PL180747B1 - Koniugat przeciwciało-superantygen - Google Patents
Koniugat przeciwciało-superantygenInfo
- Publication number
- PL180747B1 PL180747B1 PL95318162A PL31816295A PL180747B1 PL 180747 B1 PL180747 B1 PL 180747B1 PL 95318162 A PL95318162 A PL 95318162A PL 31816295 A PL31816295 A PL 31816295A PL 180747 B1 PL180747 B1 PL 180747B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sea
- conjugate
- binding
- cells
- mhc class
- Prior art date
Links
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 title claims abstract description 53
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 65
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims abstract description 10
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 8
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 74
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 20
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 4
- 230000009545 invasion Effects 0.000 claims description 4
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 22
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 102220580968 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1_F47Y_mutation Human genes 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 6
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 6
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 6
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 102220556624 Acyl-coenzyme A thioesterase 11_H50A_mutation Human genes 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 102220554190 APC membrane recruitment protein 1_D45A_mutation Human genes 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102220580971 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1_F47W_mutation Human genes 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 3
- 102220480887 Thymocyte selection-associated high mobility group box protein TOX_K55A_mutation Human genes 0.000 description 3
- 102220465728 USP6 N-terminal-like protein_K14A_mutation Human genes 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710101607 Toxic shock syndrome toxin-1 Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 2
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000011547 Bouin solution Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102220470231 Charged multivesicular body protein 5_D11A_mutation Human genes 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 108010069304 Exfoliatins Proteins 0.000 description 1
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010064885 HLA-DR3 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710120978 Kanamycin resistance protein Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000045576 Lactoperoxidases Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101100003996 Mus musculus Atrn gene Proteins 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102220528595 Ribonuclease P/MRP protein subunit POP5_L48A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N [125I][125I] Chemical compound [125I][125I] PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005595 deprotonation Effects 0.000 description 1
- 238000010537 deprotonation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000431 effect on proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010022946 erythrogenic toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000011344 liquid material Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102220237717 rs779249550 Human genes 0.000 description 1
- 101150033897 sea gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 108010010318 streptococcal M protein Proteins 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010088577 zinc-binding protein Proteins 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
- A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3046—Stomach, Intestines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1. Koniugat przeciwcialo-superantygen, znamienny tym, ze obejmuje a. przeciwcialo lub jego fragment wiazacy antygen zdolne do wiazania okreslonej stru- ktury powierzchniowej zwiazanej z choroba i b. peptyd, który: i. zawiera sekwencje aminokwasowa pochodzaca od superantygenu wybranego z grupy obej- mujacej enterotoksyne stafylokokowa A, B, C 1 , C2, D ii. jest zmodyfikowany przez mutacje w kodonie kodujacym reszte aminokwasowa, która koordynuje cynk, gdy wiaze sie z antygenami MHC klasy II, iii. ma zmniejszona zdolnosc do wiazania sie z antygenami MHC klasy II w porownaniu z naturalnie wystepujaca enterotoksyna stafylokokowa, iv. ma zdolnosc wiazania sie z lancuchem Vß receptora limfocyta T. PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest koniugat hrzeciwciało-suherantygen.
Suherantygany sąprzade wszystkim białkami pochodzenia bakteryjnego albo wirusowego i są zdolne do równoczesnego wiązania antygenów MHC klasy II na komórkach ssaków i łańcucha νβ receptora limfocyta T. Wiązanie prowadzi do aktywacji limfocytów T i lizy komórki niosącej MHC klasy II. Umiarkowanego stopnia polimorfizm części wiążącej łańcucha νβ powoduje aktywację stosunkowo dużej populacji limfocytów T po kontakcie z superantygenem (w porównaniu z aktywacją przez normalną obróbkę antygenu).
Początkowo, koncepcja superantyganu była związana z różnymi enterotoksynami stafylokoków (SEA, SEB, SEC, SEC2, SED i SEE). Ostatnio odkryto nową enterotoksynę stafylokokową nazwaną SEH (Keyong i in., J. Exp. Med., 180 (1994) 1675-1683). Po wzroście zainteresowania, odkryto dalsze superantygeny. Przykładami jest, między innymi, toksyna-1 zespołu wstrząsu toksycznego (TSST-1), toksyny eksfoliatywne (Exft) związane z zespołem złuszczania skóry, streptokokowe pirogenne egzotoksyny A, B i C (SPE A, B i C), białka mysiego wirusa guza sutka (MMTV), białka M streptokoków, enterotoksyną Clostridium perfringens (CPET). Przegląd superantygenów i ich właściwości opublikował Kotzin i in. (Adv. Immunol. 54 (1993) 99-166).
Egzotoksyna A psauZrmrnas, badana była jako funkcjonalny superantygen, ponieważ istnieją dane świadczące, że ta toksyna może ulegać obróbce wewnątrzkomórkowej przez komórki dodatkowe na fragmenty ulegające ekspresji na powierzchni komórki, zachowując zdolność wiązania z łańcuchem Vp i następującej potem aktywacji limfocytów T. (Pseudomonas exotoxin A. Legaard i in., Cell Immunol., 135 (1991) 372-382).
Sugerowano, że superantygeny jako takie, mogąbyć zastosowane w leczeniu różnych chorób, przy czym wpływ leczniczy miał być osiągany przez uogólnioną aktywację układu odporno180 747 ściowego (Kalland i in., WO 9104053; Terman i in., WO 9110608; Terman i in., WO 9324136; Newell i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 1074-1078).
W powiązaniu ze szczepionkami, sugerowano zastosowanie superantygenów zmutowanych w taki sposób, że utraciły swoją zdolność wiązania TCR (Kappler i Marrack, WO 9314634).
Mutacje superantygenów opisano uprzednio (Kappler i Marrack, WO 9314634; Kappler i in., J. Exp. Med. 175 (1992) 387-396; Grossman i in., J. Immunol. 147 (1991) 3274-3281; Hufnagle i in., Infect. Immun. 59 (1991) 2126-2134).
Wynalazcy sami uprzednio sugerowali użycie koniugatów superantygenu i przeciwciała do leczenia, w celu lizy komórek, w których zachodzi ekspresja struktury, przeciwko której jest skierowane przeciwciało (Dohlstein i in., WO 9201470; Lando i in., Cancer Immunol. Immunother. 36 (1993) 223-228; Kalland i in., Med. Oncol. Tumor Pharmacother. 10 (1993) 3747; Lando i in., J. Immunol. 150 (8 część 2) (1993) 114A (Joint Meeting of the American Association of Immunologists and the Clinical Immunology Society, Denver, Colorado, USA, 21 -25 maja (1993)); Lando i in., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. Annu. Meet. 33(0) (1992) 339 (Annual Meeting ofthe American Association for Cancer Research, San Diego, California, USA, 20-23 maja (1992)); Dohlstein i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 9287-9291). Choroby, które sugeruje się jako możliwe do leczenia obejmująnowotwory, zakażenia wirusowe, inwazje pasożytów, choroby autoagresyjne i inne choroby związane z komórkami ekspresjonującymi swoiste dla choroby struktury powierzchniowe. Prace doświadczalne przeprowadzone do tej pory skupiały się na komugatach zawierających rekombinowaną SEA i różne przeciwciała przeciwnowotworowe. Koniugaty jako takie wykazywały nieco zmniejszoną zdolność do wiązania antygenów MHC klasy II w porównaniu z postacią niekoniugowaną superantygenu. Nie określono dotąd, czy zmniejszona zdolność wiązania antygenu MHC klasy II jest korzystna czy nie, dla uzyskania optymalnej lizy i optymalnego efektu terapeutycznego.
Doświadczenia immunoterapeutyczne z SEB koniugowaną chemicznie z antyidiotypowym przeciwciałem swoistym dla nowotworu zostały opisane przez Ochi i in., (J. Immunol. 151 (1993)3180-3186).
Podczas rozpatrywania pierwszego zgłoszenia, Szwedzki Urząd Patentowy cytował dodatkowo pracę Buelow i in., (J. Immunol. 148 (1992) 1-6), która opisuje fuzję pomiędzy białkiem A i fragmentami SEB, bez podkreślania wiązania z MHC klasy II albo zastosowania fuzji do niszczenia komórek; i pracę Hartwig i in., (Int. Immunol. 5 (1993) 869-875), w której opisano mutacje zakłócające wiązanie z MHC klasy II niefuzyjnej postaci superantygenowej toksyny erytrogennej A streptokoków.
Celem wynalazku jest ulepszenie znanych uprzednio koniugatów superantygenów z przeciwciałami, które prowadziłoby do lepszego uogólnionego pobudzenia układu odpornościowego w funkcji cytotoksyczności ukierunkowanej. Pobudzenie powoduje aktywację limfocytów T i jest zależne od zdolności superantygenu do wiązania zarówno z receptorem limfocyta T jak i z antygenem MHC klasy II.
Wykazano, że koniugaty przeciwciał i superantygenów o zmodyfikowanym powinowactwie do antygenów MHC klasy II według wynalazku poprawiają wybiórczość cytolizy komórkowej zależnej od superantygenu-przeciwciała (SADCC) komórek eksponujących antygen (przeciwko któremu skierowane jest przeciwciało/bioswoista składowa powinowactwa koniugatu) w stosunku do komórek eksponujących antygeny MHC klasy II.
Koniugaty według wynalazku mogą być zastosowane jako czynnik aktywny w leczeniu ssaków cierpiących z powodu nowotworów, chorób autoagresyjnych, inwazji pasożytniczych, zakażeń wirusowych albo innych chorób związanych z komórkami, na których powierzchni w wyniku ekspresji powstają struktury, swoiste dla odpowiedniej choroby.
Koniugat według wynalazku obejmuje
a. przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zdolne do wiązania określonej struktury powierzchniowej związanej z chorobą i
b. peptyd, który:
180 747
i. zawiera sekwencję aminokwasową pochodzącą od superantygenu wybranego z grupy obejmującej enterotoksynę stafylokokową A, B, Cb C2, D ii. jest zmodyfikowany przez mutację w kodonie kodującym resztę aminokwasową, która koordynuje cynk, gdy wiąże się z antygenami MHC klasy II, iii. ma zmniejszoną zdolność do wiązania się z antygenami MHC klasy II w porównaniu z naturalnie występującą enterotoksyną stafylokokową, iv. ma zdolność wiązania się z łańcuchem νβ receptora limfocyta T.
