LU82099A1 - Procede de preparation de derives immunoregulateurs de copolymeres de monomeres olefiniques et d'anhydrides polycarboxyliques et nouvelles compositions ainsi obtenues - Google Patents
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Description
4 1.
La présente invention se rapporte à des composés polymères utiles dans la conduite immunorégulatrice de la thérapie des tumeurs.
-.1 Bien que le domaine de la thérapie des tumeurs 5 ait été le sujet d'études importantes, on a trouvé jus-5 qu'à présent très peu de composés efficaces pour cette utilisation.
Selon une voie d'approche, des tentatives sont faites pour manipuler le système d'immunisation de l'orga-10 nisme. Par exemple, on reconnaît généralement que la glande appelée thymus est d'une grande importance dans le développement et la sénescence de la compétence immunologique. Par divers mécanismes dont on croit qu'ils sont principalement hormonaux, la glande appelée thymus exerce 15 un contrôle sur la fonction d'immunisation au moyen ou par l'intermédiaire des lymphocytes T. Un grand nombre de peptides naturels et préparés par voie de synthèse ont été ainsi testés en tant que produits de stimulation et/ou produits supprimant ce système d'immunisation, avec di-20 vers résultats .
D'autres agents dont on a trouvé qu'ils avaient une activité adjuvante pour l'immunisation comprennent,par exemple, le Bacille Calmette-Guérin (BCG), le Corynebacte-.-q rium parvum, le glucane, le lévamisole et la tilorone.
25 Certains de ces composés augmentent la production d'anti-^ corps, alors que d'autres renforcent ou inhibent l'immuni té par l'intermédiaire des cellules.
*s
Divers polyélectrolytes de synthèse biologique-? ment actifs ont également été proposés en tant qu'agents 30 antitumeurs utiles. Ainsi, Regelson et Holland ont trouvé une large gamme d'activités antitumeurs chez les souris pour le sel de sodium de polyéthylênesulfonate . Nature (Londres) 181, 46 (1958). On a trouvé alors qu'un certain nombre de polymères d'acides carboxyliques à poids 35 moléculaire sensiblement élevé, par exemple, l'acide polyacrylique, l'acide polyméthacrylique et un copolymère éthylène-anhydride maléique (EMA) avaient une activité an- 2.
tinéoplastique semblable à celle du polyëthylènesulfonate de sodium. Regelson et collaborateurs, Nature (Londres) 186, 778-80 (1960); Regelson, "Water-Soluble Polymers", - dans "Polymer Science and Technology", Vol. 2 (ed. N.K.
5 Bikales), p. 161-77, Plenum Press, New York, 1973.
; L'activité antinéoplastique des polymères du type EMA est également décrite dans le brevet canadien n° 664.326. On dit que le poids moléculaire utile de ce polymère est compris entre 500 et 1.500,000. On a indiqué ultérieurement 10 qu'un de ces polymères, la semi-amide,semi-sel d'ammonium . de l'EMA, ayant un poids moléculaire moyen de 20.000- 30.000, était chroniquement toxique pour les rongeurs et les chiens, Mihich et collaborateurs, Fed. Proceedings,
Vol. 19, N° 1, Pt. 1, mars 1960. Une toxicité chronique a été 15 ultérieurement indiquée avec le polymère à poids moléculaire de 2.000-3.000 chez les chiens par Mihich et collaborateurs. Fed. Proceedings, Vol. 20, n° 1, Pt. 1, Mars 1961.Ces découvertes de la toxicité s'opposaient à une expérimentation clinique des polymères.
20 Ultérieurement, le copolymère apparenté éther divinylique-anhydride maléique 1 : 2 présentait une activité antitumeur dans des tests conduits par le National Cancer Institute, Breslow, Pure & Appl. Chem. 46, 103-13 (1976). Ce copolymère est également connu sous le nom de copolymère de 25 pyrane ou DIVEMA, et un échantillon bien connu a été désigné - par NSC 46015. L'utilisation de ces copolymères de pyrane en 5 tant qu'agents antitumeurs est également décrite dans les brevets américains n° 3.224.943 et n° 3.794.622, où le poids : moléculaire utile est décrit comme étant compris entre 5.000 30 et 30.000. L'activité antitumeur du copolymère de pyrane a été attribuée à un immunorenforcement ou à un effet sur la réponse d'immunisation par le système réticuloendothélial (RES) par renforcement de la fonction du macrophage dans un certain nombre d'articles qui comprennent, par exemple, les 35 articles suivants ; Breslow, Pure & Appl. Chem. 46, 103-13 (1976); Mohr et collaborateurs, Prog. Cancer Res. Ther. 7, 415-26 *1978;. Schultz et collaborateurs, id. 7, 459-67 3 .
(1978); et Dean et collaborateurs, Cancer Treatment Reports 62, septembre 1978.
Nonobstant la toxicité chronique, préalable-,=· ment indiquée, de divers polymères de type EMA, à poids 5 moléculaire supérieur, une étude par recherches a été réa- ? Usée par la demanderesse pour évaluer encore des polymères de ce type général afin de déterminer l'activité immunoré-gulatrice. On a institué de nouvelles voies d'approche et de nouveaux procédés d'évaluation , qui permettaient de recon-naître l'activité immunorégulatrice sans cytotoxicité simultanée. Par suite, on a trouvé que certains de ces composés évalués plus récemment n'avaient pas d'activité cytotoxique directe, et on a cependant trouvé de manière surprenante et inespérée qu'ils étaient très efficaces contre les métasta-15 ses de tumeurs et la récurrence ou le retour de tumeurs après excision ou enlèvement de la tumeur en masse. Ainsi, ces composés sont indiqués comme étant particulièrement utiles pour la conduite de la thérapie des tumeurs par un mécanisme immunologique. Ils sont utiles pour empêcher la rëcur-20 rence ou le retour des tumeurs ou le développement des métastases par administration après excision ou enlèvement de la tumeur en masse par chirurgie, rayons X ou chimiothérapie cytotoxique.
Ά Selon la présente invention, la demanderesse a 25 synthétisé un nouveau groupe de composés du type général EMA, indiqués précédemment, qui sont efficaces contre les métastases dues aux tumeurs et contre la récurrence ou le retour de tumeurs chez les mammifères,même s'ils manquent de forte ? activité antitumeur principale. Ces composés sont des copo- 30 lymères de monomères oléfiniques, ayant 2 à environ 4 atomes de carbone, et d'anhydrides polycarboxyliques a,β-insaturés ayant 4 à environ 6 atomes de carbone, ayant un poids moléculaire moyen d'environ 300 à environ 1.500 et dont on réalise des dérivés pour qu'ils contiennent une fonction semi-35 amrde, semi-sel constituée de carboxylates et une fonction imide où cette fonction imide comprend environ 5 % à environ 40 % de cette fonction obtenue par des dérivés. Des exem- 4 .
pies à titre d'illustration des monomères oléfiniques sont l'éthylène, le propylène et l'isobutylène? des exemples à titre d'illustration de ces anhydrides polycarboxyliques sont l'anhydride maléique, l'anhydride citraconique et 5 l'anhydride aconitique. Parmi ces composants monomères, ' l'éthylène et l'anhydride maléique sont préférés.
Dans des buts d'illustration et non pas de limitation, le copolymëre préféré d'éthylène et d'anhydride maléique tel que dérivé de manière appropriée, peut être re-]_q présenté comme ayant les unités ou les groupes structuraux suivants : (a) semi-amide, semi-sel constitué de carboxy- late ^~CR2—CH2—CH—CH—
15 i I
0=C C=0 nx2 o"y+ et (b) imide 2o —CH2~—CH2—CH CH— 0=C C=0 \/
N
S Z
25 - où X = H ou groupe alkyle en C^_^, et de préfé rence H, % Y = H, ammonium ou un cation métallique phar- , maceutiquement acceptable, et de préférence ammonium; et 30 Z = H, groupe alkyle en C^_^, ammonium ou cation métallique pharmaceutiquement acceptable, et de préférence H.
Les unités ou les groupes (a) et (b) respectifs sont distribués le long d'une molécule à atomes de carbone, continue, sensiblement linéaire. Environ 5 % à environ 40 % de ces unités doivent être des imides, le complément étant 35 5 .
principalement des unités semi-amides, semi-sels constitués de carboxylates. Ces unités peuvent être placées au hasard dans la chaîne et/ou au hasard dans le polymère. On appréciera qu'une petite partie (dont on croit qu'elle est 5 inférieure à 10 %) de groupes carboxyl-monoammonium ou autres groupes salins pharmaceutiquement acceptables et/ou des groupes dicarboxyles peuvent être également présents, comme cela peut se produire par suite de l'anhydride n'ayant pas réagi ou ayant réagi partiellement durant la préparation de 10 ces composés.
Parmi les groupes précédents dont on a formé des dérivés, le groupe (a) semi-amide, semi-sel constitué de carboxylate est de préférence la semi-amide, semi-sel d'ammonium , et (b) le groupe imide est de préférence une imide 15 non substituée.
De nouveau/ à titre d'illustration et non pas de limitation, le copolymère préféré d'éthylène et d'anhydride maléique, tel que dérivé de manière préférable, peut être représenté comme ayant les unités ou groupes structuraux 20 suivants : (a) semi-amide, semi-sel d'ammonium : -CH „-CH~--CH-CH-
II
o=c c=o
25 I I
NH„ 0_NH.+ 2 4 et (b) imide non substituée 30 —CH2—CH^—CH—CH— 0=C C=0 \/
N
H
1_ _ 35 Comme précédemment, les unités ou les groupes respectifs (a) et (b) sont distribués le long de molécules à atomes de carbone, continues, sensiblement linéaire. Environ 6.
5 % à environ 40 % de ces unités sont de préférence une imide non substituée, le complément étant principalement les unités préférées de semi-amide, semi-sel d'ammonium. Ces uni-.·=· tés peuvent être placées au hasard à l'intérieur de la chaî- 5 ne, ou au hasard dans le polymère. On appréciera qu'une petite partie (dont on croit qu'elle est inférieure à 10 %) de groupes monoammoniumcarboxyles ou de groupes dicarboxyles peut être présente telle qu'elle peut provenir d'anhydride n'ayant pas réagi ou d'anhydride ayant partiellement réagi ]_q durant la préparation de ces composés.
Les agents polymères d'immunorégulation de la présente invention sont également de préférence solubles dans l'eau.
La présente invention est en outre illustrée par 15 les dessins ci-joints dans lesquels :
La figure 1 représente la région d'empreinte du spectre d'absorption dans l'infrarouge d'un polymère représentatif de la présente invention dont on forme un dérivé pour qu'il contienne 20 % d'imide (voir exemple 3, tableau 2o IV, essai 5, ci-dessous);
La figure 2 représente, dans des buts de comparaison, la région d'empreinte du spectre d'absorption dans l'infrarouge d'un polymère correspondant qui contient 0 % d'imi-=>. de (voir exemple 2 (a) ci-dessous); et 25 La figure 3 représente, dans des buts de comparai- % son, la région d'empreinte du spectre d'absorption dans l'infrarouge d'un polymère correspondant dont on forme un dérivé pour qu'il contienne 100 % d'imide (voir exemple 5 ; ci-dessous).
3q Bien que le brevet canadien n° 664.326 décrive l'utilisation des semi-amides, semi-sels d'ammonium des copolymères de type EMA, ou l'utilisation d'imides ou de dérivés partiellement transformés en imides de copolymères de type EMA pour l'activité antinéoplastique, on croit que les poly-35 mères spécifiques de la présente invention ayant la combinaison de (a) la fonction semi-amide, semi-sel constitué de carboxylate et (b) la fonction imide dans les proportions dé- 7 .
finies ici, et ayant un poids moléculaire moyen relativement faible d'environ 300 à environ 1.500 sont nouveaux.
Ces bouveaux polymères ont des propriétés non évidentes et utiles d'immunorégulation qui ne sont pas présentées par les 5 polymères correspondants ayant seulement la fonction (a) ou seulement la fonction (b) ou ayant un poids moléculaire sensiblement supérieur. Egalement, à titre de comparaison, on a décrit que les fragments monomères correspondants de ces polymères, à savoir la succinimide et l’acide succinamique 10 (anhydride succinique ammonié) préalablement ne présentaient - pas d'efficacité importante d'inhibition de tumeurs, Regelson et collaborateurs, Nature (Londres), 186, 778-80 (1960).
Les copolymères à faible poids moléculaire, non transformés en dérivés, qui sont utilisés pour préparer les 15 agents désirés d'immunorégulation de la présente invention peuvent être préparés par des procédés bien connus comme décrit, par exemple, dans les brevets américains n° 2.857.365, n° 2.913.437, n° 2.938.016 et n° 2.980.653. Typiquement, l'oléfine, par exemple,1'éthylène, est mise à réa-20 gir avec l'anhydride polycarboxylique, par exemple l'anhydride maléique, à des températures allant d'environ 40°C à environ 100°C en présence d'un catalyseur favorisant la formation de radicaux libres et d'un solvant liquide qui est ^ un solvant pour les produits réagissants et un non solvant 25 pour 1'interpolymère formé. Des catalyseurs de polymérisa tion classiques, favorisant la formation de radicaux libres, du type peroxyde et du type azoïque, sont éminemment convenables dans ce but, et le peroxyde de benzoyle, par exemple, : est préféré. Des solvants inertes, tels que le benzène, les 30 halobenzênes,et les haloparaffines,sont des solvants utiles pour la réaction de polymérisation. Cependant, un hydrocarbure aromatique alkylé ayant au moins un hydrogène en a , tel que par exemple 1'éthylbenzêne, 1'isopropylbenzène, le diiso-propylbenzène, le toluène ou le xylène, est un milieu ligui-35 de préféré pour la réaction de polymérisation dans le but de réduire le poids moléculaire du copolymère produit, comme décrit dans le brevet américain n° 2.913.437.
8 .
L1éthylbenzène est spécialement préféré comme milieu liquide dans ce dernier but. Le copolymère contient de préférence des quantités sensiblement équimolaires du reste - oléfinique et du reste d'anhydride, tel qu'on en obtiendra 5 par l'utilisation de quantités à peu près équimolaires des monomères réagissants. Le copolymère produit résultant est obtenu sous forme solide et est facilement récupéré par filtration, centrifugation et autres modes opératoires semblables de séparation.
10 On appréciera que l'initiateur à radicaux libres, * à la fois par amorçage de la réaction de polymérisation et par terminaison ultérieure ou télomérisation avec le milieu liquide d'hydrocarbure aromatique alkylé, provoquera l'introduction de diverses parties organiques dans la structure de polymère. Le pourcentage de ces parties dans la composition totale de polymère augmentera lorsque le poids moléculaire du polymère sera diminué. Par exemple, l'utilisation de peroxyde de benzoyle comme initiateur à radicaux libres et d'éthylbenzène comme milieu réactionnel liquide provoqueront 2o l'introduction de leurs parties aromatiques respectives dans la structure polymère. Ces parties constitueront un pourcentage supérieur de la structure totale des polymères ayant un poids moléculaire d'environ 300 par rapport aux polymères ^ ayant un poids moléculaire d'environ 1.500.
25 On reconnaîtra en outre que, dans la préparation s de ces copolymères à faible poids moléculaire, une certaine quantité d'agent de réticulation peut être incorporée dans le copolymère pour rendre ainsi le produit insoluble dans l'eau.
- Des exemples de ces agents de réticulation sont des esters 30 vinyliques et des esters allyliques, spécialement les acryla-tes et les crotonates comme décrit dans le brevet américain n° 3.165.486. Les copolymères peuvent être également insolu-bilisés après transformation en dérivés, par divers moyens tels que, par exemple, la réticulation avec une diamine, com-35 me décrit dans le brevet américain n° 3.554.985, ou par fixation sur des supports tels que la bentonite, des particules de latex ou des érythrocytes.
4 9.
Il est bien connu que des dérivés amidés des copolymères de type EMA peuvent être préparés par réaction du copolymère avec de l'ammoniac gazeux à des températures ordinaires ou à des températures élevées, comme décrit dans g le brevet canadien n° 664.326 et dans les brevets améri-7 cains n° 2.883.287 et n° 3.157.595. On sait également que la réaction aux températures supérieures tend à favoriser la formation d'imide, alors que la réaction dans des milieux de solvants liquides organiques inertes, tels que le benzène, peut être utilisée pour contrôler la température de réac-* tion et retarder la formation d'imide. Un autre procédé con nu pour la formation d'amide comprend la réaction du polymère dans de l'ammoniac liquide à -33°c.
Alors que les modes opératoires mentionnés précé-demment sont généralement utiles pour la préparation de la semi-amide, semi-sel d'ammonium, comme étape intermédiaire pour la préparation des dérivés contenant des groupes imides, ils présentent des défauts provenant d'un effet de diffusion d'ammoniac, au cours du temps, dans le noyau intérieur des 20 particules d'EMA dans les buts de la présente invention, comme décrit dans l'exemple 2 ci-dessous. Un procédé préféré dans les buts de la présente invention consiste d'abord à dissoudre le copolymère de type EMA dans l'acétone, suivi ~ de réaction du polymère dissous avec de l'ammoniac liquide dans l'acétone. Le produit désiré, constitué de semi-amide, 3 semi-sel d'ammonium, précipite dans la solution et peut être alors facilement récupéré par filtration, centrifugation et autres modes opératoires semblables de séparation comme il-: lustré en outre dans l'exemple 2, parties a, b et c ci-des- 2q sous. La figure 2 des dessins ci-joints représente le spectre dans l'infrarouge du produit de l'exemple 2(a) constitué de la semi-amide, semi-sel d'ammonium, qui contient 0 % d'imide.
La préparation du dérivé désiré contenant des grou-pes imides peut être alors réalisée par réaction de l'inter-médiaire, constitué de la semi-amide, semi-sel d'ammonium avec de l'ammoniac pour transformer encore en dérivé le co- 10.
polymère afin qu'il contienne (a) des groupes semi-amides, semi-sels d'ammonium et (b) des groupes imides où ces groupes imides forment environ 5 % à environ 40 % en poids des groupes transformés en dérivés et, de manière faculta-5 tive, en transformant le groupe de semi-sel d'ammonium en d'autres groupes salins pharmaceutiquement acceptables. La réaction est conduite dans des milieux de solvants organiques convenables tels que, par exemple, le toluène ou le xylène, à des températures de reflux jusqu'à ce que le pour-2_q centage souhaité du dérivé d'imide soit formé, comme illustré en outre dans les exemples 3 et 4 ci-dessous. Des températures de reflux peuvent varier entre environ 50°C et environ 200°C, de préférence d'environ 60°C à environ 150°C et, de préférence encore, de 100°C à 150°C.
]_5 La figure 1 des dessins ci-joints montre le spectre dans l'infrarouge d'un exemple représentatif (exemple 3, tableau IV, essai 5) du polymère désiré qu'on transforme en dérivé pour qu'il contienne (a) la fonction semi-amide, semi-sel d'ammonium et (b) la fonction imide, et où 1'imide 2o constitue 20 % de cette transformation en dérivé. Le polymère de cet exemple a un poids moléculaire moyen d'environ 850 et les 20 % d'imide se trouvent dans la gamme préférée d'environ 10 % à environ 25 % d'imide.
~ Dans des buts de comparaison, un dérivé constitué 25 totalement par 100 % d' imide du copolymère d'EMA a été éga-~ lement préparé comme illustré dans l'exemple 5 ci-dessous.
La figure 3 des dessins montre le spectre dans l'infrarouge de ce polymère.
Une description détaillée de l'analyse dans l'infra-30 rouge pour l'identification des divers groupements fonctionnels indiqués précédemment, telle qu'illustrée dans les figures 1 à 3, est présentée ci-dessous, après l'exemple 1.
Pour démontrer l'efficacité des polymères de la présente invention dans la conduite immunorégulatrice de la 35 thérapie des tumeurs, des exemples représentatifs des polymères ont été soumis à divers tests comme suit :
Dans une série de tests, les polymères ont été tes- 11.
tés dans un modèle de tumeur pour souris sans métastase, induite par virus. Le modèle utilisé était le fibrosarcome induit par virus SV40 (m KSA) à origine souris BALB/c syngénéi-que. Cette tumeur murine, mKSA-TU5, a été fournie par le pro-5 cédé de Kit et collaborateurs : Int. J. Cancer 4, 384-392 (1969) et sa régression n'est pas connue dans les souris BALB/c syngénéiques. Dans cette série de tests, les régressions des tumeurs observées ont été reliées à 1'immunosti-mulation et à la réduction de la charge de tumeur en accord •j_q avec Dean et collaborateurs Int. J. Cancer, 16, 465-475 * (1975) qui ont démontré que le mKSA possédait des antigènes associés aux tumeurs et que, dans les animaux portant de petites tumeurs, il y avait une bonne corrélation avec l'immunité par l'intermédiaire des cellules. Les souris ont été traitées avec trois doses différentes du composé expérimental avant ou après ou à la fois avant et après le test avec des cellules de tumeurs viables à une dose DT2.00 e*" ^ Une dose DTr^. La croissance des tumeurs a été alors évaluée dü dans les animaux traités par rapport aux souris de contrôle 2o normales non traitées. Dans cette série de tests, les polymères de la présente invention, ayant un poids moléculaire moyen d'environ 850, présentaient une activité de régression des tumeurs sensiblement plus importante que les polymères correspondants à poids moléculaire de 2.000-3.000 et à poids 25 moléculaire de 20.000-50.000.
Dans une autre série de tests, des polymères représentatifs de la présente invention ont été testés dans un modèle de tumeur de rat à formation de métastases, induites chimiquement. Le modèle utilisé était une tumeur de la vessie, 3q induite par le 3-méthylcholanthrène (BLCA) dans des rats dits Fischer 344,Prehn. R.T. et collaborateurs, J. Nat. Can. Inst. 18, 769 (1957) et Falk. R. et collaborateurs, Surgery, Octobre (1978). Les cellules de tumeur avaient été passées dans la culture de cellule pendant cinq ans et, après implanta-35 tion sous-cutanée (SC), on savait qu'elles formeraient des métastases pour les poumons au bout d'une semaine d'implantation. Le temps ordinaire de survie après l'implantation des 12.
tumeurs sous-cutanées est de trois semaines ou moins.
