rozpuszczeniu w roztworze soli do st ezenia 10 BU/ml. Stosowano j a w do swiadczeniach przez 5 dni. Reszt e leku zamra zano i przechowywano w -20°C przez co najwy zej 30 dni. Endotoksyn e L-3129 (Sigma, St. Louis, MO, USA) rozpuszczono w roztworze soli do st ezenia 50 µg/ml. Do ka zdego do swiadczenia przygotowywano swie zy roztwór. Ludzki fibrynogen znakowany 125 I (Amersham, Little Chalfont, Buck, Wielka Brytania) przecho- wywano w stanie zliofilizowanym w 8°C. Po rozpuszczeniu w roztworze soli/wodzie destylowanej (80/20 obj eto sciowo) w celu otrzymania roztworu podstawowego o zawarto sci oko lo 0,8 MBq/ml (20 µCi/ml) roz- twór podzielono na podwielokrotne porcje (po jednej na ka zde do swiadczenie), szybko zamra zano i przechowywano w -20°C. Stosowano go w do swiadczeniach przez 14 dni od daty produkcji. Inaktyn e, sól sodow a tiobutabarbitalu (Research Biochemicals International, Natick, USA) roz- puszczono w roztworze soli/wodzie destylowanej (50/50 obj eto sciowo) do st ezenia 50 mg/ml.PL 203 505 B1 7 Inhibitor trombiny, inogatran, rozpuszczano w 40% (wag.) roztworze cyklodekstryny (HB ßCD) do st ezenia 5 mg/ml i przechowywano w -20°C. Przed u zyciem w ró znych do swiadczeniach rozcie n- czano go 40% roztworem cyklodekstryny. W badaniach lek podawano podskórnie. Inhibitor trombiny melagatran rozpuszczano w roztworze soli. Inhibitory CPU, MERGETPA i zwi azek A, rozpuszczano w odtlenionym roztworze soli. Roztwór soli odtleniano drog a obróbki ultrad zwi ekami przez 20 minut, a nast epnie przepuszczania azotu przez kolej- ne 20 minut. Do ka zdego do swiadczenia zawsze przygotowywano swie ze roztwory. Inhibitor CPU podawano szczurom drog a infuzji i.v. trwaj acej 5 minut. Zwierz eta W do swiadczeniach stosowano samce szczurów szczepu Sprague Dawley (Charles River, Szwecja), wa zace 325-425 g. Tydzie n przed u zyciem w do swiadczeniach zwierz eta pozostawiono by sie oswoi ly z warunkami w laboratoriach AstraZeneca R&D, Mölndal, Szwecja. Przygotowanie zwierz at Znieczulenie wywo lano i utrzymywano z u zyciem inaktyny 100 mg/kg i.p. W lewej zyle szyjnej umieszczano dwa cewniki, jeden do podawania 125 I fibrynogenu i batrokso- biny, a drugi do podawania endotoksyny i inhibitora CPU lub odpowiednich ich no sników. W t etnicy szyjnej umieszczano trzeci cewnik do pobierania próbek krwi i pomiaru sredniego t etniczego ci snienia krwi i cz esto sci akcji serca. Dla unikni ecia powstawania skrzeplin krwi w cewniku t etniczym przez ca ly czas do swiadczenia prowadzono powoln a infuzj e roztworu soli (oko lo 1,0 ml/kg*h). Szczurom wyko- nano tracheotomi e w celu u latwienia samorzutnego oddychania. Temperatur e cia la monitorowano i utrzymywano na poziomie 38°C przez zewn etrzne ogrzewanie. Procedura do swiadczalna Na pocz atku do swiadczenia zwierz etom wstrzykiwano i.v. endotoksyn e (50 µg/kg). Po up lywie 2 godzin wstrzykiwano podskórnie inhibitor trombiny lub jego no snik, a po up lywie kolejnych 15 minut podawano 125 I fibrynogen (0,04 MBq) drog a iniekcji do zylnej (i.v.). Po up lywie 5 minut rozpoczynano trwaj ac a 5 minut infuzje inhibitora CPU lub jego no snika. Po 5 