Peptyd i przeciwciało lub jego fragment, który stanowi składową powinowactwa, są połączone kowalencyjnie ze sobą mostkiem (B).
Korzystne koniugaty mają zdolność do aktywowania i kierowania limfocytów T do selektywnej lizy komórek, które na swej powierzchni eksponują strukturę, przeciwko której skierowana jest składowa powinowactwa. Oznacza to, że koniugaty powinny powodować cytolizę metodą SADCC (cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciała-superantygenu). Patrz, część doświadczalna poniżej i poprzednie publikacje dotyczące koniugatów pomiędzy superantygenami i przeciwciałami (np. Dohlsten i in., WO 9201470).
Struktura powierzchniowa komórki związana jest z chorobą wybraną z grupy obejmującej raka, zakażenie wirusowe, chorobę autoagresyjnąalbo inwazję pasożytniczą, a zwłaszcza z rakiem.
Korzystne koniugaty według wynalazku mają budowę analogiczną do koniugatów superantygen-przeciwciało, opisanych w stanie techniki (Dohlsten i in., WO 9201470), t.j. koniugaty określone są wzorem:
T-B-SA(m) w którym T oznacza przeciwciało jako bioswoistaskladowapowmowactwa, SA(m) oznacza zmodyfikowany superantygen (wspomniany wyżej peptyd), zaś B oznacza mostek kowalencyjny łączący T i SA(m) ze sobą.
T wiąże się na zasadzie swoistego biologicznie powinowactwa i jest zdolne do wiązania się ze strukturą powierzchni komórki swoistą dla choroby, jak określona wyżej. Struktura, przeciwko której skierowane jest T jest zwykle różna od (a) epitopu łańcucha Vp, z którym wiąże się peptyd uzyskany z superantygenu (SA(m)) i (b) epitopu antygenu MHC klasy II, z którym wiąże się niemodyfikowany superantygen.
Korzystnie T j est przeciwciałem albo fragmentem przeciwciała wiążącym antygen (włącznie z Fab, F(ab)2, Fv, przeciwciałem jednołańcuchowym itp.), ze szczególnym uwzględnieniem fragmentu czynnego przeciwciała (jak Fab) przeciwciał skierowanych przeciwko tzw. epitopowi C242 (Lindholm i in., WO 9301303) albo przeciwko innym epitopom swoistym dla nowotworu.
Korzystnie T jest przeciwciałem monoklonalnym albo jest mieszaniną określonej liczby przeciwciał monoklonalnych (np. 2,3,4,5 albo więcej). T może być przeciwciałem poliklonalnym, w przypadku gdy zastosowanie nie jest lecznicze.
Jako drugi składnik koniugatu według wynalazku stosuje się zmutowane postaci superantygenów posiadające liczne miejsca wiązania MHC klasy II i/lub zdolność do wiązania koordynacyjnego Zn2+, przykładowo SEA, SED, SEE i SEH.
T podobnie jak SA(m) może być wytworzone technikami rekombinacji.
Mostek B może być wybrany jak to opisano wcześniej (Dohlsten i in., WO 9201470), tzn. powinien on być korzystnie hydrofilowy i posiadać jedną lub wiele struktur wybraną spośród amidu, tioeteru, eteru, disulfidu itp. W przypadku, gdy mostek zawiera niepodstawione, nieprzerwane łańcuchy węglowodorowe, pozbawione są one korzystnie pierścieni aromatycznych takich jak fenyl. Najważniejsze mostki uzyskane są technikami rekombinacji, t.j. Gdy koniugacja zachodzi na poziomie genetycznym. W takich przypadkach, korzystne są mostki oligopeptydowe zawierające hydrofitowe reszty aminokwasowe, takie jak Gin, Ser, Gly, Glu i Arg. Mogą być włączone Pro i His. Podczas roku pierwszeństwa zadecydowano, że korzystnym mostkiem jest peptyd obejmujący trzy reszty aminokwasowe (GlyGlyPro).
180 747
Koniugat według wynalazku może obejmować jeden lub więcej zmodyfikowanych superantygenów przypadających na przeciwciało i odwrotnie. Oznacza to, że T we wzorze może zawierać jeden lub więcej zmodyfikowanych superantygenów dodatkowo do składowej bioswoistej. Analogicznie, SA(m) może zawierać jedną lub więcej bioswoistych składowych powinowactwa T. Liczba zmodyfikowanych superantygenów na jedną składową powinowactwa wynosi korzystnie jeden albo dwa.
Synteza nowych komugatów według wynalazku może być przeprowadzona w zasadzie dwiema drogami: 1. technikami rekombinacji, 2. przez chemiczne wiązanie T z SA(m). Sposoby sądobrze znane specjalistom i obejmująwiele odmian. Oznacza to, że wynalazek dotyczy przede wszystkim koniugatów sztucznych, t.j. koniugatów nie spotykanych w naturze.
Wiązanie chemiczne zmodyfikowanego superantygenu z bioswoistą składową powinowactwa T, często wykorzystuje grupy funkcyjne (np. pierwszorzędowe grupy aminowe albo karboksylowe) obecne w wielu pozycjach w każdym ze związków. Oznacza to, że produkt końcowy będzie zawierał mieszaninę cząsteczek koniugatu różniących się pozycją, w której miało miejsce wiązanie.
W przypadku koniugatów rekombinowanych (białek fuzyjnych) uzyskany koniugat będzie jednorodny w odniesieniu do pozycji wiązania. Koniec aminowy zmodyfikowanego superantygenu wiązany jest z końcem karboksylowym bioswoistej składowej powinowactwa albo odwrotnie. W przypadku przeciwciał, takich jak całe przeciwciała albo fragmenty wiążące antygen (Fab, Fv itp.), do fuzji może być wykorzystany zarówno łańcuch ciężki jak i lekki. Obecnie, uważa się, że korzystne sąkoniugaty rekombinowane, szczególnie fragmenty Fab i wiązanie końca aminowego zmodyfikowanego superantygenu z pierwszą domeną stałą łańcucha ciężkiego przeciwciała (CH1), bez wyłączania analogicznego wiązania łańcucha lekkiego albo domen VH i VL, co również może dawać dobre wyniki.
S ą dwa różne sposoby uzyskiwania dużych ilości superantygenów w E. coli (włączaj ąc postaci zmodyfikowane i poddane fuzji): wytwarzanie wewnątrzkomórkowe albo wydzielanie. Ten drugi sposób jest korzystny dla koniugatów według wynalazku, ponieważ zapewnia oczyszczanie prawidłowo pofałdowanego białka z periplazmy i pożywki hodowlanej. Wytwarzanie wewnątrzkomórkowe powoduje skomplikowaną procedurę oczyszczania i często wymaga ponownego fałdowania białka in vitro (żeby białko uzyskało prawidłową strukturę trzeciorzędową). Powyższe nie wyklucza, że jest możliwe wytworzenie czynnych koniugatów również w innych komórkach gospodarza, np. komórkach eukariotycznych takich jak komórki drożdży albo ssaków.
Wytwarzanie zmutowanych superantygenów i selekcję mutantów wykazujących zmienioną zdolność do wiązania (powinowactwa) z antygenami MHC klasy II, można przeprowadzić znanymi technikami (patrz np., Kappler i in., J. Exp. Med. 165 (1992) 387-396). Patrz również część doświadczalna.
Zdolność koniugatu do wiązania się z łańcuchem Vp receptora limfocyta T, strukturą docelową i powodowania lizy komórki docelowej, zależy przede wszystkim od peptydu (SA(m)) uzyskanego z superantygenu, bioswoistej składowej powinowactwa (T) oraz długości i budowy mostka (B). Specjalista jest w stanie optymalizować koniugaty według wynalazku w odniesieniu do ich zdolności wiązania oraz zdolności do powodowania lizy, przez badanie zależności pomiędzy efektem a strukturą, stosując modele ujawnione w związku ze znanymi uprzednio koniugatami przeciwciał i superantygenów (patrz, wspomniane wyżej odnośniki). Patrz również, część doświadczalna poniżej.
Przez zmodyfikowaną zdolność wiązania antygenów MHC klasy II rozumie się, że stosunek IC50 (SA(wt)): IC50(SA(m)) jest <0,9 (90%), taki jak <0,5 (<50%) i może być także <0,01 (< 1%). Ewentualnie, zmodyfikowana zdolność wiązania koniugatów według wynalazku może być mierzona jako stosunek stałych dysocjacji Kd(SA(wt)): Kd(SA(m)) przy stałej Kd mierzonej w nM i w tych samych granicach co stosunek IC50(SA(wt)): IC50(SA(m)). W celu oznaczania IC50(SA(wt)), IC50(SA.(m)), Kj(SA(wt)) i Kd(SA(m)), patrz część doświadczalna niżej.
180 747
Wiadomo, że pewne superantygeny mogą mieć dwa lub więcej miejsc wiązania antygenu MHC klasy II (Fraser i in., Superantigens: A pathogens wiev on the immune system. Wyd. Hyber & Palmer, Current Communications in Celi Molecular Biology 7 (1993) 7-29). Dla tego typu superantygenów zdolność wiązania powinna być modyfikowana w przynajmniej jednym z miejsc wiążących, np. przez zmniejszenie wyżej wspomnianej wielkości. Prawdopodobnie, może wystarczyć modyfikacja superantygenu powodująca zmienioną różnicę w powinowactwie obu miejsc wiążących MHC klasy li, przykładowo > 10%, zaś korzystnie przez zmniejszenie powinowactwa przynajmniej jednego miejsca.
Superantygeny wiążąłańcuchy νβ różnych podtypów z różnym powinowactwem. W białkach fuzyjnych/koniugatach według wynalazku, zastosowany superantygen może być zmodyfikowany tak, aby wykazywał zmienioną swoistość podtypu albo zmienione powinowactwo do jednego lub wielu członków podtypu. Istnieją poważne powody, aby sądzić, że istnieje paraboliczna zależność pomiędzy powinowactwem do TCR νβ i pobudzeniem przez TCR, tj. umiarkowane powinowactwo daje najwyższe pobudzenie. Odpowiednie powinowactwo zmodyfikowanego superantygenu do VeTCRmoże być korzystne, jak długo białko fuzyjne/koniugat obejmujący zmodyfikowany superantygen jest zdolny do znaczącego pobudzenia do proliferacji populacji spoczynkowych limfocytów T reprezentujących zasadniczo dystrybucję wszystkich ludzkich podgrup Vp. Populację limfocytów T mogą stanowić spulowane limfocyty T od losowo wybranych osobników ludzkich. Przez określenie “znaczące” rozumie się, że pobudzenie jest możliwe do zmierzenia. Wyniki przedstawione w tabeli II (prawa kolumna) w części doświadczalnej wskazują, że zdolność do wywoływania SADCC koniugatów/białek fuzyjnych według wynalazku jest często zasadniczo taka sama jak dla fuzji obejmującej superantygen typu dzikiego.
Główne zastosowanie koniugatów/białek fuzyjnych według wynalazku
Koniugaty według wynalazku sąprzede wszystkim przeznaczone do leczenia tych samych chorób, co koniugaty pomiędzy normalnymi superantygenami i przeciwciałami. Patrz, wyżej wymienione publikacje. Tak więc, koniugaty według wynalazku mogą być podawane zarównojako leczenie główne, jak i jako terapia wspomagająca w połączeniu z chirurgią albo innymi lekami.
Koniugaty według wynalazku mogąbyć podawane w postaci kompozycji farmaceutycznej o znanych formach użytkowych. Tak więc, kompoozycje mogąbyć w postaci 1 iofilzowariego materiału proszkowego, sterylnego albo wytworzonego aseptycznie roztworu, tabletki, ampułki itp. Mogą one zawierać nośnik taki jak woda (korzystnie buforowana do wartości fizjologicznego pH, np. za pomocąPBS) albo inny obojętny materiał stały lub ciekły. W znaczeniu ogólnym, kompozycje są wytwarzane przez mieszanie koniugatu z, rozpuszczanie w, wiązanie z, albo łączenie w inny sposób z jednym lub wieloma rozpuszczalnymi w wodzie albo nierozpuszczalnymi w wodzie, wodnymi albo nie wodnymi nośnikami, jeżeli to konieczne wraz z odpowiednimi dodatkami i adiuwantami. Konieczne jest aby nośniki i warunki nie wpływały ujemnie na aktywność koniugatu. Woda jako taka zawarta jest w nośniku ekspresyjnym.
Normalnie, koniugat będzie sprzedawany i podawany w uprzednio podzielonych dawkach, z których każda zawiera skuteczną ilość koniugatu, która w oparciu o prezentowane tu wyniki, uważa się że zawiera się w zakresie od 10 pg do 50 mg. Dokładna dawka różni się w zależności od przypadku i zależy od ciężaru i wieku pacjenta, drogi podania, rodzaju choroby, przeciwciała, superantygenu, wiązania (-B-) itp.
Drogi podania są powszechnie znane w tej dziedzinie, tj. doprowadza się do kontaktu z komórką docelową ilość skuteczną do lizy komórki docelowej albo ilość skuteczną terapeutycznie koniugatu według wynalazku. We wskazaniach wymienionych powyżej oznacza to zwykle podawanie pozajelitowe, takie jak wstrzyknięcie albo infuzję (podskórnie, dożylnie, dotętniczo, domięśniowo) ssakowi, takiemu jak człowiek. Koniugat może być podawany miejscowo albo układowo.
Przez “ilość skuteczną do lizy komórki docelowej” rozumie się, że ilość jest skuteczna do aktywacji i kierowania limfocytów T do niszczenia komórki docelowej.
Pod koniec roku pierwszeństwa zadecydowano, że korzystną drogą podania koniugatów/białek fuzyjnych obejmujących niemodyfikowany superantygen jest 3 godzinna doży180 747 lna infuzja na dzień w skojarzeniu z lekiem obniżającym gorączkę (paracetamol). Podawanie jest powtarzane w ciągu 4 dni i kończone zanim zostaną wywołane u pacjenta wtórne przeciwciała przeciwko białku fuzyjnemu/koniugatowi. Ten schemat leczenia jest możliwy do zastosowania również w przypadku koniugatów/białek fuzyjnych według niniejszego wynalazku.
Alternatywne dziedziny zastosowania
Koniugaty według wynalazku są również stosowane do ilościowego albo jakościowego wykrywania struktur, przeciwko którym skierowana jest grupa poszukująca celu (T). Ogólnie, sposoby te są dobrze znane specjalistom. Tak więc, zmodyfikowany superantygen może działać jako grupa znacznikowa w testach immunologicznych, włącznie z immunohistochemią, w tym znaczeniu, że grupa znacznikowajest z kolei wykrywana przez, przykładowo, przeciwciało skierowane przeciwko peptydowi (SA(m)) i znakowane enzymem, izotopem, fluoroforem albo mną znana grupą znacznikową. Inną metodą testu immunologicznego jest wykrywanie w populacji komórek, takich komórek, które ekspresjonująna swej powierzchni strukturę zdolnądo wiązania się z grupą poszukującą celu (T). To zastosowanie polega na tym, że próbkę populacji komórek inkubuje się z limfocytami T wraz z koniugatem według wynalazku, jak w teście SADCC. W przypadku gdy inkubacja prowadzi do lizy komórkowej, oznacza to, że populacja zawiera komórki, które na swej powierzchni ekspresjonują wspomnianą strukturę.
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
Wytwarzanie białek rekombinowanych
Przeciwciała
Praca doświadczalna w związku z wynalazkiem została głównie wykonana z przeciwciałem monoklonalnym C215 jako substancją modelową. Przeciwciało to jest skierowane przeciwko antygenowi z rodziny GA-733 (patrz, przykładowo EP 376,746), cytowane odnośniki oraz Larsson i in., Int. J. Canc. 32 (1988) 877-82). Epitop C215 nie został uznany za wystarczająco swoisty do leczenia nowotworów u ludzi. W momencie daty pierwszeństwa przeciwciało monoklonalne C242 (Lindholm i in., WO 9301303) uważano za lepszego kandydata, jak wynika z doświadczeń z jego produktem fuzyjnym z SEA typu dzikiego.
Szczepy bakteryjne i plazmidy
Szczepy E. coli UL635 (xyl-7, ara-14, T4R, AompT) i HB 101 (Boyer i Roulland-Dessoix, J. Mol. Biol., 41(1969) 459-472) zastosowano, odpowiednio, do ekspresji i klonowania. Wektor pKP889 zastosowano do ekspresji białka fuzyjnego Fab-SEA (uzyskanego z mysiego przeciwciała C215), zaś wektory pKP943 i pKP1055 do wydzielania SEA (Fig ). Wektor ekspresyjny pKP889 jest identyczny z pKP865 (Dohlsten i in., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (w druku)) z wyjątkiem takim, że łącznik pomiędzy CH1 i SEA stanowi GlyGlyAlaAlaHisTyrGly. Ekspresja z pKP943 daje SEA z natywnym końcem aminowym. Zastosowanie pKP 1055 powoduje powstanie SEA posiadającej resztę Gly dodaną na końcu aminowym. W obu wektorach do transkrypcji i translacji zastosowano sygnały białka A stafylokoków (Uhlen i in., J. Biol. Chem. 259 (1984) 1695-1702), zaś do wydzielania zastosowano syntetyczny peptyd sygnałowy (L. Abrahmsen, nieopublikowane).
Mutageneza in vitro
Mutacje wykonano przez reakcje łańcuchowe polimerazy przeprowadzone na urządzeniu Perkin Elmer Thermocycler. Mieszanina reakcyjna (100 pl) zawierała: bufor PCR 1 x z Perkin Elmer Cetus (10 mM Tris/HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCf, 0,001% (wag./obj.) żelatyna, dodatkowe 2 mM MgCĘ, 0,4 mM dNTP (Perkin Elmer Cetus), 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus, USA) i 100 ng matrycowego DNA. Startery dodano w stężeniu końcowym 0,8 pM. Oryginalną matrycą był plazmid zawierający gen enterotoksyny A Staphylococcus aureus identyczny z opublikowanym przez Bentley i in., (J. Bacteriol. 170 (1988) 34-41), z wyjątkiem takim, że pierwszy kodon (kodujący Ser) zastąpiono na tCc w celu wprowadzenia miejsca BamHI na końcu 5' genu. Następnie zastosowano pochodną zawierającą więcej unikalnych miejsc restrykcyjnych wprowadzonych mutacjami niemymi. W pobliżu miejsca restrykcyjnego wprowadzono mutacje stosując zestaw starterów, z których jeden zawiera! mutację i miejsce restrykcyjne. Dla większości mutacji konieczne było zastosowanie dwóch zestawów starterów, zaś PCR wykonywano w
180 747 dwóch kolejnych etapach. Nowe miejsce restrykcyjne wprowadzano wraz z każdą mutacją w celu umożliwienia łatwej identyfikacji. Oligonukleotydy zastosowane jako startery zsyntetyzowano na urządzeniu Gene Assembler (Pharmacia Biotech AB, Szwecja). W celu potwierdzenia każdej z mutacji, odpowiednią część sekwencji nukleotydowej oznaczano na urządzeniu Applied Biosystems DNA-Sequenser stosując zestaw Taq DyeDeoxy Termination Cycle Sequencing Kit.