Dans une partie de ces tests dans le modèle de tumeurs pour rats avec formation de métastases, le polymère ** expérimental a été administré périodiquement par interval- 5 les à peu près hebdomadaire pendant trois semaines après ' l'implantation des tumeurs. Ces animaux traités avaient un taux de survie supérieur à trois fois celui des animaux de contrôle non traités et aucune croissance de métastases n'a été notée durant les six semaines d'observation.
10 Dans une autre partie de ces tests dans le modèle , de tumeurs pour rat, avec formation de métastases, le poly mère expérimental a été administré sous forme d‘un produit auxiliaire ou complément à l'excision de tumeurs au bout de 7-10 jours après l'inoculation de tumeurs. Les animaux trai-15 tés ont été observés pour déterminer la récurrence ou le retour des tumeurs après excision par rapport aux animaux de contrôle non traités. Dans les animaux de contrôle, la récurrence ou le retour des tumeurs était de 100 % en six semaines après la nouvelle section, avec un temps moyen de 20 32 jours, alors que, dans les animaux traités avec des poly mères préférés de la présente invention,à la dose de 30 mg/ kg, il n'y avait pas de récurrence durant les six premières semaines et, après dix semaines, la récurrence des tumeurs ^ a été vue pour seulement 13 % des animaux.
25 Dans une autre série encore de tests, des polymè- res représentatifs de la présente invention ont été testés dans des rats normaux de souche dite Lewis et on a trouvé qu'ils stimulaient les réponses d'immunisation, comme cela est mis en évidence par une augmentation de la production 30 d'anticorps.
D'autres tests encore dans des rats normaux de souche dite Lewis présentaient une activation des cellules B par des polymères représentatifs de la présente invention dans la présence de cellules T, en indiquant ainsi l'utili-35 sation de ces polymères comme remplacement de la fonction du thymus. Les cellules T sont des lymphocytes provenant du thymus , alors que Les cellules B sont des lymphocytes qui 13.
se différencient dans l'équivalent des bourses ou dans la moelle des os.
Une autre expérimentation dans des rats normaux ^ de souche dite Lewis pour l'augmentation des macrophages 5 du péritoine et de l'activité de phagocytose de latex des macrophages a indiqué que l'effet d1immunorégulation de ces polymères sur l'activité des cellules B n'est pas produite par stimulation de l'activité des macrophages. Les polymères de la présente invention semblent ainsi fonctionner différem-10 ment des copolymères de pyrane apparentés, de la technique , antérieure, qui agissent par l'intermédiaire du RES en aug mentant la fonction de macrophage.
Une description détaillée des tests mentionnés précédemment et d'autres tests encore et les résultats corresponds dants sont présentés dans les exemples 8 à 23 ci-dessous.
En général, les polymères de la présente invention peuvent être administrés à un hôte suivant une quantité efficace immunorégulatrice comme produit auxiliaire ou complément à la chimiothérapie des tumeurs, à la thérapie par 20 rayonnement pour les tumeurs et/ou à l'excision des tumeurs. En tant qu'auxiliaires ou compléments dans la conduite de la thérapie des tumeurs, ils peuvent être administrés à peu près au même moment que cette thérapie, ou dans une période de 5 temps appropriée avant ou après cette thérapie. Généralement, 25 cette période serait dans les deux jours précédant immédiatement et dans la période d'un mois suivant immédiatement cette thérapie. Des études indiquent que l'élimination d'un polymère préféré, soluble dans l'eau, de la présente invention se * produit à peu près en 30-60 jours, et on prévoit ainsi que 30 l'administration de doses de renforcement du polymère peut être prévue à peu près toutes les six semaines.
Les polymères peuvent être administrés par voie parentérale ainsi que par voie orale en quantités allant, par exemple,d'environ 1 à environ 100 mg par kg de poids cor-35 porel. Ils peuvent être administrés à la fois par voie intraveineuse et intrapéritonéale, de préférence dans une solution aqueuse telle que de l'eau stérile ou une solution saline.
14 .
Oralement, ils peuvent être administrés sous forme de tablettes, de poudres, de capsules, d'élixirs et d'autres formes de doses analogues, mélanges avec des produits solides " et liquides courants, constitués par des supports, des 5 agents de mise en suspension et des adjuvants tels que, par exemple, l'amidon de mais, le lactose, le talc, l'acide stéarique, le stéarate de magnésium, la gélatine, les gommes d'acacia et les gommes de caroube, l'alcool, l'eau, le diméthylsulfoxyde (DMSO), des huiles végétales et d'auto très matières semblables. La forme de dose orale est de pré-„ férence un solide reconstitué dans un mélange de liquides convenables au moment de l'administration, afin de maintenir la stabilité des deux groupements constitués par (a) la semi-amide, semi-sel constitué de carboxylate et (b) l'imi-2_5 de. D'autres doses convenables des polymères pour produire un effet désiré d'immunorégulation peuvent être déterminées en se référant aux exemples spécifiques présentés ci-après. Une forme de dose préférée d'administration du polymère est dans une solution saline physiologique.
20 Bien que les exemples détaillés suivants illustre ront encore la présente invention, on appréciera que cette invention n'est pas limitée aux exemples spécifiques. Dans tous les exemples, le rendement en pourcentage est un rende-^ ment en pourcentage par rapport à la théorie, en se basant 25 sur le produit récupéré.
? EXEMPLE 1
Préparation de 11 EMA
Le copolymère éthylène/anhydride maléique (EMA), = en tant que matière première désirée, a été préparé dans un 30 réacteur en acier inoxydable chauffé, de 3,8 litres, pourvu d'un serpentin de refroidissement interne par l'eau, d’un agitateur entraîné magnétique, fonctionnant de manière optima à 1.000-1.200 tours par minute, d'une entrée d'éthvlène et d'une entrée par laquelle du catalyseur supplémentaire 35 pourrait être ajouté dans la solution pressurisée par l'éthylène. Des échantillons pourraient être retirés ou le contenu final vidé par l'intermédiaire d'un orifice au 15.
fond. Un équipement auxiliaire pour le contrôle du chauffage et du refroidissement a été prévu. Dans un essai typique, la charge dans le réacteur se composait de 1.625 g (1.875 ml) d'éthylbenzène, de 190 g (1,94 mole) d'anhydride maléique et 5 de 14,1 g (0,058 mole) de peroxyde de benzoyle dissous dans 80 g (92 ml) d'éthylbenzène. Le récipient du catalyseur a été lavé dans le réacteur avec 20,0 ml supplémentaires d'éthylbenzène. Le réacteur a été fermé et balayé sous pression deux fois avec de l'éthylène à la température ambiante 10 pour déplacer l'air dans le dispositif. Ensuite, la température a été amenée à 70°C et maintenue à cette valeur avec 2 une pression d'alimentation d'éthylène de 14 kg/cm pendant la durée de la polymérisation. Après trois heures de polymé- 2 risation à 70°C et sous une pression d'éthylène de 14 kg/cm , 15 on a réalisé une addition de 9,4 g (0,039 mole) de peroxyde de benzoyle dans 60 g (70 ml) d'éthylbenzène, par la canalisation d'addition de catalyseur, suivi d'un lavage de cette entrée avec 20 ml d'éthylbenzène. L'agitation avec chauffa- 2 ge à 70°C et avec une alimentation d'éthylène sous 14 kg/cm 2o a été alors poursuivie pendant 14 heures supplémentaires pour achever la polymérisation. A la fin de l'essai, le réacteur a été refroidi et mis en communication avec 11 atmosphère,et le contenu se composait d'une boue, dans 1'éthylbenzène, du ~ copolymère produit éthylène/anhydride maléique (EMA) et 25 d'une petite quantité de l'EMA produit lustré sur l'agita-- teur, les serpentins de refroidissement et les surfaces du réacteur. Cette boue a été filtrée,après combinaison avec la matière lustrée retirée par grattage, et la transforma-• tion de l'anhydride maléique a été déterminée sur le filtrat 30 par titrage par NaOH jusqu'au point de virage à la phênol-phtaléine.
Le traitement du produit total en EMA se composait de filtration, d'extraction de la boue trois fois (1 heure à chaque fois) avec 2 litres de xylëne à la température ambiante, suivie de trois extractions (1 heure à chaque fois) avec 2 litres 3 5 16.
d'hexane et d'une extraction finale. La filtration a été employée entre toutes les étapes d'extraction. Le produit en EMA final a été séché sous vide toute la nuit avec le vide total d'une pompe à huile à 55-60°C. Le produit en 5 EMA ainsi séché a été pulvérisé dans un mélangeur dit Waring pendant 5 minutes, pour réduire la partie peu importante de la matière lustrée a une consistance de poudre. Le tableau I résume les résultats obtenus sur sept polymérisations consécutives de l'EMA.
10 TABLEAU I
,_|_|________!_|-4
Es- Trans- Récupération % d'hy- % de Viscosité Poids sai forma- du produit drogène carbo- spécifi- équi- n° tion en EMA,g (% (1) ne (1) que,solu- va- d'anhy- de rendement) tion à 1% lent dride dans la (3) maléi- diméthyl- que,% formamide (DMF) à ___________25°C (2)__ A 91,5 185 (68,8) ' 4,98 57,34 0,064 138,5 B 98,6 227 (83,6) 5,03 58,11 0,068 139,9 2o C 98,3 223 (82,1) 5,10 58,15 0,063 140,0 D 98,3 219 (81,1) 4,04 58,24 0,066 139,1 E 97,9 223 (81,7) 5,10 57,89 0,063 140,6 F 97,9 225 (81,9) 5,12 58,14 0,061 141,5 G 98,6 [224 (82,4)__5,11 )58,05 0,064 140,1 25 (1) Moyenne de deux déterminations = (2) Sensiblement selon le mode opératoire ASTM D-2515-74, viscosimètre d'Ostwald (3) Poids en grammes contenant une unité molaire d'anhydride, déterminé par titrage potentiométrique de pH de la solu-30 tion aqueuse avec NaOH standard
Les paramètres de poids moléculaires ont été déterminés sur l'EMA produit en utilisant la préparation F ci-dessus en tant que produit typique. La matière a été séchée sous vide pendant 24 heures à 100°C en utilisant le vide 35 d'une pompe à huile. Les paramètres ont été déterminés dans la diméthylformamide sèche (DMF). Pour la préparation F, le 17.
poids moléculaire moyen en nombre (M^) a été déterminé comme étant de 852 en utilisant l'osmométrie par tension de vapeur dans la DMF à 120°C en employant un osmomètre dit Knauer VP. Le poids moléculaire moyen en poids (M ) a été 5 déterminé comme étant de 5.730 en utilisant la dispersion de la lumière fournie par un laser à petit angle, de nouveau dans la DMF, en employant un instrument dit Chromatix KMX-6. La viscosité intrinsèque dans la DMF à 25°C a été mesurée par viscosimétrie d'un capillaire en utilisant un 10 viscosimètre à dilution dit Cannon Ubblehode (dimension 75) par extrapolation de quatre concentrations différentes à la concentration de zéro. La viscosité intrinsèque de la préparation F a été trouvée à une valeur de 0,0607 dl/g.
Des déterminations semblables de Μ , M et de n p
15 la viscosité intrinsèque ont été réalisées de manière identique en utilisant une préparation d'EMA à viscosité spécifique supérieure (0,11, 1 %, DMF, 25°C) . Dans ce cas, la viscosité intrinsèque a été trouvée à une valeur de 0,1227 dl/g, M
était 2.264 et M était 12.970.
P
20 En utilisant les valeurs indiquées ci-dessus pour deux produits en EMA à diverses viscosités spécifiques,les constantes K et a dans l'équation standard, reliant la viscosité intrinsèque ([η]) au poids moléculaire [η]=ΚΜσ ont été déterminées.
25 Les relations trouvées étaient : :· DMF —4 0,72 [η]°50 = 4,71 x 10 4 Mn et r ηDMF , C1 ._-5 0,86 [η] 25o = 3,51 x 10 Mp L'expression "poids moléculaire moyen”, telle 30 qu'utilisée ici par rapport aux copolymères indiqués de la présente invention, est définie comme étant le poids moléculaire moyen en nombre.
Identification des groupes fonctionnels L'identification des divers groupements fonctionnels 35 pour tous les exemples de dérivés polymères,à la fois quantitative et qualitative, a été réalisée par analyse dans l'infrarouge en utilisant un spectrophotomëtre dit Beckman IR-12.
18 .
La préparation d'échantillons, les attributions de fréquences de (capacité d')absorption et les modes opératoires pour déterminer le rapport groupes imides/groupements amides ont suivi les modes opératoires présentés dans "The Infra-red 5 Spectra of Complex Molécules", Bellamy, John Wiley and - Sons, 1960, ou dans "Practical Infra-red Spectroscopy",
Cross, Butterworth, 1964. La préparation des échantillons, dans tous les cas, utilisait des disques comprimés de 2 mg de polymère peur 250 mg de composition de KBr sec avec 70 10 mg de polymëre/KBr mélangés par disque. Les positions des bandes d'absorption sont indiquées en unités de nombre d'onde qui sont exprimées en inverses des centimètres (cm ) , ordinairement dénommées fréquences de bandes.
Pour la "formation d'empreinte" qualitative de la 15 composition des produits sous forme de présence ou d'absence de certains groupes, les attributions suivantes de fréquences de bandes sont acceptées et ont été utilisées :
Nombre d'ondes Fonction ( cm“'·*·) 20 1. Anhydride cyclique pentago nal
Doublet : 1870-1830 peu Allongement important C=0 1800-1760 impor- - tant 25 2. Acide aliphatique non dissocié (COOH) : 1725-1700 Allongement C=0 3. Noyau pentagonal d'imide polymère 1715 important Allongement
Doublet : 1770 peu im- C=0 portant 30 4. Amide primaire polymere :
Bande amide-I 1670 important Allongement 1620 peu im- C=0 portant Déformation
NH
et allongement C-N 35 5. Ion carboxylate CO- 1560-1570 Allongement z asymétrique 6. Méthylène -CH^- 1470-1450 Déformation 19.
C-H
7. Sel d'ammonium (NH4 + ) 1405-1400 Allongement de carboxylate symétrique (l'intensité dépend de la nature du cation) 5 8. Polymères à concentration élevée de groupes imides (plus de 50 %) contien- 1180-1200 Allongement
nent également important C-N
un doublet : 1370-1359 en plus de ceux indiqués peu impor- en 3 ci-dessus tant 10 Pour l'estimation quantitative de la teneur en imi- de/amide d'un polymère contenant les deux groupes, en plus de la fonction carboxylate d'ammonium, le rapport entre l'intensité de la (capacité d')absorption de la bande d'imide principale à 1.715 cm et celle de la bande d'amide primaire prin-15 cipale à 1.670 cm ^ a été déterminé. La teneur en imide a été déterminée en comparant le rapport mesuré imide/amide (indiqué ci-dessus) à une courbe standard du pourcentage d'imide en fonction du rapport de capacité d'absorption imide/amide préparé à partir d'une série de tracés dans l'infrarouge ob-20 tenus en mélangeant des quantités croissantes d'imide pur (environ 100 %)(décrit dans l'exemple 5) avec un polymère ne contenant pas d'imide ou de COOH non ionisé mais avec seulement des fonctions amide et carboxyle ionisé (décrites dans l'exemple 2) .
25 Pour ce dernier test du rapport imide/amide, on a ^ pris soin de s'assurer que le carboxyle non ionisé n'était pas présent à 1.715 cm ^ en dissolvant d'abord l'échantillon dans l'eau, en réglant le pH à 10,0 avec de l'ammoniaque et en séchant par congélation pour transformer tout le COOH non 30 ionisé en carboxylate d'ammonium. Ces modes opératoires augmentent l'intensité des bandes de carboxylates à 1.560 et 1.400 cm 1 mais assurent que la bande restant à 1.715 cm 1 est en fait d'origine imidigue.
Dans tous les exemples suivants, les références à 35 la présence ou à l'absence de groupes fonctionnels et à la teneur en imide de polymères contenant des groupes imides sont réalisées sur la base de la présence ou de l'absence des at- 20.
tributions de bandes fonctionnelles indiquées ci-dessus et du procédé indiqué ci-dessus pour l'estimation des rapports d'intensités quantitatives des bandes imide/amide.
EXEMPLE 2 5 Préparation de la semi-amide,_semi-sel formé de COQ d'ammo nium de l'EMA (AEMA)
Les procédés précédents pour l'ammoniation de polymères d'EMA (décrits dans le brevet américain n° 3.157.595 et dans le brevet canadien n° 664.326) par l'un ou l'autre 10 des trois procédés : (1) ammoniation à sec avec de l'ammoniac gazeux aux températures ordinaires en aspergeant de l'ammoniac dans une poudre d'EMA sèche, vigoureusement agitée, (2) aspersion de l'ammoniac dans une boue agitée de poudre d'EMA dans le benzène ou dans l'hexane, ou (3) par ad-15 dition directe de poudre d'EMA solide à un excès agité d'ammoniac liquide pour fournir la semi-amide, semi-sel constitué de carboxylate d'ammonium de l'EMA se sont révélés déficients pour l'utilisation actuelle. Cet aspect déficient est relié à l'effet de diffusion substantielle de 1'ammo-20 niac, en fonction du temps, dans le noyau intérieur des parties d'EMA même finement broyées. Même avec un temps de réaction prolongé, les produits en amide-sel d'ammonium ainsi préparés contiennent toujours des quantités résiduelles d'anhydride n'ayant pas réagi, s'approchant de 5 % en 25 poids, comme cela est mis en évidence par la présence de bandes d'absorption d'anhydride aux fréquences de 1.780 et 1.850 cm ^.
Le procédé préféré suivant a été mis au point pour pallier les longues périodes de réaction et le mauvais con-30 trôle de température avec la formation de produits qui ne contenaient pas de fonction anhydride.
(a) Le polymère d'EMA provenant de l'exemple 1-F (80 g) a été dissous dans 800 ml d'acétone (qualité AR) et cette solution a été ajoutée pendant une période de 20 35 minutes à une solution agitée de 100 ml d'ammoniac liquide dans 3 litres d'acétone à -70°C (bain d'acétone-glace sèche). Après la période d’addition de 20 minutes, on a laissé le 21.
mélange total s'échauffer peu à peu jusqu'à la température ambiante (4 heures) et, durant ce temps, la couleur du produit précipité passait d'un jaune initial au blanc. Le produit a été filtré et transforme en boue successivement 5 deux fois avec 2 litres d'acétone, suivi de deux formations de boue avec 1,5 litre du mélange acétone/hexane 50/50. Toutes les étapes de transformation en boue ont duré chacune 30 minutes. Le produit final a été filtré et séché toute la nuit à 45°C sous 20-25 mm Hg de vide. Le produit séché a été 10 dissous dans 900 ml d'eau, filtré à travers un filtre de 0,45 micron, et séché par congélation pour fournir 98,7 g (rendement 100 %) de semi-amide, semi-sel d'ammonium carboxy-le (carboxylate d'ammonium).
(b) Le mode opératoire (a) ci-dessus a été répété 15 comme suit en utilisant un polymère d'EMA provenant de l'exemple 1-F mais avec de l'eau ajoutée à la solution d'EMA d'origine dans l'acétone. L'EMA (60 g) a été dissous dans 500 ml d'acétone plus 2,32 g d'eau et la solution a été chauffée au reflux pendant 2 heures. La solution d'EMA,dans 20 l'acétone refroidie, a été ajoutée avec agitation pendant une période de 10 minutes à 2 litres d'acétone contenant 3 moles d'ammoniac liquide à -60°C. Comme auparavant, on a laissé la boue réactionnelle s'échauffer jusqu'à la température ambiante, et on l'a traitée comme ci-dessus avec 2 25 transformations en boue dans 1,5 litre d'acétone et une transformation en boue avec 1 litre d'hexane, on l'a filtrée et on l'a séchée sous vide avec 40°C sous 20-25 mm Hg toute la nuit. Le produit séché récupéré était en quantité de 84 g, ce qui est supérieur à un rendement de 100 %.
30 (c) Une troisième préparation a utilisé un polymè re d'EMA provenant de l'exemple 1-G. 100 g (0,714 mole) d'EMA ont été chauffés au reflux pendant 2 heures dans 700 ml d'acétone contenant 3,85 g d'eau. La solution acétonique refroidie a été ajoutée pendant une période de 10 minutes à 35 une solution agitée de 3,3 litres d'acétone contenant 60 ml d'ammoniac liquide à -50°C. Après une heure à -50°C, on a laissé la boue réactionnelle s'échauffer jusqu'à la tempéra- 22.
ture ambiante (2 heures). Le produit filtré a été transformé en boue deux fois dans 2 litres d'acétone (30 minutes chaque fois) et 2 fois dans 2 litres d'hexane (30 minutes chaque fois), filtré et séché toute la nuit à 50°C avec le vide 5 total d'une pompe à huile. Le produit récupéré constitué par la semi-anide, semi-sel d'ammoniumcarboxyle (carboxylate d'ammonium) était en quantité de 115,6 g, soit un rendement de 93 %.
L'analyse des trois préparations ci-dessus est ré-10 sumëe dans le tableau II.
TABLEAU II
Préparation T~ a 1 b c
Azote, % (moyenne de deux détermi- 15 nations) 13,40 14,18 14,19
Composition fonctionnelle donnée par l'infrarouge
Anhydride Aucun Aucun Aucun C00H non dissocié Aucun Aucun Aucun
Imide Aucune Aucune Aucune 20
Amide primaire Quantité Quantité Quantité principale principale principale C00 ionisé Quantité Quantité Quantité principale principale principale Méthylène -CH - Oui Oui Oui + 1 " 25 -C00-NH4 Quantité Quantité Quantité j________J__principale__principale! principale EXEMPLE 3
Préparation de dérivés d'imide partielle dans du xylène
Un échantillon de 10 g de la semi-amide,semi-sel d1ammoniumcarboxyle (carboxylate d'ammonium) de l'exemple 2a 30 a été transformé en boue dans 250 ml de xylène dans un ballon de 1 litre pourvu d'un agitateur, d'un thermomètre, d'un piège d'enlèvement d'eau et d'un dispositif d'aspersion à entrée de gaz pour l'ammoniac. La boue a été chauffée au reflux pendant une période de 12 heures, tout en maintenant un 35 écoulement constant d'ammoniac par l'intermédiaire du dispo- 4 23.
sitif d'aspersion â entrée de gaz. Des échantillons de prélèvement du produit sous forme de boue ont été retirés à diverses périodes de temps (voir tableau III) pour l'évaluation de la transformation en imide en fonction du temps.
