LT5855B - Rekombinantinis viengrandžio antikūno fragmentas, neutralizuojantis vaginolizino citolitinį aktyvumą - Google Patents
Rekombinantinis viengrandžio antikūno fragmentas, neutralizuojantis vaginolizino citolitinį aktyvumą Download PDFInfo
- Publication number
- LT5855B LT5855B LT2010104A LT2010104A LT5855B LT 5855 B LT5855 B LT 5855B LT 2010104 A LT2010104 A LT 2010104A LT 2010104 A LT2010104 A LT 2010104A LT 5855 B LT5855 B LT 5855B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- scfv
- antibody fragment
- vly
- recombinant
- vaginolysin
- Prior art date
Links
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 title abstract description 8
- 241000207201 Gardnerella vaginalis Species 0.000 claims abstract description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 208000004926 Bacterial Vaginosis Diseases 0.000 claims description 7
- 208000037009 Vaginitis bacterial Diseases 0.000 claims description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 28
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 abstract description 15
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 abstract description 12
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 9
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 9
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 3
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 3
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 208000004145 Endometritis Diseases 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 2
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 208000029082 Pelvic Inflammatory Disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 208000018773 low birth weight Diseases 0.000 description 2
- 231100000533 low birth weight Toxicity 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101000654311 Androctonus australis Alpha-mammal toxin AaH2 Proteins 0.000 description 1
- 101000583076 Anemonia sulcata Delta-actitoxin-Avd1c Proteins 0.000 description 1
- 241001135699 Arcanobacterium Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000761697 Hemachatus haemachatus Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000588937 Heteractis magnifica Delta-stichotoxin-Rpa1a Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 101000640206 Tityus serrulatus Alpha-mammal toxin Ts2 Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 150000001555 benzenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- VDQVEACBQKUUSU-UHFFFAOYSA-M disodium;sulfanide Chemical compound [Na+].[Na+].[SH-] VDQVEACBQKUUSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- QPEUVQOIQCTLBQ-UHFFFAOYSA-N fluorosulfonyloxymethylbenzene Chemical compound FS(=O)(=O)OCC1=CC=CC=C1 QPEUVQOIQCTLBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000009418 renovation Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002795 scorpion venom Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910052979 sodium sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Genų inžinerijos būdu iš hibridomos 9B4 (DSM ACC2991) gautas rekombinantinis antikūno fragmentas scFv. Jis buvo sėkmingai išgrynintas ir parodytas jo specifiškumas VLY citolizinui iš G.vaginalis bakterijų ir efektyvi citolitinio aktyvumo neutralizacija. Išradimo pavyzdžiai parodo, kad rekombinantinis antikūno fragmentas scFv gali būti naudojamas terapiniais ir profilaktiniais tikslais gydant patologijas, sukeltas G.vaginalis infekcijos, arba išvengiant jų. Gauti viengrandžiai antikūno fragmentai (scFv) atskleidė svarbius privalumus prieš tradiciniu keliu gautus monokloninius antikūnus: pagaminti scFv galima paprastesniu ir pigesniu bakterinės biosintezės būdu, dėl mažesnės molekulinės masės tokie baltymai lengviau prasiskverbia į infekcijos pažeistus audinius.
Description
Išradimo sritis
Išradimas priskirtinas baltymų biotechnologijos sričiai; jis aprašo rekombinantinio viengrandžio antikūno fragmento (scFv), neutralizuojančio vaginolizino citolitinį aktyvumą, gavimą
Išradimo technikos lygis
Vaginolizinas (VLY) yra pagrindinis Gardnerella vaginalis bakterijų virulentiškimo faktorius. Jis priskiriamas didelei poras formuojančių, nuo cholesterolio priklausomų toksinų citolizinų (CDCs), šeimai. Šios šeimos toksinai randami daugiau negu 20-yje bakterijų rūšių, įskaitant Clostridium, Streptococcus, Listeria, Arcanobacterium, Bacillus ir kitas. Šie toksinai (dažnai vadinami citolizinais ar hemolizinais) sukelia ląstelės membranos ližę ir atlieka keletą kitų funkciją įskaitant citokinų indukciją ir imuninės sistemos moduliaciją. Taigi, labai tikėtina, kad šie citolizinai veikia kaip virulentiškumo faktoriai aukščiau minėtų bakterijų infekciniuose procesuose. [Tweten R. K. Infect. Immun. 2005, 73, pp.6199-6209].
