PL171356B1

PL171356B1 - A method for producing growth hormone crystals or growth hormone derivatives and a histidine or a histidine derivative

Info

Publication number: PL171356B1
Application number: PL92304017A
Authority: PL
Inventors: Hans H Soerensen; Lars Skriver; Annie R Hoelgaard
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1991-12-20
Filing date: 1992-12-16
Publication date: 1997-04-30
Also published as: ZA929825B; DK204691D0; SG47483A1

Abstract

(. Sposób \vytóvarzaniakr\'sz,tkłów hormonu wziostu lub poctwdnych dormonu mzrostu i histydyny lub pochodnej histydyny, znamienny tym, że wytwarza się roztwór nbrmbno wzrostu lub pochodnej hormonu wzrostu w rozpuszczalniku, dodaje się histydynę lub pochodną histydyny w stężeniu od 5 mM du 25 mM, doprowadza się odczyn roztworu do wartości pH od 5 do 7,5, korzystnie kwasem solnym, dodaje się kationy organiczne lub nieorganiczne, krystalizuje się roztwór w temperaturze ud około 0°C do okuło 30°C i wyodrębnia się powstałe kryształy w znany sposób.(. A method for producing crystals of growth hormone or growth hormone derivatives and histidine or a histidine derivative, characterized in that a solution of growth hormone or a growth hormone derivative is prepared in a solvent, histidine or a histidine derivative is added in a concentration of 5 mM to 25 mM, the pH of the solution is adjusted to a value of 5 to 7.5, preferably with hydrochloric acid, organic or inorganic cations are added, the solution is crystallized at a temperature from about 0°C to about 30°C and the resulting crystals are isolated in a known manner.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kryształów hormonu wzrostu lub pochodnych hormonu wzrostu i histydyny lub pochodnej histydyny.The subject of the invention is a method for producing crystals of growth hormone or derivatives of growth hormone and histidine or a histidine derivative.

Ludzki hormon wzrostu oraz hormony wzrostu pospolitych zwierząt domowych stanowią białka, zbudowane z około 191 aminokwasów, syntetyzowane i wydzielane przez przedni płat przysadki. Ludzki hormon wzrostu składa się ze 191 aminokwasów.Human growth hormone and the growth hormones of common domestic animals are proteins composed of approximately 191 amino acids, synthesized and secreted by the anterior pituitary gland. Human growth hormone consists of 191 amino acids.

Hormon wzrostu jest kluczowym hormonem biorącym udział nie tylko w regulacji wzrostu somatycznego, ale również w regulacji metabolizmu białek, węglowodanów i lipidów. Główne działanie hormonu wzrostu polega na pobudzaniu wzrostu.Growth hormone is a key hormone involved not only in regulating somatic growth but also in regulating protein, carbohydrate, and lipid metabolism. Its primary action is to stimulate growth.

Narządy i układy podatne na działanie hormonu wzrostu to kościec, tkanka łączna, mięśnie, oraz trzewia, takie jak wątroba, jelito i nerki.Organs and systems sensitive to the effects of growth hormone include the skeleton, connective tissue, muscles, and viscera such as the liver, intestine, and kidneys.

Przed opracowaniem technologii rekombinacji oraz klonowania genu hormonu wzrostu, które obecnie umożliwiają produkcję na przykład ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) i Met-hGH na skalę przemysłową, ludzki hormon wzrostu otrzymywany mógł być wyłącznie poprzez ekstrakcję z przysadek pochodzących ze zwłok ludzkich. Jako że możliwości uzyskiwania hormonu wzrostu były bardzo ograniczone, zastosowanie go rezerwowano dla pobudzania wzrostu ciała na długość w okresie dzieciństwa i pokwitania w leczeniu karłowatości, mimo że proponowano leczenie hormonem wzrostu m.in. niskorosłości (spowodowanej niedoborem hormonu wzrostu, niskorosłości zwykłej i zespołu Turnera), niedoboru hormonu wzrostu u dorosłych, niepłodności, oparzeń, dla przyspieszenia gojenia ran, w dystrofii, w leczeniu zrostu fragmentów kości, osteoporozy, rozsianego krwawienia z żołądka i stawów rzekomych.Before the development of recombinant growth hormone gene cloning technologies, which now enable industrial-scale production of human growth hormone (hGH) and Met-hGH, human growth hormone could only be obtained by extraction from pituitary glands from human cadavers. Because the potential for obtaining growth hormone was very limited, its use was reserved for stimulating longitudinal growth during childhood and adolescence to treat dwarfism, although growth hormone treatment has been proposed for conditions such as short stature (caused by growth hormone deficiency, common short stature, and Turner syndrome), adult growth hormone deficiency, infertility, burns, to accelerate wound healing, in dystrophy, in the treatment of bone fusion, osteoporosis, diffuse gastric bleeding, and pseudoarthrosis.

Proponowano również zastosowanie hormonu wzrostu w celu zwiększenia tempa wzrostu zwierząt domowych lub w celu zmniejszenia procentowej zawartości tkanki tłuszczowej u zwierząt rzeźnych.The use of growth hormone has also been proposed to increase the growth rate of domestic animals or to reduce the percentage of body fat in slaughter animals.

Preparaty farmaceutyczne hormonu wzrostu bywają niestabilne. Powstają, szczególnie w roztworach hormonu wzrostu, produkty degradacji, na przykład produkty deamidowane lub sulfoksydowane, oraz formy dimerowe i polimerowe.Pharmaceutical preparations of growth hormone can be unstable. Degradation products, such as deamidated or sulfoxidated products, as well as dimeric and polymeric forms, are formed, particularly in growth hormone solutions.

Głównymi reakcjami degradacji hGH są: 1) deamidacja, przez hydrolizę, bezpośrednią lub z powstaniem cyklicznego imidu kwasu bursztynowego jako produktu pośredniego; w wyniku deamidacji powstają zmienne ilości L-asp-hGH, L-iso-asp-hGH, D-asp-hGH i D-iso-asp-hGHThe main degradation reactions of hGH are: 1) deamidation, by hydrolysis, either direct or with the formation of cyclic succinimide as an intermediate; deamidation produces variable amounts of L-asp-hGH, L-iso-asp-hGH, D-asp-hGH and D-iso-asp-hGH

171 356 (por. wykaz literatury, poz. 1-3), 2) utlenienie reszt metioninowych w położeniu 14 i 125 (poz. 4-9) i 3) rozszczepienie wiązań peptydowych.171 356 (see the literature list, items 1-3), 2) oxidation of methionine residues in position 14 and 125 (items 4-9) and 3) cleavage of peptide bonds.

Deamidacja ma miejsce szczególnie przy Asn w położeniu 149.Deamidation occurs particularly at Asn at position 149.

hGH jest dość łatwo utleniany w położeniu 14 i 125, szczególnie w roztworze (poz. 4-8).hGH is oxidized quite easily at the 14 and 125 positions, especially in solution (pos. 4-8).

Utlenienie hGH w roztworze z następczym utworzeniem sulfotlenków jest normalnie spowodowane obecnością w preparacie rozpuszczonego tlenu. Rozpuszczalność tlenu w wodzie destylowanej wynosi około 200 μΜ (poz. 9). Ponieważ stężenie hGH w preparacie, zawierającym 4 IU/ml, wynosi 1,3 mg/ml, co odpowiada 60 mM hGH, w normalnych warunkach przechowywania, będzie obecny w nadmiarze 3000 razy przewyższającym stechiometryczną ilość dla utlenienia hGH. Problem nie jest możliwy do rozwiązania poprzez odgazowanie buforów przed rozlaniem preparatu do opakowań.Oxidation of hGH in solution with subsequent formation of sulfoxides is normally caused by the presence of dissolved oxygen in the preparation. The solubility of oxygen in distilled water is approximately 200 μM (item 9). Since the concentration of hGH in a preparation containing 4 IU/ml is 1.3 mg/ml, corresponding to 60 mM hGH, under normal storage conditions, it will be present in an excess of 3000 times the stoichiometric amount for hGH oxidation. This problem cannot be solved by degassing the buffers before filling the preparation into containers.

Obecnie uważa się, że te produkty degradacji nie powinny mieć toksycznej czy zmienionej aktywności biologicznej ani zdolności łączenia się z receptorem, są jednak pewne dane wskazujące, że stabilność struktury przestrzennej sulfotlenków jest obniżona w porównaniu z natywnym hGH.It is currently believed that these degradation products should not have toxic or altered biological activity or receptor binding ability, however, there is some data indicating that the stability of the spatial structure of the sulfoxides is reduced compared to native hGH.

Dla wytworzenia stabilnego rozpuszczonego preparatu zawierającego hGH ważna jest znajomość szybkości powstawania sulfotlenków, jak również środków służących regulacji utleniania.To produce a stable, dissolved hGH preparation, it is important to know the rate of sulfoxide formation as well as the means to regulate oxidation.

Kinetyka degradacji zależy od temperatury, pH oraz różnych dodatków i adiuwantów obecnych w preparacie farmaceutycznym hGH.The kinetics of degradation depend on temperature, pH and various additives and adjuvants present in the hGH pharmaceutical preparation.