5 Chaque petit échantillon a été traité par trois transformations en boue consécutives dans 100 ml d'hexane, filtré et séché à 50°C sous un vide de 20-25 mm Hg. Le pH de solutions aqueuses à 2 % a été mesuré avant et après la dissolution ultérieure dans l'eau, le réglage du pH â 10 (NH^OH) et le •j^Q séchage par congélation. Les données dans l'infrarouge ont été obtenues sur tous les échantillons pour établir les rapports imide/amide et ainsi la teneur en pourcentage d'imide. Les résultats sont présentés dans le tableau III.
TABLEAU III
15 --------------------ï-------------------_______
Temps de , , , ... i reflux du pH-Ι a pH-2 Rapport I/A Imide J ! xylène lors (imide/ami- % en poids j de 1’enlè- de)(c) j vement de j l'échantil- j
Ion I
20 15 mn 6,26 ‘ 7,20 ' 0,723 13,8 30 mn 6,00 5,86 0,858 18,5 45 mn 5,91 5,76 0,999 23,3 1 h 5,78 5,53 1,113 27,4 1.5 h 5,43 5,43 1,398 36,8 25 2 h 5,27 5,76 1,501 40,2 3 h 4,94 5,72 1,821 50,0 4 h 4,78 5,38 --- --- 6 h 4,73 5,76 --- --- 7.5 h 4,73 5,60 30 12 h --- — --- --- ----------,-
(a } pH de la solution aqueuse à 2 % avant réglage du pH
(b) pH de solution aqueuse à 2 %, réglée à un pH de 10, et séchée ultérieurement par congélation (c) Rapport de l'intensité d'absorption de bandes dans -.r- _1 J:> l'infrarouge pour un nombre d'onde de 1.715 cm / 1.670 cm ^ 24.
(d) Obtenu à partir de courbe standard de composition en fonction du rapport I/A
Une autre série de neuf expériences individuelles a été réalisée, où la semi-amide,semi-sel d'ammoniumcarboxy-5 le (carboxylate d'ammonium) de l'exemple 2-b a été utilisée. Chaque essai individuel a été soumis au chauffage au reflux dans une boue de xylêne pendant le temps noté (tableau IV) et traité totalement comme dans cet exemple.
Les produits secs provenant du lavage à l'hexane 10 ont été individuellement dissous dans 150 ml d'eau, leur pH a été réglé à 10,0 avec NH^OH, filtré à travers un filtre de 0,20 micron et directement séché par congélation dans des bouteilles à sérum stérile pour l'évaluation in vivo sur des animaux. Les rendements et l'analyse des divers essais 15 sont décrits dans le tableau IV.
TABLEAU IV
Es- Temps de Rendement en [” : sai réaction produit (1) pH-Ι pH-2 Azote iRapport Imide n° lors du g (% de ren- (a) (b) (c), I/A (e) reflux dement) % (d) % 2° du xylè- __ne_________________ 1. 2 mn "'4,45 (9oTT) ΓΒ,Οδ"7,08"Ï4,27 0,489 5,3 2. 4 mn 3,92 (92,6) 4,85 6,93 14,28 0,559 7,9 3. 10 mn 7,87 (80,5) 4,43 7,12 14,48 0,661 11,5 4. 20 mn 6,28 (81,1) 4,52 6,74 13,82 0,798 16,5 25 = 5. 30 mn 6,15 (80,1) 3,99 6,39 13,67 0,911 20,4 6. 45 mn 6,30 (82,7) 4,60 6,69 13,71 1,020 24,1 7. 1 h 6,30 (83,4) 4,70 6,22 13,80 1,139 28,2 8. 1,5 h 6,15 (82,6) 4,37 6,00 13,07 1,333 34,7 9. 3,0 h 5,90 (81,9) 4,33 5,81 12,52 1,828 50,1 30 (1) L'essai 1 utilisait 5,0 g d'AEMA, l'essai 2 utilisait 4,3 g d'AEMA, l'essai 3 utilisait 10,0 g d'AEMA et le reste des essais utilisait 8,0 g d'AEMA.
(a) pH de solution aqueuse à 2 % avant le réglage du pH
(b) pH de solution aqueuse à 2 %, réglée à un pfî de 10,0 3 5 et séchée par congélation.
(c) Obtenu sur un produit séché par congélation, à pH ré- 25 .
glé .
, (d) Voir note (c) dans le tableau Ill-produit séché par congélation (e) Voir note (d) dans le tableau Ill-produit séché par 5 congélation.
EXEMPLE 4
Préparation de dérivés d'imide partielle dans du toluène
Des imides partielles de semi-amide, semi-sel d'am-moniumcarboxyle (carboxylate d'ammonium) du polymère d'EMA 10 ont été préparées essentiellement comme dans l'exemple 3, ’ sauf que le taux de formation d'imide a été modifié en fonctionnant avec un reflux du toluène (110°C) dans la boue toluénique, au lieu d'employer du xylène comme dans 1'exemple 3 .
15 L'EMA utilisé provenait de l'exemple 1-F et le mo de opératoire utilisé pour la préparation de la semi-amide, semi-sel d'ammonium était la même que dans l'exemple 2a, sans eau ajoutée. Ce produit présentait des bandes d'absorption principale dans l'infrarouge pour l'amide primaire, le 20 carboxyle ionisé et le carboxylate d'ammonium, sans preuve de la présence d'anhydride ou d'imide, 28 g de cette amide-sel d'ammonium ont été transformés en boue dans un litre de toluène et chauffés au reflux. Trois prélèvements ont été retires au bout d'un temps de reflux de 2 heures, 3 heures et 25 demie et 5 heures (fin de l'essai). Les produits ont été isolés par filtration, trois transformations en boue dans 150 ml de toluène et trois transformations en boue dans de l'éther de pétrole et séchés sous vide sous 25 mm Hg pendant 17 heures à la température ambiante. Les produits secs 30 ont été alors dissous dans 100 ml d'eau, réglés à un pH de 9,0 avec NH40H, filtrés à travers un filtre de 0,20 micron et séchés directement par congélation dans des bouteilles de sérum stérile, pour l'évaluation in vivo sur les animaux. Les résultats ont été obtenus comme suit : 26 .
"Temps de Γ~Rrodüït~~ * Azo'téT T Rapport~Ί7α Imide-’(b) , reflux du g (a) % toluène, h_________________ 2 6,15 " ' 13,78 ' 0,531 6,5 3,5 7,73 13,41 0,600 9,5 5 5__9,24 13,82 _ 0,647 11,0 (a) Voir note (c) du tableau III - produit séché par congélation (b) Voir note (d) du tableau III - produit séché par congélation.
10 EXEMPLE 5
Préparation de 11imide totale de l'EMA - Viscosité spécifique de l'EMA = 0,061 L'imide totale de l'EMA a été préparée en chauffant au reflux 20 g du produit provenant de l'exemple 2a dans 250 ml de boue xylénique pendant 18,5 heures sous un écoulement constant d'ammoniac et en retirant l'eau de réaction dans un piège dit Dean Stark. On a retiré au total 2,7 ml d'eau dans le piège. Le produit a été filtré, transformé en boue avec de l'hexane trois fois et séché toute la nuit, 20 sous un vide de 25 mm Hg, à la température ambiante. Le produit sec pesait 13,5 g (rendement 84,3 %). Trois grammes du produit ont été agités dans 150 ml d'eau toute la nuit, filtrés, lavés avec de l'eau et séchés par congélation. Le produit avait une teneur en azote de 9,53 % et un balayage pour _ 2 6 un rayonnement infrarouge présentait des bandes d'absorption seulement pour les nombres d'onde de 1.190, 1.360, 1.715 et 1.770 cm \ qui sont des valeurs typiques de la fonctionnalité imide. Aucune bande d'absorption d'amide, d'anhydride, de carboxyle ionisé ou de carboxylate d'ammonium n'était évidente.
Le produit ci-dessus constitué totalement d'imide a été utilisé suivant divers mélanges avec la semi-amide, semi-sel formé de carboxylate d'ammonium, ne renfermant pas ^ d'imide, provenant de l'exemple 2a, pour établir une courbe principale dans l'infrarouge pour les compositions imide/ amide, comme décrit préalablement selon l'exemple 1, comme 27.
suit : les quantités notées pesées sur une balance d'analyse, ont été mélangées dans des mélangeurs en acier inoxydable en utilisant un mélangeur dit Wigglebug. Des balayages par un rayonnement infrarouge ont été déterminés sur les 5 disques pressés des mélanges indiqués ci-dessus avec KBr sec en utilisant un mélange de 2 mg de polymère pour 250 mg de KBr. La boulette se composait de 70 mg du mélange polymère/ KBr par disque. La courbe principale totale a été construite à partir des compositions mélangées suivantes : 10 _______________________
Poids d'imide tota- Poids du produit Rapport d'absorp- I
le provenant de à 0 % d'imide tion imide/amide 1'exemple 5, mg provenant de j ___11 exemple 2a, mg____ j 3 97“ 07427 j 6 94 0,509 1 15 10 90 0,621 j 20 80 0,843 ! » 30 70 1,161 ! 40 60 1,519 50 50 1,871 20 60 40 2,099 ' 70 30 2,564 __80_________20____ 3,008_j
EXEMPLE 5-A
Préparation d'imide totale d'EMA, viscosité spécifique 25 d'EMA = 0,66 L'imide totale d'EMA à poids moléculaire supérieur à celui qui a été utilisé dans l'exemple 5 a été préparée en utilisant de 1ΈΜΑ à viscosité spécifique de 0,66 (1 %, DMF, 25°C) correspondant à un poids moléculaire de 20-30.000. 50 Dans ce cas, 1'EMA ammonié a été préparé comme dans l'exemple 6 (a) en aspergeant de l'ammoniac gazeux sec à travers de 1ΈΜΑ en poudre agité à une température en-dessous de 70°C. La semi-amide, semi-sel d'ammonium carboxyle (carboxy-late d'ammonium)d'EMA résultante (viscosité spécifique = 35 0,66), sous forme de poudre, a été en outre chauffée à une température élevée pour transformer la semi-amide en imide 28.
en chassant l'eau.
525 g de la semi-amide, semi-sel d'ammoniumcarbo-xyle (carboxylate d'ammonium), provenant de 1'EMA, à viscosité spécifique de 0,66, ont été vigoureusement agités dans 5 un grand ballon de 11,3 1, pourvu d'un enlèvement d'eau et sous un écoulement continu d'ammoniac gazeux. La température a été élevée jusqu'à 122°C où l'eau a commencé à être emprisonnée dans le dispositif d'enlèvement d'eau. Après une heure, la température a atteint 152°C et 24 ml d'eau avaient ]_q été retirés. Le chauffage avec agitation sous un écoulement d'ammoniac a été poursuivi pendant 5 heures (total de 6 heures) , 54 ml d'eau au total étant obtenus. Après refroidissement, le produit était une poudre blanche à aspect de farine. Le pourcentage d'azote était 11,11 par rapport à une ]_5 valeur théorique de 11,20.
Un produit constitué par 100 % d'imide de l'EMA, à poids moléculaire supérieur, a été testé pour déterminer l'inhibition de croissance des tumeurs dans un laboratoire d'expérimentation indépendant en 1958 et ne présentait pas 2o d'activité (voir exemple n° 22).
EXEMPLE 6
Préparation de la semi-amide, semi-sel de COQ d'ammonium (carboxylate d'ammonium) de 1ΈΜΑ par des procédés de la technique antérieure avec et sans eau 25 (a) Un ballon de 500 ml, à 4 cols, a été pourvu d'un agitateur en produit dit Téflon, d'un thermomètre, d'un dispositif d'aspersion à entrée de gaz et d'un dispositif de barbotage à sortie de gaz. Le gaz d'entrée, constitué par de l'ammoniac, a été amené à s'écouler à travers un débit-30 mètre pour suivre le taux d'écoulement seulement sur une base qualitative. Dans le ballon, on a introduit 25 g d'EMA provenant de l'exemple 1D, et la poudre a été agitée à la vitesse de 500 tours par minute. L'écoulement d'entrée de l'ammoniac a été maintenu à un taux qui permet d'atteindre 35 70°C en partant de la température ambiante sans utiliser une chemise de chauffage. En 9 minutes, la température de la poudre avait atteint 70°C et l'écoulement d'ammoniac a été 29 .
diminué pour maintenir cette température. Une température de 70°C a été maintenue pendant 1 heure 30 minutes et, à ce moment, l'ammoniac a été interrompu et la masse réactionnelle a été refroidie sous de l'azote. Le rendement en 5 EMA ammonié sec sous forme de semi-amide, semi-carboxylate d'ammonium était 30,8 g, soit un rendement de 98,8 %. Le pourcentage d'azote était 14,01,par rapport à une valeur théorique de 14,18, et le pH d'une solution aqueuse à 2 % était 6,07. Les balayages par l'infrarouge indiquaient des 10 bandes d'absorption pour;
Anhydride n'ayant pas réagi à 1.780 et 1.850 (moins de 5 % estimés)
Amide primaire à 1.670 et 1.620 (quantité prin cipale) 15 Ion carboxylate à 1.565 (quantité prin cipale)
Carboxylate de NH4 + à 1.405 (quantité prin cipale)
Imides Aucunes 20 (b) Une seconde ammoniation de l'EMA provenant de l'exemple 1D a été réalisée comme en (a) ci-dessus, sauf que l'EMA a été d'abord traité avec de l'eau, comme décrit ci-dessous, pour renforcer la réaction avec de l'ammoniac et abaisser le composant anhydride dans le produit. 25 g 25 d'EMA ont été agités à 500 tours par minutes à 40°C (chemise de chauffage) pendant 6 heures en présence de 0,53 g (17 % en mole) d'eau qui a été ajouté goutte à goutte pendant les 20 minutes initiales avec une seringue de 1,0 ml. Après 6 heures, la poudre a été refroidie jusqu'à la température am-30 biante et l'ammoniation a été réalisée comme en (a) ci-dessus en laissant la température atteindre 70°C en 10 minutes. Le temps d'ammoniation total à 70°C était une heure et le produit a été refroidi sous de l'azote.Le rendement était 31,4 g, soit un rendement de 100,8 %, le pourcentage 35 d'azote était 14,02, par rapport à une valeur théorique de 13,94, et la solution aqueuse à 2 % avait un pH de 6,45.Les balayages dans l'infrarouge indiquaient les bandes d'absorp- 30.
tion suivantes :
Anhydride n'ayant pas réagi - présent mais beaucoup moins qu'en (a)
Amide primaire quantité principale 5 comme en (a)
Ion carboxyle le carboxylate de
Carboxylate de NH^ NH^ augmentant par par rapport à (a)
Imide Absente EXEMPLE 7 10 Caractérisation de produits préalablement préparés sensiblement comme dans l'exemple 6
Durant la période de juillet 1956 à février I960, les dérivés semi-amides, semi-sels constitués de carboxyla-tes d'ammonium, ayant plusieurs qualités de viscosité (diffé-15 rents poids moléculaires) d'EMA ont été réalisés et évalués. Les qualités de viscosité, exprimées par la viscosité spécifique pour 1,0 % en poids dans la DMF à 25°C, utilisées allaient de 1,19, 0,60, 0,11 à 0,060. Les valeurs correspondantes estimées de poids moléculaire (Mn) étaient 50-60.000, 20 20-30.000, 2-3.000 et 1.000. Les trois premiers produits, c'est-à-dire utilisant de l'EMA à viscosité spécifique de 0,11, 0,60 ou 1,19 ont été ammoniés dans un grand équipement pour installation pilote fournissant des quantités de pro-- duit égales à 272-362 kg. L'EMA à viscosité inférieure(0,060) 25 a été ammonié dans un équipement plus petit pour laboratoire = en utilisant 200-300 grammes d'EMA. Les modes opératoires sont décrits ci-dessous, suivis de la caractérisation du produit obtenu à ce moment.
Résumé du mode opératoire pourl'installation pilote 30 (pour de l'EMA à viscosité spécifique de 1,19, 0,60 et 0,11) : Le récipient d'"ammoniation" utilisé était un séchoir rotatif dit Stokes, en acier inoxydable, à chemise, modèle 59AB, pourvu de moyens convenables pour introduire de la vapeur d'eau sèche et de l'ammoniac anhydre au-dessus de la surfa-35 ce du contenu, un agitateur fonctionnant à 5,7 tours par minute, et une valve rotative pour fermer de manière étanche le fond et évacuer le produit final. Le volume "total" de l'uni- * 31.
té était 1,13 mètre cube, le volume "opératoire" était 0,76 mètre cube et la surface de la chemise était 5,85 mètres carrés. Dans un essai typique, le dispositif d'ammo-5 niation a été fermé au fond et 226-272 kg de l'EMA à visco- 5 sité appropriéeont été introduits, l'agitateur étant en fonctionnement. L'EMA a été chauffé jusqu'à 55°C,après quoi il a été pré-hydrolyse jusqu'à une proportion de 0,15-0,20 mole d'eau par mole d'EMA par l'addition "au-dessus de la surface" de vapeur d'eau sèche au taux de 0,003 kg de vapeur ]_0 d'eau par kg d'EMA pendant une période de 3 heures. Durant cette période, la température a été maintenue entre 55 et 70°C en utilisant de l'eau de refroidissement dans la chemise. De l'ammoniac gazeux anhydre a été alors admis dans le réacteur (au-dessus de la surface de l'EMA partiellement 2_5 hydrolyse à un taux tel que la température soit maintenue entre 60 et 70°C (environ 2,2-3,6 kg par heure) jusqu'à ce que 2,0 moles d'ammoniac par mole d'EMA aient été ajoutées. Après que tout l'ammoniac a été ajouté, le produit a été refroidi jusqu'à une température inférieure à 50°C et déver-2o sé dans des récipients d'emmagasinage.
Mode opératoire au laboratoire pour de l'EMA à viscosité spécifique de 0,06 : L'EMA de départ a été préparé de manière semblable * à celle décrite dans l'exemple 1, sauf que la charge dans le 25 réacteur se composait de 267 g d'anhydride maléique, de - 2.089 ml d'éthylbenzène, de 45,8 ml de n-butyraldéhyde et de 13,20 g de peroxyde de benzoyle, ajoutés tous au commencement.
La pression d'éthylène a été maintenue pendant 24 heures sous 2 14 kg/cm à 70°C. Le rendement en EMA produit final traité 30 était 279 g, soit un rendement de 73,3 %, et la viscosité spécifique est 0,060 pour une solution à 1 % de produit dans la DMF à 25°C. Dans un ballon de 5 litres à 4 cols, on a introduit 249 g de poudre solide d'EMA à viscosité spécifique de 0,060 et cette poudre a été vigoureusement ajoutée 35 pendant 6 heures à 45-55°C après l'addition initiale de 5,3 g d'eau (15 % en mole en se basant sur l'EMA) pour effectuer 32.
l'hydrolyse partielle. L'aromoniation a été commencée en utilisant de l'ammoniac gazeux anhydre sec, aspergé dans la poudre d'EMA solide vigoureusement agitée et la température i a été maintenue à 31-32°C pendant 18 heures. Durant cette 5 période, on a observé une absorption d'ammoniac lente mais s. constante. Le produit final pesait 320 g, le rendement étant 103,3 %.
La caractérisation de tous les produits indiqués ci-dessus est décrite dans le tableau V ci-dessous.
10 TABLEAU V
Identification : D C B A
EMA utilisé/viscosité spécifique(D 1,19 0,60 0,11 0,060
Gamme de poids
VM WM
15 moléculaires : 50- 20- 2300 1060 60.000* 30.000*
Produit ammonié : code CRD : S-24 334 333 337 |
Année de la préparation : 1957 1957 1956 I960
Azote, % 15,83 16,86 14,80 13,83 20
Caractérisation dans l'infrarouge i
Date de l'essai --- 22 mai 8 juin 5 juil- 1959 1959 let I960 » Anhydride --- Absent Absent Absent 25 Acide carboxy- lique (COOH) --- Absent Absent Absent
Imide --- Absente Absente Absente
Amide primaire --- Présente Présente Présente
Ion carboxylate (CO2 ) --- Présent Présent Présent 30 Carboxylate d'ammonium --- Présent Présent Présent ( 1 ) Solution à î % darîs~~la DMF ,^25^ x estimé à partir de la relation de la courbe de visco
sité - M
35 xx Déterminé en décembre 1960 par le procédé ebulliométri-que par élévation du point d'ébullition dans l'acétone.
33.
Les échantillons de la semi-amide, semi-sel constitué de carboxylate d'ammonium d1 EMA,préparés en 195 7-1960 et caractérisés à ce moment, comme décrit dans le tableau V, 5 ont été emmagasinés dans des récipients en verre avec des 5 calottes à vis ordinaires (sans être sous azote, ni fermés de manière étanche d'une façon quelconque) jusqu'au début de 1977 dans un entrepôt à utilisation générale. A ce moment (1977), ils ont été retirés pour une évaluation continue (voir exemples 9 et 10). Avant la réutilisation, les matières •Lq ont été de nouveau caractérisées, les résultats étant présentés dans le tableau VI.
Il est évident que les produits polymères testés en 1959-1960 (exemple 8) qui ne contenaient pas d'imide à ce moment avaient perdu à la fois de l'ammoniac et de l'eau, et ^5 ils étaient ainsi transformés en produits polymères contenant des groupes imides durant la longue période d'emmagasinage. Ces produits transformés, tels que testés plus récemment dans les exemples 9 et 10, donnaient des résultats différents de manière inespérée par comparaison avec les 2o premiers résultats.
TABLEAU VI
Produit ammoniê j j ! Code d'identifica-, | tion : ! S-24 334 333 337 j
Correspondance D (poids C B (poids A (poids J
25 avec le tableau V moléculai- molécu- molécu- re 50000) laire laire ! 2300) 1060)
Azote, % 14,02 12,46 12,53 j12,62
Caractérisation dans l'infrarouge
Date de l'essai: 1977 1978 1977 1977 30 Anhydride Absent Absent Absent Absent
Acide carboxy- lique (COOH) Absent Absent Absent Absent
Imide Présente Présen- Présente Présente te
Amide primaire Présente Présen- Présente Présente te
Ion carboxyla- 35 te (CO2“) Présent Présent Présent Présent
Carboxylate d'ammonium Présent Présent Présent Présent i TABLEAU VI (Saite) 34 .