Bakterijos G.vaginalis yra žinomos kaip bakterinės vaginozės (BV) sukėlėjai ir tikėtina, kad jų sekretuojamas VLY toksinas ir yra atsakingas už minėtos ligos progresavimą [Cauci S, Monte M, Ropele C et ai., Mol Microbiol, 1993, 9, pp. 5358]. BV įtakoja milijonų moterų sveikatą nes manoma, jog yra priešlaikinis gimdymo lemiančio mažą naujagimių svorį ir naujagimių mirtingumą ir sergamumą, sukėlėjas. Be to, nustatyta, jog BV yra pooperacinio endometrito ir dubens uždegimo priežastis. Galima manyti, kad VLY neutralizavimas naudojant antikūnus galėtų būti perspektyvus G.vaginalis sukeltų patogeninių efektų gydimo ir profilaktikos metodas.
Antikūnai, neutralizuojantys bakterinius toksinus, buvo aprašyti 1993 metais, kai buvo gauti nauji monokloniai antikūnai prieš stabligės toksiną ir išanalizuotas jų apsauginis efektas. [Lang et ei., J. Immunol. 1993, 151, pp. 466-472],
Monokloniniai antikūnai prieš botulizmo toksiną buvo gauti naudojant fagų ekspozicijos bibliotekas, gautas iš imunizuotų pelių ir žmogaus [Brekke and Sandlie, Nat.Rev. Drug Discov. 2002, 2, pp. 52-62]. Neseniai buvo gauti pelių monokloniai antikūnai prieš pneumoliziną ir jų efektyvumas patikrintas ant gyvūnų modelių. [Garsia-Suarez et ai., Infect. Immun. 2004, 72, pp. 4534-4540]. Buvo identifikuotas pelių monokloninis antikūnas PLY5, kuris neutralizavo įvairius citolizinus. Parodyta, kad šis monokloninis antikūnas susiriša su specifiniu epitopu - undekapeptidu, bendru visai cholesterolį surišančiai toksinų grupei, šis monokloninis antikūnas inhibuoja toksinų prisirišimą prie ląstelės membranos, kadangi yra uždengiamas undekapeptido epitopas [Jacobs et ai., FEBS Lett. 1999,459, pp. 463-466],
Genų inžinerijos ir antikūnų humanizacijos technikos tobulėjimas leidžia antikūnus plačiai naudoti biofarmaciniuose preparatuose. Šiuolaikinė rekombinantinės DNR technologija leidžia sukonstruoti ir ekspresuoti modifikuotus (pakeistus) antikūnus.
Šios naujos molekulės yra suprojektuotos naujai specifinei paskirčiai. Biofarmacinės paskirties antikūnai gali būti gauti skirtingų formų - pilno ilgio chimerinės formos, kitaip vadinami humanizuoti imunoglobulinai, arba antikūnų fragmentai, apimantys tik antigeną surišantį antikūno regioną (scFv). Genai, koduojantys variabilius (kintamus) imunoglobulinų fragmentus, gali būti klonuojami iš pelės arba žmogaus B limfocitų ir ekspresuoti bakterijose, mielėse, augalų ir žinduolių ląstelėse arba fagų ekspozicijos sistemose. Visa eilė chimerinių antikūnų yra gauta, sujungus pelės V domeną su konstantiniu (pastoviuoju) (C) žmogaus imunoglobulinų domenu. Naujieji antikūnai rodė laukiamas surišimo ir efektorines funkcijas. Humanizuoti antikūnai pasižymi sumažintu šeimininko (žmogaus) imuniniu atsaku, o bifunkciniai imunoglobulinai yra panaudojami vėžio terapijoje ir diagnostikoje.
Viengrandžiai antikūnai ir sulieti baltymai, turintys antikūnų specifiškumą (variabilias sritis) ir sujungti su neimunoglobulininėmis sekomis, yra perspektyvus modifikuotų antikūnų su naujomis savybėmis šaltinis [Sandhu, Crit Rev Biotechnol.
1 992,Ί 2; pp. 437-462].
Maynard ir kiti pranešė apie didelio afiniškumo viegrandžių antikūnų (scFv), neutralizuojančių Bacillus anthracis toksiną, sukonstravimą [Maynard et ai., Nature Biotechnol. 2002, 30, pp. 597-601]. Injekuojant šiuos scFv pelėms jos tapo apsaugotos nuo letalaus B.anthracis toksino efekto. Neutralizuojantys žmogaus antikūnai prieš Shiga toksiną 1 buvo gauti, naudojant transgenines peles [Mukherjee et ai., Infect. Immun. 2002, 70, pp. 5896-5899]. Buvo gauti ir charakterizuoti neutralizuojantys scFv prieš skorpiono toksiną II [Mousli et.al., FEBS Lett. 1999, 442 pp. 183-188],
Neseniai rekombinantinis vaginolizinas iš G.vaginalis buvo gautas naudojant genų inžinerijos metodus [Gelber SE, Aguilar JL, Lewis KLT et ai., J Bacteriol, 2008, 190, pp. 3896-3903], Hibridomos, gaminančios monokloninius antikūnus prieš VLY, buvo gautos šios paraiškos autorių [Žvirbliene A, Pleckaityte M, Lasickiene R, Žvirblis G, ΤοχΙοοη, 2010, 56, pp.19-28]. Keli monokloniniai antikūnai, produkuojami hibridominių klonų 9B4 ir 23A2, rodė VLY citolitinio aktyvumo neutralizaciją in vitro [WO 2010/095917].
