PL195206B1

PL195206B1 - Chamber for performing hybridisation of cells and analytical examination of body fluids and excreta

Info

Publication number: PL195206B1
Application number: PL328254A
Authority: PL
Inventors: Andrzej Dyszkiewicz
Original assignee: Andrzej Dyszkiewicz
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1998-08-26
Publication date: 2007-08-31
Also published as: PL328254A1

Abstract

Komora do hybrydyzacji komórek oraz diagnostyki płynów ustrojowych i wydalin składająca się z dwu elektrod, znamienna tym, że posiada zewnętrzną elektrodę w postaci tulei (2) i ustaloną współosiowo wewnętrzną elektrodę w postaci walca (3) pokrytego siecią ostrosłupów (10) ułożonych na powierzchni pierścieniowo (8) lub po linii śrubowej (9).A chamber for cell hybridization and diagnostics of body fluids and excretions, consisting of two electrodes, characterized in that it has an external electrode in the form of a sleeve (2) and a coaxially fixed internal electrode in the form of a cylinder (3) covered with a network of pyramids (10) arranged on the surface in a ring-like manner (8) or in a helical line (9).

Description

Przedmiotem wynalazku jest komora do hybrydyzacji komórek oraz diagnostyki płynów ustrojowych i wydalin.The subject of the invention is a chamber for cell hybridization and diagnostics of body fluids and excreta.

Komora jest stosowana w medycynie i biotechnologii do tworzenia hybryd komórkowych oraz w diagnostyce płynów ustrojowych i wydalin.The chamber is used in medicine and biotechnology to create cell hybrids and in the diagnosis of body fluids and excreta.

Hybryda komórkowa jest tworem złożonym z dwóch komórek wyjściowych; pierwsza jest komórką nowotworową plazmocytoma, zaprogramowana na bezustanną produkcję przeciwciał, druga natomiast jest komórką zawierającą interesujące struktury, np. komórkę guza nowotworowego pobraną od pacjenta w czasie operacji. Powstanie hybrydy prowadzi do masowej produkcji przeciwciał monoklonalnych mających powinowactwo do zastosowanej w hybrydyzacji komórki nowotworowej. Proces tworzenia hybryd składa się z trzech zasadniczych etapów: bezpośredniego zbliżenia dwóch rodzajów komórek, podziałanie czynnikiem perforującym błony komórkowe w miejscu stykania się komórek, wyselekcjonowanie w celu hodowli pozaustrojowej i uzyskiwanie przeciwciał.A cell hybrid is a creation of two original cells; the first is a plasmacytoma neoplastic cell programmed for the continuous production of antibodies, while the second is a cell containing interesting structures, e.g. a tumor cell taken from a patient during surgery. The formation of a hybrid leads to the mass production of monoclonal antibodies having an affinity for the tumor cell used in hybridization. The process of creating hybrids consists of three basic steps: direct approximation of two types of cells, treatment with a factor that perforates the cell membranes at the point of contact between cells, selection for extracorporeal culture and obtaining antibodies.