Rapport de capacité d'absorption i imide/amide 0,890 0,922 1,180 0,950 i
Imide, %______19,5________20,7__29,5__21,7 j 5 Exemples 8-21 pour l'évaluation des produits EXEMPLE 8
Trois versions à poids moléculaires différents des dérivés d'EMA, constitués de semi-amides, semi-carboxylates d'ammonium (ne contenant pas de fonction imide), tels qu'iden-10 tifiés dans l'exemple 7-tableau V-A, B et C ont été évaluées dans un laboratoire d'expérimentation indépendant durant 1959 et 1960, en utilisant des modes opératoires officiels pour les produits transplantés solides dits Sarcoma-180, tels que spécifiés par the Cancer Chemotherapy National Service Center 15 (CCNSC) et obtenus à National Institutes of Health. Le mode opératoire permettait d'avoir 2 morts pour six animaux comme limite toxique. Les rapports d'essai T/C ont été calculés comme étant le rapport entre le poids moyen de tumeur des animaux traités et le poids moyen de tumeur des animaux de con-20 trôle. Les valeurs T/C ont été calculées pour une série de trois expériences si l'expérience précédente satisfaisait à des limites tolérables. La matière était acceptable si l'expression (T/C)^ x (T/C)2 x (T/C)2 est inférieure à 0,08 - après l'expérience finale. Les expérience ont été continuées 25 si (T/C)^ était inférieur à 0,54 et si (T/C)1 x (T/C)2 était inférieur à 0,20. Les animaux utilisés étaient des souris suisses spécifiées (CCNSC, spécification XIV), la voie d'administration du produit pharmaceutique était intrapéritonéale (spécification III) et la détermination de dose était réalisée 30 par la spécification XII.
Les données résumées sont montrées dans le tableau VII.
TABLEAU VII
35.
' Compo~sé_rtabrêau v7 exêm- r " ;
! pie 7) ---x j aXX B C
Viscosité spécifique j i 5 de ΓΈΜΑ --- 0,060 0,11 ! 0,60 !
Code de produit U-1104* CRD337 j CRD333 CRD334 j xx I i
Expérience 1 : dose mg/kg 500 ' 500 I 375 j 60 animaux morts/to- : - tal des 10 animaux 2/6 i 2/6 0/7 1/7 (V/C)l 0,89 j 0,45 0,337 0,180
Commentaire ; Rejet i Conti- Conti- Conti- I nuation nuation nua- i tion • 1
Expérience 2 : dose mg/kg ' i 500 375 60 animaux morts/to-tal des ; animaux j --- ' 2/6 1/7 2/6 (T/C) ! — ! o,29 0,159 0,51 (T/C)J x 1 (T/C) 2 --- 0,13 0,053 0,093 20 Commentaire . --- Conti- Conti- Conti- j nuation nuation nua- j 1 tion (Expérience 3 : dose mg/kg ' --- 500 375 60 I animaux ! j morts/to- : I tal des | 25 i animaux | 1/6 1/6 1/6 I (T/C)^ { 0,77 0,15 0,50
(T/C)£ x I
(T/C)2 x j (T/C) 3 --- 0,10 0,008 0,046 j Commentaire --- Rejet Accep- Accep- 30 j tation tation x Le produit dit U-1104 était le sel d'ammonium d'acide suc-cinamique, la partie fonctionnelle monomère des polymères A, B et C.
xx Testé deux fois. Au second test, il y a rejet lors de 35 l'expérience 1 avec 500 mg/kg, animaux morts/total des animaux - 1/6 et (T/C)^ = 1,39.
36.
On en a conclu qu1 alors que la toxicité s'améliorait lorsque le poids moléculaire devenait plus faible, l'activité était perdue lorsque la dimension diminuait vers la partie monomère inactive pour cette série de dérivés. Aucun 5 dérivé semblable contenant la fonction d'imide partielle n'a été préparé ou évalué par les modes opératoires CCNSC ou par tout autre mode opératoire dans la période de temps indiquée ci-dessus (1959-1960). Tous les trois polymères (A, B et C ci-dessus) ont été rejetés lorsqu'ils ont été éva-]_q lues par les modes opératoires (CCNSC contre le carcinome 755 et la leucémie 1210.
EXEMPLE 9
Les compositions de polymères (A, B, D), comme décrites dans l'exemple 7,tableau VI/préparées à partir de ]_5 trois matières premières constituées d'EMA à viscosité spécifique différentes et ainsi présentant trois poids moléculaires variant largement, ont été administrées à des souris dites BALB/c en utilisant trois programmes de dose, (a) avant (jour -9 et jour -1) ou (b) après (jours 1 et 9) 2o l'inoculation de tumeurs avec des cellules à tumeurs (désignées par mKSA-TU5) transformées par SV40, ou (c) à la fois avant (jours -9 et -1) et après (jours 1 et 9) l'expéri-tation des tumeurs. Le composé a été administré par voie intrapéritonéale (IP) à trois doses respectivement égales à 25 62,5, 125,0 et 250,0 mg/kg. Les cellules à tumeurs ont été 4 inoculées au taux de 1 x 10 cellules par voie sous-cutanée (SC) dans un groupe d'animaux et au taux de 1 x 10^ cellules par voie sous-cutanée dans un autre groupe d'animaux. La croissance des tumeurs dans les souris traitées par rapport 30 aux souris de contrôle normales non traitées a été alors évaluée. Les données sont résumées dans les tableaux VIII-A, VIII-B et VIII-D. A partir du tableau VIII-A en utilisant le polymère provenant de l'exemple 7-tableau VI-A en employant le programme de dose (a), 48 % (17/36) de souris expérimen-35 tées par des tumeurs sont restées saines et exemptes de tumeurs pendant toute la période d'observation de 58 jours. Le 61 jour, les animaux exempts de tumeurs ont été testés à 4 37.
nouveau avec des cellules à tumeurs viables (mKSA-TU5 au taux de 1 x 1<j par voie sous-cutanée) et 82 % (14/17) restaient exempts de tumeur (c'est-à-dire immunisés) au bout de 37 jours après l'expérimentation.
5 En utilisant le programme de dose (b) où le polymè re 7-tableau VI-A a été administré après l'expérimentation des tumeurs, 42 % (15/36) sont restés résistants aux tumeurs après 58 jours d'observation. Après une nouvelle expérimen- m A 4 tation (61 jour) avec 1 x 10 cellules de tumeurs via- 10 blés, 80 % (12/15) restaient exempts de tumeur au bout de 37 jours après la nouvelle expérimentation.
Des animaux dans le programme de dose (c) où le polymère 7-tableau VI-A a été administré à la fois avant et après l'expérimentation des tumeurs étaient résistants ïï)p 15 en proportion de 28 % (10/36) jusqu'au 58 jour et tous ces animaux exempts de tumeurs étaient immunisés vis-à-vis de l'expérimentation secondaire des tumeurs.
TABLEAU VIII - A
38.
, Tumeur ^Composé Dose ΓProgramme” öe C r cTis~sance AnTmaux r- I mKSA-TU5 experimental mg/kg1 traitement des tu- exempts I ! meurs dans 'de tu- j les ani- meur auj i - i maux récep- bout du; j j teurs au 5 8me j I ! bout du jour 1 1___J I 5 8me jour 4 Γ " J--- 1 x 10 Contrôle — — 6/6 1 0 , (voie j SQUS- cuta née SC)
" " Polymère de I
l'exemple 7- Jours -9 j
tableau VI-A 250 et -1 6/6 ! O
" " " 125 " 4/6 2 15 " " " 62,5 " 2/6 4 " " ” 250 Jours +1 et +9 1/6 5 " " " 125 " 2/6 4 " " " 62,5 " 4/6 2
Jours -9 et -1 20 " " " 250 Jours +1 et +9 3/6 3 " ” " 125 " 4/6 ! 2 j " " ” 62,5 " 4/6 2 1 x 1Q3 Contrôle — — 6/6 0 SC j
" " Polymère de J
25 l'exemple 7- tableau VI-A 250 Jours -9 et -1 1/6 5 125 " 2/6 4 " " " 62,5 " 4/6 2 250 Jours +9 et +1 3/6 3 " " " 125 " 6/6 0 30 " " " 62,5 " 5/6 1
Jours -9 et -1 Jours +9 " " " 250 et +1 6/6 0 " " " 125 " 5/6 1 " " " 62,5 " 4/6 2 « 35---------L—-----------1
TABLEAU VIII - B
39.
)~TÛmëür Tcompose Dose Programme de Croissance Animaux I mKSA-TU5 expérimental mg/kg'traitement ,des tu- exempts ! Voie meurs chez de tu- 5 d'admi- jles ani- meur au nistra- maux récep-bout du tion teurs au 51me bout du jour _________51me jour___ 1x10 Contrôle 5/6 χ . SC Polymère de 10 11 exemple 7- tableau VI-B 250 Jours -9 et -1 6/6 0 " " " 125 " 3/6 3 " " " 62,5 " 5/6 1 " " " 250 Jours +1 et 15 +9 5/6 1 j " " " 125 " 4/6 2 | " " " 62,5 " 5/6 1 " " " 250 Jours -9 et -1,
Jours +1 et 20 +9 5/6 1 '· " " 125 " 5/6 1 " " " 62,5 " 6/6 0 1x10^ Non expéri- a mente --i_________1--1
TABLEAU VIII -D
40.
jTumeur Composé Dosé~ Prô^immë~"de" Croissance Animaux v mKSA-TU5 expérimental mg/kg traitement des tu- exempts , meurs dans de tu- 5 j j les ani- meur au ! I maux récep-bout du I teurs au !36me bout du pour _________________ _____________ 36me jour +4 ' ~~ — — 1 x 10 Contrôle --- --- 6/6 0
SC
10 " " Polymère de 1 ' exemple 7- tableau VI—D 75 Jours — 9 et
-1 6/6 O
" " " 50 " 5/6 1 " " " 25 " 6/6 0 " " " 75 Jours +1 et , c +9 6/6 0 15 - ·· « 50 „ 6/6 0 " " " 25 " 5/6 1
Jours -9 et -1
Jours +1 et " " " 75 +9 6/6 0 " " " 50 " 6/6 0
20 " " " 25 " 6/6 O
1 x 10+^Contrôle 6/6 0
SC
" " Polymère de l'exemple 7- tableau VI-D 75 Jours -9 et -1 6/6 0 25 " " " 50 " 4/6 2 " " " 25 " 5/6 1 75 Jours +9 et +1 6/6 0 50 " 6/6 0 " " ” 25 " 4/6 2 75 Jours -9 et -1 6/6 0 ^ Jours +1 et +9 " " " 50 " 5/6 1 " " " 25 " 2/6 4
Le polymère provenant de l'exemple 7-tableau vi-b _ a été testé seulement sur des souris auxquelles on a inoculé 35 4 1 x 10 cellules viables mKSA-TU5 (voie sous-cutanée) (voir tableau VIII-B). En utilisant le programme de dose (a), 22 % * 41.
(4/18) des souris sont demeurés exempts de tumeurs durant toute la période de 51 jours d'observation. Avec le program-me (b) , 22 % (4/18) des souris expérimentées par les tumeurs sont demeurés de manière semblable exempts de tumeurs après 5 51 jours. Dans le groupe (c) seulement, 2/18 (11 %) des sou- mg ris demeuraient exempts de tumeurs pendant 51 jour. Le 54 jour, toutes les souris indiquées ci-dessus exemptes de tumeurs (10/54) ont été soumises de nouveau à l'expérimentation 4 = avec 1 x 10 cellules viables mKSA-TU5 (voie sous-cutanée), 10et, après 37 jours, toutes les 10 souris sont demeurées exemptes de tumeurs (c'est-à-dire immunisées) vis-à-vis de la nouvelle expérimentation par les tumeurs.
Le polymère provenant de l'exemple 7-tableau VI-D a été expérimenté pour deux niveaux d'expérimentation des 15 tumeurs comme avec le polymère 7-tableau VI-A ci-dessus (voir tableau VIII-D). Le polymère 7D présentant un poids moléculaire bien supérieur aux polymères de l'exemple 7A ou de l'exemple 7B, la dose pour le polymère 7D a été fournie (voie intrapéritonéale) au taux de 75, 50 et 25 mg/kg comme 20noté. Avec le programme de traitement (a), 11 % (4/36) des souris ayant reçu une expérimentation de tumeurs sont demeurés exempts de tumeurs après 36 jours d'observation. Parmi ces souris 75 % (3/4) sont demeurés exempts de tumeurs après 37 jours d'une nouvelle expérimentation secondaire des tu-25meurs. Dans le programme (b), 8 % (3/36) demeuraient exempts de tumeurs après 36 jours d'expérimentation principale des tumeurs et seulement une de ces souris était immunisée à la nouvelle expérimentation secondaire des tumeurs. Dans le programme (c), où le polymère 7 du tableau VI-D a été fourni, 30à la fois avant et après la tumeur, 14 % (5/36) des souris sont demeurés exempts de tumeurs pendant 36 jours et 4 de ces 5 souris (80 %) étaient immunisées vis-à-vis d'une nouvelle expérimentation secondaire des tumeurs.
Les nombres totaux d'animaux exempts de tumeurs 35SOnt indiqués dans les tableaux VIII A, B et D à la fin des périodes d'observation respectives provenant de ces deux sources, (a) ceux qui étaient exempts de tumeurs durant toute 42.
la période d'observation et (b) ceux qui produisaient des tumeurs mesurables durant la période d'observation, ces tumeurs régressant ultérieurement et disparaissant avant la fin de la période d'observation.
5 Une dissociation des animaux expérimentés entre ceux ayant des tumeurs ayant régressé par rapport à ceux qui demeuraient exempts de tumeurs pendant toute l'expérimentation, sans régression, indiquait que cela dépendait à la fois de la charge de tumeur et du polymère utilisé. Le 10 résumé de ces dissociations des tumeurs ayant régressé par rapport au nombre total d'animaux exempts de tumeurs est présenté dans le tableau VIII-E.
TABLEAU VIII - E
Données Polymère.Charge de Animal Animaux Total{Pourcen-prove- [dose de exempt présen- tage nant du tumeur de tu- tant d'ani- ; tableau meur des tu- maux ( n° durant meurs présen- ! toute ayant tant des| l'ex- rêgres- tumeurs péri- sé (2) ayant 2o menta- régressé ______ tion ( 1)____'
VIII-A Exemple 7- 1χ1()3 8 10 ~18 56 I
tableau lxl04 0 24 24 100 ! VI-A Total 8 34 42 81 | VIII-B Exemple 7- lxlO3 NT1 2 3 NT NT NT ; 25 tableau 1x10 _1_ _9_ 10 90 ! VI-B Total 1 9 10 90 i VIII-D Exemple 7- lxlO3 10 O 10 0 tableau 1x10 0 2 2 100
VI-D Total 10 2 12 17 I
Animaux exempts de tumeurs pendant toute la période 30 d'observation - pas de régression des tumeurs.
2
Animaux où se sont produites des tumeurs qui régressaient jusqu'à zéro à la fin de la période d'observation 3
Pas d'expérimentation.
EXEMPLE 10
La composition de polymère provenant de l'exemple 7 43.
-tableau VI-A a été testée de nouveau comme dans l'exemple 9 ci-dessus, sauf que 10 souris ont été utilisées par groupe d'expériences, et seuls les programmes de traitement (a) et (b) ont été employés. Les données sont résumées dans le 5 tableau IX.
En utilisant le programme de dose (a) où le polymère a été fourni le jour 9 et le jour 1 avant l'expérimentation par les tumeurs, 37 % (22/60) des souris expérimentées par les tumeurs demeuraient exempts de tumeurs durant * nie 10 toute la période d'observation de 61 jour. Le 62 jour, 21 des animaux exempts de tumeurs ont été de nouveau soumis 4 à l’expérimentation avec 1 x 10 cellules de tumeurs mKSA-TU5 (voie sous-cutanée) et, après 30 jours supplémentaires, 90 % (19/21) des souris étaient exempts de tumeurs 15 (souris immunisées).
Dans le second programme de dose (b), où le polymè- me re a été administré, le 1er et le 9 jour après l'expérimentation des tumeurs, 47 % (28/60) des souris demeuraient exempts de tumeurs durant toute la période d'observation 20 de 61 jours.Parmi les 28 souris exemptes de tumeurs (au bout de 61 jours), 64 % (18/28) restaient immunisées pendant 30 jours supplémentaires après la nouvelle expérimentation secondaire avec des tumeurs.
44.
TABLEAU IX
1 Tumeur Composé " Dose |'Pr^râmmë~de (Croissance! Animaux* mKSA-TU5,expérimental1 mg/kg traitement des tu- exempts! ! I meurs dans de tu- 5 les ani- meurs maux récep- au bout teurs au du 61me bout du jour ________61me jour________ 1 x 10^ Contrôle — — 10/10 0
SC
-^q Polymère de 11 exemple 7-tableau " " VI-A 250 Jours -9 et -1 8/10 2 " " " 125 " 10/10 0 " " ” 62,5 “ 7/10 3 " " " 250 Jours +1 et 15 +9 6/10 4 " " " 125 " 6/10 4 " " " 62,5 " 7/10 3 1 x 103 Contrôle :-- - 5/10 5
sc I
Polymere de j 11 exemple 7-20 tableau " " VI-A 250 Jours -9 et -1 7/10 3 " " " 125 " 4/10 6 " " " 62,5 " 2/10 8 " " " 250 Jours +1 et +9 7/10 3
95 " ” " 125 " 5/10 5 I
12_"_1_"_____! 62,5 1/10_9 , EXEMPLE 11
La composition de polymère de l'exemple 6a, de 1 ' EiMA ammonié par de l'ammoniac gazeux, en phase solide sans eau ajoutée, a été administrée à des souris dites BALB/c en 30 utilisant les niveaux de dose et les programmes de traitement de l'exemple 10 avec 10 souris par groupe expérimental. Les résultats obtenus après une observation pendant 61 jours sont résumés dans le tableau X. En utilisant le programme me de traitement (a) où le polymère 6a a été fourni le 9 jour et le premier jour avant l'expérimentation des tumeurs avec des cellules à tumeurs mKSA-TU5, 40 % (24/60) des souris 45.
sont restés exempts de tumeurs après 61 jours.
En utilisant le programme de traitement (b) où le polymère ba a été administré le 1er jour et le 9 jour après l'inoculation des tumeurs, 32 % (19/60) des souris 3 expérimentées par les tumeurs demeuraient exempts de tumeurs après 61 jours. Sur le total de 43 souris exemptes de tumeurs provenant des groupes (a) plus (b) après 61 jours,36 ou 87 % demeuraient immunisés vis-à-vis de la nouvelle expé- 4 rimentation secondaire par les tumeurs viables (1 x 10 cel-* 10 Iules) pendant une période de 30 jours.
TABLEAU X
Tumeur Composé- Dose ["Programme deFcroissance Ani- ! mKSA-TU5 expérimental mg/kg traitement des tu- maux meurs dans exempts les ani- de tu-maux récep- meurs teurs au au bout du bout 61mâ jour du 61me _______________________jour 1 x 104 Contrôle 9/10 1
20 SC
Polymère de " 11 l'exemple 6a 250 Jour -9 et -1 8/10 2 " " " 125 " 9/10 1 " " " 62 " 9/10 1 " " " 250 Jour +1 et 25 +9 7/10 3 " " " 125 " 6/10 4 62 " 9/10 1 1 x 103 Contrôle 8/10 2
SC
Polymère de " " l'exemple 6a 250 Jour -9 et 30 -1 2/10 8 .. .. .. 125 " 5/10 5 " " " 62 " 3/10 7 " " " 250 Jour +1 et +9 7/10 3 » il h 125 " 7/10 3 " » » 62 " 5/10 5 35 EXEMPLE 12
La composition de polymère de l'exemple 6b, qui est de l'EMA ammonié par de l'ammoniac gazeux en phase soli 46 .
de avec de l'eau ajoutée, a été administrée à des souris dites BALB/c en utilisant les niveaux de dose et les programmes de traitement de L'exemple 10 avec 10 souris par groupe d'expérience. Les données obtenues après 61 jours d'observa- 5 tion sont résumées dans le tableau XI.Avec le programme de • me ; traitement (a) où le polymère 6b a été administré le 9 jour et le 1er jour avant l'expérimentation par les tumeurs avec des cellules à tumeurs mKSA-TU5, 30 % (18/60) des souris demeuraient exempts de tumeurs après 61 jours. Avec le 10 programme de traitement (b) où le polymère 6b a été adminis-tré le 1 jour et le 9 jour après l'inoculation de tumeurs, 17 % (10/60) des souris expérimentées par des tumeurs sont restés exempts de tumeurs après 61 jours. Sur le total de 28 souris exemptes de tumeurs provenant des groupes (a) plus (b) 15 après 61 jours, 23 ou 82 % demeuraient exempts de tumeurs pendant 30 jours après une nouvelle expérimentation secondaire 4 de 1 x 10 cellules a tumeurs.
TABLEAU XI
47.
Tumeur I Compose J Dose Programme de Croissance Animaux j mKSA-TU5 expérimental mg/kq traitement des tu- exempts , meurs dans de tu-les ani- meurs maux récep-.au bout teurs au ;du 61me bout du ijour ________________ 61me jour I_
1 x 10^ Contrôle 10/10 O
SC
Polymère de " " l'exemple 6b 250 Jour -9, et -1 8/10 2 " " " 125 " 9/10 1 " " " 62 " 7/10 3 " " " 250 Jour +1, et +9 8/10 2 " " " 125 " 7/10 3 15 " " " 62 " 10/10 0 1 x 10^ Contrôle 4/10 6
SC
Polymère de " " l'exemple 6b 250 Jour -9,et -1 8/10 2 " " " 125 " 4/10 6 2o " " " 62 " 6/10 4 " " " 250 Jour +1 et +9 8/10 2 " " " 125 " 10/10 0 " " " 62 " 7/10 3 EXEMPLE 13 25 L'évaluation décrite dans les exemples 9 à 12 a été étendue à un second système de modèle de tumeurs, gui ^ était un carcinome de la vessie transplantable, induit par le 3-mêthylcholanthrène pour des rats de la souche Fischer (F344). Quand cette tumeur est transplantée dans des rats 30 Fischer normaux, elle croît à l'emplacement principal et forme des métastases spontanément dans le poumon. En outre, un cancer récurrent est toujours observé après enlèvement chirurgical de la tumeur principale.