minutach podawano batroksobin e (10 BU/kg) w postaci iniekcji do zylnej (bolus), trwaj acej 1 minut e. We wszystkich do swiadczeniach próbki krwi do oznaczania zawarto sci 125 I pobierano tu z przed podaniem batroksobiny oraz w 5, 20 i 30 minut po jej podaniu. Po zako nczeniu do swiadczenia wyci- nano p luca, tkank e lagodnie przemywano roztworem soli, osuszano bibu la i wa zono. Zawartosc 125 I w tkance i próbkach krwi oznaczano z u zyciem licznika Wallac 1282 Compugamma. St ezenie 125 I w osoczu i w p lucach wyra zano jako procent radioaktywno sci w stosunku do próbki krwi t etniczej po- branej tu z przed wstrzykni eciem batroksobiny. P r z y k l a d 1 Inhibitor CPU, mergetpa (kwas DL-2-merkaptometylo-3-guanidynoetylotiopropanowy), znany np. z Biochimica & Biophysica Acta 1034 (1990), 86-92, zastosowano w polaczeniu z inhibitorem trombi- ny, inogatranem. Wyniki do swiadcze n przedstawiono w tabeli I. Wyniki wyra zono jako procent fibryny pozostaj a- cej w p lucach po leczeniu, czyli 100% oznacza brak dzia lania; n oznacza liczb e do swiadcze n (szczurów). T a b e l a I Wp lyw na osadzanie si e fibryny w p lucach u znieczulonych szczurów w do swiadczeniach ze srodkiem MERGETPA i/lub inogatranem Inhibitor CPU Inhibitor trombiny Inhibitor CPU + inhibitor trombiny Dawka (µmole/kg) Fibryna pozostaj aca po leczeniu (% ± SD) Dawka (µmole/kg) Fibryna pozostaj aca po leczeniu (% ± SD) Dawka (µmole/kg) Fibryna pozostaj aca po leczeniu (% ± SD) 1 2 3 4 5 6 2,1 - 0,6 - 2,1 + 0,6 100 ± 23,9 n = 6 4,2 - 1,2 - 4,2 + 1,2 62 ± 21,9 n = 6 8,4 90 ± 18,1 n = 6 2,3 94 ± 20,2 n = 6 8,4 + 2,3 26 ± 13,3 n = 9PL 203 505 B1 8 cd. tabeli I 1 2 3 4 5 6 21,1 37 ± 19,3 n = 6 3,4 72 ± 23,6 n = 6 - - 33,7 23 ± 17,3 n = 6 5,7 41 ± 20,3 n = 6 - - - - 17,2 39 ± 15,9 n = 6 Z tabeli I wynika, ze podawanie po laczenia inhibitora CPU i inhibitora trombiny jest korzystniej- sze od podawania któregokolwiek z inhibitorów pojedynczo, w odniesieniu do fibryny pozostaj acej po leczeniu. P r z y k l a d 2 Inhibitor CPU (kwas 3-(6-aminopirydyn-3-ylo)-2-merkaptometylo)propanowy) (zwi azek A) zasto- sowano w po laczeniu z inhibitorem trombiny, melagatranem. Wyniki tych do swiadcze n przedstawiono w tabeli II. Wyniki wyra zono jako procent fibryny pozo- staj acej w p lucach po leczeniu, czyli 100% oznacza brak dzia lania; n oznacza liczb e do swiadcze n (szczurów). T a b e l a II Wp lyw na osadzanie si e fibryny w p lucach u znieczulonych szczurów w do swiadczeniach ze zwi azkiem A i/lub melagatranem Inhibitor CPU Inhibitor trombiny Inhibitor CPU + inhibitor trombiny Dawka (µmole/kg) Fibryna pozostaj aca po leczeniu (% ± SD) Dawka (µmole/kg) Fibryna pozostaj aca po leczeniu (% ± SD) Dawka (µmole/kg) Fibryna pozostaj aca po leczeniu (% ± SD) 0,20 100 ± 25,8 n = 8 0,23 97 ± 12,4 n = 6 0,20 + 0,23 75 ± 35,2 n = 5 0,28 88 ± 23,2 n = 4 0,35 77 ± 22,4 n = 4 0,28 + 0,35 19 ± 13,9 n = 8 0,4 87 ± 50,6 n = 6 0,58 62 ± 17,0 n = 2 - - 2,0 49 ± 30,0 n = 7 1,75 31 ± 13,3 n = 4 - - 4,0 15 ± 9,3 n = 4 3,5 55 ± 21,7 n = 4 - - 20,0 7 ± 1,4 n = 2 - - - - Z tabeli II wynika, ze podawanie po laczenia inhibitora CPU i inhibitora trombiny jest