LU87624A1 - Composition pharmaceutique et/ou cosmetique contenant un facteur de croissance hypophysaire(hdgf)stabilise par de l'elastine soluble - Google Patents
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Description
La présente invention a pour objet une composition pharmaceutique et/ou cosmétique à base d’un facteur de croissance hypophysaire stabilisé et son utilisation dans le traitement de la peau notamment dans le processus de cicatrisation et d'amélioration de son aspect esthétique.
Les facteurs de croissance sont des molécules polypeptidiques dont les études in vivo et in vitro ont permis de mettre en évidence diverses propriétés en tant qu'agents de multiplication et de différenciation de cellules d'origine et d'espèces différentes.
Pour certains d'entre eux la séquence en acides aminés a pu être déterminée ainsi que la structure du gène correspondant.
Parmi les facteurs de croissance tissulaire, ceux qui ont fait l'objet d'études approfondies en raison d'une part de la multiplicité des cellules cibles concernées, ou des effets biologiques observés, et d'autre part de l'impact thérapeutique que les médecins et notamment les dermatologistes peuvent espérer, on doit tout particulièrement mentionner le facteur de croissance épidermique ou EGF (Epidermal Growth Factor), le facteur de croissance des fibroblastes ou FGF (Fibroblast Growth Factor) ainsi que le facteur de croissance dérivé de l'oeil ou EDGF (Eye Derived Growth Factor).
Le EGF exerce une activité stimulatrice de la prolifération des cellules épithéliales et peut jouer également un rôle indirect dans la régénération des fibres nerveuses, dans la cicatrisation des tendons et dans la formation des vaisseaux sanguins. L'EGF par rapport au FGF s'est avéré surtout efficace pour les lésions superficielles alors que le FGF le serait surtout pour les lésions profondes.
L'EDGF est un facteur de croissance qui a été mis en évidence et isolé à partir de la rétine du boeuf adulte. En culture, il favorise la croissance d'un grand nombre de cellules cibles comme les cellules endothéliales, les fibroblastes, les myoblastes, les chondrocytes mais également les kératinocytes.
Comme pour l'EGF, l'EDGF semble également jouer un rôle non négligeable dans les phénomènes de cicatrisation tout au moins dans celui concernant les plaies superficielles de l'épiderme.
Parmi les études ayant porté sur l'EGF on peut notamment mentionner les articles de G. CARPENTER et al, Ann. Rev. Biochem., 48, 193-216 (1979) et de L. E. KING et al, Progress In Dermatology, Vol. 19, N°l, 1-8 (1985).
Parmi les études ayant porté sur le F.G.F. on peut notamment mentionner les articles de D. GOSPODAROWICZ et al, J. Cell. Physiol.
Supp.,5/15-26 (1987) et de GARY D. SHIPLEY et al., J. Cell. Physiol. 138/511-518 (1989).
Parmi les études se rapportant à l'EDGF on peut citer les articles de D. BARRITAULT et al, Journal of Neuroscience Research, 8:477-490 (1982) et de A. Y. FOURTANIER et al, The Journal of Investigative Dermatology,
Vol. 87, N°1, 76-80 (1986).
Par ailleurs des études ont été entreprises en vue de prévenir l'inactivation des facteurs de croissance notamment du FGF et ainsi de protéger leur activité biologique.
Compte tenu du grand intérêt que présentent les facteurs de croissance cellulaire, dans le domaine pharmaceutique et cosmétique, notamment pour influencer les modalités du vieillissement cutané, des études ont été poursuivies sur les moyens de stabiliser, donc de prévenir l'inactivation des facteurs de croissance du type FGF à l'aide de divers supports protéiques.
On a maintenant découvert, de façon tout à fait inattendue et surprenante, que l'élastine soluble et notamment la kappa-élastine (K-élastine) constitue un support de choix permettant de conserver l'activité initiale des facteurs de croissance du type FGF.
La présente invention concerne plus particulièrement la stabilisation des facteurs de croissance dérivés d'hypophyses ou HDGF (Hypophyse Derived Growth Factor).