Z powodu swej niestabilności hormon wzrostu jest obecnie liofilizowany i przechowywany w postaci liofilizowanej w 4°C aż do momentu użycia, kiedy przywracany jest do pierwotnej postaci, w celu zmniejszenia do minimum jego degradacji.Due to its instability, growth hormone is currently lyophilized and stored in its lyophilized form at 4°C until use, when it is reconstituted to its original form to minimize its degradation.

Liofilizowane preparaty farmaceutyczne leków zawierających hGH są obecnie przywracane do pierwotnej postaci przez pacjenta i następnie przechowywane w niskiej temperaturze, przeważnie około 4°C, w lodówce, w postaci roztworu, przez okres ich używania, który wynosi do 14 dni, w czasie którego degradacja w pewnym stopniu zachodzi.Lyophilized pharmaceutical preparations of hGH-containing drugs are currently reconstituted by the patient and then stored at a low temperature, typically around 4°C, in a refrigerator, in solution, for a period of use of up to 14 days, during which some degradation occurs.

Przywracanie liofilizowanego hormonu wzrostu do pierwotnej postaci stwarza również trudności pacjentowi.Restoring freeze-dried growth hormone to its original form also creates difficulties for the patient.

Niespodziewanie odkryto, że preparat ludzkiego hormonu wzrostu, zawierający jako dodatek lub substancję buforującą tylko histydynę lub jej pochodną, w ilości od 0,1 do 12 mg histydyny lub jej pochodnej na mg hormonu wzrostu wykazuje bardzo dużą stabilność, czyli oporność na deamidację, utlenianie i rozszczepianie wiązań peptydowych.It was unexpectedly discovered that a preparation of human growth hormone containing only histidine or its derivative as an additive or buffering substance, in an amount of 0.1 to 12 mg of histidine or its derivative per mg of growth hormone, shows very high stability, i.e. resistance to deamidation, oxidation and cleavage of peptide bonds.

Preparat można produkować w postaci liofilizowanego proszku, do późniejszego przywrócenia do pierwotnej postaci z zastosowaniem konwencjonalnych rozczynników, takich jak woda destylowana lub woda do wstrzyknięć, lub w postaci roztworu lub zawiesiny kryształów, zawierającej hormon wzrostu. Rozczynniki mogą zawierać konwencjonalne środki konserwujące, takie jak m-krezol i alkohol benzylowy.The formulation may be produced as a lyophilized powder, for later reconstitution with conventional excipients such as distilled water or water for injection, or as a solution or suspension of crystals containing the growth hormone. Excipients may contain conventional preservatives such as m-cresol and benzyl alcohol.

Preparat farmaceutyczny ludzkiego hormonu wzrostu, zawierający histydynę lub jej pochodną w postaci wodnej zawiesiny kryształów hormonu wzrostu zbuforowanej buforem histydynowym jest bardzo stabilny i utrzymuje hormon wzrostu w postaci krystalicznej w czasie przechowywania i transportu w postaci gotowej do użycia, wykazując jeszcze mniejszą skłonność do degradacji. Po wstrzyknięciu taki preparat działa jak preparat rozpuszczony, to znaczy, nie dochodzi do przedłużonego uwalniania ludzkiego hormonu wzrostu.A pharmaceutical preparation of human growth hormone containing histidine or a derivative thereof in the form of an aqueous suspension of growth hormone crystals buffered with histidine buffer is highly stable and maintains the growth hormone in crystalline form during storage and transport in a ready-to-use form, demonstrating even less tendency to degrade. After injection, such a preparation acts as a dissolved preparation, meaning there is no sustained release of human growth hormone.

Z uwagi na stabilność, pH preparatu w postaci roztworu lub zawiesiny jest, korzystnie, wyrównywane do wartości zawartej w przedziale między 2 a 9. Korzystniejsze są preparaty, których pH wynosi 5 do 8, a szczególnie takie, których pH wynosi 6 do 7,5.For stability reasons, the pH of a preparation in the form of a solution or suspension is preferably adjusted to a value between 2 and 9. More preferred are preparations with a pH of 5 to 8, and especially those with a pH of 6 to 7.5.

Stężenie histydyny wynosi, korzystnie, od 1 mM do 100 mM, w celu osiągnięcia efektu stabilizacji. Stężenie dodanej histydyny wynosi, korzystniej, od 2 do 20 mM, a najkorzystniej od 5 do 15 mM.The concentration of histidine is preferably from 1 mM to 100 mM to achieve a stabilizing effect. The concentration of added histidine is more preferably from 2 to 20 mM, and most preferably from 5 to 15 mM.

Dodanie 10% etanolu lub 5% metanolu daje w rezultacie 20% zmniejszenie deamidacji.Adding 10% ethanol or 5% methanol results in a 20% reduction in deamidation.

Jak dotąd nie donoszono o skutecznych próbach krystalizacji GH, mimo że GH jest dostępny w postaci gotowej i ilościach dostatecznych dla krystalizacji. Liczne źródła donoszą o uzyskaniu mikrokryształów lub materiału bezpostaciowego (Jones i in., Bio-Technology (1987) 5, 499-500;No successful attempts to crystallize GH have been reported so far, although GH is available in ready-made form and in sufficient quantities for crystallization. Numerous sources report obtaining microcrystals or amorphous material (Jones et al., Bio-Technology (1987) 5, 499-500;

171 356171 356

Wilhelmi i in., J. Biol. Chem. (1984) 176, 735-745; Clarkson i in., J. Mol. Biol. (1989) 208, 719-721; oraz Bell i in., J. Biol. Chem. (1985) 260, 8520-8525).Wilhelmi et al., J. Biol. Chem. (1984) 176, 735-745; Clarkson et al., J. Mol. Biol. (1989) 208, 719-721; and Bell et al., J. Biol. Chem. (1985) 260, 8520-8525).

Najpopularniejszą metodą stosowaną w próbach krystalizacji GH jest metoda wiszącej kropli. Najwyraźniej, z powodu heterogeniczności preparatów hormonu wzrostu, wielkość i kształt uzyskiwanych kryształów różniły się między sobą w znaczący sposób, według doniesień literaturowych. Największy uzyskany kryształ został opisany przez Jones i in. (1987). W swych udanych doświadczeniach zastosowali oni mieszaninę glikolu polietylenowego 3500 i betaoktylglikozydu w pH obojętnym. Clarkson i in. (1989) donoszą, że zastosowanie alkoholi niższych i acetonu umożliwiło wytworzenie kryształów o wielkości od 0,001 do 0,005 mm sześciennych, o różnych kształtach. Jednakże żadna ze znanych metod nie nadaje się do wykorzystania w przemysłowej produkcji kryształów GH i innych z tej przyczyny, że niezbędny okres ich hodowli wynosi od kilku tygodni do jednego roku.The most common method used in GH crystallization trials is the hanging drop method. Apparently, due to the heterogeneity of growth hormone preparations, the size and shape of the crystals obtained varied significantly, according to literature reports. The largest crystal obtained was described by Jones et al. (1987). In their successful experiments, they used a mixture of polyethylene glycol 3500 and beta-octylglycoside at neutral pH. Clarkson et al. (1989) reported that the use of lower alcohols and acetone allowed the production of crystals ranging in size from 0.001 to 0.005 cubic mm and of various shapes. However, none of the known methods is suitable for industrial production of GH and other crystals because the required cultivation period ranges from several weeks to one year.

Wyprodukowano bydlęcy hormon wzrostu do użytku weterynaryjnego w postaci mieszaniny jonów dwuwartościowych i oleju (EP 343 696). Dodając ZnCh do bydlęcego lub świńskiego hormonu wzrostu w obecności lipidów, uzyskiwano różne cząsteczki, stanowiące preparat o przedłużonym uwalnianiu się w ustroju. Hormon wzrostu rozpraszano w nośniku w taki sposób, aby na każdą cząsteczkę hormonu wzrostu przypadało 1 do 4 cząsteczek Zn. Roztwory przygotowywano w obecności denaturujących substancji rozpuszczonych w różnych stężeniach (1 do 4 M mocznika) w wysokim pH (9,5). Analogiczne postępowanie z zastosowaniem hGH wykazało, że niemożliwa jest produkcja kryształów w ten sposób.Bovine growth hormone for veterinary use was produced as a mixture of divalent ions and oil (EP 343 696). By adding ZnCl to bovine or porcine growth hormone in the presence of lipids, various molecules were obtained, constituting a sustained-release formulation. The growth hormone was dispersed in a carrier so that each molecule of growth hormone contained 1 to 4 Zn molecules. Solutions were prepared in the presence of denaturing solutes at various concentrations (1 to 4 M urea) at high pH (9.5). Analogous procedures using hGH demonstrated that crystal production in this manner was impossible.

W europejskim opisie patentowym nr EP 374 120 ujawniono stabilizowane preparaty zawierające ludzki hormon wzrostu (hGH) i alkohol wielowodorotlenowy o trzech grupach wodorotlenowych. Wymieniono glicerynę i trój(hydroksymetylo)aminometan. Ponadto, ujawniono obecność chlorowodorku histydyny jako buforu, łącznie z alkoholem wielowodorotlenowym. Chlorowodorek histydyny stosuje się wyłącznie jako bufor, podczas gdy działanie stabilizujące osiągane jest dzięki alkoholowi wielowodorotlenowemu. Działanie stabilizujące, z którym mamy do czynienia w tym opisie patentowym polega na zmniejszaniu się tworzenia substancji nierozpuszczalnych w ciągu długiego przechowywania i zachowaniu bioaktywności hormonu wzrostu w kompozycji w postaci roztworu, a nie na zmniejszeniu tworzenia się deamidowanego hormonu wzrostu.European Patent No. EP 374 120 discloses stabilized formulations containing human growth hormone (hGH) and a trihydric alcohol. Glycerin and tri(hydroxymethyl)aminomethane are mentioned. Furthermore, the presence of histidine hydrochloride as a buffer, along with the polyhydric alcohol, is disclosed. The histidine hydrochloride is used solely as a buffer, while the stabilizing effect is achieved by the polyhydric alcohol. The stabilizing effect addressed in this patent is based on reducing the formation of insoluble substances during long-term storage and preserving the bioactivity of the growth hormone in the solution composition, not on reducing the formation of deamidated growth hormone.

W opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 917 685 i nr 4 816 568 ujawniono różne związki wykazujące działanie stabilizujące na preparat hormonu wzrostu. Wśród pewnych aminokwasów wymieniano jako wykazujące to działanie stabilizujące kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Działanie stabilizujące według tych patentów polega na zmniejszeniu tworzenia się substancji nierozpuszczalnych i zachowaniu bioaktywności hormonu wzrostu w kompozycji w postaci roztworu.U.S. Patent Nos. 4,917,685 and 4,816,568 disclose various compounds that exhibit a stabilizing effect on growth hormone formulations. Among certain amino acids, aspartic acid and glutamic acid are cited as exhibiting this stabilizing effect. The stabilizing effect, according to these patents, involves reducing the formation of insoluble substances and preserving the bioactivity of the growth hormone in the solution composition.

Jak dobrze wiadomo z literatury, obecnos'ć kationów dwuwartościowych w czasie procesu krystalizacji insuliny pozwala nie tylko na doskonałą orientację w czasie analizy, ale również poprawia fizyczne warunki krystalizacji (por. np. US pat. nr 2174862). Jednakże hormon wzrostu jest ponad trzykrotnie większy niż insulina i ma całkowicie różną strukturę przestrzenną. Niespodziewanie wykazano, że dodatnie kationów do roztworów zawierających hGH i histydynę lub pochodną histydyny umożliwia wytwarzanie z dużą wydajnością stabilnych, jednolitych kryształów hormonu wzrostu. Okres czasu niezbędny do wytworzenia wysokiej jakości kryształów hGH jest również stosunkowo krótki.As is well known from the literature, the presence of divalent cations during insulin crystallization not only allows for excellent orientation during analysis but also improves the physical conditions of crystallization (see, e.g., U.S. Pat. No. 2,174,862). However, growth hormone is more than three times larger than insulin and has a completely different spatial structure. Surprisingly, it has been shown that adding cations to solutions containing hGH and histidine or a histidine derivative enables the production of stable, uniform growth hormone crystals with high yields. The time required to produce high-quality hGH crystals is also relatively short.

Sposób wytwarzania kryształów hormonu wzrostu lub pochodnych hormonu wzrostu i histydyny lub pochodnej histydyny polega na tym, że wytwarza się roztwór hormonu wzrostu lub pochodnej hormonu wzrostu w rozpuszczalniku, dodaje się histydynę lub pochodną histydyny w stężeniu od 5 mM do 25 mM, doprowadza się odczyn roztworu do wartości pH od 5 do 7,5, korzystnie kwasem solnym, dodaje się kationy organiczne lub nieorganiczne, krystalizuje się roztwór w temperaturze od około 0°C do około 30°C i wyodrębnia się powstałe kryształy w znany sposób.A method for producing crystals of growth hormone or growth hormone derivatives and histidine or a histidine derivative comprises preparing a solution of growth hormone or a growth hormone derivative in a solvent, adding histidine or a histidine derivative in a concentration of 5 mM to 25 mM, adjusting the pH of the solution to a value of 5 to 7.5, preferably with hydrochloric acid, adding organic or inorganic cations, crystallizing the solution at a temperature of about 0°C to about 30°C and isolating the resulting crystals in a known manner.

Jako rozpuszczalnik tworzący roztwór korzystnie stosuje się krótkołańcuchowe alifatyczne, alicykliczne i aromatyczne alkohole i ketony, a jako hormon wzrostu korzystnie stosuje się hGH.Short-chain aliphatic, alicyclic and aromatic alcohols and ketones are preferably used as the solution-forming solvent, and hGH is preferably used as the growth hormone.

171 356171 356

Odkryto, że krystalizacja hGH w obecności histydyny lub pochodnej histydyny pozwala na uzyskanie większej wydajności wytwarzania krystalicznego hGH w postaci większych i bardziej czystych i jednolitych kryształów, niż krystalizacja w obecności buforu fosforanowego, który jest zwykle używany w preparatach hGH. Wyodrębnianie i oczyszczanie kryształów jest zatem ułatwione.It has been discovered that crystallization of hGH in the presence of histidine or a histidine derivative allows for a higher yield of crystalline hGH in the form of larger, purer, and more uniform crystals than crystallization in the presence of a phosphate buffer, which is typically used in hGH preparations. This simplifies the isolation and purification of the crystals.

Przy przeprowadzaniu krystalizacji w obecności histydyny wydajności uzyskiwania kryształów jest wyższa o około 20% w stosunku do krystalizacji według poprzednich sposobów.When crystallization is carried out in the presence of histidine, the crystal yield is approximately 20% higher than that obtained by the previous methods.

Materiał początkowy, czyli hormon wzrostu, może być koncentratem, otrzymanym bezpośrednio z pożywki fermentacyjnej, lub preparatem liofilizowanym, rozpuszczonym w rozpuszczalniku i o stężeniu wyrównanym do, korzystnie, stężenia większego niż 0,1 mg/ml, korzystniej, stężenia wynoszącego od 4 do 7 mg/ml, a najkorzystniej, stężenia wynoszącego 6 mg/ml. Odpowiednim rozpuszczalnikiem do zastosowania w etapie wytwarzania roztworu jest bufor wodny jak na przykład bufor fosforanowy lub bufor histydynowy.The starting material, i.e., the growth hormone, may be a concentrate obtained directly from the fermentation medium, or a lyophilized preparation dissolved in a solvent and adjusted to a concentration of, preferably, greater than 0.1 mg/ml, more preferably, a concentration of 4 to 7 mg/ml, and most preferably, a concentration of 6 mg/ml. A suitable solvent for use in the solution preparation step is an aqueous buffer, such as a phosphate buffer or a histidine buffer.

Krystalizację prowadzi się przez okres od 1 do 120 godzin, korzystnie od 5 do 72 godzin, a najkorzystniej od 20 do 48 godzin w określonej temperaturze. Temperatura ta wynosi, korzystnie, od 4 do 25°C.Crystallization is carried out for a period of from 1 to 120 hours, preferably from 5 to 72 hours, and most preferably from 20 to 48 hours at the specified temperature. This temperature is preferably from 4 to 25°C.

Wartość pH w etapie wytwarzania roztworu wynosi normalnie od 5,0 do 7,5, korzystnie od 5,0 do 6,8, korzystniej od 5,8 do 6,5, a najkorzystniej od 6,0 do 6,3.The pH in the solution forming step is normally from 5.0 to 7.5, preferably from 5.0 to 6.8, more preferably from 5.8 to 6.5, and most preferably from 6.0 to 6.3.

Stężenie histydyny lub pochodnej histydyny w etapie wytwarzania roztworu, korzystnie wynosi od 5 do 15 mM, w celu uzyskania kryształów o odpowiedniej wielkości i jakości, jak to stwierdzono powyżej.The concentration of histidine or histidine derivative in the solution preparation step is preferably from 5 to 15 mM in order to obtain crystals of appropriate size and quality as stated above.

Korzystne jest zastosowanie kationów dwuwartościowych; odkryto, że kationy nieorganiczne, jak na przykład Zn⁺⁺, są odpowiednie dla uzyskania szybkiego tworzenia się stabilnych kryształów GH. Można również stosować mieszaniny kationów.The use of divalent cations is preferred; inorganic cations, such as Zn ⁺⁺ , have been found to be suitable for achieving rapid formation of stable GH crystals. Mixtures of cations can also be used.

Ilość dodanego kationu musi być taka, aby zapewniała szybkie i efektywne tworzenie się dokładnie zdefiniowanych kryształów. Górną granicą ilości dodanego kationu jest taka ilość, która spowodowałaby nieswoistą precypitację znacznych ilości materiału bezpostaciowego.The amount of cation added must be sufficient to ensure the rapid and efficient formation of well-defined crystals. The upper limit of the cation added is the amount that would cause nonspecific precipitation of significant amounts of amorphous material.