korzystniej- sze od podawania któregokolwiek z inhibitorów pojedynczo, w odniesieniu do fibryny pozostaj acej po leczeniu. P r z y k l a d 3 Inhibitor CPU (kwas 3-(6-aminopirydyn-3-ylo)-2-merkaptometylo)propanowy) (zwi azek A) zasto- sowano w po laczeniu z inhibitorem trombiny, melagatranem. Wyniki tych do swiadcze n przedstawiono w tabeli III. Wyniki wyra zono jako procent fibryny po- zostaj acej w p lucach po leczeniu, czyli 100% oznacza brak dzia lania; n oznacza liczb e do swiadcze n (szczurów).PL 203 505 B1 9 T a b e l a III Potwierdzenie synergistycznego dzia lania na osadzanie si e fibryny w p lucach u znieczulonych szczurów w do swiadczeniach ze zwi azkiem A i melagatranem Inhibitor CPU (zwi azek A) Inhibitor trombiny (melagatran) Inhibitor CPU + inhibitor trombiny Dawka (µmole/kg) Fibryna pozostaj aca po leczeniu (% ± SD) Dawka (µmole/kg) Fibryna pozostaj aca po leczeniu (% ± SD) Dawka (µmole/kg) Fibryna pozostaj aca po leczeniu (% ± SD) 0,20 97 ± 24,1 n = 10 0,18 110 ± 15,2 n = 3 - - 0,20 97 ± 24,1 n = 10 0,23 98 ± 11,5 n = 7 0,20 + 0,23 70 ± 33,8 n = 6 0,20 97 ± 24,1 n = 10 0,30 87 ± 27,6 n = 3 0,20 + 0,30 51 ± 33,3 n = 5 0,20 97 ± 24,1 n = 10 0,35 77 ± 22,4 n = 4 0,20 + 0,35 35 ± 24,3 n = 5 0,20 97 ± 24,1 n = 10 0,70 - 0,20 + 0,70 18 ± 12,7 n = 2 0,28 81 ± 24,5 n = 5 0,18 110 ± 15,2 n = 3 0,28 + 0,18 71 ± 33,2 n = 5 0,28 81 ± 24,5 n = 5 0,23 98 ± 11,5 n = 7 0,28 + 0,23 42 ± 28,3 n = 5 0,28 81 ± 24,5 n = 5 0,30 87 ± 27,6 n = 3 - - 0,28 81 ± 24,5 n = 5 0,35 77 ± 22,4 n = 4 0,28 + 0,35 20 ± 13,3 n = 9 0,28 81 ± 24,5 n = 5 0,42 - 0,28 + 0,42 9 ± 3,5 n = 2 W przypadku ka zdej z czterech ró znych kombinacji dawek, sam inhibitor CPU, sam inhibitor trombiny oraz inhibitor trombiny wraz z inhibitorem CPU w dawce odpowiednio 0,2 i 0,28 µmola/kg, dopasowywano odr ebne modele E-max. Modele dopasowywano w skali logarytmicznej, otrzymuj ac sza- cunkowe warto sci mediany skutecznej dawki, czyli dawki, przy której u po lowy populacji osi agni eto 50% efekt. Na fig. 1 przedstawiono przedzia ly ufno sci dla tych warto sci ED 50 . Przy braku dzia lania synergistycznego warto sc ED 50 dla po laczenia inhibitora CPU z inhibitorem trombiny powinna le ze c na linii lacz acej warto sci ED 50 dla ka zdego z leków podawanych osobno (patrz fig. 1). W celu oszacowania dzia lania synergistycznego wszystkie cztery kombinacje dawek dopasowano do modelu E-max, przy czym ED 50 dla inhibitora trombiny wraz z inhibitorem CPU w dawce odpowiednio 0,2 i 0,28 µmola/kg modelowano z u zyciem parametru ?, jak to przedstawiono na figurze. Warto sc parametru ? oszacowano na 0,52 przy 95% przedziale ufno sci (0,116 - 0,934); by l on statystycznie ró zny od 0, p < 0,001. Skróty Aze = kwas (S)-azetydyno-2-karboksylowy BU = jednostki batroksobiny, okre slone przez American Diagnostica Inc., USA Cha = ß-cykloheksyloalanina Cgl = (S)-cykloheksyloglicyna HP ßCD = hydroksypropylo- ß-cyklodekstryna i.p. = sródotrzewnowo i.v. = do zylnie Nag-H = noragmatyna Pab-H = 1-amidyno-4-aminometylobenzen Pic = kwas pipekolinowy SD = odchylenie standardowePL 203 505 B1 10 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL