LV15613B - Gangrenoza apendicīta attīstības riska noteikšanas paņēmiens bērniem - Google Patents

Abstract

Gangrenoza apendicīta attīstības risku bērniem nosaka pirms ķirurģiskas operācijas, izmantojot "sendviča" tipa ELISA metodi nosakot asins serumā citokīnu, proti, IL-6, NGAL un LRG1 daudzumu.

Description

IZGUDROJUMA APRAKSTS

[001] Izgudrojums attiecas uz medicīnu, proti, uz abdominālo ķirurģiju, un to var izmantot, parādoties akūtām sāpēm vēdera dobumā bērniem, lai noteiktu gangrenoza apendicīta attīstības risku.

Zināmais tehnikas līmenis

[002] Akūts iekaisums apendicīta gadījumā ir visizplatītākā ķirurģiskā slimība bērniem vecumā līdz 18 gadiem. Bērniem apendektomija veido no 70 līdz 75% no ārkārtas ķirurģiskajām manipulācijām. Gangrenoza apendicīta riska noteikšana ir nopietna problēma, jo akūts iekaisums apendicīta gadījumā samērā bieži “atdarina” citu akūtu iekaisumu vēdera dobumā, piemēram, akūtu iekaisumu mezenteriāla limfadenīta (mezenterīta) gadījumā bērniem. Pacienta veselības stāvoklis strauji pasliktinās, parādās paātrināta sirds darbība, paātrināta elpošana, temperatūra paaugstinās līdz 38,5 - 39° C. Pacientam ir asas sāpes vēderā, var būt vemšana. Asins analīze parāda leikocītu skaita palielināšanos līdz 30 000. Sāpes vispirms aptver visu vēdera lejasdaļu, pēc tam “pārvietojas” uz apakšējo labo stūri. Diezgan bieži pacientam tiek diagnosticēts akūts apendicīts. Veic operāciju, un tikai operācijas laikā tiek atklāts mezenteriāls limfadenīts (mezenterīts). Ārstēšana notiek, ievadot vēdera dobumā antibiotiku maisījumu [1,2].

[003] Akūtam gangrenozam apendicītam raksturīgs strutains iekaisums ar apendiksa sieniņas nekrozi, tās perforāciju un sekojošu peritonītu. Akūta gangrenoza apendicīta diagnoze tiek noteikta tikai pēc apendiksa intraoperatīvās vizuālās novērtēšanas. Jebkuras manipulācijas ar gangrenozi izmainītu apendiksu noslēdzas ar tā plīšanu. Pēdējā laika novērojumi liecina, ka akūtu apendicītu ne vienmēr vajag operēt, īpaši tas attiecas uz bērniem. Bet akūta gangrenoza apendicīta gadījumā operācija ir obligāti nepieciešama. Saistībā ar izklāstīto problēmu ir svarīgi noteikt gangrenoza apendicīta attīstības risku bērniem vecumā līdz 18 gadiem.

[004] Zināms akūta apendicīta attīstības riska noteikšanas paņēmiens bērniem, izmantojot Alvarado skalas kritērijus [3]. Alvarado skalā ietilpst seši klīniskie simptomi un divi laboratorijas testi [4, 5].

[005] Zināms akūta iekaisuma attīstības riska noteikšanas paņēmiens apendicīta gadījumā bērniem, pielietojot novokaīna blokādi [6, 7], Novokaīna blokāde mazina spazmas dažādos vēdera dobuma orgānos, kas atrodas šajā inervētajā zonā. Zināmais paņēmiens var izraisīt klīnisko izpausmju samazināšanos.

[006] Zināms akūta iekaisuma attīstības riska noteikšanas paņēmiens apendicīta gadījumā bērniem, izmantojot vēdera dobuma orgānu ultraskaņas izmeklēšanu [8], Veic vēdera dobuma un asins plūsmas kartēšanu. Konstatējot piedēkļa sieniņas kontrastainu zīmējumu, un, vizualizējot piedēkli vainaga formā, tiek noteikts iekaisuma attīstības risks akūtā apendicīta gadījumā bērniem.