Wytwarzanie i analiza białka
Komórki E. coli niosące różne konstrukty genowe namnażano przez noc w temperaturze pokojowej (wektory Fab-SEA) oraz w temperaturze 24-34°C (wektory wydzielnicze, optimum zależy od mutacji). Brzeczkę stanowił 2xYT (trypton Bacto 16 g/l, ekstrakt drożdżowy Bacto 10 g/l, NaCl 5 g/l) z dodatkiem kanamycyny (50 mg/l). Białka fuzyjne indukowano przez dodanie izopropylo-p-D-tiogalaktozydu do stężenia końcowego 100 pM. (Promotor białka A zastosowany do ekspresji niefuzyjnego SEA jest konstytutywny). Komórki żwirowano przy 5000 x g, zaś zawartość periplazmy uwolniono przez delikatne odmrożenie uprzednio zamrożonego osadu komórkowego wlO mM Tris-HCl (pH 7,5) na lodzie, podczas mieszania przez godzinę. Ekstrakty periplazmatyczne klarowano przez odwirowanie przy 9500 x g przez 15 minut. Białka Fab-SEA zastosowano bez dalszego oczyszczania. SEA i Gly-SEA oczyszczono dalej przez chromatografię powinowactwa, na kolumnie z przeciwciałami przeciwko SEA. Królicze przeciwciała poliklonalne przeciwko SEA pobrano uprzednio od królików immunizowanych SEA, i oczyszczono przez chromatografię powinowactwa na podłożu G Sepharose® (Pharmacia Biotech).
Analiza białka
Białka rozdzielono na uprzednio odlanym żelu poliakrylamidowym Novex Tris-Glycine z SDS (gradient 4-20% albo homogenny 12%, nowa eksperymentalna technologia Novex) i barwiono błękitem Coomassie albo stosowano w badaniu metodą western blot. W celu wykrywania SEA w badaniu metodą western blot stosowano poliklonalne przeciwciała królicze przeciwko SEA (patrz wyżej), a następnie świńskie przeciwciała przeciwko króliczym Ig, i królicze przeciwciała przeciwko peroksydazie chrzanowej oraz peroksydazę. Z białkami fuzyjnymi Fab-SEA stosowano również przeciwciała szczurze sprzęgnięte z peroksydazą, rozpoznające łańcuch κ (AAC 08P, Serotech Ltd., Anglia). Do uwidocznienia peroksydazy stosowano 3,3'-diaminobenzydynę (Sigma).
Widma dichroizmu kołowego (CD) zbierano stosując spektropolarymetr J-720 (JASCO, Japonia) w temperaturze pokojowej (22-256C) w buforze-10 mM fosforan, pH 8,2, z 0,02 mM ZnSO4 i 0,005% (obj./obj.) Tween® 20. Prędkość skanowania wynosiła 10 nm/min., zaś każde widmo uśredniano z pięciu kolejnych skanów. Długość ścieżki komory wynosiła 1 mm, zaś stężenie białka od 0,2 do 0,5 mg/ml. Mierzono denaturację chlorowodorkiem guadyniny (Gdn-HCl) w stanie równowagi w temperaturze 23°C przy CD 222 nm w stężeniu białka 0,3 mg/ml i długości ścieżki komory równej 1 mm. Dane te zastosowano do obliczenia frakcji białka niepofałdowanego (Fapp). Równowagę parametrów niepofałdowania uzyskano przez dopasowanie danych do procesu fałdowania dwustronnego (Hurle i in., Biochemistry 29 (1990) 4410-4419).
Wiązanie i testy czynnościowe in vitro
Materiały
Reagenty: pożywkę RPMI 1640 uzyskano z Gibco, Middlesex, Anglia. pH pożywki wynosiło 7,4 i zawierała ona 2 mM L-glutaminy (Gibco, Middlesex, Anglia), 0,01 M HEPES (Biological Industries, Izrael), 1 mMNaHCO3(Biochrom AG, Niemcy), 1 mg/ml siarczanu gentamycyny (Biological Industries, Izrael), 1 mM pirogronianu sodu (JHRBiosciences Industries, USA), 0,05 mM merkaptoetanol (Sigma Co., USA), 100-krotnie stężone niezasadnicze aminokwasy (Flow Laboratories, Szkocja) z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej (Gibco, Middlesex, Anglia). Rekombinowaną SEA(wt), SEA(m) oraz białka fuzyjne C215Fab-SEA(wt) i C215Fab-SEA(m) uzyskano, jak to opisano wyżej. Rekombinowaną ludzką IL-2 uzyskano z Cetus Corp., USA. Mitomycyna C pochodziła z Sigma Co., USA. Na251CrO4 pochodził z Merck, Niemcy. Roztwór soli buforowany fosforanem (PBS) bez magnezu i wapnia uzyskano z Imperial, Anglia.
180 747
Komórki: Linię komórkową ludzkiego raka okrężnicy Colo2051 linię chłoniaka z limfocytów B Raji uzyskano z American Type Cell Culture Collection (Rockville, MD, USA) (ekspresjonujące HLA-DR3/w10, -DP7, -DQwl/w2). Limfoblastoidalna linia komórkowa BSM transformowana EBV była hojnym darem od dr van De Griend, Dept of Immunology, Dr Daniel den Hoed Cancer Center, Leida, Holandia. Komórki badano kilkakrotnie w kierunku zanieczyszczenia drobnoustrojami Mycoplasma stosując test Gen-Probe Mycoplasma T. C., Gen-Probe Inc., San Diego, USA.
Linie limfocytów T aktywowanych SEA wytworzono przez aktywację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Krew uzyskano jako kożuszki leukocytame od dawców krwi z Uniwersity Hospital ofLund. PBM w gęstości 2x106 komórek/ml pobudzono komórkami BSM opłaszczonymi sEa (preinkubowanymi z SEA 100 ng/ml) i traktowanymi mitomycynąC, w pożywce z 10% FCS. Linie limfocytów T restymulowano co dwa tygodnie stosując 20 U/ml rekombinowanej ludzkiej IL-2 i co tydzień komórkami BSM opłaszczonymi SEA i traktowanymi mitomycyną C. Linie komórkowe hodowano 4-12 tygodni przed zastosowaniem w teście.
Żywotność komórek efektorowych, oznaczona liczeniem w błękicie trypanu, przekraczała
50%.
Określenie charakterystyki wiązania SEA typu dzikiego i zmutowanej SEA z MHC klasy II
Procedura znakowania jodem radioaktywnym. Odpowiednie ilości SEA typu dzikiego i zmutowanej znakowano radioaktywnie stosując od 10 do 25 mCi Na125I i technikę perełek enzymatycznych opłaszczonych laktoperoksydazą (NEN, Boston, MA). Reakcję zatrzymano przez traktowanie azydkiem sodu i oddzielono radioaktywność związaną z białkiem od wolnego jodu, przez filtrację na kolumnie PD-10 (Pharmacia Biotech AB, Szwecja) stosując pożywkę R10 jako bufor elucyjny. Warunki dobrano tak aby uzyskać pomiędzy jodem-125 i białkiem stosunek stechiometryczny równy <2:1. Czystość radiochemiczną potwierdzono przez chromatografię żelową na kolumnie TSK SW 3000 HPLC. Wpływ znakowania jodem radioaktywnym na aktywność wiązania badano wyłącznie na SEA typu dzikiego i nie stwierdzono by była zakłócona (dane nie pokazane).
Bezpośredni test wiązania. Komórki Raji, 6x104/100 pl, hodowane uprzednio w pożywce R10, wprowadzono do stożkowej probówki polipropylenowej i inkubowano (22°C/45 minut) w potrójnym powtórzeniu z 100 pl/probówkę kolejnych rozcieńczeń SEA typu dzikiego i zmutowanej, znakowanych 1¾ Komórki płukano 2 ml 1% (wag./obj.) albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS), pH, 7,4, odwirowano przy 300 x g przez 5 minut i aspirowano. Tąprocedurę powtarzano dwukrotnie. Na koniec, komórki analizowano na radioaktywność związaną z komórką w liczniku gamma (Packard Instruments Co, Downers Grove, IL, USA). Prawdopodobna stała dysocjacji Kd oraz liczba miejsc wiążących N została obliczona według Scatcharda (Ann. N. Y Acad. Sci., 51 (1949) 660-72) po odjęciu wiązania nieswoistego (tj. wiązaniu po inkubacji z samą pożywką R10).
Test zahamowania (zahamowania wiązania SEA typu dzikiego, znaczonej l25I i SEA zmutowaną). Doświadczenia nad zahamowaniem przeprowadzono, zasadniczo, jak to opisano dla testu bezpośredniego wiązania, z niewielkimi modyfikacjami. Pokrótce, 50 pl SEA typu dzikiego, znakowanej 125I pozostawiono do współzawodniczenia o wiązanie z 6x104/100 pl komórek Raji, z nadmiarem nieznakowanej SEA typu dzikiego albo zmutowanej (50 pl/probówkę). W celu uzyskania maksymalnej czułości w teście zahamowania, stosowano stężenie znacznika równe około 40% radioaktywności związanej w teście bezpośrednim. Zdolność wypierania substancji współzawodniczącej wyrażano jako stężenie dające 50% zahamowania (IC50) radioaktywności związanej. Powinowactwo wiązania mutantów względem SEA typu dzikiego obliczano stosując równanie:
IC50(SA(wt)): IC50(SA(m))
W celu zbadania czy mutanty współzawodniczą o wiązanie z tym samym miejscem na komórkach Raji co SEA typu dzikiego, dane dotyczące wiązania z mutantami SEA wykreślono jako funkcję log-logit i badano pod kątem zbieżności z odpowiednimi danymi SEA typu dzikiego.
180 747
Test zahamowania (zahamowanie wiązania SEA typu dzikiego znakowanej flurrescancyjnie przez SEA typu dzikiego nieznnkrwnnej oraz mutanty SEA). Komórki Raji (2,5x105) inkubowano z inhibitorem (SEA typu dzikiego albo zmutowana; 0-6000 nM) rozcieńczonym w 50 pl pożywki niezależnej od CO2 (Gibco) z dodatkiem 10% FCS, glutaminy i gentamycyny w 37°C przez 30 minut. SEA typu dzikiego znakowana fluorescencyjnie została dodana w stężeniu końcowym równym 30 nM, po czym próbki inkubowano przez dodatkowe pół godziny w 37°C. Próbki płukano trzykrotnie lodowatym PBS z dodatkiem 1% BSA (PBS-BSA) i trzymano na koniec w 0,4 ml PBS-BSA na lodzie do momentu badania. 10000 żywych komórek z każdej próbki badano pod kątem zielonej fluorescencji w cytometrze przepływowym FACStar® (Becton Dickinson) i obliczano średnią wartość flurrescancji stosując program LYSIS II.