Aktualnie stosowane metody hybrydyzacji można podzielić na trzy grupy pod względem czynników perforujących błony komórkowe: chemiczne, biologiczne, fizyczne. Znana metoda Zimmermana opublikowana w książce Human Hybrydomas autora Strelkauscas wydanej w 1990 roku opisuje komorę do hybrydyzacji wykorzystującą zjawisko elektroogniskowania. W komorze tej stosuje się dwie elektrody (płaskie lub w postaci cylindra i walca) oddalone od siebie od ułamka do kilku milimetrów. Pomiędzy elektrodami znajduje się zawiesina dwóch rodzajów komórek (plazmocytomy i komórki przeciw, którym chcemy wytworzyć przeciwciała). Elektrody połączone są z generatorem prądu o przebiegu prostokątnym lub sinusoidalnym pulsującym jednostronnie o częstotliwości około 0,5 MHz i napięciu około 24 V. Pojawiające się w tych warunkach jednorodne pole elektryczne powoduje, że komórki obu rodzajów układają się pomiędzy elektrodami w charakterystyczne „sznureczki”, a w obrębie „sznureczka” często naprzemiennie. Jeżeli do elektrod zostanie doprowadzony gwałtownie potencjał o wysokim napięciu powodujący wyładowanie elektryczne - iskra elektryczna będzie perforować błony komórek tworzących poszczególne „sznury”. Zastosowanie równoległych (płaskich lub walcowych) elektrod powoduje, że powstaje między nimi jednorodne pole elektryczne i wyodrębniają się „sznury” komórek o różnej długości i w zupełnie przypadkowych miejscach. Konsekwencją tego jest różny stopień perforacji błon i różne prawdopodobieństwo powstania oczekiwanej hybrydy. W opisanej komorze efektywność procesu hybrydyzacji jest mała - wynosi poniżej 1%, co znaczy, że w komorze uzyskano poniżej 1% udanych połączeń hybrydowych. Uzyskane hybrydy, po wyizolowaniu, stosowane są w dalszej pozaustrojowej hodowli produkującej przeciwciała.The currently used hybridization methods can be divided into three groups in terms of factors that perforate cell membranes: chemical, biological, physical. The well-known Zimmerman method published in the book Human Hybrydomas by the author Strelkauscas, published in 1990, describes a hybridization chamber using the electrofocusing phenomenon. In this chamber, two electrodes (flat or in the form of a cylinder and a cylinder) are used, spaced from each other from a fraction to a few millimeters. Between the electrodes there is a suspension of two types of cells (plasmacytomas and cells against which we want to make antibodies). The electrodes are connected with a rectangular or sinusoidal current generator pulsating one-sidedly with a frequency of about 0.5 MHz and a voltage of about 24 V. The homogeneous electric field appearing in these conditions causes the cells of both types to form characteristic "strings" between the electrodes, and within the "string" often alternately. If a high voltage potential is suddenly applied to the electrodes, causing an electric discharge - the electric spark will perforate the membranes of cells that make up individual "ropes". The use of parallel (flat or cylindrical) electrodes causes a homogeneous electric field to arise between them and to separate "strings" of cells of various lengths and in completely random places. The consequence of this is a different degree of membrane perforation and a different probability of the expected hybrid formation. In the described chamber, the efficiency of the hybridization process is low - it is less than 1%, which means that less than 1% of successful hybrid connections were achieved in the chamber. The obtained hybrids, after isolation, are used in further extracorporeal culture to produce antibodies.

Komora do hybrydyzacji i diagnostyki płynów ustrojowych i wydalin według wynalazku składa się z dwu elektrod, zewnętrznej w postaci tulei i ustalonej współosiowo wewnętrznej elektrody w postaci walca pokrytego siecią ostrosłupów ułożonych na powierzchni pierścieniowo lub po linii śrubowej.The chamber for hybridization and diagnostics of body fluids and excreta according to the invention consists of two electrodes, the outer electrode in the form of a sleeve and the coaxially fixed inner electrode in the form of a cylinder covered with a network of pyramids arranged on the surface in a ring or in a helix.

W komorze według wynalazku występuje korzystniejszy rozkład pola elektrycznego z punktu widzenia hybrydyzacji komórek przez co wzrasta jej efektywność osiągając 7-8% udanych połączeń komórek.The chamber according to the invention has a more favorable distribution of the electric field from the point of view of cell hybridization, which increases its efficiency, reaching 7-8% of successful cell connections.

Przedmiot wynalazku jest uwidoczniony w przykładzie wykonania na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schematycznie komorę do hybrydyzacji i diagnostyki, fig. 2 - walcową elektrodę z nacięciami pierścieniowymi i wzdłużnymi, fig. 3 - elektrodę z nacięciami spiralnymi trójkątnymi i wzdłużnymi, fig. 4 - przekrój poprzeczny elektrody walcowej, fig. 5 - tworzenie się „sznurów” komórek.The subject of the invention is shown in the embodiment in the drawing, in which Fig. 1 shows schematically the hybridization and diagnostic chamber, Fig. 2 - a cylindrical electrode with annular and longitudinal cuts, Fig. 3 - an electrode with spiral triangular and longitudinal cuts, Fig. 4 - cross section of a cylindrical electrode, Fig. 5 - formation of cell "strings".