[007] Zināms akūta iekaisuma attīstības riska noteikšanas paņēmiens apendicīta gadījumā bērniem, izpētot leikocītus [9, 10], Nosaka intoksikācijas leikocitāro indeksu, C-reaktīvā olbaltuma līmeni, imūnglobulīna G un imūnglobulīna E līmeni, aprēķina punktus, summē tos pēc formulas un, ja punktu summa ir 5 un vairāk, prognozē akūta apendicīta attīstības risku.

[008] Zināms akūta iekaisuma attīstības riska noteikšanas paņēmiens apendicīta gadījumā pacientiem, izmantojot dažādus biomarķierus un matemātisko algoritmu, lai iegūtu testa novērtējumu [11],

[009] Zināms akūta iekaisuma attīstības riska noteikšanas paņēmiens apendicīta gadījumā ar klīnisko simptomātiku, kas imitē labās puses nieru kolikas [12], Pacientam ar aizdomām par akūtu apendicītu vienlaikus nosaka laktoferīna koncentrāciju izkārnījumos un urīna paraugos. 100 reizes atšķaidīta fekāliju ekstrakta un urīna paraugi vienādos apj omos 100 μΐ ar automātisku pipeti tiek ievadīti plāksnes vai sloksnes iedobēs laktoferīna imūnfermentālai analīzei. Ja fekālā laktoferīna koncentrācija ir lielāka par 7500 ng/g un urīnā laktoferīna koncentrācija ir no 0 līdz 60 ng/ml, nosaka akūta apendicīta risku, izslēdzot akūto labās puses nieru patoloģijas risku.

[010] Nav zināms gangrenoza apendicīta attīstības riska noteikšanas paņēmiens bērniem.

Izgudrojuma mērķis un būtība

[011] Izgudrojuma mērķis ir izstrādāt gangrenoza apendicīta vai mezenteriāla limfadenīta attīstības riska noteikšanas paņēmienu bērniem.

[012] Mērķi realizē, pateicoties tam, ka akūta iekaisuma vēdera dobumā gadījumā pirms ķirurģiskās operācijas veikšanas, izmantojot kvantitatīvās “sendviču” tipa ELISA principu, asins serumā un urīnā nosaka citokīnu daudzumu, interleikīnu - 6 (IL-6), lipokalīnu (NGAL), alfa-2-glikoproteīnu 1 (LRG1) un, ja interleikīna daudzums asins serumā ir 641 pg/ml un vairāk, lipokalīna daudzums asins serumā ir 251 ng/ml un mazāk, bet alfa-2-glikoproteīna 1 daudzums asins serumā ir 81.4 ng/ml un mazāk, tad pastāv gangrenoza apendicīta attīstības risks.

[013] Zināmi citokīnu (limfocītu signālšūnas) pētījumi, pētot stresa stāvoklī esošas šūnas: 1) interleikin-6 (IL-6), 2) olbaltumu lipokalīnu, asociētu ar neitrofilu želatināzi (Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)), 3) alfa-2-glikoproteīnu 1 (Leucine-rich alpha-2glycoprotein 1 (LRG1)).

[014] Interleikin-6 (IL-6) ir iekaisuma pozitīvs citokīns, ko ražo dažādas šūnas, stimulē imūnatbildi, to sintezē makrofāgi un T-šūnas [13],

[015] Olbaltumviela NGAL - lipokalīns, asociēts ar neitrofīlu želatināzi. Atkarībā no dažādiem patoloģiskiem apstākļiem NGAL sekretējas un ekspresējas ar dažādām šūnām, kas atrodas stresa stāvoklī - ar imūnām šūnām, hepatocītiem, elpošanas un gremošanas trakta epitēlija šūnām [14],

[016] Alfa-2-glikoproteīns 1 (LRG1) piedalās signāla mijiedarbībā šūnu adhēzijas un dažādu imūnprocesu attīstības gadījumos [15].