Testy SDCC i SaDcC wykonane na SEA(wt). SEA(m) i ch białkach fuzyjnych z C215Fab
Testy SDCC. Cytotoksyczność SEA(wt), SEA(m) i ich fuzji z C215Fab przeciwko komórkom Raji MHC klasy Π+, badana była standardowym 4-godzinnym testem uwalniania 5'Cr3* , przy użyciu pobudzonych SEA swoistych linii limfocytów T jako komórek efektorowych. Pokrótce, komórki Raji znakowane 5’Cr inkubowano w gęstości 2,5x103 komórek na 0,2 ml pożywki (RPMI, 10% FCS) w płytkach do mikromiareczkowania, w określonym stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych w obecności albo nieobecność (kontrola) dodatków. Procent swoistej cytotoksyczności obliczono jak 100 x ([cpm uwalniania doświadczalnego - cpm uwalniania spontanicznego]/[cpm uwalniania całkowitego - cpm uwalniania spontanicznego]). Stosunek komórek afaktrrowych do docelowych wynosił dla SEA nie poddanych fuzji 30:1 i 40:1 dla białek fuzyjnych.
SADCC przeciwko ludzkim komórkom raka okrężnicy. Cytotoksyczność C215FabSEA(wt), C215Fab-SEA(m), SEA(wt) i mutantów SEA przeciwko komórkom raka okrężnicy SW 620, C215+ MHC klasy II, badano w standardowym 4-godzinnym teście uwalniania 5*Cr3+, przy użyciu pobudzonych SEA swoistych linii limfocytów T jako komórek efektorowych. Pokrótce, komórki SW 620 znakowane 5 Cr inkubowano w gęstości 2,5x103 komórek na 0,2 ml pożywki (RPMI, 10% FCS) w płytkach do mikromiareczkowania, w stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych równym 30:1, w obecności albo pod nieobecność (kontrola) dodatków. Procent swoistej cytotoksyczności obliczono jak w testach SDCC.
Doświadczenia czynnościowe in vivo
Komórki nowotworowe. Komórki czerniaka B16-F10 taansfakrwana cDNA kodującym ludzki antygen związany z nowotworem C215 (B16-C215) (Dohlstein i in., Monoclonal antibrdysuhernntigen fusion proteins: Tumor specific agents for T cell based tumor therapy; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, w druku, 1994), namnażano jako komórki przylegające, do zlewności. Pożywka hodowlana zawierała RPMI 1640 (GIBCO, MidZlesex, UK) z dodatkiem 5x10’5 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 2 mM L-glutaminy (GIBCO), 0,01 M HEPES (Biological Industries, Izrael), i 10% surowicy płodowej cielęcej (GIBCO). Komórki złuszczono przez krótką inkubację w 0,02% EDTA i zawieszono w lodowatym roztworze soli buforowanym fosforanem z 1% surowicą syngeniczną mysią (nośnik) w gęstości 4x105 komórek/ml.
Zwierzęta i traktowanie zwierząt. Myszy C57B1/6, transganiczne dla łańcucha νβ3 receptora limfocytów T(Dohlsten i in., Immunology 79 (1993) 520-527), były w wieku 12-19 tygodni. Sto tysięcy komórek B16-C215 wstrzyknięto i. v. do żyły ogonowej w 0,2 ml nośnika. Dnia 1,2 i 3 myszom podano wstrzyknięcia i. v. C215Fab-SEA(wt) albo C215Fab-SEA(D227A) w 0,2 ml nośnika w dawkach pokazanych na figurach 5a i 5b. Myszom kontrolnym podano wyłącznie nośnik w oparciu o ten sam schemat. Dnia 21 po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, myszy zabito przez dyslokację szyjną, płuca pobrano, utrwalono w roztworze Bouin’a i liczono przerzuty płucne.
WYNIKI “Skanowanie alaniny” stafylokokowej anterrtrksyny A
Początkowo budowa SEA była nieznana i można było jedynie spekulować, które łańcuchy boczne były dostępne z powierzchni. Stąd, większość mutantów wybrano na podstawie powiązań homologicznych suparαntygenów (Marrack i Kappler, science 248 (1990) 705-711).
180 747
Na podstawie przesłanki, że niektóre z tych superantygenów, jak się oczekuje, wiążąHLA-DE w sposób zakonserwowany (Chitagumpala i in., J. Immunol. 147 (1991) 3876-3881) wybrano zakonserwowane reszty (głównie polarne). Zastosowano podstawianie alaniny, w oparciu o opublikowaną strategię (Cunningham i Wells, Science 244 (1988) 1081-1085). Podczas trwania tej pracy zwiększała się dostępna informacja: i) wykazano, że jon Zn2+jest istotny dla oddziaływania pomiędzy SEA i MHC klasy II (HLA-DR) (Fraser i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1991) 5507-5511), ii) przedstawiono analizę mutacyjnąstafylokokowej enterotoksyny B (SEB) (Kappler i in., J. Exp. Med. 175 (1992) 387-396), i iii) pokazano strukturę SEB (Swaminathan i in., Nature 359 (1992) 801-8060.
Pierwszy mutant wykazujący silnie zmniejszone powinowactwo do HLA-DR, D227A, bardzo słabo koordynował, jak wykazano, jony Zn2+ (dane nie pokazane). Zakładając podobne fałdowanie SEA i SEB, nowe dane sugerowały dwa regiony wiązania MHC klasy II; jeden wiążący jon Zn2+ i jeden odpowiadający miejscu określonemu w SEB. Na podstawie tych przypuszczeń wykonano drugi zestaw mutacji. Drugi zestaw mutantów ekspresjonowano w postaci SEA posiadającej dodaną glicynę na końcu aminowym. Wydłużenie nie miało wpływu, jak wykazano, na właściwości wiązania SEA typu dzikiego (następny rozdział).
Większość mutantów była ekspresjonowana i wydzielana z E. coli w postaci funkcjonalnej, jak oceniono przez analizę wiązania z przeciwciałami monoklonalnymi (Tabela I). Uzyskano bardzo małe ilości mutantów E154A/D156A i R160A. W wyniku, wyłączono je z badań. Mutanty o podstawieniach Ala w pozycji 128, 187, 225 albo 227 nie były rozpoznawane przez przeciwciało 1E. Dwa ostatnie mutanty wykazywały obniżony poziom ekspresji (silniej wyrażony w 34°C niż w 24°C) i szybciej migrowały podczas SDS-PAGE w warunkach denaturujących, ale nie w redukujących (wszystkie pozostałe mutanty migrowałyjak SEA typu dzikiego, dane nie pokazane). Oceniając analizą widma DC, struktura D227A mogła różnić się nieco od natywnej SEA (Figura 2), ale stabilność bardzo przypominała SEA typu dzikiego (co mierzono odpornością na denaturację chlorowodorkiem guanidiowym). Wyliczona AAG pomiędzy zmutowaną i natywną SEA (SEA(wt)) wynosiła -Ό, 16 kcal/mol i stanowiła tylko 4% wartości AG° (dane nie pokazane). Całkowity sygnał w badaniu CD był słaby, jak oczekiwano w przypadku struktury w większości typu płachty-β. Ostatnio doniesiono, że His 225 koordynuje Zn2+ (dane nieopublikowane Fraser i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1991) 5507-5511)). Ponieważ Asp 227 jest związana z koord;^:^i^cyiąZn2+ (wyżej) i prawdopodobnie położona w tej samej płachcie-β co His 225, wskazuje to, że te dwie reszty stanowią ośrodek wiązania cynku, spotykany w białkach koordynujących cynk (Vallee i Alud, Biochemistry 29 (1990) 5647-5659).
Wiązanie z MHC klasy II i receptorem limfocyta T,
Powinowactwo do MHC klasy II obliczono z ilości niezbędnych do współzawodnictwa ze znakowaną fluorescencyjnie SEA typu dzikiego o komórkę Raji eksponującą duże ilości MHC klasy II. Wielkość wypierania mutanta obliczono ze stężeń powodujących 50% zahamowanie (IC50) związanej fluorescencji w porównaniu ze stężeniem wymaganym przez SEA typu dzikiego dla tego samego konkurenta. Dla SEA typu dzikiego i niektórych mutantów, wyniki porównano z wynikami uzyskanymi z analizy, gdzie jako znacznika użyto SEA typu dzikiego, znakowanej 125I. Jak to widać na tabeli II, wartości uzyskane z tych dwóch badań zahamowania dobrze korelowały.
Dla sześciu wybranych mutantów, wiązanie z MHC klasy II mierzono bezpośrednio stosując zmutowaną SEA znakowaną 125I (tabela II). Dla mutanta H50A, wartości uzyskane z bezpośredniego testu wiązania i testu zahamowania dobrze korelowały, ale dla mutanta F47A stwierdzono dużą rozbieżność: wiązanie bezpośrednie wskazywało na wiązanie tylko 7-krotnie słabsze niż SEA typu dzikiego, ale oba testy współzawodnictwa wykazały wiązanie zmniejszone około 70-krotnie. Dane z dwóch innych mutantów wskazywały na dwie różne interakcje wiązania. Dla mutantów H225A i D227A powinowactwo znajdowało się poniżej granicy wykrywania w tym badaniu.