La présente invention a donc pour objet une composition pharmaceutique ou cosmétique contenant, en tant que substance active, un facteur de croissance stabilisé, caractérisée par le fait que le facteur de croissance est le facteur de croissance dérivé d'hypophyses ou HDGF, stabilisé par de l’élastine soluble.
Le HDGF contient du FGF mais également d'autres facteurs de croissance contenus dans l'hypophyse, ayant notamment une activité EGF-like (Epidermal growth Factor-Like).
La préparation du HDGF peut être réalisée selon la méthode de LEMMON et BRADSHAW (J. of Cell. Biochem. 21/3, 195-208, 1983) à partir d'hypophyses. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le HDGF est préparé à partir d'hypophyses bovines selon les étapes suivantes : 1°) Lavage des hypophyses bovines congelées dans du liquide physiologique à environ 4°C, - homogénéisation dans un broyeur électrique à petite vitesse dans une solution de sulfate d'ammonium contenant des inhibiteurs de protéases notamment la leupeptine et la pepstatine, - agitation du broyât à 4°C, - première centrifugation pour récupérer un premier extrait, - deuxième centrifugation après reprise du premier résidu dans une solution de sulfate d'ammonium contenant des inhibiteurs de protéases pour récupérer le deuxième extrait, 2°) Mélange des deux extraits et précipitation à 65 % de saturation en sulfate d'ammonium, - récupération du précipité par centrifugation, - solubilisation dans une solution de sulfate d'ammonium à 25 % de saturation, - dialyse du surnageant contre du liquide physiologique, - clarification de la solution par centrifugation à grande vitesse, - détermination de l'activité "facteur de croissance" de la solution stérile (stérilisation sur membrane) par test biologique.
Caractéristiques du HDGF : 1°/ Caractéristiques physiques et chimiques.
- solution aqueuse incolore à jaunâtre et inodore, légèrement translucide, de pH 6,5.
- concentration en protéines : ^500pg/ml.
2°/ Analyse de la composition peptidique par électrophorèse en gel de polyacrylamide 6,25%-12,5%.
Cette analyse permet de constater que la préparation de HDGF ne contient pas de protéines d'un poids moléculaire supérieur à 66 KD. La majorité des peptides présente un poids moléculaire de + 20 KD par rapport aux protéines de poids moléculaire connu utilisées comme références ainsi que des peptides de plus petites tailles.
3°/ Dosage de l'activité biologique.
Le dosage s'effectue en mesurant la stimulation de la multiplication cellulaire sur une lignée de fibroblastes embryonnaires de souris, la lignée Balb 3T3.
L'unité biologique est définie par la quantité de HDGF qu'il faut ajouter pour avoir 50 % de la stimulation maximale obtenue avec 5 % de sérum de veau foetal.
Le détail de ces études sur l'activité biologique du HDGF seul ou associé à l'élastine soluble sera décrit ci-après.
Par le procédé tel que décrit ci-dessus on obtient en général, à partir de 1 kg d'hypophyses bovines, de 5 à 10 millions d'unités d'activité mitogénique.
L'élastine soluble ou kappa-élastine (K-élastine) est un mélange de peptides obtenus par solubilisation de l'élastine fibreuse ou polymérique par un processus de dégradation ménagée soit par des élastases, par exemple l'élastase pancréatique, soit par des solvants tels que la potasse en milieu organo-aqueux, par exemple la potasse IM dans l'éthanol à 80 %.
La taille des peptides qui la composent et qui sont coacervables ont un poids moléculaire généralement compris entre 10 KD et 60 KD.
Pour sa préparation et ses propriétés, on peut utilement se référer aux articles suivants : L. ROBERT et N. POULAIN "Etudes sur la structure de l'élastine et le mode d'action de l'élastase. I. Nouvelle méthode de préparation de dérivés solubles de l'élastine". Bull. Soc. Chim. Biol. (Paris), 1963, 45, 1317-1326, L. ROBERT "Le tissu Conjonctif : l'élastine", publié dans "Précis de Physiologie cutanée" Ed. Meynadier J. Editions de la Porte Verte, Paris, 1980, 155-173, et M. MENASCHE, M.P. JACOB, et L. ROBERT "Pharmacological studies on elastin peptides (K.elastine)".Path. Biol. 1981,29,n°9,548-554.