[017] ELISA ir jūtīga metode, jo katra fermenta molekula var pārveidot daudzas substrāta molekulas, kas darbojas kā reakcijas pastiprinātājs. Antigēns ir saistīts ar cietu virsmu, primāra antiviela sasaistās ar antigēnu, bet sekundārā enzīmu-savienota poliklinālā antiviela sasaistās ar primāro antivielu. Enzīms pārvērš substrātu par nokrāsotu galīgo produktu, kas veido precipitātu proporcionāli antivielu daudzumam pacienta asins serumā. Monoklonālā antiviela sasaistās uz cietās virsmas un saista antigēnu, ja tas ir pacienta asins serumā, un substrātu, kas pārvērš par nokrāsoto produktu proporcionāli antivielu daudzumam pētāmajā asins serumā. Kvantitatīvas “sendviču” tipa ELISA reakcijas veikšanai izmanto speciālas cilvēka specifiskās antivielas (kit) [16],

[018] Paņēmienu realizē sekojoši.

[019] Veic citokīnu izpēti, izmantojot kvantitatīvo “sendviču” tipa ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) principu. Izmanto biomarķierus IL-6, NGAL (ražotājs R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) un LRG1 (ražotājs Novus Biologicals, USA).

[019] Izmanto IL-6 kā biomarķieri reakcijā ar 100 μΐ asins seruma un 100 μΐ urīna. Asinīm ņēma 2 ml stobriņu. Urīnam ņēma 15 ml stobriņu.

[020] Izmanto NGAL kā biomarķieri reakcijā ar 2 μΐ asins seruma un 10 μΐ urīna. Asinīm ņēma 2 ml stobriņu. Urīnam ņēma 15 ml stobriņu. 5 5 5 5

[021] NGAL biomarķieri urīna paraugus atšķaida 5 reizes, bet asins seruma paraugus 25 reizes, izmantojot kita kalibrācījas atšķaidītāju. Ja bija paredzama augstāka vai zemāka koncentrācija, tad atšķaidījumi attiecīgi mainījās, lai iekļautos biomarķiera noteikšanas robežās. [022] LRG1 biomarķieri urīna paraugus atšķaida 200 reizes, bet asins seruma paraugus 10000 reizes, izmantojot biomarķiera atšķaidītāju. Ja bija paredzama augstāka vai zemāka koncentrācija, tad atšķaidījumi attiecīgi mainījās, lai iekļautos biomarķiera noteikšanas robežās. [023] Paraugus centrifugē ar ātrumu 2000 apgr./min. 10 minūtes 4° C temperatūrā. No asinīm paņem serumu un no urīna tā augšējo slāni. Turpmākiem pētījumiem paraugus sasaldē - 80° C temperatūrā, lai, ilglaicīgi uzglabājot, nenotiktu proteīnu degradācija.

[024] IL-6 biomarķieri izmanto kvantitatīvā “sendviču” tipa ELISA principu. Biomarķieri nodrošinātā mikroplatīte ir pārklāta ar cilvēka specifiskajām IL-6 antivielām. Pirmajā reakcijas solī mikroplatīšu bedrītēs pievieno standartus un paraugus, un šķīdumos esošais IL-6 piesaistās pie imobilizētajām antivielām. Mazgāšanas solī skalo visas pie antivielām nepiesaistījušās vielas. Pēc tam pievieno cilvēku specifisko IL-6 enzīmu-savienotu poliklonālu antivielu. Pēc atkārtotas mazgāšanas, kad tiek aizvākti nepiesaistījušās antivielas - enzīma reaģenti, pievieno substrāta šķīdumu, un proporcionāli IL-6 daudzumam attīstās krāsas intensitāte. lekrāsojuma attīstīšanās tiek apturēta, pievienojot stop šķīdumu (2N sērskābe), un krāsas intensitāti mēra mikroplašu fotospektometrā.

[025] NGAL biomarķierī izmanto kvantitatīvu “sendviču” tipa ELISA principu. Biomarķierī nodrošinātā mikroplatīte ir pārklāta ar cilvēka specifiskajām NGAL antivielām. Pirmajā reakcijas solī mikroplatīšu bedrītēs pievieno standartus un paraugus. Šķīdumos esošais NGAL piesaistās pie imobilizētajām antivielām. Mazgāšanas solī skalo visas pie antivielām nepiesaistījušās vielas. Pēc tam pievieno cilvēku specifisko NGAL enzīmu-savienotu poliklonālu antivielu. Pēc atkārtotas mazgāšanas, kad tiek aizvākti nepiesaistījušās antivielas enzīma reaģenti, pievieno substrāta šķīdumu, un proporcionāli NGAL daudzumam attīstās krāsas intensitāte. lekrāsojuma attīstīšanās tiek apturēta, pievienojot stop šķīdumu (2N sērskābe), un krāsas intensitāti mēra mikroplašu fotospektometrā.