Wykazano uprzednio, że białko fuzyjne zbudowane z fragmentu Fab przeciwciała skierowanego przeciw nowotworowi i SEA może być zastosowane do kierowania cytotoksycznych li12
180 747 mfocytów T w kierunku swoistej lizy komórek nowotworowych, podczas gdy oddziaływanie pomiędzy SEA i receptorem limfocyta T (TCR) jest zbyt słabe, by mogło być wykryte (Dohlstein i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, w druku). Tak więc w przeciwieństwie do badań wykorzystujących izolowany superantygen, fuzja z Fab umożliwia badanie czynnościowe interakcji pomiędzy SEA i TCR, niezależnie od wiązania z MHC klasy II. Tak więc, efektywność różnych koniugatów służących kierowaniu limfocytów T w kierunku lizy komórek rozpoznawanych przez domenę Fab była badana testem uwalniania chromu. Badanie potwierdziło, że mutacje, które wpływają na wiązanie MHC klasy II nie wpływają na wiązanie z TCR (tabela II).
Efekty biologiczne mutacji
Wpływ na proliferację mierzony był zdolnością do pobudzania limfocytów obwodowych do podziałów. Wszystkie trzy mutanty słabo współzawodniczące o MHC klasy II wywoływały słabą albo żadną proliferację, zaś mutant pośredni H187A wykazywał pewną zdolność proliferacyjną, podczas gdy inne badane mutanty były nieodróżnialne od typu dzikiego (tabela III). Hams i in., Infect. Immun. 61 (1993) 3175-3183, opisali ostatnio podobne, silne zmniejszenie aktywności pobudzającej limfocyty T mutantów SEA F47G i L48G. Silne zmniejszenie w każdym z tych dwóch sugerowanych regionach wiązania wywierało silny wpływ na zdolność do wywoływania proliferacji. Sugeruje to, że SEA wiąże krzyżowo dwie cząsteczki MHC klasy II, co prowadzi do dimeryzacji TCR, co jest niezbędne do przekazania sygnału.
W przeciwieństwie, efektywność różnych mutantów w kierowaniu limfocytów T, pobudzonych in vitro SEA, do lizy komórek docelowych niosących MHC klasy II, wykazuje raczej korelację z powinowactwem wiązania, niż ze zdolnością do współzawodnictwa (tabela III). Przykładowo, efektywność F47A i D227A jest zmniejszona, odpowiednio, tylko 2,5-krotnie i 300-krotnie. Tak więc, żaden wewnętrzny wymóg diwalencji nie jest oczywisty. Zwiększenie multiwalencji spowodowane znacznie większą liczbą TCR na powierzchni pobudzonych limfocytów T może częściowo maskować wpływ mniejszej zachłanności oddziaływania SEA/MHC klasy II. Ta dimeryzacja nie jest konieczna kierowania cytotoksycznością limfocytów T, co wykazano uprzednio zastosowaniem swoistych dla nowotworu przeciwciał o podwójnej swoistości, zawierających domenę anty-CD3 i domenę przeciwnowotworową (Renner i in., Science 265 (1994) 833-35).
Doświadczenia czynnościowe in vivo: Wyniki przedstawiono na figurach 6a i 6b. Traktowanie myszy C215Fab-SEA(wt) i C215Fab-SEA (d227A) było w obu przypadkach bardzo skuteczne w zmniejszaniu liczby przerzutów płucnych komórek czerniaka B16-C215. Efekt terapeutyczny był zasadniczo identyczny dla obu wariantów ukierunkowanych superantygenów. Leczenie C215Fab-SEA(wt) powodowało 70% śmiertelność w dawce 5 pg/wstrzyknięcie. W przeciwieństwie, żadna z myszy nie padła gdy zastosowano tą samą dawkę C215Fab-SEA (D227A). Podsumowując, SEA (D227A) jest przykładem mutanta o zmniejszonej toksyczności i zachowanej skuteczności terapeutycznej, gdy jest włączony do białka fuzyjnego Fab-SEA.
DYSKUSJA
Struktura kompleksu pomiędzy SEB i HLA-DR została niedawno opisana (Jardetzky i in., Nature 368(1994) 711-718). Większość reszt SEB zidentyfikowanych jako biorące udział w tym oddziaływaniu jest zakonserwowana w SEA. Dane dotyczące mutanta D227A wskazująna słabe powinowactwo do oddziaływania pomiędzy tym miejscem SEA (miejsce proksymalne aminowo) i MHC klasy II, wykazując wartość Kd wyższą niż 8pM. Kd oddziaływania pomiędzy SEB i HLA-DR opisano ostatnio jako 1,7 pM (Seth i in., Nature 369 (1994) 324-27). Badano różne oddziaływania pomiędzy SEB, TCR i HLA-DR i wykazano, że kompleks SEB i HLA-DR był niestabilny pod nieobecność TCR. Doświadczenia z wykorzystaniem rezonansu plazmowego wskazują, że spowodowane jest to bardzo szybkim zjawiskiem “off-rate”. Efekty zachłanności uzyskane gdy SEA wiązała krzyżowo dwie cząsteczki MHC klasy II, w następstwie czego następowała dimeryzacja TCR, pozwala wyjaśnić jak SEA może wywoływać zjawisko proliferacji w stężeniach znacznie niższych niż Kd. Zakładając, że mutacja F47A zmniejsza powinowactwo miejsca proksymalnego aminowo poniżej poziomu istotności, Kd miejsca Zn2+ wynosi około 95 nM. Ta hipoteza została ostatnio wzmocniona przez obserwację, że mutanty F47R, F47R/H50A i
180 747
F47R/L48A/H50D, wykazywały identyczne powinowactwo do MHC klasy II co F47A (niepublikowane).
W oparciu o strukturę SEB (Kappler i in., J. Exp. Med. 175 (1992) 387-396) oraz porównanie homologii (Marrack i Kappler, Science 248 (1990) 705-711), sugeruje się, że His225 i Asp227 położone sąna tej samej płachcie-β i w ten sposób łańcuchy boczne mogą być proksymalne. Tak więc, najprawdopodobniej te dwie reszty stanowią ośrodek wiązania cynku spotykany w białkach wiążących cynk Vallee i Alud, Biochemistry 29 (1990) 5647-5659). Podobnie do tych mutantów, mutanty o podstawieniu w pozycji 128 i 187 są rozpoznawane przez wszystkie przeciwciała monoklonalne z wyjątkiem 1E. Fraser i in.,(Proc. Natl. Acad. Sci USA 89 (1991) 5507-5511) wykazali, że Zn2+jest wiązany przez SEA i jest potrzebny do oddziaływania silnego powinowactwa z MHC klasy II. Powinowactwo do cynku nie było zakłócone przez dodanie HLA-DR. W oparciu o tę obserwację i silne powinowactwo do Zn2+ (Kd rzędu 1 pM) sugeruje się 4-krotną koordynację zapewnianą wyłącznie przez SEA. Dane niniejsze wskazują udział czterech resztN128, H187, H225 i D227. Funkcja dwóch ostatnich reszt nie jest jasna; zamiast zapewniania ligandu N128 może pomagać w deprotonacji D227. Jeden argument za tym, stanowi fakt, że wpływ zastąpienia D227 jest cięższy niż zastąpienia H225.
Uprzednio doniesiono, że nie ma korelacji pomiędzy powinowactwem różnych superantygenów do MHC klasy II i zdolnością do pobudzania limfocytów T do proliferacji (Chintagumpala i in., J. Immunol. 147 (1991) 3876-3881). Wyniki te mogą być częściowo wyjaśnione różnymi powinowactwami superantygenów wobec różnych łańcuchów V β TCR. W niniej szych doświadczeniach obserwowano ten sam brak korelacji, ale w przeciwieństwie do oddzielnych superantygenów mutanty wykazywały identyczne powinowactwo do TCR jak to wykazano w kontekście Fab-SEA (mierzono SADCC). Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem braku korelacji jest to, że dwa regiony wiążące zidentyfikowane w tym badaniu stanowią dwa osobne miejsca wiążące, które powodują nie tylko współwiązanie, ale powodują wiązanie krzyżowe dwóch cząsteczek MHC klasy II, co z kolei powoduje dimeryzację dwóch cząsteczek receptora limfocyta T. Może to powodować, że powinowactwo obu miejsc jest istotne dla uzyskania efektu proliferacyjnego. Wysoka zachłanność wynika z oddziaływania w heksamerycznym kompleksie obejmującym po dwie cząsteczki SEA, TCR i MHC klasy II. Tak więc, silne powinowactwo/zachłanność SEA wobec MHC klasy II umożliwia oddziaływanie SEA z TCR mimo niskiego bezpośredniego powinowactwa.
Inne bioswoiste składowe powinowactwa. Białko fuzyjne SEA (D227A) i domeny wiążącej IgG białka A stafylokoków wytworzono techniką rekombinacji i poddano ekspresji w E. coli. Reagent ten z powodzeniem zastosowano do kierowania limfocytów T na komórki Mot 4 i CCRF-CEM (uzyskane z ATCC), które są pozytywne pod względem CD7 i CD38 ale negatywne pod względem HLA-DP, -DQ i -DR. Komórki Mot 4 i CCRF-CEM inkubowano z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD7 i przeciwko DC38 (Dianova, Hamburg, Niemcy). W celu wzmocnienia wiązania pomiędzy mysimi przeciwciałami monoklonalnymi i częścią wiążącą IgG białka fuzyjnego, dodano również króliczego przeciwciała przeciwko mysim Ig.
W porównaniu z białkiem A-SEA(wt), białko A-SeA (D227A) wykazywało zmniejszoną zdolność do wiązania się z komórkami Daudi ekspresjonującymi antygen MHC klasy II.