Sa préparation a également été décrite dans le Brevet Français n° 76.16602 (2.353.282).
Cette élastine soluble lyophilisée se présente sous forme d'une poudre fine, jaune clair, légèrement hygroscopique n'ayant aucune odeur part iculière.
Les solutions aqueuses et alcooliques de 1 à 30 % sont parfaitement limpides à température ambiante et à + 4°C.
Le pH d'une solution à 5 % est d'environ 6,5 + 0,5 à 20°C.
Comme élastine soluble on peut utiliser selon l'invention celle vendue par la Société SODICHIMIC S.A. sous la dénomination de "Kappa-élastine SCD".
Bien que la stabilisation du HDGF par l'élastine soluble puisse être réalisée extemporanément lors de la fabrication des compositions pharmaceutiques ou cosmétiques, on préfère, selon l'invention, procéder au mélange préalable de l'élastine soluble et de la solution de HDGF, puis procéder à une lyophilisation suivie d'une stérilisation.
Les études qui ont été réalisées ont mis en évidence que la lyophilisation n'altérait pas de manière significative l'activité biologique du HDGF.
Solution de HDGF après congélation : 16,1 U/ml,
Solution de HDGF après lyophilisation : 14,1 U/ml : perte d'activité de 12 %.
Solution de HDGF et d'élastine soluble après congélation : 17,0 U/ml.
Solution de HDGF et d'élastine soluble après lyophilisation : 14,6 U/ml : perte d'activité de 9 %.
Le rapport de la solution de HDGF et d'élastine soluble est généralement compris entre 500 et 100.000 unités d'activité mitogénique par gramme d'élastine soluble et de préférence entre 5.000 et 50.000 unités, le rapport préféré étant de 10.000 unités mitogéniques.
Les essais de conservation ont permis de montrer qu'en solution aqueuse, à température ambiante, l'association était parfaitement stable durant plusieurs mois.
La préparation lyophilisée est parfaitement stable à condition d'éviter l'humidité.
Mesure de l'activité biologique de HDGF incorporé à un gel en présence et en l'absence d'élastine soluble
Technique :
Une solution de HDGF contenant 800 U est lyophilisée en absence et en présence de 50 mg d'élastine soluble. Le matériel lyophilisé est repris dans 0,5 ml d'eau distillée qui est incorporé à 5 g du gel neutre suivant : Acide polyacrylique réticulé vendu sous la dénomination de : "CARB0P0L 940" par la société GOODRICH.. 50 %
Acide déhydroacétique................... 0,4 %
Parahydroxybenzoate de méthyle sodé..... 0,1 %
Parahydroxybenzoate de propyle sodé..... 0,25 %
Triéthanolamine q.s.p. pH = 7,4
Eau purifiée q.s.p. 100 g
Cette incorporation conduit donc à un gel à 1 % d'élastine soluble et 16.000 U/100 g. Le gel est mis en solution dans un milieu de culture contenant 0,1 % de sérum de veau foetal (milieu de quiescence) à raison de 10 mg/ml. Après mise en solution du gel, deux dilutions sont réalisées pour tester en culture 0,5 et 2,5 mg de gel.
- Aux concentrations testées (0,5 et 2,5 mg) le gel seul ne possède pas d’activité cytotoxique vis-à-vis des fibroblastes en culture.
L'élastine soluble seule n’a pas d’activité. Le gel contenant le HDGF seul (2,5 mg de gel:0,4 U de HDGF) présente une activité mitogénique mesurée à 0,065 U tandis que le gel contenant le HDGF et l'élastine soluble présente une activité mitogénique mesurée à 0,12 U.
Les mesures sont faites en duplicate avec un écart de + 10% par rapport à la moyenne.
En conclusion, il est possible de retrouver une activité biologique après incorporation de HDGF dans un gel. La présence d’élastine soluble protège cette activité.