[026] LRG1 biomarķierī tiek izmanots kvantitatīvās “sendviču” tipa ELISA princips. Biomarķierī tiek nodrošināta 96 bedrīšu mikroplatīte, kas pārklāta ar cilvēka specifiskajām poliklonālajām antivielām. Pirmajā solī pievieno standartus un paraugus, un šķīdumos esošais LRG1 piesaistās imobilizētajām antivielām. Mazgāšanas solī skalo visas nepiesaistījušās vielas. Nākamajā solī pievieno cilvēka LRG1 specifiskās biotinilētās poliklonālās antivielas. Mazgāšanas soli atkārto. Pēc tam pievieno streptavidīna peroksidāzes konjugātu, kas atpazīst biotinilētās poliklonālās antivielās un piesaistās tām. Vēlreiz atkārto mazgāšanas soli un pievieno peroksidāzes enzīma substrātu. Proporcionāli LRG1 daudzumam attīstās krāsas intensitāte. lekrāsojuma attīstīšanās tiek apturēta, pievienojot stop šķīdumu (0,5 N sālsskābe), un krāsas intensitāti mēra mikroplašu fotospektrometrā.

[027] Tiek izmantotas biomarķieros nodrošinātās 96 bedrīšu mikroplatītes, kas visos gadījumos jau ir pārklātas ar attiecīgā biomarķiera cilvēka specifiskajām poliklonālajām antivielām. Biomarķieru attiecīgie standarti ir liofilizētā veidā, un pirms lietošanas ir jāizšķīdina attiecīgā biomarķiera atšķaidītājā (LRG1) vai dejonizētā/destilētā ūdenī (NGAL). Visas pārējās vielas ir šķidrā koncentrētā veidā, kas jāatšķaida ar destilētu/dejonizētu ūdeni vai attiecīgā biomarķiera atšķaidītāju.

[028] Lai izstrādātu jaunu, ticamu un savlaicīgu akūta gangrenoza apendicīta attīstības riska noteikšanas paņēmienu bērniem līdz 18 gadu vecumam, laika posmā no 2018. gada līdz 2020. gadam VSIA Bērnu klīniskajā universitātes slimnīcā (BKUS) tika veikts, uz klīniskās gaitas, laboratorisko un ārstēšanas rezultātu analīzi pamatots, prospektīvs pētījums. Pētījumā tika iekļauti 59 pacienti ar akūtām sāpēm vēderā un sākotnējo klīnisko diagnozi “aizdomas par akūtu apendicītu”. Pētījuma protokolā “aizdomas par akūtu apendicītu” definēta kā diagnoze pacientam, kuram BKUS Neatliekamās palīdzības nodaļā iegūti un izvērtēti venozo asins paraugi, veikta vizuālā diagnostika (vēdera dobuma orgānu un retroperitoneālās telpas ultrasonogrāfija) un papildus nozīmēta bērnu ķirurga konsultācija, lai apstiprinātu vai izslēgtu akūtu vēdera dobuma ķirurģisku slimību. Pētījuma procesā visiem 59 pacientiem tika veikti citokīnu pētījumi, izmantojot kvantitatīvās “sendviču” tipa ELISA principu. Izmantoja interleikīnu - 6 (IL-6), lipokalīnu (NGAL), un alfa-2-glikoproteīnu 1 (LRG1). Pētījuma procesā 30 pacientiem noteica akūtu mezenteriālu limfadenītu. 29 pacientiem apstiprināja akūta gangrenoza apendicīta attīstības iespēju. Jaunais gangrenoza apendicīta attīstības riska noteikšanas paņēmiens tika izstrādāts, pamatojoties uz 29 pacientu fizikālās, laboratoriskās un radioloģiskās izmeklēšanas datiem. Ķirurģiska ārstēšana bija indicēta visiem 29 bērniem, un 10 bērniem akūta gangrenoza apendicīta diagnoze tika apstiprināta operācijas laikā, kā arī precizēta ar aklās zarnas piedēkļa patohistoloģisko izmeklēšanu.