Odpowiednie stężenia dla Zn++ typowo wynoszą od około 0,2 do 10 moli Zn⁺⁺ na mol GH. Jednakże jeżeli mieszanina krystalizacyjna zawiera bufor, lub inny składnik zdolny do związania kationu, na przykład w postaci kompleksu, dla procesu krystalizacji niezbędne jest zastosowanie wyższego stężenia dodawanego kationu, a to w celu skompensowania tego wiązania.Suitable concentrations for Zn++ are typically from about 0.2 to 10 moles of Zn ⁺⁺ per mole of GH. However, if the crystallization mixture contains a buffer or other component capable of binding the cation, for example as a complex, a higher concentration of added cation is necessary for the crystallization process to compensate for this binding.

Zn++ jest, korzystnie, stosowany w ilości powodującej wytworzenie się kryształów GH o stosunku molowym między Zn++ a GH wynoszącym od około 0,2 do około 10, korzystniej od około 0,5 do około 5 i, najkorzystniej, od około 0,5 do około 2.Zn++ is preferably used in an amount to produce GH crystals having a molar ratio between Zn++ and GH of from about 0.2 to about 10, more preferably from about 0.5 to about 5, and most preferably from about 0.5 to about 2.

Jeżeli stosuje się inne kationy nieorganiczne, ich stężenie może wahać się pomiędzy 0,5 a 10 moli kationu na mol GH.If other inorganic cations are used, their concentration may vary between 0.5 and 10 moles of cation per mole of GH.

W korzystnym wykonaniu wynalazku w etapie wytwarzania roztworu dodaje się rozpuszczalnik organiczny lub mieszaninę rozpuszczalników organicznych.In a preferred embodiment of the invention, an organic solvent or a mixture of organic solvents is added in the solution preparation step.

Odpowiedni rozpuszczalnik organiczny, który ma być dodany do krystalizacji, można dobrać spomiędzy: alkoholi lub ketonów alifatycznych, alicyklicznych i aromatycznych, takich jak metanol, etanol, 1- i 2-propanol, cykloheksanol, aceton, oraz fenol lub m-krezol. Korzystne jest zastosowanie etanolu i acetonu jako rozpuszczalników organicznych, przy czym najkorzystniejsze jest zastosowanie etanolu.A suitable organic solvent to be added for crystallization can be selected from aliphatic, alicyclic, and aromatic alcohols or ketones, such as methanol, ethanol, 1- and 2-propanol, cyclohexanol, acetone, and phenol or m-cresol. Ethanol and acetone are preferred as organic solvents, with ethanol being most preferred.

Można dokonać zaszczepienia krystalizacji w roztworze poprzez dodanie małych i dokładnie określonych kryształów hGH o kształcie heksagonalnym lub iglastym, ale korzystnie nie stosuje się zaszczepienia.Seeding of crystallization in the solution may be accomplished by adding small and well-defined hGH crystals of hexagonal or acicular shape, but seeding is preferably not used.

Stężenie rozpuszczalnika organicznego może wynosić od 0,1 do 50% obj., korzystnie od 0,1 do 30%, korzystniej od 0,1 do 20%, jeszcze korzystniej od 5 do 15%, a najkorzystniej od 6 do 12% objętościowych. Jako że kryształy tworzą się w dużych objętościach roztworów, niniejszy sposób może być stosowany jako szybki i efektywny proces obróbki współprądowej omawianego hormonu wzrostu.The concentration of the organic solvent may be from 0.1 to 50% by volume, preferably from 0.1 to 30%, more preferably from 0.1 to 20%, even more preferably from 5 to 15%, and most preferably from 6 to 12% by volume. Since crystals form in large volumes of solutions, the present method can be used as a fast and efficient downstream treatment process for the growth hormone in question.

Gdy jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się etanol, odpowiednie stężenie wynosi między 0,1 a 20%, korzystniej 5 a 15% i korzystnie od 6 do 12% (objętościowych).When ethanol is used as the organic solvent, a suitable concentration is between 0.1 and 20%, more preferably 5 and 15% and preferably 6 to 12% (by volume).

171 356171 356

Wytworzone kryształy mogą być wyodrębniane konwencjonalnymi metodami, takimi jak odwirowywanie lub filtracja, płukanie i ewentualnie liofilizacja w celu usunięcia śladów rozpuszczalników organicznych.The crystals produced can be isolated by conventional methods such as centrifugation or filtration, washing and optionally freeze-drying to remove traces of organic solvents.

Wielkość kryształów zależeć będzie od stosunku Zn⁺⁺ do GH oraz doboru i składu rozpuszczalnika zastosowanego w procesie.The crystal size will depend on the ratio of Zn ⁺⁺ to GH and the selection and composition of the solvent used in the process.

Wykazano, że kryształy hGH otrzymane sposobem według niniejszego wynalazku mają aktywność biologiczną podobną do aktywności biologicznej rozpuszczonego wzorcowego hGH w testach in vitro. Kryształy GH wytworzone tą nową metodą mogą zatem być stosowane z tych samych wskazań, co dostępny na rynku preparat hGH.The hGH crystals obtained by the method of the present invention have been shown to have biological activity similar to that of a dissolved hGH standard in in vitro assays. GH crystals produced by this new method can therefore be used for the same indications as the commercially available hGH preparation.

Farmaceutyczne preparaty zawierają, korzystnie, jednostkowe dawki leku zawarte pomiędzy 4 IU a 100 IU hormonu wzrostu na dawkę.The pharmaceutical preparations preferably contain unit doses of the drug ranging from 4 IU to 100 IU of growth hormone per dose.

Hormon wzrostu, w rozumieniu niniejszego opisu, może stanowić hormon wzrostu dowolnego pochodzenia, może to być hormon wzrostu pochodzący na przykład od ptaków, bydła, konia, człowieka, owcy, świni, łososia, pstrąga lub tuńczyka, korzystnie jest to bydlęcy, ludzki lub świński hormon wzrostu, a najkorzystniej ludzki hormon wzrostu. Hormon wzrostu, otrzymany według niniejszego wynalazku, może być natywnym hormonem wzrostu, wyizolowanym ze źródła naturalnego, na przykład poprzez ekstrakcję z przysadek w znany sposób, lub hormonem wzrostu produkowanym przy użyciu technik rekombinacyjnych, jak to na przykład opisano w Biotech and Bioeng. 36, 1-11 (1990), autorzy: E.B. Jensen i S. Carlsen. Pochodna hormonu wzrostu może być okrojoną formą hormonu wzrostu, pozbawioną jednej lub więcej reszt aminokwasowych; jego analogiem, w którym jedna lub więcej reszt aminokwasowych cząsteczki natywnej została zastąpiona innymi resztami aminokwasowymi, korzystnie resztą naturalnie występującego aminokwasu, o ile takie podstawienie nie wywołuje żadnych niekorzystnych skutków, takich jak antygenowość lub osłabienie działania; lub jego pochodną, na przykład jedną z deamidowanych lub sulfoksydowanych form hormonu wzrostu, lub form mających przedłużenie Nlub C-końcowe, takie jak np. Met-hGH, Met-Glu-Ala-Glu-hGH, lub Ala-Glu-hGH. Korzystnym hormonem wzrostu jest hGH.Growth hormone, as used herein, may be growth hormone of any origin, for example, avian, bovine, equine, human, ovine, porcine, salmon, trout, or tuna growth hormone, preferably bovine, human, or porcine growth hormone, and most preferably human growth hormone. The growth hormone obtained according to the present invention may be native growth hormone, isolated from a natural source, for example by extraction from pituitary glands in a known manner, or growth hormone produced using recombinant techniques, as for example described in Biotech and Bioeng. 36, 1-11 (1990), by E.B. Jensen and S. Carlsen. The growth hormone derivative may be a truncated form of growth hormone lacking one or more amino acid residues; an analogue thereof in which one or more amino acid residues of the native molecule have been replaced by other amino acid residues, preferably by a naturally occurring amino acid residue, provided that such substitution does not result in any adverse effects such as antigenicity or impairment of function; or a derivative thereof, for example one of the deamidated or sulfoxidated forms of growth hormone, or forms having an N- or C-terminal extension, such as e.g. Met-hGH, Met-Glu-Ala-Glu-hGH, or Ala-Glu-hGH. A preferred growth hormone is hGH.

Pojęcie pochodnej histydyny używane jest, w związku z omawianym tematem, dla oznaczenia amidów i estrów histydyny, takich jak ester metylowy lub etylowy, dwu-peptydów takich jak His-Gly, His-Ala, His-Leu, His-Lys, His-Ser i His-Phe, oraz analogów lub pochodnych His, takich jak imidazol, dezamino-His lub poli-His. Dla uproszczenia zawartość histydyny lub jej pochodnej w preparatach otrzymanych sposobem według wynalazku obliczono uwzględniając ciężar molowy samej histydyny.The term "histidine derivative" is used, in connection with the subject under discussion, to designate amides and esters of histidine, such as the methyl or ethyl ester, dipeptides such as His-Gly, His-Ala, His-Leu, His-Lys, His-Ser and His-Phe, and analogues or derivatives of His, such as imidazole, desamino-His or poly-His. For simplicity, the content of histidine or its derivative in the preparations obtained by the method of the invention was calculated taking into account the molar weight of histidine itself.