Komorę 1 do hybrydyzacji i diagnostyki tworzą dwie elektrody, zewnętrzna w postaci tulei 2 oraz wewnętrzna o kształcie walca 3 z nacięciami usytuowana współosiowo wewnątrz tulei 2 i zamknięta dwoma przykrywkami 4 wykonanymi z materiału o własnościach izolacyjnych. Elektroda walcowa 3 zakończona jest z dwu stron śrubowymi końcówkami 5, które przechodzą przez otwory 6 w przykrywkach 4. Przykrywki 4 dociśnięte są do czoła zewnętrznej elektrody w postaci tulei 2 nakrętkami 7. Elektroda walcowa 3 w swej środkowej części posiada nacięcia pierścieniowe 8 o kształcie trójkąta o kącie wierzchołkowym około 60° lub po spirali gwintu trójkątnego 9. Ponadto na elektrodzie walcowej 3 wykonane są wzdłużne nacięcia do głębokości nacięć pierścieniowych 8 lub gwintu trójkątnego 9 w ten sposób, że na powierzchni walca 3 powstały ostrosłupy 10 o kącie wierzchołkowym zbliżonym do 60° ułożone pierścieniowo 8 lub po spirali 9 co pokazano na rysunku fig. 2 i 3. Odległość wierzchołków ostrosłupów 10 od wewnętrzne] powierzchni walcowej tulei 2 mieści się w granicach kilku dziesiętnych milimetra do kilku milimetrów w zależności od wielkości komory 1 do hybrydyzacji.The hybridization and diagnostics chamber 1 consists of two electrodes, the outer one in the form of a sleeve 2 and the inner one in the form of a cylinder 3 with incisions located coaxially inside the sleeve 2 and closed with two covers 4 made of a material with insulating properties. The cylindrical electrode 3 ends on both sides with helical tips 5, which pass through the holes 6 in the covers 4. The covers 4 are pressed against the face of the outer electrode in the form of a sleeve 2 with nuts 7. The cylindrical electrode 3 in its central part has annular cuts 8 in the shape of a triangle with an apex angle of approximately 60 ° or along a helix of a triangular thread 9. In addition, longitudinal incisions are made on the cylindrical electrode 3 to the depth of the ring cuts 8 or of a triangular thread 9 in such a way that pyramids 10 with an apex angle close to 60 ° are formed on the surface of the cylinder 3 arranged in a ring 8 or in a spiral 9 as shown in Figures 2 and 3. The distance of the tops of the pyramids 10 from the inner surface of the cylindrical sleeve 2 is in the range of a few tenths of a millimeter to a few millimeters depending on the size of the hybridization chamber 1.