La première étude a été conçue pour évaluer l'effet 35 du polymère provenant de l'exemple 7-tableau VI-A sur la survie de rats portant des tumeurs et l'aptitude du composé à empêcher la formation de métastases.
48.
Des rats de la souche dite Fischer, pesant approximativement 250 g chacun, ont été implantés par voie sous-cutanée (trocart) avec une section de 2 x 2 mm de tumeur. Au bout de 5, 12 et 18 jours après l'implantation de tumeurs, 5 les rats porteurs de tumeurs ont été traités avec le polymère à une dose de 62 mg/kg par injection dans la cavité péritonéale. En tout, six animaux ont été traités d'une telle manière. Quatre animaux avec une tumeur implantée ont été laissés sans traitement et transportés en tant que contrôles. 10 Tous les animaux de contrôle sont morts de la maladie en trois semaines ou en moyenne 15 jours après l'implantation de tumeurs. Deux des animaux traités sont morts au bout de 37 ΙΠΘ jours. Les quatre animaux restants ont été sacrifiés le 42 jour après l'implantation. L'examen global révélait qu'ils 15 avaient une croissance proéminente de tumeur principale mais pas de maladie des poumons due à des métastases.
EXEMPLE 14
Une seconde étude a été réalisée pour répéter l'exemple 13 et pour évaluer l'effet d'une dose inférieure 20 et d'une fréquence réduite de traitement. Des rats de la souche Fischer ont reçu le même type de produit d'implantation de tumeurs et, au bout de 8 jours après l'implantation, les rats porteurs de tumeurs ont été traités par le polymère provenant de l'exemple 7-tableau VI-A au taux de 65 mg/kg ou 25 de 30 mg/kg par une injection intrapéritonéale (4 rats dans chaque groupe). Au bout de 16 jours après 1'implantation,le groupe ayant reçu une dose inférieure a reçu un produit de renforcement en quantité de 30 mg/kg.La survie a été observée pendant une période de 6 semaines. Après six semaines,les 30 survivants ont été examinés pour déterminer la présence de maladie due aux métastases dans leur poumon. Cinq animaux à tumeur implantée n'ont pas été traités en tant que contrôles . Tous les animaux de contrôle sont morts de maladie et avaient une survie moyenne de 23 jours après l'implantation 35 de tumeurs. Le groupe de quatre animaux avec une dose unique de produit pharmaceutique en quantité de 65 mg/kg était vivant au bout de 40 jours et a été sacrifié. L'examen ne révélait 49.
aucune métastase. Sur le groupe de souris qui a reçu un produit de renforcement en quantité de 30 mg/kg au bout ΓΤ1Θ ixiq de 16 jours, deux sont morts le 35 et le 36 jour et me les deux restants ont été sacrifiés le 40 jour. De nou-5 veau, l'examen ne montrait aucune preuve de métastase. Une _ survie prolongée par rapport aux animaux de contrôle dans les deux groupes traités était bien sûr évidente.
EXEMPLE 15
Une troisième étude a été conçue pour évaluer 4 10 l'aptitude du polymère provenant de l'exemple 7-tableau VI-A
à empêcher la récurrence ou le retour de tumeur dans les rats Fischer dont la tumeur principale a été retirée par voie chirurgicale. Des rats de la souche Fischer ont reçu une implantation par trocart d'une section de 2 x 2 mm de 15 tumeur, comme dans les exemples 13 et 14. On a laissé alors la tumeur grandir jusqu'à une dimension de diamètre de 2-3 cm. A ce stade (8 jours après l'implantation), la tumeur a été retirée par voie chirurgicale, et concurremment, le rat a été traité avec une seule dose de polymère 20 au taux de 65 mg/kg ou de 30 mg/kg par une injection intrapéritonéale dans deux groupes de quatre rats. La survie et la récurrence des tumeurs ont été observées pendant une période de sept semaines. Dans le groupe recevant 30 mg/kg du polymère, lors d'une nouvelle section des tumeurs, tous 25 les quatre animaux étaient vivants au bout de 47 jours, „ sans aucune preuve de récurrence des tumeurs. Dans le grou pe recevant 65 mg/kg en tant que dose unique, lors de la nouvelle section, un est mort le 16 jour après la récurrence des tumeurs, alors que les trois autres animaux étaient 30 vivants au bout de 47 jours sans aucune preuve de récurrence des tumeurs.
EXEMPLE 16
Une seconde étude pour la prévention de la récurrence des tumeurs a été réalisée dans des rats Fischer, 35 semnlable à l'étude de l'exemple 15, sauf que trois polymères à différentes teneurs en imide ont été utilisés. Les teneurs en imide étaient 0, 5 et 21,7 %. Dans cette étude, 50.
les implantations de tumeurs par trocart ont été réalisées comme décrit dans les exemples 13, 14 et 15. L'excision de toutes les tumeurs a été réalisée 14 jours après l'implantation.
5 Un groupe de quatre rats a été utilisé comme con- r trôle et n'a pas reçu de traitement au moment de l'exci sion. La récurrence des tumeurs était 100 % au bout de 21, 33, 40 et 44 jours après l'excision pendant un temps de récurrence moyen de 34 jours. Dans ce groupe de contrôle, ΓΠ6 1 10 deux rats sont morts le 44 jour et deux étaient vivants et ont été sacrifiés à ce moment. On a trouvé que tous les quatre avaient une preuve de la présence de métastases.
Un second groupe de cinq rats a reçu une seule dose par voie intrapéritonéale de 30 mg/kg du polymère prove-15 nant de l'exemple 2a (0 % d'imide) au moment de la nouvelle section des tumeurs. Dans ce groupe, une tumeur s'est re- produite dans deux rats le 33 jour après la nouvelle sec- Π1Θ tion et dans un troisième rat le 40 jour. Après 55 jours, 3 des 5 rats (60 %) présentaient une récurrence des tumeurs.
20 Un troisième groupe de 6 rats a reçu une seule dose intrapéritonéale de 30 mg/kg du polymère provenant de l'exemple 3, tableau IV-1, contenant une fonctionnalité imide de 5 %, au moment de la nouvelle section des tumeurs. Aucune récurren-- ce des tumeurs n'a été observée dans n'importe quel animal du- 25 rant toute la période de 55 jours. Le 55 jour, deux de ces rats sont morts (sans tumeur) et, lors de l'examen, on n'a pas trouvé de preuve de métastase.
Un quatrième groupe de six rats a reçu une seule dose intrapéritonéale de 30 mg/kg du polymère provenant 30 de l'exemple 7,tableau VI-A, contenant 21,7 % d'imide, au moment de la nouvelle section des tumeurs. Dans ce groupe, un me animal avait une récurrence de tumeur au 21 jour et un se- mû cond le 43 jour. Tous étaient vivants après 55 jours. Ainsi, deux seulement des six animaux présentaient une récurren-35 ce de tumeur suivant une moyenne de 33 %.
EXEMPLE 17
Les expériences sur les animaux décrites dans les 51.
exemples 13 à 16 utilisaient des polymères dosés par injection dans la cavité du péritoine. Cet exemple illustre l'utilité d'une composition contenant des groupes imides, quand on l'administre par voie orale au moment de la nouvelle 5 section des tumeurs pour empêcher ou retarder la récurrence * des tumeurs. Dans l'exemple 16, on a note que les animaux de contrôle ne recevant pas de produit pharmaceutique au moment de la nouvelle section des tumeurs présentaient un temps moyen, pour la récurrence des tumeurs, égal à 34 jours. 10 Dans cet exemple, un groupe de 10 rats Fischer ont reçu une implantation de tumeurs par trocart comme dans l'exemple 13. Les tumeurs développées ont été retirées par ΓΠΘ voie chirurgicale le 13 jour avant l'implantation et, concurremment, chaque rat a été soumis à une incubation par 15 voie orale avec 1 ml d'eau stérile contenant 30 mg/kg du polymère contenant des groupes imides de l'exemple 7, tableau VI-A (21,7 % d'imide). La récurrence des tumeurs a été alors observée pendant une période de 10 semaines. Un rat est mort au moment de l'enlèvement chirurgical des tumeurs. Sur les 9 20 rats restants, de faibles récurrences des tumeurs ont été observées pour 7 animaux au bout de 42, 42, 42, 43, 46, 50 et 59 jours après l'excision des tumeurs. Deux rats étant exempts de récurrence des tumeurs après 70 jours.
EXEMPLE 18 25 Le but de cette expérience était de déterminer si l'exposition de cellules de tumeurs au polymère provenant de l'exemple 7-tableau VI-A modifiait leur antigénicité et/ou avait un effet cytotoxique direct sur les cellules de tumeurs.
Les cellules de tumeurs ont été préparées à partir 30 de la tumeur BLCa décrite dans l'exemple 13 en excisant une masse de tumeurs sous-cutanées . Les cellules ont été alors mises en suspension en faisant sortir les cellules hors de la tumeur avec une tripsinisation supplémentaire modérée des morceaux de tumeurs. Les cellules séparées ont été lavées trois 35 fois dans une solution saline équilibrée (BSS) et comptées pour déterminer le rapport cellules vivantes/cellules mortes . Une population de cellules de 90-95 % a été obtenue à ce 52.
point.
Des cellules de tumeurs, à une concentration de 1 x 5 10 cellules par ml, dans des milieux essentiels minimaux d'Eagles dans du BSS d'Earl, plus 10 % de sérum de foetus 5 de veau, ont été soumises à l'incubation avec 30 mg/ml de polymère provenant de l'exemple 7-tableau VI-A.L'incubation a été réalisée à 37°C pendant 90 minutes, après quoi les cellules ont été sorties de la suspension par centrifugation au taux de 300 g pendant 6 minutes. Les cellules ont été ]_q de nouveau examinées pour déterminer la viabilité qui n'avait pas été modifiée par rapport au niveau de pré-incubation. Le mode opératoire a été répété lors de trois occasions séparées.
Les cellules provenant de cette expérience ont été 15 injectées dans des rats Fischer par voie sous-cutanée à une g dose de 1 x 10° cellules. Cinq animaux ont été injectés dans les cellules traitées par le polymère et comparés à cinq animaux qui ont reçu des cellules à tumeurs traitées comme ci-dessus, mais sans polymère ajouté. Les résultats sont résu-20 més dans le tableau XII.
TABLEAU XII
Rat η73 Τ' Contrôles ~Π·Τ~ Animaux expérimen- 1
taux (2) * I
Jours pour la forma- Jours pour la forma-J tion d'une tumeur tion d'une tumeur de 25 de 2-3 cm 2-3 cm ! “ I 11 11 2 11 11 3 13 13 4 11 11 30 ___L !3_ _ _ _11___ g - » (1) 1 x 10 cellules de tumeurs non incubées avec le polymè re, inoculation par voie sous-cutanée g (2) 1 x 10 cellules de tumeurs pré-incubées avec le polymè re provenant de l'exemple 7-tableau VI-A, inocu-35 lation par voie sous-cutanée
Il n'v avait pas de différence entre ces animaux en ce qui concerne le temps pour la formation ou le développement 53.
des tumeurs. En outre,la configuration de croissance de la tumeur après cette expérience était comparable entre les deux groupes. La conclusion tirée de ces expériences est que, pour la dose utilisée, le polymère provenant de l'exem-5 pie 7-tableau VI-A (21,7 % d'imide) n'avait pas un effet - cytotoxique direct sur les cellules de tumeurs BLCa. En ou tre, la pré-incubation du polymère avec la cellule de tumeur n'a pas modifié l'antigénicité des cellules de tumeur.
EXEMPLE 19
La toxicité directe du polymère contenant des groupes imides provenant de l'exemple 7-tableau VI-A a été déterminée sur des rats normaux Fischer. A la fois une injection intrapéritonéale et intraveineuse du polymère se composait d'approximativement 1 ml de solution saline physiolo-2^5 gique contenant la quantité appropriée de polymère. Pour déterminer la toxicité, un polymère aux doses de 100 mg/kg, avec des incréments croissants de 100 mg/kg jusqu'à 1.000 mg/kg, a été administré aux cinq animaux dans chaque groupe de doses. Le polymère a été administré à la fois par voie 9Q intrapéritonéale et par voie intraveineuse. Aucune toxicité ou aucune mort d'animaux n'a été observée avec des animaux utilisant la voie intrapéritonale jusqu'à 30 jours d'observation pour un total de 50 rats. La toxicité a été, cependant, observée quand un polymère a été fourni à des do-25 ses de 800 mg/kg (voie intraveineuse) et plus. Il apparaissait qu'un sur cinq animaux, au taux de 800 mg/kg, deux sur cinq animaux, au taux de 900 mg/kg, et quatre sur cinq animaux au taux de 1.000 mg/kg avaient des convulsions par administration intraveineuse de polymère et mouraient. Aucune 3Q toxicité ou aucune mort n'a été notée pour les animaux ayant reçu des doses par voie intraveineuse de 700 mg/kg ou moins, pendant la période d'observation de 30 jours (35 animaux).
Après la période d'observation de 30 jours, les 85 rats survivants ont été sacrifiés et le cerveau, le pou- 35 mon, le coeur, le foie, le rein et la rate provenant de cha que rat ont été soumis à une étude pathologique globale et au miscrocope. Aucune anormalité associée aux médicaments 54 .
n'a été observée dans l'un quelconque des tissus d'organe.
Dans une autre étude, la toxicité du polymère indiqué ci-dessus, administré par voie intrapéritonéale, a été comparée à celle du polymère administré par voie orale. Le 5 polymère provenant de l'exemple 7-tableau VI-A a été adminis-" tré, aux doses de ÎOO mg/kg, 500 mg/kg etl.OOO mg/kg par injection (voie intrapéritonéale) ou par gavage (voie per oral), à chacun des cinq rats Fischer par groupe de doses.
Les rats ont été observés pendant 14 jours et aucune mort j^q ou aucune manifestation de toxicité ne s'est produite. Après 14 jours, tous les animaux ont été sacrifiés, à la fois par administration du médicament par voie intrapéritonéale et per oral et le cerveau, le poumon, le coeur, le foie, le rein et la rate provenant de chaque animal ont été soumis à l'étude 2^ pathologique globale et à l'étude pathologique au microscope. De nouveau, aucune anormalité n'a été observée dans l'un quelconque des tissus d'organe.
EXEMPLE 20
Les polymères de la présente invention, comme décrit 2q dans les exemples 3 et 4, ont été évalués dans des rats de Lewis normaux pour déterminer leur aptitude à stimuler les réponses d'immunisation, exprimé par l'augmentation des cellules productrices d'anticorps 19-S (IgM) vis-à-vis d'érythrocytes hétérologues (globules rouges du sang de mouton, dits 25 SRBC) par le procédé d'évaluation standard dit Jerne Plaque.
On se reportera à "Textbook of Immunology", J.T. Barrett, C.V . Mosby Company, 1978 et "Immunology", H.N. Eisen,
Medical Department, Harper and Row Publishers Inc., 1974.
Dans un test typique, un animal, dans ce cas des rats de Le-3q wis, est immunisé avec 1 ml d'une dilution 1 : 5 des SR3C lavées dans une solution saline physiologique par l'intermédiaire de la veine de la queue. Au même moment, les animaux reçoivent des injections, par voie intrapéritonéale, du polymère indiqué dans 1 ml de solution saline physiologique.
35 Après 4 jours, les cellules de la rate provenant des animaux immunisés sont revêtues dans un système de culture de tissu sur agarose avec des SRBC. Le milieu de culture de tissu en- 55 .
tretient la croissance et l'excrétion d'anticorps par des cellules à synthèse d'anticorps. Ces anticorps diffusent à partir de la cellule d'origine et se fixent sur les érythrocytes voisins.Le complément de sérum (sérum normal de cochon 5 d'Inde) est ajouté en favorisant la lyse des SRBC qui ont été ? revêtues par l'anticorps en formant une surface claire, ou plaque, autour de la cellule formant des anticorps. Ces plaques (PFC) sont comptées et exprimées sous forme des nombres g de PFC pour 1 x 10 cellules de rate. Les résultats sont ré-10 sumés dans le tableau XIII. Toutes les compositions de polymère dans le tableau XIII ont été testées au taux de 30 mg/ kg.
TABLEAU XIII
P5 [ Source de [Tôïïrcenta^TNombre to- ~ 3" -in6 Indice de polymère ge d'imi- tal d'anl- t |u · 1 stimula- provenant de prove- maux en tion__ de l'exem- nant du moyenne Contrôle= pie n° rapport 1,00 imide/ ami de ___aux IR _ _________ 20 Aucune (Contrôle) 16 568 1,00 2a 0 10 1564 2,75 3-IV-l 5,3 6 1446 2,54 4 6,5 6 1478 2,60 3-IV-3 11,5 10 1620 2,86 25 3-IV-4 16,5 10 1770 3,12 16,0 6 1866 3,28 3-IV-6 24,1 10 1968 3,46 24,4 6 1984 3,49 3-IV-7 28,2 10 1992 3,51 32,6 6 1268 2,23 3-IV-8 34,7 ÎO 1664 2,93 3-IV-9 50,1 10 926 1,63 30 -----------—----
EXEMPLE 20-A
Dans une autre série d'expériences, les effets du polymère provenant de l'exemple 7-tableau VI-A sur la réponse d'anticorps IgM à l'antigène des SRBC (de nouveau en utilisant le procédé d'évaluation dit Jerne Plaque comme dans 35 l'exemple 20) ont été évalués (1) dans des rats de Lewis normaux avec le polymère donné par voie intrapéritonéale ou 56.
orale et (2) dans des rats de Lewis comme remplacement de la fonction du thymus, de nouveau le polymère étant donné par voie intrapéritonéale ou orale. Dans le cas (1), le mode opératoire suivait celui de l'exemple 20. Dans le cas (2), 5 la fonction normale du thymus a été supprimée par la thymectomie pour adulte (Tx) qui a été réalisée par voie chirurgicale à l'âge de 8 à 12 semaines et avec des doses importantes d'irradiation totale de l'organisme (TBI), suivi de repopulation des cellules de la moelle de” os (BM). La thymeeto-10 mie, l'irradiation totale de l'organisme et la repopulation de cellules de la moëlle des os ont tous été réalisés par des modes opératoires standard décrits par Falk, R.E. et collaborateurs Surgery, Octobre 1978 par Falk, R.E. et collaborateurs, Abstract, Canadian Society for Clinical 15 Investigation, 24-27 janvier 1978 Vancouver et par Falk R.E. et collaborateurs Abstract, Royal College of Physicians and Surgeons, 25-28 janvier 1978, Vancouver.
Dans ces modes opératoires, le TBI et la repopulation des BM ont été réalisés deux jours après la thymecto-20 mie chirurgicale. Pour la TBI, les animaux ont été irradiés en utilisant une source de césium 137 (Atomic Energy of Canada) . La dose de rayonnement dans cette machine est calibrée par le fournisseur et est appliquée de manière équitable sur toute la surface de l'organisme des animaux placés 25 dans le récipient. Pour la repopulation des BM, des suspensions individuelles de cellules de la moëlle des os ont été préparées en lavant les os longs du fémur et du tibia dans le rat avec une solution de sel équilibrée (BSS) à 4°C.
Les cellules ont été lavées trois fois dans le BSS et com-30 ptées dans un hémocytomètre pour déterminer la viabilité et la dilution appropriée des cellules.Les cellules ont été administrées par voie intraveineuse en utilisant des préparations ayant plus de 90 % de viabilité. Pour chaque repopu-
Q
lation des BM des rats, 1 x 10 cellules étaient appliquées. 35 Le taux de mortalité des animaux pour le mode opé ratoire total Tx + TBI + BM était inférieur ä 10 %. On a laissé alors ces animaux revenir à l'état normal pendant une 57.
période de 6 semaines avant de réaliser la réponse d'anticorps IgM aux SRBC.
Après la période de retour à la normale, le polymère de l'exemple 7-tableau VI-A et les SRBC ont été adminis-5 très comme dans l'exemple 20. Les résultats de l'expérience globale sont présentés dans .le tableau XIII-A.
TABLEAU XIII-A
Réponse d'anticorps IgM des rats de Lewis
Polymère Traitement NombrëTDôsë^ [Réponse Indice de 10 des ani- d'ani- mg/kg/ moyenne stimula- maux maux voie IgM~PFC/ tion,con- d'ad- 1x10^ trôle = minis- cellules 1,00 tra- de rate _________________________ tion___
Aucun Contrôles 15 normaux sans traitement 10 — 174,2
Exemple 7-tableau VI-A Normal 10 30x/voie 836,0 4,78 intrapé-ritonéa- 20 le
Exemple 7-tableau VI-A Normal 10 30 /voie 865,6 4,96 orale
Aucun Tx,950R,BM,
Contrôles*“4 10 — 73,6 25 Exemple 7-Tx,950R,BM 10 30x/voie 740,4 10,10 tableau intrapé- VI-A ritonéa- le
Exemple 7-Tx,950R,BM 10 30x/voie 474 ,0 6,42 tableau orale
VI-A
30 x Des résultats semblables ont été obtenus avec 15 mg/kg xx Tx = thymectomie R = Rads d'irradiation totale de l'organisme BM = Moelle des os reconstituée EXEMPLE 21
Neuf polymères à diverses teneurs en imide (O à 35 35 %) et identiques à de nombreux polymères parmi ceux décrits dans l'exemple 20, tableau XIII,ont été évalués sur des rats Fischer pour déterminer leur performance compara- ! 58.
ble en fonction du pourcentage d'imide pour empêcher la récurrence ou le retour de tumeur principale de BLCa après la nouvelle section des tumeurs. Le mode opératoire expérimental suit celui décrit dans les exemples 15, 16 et 17, sauf 5 que, dans ce cas, 10 rats ont été utilisés pour tous les groupes de doses et les contrôles et les diverses compositions d'imide ont été dosées à la fois à 30 mg/kg et à 15 mg/kg par injection intrapéritonéale dans 1 ml de solution saline. Les contrôles ont reçu seulement 1 ml de solu-10 tion saline par voie intrapéritonéale. Un groupe de 10 animaux a reçu 30 mg/kg, par voie orale, de polymère de l'exemple 7-tableau VI-A (21,7 % d'imide) comme noté. Toutes les tumeurs ont été retirées par voie chirurgicale 11 jours après l'implantation par trocart et les produits pharmaceu-15 tiques ont été administrés suivant des doses uniques, comme ci-dessus, un jour après l'excision des tumeurs. Les résultats sont résumés dans le tableau XIV. Le fait que la moyenne des jours pour la récurrence des tumeurs pour les 10 contrôles soit de 32,3, se comparant bien avec la moyenne de con-20 trole de 34 jours (4 rats) dans l'exemple 16, est particulièrement intéressant.