Pojęcie sole, używane dla oznaczenia dodatkowych czynników ułatwiających obróbkę lub przywracanie do pierwotnej postaci preparatów farmaceutycznych, obejmuje konwencjonalne dodatki, takie jak metal alkaliczny, metal ziem alkalicznych lub sole amonowe kwasów organicznych, na przykład cytrynowego, winowego lub octowego, takie jak cytrynian sodowy, winian sodowy lub octan sodowy, bądź kwasów nieorganicznych, takich jak kwas solny, na przykład chlorek sodowy.The term salts, when used to designate additional agents which facilitate the processing or reconstitution of pharmaceutical preparations, includes conventional additives such as alkali metal, alkaline earth metal or ammonium salts of organic acids, for example citric, tartaric or acetic acids, such as sodium citrate, sodium tartrate or sodium acetate, or of inorganic acids such as hydrochloric acid, for example sodium chloride.

Dla potrzeb niniejszego opisu przyjmuje się, że duża stabilność osiągana jest wtedy, gdy preparat jest bardziej stabilny, niż konwencjonalne preparaty zawierające bufor fosforanowy.For the purposes of this description, high stability is considered to be achieved when the formulation is more stable than conventional phosphate buffer formulations.

Alkoholem cukrowym może być m.in. mannit, ksylit, erytryt, treit, sorbit lub glicerol.Sugar alcohol may be, among others, mannitol, xylitol, erythritol, threitol, sorbitol or glycerol.

W niniejszym opisie pojęcie dwucukier używane jest dla oznaczenia naturalnie występujących dwucukrów, takich jak sacharoza, trehaloza, maltoza, laktoza, sefaroza, turanoza, laminarybioza, izomaltoza, gentiobioza lub melibioza.In this specification, the term disaccharide is used to denote naturally occurring disaccharides such as sucrose, trehalose, maltose, lactose, sepharose, turanose, laminaribiose, isomaltose, gentiobiose or melibiose.

Rozpuszczalnikiem stosowanym w preparacie może być woda, alkohole takie jak alkohol etylowy, n-propylowy, izopropylowy lub butylowy, lub ich mieszanina. Rozpuszczalnik zawierać może środek konserwujący, taki jak m-krezol lub alkohol benzylowy.The solvent used in the formulation may be water, alcohols such as ethyl, n-propyl, isopropyl, or butyl alcohol, or a mixture thereof. The solvent may contain a preservative such as m-cresol or benzyl alcohol.

Wynalazek opisany jest bardziej szczegółowo z odniesieniem do rysunków, na których: fig. 1 przedstawia fotografię kryształów wytworzonych bez dodatku histydyny, a fig. 2 przedstawia fotografię kryształów hGH otrzymanych sposobem według wynalazku.The invention is described in more detail with reference to the drawings, in which: Figure 1 is a photograph of crystals prepared without the addition of histidine, and Figure 2 is a photograph of hGH crystals obtained by the method according to the invention.

171 356171 356

Wynalazek jest objaśniony bardziej szczegółowo w poniższych przykładach, które ilustrują wynalazek, nie mając na celu ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku, który jest określony w załączonych zastrzeżeniach.The invention is explained in more detail in the following examples, which illustrate the invention without being intended to limit the scope of the present invention, which is defined in the appended claims.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNAEXPERIMENTAL PART

Przykład I. Zmniejszenie deamidacji.Example I. Reduction of deamidation.

Badano szybkość deamidacji preparatów hGH, zawierających 4 IU i 12 IU w pH 6,5 w 37°C w buforze His w porównaniu z buforem fosforanowym w tym samym pH.The deamidation rate of hGH preparations containing 4 IU and 12 IU at pH 6.5 at 37°C in His buffer was studied in comparison to phosphate buffer at the same pH.

Preparat hGH, zawierający 4 IU, o składzie chemicznym A, przygotowano rozpuszczając 13,3 mg hGH w 10 ml 10 mM buforu histydynowego, przygotowanego przez rozpuszczenie 15,5 mg histydyny w 10 ml dejonizowanej wody, zawierającej 0,9% alkoholu benzylowego i dodając 0,1 N kwas solny do pH 6,5. Preparat zawierający 12 IU przygotowano, rozpuszczając 40 mg hGH w tych samych składnikach, jak to opisano powyżej.A 4 IU hGH formulation of chemical composition A was prepared by dissolving 13.3 mg of hGH in 10 ml of 10 mM histidine buffer prepared by dissolving 15.5 mg of histidine in 10 ml of deionized water containing 0.9% benzyl alcohol and adding 0.1 N hydrochloric acid to pH 6.5. A 12 IU formulation was prepared by dissolving 40 mg of hGH in the same ingredients as described above.

Preparat hGH, zawierający 4 IU, o składzie chemicznym B, przygotowano rozpuszczając 13,3 mg hGH w 10 mM fosforanu dwusodowego, przygotowanego przez rozpuszczenie 17,8 mg wodorofosforanu dwusodowego w 10 ml wody dejonizowanej, zawierającej 0,9% (objętościowych) alkoholu benzylowego, i dodając 0,1 N kwas fosforowy do pH 6,5. Preparat zawierający 12 IU przygotowano rozpuszczając 40 mg hGH w tych samych składnikach, jak to opisano powyżej.A 4 IU hGH formulation of Chemical Composition B was prepared by dissolving 13.3 mg of hGH in 10 mM disodium phosphate, prepared by dissolving 17.8 mg of disodium hydrogen phosphate in 10 ml of deionized water containing 0.9% (by volume) benzyl alcohol and adding 0.1 N phosphoric acid to pH 6.5. A 12 IU formulation was prepared by dissolving 40 mg of hGH in the same ingredients as described above.

Skład chemiczny A:Chemical composition A:

mM His alkohol benzylowy 0,9%mM His benzyl alcohol 0.9%

HCl do pH 6,5 Skład chemiczny B:HCl to pH 6.5 Chemical composition B:

mM fosforanu dwusodowego alkohol benzylowy 0,9% kwas fosforowy do pH 6,5mM disodium phosphate benzyl alcohol 0.9% phosphoric acid to pH 6.5

Preparat zbadano na zawartość dezamido-hGH przy użyciu immunoelektroforetycznej chromatografii cieczowej wysokosprawnej, bezpośrednio po przywróceniu do pierwotnej postaci i po 7 dniach w 37°C. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 1.The preparation was tested for deamido-hGH content using high-performance liquid chromatography immunoelectrophoretic analysis immediately after reconstitution and after 7 days at 37°C. The results are presented in Table 1 below.

Tabela 1 DeamidacjaTable 1 Deamidation

Preparat Preparation Dezamidopochodne %Dezamide derivatives % Bufor ABuffer A 4 IU/ml 4 IU/ml 1,7 1.7 Początek Beginning 12 IU/ml 12 IU/ml 2,1 2.1 Bufor ABuffer A 4 IU/ml 4 IU/ml 10,1 10.1 7 dni w 37°C7 days at 37°C 12 IU/ml 12 IU/ml 10,4 10.4 Bufor BBuffer B 4 Ul/ml4 UL/ml 1,8 1.8 Początek Beginning 12 IU/ml 12 IU/ml 2,3 2.3 Bufor BBuffer B 4 Ul/ml4 UL/ml 16,9 16.9 7 dni w 37°C7 days at 37°C 12 IU/ml 12 IU/ml 14,9 14.9

Z powyższych liczb wynika, że deamidacja hGH jest znacząco zmniejszona w 37°C w buforze histydynowym w porównaniu z buforem fosforanowym.From the above figures, it can be seen that deamidation of hGH is significantly reduced at 37°C in histidine buffer compared to phosphate buffer.

Przykład IL Zmniejszenie deamidacji w obecności histydyny lub pochodnych histydyny.Example IL Reduction of deamidation in the presence of histidine or histidine derivatives.

Badano tempo deamidacji w 25°C preparatów hGH, zawierających 6 IU hGH w pH 6,5 i w pH 7,3 w 5 mM, 10 mM i 100 mM buforze His w porównaniu z 8 mM buforu fosforanowym w tym samym pH. Następnie przetestowano pochodne histydyny His-Gly, His-Ala, His-Leu,The deamidation rate at 25°C of hGH preparations containing 6 IU hGH at pH 6.5 and at pH 7.3 in 5 mM, 10 mM and 100 mM His buffer was studied in comparison with 8 mM phosphate buffer at the same pH. Next, histidine derivatives His-Gly, His-Ala, His-Leu,

171 356171 356

His-Lys, His-Phe, His-Ser, ester metylowy histydyny, histydynol, imidazol, kwas imidazoloczterooctowy i histaminę.His-Lys, His-Phe, His-Ser, histidine methyl ester, histidinol, imidazole, imidazoletetraacetic acid and histamine.