180 747
Tabela I
Potwierdzenie integralności struktury mutantów. Badano wiązanie sześciu przeciwciał monoklonalnych.
| Mutacja | Przeciwciało monoklonalne | |||||
| 1A | 2A | 3A | 1E | 4E | EC-A1 | |
| Typ dziki | + | + | + | + | + | + |
| Dl 1A/K14A | + | + | + | + | + | + |
| D45A | + | + | + | + | + | + |
| F47A | + | + | + | + | + | + |
| H50A | (+) | + | (+) | + | + | + |
| K55A | + | + | + | + | + | + |
| H114A | + | + | + | + | + | + |
| K123A/D132G | + | + | + | + | + | + |
| N128A | + | + | + | - | + | + |
| K147A/K148A | + | + | + | + | - | + |
| E154A/D156A | + | + | + | + | + | + |
| R160A | + | + | + | + | + | + |
| H187A | + | + | + | - | + | + |
| E191A/N195A | ND | ND | ND | + | ND | ND |
| D197A | ND | ND | ND | + | ND | ND |
| H225A | + | + | + | - | + | + |
| D227A | + | + | + | - | + | + |
Przypis: Znak “+” oznacza wiązanie, nawiasy oznaczająwiązanie 50-90% w porównaniu z SEA typu dzikiego. ND oznacza “nie stwierdzono”.
Tabela II
Wiązanie mutantów SEA z MHC klasy II i receptorem limfocyta T. To ostatnie badano jako zdolność do kierowania aktywowanych cytotoksycznych limfocytów T w kierunku lizy komórek nowotworowych stosując fuzje Fab-SEA różnych mutantów (SADCC).
| Mutacja | IC50 (nM) SEA-FITC1 | IC50 (nM) SEA-Ί’Γ | Kd (nM) znak. ,25I' | SADCC (% typu dzikiego)1 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Typ dziki | 50 | 3.8 | 13 | 1002 |
| Gly-SEA | 50 | ND | ND | 1002 |
| D1TA/K14A | 50 | ND | ND | ND |
| D45A | 53 | ND | ND | ND |
| F47A | 3150 | 2943 | 95 | 100 |
| H50A | 150 | 132 | 32 | 100 |
| K55A | 44 | ND | ND | ND |
| H114A | 48 | ND | ND | ND |
| K123A/D132G | 188 | 75 | 12/237 | 100 |
| N128A | 1150 | ND | 2,9/76 | 100 |
| K147A/K148A | 58 | ND | ND | ND |
180 747 cd tabeli II
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| H187A | 1030 | 602 | 97 | 100 |
| E154A/D156A | 51 | ND | ND | ND |
| D197A | 78 | ND | ND | ND |
| H225A | >9000 | 9600 | ND | ND |
| D227A | >9000 | >10000 | >8000 | 100 |
Przypis: 1) ND oznacza “nie stwierdzono”. 2) W kontekście Fab-SEA łącznik pomiędzy Ch 11 SEA kończył się Gly.
Tabela III
Efekty biologiczne mutacji. Badano zdolność do pobudzania spoczynkowych limfocytów T do proliferacji i zdolność do kierowania komórek cytotoksycznych na lizę komórek docelowych eksponujących MHC klasy II (SDCC = cytotoksyczność komórkowa zależna od superantygenu)
| Mutacja | Proliferacja (%) | SDCC EC50 (względne) | Mutacja | Proliferacja (%) | SDCC EC50 (względne) |
| Typ dziki | 100 | 1 | K123A/D132G | 40 | 2,1 |
| Gly-SEA | ND | 1 | K147A/K148A | 40 | 1,2 |
| D11A/K14A | ND | 0,8 | R160A | ND | ND |
| D45A | 50 | 1,3 | H187A | 15 | 4 |
| F47A | <0,2 | 2,5 | E191A/N195A | 100 | 1,1 |
| H50A | 20 | 1,4 | D197A | ND | 1,3 |
| K55A | 100 | 1,3 | H225A | <0,2 | 3x102 |
| H114A | ND | 1 | D227A | <0,01 | 3x102 |
Przypis· ND oznacza “nie stwierdzono”.
Legenda do figur
Ogólne: mutant SEA(D227A) (=SEA(m(9) albo mutant m9) był w momencie daty pierszeństwa najbardziej obiecującą odmianą SEA. Wybrano go więc do prezentacji wyników in vitro i in vivo tej odmiany (figury 3-6).
Figura 1: Schemat przedstawiający plazmidy zastosowane do ekspresji SEA i C215FabSEA. Regiony kodujące i dwa terminatory transkrypcji następujące po genach zaznaczono ramkami. Gen kodujący białko oporności na kanamycynę zaznaczono jako Km. lacI oznacza gen represora lac. Vh i Ch1 oznaczają gen kodujący fragment Fd łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała C215. Podobnie, VK i CK oznaczają gen kodujący łańcuch kappa. Rop oznacza gen kodujący białko kontrolujące replikację pBR322. Promotory kierujące transkrypcję produktów genowych zaznaczono strzałkami, w pKP889 promotor trc zaś w pozostałych dwóch wektorach promotor stafylokokowego białka A (spa). Region zawierający początek replikacji zaznaczono jako ori. Jedyna różnica pomiędzy SEA kodowaną przez pKP943 i pKP1055 stanowi reszta glicyny dodana do końca N tego ostatniego. Gen SEA zawarty w tym ostatnim wektorze zawierał również więcej unikalnych miejsc restrykcyjnych, wprowadzonych mutacjami niemymi.
Figura 2 : Widma dichroizmu kołowego dla SEA typu dzikiego i dla mutantów F47A i D227A, przedstawiające najbardziej zmniejszone mutacje w każdym z regionów wiążących MHC klasy II. Linia stałajest krzywą dla SEA typu dzikiego. Krzywe dla mutantów sąprzerywane albo centrowane, odpowiednio dla F47A i D227A.
Figura 3: Pokazuje zależność od stężenia cytotoksyczności komórkowej zależnej od superantygenu (SDCC) dla C215Fab-SEA(wt) i C215Fab-SEA (D227A).
180 747
Figura 5: pokazuje zależność od stężenia cytotoksyczności komórkowej zależnej od superantygenu-mAb (SADCC) dla C215Fab-SEA(wt) i C215Fab-SEA (D227A) w porównaniu z samą SEA(wt).
Figura 6a porównuje efekt terapeutyczny u myszy C57B1/6 z przerzutami płucnymi komórek czerniaka B16-C215, wywołany podawaniem C215Fab-SEA(wt) i C215Fab-SEA (D227A).
Figura 6b pokazuje toksyczność C215-SEA(wt) i C215-sEa (D227A) dla leczenia pokazanego na figurze 6a.
i: -— SEAwt 0.2mg/ml lOmMPl 0.02mMZn O . 005XTwaan60 96
2:----SEA (0227A) PZT60 940526
3: ............ SEA (F47A) 0.2mg/ml PZT60 940526 i: -— SEAwt 0.2mg/ml lOmMPl 0.02mMZn O . 005XTwaan60 96
2;----SEA (0227A) PZT60 940526
3: ............ SEA (F47A) 0.2mg/ml PZT60 940526
180 747
JOSOUZ o
>» (0
Λί o
•P
O
-P >.
o >>
O
6040
-a- SEA -±- SEAm9 control kontrola concentration QogM) stężenie
FIGURA 3
180 747
C2I5FabSEA —A— C215FabSEA m9 —control kontrola
FIGURA 4
C215FabSEA -±- C215FabSEAm9
SEA —♦— control kontroli
FIGURA 5
180 040
Therapeutic effecf
Efekt terapeutyczny
FIGURA 6a
Toxlcffy
Toksyczność śmiertelności
rC215Fab-SEA • rC215Fab-SEAmut9
FIGURA 6B ug/mouse /mysz
180 747
FIGURA 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 4,00 zł.
Claims (5)
- Zastrzeżenia patentowe1 Kor^ir^u^i^t f^i';^c^c^4i^\^ic^łcos^Lq^c^raintą^i^in znamienny tym, że obejmujea. przeciwciało lub jegr fragment wiążący antygen zdrlne dr wiązania rkreślrnej struktury powierzchniowej związanej z chrrrbą ib. peptyd, który:i. zawiera sekwencję aminrkwasrwą pochodzącą rd superantygenu wybranego z grupy obejmującej enterrtrksynę stafylokokową A, B, C,, C2, D ii. jest zmodyfikowany przez mutację w kodonie kodującym resztę aminokwasową, która koordynuje cynk, gdy wiąże się z antygenami MHC klasy II, iii. ma zmniejszoną zdolność do wiązania się z antygenami MHC klasy II w porownaniu z naturalnie występującą enterotoksyną stafylokokową, iv. ma zdolność wiązania się z łańcuchem νβ receptora limfocyta T.
- 2. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że ma zdolność aktywacji limfocytów T do lizy komórek, które eksponują na powierzchni strukturę powierzchniową.
- 3. Koniugat według zastrz. 2, znamienny tym, że struktura powierzchniowa komórki związana jest z chorobą wybraną z grupy obejmującej raka, zakażenie wirusowe, chorobę autoagresyjną albo inwazję pasożytniczą.
- 4. Koniugat wodług zastrz. 3, znami en nn tym, że s tiumura powituzc hniowajcsn związana z rakiem.