Les compositions pharmaceutiques et cosmétiques, destinées à être appliquées sur la peau, contiennent de préférence de 5 à 1000 unités mitogéniques par gramme de composition et de préférence de 20 à 100.
Ces compositions sont préférentiellement des compositions aqueuses dont le pH doit de préférence être compris entre 5,5 et 8,5.
Ces compositions peuvent se présenter sous forme de lotions, de gels, de crèmes, de pommades ou encore de sprays aérosols.
De préférence les compositions se présentent sous forme de lotions aqueuses ou d'émulsions du type huile-dans-1’eau ou eau-dans-1’huile ou de systèmes vésiculaires.
Ces compositions permettent de combattre la dégradation et le vieillissement des tissus cutanés, d’agir vis-à-vis des rougeurs, des brûlures provoquées par le soleil ou peuvent également favoriser la cicatrisation des plaies ou des brûlures.
Elles peuvent bien entendu contenir, en outre, d'autres ingrédients pharmaceutiques ou cosmétiques usuels tels que des agents conservateurs, des parfums, des huiles, des alcools, des esters gras ou des vitamines.
On va maintenant donner à titre d’illustration et sans aucun caractère limitatif, un exemple de préparation de l’association de HDGF et d’élastine soluble, l’HDGF étant obtenu à partir d’hypophyses bovines, ainsi que plusieurs exemples de compositions pharmaceutiques et dermocosmétiques.
Exemple de préparation A - Des hypophyses bovines (1kg,) congelées sont lavées à plusieurs reprises dans du liquide physiologique à 4°C. Elles sont ensuite homogénéisées dans un broyeur électrique avec 2 litres d'une solution de sulfate d'ammonium 0,15M contenant des inhibiteurs de protéases (éthylène diaminotétracétate de sodium ImM, leupeptine 4 mg, pepstatine A 4 mg).
Le broyât d'hypophyses est agité â 4°C pendant 2 heures. Le premier extrait est récupéré par centrifugation pendant 20 minutes à 7.000g. Le résidu d'hypophyses est ensuite réextrait une deuxième fois pendant 18 heures à 4°C, avec 1 litre de la même solution. Le deuxième extrait est récupéré par centrifugation à 7.000g.
Les deux extraits sont rassemblés et amenés à 65 % de saturation en sulfate d'ammonium. Après quelques heures de précipitation, le matériel insoluble est récupéré par centrifugation à 4°C à 12.000 g. Le matériel précipité à 65 % de sulfate d'ammonium est ensuite partiellement solubilisé dans une solution de sulfate d’ammonium à 25 % final de saturation. Le matériel insoluble est éliminé par une centrifugation à 12.000 g. Le surnageant est ensuite dialysé contre un grand volume de liquide physiologique à 4°C avec une membrane de dialyse Spectrapor avec un cut-off de 3.500 daltons.
Après deux changements du bain de dialyse, la solution est clarifiée par une centrifugation à haute vitesse (20.000 RPM pendant 30 min.) et stérilisée sur une membrane EK 0,22 microns.
Un test biologique est réalisé sur des volumes croissants de cette solution (de 0,05 à 5 μΐ).
B - A 1 litre de la solution de HDGF obtenue ci-dessus (correspondant à 10 millions d'unités d'activité mitogénique), on ajoute 1kg d'élastine soluble (Kappa-élastine SCD) sous forme de poudre stérile. Après homogénéisation de ce mélange maintenu à 4°C, on procède, selon les méthodes conventionnelles, à sa lyophilisation.