59.
TABLEAU XIV
I N° iSource de,Pour- Dose Nombre d'animaux avec récur- ' .polymère j cen- mg./ I rence des tumeurs après X se- , exemple tage kgx j maines après la nouvelle i 5 d'imi- I section des tumeurs ____de___|X=1 2__3 4 5 6 _7 8 9 10 1. Contrôle --- --- O 1 2 3 5 10 — — — — 2. 2a 0 30 0023333445 15 0 02355 5 667 3. 3-tableau 5,3 30 0 00001 1 123 IIV-1 15 0 02222 2 223 10 4. 4 6,5 30 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 15 0001233355 5. 3-tableau IV-4 16,5 30 0 00000 0 000 15 0 00122 2 223 6 .X· 7-tableau 15 jvi-A 21,7 30 0 00000 1 244 7. '3-tableau !lV-6 24,1 30 0 00011 1 111 I 15 0000011222 i 8. — 24,4 30 0 00000 0 013 15 0 00135 5 666 20 9. 3-tableau IV-7 28,2 30 0 01355 5 566 15 0 00123 3 467 10. 3-tableau IV-8 34,7 30 0 00223 3 334 15 0 01123 3 334 _L_i_i__-J___._-___-__ 25 x Dans l'exemple 6, le polymère est administré par voie ora-le, dans tous les autres exemples par voie intrapéritonéale. Tous les groupes sont de 10 rats par dose.
EXEMPLE 22
Le dérivé à 100 % d'imide de 1'EMA (viscosité spé-30 cifique = 0,66) provenant de l'exemple 5-A a été évalué pour déterminer l'inhibition de croissance de tumeurs dans un laboratoire d'expérimentation indépendant, en utilisant le mode opératoire suivant.
Le sarcome 180 solide a été implanté par trocart 35 (diamètre 2 mm) dans le flanc de souris suisses mâles.
Le polymère provenant de l'exemple 5-A a été administré par injection intrapéritonéale à la dose indiquée, dans 0,5 ml 60 .
de solution saline pendant six jours consécutifs, en partant du premier jour après l'implantation de tumeurs. Le groupe de 5 souris a reçu 25,50 et 100 mg/kg de dose, comme décrit. Des doses supérieures de 200, 400 et 800 mg/kg se sont ré-5 vëlées toxiques, comme indiqué. Le jour après la dernière injection de produit pharmaceutique par voie intrapéritonéale, les animaux ont été sacrifiés et la tumeur retirée par dissection et pesée. L'inhibition de tumeur a été calculée en pourcentage des poids de tumeurs des animaux traités, 10 divisés par les poids de tumeurs des animaux de contrôle.
Les résultats sont présentés dans le tableau XV, indiquant qu'il n'y a aucune activité présentée par le dérivé I 100 % d'imide de l'EMA.
TABLEAU XV
15 Dose de Isouris SourisTPcTids^oids [Poids moyen 'inhibition produit au dé- à la moyen moyen de la tu- pour les pharma- part fin ini- final, meur exci- animaux ceuti- tial, g sêe, mg expérimen- que g tês/contrô- ! mg/kg les, en % .
(P__________________ ! 2o 25 5 5 27,0 31,4 1074,4 ^9 ί
Contrôle 5 5 27,6 32,2 985,4 — | i 50 5 5 26,8 34,0 724,4 +26 ;
Contrôle 5 5 27,6 32,2 985,4 — | 100 5 5 26,8 31,0 587,6 -16
Contrôle 5 5 29,0 32,3 505,8 25 200 5 2 60 % des ani- NC(2) j maux mouraient
Contrôle 5 5 29,0 | 32,3 505,8 — ! 400 5 3 40 % des ani- NC^2^ maux mouraient
Contrôle 5 5 27,6 | 32,2 | 985,4 800 5 0 100 % des ani- 30 maux mouraient —
Contrôle 5 5 27,6 i — j i ______I___!--i (1) Souris mâles suisses : sarcome-180 par une dose administrée par voie sous-cutanée par trocart, pendant 6 jours consécutifs par voie intrapéritonéale dans 0,5 ml 35 de solution saline, après l'implantation de tumeur. Les animaux ont été sacrifiés le jour après la dernière injection de produit pharmaceutique.
61.
(2) Non calculée par suite d'une toxicité aiguë EXEMPLE 23
Un polymère préféré de la présente invention a été évalué dans des rats normaux de Lewis pour déterminer l'ac-5 tivité possible dans l'augmentation des nombres de macrophages du péritoine et leur activité pour avoir une action de phagocyte sur les particules de latex de polystyrène/ activité qui a été démontrée pour un certain nombre de modulateurs de système d'immunisation tels que le Bacille 1_0 CaImette-Guërin (BCG) , le copolymère de pyrane et d'autres agents semblables.
Quatre groupes de six jeunes rats adultes normaux, de Lewis (âgés de 2 à 4 mois) ont reçu une administration de produit pharmaceutique ou de solution saline (contrôles) 15 comme suit. Le groupe I a reçu 1 ml de solution saline administrée par voie intrapéritonéale; le groupe 2 a reçu le polymère de l'exemple 7-tableau VI-A à la dose de 30 mg/ kg dans 1 ml de solution saline administrée par voie intrapéritonéale; le groupe 3 a reçu le polymère de l'exemple 7- 20 tableau VI-A au taux de 30 mg/kg dans 1 ml de solution sa line administrée par voie orale et le groupe 4 a reçu 0,1 mg de BCG dans 1 ml de solution saline administrée par voie intrapéritonéale.
Le premier, le troisième et le cinquième jour après 25 l'administration indiquée ci-dessus, deux rats de chacun des quatre groupes indiqués ci-dessus ont été sacrifiés et les cellules de la cavité du péritoine ont été récoltées.
La récolte utilisait le mode opératoire suivant. 100 ml de milieu refroidi dit RPMI 1640 ont été injectés par voie 30 intrapéritonéale et, après un massage modéré, le fluide total du péritoine a été drainé et les cellules provenant de chaque cavité individuelle du péritoine ont été séparées par rotation à 1.000 tours par minute. Ces cellules ont été tachées avec le produit de tachage dit NSE (estérase non spé-35 cifique) et lavées trois fois avec des milieux refroidis (4°C). Finalement, les cellules provenant de chaque cavité s t 62 .
individuelle ont été mises en suspension dans 10 ml de milieu et comptées pour obtenir le nombre moyen de cellules se composant de 80-95 % de macrophages obtenus à partir de chaque cavité du péritoine, en fonction du type de groupe 5 de traitement indiqué ci-dessus et en fonction du temps (jours) après traitement.
L'activité de phagocytose des particules de latex pour chaque série de cellules de la cavité du péritoine a été déterminée comme suit. Une suspension de cellules indi-10 quées ci-dessus a été préparée à une concentration de 40-50 millions de cellules par ml de sérum de foetus de veau â 50 % plus le milieu dit RPMI dans un tube de 5 ml. Dans la suspension, on a ajouté 100 lamda de latex de polystyrène (10 % de solides, diamètre de particules = un micron, de la 15 société dite Dow Diagnostics, Indianapolis, Indiana) et le mélange a été soumis à l'incubation· pendant 1 heure à 37°C.
On a alors fait tomber les cellules par une rotation, elles ont été lavées 3 fois avec le milieu dit RPMI et finalement remises en suspension dans 0,5 ml de solution saline. Des 20 plaques des suspensions de cellules ont été préparées et examinées au microscope pour déterminer l'importance de la phagocytose des particules de latex dans la cellule de macrophage. Les cellules qui contenaient Ί0 (ou davantage) par-= ticules de latex ont été considérées comme positives et le 25 nombre total de ces cellules (celles contenant 10 ou davantage particules de latex) a été exprimé en % du nombre total de cellules dans la suspension.
Les résultats de ces expériences sont présentés dans le tableau XVI pour des expériences réalisées en dou-20 ble.
Les résultats dans le tableau XVI montrent, de manière concluante, que le polymère préféré de la présente invention n'augmente pas les valeurs de macrophage du péritoine par rapport aux valeurs de contrôle, quand on l'adminis-25 tre par voie intrapéritonéale ou orale et, en outre, l'activité de phagocytose de latex de ce macrophage du péritoine n'est pas augmentée par rapport à l'activité normale de ma- 63.
crophage. Par opposition, d'autres modulateurs de système d'immunisation, tel que présenté par des résultats sur le BCG, augmentent grandement le nombre de macrophages du péritoine et ces macrophages ont une activité de phagocytose 5 de latex grandement augmentée. Cette forte activité diminue jusqu'à des valeurs normales après trois jours et au-delà.
Par opposition aux résultats montrés ci-dessus qui indiquent que les polymères de la présente invention n'activent pas la fonction de macrophages, les résultats dans les exemples 20 et 20A montrent que ces polymères agissent néanmoins comme modulateurs de cellules B dans les animaux normaux et stimulent la réponse d'anticorps des cellules B quand on les administre par voie intrapéritonéale ou orale. En outre, cet effet est noté même en l'absence de la fonction du thymus, ]_5 ce qui indique que les polymères de la présente invention servent de remplacement de la fonction du thymus dans l'activation des cellules B pour la production d'anticorps augmentée.
TABLEAU XVI
Nombre de macrophages du péritoine et leur activité quand on 20 les traite comme décrit dans l'exemple 23
Jour où Traitement T Expérience 1 Expérience 2 ~~ l'on a Nombre Absorp- iNombre Absorp- sacrifié de cel-tion de de cel- tion de les ani- Iules latex Iules latex maux pour % de pour % de après chaque cellules chaque cellules 25 l'admi- cavité avec plus cavité avec plus; ^ nistra- xlO6 de 10 x 106 de 10 tion de particu- particu- : produit les de les de pharma- latex latex _ ceutique_____________________ 1 Contrôle (1,0 ml 3q de solution saline) 10 25 3 2 9 18 31 3 21
Exemple 7-tableau VI-A,30 mg/kg,voie 5 27 11 30 intrapéritonéale14 9 27 13 25
Exemple 7-tableau VI-A,30 mg/kg, 7 27 4 20 voie orale14 6 31 6 15 BCG, 0,1 mg,voie 1 intrapéritonéale 27 97 26 90 33 97 28 84 64 .
TABLEAU XVI (Suite) 3 Contrôle (1,0 ml de ; solution saline) j 5 8 5 20 6 . 11 4 15
Exemple 7-t.ableau VI-A, 30 mg/kg, 5 voie intrapéritonéale* 3 11 8 30 6 8 8 15
Exemple 7-tableau VI-A, 30 mg/kg, voie oralex 5 20 8 11 5 8 6 10 BCG, 0,1 nig, voie ]_q intrapéritonéale 4 9 6 25 8 13 15 32 5 Contrôle (1,0 ml de solution saline) 3 26 1 16 2 23 1 7
Exemple 7-tableau VI-A, 30 mg/kg, χ ic voie intrapéritonéale 5 45 5 12 6 37 3 10
Exemple 7-tableau VI-A, 30 mg/kg, voie orale* 2 45 1 15 13 37 1 11 BCG, 0,1 mg, voie intrapéritonéale 3 26 2 20 20 [_____________6 1 38 I 7_25 x Des cellules du type, lymphocyte ont été extraites de la rate, du thymus, des nodosités de la lymphe et de moelle des os de tous les animaux traités avec le polymère provenant de l'exemple 7-tableau VI-A et, en aucun cas, il 25 n'y avait d'activité de phagocytose de latex notée comme étant supérieure à celle pour des cellules semblables obtenues à partir des rats de contrôle .
Divers autres exemples à titre d’exemples, illustrant encore la présente invention,peuvent être réalisés 30 par substitutiond 'autres matières sensiblement équivalentes aux matières spécifiques indiquées dans les exemples précédents.
Ainsi, le propylène peut être substitué à une quantité équivalente d'éthylène dans les exemples précédents, 35 comme illustration des monomères oléfiniques définis avec des résultats sensiblement semblables.
65.
Egalement, l'anhydride citraconigue peut être substitué à une quantité équivalente d'anhydride maléique dans les exemples précédents à titre d'illustration des anhydrides carboxyliques définis avec des résultats sensi-5 blement semblables.
Des polymères à poids moléculaire moyen encore inférieurs peuvent être préparés par fractionnement dans un produit solvant-produit non solvant du polymère d'EMA préparé dans l'exemple 1, ci-dessus. Le polymère à poids molé-culaire inférieur peut être alors substitué à une quantité équivalente du polymère de l'exemple 1 dans les exemples précédents, avec des résultats sensiblement semblables.
D'autres sels pharmaceutiquement acceptables d'imi-des de la présente invention peuvent être réalisés en trans-^5 formant les dérivés de sels d'ammonium en sels tels que, par exemple, de sodium, et de potassium. Par exemple, le dérivé de sel d'ammonium de l'exemple 3, tableau IV, essai 4, ci-dessus, peut être transformé en dérivé de semi-ami-de, semi-carboxyle libre par passage d'une solution aqueuse 2o à 5 % du sel d'ammonium à travers une colonne êchangeuse de cations, faiblement basique, par exemple, le produit dit Amberlite IRC-84 (copolymère acrylique réticulé de la société dite Rohm and tlaas Company) . La solution résultante sous la forme carboxylique libre peut être alors neutralisée 25 avec NaOH ou KOH, respectivement, et la solution neutralisée séchée par congélation pour obtenir les dérivés de sel de sodium et de potassium correspondants.
Le polymère d'EMA à faible poids moléculaire de l'exemple 1-ci-dessus peut être également transformé en 30 semi-monométhylamide secondaire, semi-sel formé de carboxyla-te de monométhylamine par le mode opératoire de l'exemple 2(a) en faisant réagir la solution d'EMA et d'acétone avec une solution de méthylamine dans l'acétone au lieu d'ammoniac dans l'acétone. Le produit peut être alors chauffé au 35 reflux dans le xylène pour obtenir un dérivé d'imide partielle à substitution N-méthyle, qui a une fonction imide ainsi que la présence de fonctions méthylamide secondaire, 66 .
C00“ ionisé et carboxylate d'amine.
Des modes opératoires détaillés à titre d'illustration pour réaliser les autres exemples précédents avec les résultats qui s'y rattachent sont les suivants : 5 EXEMPLE 24
Un copolymère, à faible poids moléculaire, de pro-pylène et d'anhydride maléique a été préparé de manière semblable à celle décrite dans l'exemple 1. Dans le réacteur, on a introduit 196 g d'anhydride maléique dissous 10 dans 1.600 ml d'éthylbenzène, contenant 7,30 g de peroxyde de benzoyle. La température a été amenée à 80°C et la pres- 2 sion réglée à 2,8 kg/cm par l'addition de 42 g de propylè- ne à partir d'un cylindre de propylène monté sur un plateau.
Ensuite, la pression de prooylène a été maintenue à 2,8 kg/ 2 15 cm pendant une période de 19 heures à la température de réaction de 80°C. A la fin de l'essai, la bombe a été refroidie et mise en communication avec l'atmosphère, et la boue de copolymère propylène/anhydride maléique dans 1'éthylbenzène a été traitée comme décrit dans l'exemple 1, par 20 trois extractions de la boue dans du xylène, suivies de trois extractions de la boue dans l'hexane, de filtration et de séchage avec un vide total de la pompe a huile à 60°C. Le produit final se composait de 269 g (rendement 87,3 %) et une solution à 1,0 % dans la DMF à 25°C avait une viscosité 25 spécifique de 0,0590.
Le copolymère à faible viscosité propylène/anhydride maléique (PMA) produit, préparé ci-dessus, a été transformé en semi-amide primaire, semi-sel fermé de carboxylate d'ammonium par le mode opératoire exact décrit (pour l'EMA) 30 dans l'exemple 2a. A partir de 26,0 g de PMA, on a obtenu 36,3 g (rendement 115,5 %) de produit séché au four (35°C, vide de 20-25 mm Hg). La composition fonctionnelle par analyse aux infrarouges du produit indiquait seulement la présence de groupes amides primaires, carboxyles ionisés et 35 carboxylates d'ammonium. Aucune fonction imide n'était présente .
La semi-amide, semi-sel formé de carboxylate d'ammo- 4 67 .
nium,préparée à partir d'un PMA à viscosité spécifique de 0,059/ a été transformée en une composition contenant des groupes imides partielles par le mode opératoire décrit dans l'exemple 3. Un échantillon de 20 grammes de l'amide-5 sel d'ammonium a été transformé en boue dans 400 ml de xylêne et la boue chauffée au reflux comme dans l'exemple 3. La boue a été chauffée au reflux pendant 33 minutes, avec une température finale de 139°C, en rassemblant 1,1 ml d'eau, et le produit traité comme décrit, en obtenant 15,3 10 g (rendement 79,6 %) de produit final. L'analyse dans l'infrarouge du produit montrait que l'échantillon soumis au reflux pendant 33 minutes contenait 19,0 % d'imide, en plus de la fonctionnalité amide et carboxylate d'ammonium.
Le pourcentage d'imide a été déterminé, dans ce cas, en se 15 référant à la courbe standard de composition - rapports de capacité d'absorption imide/amide pour l'EMA, comme décrit dans l'exemple 5. Le pH d'une solution aqueuse à 2 % était 5,43 avant le réglage et la lyophilisation. Après réglage à un pH de 9,5, la filtration et la lyophilisation, le pH 20 était 5,50,1a teneur en azote était 10,26 et la teneur en imide était 19,0 % en poids, comme déterminé par infrarouge .
Le dérivé de PMA indiqué ci-dessus contenant des groupes imides a été évalué sur des rats Fischer en utili-25 sant la tumeur dite BlCa pour les propriétés d'antimétastase et la non récurrence de tumeur après la nouvelle section, comme décrit dans les exemples 13 et 15. Il y avait 10 animaux dans le groupe de contrôle qui n'a pas reçu de produit pharmaceutique après l'excision des tumeurs (10 30 jours après l'implantation) et 10 animaux qui ont reçu une seule dose de 30 mg/kg par voie intrapéritonéale au moment de l'excision des tumeurs. Les résultats sont résumés dans le tableau suivant.
68.
j n Incidence Incidence Incidence Animaux de la ré- de la mort de la mé- ayant sur- currence tastase vécu au lors de bout de 16 ________la mort__semaines 5 Contrôles ΓΪΟ 10/10 10/10 (avec 10/10 (avec 0 18-50 récurrence) récurrence) jours 48-67 jours
Moyenne Moyenne 59 32.7 jours jours
Expé- riencex 10 3/10 3/3 (avec 1/3 (avec 7 -*-0 30-38 récurrence) récurrence) jours 61-70 jours
Moyenne Moyenne 66 34.7 jours jours x 30 ing/kg, dose unique, voie intrapéritonéale le jour de l'excision de la tumeur 15 n = nombre d'animaux EXEMPLE 25
Un copolymère, à faible poids moléculaire, d'éthylène et d'anhydride citraconique, a été préparé de manière semblable à celle décrite dans l'exemple 1. Dans ce cas, la 20 charge dans les matières du réacteur était 228,0 g d'anhydride citraconique à la place d'anhydride maléique,1.874 ml d'éthylbenzène et 15,6 g de peroxyde de benzoyle dans 161 ml d1éthylbenzène. La pression d'éthylène a été maintenue à 2 ^ 14 kq/cm et la réaction a été réalisée à 70°C pendant un total de 27 heures et demie. Les additions ultérieures de catalyseur ont été réalisées au bout de 3 heures et de 20 heures et demie,se composant de 10,4 g de peroxyde de benzoyle dans 108 ml d'éthylbenzène à chaque fois. Le produit constitué d'un copolymère éthylène/anhydride citraconique, trai-30 té comme dans l'exemple 1, a été obtenu en quantité de 73,5 g (rendement 23,4 %). La viscosité spécifique (1,0 % dans la DMF, 25°C) du copolymère était 0,042.
Le copolymère à faible viscosité éthylëne/anhydri-de citraconique (29,5 g, 0,21 mole) a été transformé en semi-ami de , semi-sel constitué de carboxylate d'ammonium par le mode opératoire décrit dans l'exemple 2a, avec une récupé- 69 .
ration de 37,0 g (rendement 103,0 à) de produit séché sous vide. L'analyse dans l'infrarouge indiquait la présence de fonction amide, carboxyle ionisé et carboxylate d'ammonium mais pas de fonctionnalité imide. Une imide partielle 5 de ce dérivé amide-carboxylate d'ammonium a été préparée en utilisant le mode opératoire de l'exemple 3 par chauffage au reflux d'une boue dans du xylène (400 ml) de 20 g du dérivé d'amide-sel indiqué ci-dessus, pendant 30 minutes. Le rendement en produit était de 15,7 grammes (rendement 83,6 %) ,
Pq et le rapport de capacité d'absorption I/A (infrarouge) était de 1,21, ce qui correspondait à 31,0 % d'imide par comparaison avec la courbe standard pour l'EMA, comme décrit dans l'exemple 5. Le pourcentage d'azote était 9,24 % et une solution à 5 % dans l'eau avait un pH de 5,31.