[029] Tika novērotas statistiski ticamas atšķirības starp akūtu gangrenozu apendicītu un akūtu mezenteriālu limfadenītu. Pētījumam nepieciešamie dati tika apstrādāti ar programmu SPSS for Windows 19.0. Lai novērtētu citokīnu interleikīnu - 6 (IL-6), lipokalīnu (NGAL), un alfa-2glikoproteīnu 1 (LRG1) vidējās vērtības, standartnovirzi un atšķirību starp pētāmo un kontroles grupu, rezultātu statistiskajā apstrādē izmantoja ANOVA un Hi kvādrāta (Chi square) metodi. Mainīgo lielumu salīdzināšanai starp dažādām pacientu grupām lietoja “f’testu un KruskalaVollisa (Kruskal-Wallis) un Manna-Vitnija (Mann-Whitney) testu, izmantoja ROC (receiver operator characteristics) līkni, noteica laukumu zem līknes AUC (area under the curve) un tā 95 % ticamības intervālu CI (confidence interval). P vērtība, kas mazāka par 0,05, tika uzskatīta par statistiski nozīmīgu.

[030] Pētījums VSIA BKUS tika veikts saskaņā ar VSIA BKUS Medicīniskās ētikas komitejas atļauju un Helsinku Deklarācijas prasībām.

Izgudrojuma īstenošanas piemēri

[031] Konkrēti piemēri, kas apstiprināja ticama un savlaicīga akūta gangrenoza apendicīta attīstības riska noteikšanas paņēmiena efektivitāti bērniem līdz 18 gadu vecumā ar sāpēm vēderā.

1. piemērs

[032] Paciente B., meitene 7 g.v., tika stacionēta VSIA BKUS ar akūtām sāpēm vēderā 6 stundas. Novērtējot pacienti, pēc jaunā paņēmiena rādītāju kritērijiem, IL-6 daudzums asins serumā 641 pg/ml, NGAL daudzums asins serumā 251 ng/ml un LRG1 daudzuma asins serumā ng/ml, noteica gangrenoza apendicīta attīstības risku pirmajās 1 - 24 stundās. Pacientei veica konvencionālo apendektomiju 7 stundas 40 minūtes no saslimšanas brīža. Noteica diagnozi gangrenozs apendicīts, kas apstiprinājās morfoloģiski pēc veiktās operācijas. Bērns pēc izveseļošanās tika izrakstīts no stacionāra.

2. piemērs

[033] Pacients I., zēns, 11 g.v., tika stacionēts VSIA BKUS ar akūtām sāpēm vēderā 24 stundas. Novērtējot pacientu, pēc jaunā paņēmiena rādītāju kritērijiem, IL-6 daudzums asins serumā 922 pg/ml, NGAL daudzums asins serumā 56 ng/ml un LRG1 daudzuma asins serumā 41 ng/ml, noteica gangrenoza apendicīta attīstības risku 24 - 48 stundās. Pacientam veica konvencionālo apendektomiju 53 stundas 20 minūtes no saslimšanas brīža. Noteica diagnozi akūts gangrenozs, perforējs apendicīts, kas apstiprinājās morfoloģiski pēc veiktās operācijas. Bērns pēc izveseļošanās tika izrakstīts no stacionāra.

Rūpnieciskā izmantošana

[034] Laika periodā no 2018. līdz 2020. gadam VSIA BKUS pētījumā tika iekļauti 59 bērni vecumā no 7 līdz 12 gadiem. Pediatru ķirurģijas brigāde, kas uzrauga pacientus ar apendicītu, saņēma rakstiskas piekrišanas veidlapu, kas sniedza informāciju par šo pētījumu.

[035] Visiem pacientiem bija asas sāpes vēderā, dažiem bija vemšana. Temperatūra paaugstinājās līdz 38,5 - 39,0 ° C. Asins analīze rādīja leikocītu skaita pieaugumu līdz 30000 - 35000. Sāpes aptvēra vēdera apakšējo daļu, un dažiem pacientiem tā pārvietojās uz labo apakšējo stūri.