- 5. Koniugat według zastrz. 4, znamienny tym, że jest białkiem fuzyjnym.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9402430A SE9402430L (sv) | 1994-07-11 | 1994-07-11 | Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten |
| PCT/SE1995/000681 WO1996001650A1 (en) | 1994-07-11 | 1995-06-07 | A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL318162A1 PL318162A1 (en) | 1997-05-26 |
| PL180747B1 true PL180747B1 (pl) | 2001-04-30 |
Family
ID=20394684
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL95318162A PL180747B1 (pl) | 1994-07-11 | 1995-06-07 | Koniugat przeciwciało-superantygen |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7226601B1 (pl) |
| EP (1) | EP0766566B1 (pl) |
| JP (1) | JP4175489B2 (pl) |
| KR (1) | KR100377506B1 (pl) |
| CN (1) | CN1089606C (pl) |
| AT (1) | ATE200626T1 (pl) |
| AU (1) | AU699147B2 (pl) |
| CA (1) | CA2194673C (pl) |
| DE (1) | DE69520739T2 (pl) |
| DK (1) | DK0766566T3 (pl) |
| ES (1) | ES2158950T3 (pl) |
| FI (1) | FI118150B (pl) |
| GR (1) | GR3036187T3 (pl) |
| HU (1) | HU221254B1 (pl) |
| IL (1) | IL114445A (pl) |
| MY (1) | MY112916A (pl) |
| NO (1) | NO320151B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ289951A (pl) |
| PL (1) | PL180747B1 (pl) |
| PT (1) | PT766566E (pl) |
| RU (1) | RU2183215C2 (pl) |
| SE (1) | SE9402430L (pl) |
| TW (1) | TW413636B (pl) |
| UA (1) | UA73067C2 (pl) |
| WO (1) | WO1996001650A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA955746B (pl) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9402430L (sv) * | 1994-07-11 | 1996-01-12 | Pharmacia Ab | Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten |
| SE9601245D0 (sv) | 1996-03-29 | 1996-03-29 | Pharmacia Ab | Chimeric superantigens and their use |
| TW517061B (en) | 1996-03-29 | 2003-01-11 | Pharmacia & Amp Upjohn Ab | Modified/chimeric superantigens and their use |
| CA2296798A1 (en) * | 1997-07-21 | 1999-02-04 | Morten Soegaard | Directed cytolysis of target cells, agents and compositions causing cytolysis, and compounds that can be used to produce the agents |
| DE19827837A1 (de) * | 1998-06-23 | 1999-12-30 | Ernst Gleichmann | Universell an Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle der Klasse II bindende Peptide zur prädiktiven Testung, Diagnostik, Prophylaxe und Therapie von Sensibilisierungen gegen Chemikalen |
| US7491402B2 (en) | 1998-12-24 | 2009-02-17 | Auckland Uniservices Limited | Superantigens SMEZ-2, SPE-G, SPE-H and SPE-J and uses thereof |
| SE0102327D0 (sv) * | 2001-06-28 | 2001-06-28 | Active Biotech Ab | A novel engineered superantigen for human therapy |
| GB0118155D0 (en) * | 2001-07-25 | 2001-09-19 | Lorantis Ltd | Superantigen |
| NZ519371A (en) | 2002-06-04 | 2004-11-26 | Auckland Uniservices Ltd | Immunomodulatory constructs and their uses |
| US8029803B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-10-04 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
| US8025873B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-09-27 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
| US8007805B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-08-30 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens |
| SE0402025D0 (sv) * | 2004-08-13 | 2004-08-13 | Active Biotech Ab | Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent |
| US20080274133A1 (en) * | 2004-11-18 | 2008-11-06 | Avidex Ltd. | Soluble Bifunctional Proteins |
| SG2014010029A (en) * | 2005-08-19 | 2014-08-28 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobin and uses thereof |
| CN102516392B (zh) * | 2011-11-25 | 2014-05-28 | 孙嘉琳 | 一种癌靶向超抗原融合蛋白及制备方法及用途 |
| WO2014025199A2 (ko) * | 2012-08-09 | 2014-02-13 | 주식회사 한독 | 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도 |
| MX2018008383A (es) | 2016-01-10 | 2019-05-30 | Neotx Therapeutics Ltd | Inmunoterapia contra el cáncer mediada por superantígeno mejorada por inmunopotenciador. |
| US11583593B2 (en) | 2016-01-14 | 2023-02-21 | Synthis Therapeutics, Inc. | Antibody-ALK5 inhibitor conjugates and their uses |
| CN119488607A (zh) * | 2018-07-09 | 2025-02-21 | 辛瑟斯治疗股份有限公司 | 抗体-alk5抑制剂偶联物及其用途 |
| EP3969043A1 (en) | 2019-05-15 | 2022-03-23 | Neotx Therapeutics Ltd. | Cancer treatment |
| AU2021357520A1 (en) | 2020-03-05 | 2022-09-29 | Neotx Therapeutics Ltd. | Methods and compositions for treating cancer with immune cells |
| WO2023215560A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Atoosa Corporation | Tumor cell/immune cell multivalent receptor engager – bio-nanoparticle (timre-bnp) |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3627644A (en) | 1968-03-01 | 1971-12-14 | Hajime Okamoto | Process for the cultivation of hemolytic streptococci |
| US4237224A (en) | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| US4268434A (en) | 1979-01-09 | 1981-05-19 | Higerd Thomas B | Immunosuppressive extracellular product from oral bacteria |
| SU1304736A3 (ru) * | 1981-04-14 | 1987-04-15 | Др.Мадаус Унд Ко (Фирма) | Способ получени противоопухолевого средства |
| US5091091A (en) | 1981-11-06 | 1992-02-25 | Terman David S | Protein A perfusion and post perfusion drug infusion |
| US4699783A (en) | 1983-03-11 | 1987-10-13 | Terman David S | Products and methods for treatment of cancer |
| US4681870A (en) | 1985-01-11 | 1987-07-21 | Imre Corporation | Protein A-silica immunoadsorbent and process for its production |
| IT1192014B (it) | 1986-06-27 | 1988-03-31 | Rubinetterie Mariani Spa | Becco di erogazione per lavabo o simile apparecchio idraulico con comando del salterello |
| US4980160A (en) | 1986-10-16 | 1990-12-25 | Biogen, Inc. | Combinations of tumor necrosis factors and anti-inflammatory agents and methods for treating malignant and non-malignant diseases |
| ES2058538T3 (es) | 1988-07-22 | 1994-11-01 | Imre Corp | Compuestos de proteina a purificados y procedimiento para su preparacion. |
| SE8903100D0 (sv) | 1989-09-20 | 1989-09-20 | Pharmacia Ab | New pharmaceutical agent |
| US6126945A (en) * | 1989-10-03 | 2000-10-03 | Pharmacia Ab | Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds |
| EP1103268B1 (en) | 1990-01-17 | 2005-08-31 | TERMAN, David S. | Use of staphylococcal enterotoxins or related compounds for cancer treatment |
| CA2087164C (en) * | 1990-07-20 | 2002-11-26 | Terje Kalland | Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation |
| US5858363A (en) * | 1990-07-20 | 1999-01-12 | Pharmacia & Upjohn Ab | Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation |
| US6197299B1 (en) * | 1990-07-20 | 2001-03-06 | Pharmacia & Upjohn Ab | Antibody conjugates |
| WO1993024136A1 (en) * | 1991-01-17 | 1993-12-09 | Terman David S | Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds |
| SE9102074D0 (sv) | 1991-07-03 | 1991-07-03 | Kabi Pharmacia Ab | Tomour antigen specific antibody |
| CA2128415A1 (en) | 1992-01-28 | 1993-08-05 | John W. Kappler | Protective effects of mutated superantigens |
| SE9402430L (sv) * | 1994-07-11 | 1996-01-12 | Pharmacia Ab | Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten |
| SE9601245D0 (sv) * | 1996-03-29 | 1996-03-29 | Pharmacia Ab | Chimeric superantigens and their use |
| TW517061B (en) * | 1996-03-29 | 2003-01-11 | Pharmacia & Amp Upjohn Ab | Modified/chimeric superantigens and their use |
| SE0102327D0 (sv) * | 2001-06-28 | 2001-06-28 | Active Biotech Ab | A novel engineered superantigen for human therapy |
-
1994
- 1994-07-11 SE SE9402430A patent/SE9402430L/xx not_active Application Discontinuation
-
1995
- 1995-06-07 AT AT95926057T patent/ATE200626T1/de active
- 1995-06-07 WO PCT/SE1995/000681 patent/WO1996001650A1/en not_active Ceased
- 1995-06-07 PT PT95926057T patent/PT766566E/pt unknown
- 1995-06-07 KR KR1019970700156A patent/KR100377506B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-07 EP EP95926057A patent/EP0766566B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/765,695 patent/US7226601B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-07 NZ NZ289951A patent/NZ289951A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-06-07 DK DK95926057T patent/DK0766566T3/da active
- 1995-06-07 HU HU9700063A patent/HU221254B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-06-07 DE DE69520739T patent/DE69520739T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 CN CN95194071A patent/CN1089606C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-07 JP JP50425196A patent/JP4175489B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-07 ES ES95926057T patent/ES2158950T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 AU AU29940/95A patent/AU699147B2/en not_active Ceased
- 1995-06-07 RU RU97102113/13A patent/RU2183215C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-06-07 CA CA002194673A patent/CA2194673C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-07 PL PL95318162A patent/PL180747B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-07-01 TW TW084106800A patent/TW413636B/zh not_active IP Right Cessation
- 1995-07-04 IL IL11444595A patent/IL114445A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-07-06 UA UA97020534A patent/UA73067C2/uk unknown
- 1995-07-10 MY MYPI95001925A patent/MY112916A/en unknown
- 1995-07-11 ZA ZA955746A patent/ZA955746B/xx unknown
-
1997
- 1997-01-10 FI FI970100A patent/FI118150B/fi not_active IP Right Cessation
- 1997-01-10 NO NO19970108A patent/NO320151B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-07-06 GR GR20010401035T patent/GR3036187T3/el unknown
-
2005
- 2005-07-29 US US11/193,748 patent/US20050260215A1/en not_active Abandoned
- 2005-07-29 US US11/193,869 patent/US20060062795A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL180747B1 (pl) | Koniugat przeciwciało-superantygen | |
| JP4114951B2 (ja) | 改変／キメラスーパー抗原およびその使用 | |
| RU2198895C2 (ru) | Конъюгат, обладающий способностью активировать иммунную систему, и фармацевтическая композиция, включающая указанный конъюгат | |
| JP4056543B2 (ja) | 非抗原性即素複合体およびインターナライジング受容体システムの融合タンパク | |
| CA2575406A1 (en) | Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent | |
| CN108452320B (zh) | 抗trailr2抗体-毒素-偶联物及其在抗肿瘤治疗中的药物用途 | |
| US12435158B2 (en) | Anti-lambda myeloma antigen (LMA) binding proteins to treat LMA-expressing cancer and autoimmune disorders | |
| CN110152014B (zh) | 抗trailr2抗体-毒素-偶联物及其在抗肿瘤治疗中的药物用途 | |
| HK1012226B (en) | A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate | |
| Satwani et al. | Antibody-Targeted Therapy for Children, Adolescents and Young Adults with Hematological Malignancies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20140607 |