Preparaty hGH przygotowywano rozpuszczając 20 mg hGH w 10 ml buforu histydynowego o pożądanym stężeniu, przygotowanego przez rozpuszczenie odpowiednio 7,8 mg, 15,5 mg i 155,2 mg histydyny w 10 ml dejonizowanej wody, zawierającej 0,9% (obj.) alkoholu benzylowego i dodając 0,1 N kwas solny aż do uzyskania wyżej wymienionego pH.The hGH preparations were prepared by dissolving 20 mg of hGH in 10 ml of histidine buffer of the desired concentration, prepared by dissolving 7.8 mg, 15.5 mg and 155.2 mg of histidine, respectively, in 10 ml of deionized water containing 0.9% (v/v) benzyl alcohol and adding 0.1 N hydrochloric acid until the above-mentioned pH was obtained.

Preparaty hGH, przedstawione w poniższej tabeli 2, przechowywano w 25°C i poddano analizie na obecność składników dezamidowanych po 14 i 30 dniach przy użyciu immunoelektroforetycznej chromatografii cieczowej wysokosprawnej. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 2.The hGH preparations shown in Table 2 below were stored at 25°C and analyzed for deamidated components after 14 and 30 days using high-performance liquid chromatography immunoelectrophoretic analysis. The results are presented in Table 2 below.

Tabela 2 Zawartość hGH, oznaczona przy użyciu immunoelektroforetycznej chromatografu cieczowej wysokosprawnej, jako funkcja postaci leku i czasu w roztworze w 25°C:Table 2 hGH content, determined using immunoelectrophoretic high-performance liquid chromatography, as a function of drug form and time in solution at 25°C:

Preparat (*)Preparation (*) Tworzenie się składników dezamidowanych w 25°CFormation of deamidated components at 25°C 14 dni (')14 days (') 30 dni30 days 5 mM His pH 6,55 mM His pH 6.5 6,5 6.5 9,1 9.1 5 mM His pH 7,35 mM His pH 7.3 11,0 11.0 17,4 17.4 10 mM His pH 6,510 mM His pH 6.5 6,8 6.8 9,7 9.7 10 mM His pH 7,310 mM His pH 7.3 11,3 11.3 16,6 16.6 100 mM His pH 6,5100 mM His pH 6.5 9,8 9.8 15,2 15.2 100 mM His pH 7,3100 mM His pH 7.3 19,3 19.3 28,8 28.8 8 mM dwu-Na-fosforan pH 6,58 mM di-Na-phosphate pH 6.5 7,8 7.8 10,8 10.8 8 mM dwu-Na-fosforan pH 7,38 mM di-Na-phosphate pH 7.3 15,2 15.2 20,3 20.3 8 mM dwu-Na-fosforan pH 6,58 mM di-Na-phosphate pH 6.5 9,4 9.4 13,2 13.2 0,3% m-krezol0.3% m-cresol 10 mM Asp, pH 6,510 mM Asp, pH 6.5 21,7 21.7 niewykryw undetected 10 mM Glu, pH 6,510 mM Glu, pH 6.5 14,8 14.8 niewykryw. undetected 10 mM His-Gly, pH 6,210 mM His-Gly, pH 6.2 5,6 5.6 8,1 8.1 10 mM His-Ala pH 6,510 mM His-Ala pH 6.5 6,2 6.2 8,5 8.5 10 mM His-Leu pH 6,510 mM His-Leu pH 6.5 8,8 8.8 12,3 12.3 10 mM His-Lys pH 6,510 mM His-Lys pH 6.5 8,6 8.6 12,0 12.0 10 mM His-Phe pH 6,510 mM His-Phe pH 6.5 7,5 7.5 11,3 11.3 10 mM His-Ser pH 6,310 mM His-Ser pH 6.3 22,0 22.0 niewykryw. undetected 10 mM His-metyloester pH 6,510 mM His-methylester pH 6.5 4,6 4.6 5,2 5.2 10 mM histydynol pH 6,510 mM histidinol pH 6.5 27,4 27.4 niewykryw. undetected 10 mM imidazol pH 6,510 mM imidazole pH 6.5 9,2 9.2 12,2 12.2 10 mM kwas imidazoloczterooctowy pH 6,510 mM imidazole tetraacetic acid pH 6.5 10,3 10.3 14,2 14.2 10 mM histamina pH 6,510 mM histamine pH 6.5 9,8 9.8 12,2 12.2

*. zawiera alkohol benzylowy 0,9%, z wyjątkiem preparatu nr 9.*. contains 0.9% benzyl alcohol, except preparation no. 9.

Zawartość dezamido-hGH w materiale początkowym wynosiła: 2,1%.The content of deamido-hGH in the starting material was: 2.1%.

Z powyższej tabeli 2 wynika, że deamidacja hGH jest zmniejszona o około 20% przy dodaniu histydyny, w porównaniu z buforem fosforanowym, w pH 6,5 i 7,3. Ponadto zmniejszenie pH z wartości 7,3, która jest konwencjonalną wartością pH dla handlowych preparatów hGH, do 6,5, powoduje samo w sobie zmniejszenie tempa deamidacji o 50%.From Table 2 above, it can be seen that deamidation of hGH is reduced by approximately 20% with the addition of histidine, compared to phosphate buffer, at pH 6.5 and 7.3. Furthermore, reducing the pH from 7.3, which is the conventional pH for commercial hGH preparations, to 6.5, in itself reduces the rate of deamidation by 50%.

Wydaje się, że histydynol w warunkach testu nie stabilizuje preparatu, a dodatek histydyny w większych ilościach nie poprawia, lecz raczej pogarsza pożądany efekt.It appears that histidinol does not stabilize the preparation under the test conditions, and the addition of histidine in larger amounts does not improve but rather worsens the desired effect.

Porównywalne rezultaty osiągnięto przy zastosowaniu analogów histydyny, takich jak imidazol, histamina i kwas imidazoloczterooctowy, jak również estru metylowego histydyny,Comparable results were achieved using histidine analogues such as imidazole, histamine and imidazoletetraacetic acid, as well as histidine methyl ester,

171 356 który powodował tworzenie zaledwie 3,1% dezamido-hGH po 30 dniach w 25°C, co pozwalało na przechowywanie preparatu przez okres 3 do 4 miesięcy.171 356 which resulted in the formation of only 3.1% deamido-hGH after 30 days at 25°C, which allowed the preparation to be stored for 3 to 4 months.

Dodanie Asp lub Glu zwiększa tempo deamidacji w porównaniu z fosforanem przy pH 6,5.Addition of Asp or Glu increases the rate of deamidation compared to phosphate at pH 6.5.

Dodanie dwupeptydów o typie His-X daje pozytywne rezultaty w przypadku His-Gly i His-Ala, podczas gdy His-Ser, zmniejsza stabilność, czyli oporność na deamidację.The addition of dipeptides of the His-X type gives positive results in the case of His-Gly and His-Ala, while His-Ser reduces stability, i.e. resistance to deamidation.

Powyższe rezultaty dowodzą, że tempo deamidacji zmniejszyć można obniżając pH i dodając histydynę w niskim stężeniu, korzystnie, około 5 mM do 10 mM. Obniżając pH i zastępując bufor fosforanowy histydyną, można zmniejszyć tempo deamidacji o ponad 50%.The above results demonstrate that the rate of deamidation can be reduced by lowering the pH and adding histidine at a low concentration, preferably about 5 mM to 10 mM. By lowering the pH and replacing the phosphate buffer with histidine, the rate of deamidation can be reduced by more than 50%.

Wydaje się, że zastosowanie m-krezolu lub alkoholu benzylowego jako środków konserwujących nie wywiera żadnego wpływu na tempo deamidacji.The use of m-cresol or benzyl alcohol as preservatives does not appear to have any effect on the rate of deamidation.

Rozszczepianie (hydroliza wiązań peptydowych) jest przy pH 6,5 zmniejszane przez histydynę w porównaniu z fosforanem.Cleavage (hydrolysis of peptide bonds) is reduced by histidine compared to phosphate at pH 6.5.

Przykład III. Zmniejszenie powstawania sulfotlenku.Example III. Reduction of sulfoxide formation.

Badano zależność od pH i rodzaju buforu.The dependence on pH and buffer type was investigated.

Zależność od pH:Dependence on pH:

Preparat:Preparation:

Przy użyciu 0,1 N kwasu solnego wyrównano pH handlowego preparatu hGH (Norditropin®), 12 IU/ml, zawierającego dwuwęglan, glicynę i mannit, plus alkohol benzylowy 0,9%, do pH 8,3, 8,0,7,5,7,0, 6,5 i 6,01 próbki pozostawiono w 37°C. Po 0,7 i 14 dniach przeprowadzono analizę z zastosowaniem metody chromatografii cieczowej wysokosprawnej RP. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 3.A commercial hGH preparation (Norditropin®), 12 IU/ml, containing bicarbonate, glycine, and mannitol, plus 0.9% benzyl alcohol, was adjusted to pH 8.3, 8.0, 7.5, 7.0, 6.5, and 6.01 using 0.1 N hydrochloric acid. The samples were left at 37°C. After 0.7 and 14 days, analysis was performed using the RP high-performance liquid chromatography method. The results are presented in Table 3 below.