PL 195 206 B1PL 195 206 B1

Elektroda zewnętrzna w postaci tulei 2 oraz wewnętrzna w postaci walca 3 z nacięciami podłączone są do generatora prądu o przebiegu prostokątnym lub sinusoidalnym pulsującym jednokierunkowo o częstotliwości około 0,5 MHz i napięciu 24 V oraz do źródła impulsów prądowych o napięciu 100-200 V na 1 cm² powierzchni elektrody. Komorę 1 do hybrydyzacji wypełnia się zawiesiną dwóch rodzajów komórek umownie oznaczonych A i B (komórka A - guz nowotworowy, komórka B - plazmocytoma), zamyka przykrywką 4 dokręcając nakrętki 7. Po wsączeniu zasilania prądu o napięciu 24 V wewnątrz komory 1 powstaje niejednorodne pole elektryczne wynikające z tego, że maksymalny potencjał elektryczny występuje na ostrzach - wierzchołkach ostrosłupów 10 co uwidoczniono schematycznie na rysunku fig. 5. „Sznury” komórkowe tworzą się jedynie na wierzchołkach ostrosłupów 10 elektrody 3, ich długość jest bardzo zbliżona. W tej sytuacji potencjał wyładowania elektrycznego zostanie równomiernie rozłożony na liczbę ostrosłupów, a natężenie przepływu prądu będzie porównywalne w każdym „sznurze”. Biologiczną konsekwencją jest podobny stopień perforacji błon komórkowych i podobne prawdopodobieństwo wystąpienia hybrydyzacji na dowolnym wierzchołku ostrosłupa 10. Efektywność procesu hybrydyzacji w komorze 1 według wynalazku wyraźnie wzrosła w warunkach laboratoryjnych do 7-8%.The outer electrode in the form of a sleeve 2 and the inner one in the form of a cylinder 3 with notches are connected to a current generator with a rectangular or sinusoidal pulsating unidirectional waveform with a frequency of about 0.5 MHz and a voltage of 24 V and a source of current pulses with a voltage of 100-200 V per 1 cm ² of the electrode area. The hybridization chamber 1 is filled with a suspension of two types of cells, conventionally labeled A and B (cell A - tumor, cell B - plasmacytoma), closed with a cover 4 tightening the caps 7. After applying the 24 V power supply, an inhomogeneous electric field is created inside chamber 1 resulting from the fact that the maximum electric potential occurs at the tips - the tips of the pyramids 10 as shown schematically in Fig. 5. Cell "ropes" are formed only at the tips of the pyramids 10 of the electrode 3, their length is very similar. In this situation, the electric discharge potential will be evenly distributed over the number of pyramids, and the current flow rate will be comparable in each "string". The biological consequence is a similar degree of perforation of the cell membranes and a similar probability of hybridization occurring at any apex of the pyramid 10. The efficiency of the hybridization process in chamber 1 according to the invention clearly increased under laboratory conditions to 7-8%.

Komorę 1 według wynalazku można również wykorzystać do diagnostyki płynów ustrojowych i wydalin pod kątem obecności elementów morfotycznych (przykładowo komórek krwi w moczu lub bakterii). Badania przeprowadza się przez porównanie oporu rzeczywistego roztworu po włączeniu elektrod 2 i 3 do generatora prądu stałego, a następnie zmiennego. Jeżeli w roztworze nie ma elementów morfotycznych - różnica w oporze nie występuje. Elementy morfotyczne, z uwagi na obecność błony komórkowej przy włączeniu prądu zmiennego powodują powstanie oporu pojemnościowego, co zostaje wykazane na mierniku. Ponadto można oceniać czy w roztworze znajduje się jeden czy kilka rodzajów komórek zmieniając częstotliwość prądu zmiennego. Im większa komórka - maksimum oporu pojemnościowego występuje przy mniejszej częstotliwości. Skanując badany roztwór prądem o zmiennej częstotliwości, na podstawie obecności jednego lub kilku maksimów oporności pojemnościowej stwierdzamy obecność jednego rodzaju komórek lub kilku rodzajów komórek.The chamber 1 according to the invention can also be used for the diagnosis of body fluids and excreta for the presence of morphotic elements (for example blood cells in the urine or bacteria). The tests are carried out by comparing the resistance of the real solution after connecting electrodes 2 and 3 to a DC generator and then an AC generator. If there are no morphotic elements in the solution, there is no difference in resistance. Morphotic elements, due to the presence of a cell membrane, cause a capacitive resistance when switching on the alternating current, which is shown on the meter. Moreover, it is possible to judge whether there are one or several types of cells in a solution by changing the frequency of the alternating current. The larger the cell - the maximum capacitive resistance occurs at a lower frequency. Scanning the test solution with a current of variable frequency, on the basis of the presence of one or more maxima of capacitive resistance, we find the presence of one type of cells or several types of cells.

Claims

Chamber for cell hybridization and diagnostics of body fluids and excretions consisting of two electrodes, characterized by having an outer electrode in the form of a sleeve (2) and a coaxially fixed inner electrode in the form of a cylinder (3) covered with a network of pyramids (10) arranged on the surface in a ring (8) or in a helix (9).