[036] Visiem pacientiem veica izmeklējumus, lai apstiprinātu vai izslēgtu diagnozi: novērtēja fizisko stāvokli, veica pilnu asins analīzi, noteica C-reaktīvo proteīnu asins serumā un veica vēdera dobuma ultraskaņu.

[037] Visiem 59 pacientiem tika veikti citokīnu pētījumi, izmantojot kvantitatīvās “sendviču” tipa ELISA principu. Izmantoja interleikīnu - 6 (IL-6), lipokalīnu (NGAL), un alfa-2glikoproteīnu 1 (LRG1).

[038] Izmantoj ot j auno paņēmienu, 10 bērniem (no kopēj ā skaita) konstatēj a akūta gangrenoza apendicīta attīstības riska iespējas, un savlaicīgi 1-72 stundu laikā veica apendektomijas operāciju. Ticama, akūta gangrenoza apendicīta attīstības riska iespējas apstiprināja morfoloģiski - pēc operācijas veikšanas. Ņemot vērā rezultātus, kuri iegūti ar jauno paņēmienu, jaunais paņēmiens var būt rekomendējams plašai izmantošanai pediatriem klīnikās un ambulancēs, ātrās neatliekamās medicīniskās palīdzības ārstiem un citiem speciālistiem.

Informācijās avoti

1. MeaeHTepHajībHBiH ππΜφη,ζιεΗπτ. https://www.iensmed.ru/news/post newl 1294.htbl

2. MamKOBCKHH M.^. JleKapcTBeHHBie cpeņcTBa. M/MeņmiHHa, 2 tom, 1993 - 309, 327 c.

3. Alvarado A. A practical score for the early diagnosis of acute appendicitis.

4. Ohle R. The Alvarado score for predicting acute appendicitis: a systematic review.

5. Pat RU 2614723, Cl, 2017, G01N33/49.

6. TocTHmeB B.K. OneparnBnaa monnaa xnpyprna, M.: Me^minna. - 1996. C.- 268.

7. 3aTCBaxHH H.H. AS^OMunajīBnaa xnpyprna (H.H.3aTeBaxHH, A.H.KnpneHKO,

B.A.Ky6BimKHH, HaijHOHajīBHoe pyKOBoņcTBO. KpaTKoe onncaune. - Μ.:Γ3ΟΤΑΡ Meņna, 2016 -912 c.

8. Pat. RU 2318442, Cl, 2008, A61B8/00.

9. Pat. RU 2434573, C2, 2011, A61B5/00.

10. Piet. WO 2004032711, 2004, A2, A61B1/00.

11. Piet. WO 2013075055, A2, 2013, G01N33/68.

12. Pat. RU 2684727, Cl, 2019, G01N33/48.

13. https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%98%D0%BD%D1 %82%, 01.09.2020

14. http://kalog-adm.ru/2020/07/gemoglobinemiya/, 01.09.2020

15. https://en.wikipedia.org/wili/LRGl, 01.09.2020

16. https://spravochnik.svnevo.ua/ru/intro/method.html.

Claims (2)

1. Gangrenoza apendicīta attīstības riska noteikšanas paņēmiens bērniem, kas raksturīgs ar to, ka akūta iekaisuma vēdera dobumā gadījumā, pirms ķirurģiskās operācijas veikšanas, izmantojot kvantitatīvo “sendviču” tipa ELISA principu, asins serumā un urīnā nosaka citokīnu daudzumu, konkrēti, interleikīnu - 6 UL-6), lipokalīnu (NGAL), alfa-2glikoproteīnu 1 (LRG1).

2. Paņēmiens saskaņā ar 1. pretenziju, kas raksturīgs ar to, ka, ja interleikīna daudzums asins serumā ir 641 pg/ml un vairāk, lipokalīna daudzums asins serumā ir 251 ng/ml un mazāk, bet alfa-2-glikoproteīna 1 daudzums asins serumā ir 81.4 ng/ml un mazāk, tad pastāv gangrenoza apendicīta attīstības risks.