15 Le produit indiqué ci-dessus, contenant des grou pes imides, constitué de copolymère ammonié éthylène/anhydri-de citraconique a été évalué dans des rats de Fischer en utilisant la tumeur dite BLCa pour déterminer les propriétés de survie, de non récurrence et les propriétés antimétasta-2o ses après la nouvelle section de tumeur, comme décrit dans les exemples 13 et 15. Les résultats sont résumés dans le tableau suivant : . n. incidence Incidence Incidence jSurvie au de la ré- de la de la mé- bout de 25 currence mçrt tastase 16 semaines sur la _ ! mort
Contrôles κΓΊο/ΙΟ '10/10 (avec 10/10 (avec 0 récurrence) récurrence) 18- 50 48-67 jours jours Moyenne 59 _ Moyenne jours Jü 32,7 χ jours
Test 9 4/9 4/4 (avec 0/4 (avec 5 xx récurrence) récurrence) 19- 39 61-78 jours jours Moyenne 70,5
Moyenne jours 35 _ 30 jours______ x 30 mg/kg, dose unique, voie intrapéritonéale, administrée le jour de l'excision de la tumeur « 70.
Excision de la tumeur au bout de 10 jours après l'administration du produit d'implantation de tumeur xx Une mort lors de l'excision de tumeur n = nombre d'animaux 5 EXEMPLE 26
Cet exemple décrit la préparation d'une composition d'EMA à très faible poids moléculaire, obtenue par fractionnement dans un solvant-produit non solvant de polymères d'EMA décrits dans l'exemple 1. A partir de huit pré-10 parations séparées d'EMA, on a amassé 1.284 g d'EMA après séchage toute la nuit à 80°C sous un vide total fourni par une pompe à huile. Ces huit produits en EMA avaient des viscosités spécifiques variables (1 %, DMF,25°C) entre 0,051 et 0,058 (moyenne 0,053) et leurs poids équivalents va-15 riaient de 134 à 142 avec le fractionnement par solvant. Chacun des huit essais (160 g) a été dissous dans 500 ml d'acétone et précipité dans 2,5 litres de toluène durant une période de 10 minutes dans un bêcher de 4 litres et vigoureusement agité avec un agitateur dit Lightning. L'EMA précipité 20 a été filtré (sauf les huit filtrats principaux de liqueur mère pour le traitement du polymère soluble ci-dessous) et les solides ont été transformés en boue une fois dans 2 litres de toluène et deux fois dans 2 litres d'hexane, filtrés et séchés toute la nuit à 50°C avec le vide total fourni par 25 une pompe à huile. A partir des huit essais individuels, on a obtenu au total 1.143 g d'EMA insoluble dans les solvants qui avait une viscosité spécifique moyenne de 0,057 (les huit essais individuels précipités par des solvants avaient une viscosité spécifique variant entre 0,053 et 30 o,060).
La fraction de polymère soluble dans l'acétone-toluène dans les filtrats principaux combinés de la liqueur mère, indiqués ci-dessus a été concentrée jusqu'à fournir une huile lourde par évaporation de tous les solvants dans 35 Un dispositif dit Rotavap sur un bain d'eau bouillante sous un vide de 25-30 mm Hg. Le résidu a été dissous dans 200 ml d'acétone et précipité dans un litre de toluène à la tempe- 71.
rature ambiante pour donner un solide huileux spongieux.
La partie surnageante a été décantée et le précipité a été redissous dans 200 ml d'acétone et reprécipité dans 1,2 litre de xylène à 0°C pour donner un précipité blanc solide. 5 Ce produit a été filtré, lavé deux fois avec 400 ml de xylène et 2 fois avec 300 ml d'hexane et séché toute la nuit à 50°C, sous un vide total fourni par une pompe à huile.
On a obtenu 59 g de produit qui avait une viscosité spécifique (1 %, DMF,25°C) de 0,031, un poids moléculaire moyen en nombre calculé égal à 342 et un poids équivalent par titrage égal à 172,0. Le pourcentage de carbone était 60,92 (valeur calculée=s60,61) et le pourcentage d'hydrogène était 6,03 (valeur calculée = 6,12).
Cinq grammes de la fraction d'EMA à poids équiva-15 lent de 172, à viscosité spécifique de 0,031, indiqué ci-dessus, a été transformé en semi-amide, semi-sel de carbo-xylammonium (carboxylate d'ammonium) par le mode opératoire de l'exemple 2a en obtenant 5,4 g de produit séché au four (50°C, vide d'une pompe).Cinq grammes de cette semi-amide, 2o semi-sel de carboxylammonium ont été transformés en imide partielle par le mode opératoire de l'exemple 3 en chauffant au reflux dans du xylène pendant 1 heure. Le produit sec final (50°C, vide d'une pompe) était en quantité de 3,8 grammes. Cette quantité a été dissoute dans 70 g d'eau 25 (pH : 4,87) et réglée à un pH de 9,4 avec NH^OH, filtrée à travers un filtre de 0,2 micron et séchée par congélation.
Le produit lyophilisé final avait un pH en solution aqueuse de 2,0 %, égal à 5,1, une teneur totale en azote de 12,27 et une teneur en imide de 25,0 % en poids.
3q Le produit a été évalué dans des rats Fischer 344 en utilisant une tumeur dite FBCa pour déterminer la survie, la non récurrence et les propriétés antimétastases après la nouvelle section des tumeurs, commedécrit dans les exemples 13 et 15.
72.
---!-~----f---------> η I Incidence Incidence Incidence Survivants de récur- de la mort de la mé- au bout de rence tastase 22 semai- lors de nés _____________la mort__ 5 Contrôles« 10 10/10 10/10 (avec 10/10 (avec 0 21-37 récurrence) récurrence) jours 45-64 jours
Moyenne Moyenne 29.7 53,7 jours jours 1° TestX,XX 10 6/10 6/6 (avec 1/6 (avec 4 récurrence) récurrence) 21-60 47-102 jours jours
Moyenne Moyenne 39.7 71,7 jours __jours______ 15 x Excision de tumeur le llme jour après l'implantation de tumeur xxDose unique de 30 mg/kg, voie intrapéritonéale, le jour de l'excision des tumeurs.
Le produit a été également évalué pour déterminer 20 son aptitude à stimuler les réponses d'immunisation exprimées par l'augmentation de cellules productrices de l'anticorps IgM pour la stimulation des globules rouges du sang de mouton (antigène), comme décrit dans l'exemple 20,avec les résultats suivants : 25 Nômbrë~dë IgM-PFC/ Indice, contrô- rats dans le 1x10^ cellules le = 1,0 ______groupe___de la rate____
Contrôles 2 634 " 1,00
Test*_J_4____ · 1173__1,85_ x 30 mg/kg, voie intrapéritonéale 30 EXEMPLE 27
La préparation et l'utilité des sels de sodium et de potassium des imides de la présente invention ont été démontrées comme suit. Le dérivé de sel d'ammonium a été prépa-^ ré par des procédés décrits dans les exemples 1, 2a et 3-ta-bleau IV-5 et présentait les analyses suivantes sur le produit séché par congélation : 73 .
Pourcentage total d'azote - 14,15, 13,99
Pourcentage d'azote dans NH4+ - 6,16, 6,09 pH - solution aqueuse à 2%- 6,28 5 Pourcentage en poids d'imide par infrarouge - 20,5
Milliéquivalent de -j- NH^ /g par electrode a NH3 - 4,31
Les sels correspondants de sodium et de potassium de l'imide indiquée ci-dessus, de la présente invention ont été préparés par des techniques classiques d'échange d'ions en utilisant le produit dit IRC-120 de la société dite Rohm and Haas, sous la forme sodium ou sous la forme potassium.
^ Ces colonnes ont été préparées en chargeant 400 ml de IRC-120 (forme H ) dans une colonne appropriée et en fournissant la résine à Na+ par traitement avec 3,8 litres de NaCl, 1,0 molaire (KC1 1,0 molaire dans le cas du potassium), suivi de 4 litres d'eau. Des solutions du sel de NH4+ ci-2q dessus du polymère contenant des groupements imides ont été préparées en utilisant 5,0 g de polymère dissous dans 200 ml d'eau. Ces solutions ont été alors réglées à un pH de 8,0 avec NaOH dilué (ou KOH dans le cas du potassium). Ces solutions dont le pH a été réglé ont été passées à travers 25 les colonnes à Na ou à K respectives,suivant un débit de 15 ml/mn, suivi d'eau jusqu'à ce que 500 ml d'effluent soient rassemblés dans chaque cas. Ces effluents ont été réglés à 6,8-7,0 en tant que valeur de pH avec HCl et séchés par congélation. Les sels obtenus finalement, séchés par con-30 gélation, avaient les propriétés suivantes :
Forme de sel : NH^ Na K
Rendement, g* --- 5,47 5,80
Pourcentage total d'azote 14,07 7,77 7,00
Milliéquivalents 35 de NH^Vg 4,31 0,034 0,036 74.
NH.+ transformé en sel, % --- 99,3 99,3
Chlore, % --- 1,2 5 1,2 2
Na ou K, % --- 10,45 17,08 + 5 x h partir de 5,00 g de sel de NH^ , contient NaCl ou KC1 provenant du réglage du pH avec HCl
Les divers sels indiqués ci-dessus ont été soumis à deux évaluations biologiques, comme décrit ci-dessous : (a) le sel de NH^ d'origine a été évalué dans ‘ des rats Fischer 344 en utilisant la tumeur dite FBCa pour déterminer la survie, la non récurrence et les propriétés d'antimétastases après la nouvelle section des tumeurs, comme décrit dans les exemples 13 et 15, en fournissant les résultats suivants : 2_ 5 __ ________________ ___| n Incidence Incidence Incidence Survivants ' de la ré- de la de la mé- jau bout de currence mort tastase 19 semaines lors de ____________la mort__
Contrôles* 10 10/10 10/10 (avec 10/10 (avec 0 20 récurrence) récurrence) 30-66 53-85 jours jours
Moyenne Moyenne 47,5 74,1 jours jours
Test*,**10 3/10 3/3 (avec 1/3 (avec 7 25 récurrence) récurrence) 32-59 56-86 jours jours > Moyenne Moyenne 49,3 75,0 _ jours_ jours_[____ x Excision des tumeurs le 7me jour après l'implantation 30 de tumeur xx 30 mg/kg, dose unique, voie intrapéritonéale, le jour de l'excision des tumeurs n = nombre d’animaux (b) Les sels indiqués ci-dessus ont été évalués pour 35 déterminer leur aptitude à stimuler les réponses d'immunisation, exprimées par l'augmentation des cellules productrices d'anticorps IgM pour des érythrocytes hétérologues 75.
(SRBC, globules rouges du sang de mouton) comme décrit dans l'exemple 20, avec les résultats suivants :
Source de Nombre de IgM-PFC/ Indice , polymère rats dans 1x10^ cellu- Contrôle = 1,0 5 -Type de sel- le groupe les de la ___rate____
Contrôle 2 500 1,00
Ammonium (NH^ ) 4 1052 2,10
Contrôle 4 534 1,00
Sodium (Na ) 4 970 1,82
Potassium(K+)x 4 1098 2,06 10 Contrôle 2 538 1,00
Sodium (Na )x 2 1373 2,55
Potassium (K+)x 2 996 1,85
Sodium(Na+)xx 3 1523 2,83
Potassium (K+)xx 3 1058 1,97
Contrôle 6 541 1,00
Sodium (Na+)x 5 1254 2,32 15 Potassium (K+)x 5 1044 1,93
Sodium (Na+)xx 6 1607 2,97
Potassium (K+)xx 6 1003 1,85 x 30 mg/kg administrés par voie intrapéritonéale xx 30 mg/kg administrés par voie orale 20 EXEMPLE 28 L'EMA à faible poids moléculaire, provenant de l'exemple I-E (viscosité spécifique = 0,063), a été transformé en semi-monométhylamide secondaire, semi-sel cons-« titué de carboxylate de monométhylamine, par le mode opéra- 25 toire suivant. Une solution de 43,9 g (0,312 mole) d'EMA dans 440 ml de produit réagissant, constitué d'acétone, a été refroidie jusqu'à -78°C dans de la glace sèche-acëtone. Dans cette solution, on a ajouté 71 ml (54 g, 1,74 mole) de méthylamine condensée et 100 ml d'acétone supplémentaire 30 pour permettre une agitation efficace de la boue de produit précipité. Après que la boue de sel de méthylamide-amine a été chauffée jusqu'à la température ambiante (2 heures), elle a été agitée toute la nuit, filtrée et lavée pour la débarrasser de l'excès d'amine avec 3 boues d'acétone (500 ml 35 chacune) et séchée toute la nuit sous 20-25 mm Hg de vide à 35°C , pour obtenir 78,3 g (rendement 123,9 %) de la se-mi-méthylamine secondaire, semi-sel de méthylamine de 1'EMA.
76.
Ce sel de methylamide-amine (20,0 g) a été transformé en boue dans 400 ml de xylène et chauffé au reflux avec agitation pendant 5 minutes et avec un courant d' aspersion dé mé-thylamine à travers la boue, en retirant ainsi 0,75 ml 5 d'eau. Le produit insoluble a été filtré,transformé en boue une fois avec 400 ml de xylène, suivi de trois transformations en boue avec 400 ml d'hexane, filtré et séché à 40°c sous 20-25 mm Hg de vide pour obtenir 16,4 g (rendement 85,2 %) du dérivé d'imide partielle à substitution N-méthyle. 10 Le tracé dans l'infrarouge du produit indiquait une fonc-- tionnalité imide à 1.700 cm ^, ainsi que la présence de fonctionsméthylamide secondaire à 1.645 cm , C00 ionisé et carboxylate d’amine. Le niveau d'imide a été déterminé à 17,0 %, tel que lu à partir de la courbe de capacité d'ab-15 sorption standard I/A pour des compositions d'imide-amide primaire non substituées, comme décrit dans l'exemple 5.Le pourcentage d'azote était 11,41 et une solution aqueuse à 2 % avait un pH de 8,70.
Le produit indiqué ci-dessus, contenant des grou-20 pes N-méthylimide, a été évalué dans des rats Fischer 344 en utilisant la tumeur FBCa pour déterminer la survie, la non récurrence et les propriétés antimétastases après 11 excision de tumeurs comme décrit dans les exemples 13 et 15, en fournissant les résultats suivants : 77.
n Incidence Incidence Incidence "Survivants de la ré- de la de la mé- au bout de currence mort tastase 16 semaines lors de la _______ mort 5 Contrô- ’ les lo 10/10 10/10 (avec 10/10 (avec 0 récurrence) récurrence) 18-50 48-67 jours jours
Moyenne Moyenne 32,7 59 jours jours 10 «
Test lo 3/10 3/3 (avec 0/3 (avec 7 récurrence) récurrence) 35-40 68-77 jours jours
Moyenne Moyenne 37,3 72,7 jours jours 15 i—----u---U------j------ x 30 mg/kg, dose unique, voie intrapéritonéale, administrée le jour de la nouvelle section de tumeur.
Excision de tumeur au bout de 10 jours après l'implantation de tumeur n = nombre d'animaux 20
Préparation de la matière première constituée d1 EMA dans une installation pilote
Des préparations à plus grande échelle de matière première pour EMA et du produit qui en dérive selon la présente invention ont été préparés selon les deux exemples 25 suivants.
EXEMPLE 29 Préparation d'EMA
Le copolymère désiré éthylêne/anhydride maléique (EMA), en tant que matière première, a été préparé dans un 30 autoclave en acier inoxydable de 567 litres, équipé d'une bombe de chargement de 45 litres, pour l'addition d'initiateur, d'un réacteur agité revêtu de verre, convenablement fermé de manière étanche pour la purge par N2 où les produits réagissants ont été mélangés, d'un agitateur à turbi-35 ne, d'une valve ou soupape d'évacuation par le fond, de 7,6 cm, et entouré d'un milieu pour le chauffage ou le refroidis- 78.
sement. Les trois récipients ont été purgés par trois fois avec avant tout chargement des produits réagissants. Dans le mélangeur de produits réagissants revêtu de verre, on a introduit 243 kg d'éthylbenzène et 30 kg d'anhydride maléi-5 que (MA). Le mélange a été chauffé jusqu'à 50°C jusqu'à ce qu'une dissolution complète soit obtenue. Dans cette solution d 'EMA dans 1'êthylbenzène, on a ajouté une solution de 2.340 grammes de peroxyde de benzoyle dans 20,9 kg d'éthyl-benzène préparés dans un récipient séparé.
; 10 La solution de produits réagissants dans l'éthyl- benzène indiquée ci-dessus a été alors ajoutée dans l'autoclave en acier inoxydable de 567 litres,entouré d'un milieu à 40°C, en maintenant une légère purge par l'éthylène. L'agitateur a été réglé à 1.250 tours par minute. Après ad-dition du produit réagissant, le récipient a été rincé dans l'autoclave avec 2,2 kg d'êthylbenzène, déconnecté et la canalisation d'entrée a été fermée par une calotte. Après chargement, l'évacuation de l'autoclave a été fermée et 2 l'autoclave a été pressurisé jusqu'à 5,2 kg/cm avec de 20 l'éthylène et maintenu pendant 5 minutes. Les pressions de la 2
fermeture étanche ont été réglées à 2,75-4,5 kg/cm au-dessus de la pression du réacteur. La température de la fournée a été amenée à 75aC en réglant le milieu d'entourage à 95°C
pendant une période de 45 minutes, après quoi le réacteur a 2 été pressurisé avec de l'éthylène jusqu'à 15 kg/cm . Le temps zéro a été enregistré quand le contenu du réacteur a atteint 75 °C.
Une solution de 1.560 grammes de peroxyde de benzoyle dans 28,2 kg d'êthylbenzène a été préparée et introduite dans 30 la bombe d'addition de catalyseur,d'une contenance de 45 litres. Après 3 heures de réaction de la fournée indiquée ci-dessus à 75°C,et sous une pression d'éthylène de 15 kg/cm , la seconde addition d'initiateur a été réalisée dans l'autoclave et la bombe d'addition a été rincée avec 1,8 kg d'éthvl- 33 benzène. Après la seconde addition de peroxyde de benzoyle, 2 le réacteur a été maintenu à 75°C et sous 15 kq/cm d'éthylène pendant 14 heures de plus, soit au total 17 heures.
« 79.
Après le total de 17 heures, les produits réagissants ont été refroidis jusqu'à 25°C, la pression d'éthylène a été relâchée et le réacteur purgé trois fois avec de l'azote.
La boue d'EMA dans le réacteur, dans l'éthylben-5 zëne, a été évacuée à travers la soupape de décharge par le fond sur un filtre à vide en grés, dit Knutsche, pourvu d'une étoffe de filtre en coton du type coutil. Le filtre a été recouvert d'une chemise en matière plastique et pourvue d'une purge par l'azote. Le gâteau humide filtré a été retransfor-10 mé en boue dans 136 kg de xylène, agité pendant 15 minutes et filtré de nouveau. Ce procédé de retransformation en boue avec du xylène a été répété trois fois, suivi de trois étapes de retransformation en boue-filtration en utilisant 102 kg d'hexane. Le gâteau final, humidifié par l'hexane, de 15 1'EMA a été étalé dans des plateaux en acier inoxydable et séché sous vide à 50°C dans un séchoir à plateaux sous vide dit Devine pendant 48-72 heures, jusqu'à ce qu'aucune odeur de xylène ne soit présente. Le produit séché final pesait 35 kg, soit un rendement de 82,8 %. En tout, on a réalisé, 20 une série de 4 essais de diverses dimensions comme suit. Ce qu'on a indiqué ci-dessus décrit l'essai n° 3 mentionné ci-dessous .
Essai n°"~ Température, Rendement, kg Viscosité spé- °C cifique,solu- 25 tion à 1 % dans
__________________la DMF à 25°C
1 70 ' 11,3“ 0,063 2 75 22,6 0,053 3 75 35,4 0,051 4 _____75_ 11,3 0,052_ EXEMPLE 30 30
Préparation de l'imide partielle d'EMA ammonié L'ammoniation et l'imidation de 1ΈΜΑ (produit de l'exemple 29) ont été réalisées dans un réacteur de Pfaudler revêtu de verre, d'une contenance de 378 litres, équipé d'un dispositif à chicanes et à agitateur à pales rétracta-35 blés, d'une boucle de distillation en acier inoxydable et d’un réfrigérant qui fournissait la possibilité de l'enlê- 80.
vement total du condensât ou du retour de n'importe quelle fraction au distillât dans le réacteur. Le dispositif a été équipé de deux canalisations d'alimentation indépendantes, une pour 1'ammoniac,1'autre pour le liquide, toutes deux . 5 étant conçues pour sortir en-dessous de la surface du milieu réactionnel agité. Chaque canalisation a été équipée d'un filtre à cartouche en ligne et d’un rotamètre pour surveiller et contrôler les débits. La chemise du réacteur fournissait à la fois la chaleur de la vapeur d'eau pressurisée 10 ou le refroidissement, comme exigé. La canalisation d'entrée pour les liquides a été fixée à un réacteur Pfaudler revêtu de verre, d'une contenance de 96,5 litres,où la matière première pour l'EMA a été dissoute dans de l'acétone avant l'addition au réacteur d'ammoniation de 378 litres. Les pro-15 duits finaux provenant du réacteur de 378 litres ont été récupérés par évacuation à travers une valve inférieure sur un filtre à vide recouvert du type Knutszch,en acier inoxydable.
Une suite typique d'ammoniation et d'imidation partielle est décrite comme suit.
20 On a introduit dans le réacteur de 378 litres, 132,3 litres (102 kg) d'acétone filtrée et on a introduit dans le récipient de dissolution de 96,5 litres 81,2 litres (62,5 kg) d'acétone filtrée, tous deux étant sous une atmosphère d'azote. Dans les 81,2 litres d'acétone dans le réci-25 pient de dissolution, on a ajoute 21,3 kg de copolymère d'EMA (préparé comme dans l'exemple 29,essai 4) et l'agitation a été maintenue à 20-30°C jusqu'à ce qu'une dissolution complète soit obtenue. Concurrement, de l'ammoniac anhydre a été ajouté en-dessous de la surface de l'acétone dans le ré-2° acteur de 378 litres au taux de 0,16 kg/minute pendant 5 minutes. Ensuite, la solutiond ΈΜΑ-acétone ci-dessus a été ajoutée sous pression à travers le filtre en ligne, à un taux d'écoulement linéaire pendant une période de 40 minutes (2,1 kq/minute) sortant dans la solution agitée d'acëtone-NH^ dans 25 le réacteur de 378 litres en-dessous de la surface du liquide. L'écoulement d'ammoniac dans le réacteur de 378 litres a été maintenu au taux de 0,16 kg/minute pendant tout le temps 81.
d'addition de l'EMA. Durant ce temps, on a laissé la température du mélange réactionnel s'élever jusqu'à 44-55°C en n'appliquant pas de refroidissement extérieur. L'écoulement d'ammoniac au taux de 0,16 kg/mn a été poursuivi pen-5 dant 15 minutes après l'addition d'EMA. La boue d'EMA ammo-nië précipité a été alors refroidie jusqu'à 25°G et évacuée dans le filtre à vide pour la récupération du produit ammo-nié solide.