Exemples de compositions : 1 - Lotion aqueuse "HDGF + Kappa-élastine SCD" à 10 000 unités mitogéniques/g de
Kappa-élastine............................................... 0,5 g
Essence de lavande........................................... 0,1 g
Eau d'hamamélis.............................................. 10,0 g
Sorbitol à 70Z............................................... 4,0 g
Sel sodique de l’acide éthylènediamine tétracétique.......... 0,1 g
Huile de ricin hydrogénée polyoxyéthylénée à 60 moles d’oxyde d’éthylène................................ 0,3 g
Parahydroxybenzoate de méthyle............................... 0,15 g
Eau distillée........................................q.s.p. 100 g
2 - Emulsion H/E
"HDGF + Kappa-élastine SCD" à 10 000 unités mitogéniques/g de
Kappa-élastine............................................... 1 g
Polyéthylène glycol 400...................................... 3 g
Propylène glycol............................................. 4 g
Triéthanolamine.............................................. 0,6 g
Huile d’amande douce......................................... 2 g
Myristate d'isopropyle....................................... 1 g
Esters d’acides caprique/caprylique et d’alcools gras en C -C1D vendu sous la dénomination de "Cétiol LC-DE0" par la Société HENKEL........................................ 1 g
Alcool cétylique............................................. 3 g
Acide stéarique.............................................. 3 g
Mono et di-stéarate de glycérol non-auto-émulsionnable....... 3 g
Parfum....................................................... 0,1 g
Parahydroxybenzoate de méthyle............................... 0,2 g
Eau..................................................q.s.p. 100 g
3 - Emulsion E/H
"HDGF + kappa-élastine SCD" à 10 000 unités mitogéniques/g de
Kappa-élastine............................................... 2 g
Lanolate de magnésium (à 50% dans l’huile)................... 14,4 g
Alcool de lanoline........................................... 3,6 g
Huile de tournesol.................................... 15 g
Myristate d’isopropyle....................................... 4 g
Vaseline blanche Codex............................... 10 g
Vitamine F................................................... 0,5 g
Acide ascorbique............................................. 0,5 g
Parfum....................................................... 0,8 g
Parahydroxybenzoate de méthyle............................... 0,15 g
Parahydroxybenzoate de propyle............................... 0,15 g
Eau.................................................q.s.p. 100 g
Claims (6)
- 3. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que le HDGF est obtenu selon les étapes suivantes : i) Lavage des hypophyses bovines dans du liquide physiologique, - homogénéisation dans une solution de sulfate d'ammonium contenant des inhibiteurs de protéases, - agitation du broyât, - première centrifugation pour récupérer un premier extrait, - deuxième centrifugation après reprise du premier résidu dans une solution de sulfate d'ammonium contenant des inhibiteurs de protéase pour récupérer le deuxième extrait, ii) Mélange des deux extraits et précipitation, - récupération du précipité, - solubilisation dans une solution de sulfate d'ammonium, - dialyse du surnageant contre du liquide physiologique, - clarification par centrifugation, et - détermination de l'activité "facteur de croissance" de la solution stérile.
- 4. Composition selon l'une quelconque des revendications I à 3, caractérisée par le fait que le HDGF est stabilisé par l'élastine soluble, préalablement à son incorporation à ladite composition, par mélange de l'élastine soluble et d'une solution de HDGF, suivi d'une lyophilisation et d'une stérilisation. 5. ’ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait que le rapport de la solution de HDGF et d'élastine soluble est compris entre 300 et 100.000 unités mitogéniques par gramme d'élastine soluble.
- 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée par le fait que le rapport de la solution de HDGF et d'élastine soluble est compris entre 5.000 et 50.000 unités mitogéniques par gramme d’élastine soluble.
- 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée par le fait qu’elle contient de 5 à 1000 unités mitogéniques par gramme de composition et de préférence de 20 à 100 unités mitogéniques.
- 8. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait qu’elle se présente sous forme d'une lotion, d’une émulsion huile-dans-1'eau ou eau-dans-1'huile d'un gel, d'une crème, d'une pommade, d'un spray aérosol ou de systèmes vésiculaires.
- 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée par le fait qu'elle contient en outre au moins un ingrédient pharmaceutique ou cosmétique pris dans le groupe constitué par un agent conservateur, un parfum, une huile, un alcool, un ester gras ou une vitamine .
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| US6541447B1 (en) | 1999-09-01 | 2003-04-01 | B & M Healthcare Technologies, Inc. | Wound healing composition and method for use thereof |
Family Cites Families (1)
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-
1989
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-
1990
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| FR2654342A1 (fr) | 1991-05-17 |
| FR2654342B1 (fr) | 1992-07-17 |
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