Tabela 3Table 3

Powstawanie sulfotlenkuSulfoxide formation

PróbkaSample Temp °C Temperature °C Dni Days Sulfotlenków %Sulfoxides % pH 8,37 pH 8.37 - - 0 0 1,0 1.0 pH 8,37 pH 8.37 37 37 7 7 9,0 9.0 pH 8,04 pH 8.04 37 37 7 7 8,7 8.7 pH 7,52 pH 7.52 37 37 7 7 8,3 8.3 pH 7,01 pH 7.01 37 37 7 7 7,7 7.7 pH 6,52 pH 6.52 37 37 7 7 6,5 6.5 pH 6,02 pH 6.02 37 37 7 7 4,8 4.8 pH 8,37 pH 8.37 37 37 14 14 14,9 14.9 pH 8,04 pH 8.04 37 37 14 14 14,5 14.5 pH 7,52 pH 7.52 37 37 14 14 14,0 14.0 pH 7,01 pH 7.01 37 37 14 14 12,9 12.9 pH 6,52 pH 6.52 37 37 14 14 11 ,1 11.1 pH 6,02 pH 6.02 37 37 14 14 7,7 7.7

Jak można stwierdzić, przy obniżaniu pH od 8,4 do 6,0 zmniejsza się powstawanie sulfotlenków.As can be seen, as the pH is lowered from 8.4 to 6.0, the formation of sulfoxides is reduced.

Rodzaj buforu, pH:Buffer type, pH:

Preparat B-hGH, zawierający 12 mg/ml wody destylowanej, rozcieńczono w stosunku 1+10 w różnych buforach o stężeniu 15 mM, dodając ewentualnie inny dodatek (dodatki). Próbki pozostawiono w 25°C, i po 10 i 34 dniach przeprowadzono analizę z zastosowaniem metody chromatografii cieczowej wysokosprawnej RP. Wyniki uzyskane przy zastosowaniu metody chromatografii cieczowej wysokosprawnej RP i ewentualne dodatki przedstawiono w tabeli 4.The B-hGH preparation, containing 12 mg/ml of distilled water, was diluted 1+10 in various buffers at 15 mM concentration, with the addition of other additive(s) if necessary. The samples were left at 25°C, and after 10 and 34 days, analysis was performed using the RP-HPLC method. The results obtained using the RP-HPLC method and any additives are presented in Table 4.

171 356171 356

Tabela 4Table 4

Powstawanie solfotleokoThe formation of solfotleoko

BuforBuffer pH pH Dodatek Addition bulfotleoków bulfobleoks 10 dni 10 days 34 dni34 days % % FosforanPhosphate 7,3 7.3 - - 1,9 1.9 5,5 5.5 HistydynaHistidine 7,3 7.3 - - 0,9 0.9 2,4 2.4 HistydynaHistidine 6,9 6.9 - - 0,9 0.9 2,0 2.0 HistydynaHistidine 6,5 6.5 - - 0,8 0.8 1,9 1.9 HistydynaHistidine 7,3 7.3 18 mM Met18 mm Met 0,8 0.8 2,0 2.0 HistydynaHistidine 7,3 7.3 18 mM Cys18 mM Cys 2,4 2.4 2,9 2.9 HistydynaHistidine 7,3 7.3 0,42 mM tuk0.42 mm tuk 1,1 1.1 3,0 3.0 HistydynaHistidine 7,3 7.3 9% etanol9% ethanol 1,3 1.3 4,2 4.2 HistydynaHistidine 7,3 7.3 18 mM ask. 18 mm ask. 41 41 niewykryw undetected HistydynaHistidine 7,3 7.3 0,8% NaCl0.8% NaCl 1,3 1.3 3,5 3.5

tuk.- tokoferol; ask kwas askorbinowy.tuk.- tocopherol; ascorbic acid.

W porównaniu z buforem fosforanowym, w buforze histydynowym (pH 7,3) obserwowano wyraźnie zmniejszone powstawanie sulfoksydzwanego B-hGH. Wraz ze zmniejszaniem się pH w His-buforze obserwzwano redukcję powstawania sulfotlenków.Compared to the phosphate buffer, a significantly reduced formation of sulfoxide-bound B-hGH was observed in the histidine buffer (pH 7.3). As the pH decreased in the His buffer, a reduction in sulfoxide formation was observed.

Dodawanie drzeciwutleniaczy i innych dodatków nie dało dodatkowych efektów.Adding antioxidants and other additives did not produce additional effects.

Przykład IV. Krystalizacja hGH w obecności buforu fosforanowego lub histydynowegz.Example IV. Crystallization of hGH in the presence of a phosphate or histidine buffer.

Próbki roztworu hGH o jednakowej objętości, przygotowane według Biotechnolzgy, autor Dalboege i in. (1987) 5, 161-164, w stężeniu 6 mg/ml, m^howam w 10 mM buforze fosforanowym lub 10 mM buforze histydynzwym, w pH 6,2. Do każdej z próbek dodano etanolu, tak aby jego końcowe stężenie wyniosło 7,5% (zbj.), dodając następnie roztworu octanu cynkowego, tak aby końcowe stężenie cynku wyniosłz 1,34 mola Zn na mol hGH w przypadku buforu fosforanowego i 5,5 mola Zn na mol hGH w przypadku buforu histydynowego.Equal volumes of hGH solution samples, prepared according to Biotechnology, Dalboege et al. (1987) 5, 161-164, at a concentration of 6 mg/ml, were stored in 10 mM phosphate buffer or 10 mM histidine buffer, at pH 6.2. Ethanol was added to each sample to a final concentration of 7.5% (v/v), followed by the addition of zinc acetate solution to a final zinc concentration of 1.34 mol Zn per mol hGH in the case of phosphate buffer and 5.5 mol Zn per mol hGH in the case of histidine buffer.

Kryształy hodowano w zawiesinie przez 16 godzin, monitorując krystalizację w mikroskopie z kontrastem fazowym. Kryształy powstałe w buforze histydynowym mają dobrze zkreślony heksagonalny wygląd i jednakową wielkość oraz zawierają niewiele lub żadnych bezpostaciowych substancji zanieczyszczających (fig. 1). Kryształy hGH powstałe w buforze fosforanowym w ściśle identycznych warunkach, wykazują, przeciwnie, dużo silniej wyrażoną heterogenność i zawierają znaczącą ilość materiału bezpostaciowego (fig. 2).The crystals were grown in suspension for 16 hours, and crystallization was monitored with a phase-contrast microscope. Crystals formed in histidine buffer have a well-defined hexagonal appearance and uniform size and contain little or no amorphous contaminants (Fig. 1). hGH crystals formed in phosphate buffer under precisely identical conditions, in contrast, exhibit much more pronounced heterogeneity and contain a significant amount of amorphous material (Fig. 2).

Prowadzonz hodowlę kryształów przez dalsze 5 dni. Po odwirowaniu zebrano kryształy wytworzone zarówno w buforze nistydyozwyw jak i w buforze fosforanowym, kryształy te rozpuszczono w 7 M moczniku i przeprowadzono analizę hGH.Crystals were grown for another 5 days. After centrifugation, crystals grown in both the nitrite buffer and the phosphate buffer were collected, dissolved in 7 M urea, and hGH analysis was performed.

Bufor % kryształów % wolnego hGHBuffer % Crystals % Free hGH

Histydyna 665 35Histidine 665 35

Fosforan 55 45Phosphate 55 45

Tak więc bufor histydynowy zapewnia lepsze warunki dla krystalizacji hGH ze względu zarówno na wydajność powstawania kryształów, jak i ich jakość.Thus, the histidine buffer provides better conditions for hGH crystallization in terms of both the efficiency of crystal formation and their quality.

Przykład V. Preparat farmaceutyczny zawierający kryształy hGH.Example V. Pharmaceutical preparation containing hGH crystals.

Kryształy hodowano według opisu z przykładu IV i przechowywano w 4°C. Następnie wyodrębnianz kryształy przez odwirowywanie i następcze usunięcie z cieczy macierzystej. Następnie kryształy pozostawiono na noc dz liofilizacji w celu uzyskania suchych kryształów bez pozostałości rozpuszczalników organicznych. Następnie przygotowano farmaceutyczną zawiesinę wysuszonych kryształów o następującym składzie:Crystals were grown as described in Example IV and stored at 4°C. The crystals were then isolated by centrifugation and subsequent removal from the mother liquor. The crystals were then freeze-dried overnight to obtain dry crystals free of organic solvent residues. A pharmaceutical suspension of the dried crystals was then prepared with the following composition:

Kryształy hGH 1,3 mg/mlhGH Crystals 1.3 mg/ml

Histydyna 1,6 mg/mlHistidine 1.6 mg/ml

171 356171 356

Zn(Ac)2, H₂O 0,1 mg/mlZn(Ac)2, _H2O 0.1 mg/ml

Alkohol benzylowy 0,9% (obj.) pH wyrównano do 6,5 z użyciem HCl.Benzyl alcohol 0.9% (v/v) pH adjusted to 6.5 with HCl.

Przykład VI.Example VI.