Le produit ammonié filtré, constitué par la semi-10 amide, semi-sel formé de carboxylate d'ammonium, a été encore traité en retransformant en boue successivement (20 minutes) trois fois dans des parties de 177 litres d'acétone, avec filtration entre chaque étape de retransformation en boue,et finalement deux fois dans des parties de 15 177 litres d'hexane, suivi de filtration pour donner un gâ teau du produit, humidifié par l'hexane. Un prélèvement de ce gâteau humidifié a été séché pour l'analyse et ne présentait pas d'anhydride par analyse aux infrarouges, mais seulement des groupes amides et des groupes salins formés de 20 carboxylate d'ammonium. Le pH de sa solution aqueuse était 5,88 à une concentration de 2,0 %.
En tout, cinq de ces ammoniations ont été réalisées en utilisant diverses quantités d'EMA, comme indiqué ci-’ dessous. La descriptionci-dessus se rapporte à l'essai 5 25 mentionné ci-dessous : 82.
Essai I "ÉMA uti-jGâteaûT Analyse du produit"sec d'am- lisé,kg humi- j Anhydri- Amide"]Sel de pH d'une|% monia- difié ! de NH4+ solution d'a- tion par aqueuse zote n° l'he- à 2 % c- xane, ______JS2________________ 1 5,4 NR* Absent Pré- Pré- 5,34 12,64 sente sent 2 7,0 20,8 Absent Pré- Pré- 6,27 12,55 sente sent 3 15,9 52,1 Absent Pré- Pré- 6,48 13,51 sente sent 4 15,9 90,7 Absent Pré- Pré- 5,77 13,81 sente sent 5 21,3 NR Absent Pré- Pré- 5,88 13,93 sente sent j x NR : non déterminé
Les gâteaux indiqués ci-dessus, humidifiés par l'hexane d'EMA ammonié ont été utilisés directement dans la séquence d'imidation du procédé d'obtention de dérivé comme suit, qui décrit l'imidation de l'essai 5 d'ammoniation indiqué ci-dessus.
Le gâteau de filtration, humidifié par l'hexane, 20 provenant de l'essai 5 ci-dessus a été introduit dans le réacteur de 378 litres qui contenait 143 litres (124 kg) de toluène et 71,5 litres (62,5 kg)de xylène. Cette boue d'EMA ammonié dans un solvant constitué d'un mélange d'hexa- ne-toluëne-xylène a été chauffée jusqu'à l'ébullition avec 25 aspersion continue avec de l'ammoniac anhydre, au taux de 0,019 kg/mn. Le reflux a commencé à 82°C et toute l'eau qui était présente a été retirée de manière azéotropique suivi d'enlèvement d'hexane jusqu'à ce que la température du mélange réactionnel atteigne 115°C.La température de réaction a 30 été alors maintenue à 115-116 C, comme cela est nécessaire par des additions par incréments d'un mélange toluène/xylène suivant un rapport en volume de 2 : 1 durant l'enlèvement d'eau formée par imidation à cette température. Le chauffage au reflux a été poursuivi pendant 7 heures et demie, avec enlèvement azéotropique d'eau et avec aspersion continue d'ammoniac au taux de 0,019 kg/mn, jusqu'à ce que la 35 83.
transformation désirée en imide soit obtenue, comme déterminé par analyse dans l'infrarouge (voir le tableau suivant).
Quand la transformation désirée en imide a été obtenue, le mélange de boue réactionnel a été refroidi, filtré 5 comme décrit ci-dessus et le produit séparé contenant les groupements imides traité comme auparavant par trois étapes de retransformations en boue en utilisant du toluène (154 kg, 20 minutes), suivi finalement de deux étapes de retransformation en boue en utilisant de l'hexane (119 kg, 20 mi-10 nutes). Le gâteau final filtré, humidifié par l'hexane, a été séché dans des plateaux en acier inoxydable sous vide (pompe à huile) à 50°C pendant 72 heures ou jusqu'à ce que la pression du four à vide soit en-dessous de 3 torr à 50°C.
En tout, quatre essais ont été préparés, correspon-15 dant aux essais 1, 2, 4, 5 de la suite de préparation d'EMA ammoniê, indiquée ci-dessus. Des données intéressantes pour ces essais sont résumées ci-dessous : EMA ammoniê contenant des groupes imides,séché au four 2q Es- EMA uti- Poids de pro-iPourcen- pH de Pourcen- Pourcen-sai lise au duit, kgx tage ap- solu- tage tage idépart, parent tion total d'azote kg d'imide aqueu-d'azote dans par dé- se, NH.+ termi- con- - nation cen- aux in- tra- 25 frarou- tion ge s 2 % 1 5,4 ‘ 4,40 (67,6) " 20,5 5,3 13,26 5,11 2 7 6,42 (77,1) 21,5 5,4 13,33 5,22 4 15,8 17,00 (89,8) 21,0 5,3 13,12 5,01 5 21,3 |21,60 (84,9)__20,5 5,26 1 13,26 4,94 x Poids sec au four à 50°C sous 3 torr 30
Pourcentage de rendement entre parenthèses
Des solutions aqueuses des produits séchés au four indiqués ci-dessus ont été réglées à un pH de 9,5 avec de l'ammoniaque, filtrées jusqu'à être stériles à travers un filtre de 0,2 micron, dans des fioles à sérum, et lyophili-35 sées pour l'utilisation finale. L'analyse finale pour ces quatre essais était la suivante. Les résultats diffèrent de 84.
ceux indiqués ci-dessus par suite de la nouvelle ammoniation des groupes carboxyles qui perdaient de l'ammoniac durant le séchage au four.
Essai [Pour ce n ta - ρΗΓ l^ünë [PouFceiftäge Pourcentage“ 5 ge d'imide solution d'azote d'azote déterminé aqueuse à dans NH4 aux infra- 2 % ____rouges_____________ 1 18/0 5,96 13,78 5,95 2 20,8 6,00 13,96 5,74 4 18,5 6,69 14,54 6,23 10 5___20,0 _6,46__14,20_ 6,13_ EXEMPLE 31
Synthèse au laboratoire d'EMA ammonié contenant des groupes imides, en utilisant un gâteau d'AEMA humidifié par l'hexa-ne directement soumis à un reflux du xylëne sans séchage 15 Des préparations à l'échelle du laboratoire ont été réalisées où l'EMA,dissous dans de l'acétone, a été ajouté pendant diverses périodes de temps à une solution d'acétone dans laquelle on a ajouté de l'ammoniac gazeux suivant divers débits, en laissant la température s'élever de la 20 température ambiante (23-25°C) jusqu'à 50-53°C. L'EMA ammonié précipité a été filtré et la boue lavée avec de l'acétone, suivie de lavage de la boue avec de l'hexane, et filtré. Le gâteau, humidifié par l'hexane, de l'EMA ammonié a été - alors retransformé en boue dans du xylëne et la boue totale 25 chauffée pour retirer l'eau dans deux étapes, (1) enlèvement azéotropique d'eau dans l'intervalle de températures de 75-102°C, provenant de la réaction de NH^ et de l'acétone, suivi de (2) enlèvement d'eau formée durant l'imidation partielle de l'EMA ammonié à une tempéracure élevée (122-132°C) après 30 enlèvement d'hexane. L'imide partielle finale a été obtenue par filtration, suivi de lavage de la boue avec du xylène et de l'hexane. Douze de ces essais ont été réalisés, comme résumé dans le premier tableau ci-dessous. La description suivante résume l'essai n° 10 indiqué dans le tableau.
35 L'EMA provenant de l'exemple 29,essai 1 (280 g, 2,0 moles; a été dissous dans 1,1 litre d'acétone et filtré à travers du papier filtre. Cette solution d'EMA-acétone a « 85 .
été ajoutée pendant une période de 45 minutes à 2,4 litres d'acétone dans un ballon de 5 litres agité pourvu d'un réfrigérant à reflux pour l'enlèvement d'azéotrope, d'un ballon d'addition et d'un dispositif d'aspersion à l'entrée 5 pour l'ammoniac. Les entrées pour le dispositif d'aspersion d'ammoniac et La solution d 1 EtlA-acétone étaient en-des-sous du niveau du liquide dans le ballon de 5 litres.Durant la période d'addition d'EMA pendant 45 minutes, et pendant 10 minutes après, l'ammoniac a été aspergé dans la boue ré-10 actionnelle à un taux de 0,081 mole/minute avec au total une quantité de 4,44 moles d'ammoniac. L'addition d'EMA a été commencée à la température ambiante (23°C) et on a laissé la température de la réaction s'élever sans refroidissement durant toutes les 45 minutes. La température finale de 15 la boue d'EMA ammoniê dans l’acétone était 53,5°C. Le produit ammonié a été filtré, retransformé en boue deux fois dans 2 litres d'acétone (30 minutes à chaque fois), suivi de deux retransformations en boue dans 2 litres d'hexane (30 minutes à chaque fois) et filtré. Le gâteau humidifié par l'hexane 20 a été alors retransformé en boue sans séchage dans 2,7 litres de xylène pour l'enlèvement d'eau et l'imidation partielle. Cette boue d'EMA ammonié, dans de 1’hexane-xylène, a été chauffée au reflux pour retirer l'eau par distillation azéo-tropique en deux étapes. Durant tout ce mode opératoire, de 25 l'ammoniac gazeux a été continuellement aspergé à travers la boue à un taux de 0,030 mole/mn. L'enlèvement d'eau initiale a commencé à 88°C et, pendant une période de 60 minutes, la température s'est élevée jusqu'à 101°C et on a obtenu 9,1 ml d'eau. Le chauffage a été poursuivi avec enlèvement d'hexane 20 jusqu'à ce que l'eau provenant de la formation d'imide soit d'abord obtenue à 125°C. L'eau provenant de l'imidation a été retirée par voie azëotropique en 60 minutes, entre 125°C et · 132°C et,de ce fait,on a obtenu 6,9 ml d'eau. Après imida-tion, la boue a été refroidie jusqu'à 100°C filtrée, lavée 25 par retransformation en boue pendant 30 minutes dans 2 litres de xylène, suivi de deux lavages de la nouvelle boue (30 minutes chacun) dans 2 litres d'hexane, et filtrée. Le produit 86.
filtré a été séché pendant 15 heures à 50°C, sous le vide d'une pompe à huile sous 3 mm Hg.Le rendement en produit séché au four était 31 g (rendement 94,5 %). Le résumé de douze de ces essais est présenté dans le premier tableau ci-5 dessous. Pour l'utilisation finale, le produit séché au four a été dissous dans l'eau (2-5 %) et le pH a été réglé à 9,5 avec NH4OH; le produit a été filtré à travers un filtre de 0,2 micron et lyophilisé dans des bouteilles de sérum.
Les propriétés des produits finaux, lyophilisés et séchés 10 au four, sont données dans le second tableau ci-dessous.
:7.
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88.
Propriétés des produits de l'exemple 31
Essai Produit séché au four [Produit lyophilisé i v Solution Pourcentage Solution ["Pourcentage j aqueuse à en poids aqueuse à en poids 2 %, pH d'imide x 2 %, pH d'imide, x 5 1 5,28 ' 21,5 6,20 17,9 2 4,89 23,2 6,12 21,6 3 4,92 25,2 6,09 22,2 4 4,98 23,2 6,23 19,9 5 5,01 22,8 6,16 21,5 6 5,10 23,5 6,22 20,8 7 5,02 23,0 6,25 19,5 10 8 5,12 24,0 6,14 19,3 9 5,12 23,5 6,18 19,0 10 5,07 22,5 6,06 18,8 11 4,99 22,2 6,18 19,0 12 4,96 23,2 6,10 19,5 x Par analyse dans l'infrarouge
Le mélange total de toutes les fournées indiquées ci-dessus (environ 4.000 g) présentait l'analyse suivante : Séché au four : pH d'une solution aqueuse à 2 % : 5 ,02
Pourcentage en poids d'imide : 20 23,5
Lyophilisé : pH d'une solution aqueuse à 2 % : 6,00
Pourcentage en poids d'imide : 19,5
Le pH de deux fournées de 2.000 g chacune a été réglé à 9,5 avec NH^OH, filtré jusqu'à être stérile et lyo-25 philisé dans des bouteilles de sérum contenant 0,5 g par bouteille pour 1'utilisation, finale dans des tests sur les animaux ou sur les êtres humains, pour donner au total 8.000 de ces fioles.
L'analyse de cette matière d'essai devant fournir 30 une mise en bouteille importante était : pH, solution aqueuse à 2 % - 6,27
Rapport de capacité d'absorption imide/amide dans l'infrarouge - 0,888 35 Pourcentage en poids d'imide - 19,3
Azote total, % 14,49 89 .
Pourcentage d'azote sous forme de NH^ + - 6<27
La grande fournée finale de produit décrit ci-des-v- sus a été évaluée dans des rats Fischer 344 en utilisant 5 une tumeur FBCa pour déterminer la survie, la non récurrence et les propriétés antimétastases après l'excision des tumeurs, comme décrit dans les exemples 13 et 15, en donnant les résultats suivants :
n Incidence """"incidence Incidence Survie au I
de la ré- de la mort de la mé- bout de 16 currence tastase semaines lors de (112 jours) ____________la mort__
Contrôles* 10 10/10 10/10 (avec 10/10 (avec 0 récurrence) récurrence) 15 18-77 jours 51-95 jours
Moyenne Moyenne 45,4 jours 76,8 jours
Test* ,** 10 0/10 0/10 0 10 x Excision des tumeurs au bout de 7 jours après l'implan-?q tation de tumeur xx 30 mg/kg, dose unique,voie intrapéritonéale, le jour de l'excision de la tumeur n = nombre d1 animaux EXEMPLE 32 ± — . — - -- 25 Cet exemple utilise le mode opératoire décrit dans l'exemple 20 pour évaluer des rats de Lewis normaux pour déterminer leur aptitude à simuler des réponses d'immunisation, exprimée par l'augmentation des cellules productrices d'anticorps IgM pour des érythrocytes hétérologues (globu-30 les rouges du sang de mouton, SRBC), sauf que dans ce cas, la composition d'imide de la présente invention a été administrée par dose intraveineuse par l'intermédiaire de la veine de la queue, sous forme de 1 ml de solution saline physiologique contenant la quantité de dose indiquée. Tous 35 les autres détails étaient les mêmes que dans l'exemple 20. Les données suivantes ont été obtenues dans deux expériences .
90.
Dose in- Polymère de l'exemple Polymère de 11 exemple > travelneu- 7-tableau VI-A____3~tableau IV-5__[_ se mg/kg ~îgM PFC/1 Indice de IgM PFC/1 iIndice de i x 106 cel- stimulation, x 106 cel- stimulation, j
Iules de contrôle=l Iules de contrôle =1 I
_ la rate____la rate__l 5 0 (contrô-~ [
le) 562* 1,00 522** 1,00 I
32 1298 2,31 1406 2,69 16 1138 2,02 1282 2,46 8 1215 2,16 1684 3,23 4 1178 2,10 1882 3,61 2 1144 2,04 1238 2,37 10 1 1257 2,24 1100 2,11 0,5 1173 2,09 1844 3,53 0/1 1021 1,87 1022 1,96 x 5 animaux par groupe xx 2 animaux par groupe EXEMPLE 3 3 15 '
Un exemple préféré de la présente invention, comprenant un copolymëre d’éthylène et d’anhydride maléique ayant un poids moléculaire d'environ 850 et dont on a formé un dérivé pour qu'il contienne des groupes semi-amides, 2q semi-sels d'ammonium et des groupes imides, où les groupes imides constituent environ 20 % en poids de ces groupes (ceci étant sensiblement semblable à l'exemple illustré par la figure 1) a été testé sur des êtres humains. Durant une période de plusieurs mois dans des études cliniques à la 25 phase I d'un nombre de malades, allant jusqu'à 72, ayant un cancer gastrointestinal (comprenant des malades ayant un cancer à l'estomac, au pancréas, au colon et au rectum), il n'y avait pas de toxicité importante rencontrée avec le produit pharmaceutique par l'une quelconque des voies intrapéri-2Q tonéale, orale et/ou intraveineuse pour l'administration, et aucun type d'accélération de la progression de la maladie, après le traitement par le produit pharmaceutique, ne s'est produit.
EXEMPLE 34 25 Quand l'isobutylène est substitué à une quantité équivalente du propylène de l'exemple 24, on obtient des résultats sensiblement semblables.
91.
EXEMPLE 35
Quand de l'anhydride diraéthylmaléique est substitué à une quantité équivalente d'anhydride citraconique dans V-' l'exemple 25 on obtient des résultats sensiblement sembla-5 blés.
EXEMPLE 36
Quand de 1ΈΜΑ ayant un poids moléculaire moyen en nombre calculé égale à 300 est substitué à l'EMA ayant un poids moléculaire moyen en nombre calculé égal à 342 dans 10 l'exemple 26, on obtient des résultats sensiblement semblables .
EXEMPLE 37
Quand de l'EMA, ayant un poids moléculaire moyen en nombre calculé égal à 1.500 est substitué à l'EMA ayant un 15 poids moléculaire moyen en nombre calculé égal à 342 dans l'exemple 26, on obtient des résultats sensiblement semblables .
L'appréciation de certaines des valeurs de mesures indiquées ci-dessus doit tenir compte du fait qu'elles pro-20 viennent de la conversion d'unités anglo-saxonnes en unités métriques.
La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui 25 apparaîtront à l'homme de l'art.
Claims (25)
1. Procédé de préparation d'un dérivé immunorégulateur de copolymère de monomère oléfinique ayant environ >- 2 à environ 4 atomes de carbone et d'un anhydride polycarbo- 5 xylique à insaturation en α,β ayant 4 à environ 6 atomes de carbone, caractérisé en ce qu'un dérivé semi-amide, semi-sel d'ammonium de ce copolymère,où le copolymère a un poids moléculaire d'environ 300 à environ 1.500, est mis à réagir avec de 1'ammoniac pour former encore un dérivé du copolymè-10 re tel qu'il contienne (a) des groupes semi-amides, semi-sels d'ammonium et (b) des groupes imides;où les groupes imides forment environ 5 % à environ 40 % en poids de ces groupes dérivés, et, de manière facultative, à transformer ce groupe semi-sel d'ammonium en d’autres groupes salins, pharmaceu-15 tiquement acceptables.
2. Procédé selon la revendication 1,caractérisé en ce que la réaction est réalisée dans un milieu de solvant organique à la température de chauffage au reflux.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé 20 en ce que le milieu de solvant organique est choisi dans le groupe se composant de xylène et de toluène.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le monomère oléfinique est l'éthylène.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé 25 en ce que l'anhydride polycarboxylique est l'anhydride maléique .
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le monomère oléfinique est l'éthylène et l'anhydride polycarboxylique est l'anhydride maléique. 30
7 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le poids moléculaire moyen est environ 850.
8. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 5, caractérisé en ce que le groupe semi-amide, semi-sel constitué de carboxylate est le groupe semi-amide, semi- 35 sel d'ammonium.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le groupe imide forme environ 10 % à environ 25 % 93 . « de ces groupes dérivés.
10. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le groupe imide forme environ 10 % à environ 25 % de ces groupes dérivés.
11. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la température est environ 50°C à environ 200°C.
12. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la température est environ 60°C à environ 150°C.
13. Procédé selon la revendication 2, caractérisé Iq en ce que la température est environ 100°C à environ 150°C.
14. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend des copolymères de monomères oléfiniques, ayant 2 à environ 4 atomes de carbone, et d’anhydrides polycarboxyli-ques à insaturation en α,β, ayant 4 à environ 6 atomes de 3_5 carbone, ayant un poids moléculaire moyen d’environ 300 à environ 1.500,et dont on a constitué des dérivés pour qu’ils contiennent des groupes semi-amides, semi-sels formés de carboxylates et des groupes imides, oü les groupes imides forment environ 5 % à environ 40 % de ces groupes dérivés. 2o
15 - Composition selon la revendication 14, carac térisée en ce que le monomère olêfinique est l’éthylène.
16. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que l’anhydride polycarboxylique est l’anhydride maléique. 25
17 - Composition selon la revendication 14, carac térisée en ce que le monomère olêfinique est l’éthylène et l’anhydride polycarboxylique est l’anhydride maléique.
18. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce que le poids moléculaire moyen est environ 850. 30
19 - Composition selon la revendication 14 ou la revendication 18, caractérisée en ce que le groupe semi-ami-de, semi-sel formé de carboxylate est le groupe semi-amide, semi-sel d’ammonium.
20. Composition selon la revendication 14, carac- 35 térisée en ce que le groupe imide forme environ 10¾ à environ 25 a de ces groupes dérivés.
21. Composition selon la revendication 18, carac- 94. térisëe en ce que le groupe imlde forme environ 10 % à environ 25 % de ces groupes dérivés.
22. Procédé de production d'une réponse immunolo- ~ gique chez un hôte soumis à une chimiothérapie des tumeurs, 5. une thérapie des tumeurs par rayonnement et/ou à une excision des tumeurs, caractérisé en ce qu'on administre à l'hôte une quantité immunorégulatrice efficace de la composition selon la revendication 14.
23. Procédé d'activation de la fonction des cellu- 10 les B pour la production d'anticorps chez un animal ayant une fonction de cellules T dégradées ou épuisée, caractérisé en ce qu'on administre à cet animal une quantité efficace, pour l'activation des cellules B, de la composition de la revendication 14 . 15
24 - Procédé de stimulation de la production d'an ticorps chez un animal, caractérisé en ce qu'il consiste a administrer à l'animal une quantité efficace, favorisant la formation d'anticorps, de la composition de la revendication 15 . 20
25 - Procédé de production d'un agent immunorégu lateur, caractérise en ce qu'un copolymère transformé en dérivé, selon la revendication 14, est dissous dans une solution saline physiologique. v
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