Powtórzono przykład V z tą różnicą, że nie zastosowano Zn(Ac)₂, H2O, co dało zawiesinę o następującym składzie:Example V was repeated with the difference that Zn(Ac) ₂ , H2O was not used, which gave a suspension with the following composition:

Kryształy hGH 1,3 mg/mlhGH Crystals 1.3 mg/ml

Histydyna 16 mg/mlHistidine 16 mg/ml

Alkohol benzylowy 0,9% G^łj..) pH wyrównano do 6,2.Benzyl alcohol 0.9% G^łj..) pH adjusted to 6.2.

Przykład VII.Example VII.

Kryształy potraktowano w ten sam sposób, jak w przykładzie V, sporządzając zawiesinę o następującym składzie:The crystals were treated in the same way as in Example V, preparing a suspension with the following composition:

Kryształy hGH ,, 3 mg/mlhGH Crystals,, 3 mg/ml

Histydyna , ,3 3 mg/mlHistidine, ,3 3 mg/ml

NaCl 5,7 mg/ml alkohol benzylowy 0,9% o^lj.-) pH wyrównano do 6,2.NaCl 5.7 mg/ml benzyl alcohol 0.9% o^lj.-) pH adjusted to 6.2.

Przykład VIII.Example VIII.

Kryształy potraktowano w ten sam sposób, jak w przykładzie V, sporządzając następujący roztwór:The crystals were treated in the same way as in Example V, preparing the following solution:

Kryształy hGH 13 mg/mlhGH Crystals 13 mg/ml

Histydyna 114 mg/mlHistidine 114 mg/ml

NaCl 9,0 mg/ml pH wyrównano do 6,1.NaCl 9.0 mg/ml pH adjusted to 6.1.

Przykład IX.Example IX.

W analogiczny sposób, jak opisany w przykładzie I, sporządzono preparat biosyntetycznego ludzkiego hormonu wzrostu o stężeniu 6 Iu/ml w alkoholu benzylowym 0,9% o pH 6,5 przy różnych stężeniach histydyny, 0, 12, 5, 10, 20, 30, 50 lub 100 mM.In a similar manner to that described in Example I, a preparation of biosynthetic human growth hormone was prepared at a concentration of 6 Iu/ml in 0.9% benzyl alcohol at pH 6.5 with various histidine concentrations of 0, 12, 5, 10, 20, 30, 50 or 100 mM.

Próbki przechowywano 7 dni w temperaturze 37°C, po czym przeprowadzono analizy na obecność form dezamidowanych i utlenionych oraz dimerów i polimerów, w ten sam sposób, jak to opisano powyżej. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 5, przy czym zawartość dezamido-hGH, dimerów i polimerów oraz form utlenionych określono przy zastosowaniu metod: immunoelektroforetycznej chromatografii cieczowej wysokosprawnej, chromatografii cieczowej wysokosprawnej żelowo-permeacyjnej oraz chromatografii cieczowej wysokosprawnej RP, a zawartość rozszczepionych form hGH zmierzono przy zastosowaniu immunoelektroforetycznej chromatografii cieczowej wysokosprawnej.The samples were stored for 7 days at 37°C and then analyzed for deamidated and oxidized forms, dimers, and polymers, in the same manner as described above. The results are presented in Table 5 below, with the content of deamidated hGH, dimers and polymers, and oxidized forms determined using immunoelectrophoretic high-performance liquid chromatography, gel permeation high-performance liquid chromatography, and RP high-performance liquid chromatography, and the content of cleaved hGH forms measured using immunoelectrophoretic high-performance liquid chromatography.

Przy stężeniu histydyny 1 mM lub mniej, zawartość dimeru jest niska; stężenie histydyny większe niż 30 mM daje wyniki możliwe do przyjęcia co do powstawania składowych dezamidowanych, a co do powstawania form utlenionych korzystne są stężenia histydyny poniżej 20 mM. Sumarycznie optymalne stężenie histydyny wynosiłoby więc 5 mM.At a histidine concentration of 1 mM or less, the dimer content is low; histidine concentrations greater than 30 mM give acceptable results regarding the formation of deamidated species, and histidine concentrations below 20 mM are favorable regarding the formation of oxidized species. Overall, the optimal histidine concentration would therefore be 5 mM.

Tabela 5Table 5

Stężenie histydyny (milimoli)Histidine concentration (millimolar) Proc zaw. dezamido- pochodnych Percentage of deamido- derivatives Proc zaw dimeru Proc dimer Proc. zaw. polimeruPolymer content percentage Proc. zaw pochodnych utlenionychPercentage of oxidized derivatives Proc. zaw. form rozszczep. Percentage of cleft forms. pH pH 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 0 0 7,7 7.7 0,7 0.7 <0,2 <0.2 1,5 1.5 1,4 1.4 6,3 6.3 1 1 7,9 7.9 0,4 0.4 <0,2 <0.2 1,5 1.5 1,2 1.2 6,4 6.4 2 2 8,7 8.7 0,3 0.3 <0,2 <0.2 1,6 1.6 1,2 1.2 6,5 6.5

c d tabeli 5c d table 5

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 5 5 9,6 9.6 0,4 0.4 <0,2 <0.2 1,7 1.7 niewykrywalne undetectable 6,6 6.6 10 10 10,8 10.8 0,4 0.4 <0,2 <0.2 1,7 1.7 niewykrywalne undetectable 6,6 6.6 20 20 11,6 11.6 0,4 0.4 <0,2 <0.2 2,0 2.0 niewykrywalne undetectable 6,6 6.6 30 30 12,0 12.0 0,3 0.3 <0,2 <0.2 2,1 2.1 niewykrywalne undetectable 6,6 6.6 50 50 14,4 14.4 0,5 0.5 <0,2 <0.2 3,8 3.8 niewykrywalne undetectable 6,6 6.6 100 100 17,0 17.0 0,3 0.3 <0,2 <0.2 2,6 2.6 niewykrywalne undetectable 6,6 6.6

171 356171 356

WYKAZ LITERATURYLITERATURE LIST

1) Y. -C.J. Wang i M.A. Hanson. Parenteral Formulations of Preteins and Peptides. Stability and Stabilizers. J. Parenteral Science and Technology 42 (suplement), (1988), 53-525.1) Y.-C.J. Wang and M.A. Hanson. Parenteral Formulations of Preteins and Peptides. Stability and Stabilizers. J Parenteral Science and Technology 42 (supplement), (1988), 53-525.

2) M.C. Manning, K. Patel, R.T. Borchardt. Stability of Protein Pharmaceuticals. Pharmaceutical Research 6 (11) (1989) 903-918.2) M.C. Manning, K. Patel, R.T. Borchardt. Stability of Protein Pharmaceuticals. Pharmaceutical Research 6 (11) (1989) 903-918.

3) B.A. Johnson, J.M. Shirokawa, W.S. Hancock, M.W. Spellman, LJ. Basa i D.W. Asward. J. Biol. Chem. 264, 1462-71 (1989).3) B.A. Johnson, J.M. Shirokawa, W.S. Hancock, M.W. Spellman, L.J. Basa and D.W. Asward. J. Biol. Chem. 264, 1462-71 (1989).

4) L.C. Teh i in., J. Biol. Chem., 262, 785-794 (1987).4) L.C. Teh et al., J. Biol. Chem., 262, 785-794 (1987).

5) G.W. Becker i in., Biotech. Appl. Biochem, 10, 326-337 (1988).5) G.W. Becker et al., Biotech. Appl. Biochem, 10, 326-337 (1988).

6) R.A. Roughten i in., Arch. Biochem. Biophys. 178, 350-355 (1977).6) R.A. Roughten et al., Arch. Biochem. Biophys. 178, 350-355 (1977).

7) R.M. Riggin i in., Anal. Biochem., 167, 199-209 (1987).7) R.M. Riggin et al., Anal. Biochem., 167, 199-209 (1987).

8) P. Gellerfors i in., Acta Paediatr. Scand. (suplement), 370, 93-100 (1990).8) P. Gellerfors et al., Acta Paediatr. Scand. (supplement), 370, 93-100 (1990).

9) M.J. Kaufman, Pharm. Res., 7 (3) 289-292 (1990).9) M.J. Kaufman, Pharm. Res., 7(3) 289-292 (1990).

171 356171 356

FIG. 1FIG. 1

FIG. 2FIG. 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.Publishing Department of the Polish Patent Office. Circulation: 90 copies.

Cena 4,00 złPrice: PLN 4.00

Claims

Patent claims

A method for the production of growth hormone crystals or growth hormone derivatives and histidine or a histidine derivative, characterized by preparing a solution of the growth hormone or growth hormone derivative in a solvent, adding histidine or a histidine derivative in a concentration of 5 mM to 25 mM, the pH of the solution is 5 to 7.5, preferably hydrochloric acid, organic or inorganic cations are added, the solution is crystallized at a temperature of about 0 ° C to about 30 ° C and the resulting crystals are isolated in a known manner.

2. The method according to p. The process of claim 1, wherein the solution forming solvent is short-chain aliphatic, alicyclic and aromatic alcohols and ketones.

3. The method according to p. The process of claim 1 or 2, wherein the growth hormone is hGH.