Viengrandžiai antikūno fragmentai (scFv), specifiški VLY citolizinui ir neutralizuojantys jo aktyvumą, nėra sukonstruoti ir aprašyti anksčiau. Nors šio išradimo viengrandžiai antikūno fragmentai yra kilę iš 9B4 hibridomos klono, kuris aprašytas anksčiau [WO 2010/095917], tačiau aprašyti pilno ilgio pelės monokloniniai antikūnai skiriasi nuo scFv tiek struktūriškai, tiek ir funkciškai. Dabartiniu metu yra akivaizdus poreikis efektyvioms citolitinio VLY aktyvumo neutralizavimo priemonėms, kurių suradimas yra šio išradimo uždavinys. Problema gali būti išspręsta sukonstruojant VLY surišantį rekombinantinį scFv, kuris galėtų atpažinti natyvų vaginoliziną iš G.vaginalis ir neutralizuotų jo sukeliamą ląstelių ližę. Viengrandžių antikūno fragmentų (scFv) privalumas prieš monokloninius antikūnus yra tame, kad scFV yra gaunami žymiai paprasčiau ir pigiau (bakterinės biosintezės būdu). Be to viengrandis antikūno fragmentas turi mažesnę molekulinę masę, kas apsprendžia efektyvesnį jo patekimą į infekuotus audinius ir stipresnį terapinį poveikį. Išradime aprašomas rekombinantinis scFv gali būti naudojamas kaip potencialus terapinis agentas gydyti bakterijų G.vaginalis sukeltus patogeninius efektus.
Išradimo esmė
Siūlomo išradimo tikslas - gauti naują viengrandžio rekombinantinio antikūno fragmentą scFv, neutralizuojantį VLY citolitinį aktyvumą. Šis išradimas pateikia rekombinantinį scFv gautą, naudojant genetinę medžiagą iš hibridomos ląstelių linijos 9B4 (DSM ACC2991), gaminančios neutralizuojančius monokloninius antikūnus prieš VLY [WO 2010/095917].
Pateikiamas išradimas parodo, kad sukonstruotas scFv atpažįsta VLY ir neutralizuoja pastarojo biologinį aktyvumą, būtent, slopina VLY savybę indukuoti žmogaus eritrocitų hemolizę.
Pateikiamas išradimas, kuriame rekombinantinio viengrandžio antikūno fragmentas scFv atpažįsta tokią amino rūgščių seką (SEQ ID: NO.1):
MNNTKFYRNAAMLLLAGATIIPOCLAAPAMAAPAAKDSEPTASCAAKKDSLNNYL
WDLQYDKTNILARHGETIDNKFSSDSFNKGDEFVWEHQKKNITNTTSNLSVTSA
NDDRVYPGALFRADQNLMDNMPSLISANRAPITLSVDLPGFHGGESAVTVQRPT KSSVTSAVNGLVSKWNAQYAASHHVAARMQYDSASAQSMSQLKAKFGADFAKI GVPLKIDFDAVHKGEKQTQIVNFKQTYYTVSVDAPDSPADFFAPCTTPESLKSRG VDSKRPPVYVSNVAYGRSMYVKFDTRSKSTDFOAAVEAAIKGVEIKPNTEFHRIL QNTSVTAVILGGSANGAAKVITGNVDTLKALIQEGANLSTSSPAVPIAYTTSFVKD
NEVATLQTNSDYVETKVSSYRDGYLTLDHRGAYVARYYIYWDEYGTEIDGTPYV RSRAWEGNGKYRTAHFNTTIQFKGNVHNLRIKLVEKTGLVWEPWRTVYDRSDLP LVRQ RTIKN WGTTLWPRVAETVKN D arba panašias amino rūgščių sekas, kurių identiškumas yra bent 95%.
Toks antikūno fragmentas turi aminorūgščių seką (SEQ ID: No. 2):
DIVMTQTTSHLSVSLGDRVTIACKASAHINNWLAWYQQKPGNAPSLLIAGATGLET
GVPSRFSGSGSGKDFTLSISSLQTEDVATYYCQQYWDTPYTFGGGTKLEIRGGG
GSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLEQSGPGLVAPSESLTITCTVSGFSLNSYGVH
WVRQPPGKGLEWVGVMWAGGNTSYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQT
DDTAIYYCARARGAMDYWGQGTSVTVSS arba į ją panašią seką, kurios homologiškumas yra bent 95%.
Antikūno fragmentas pagal siūlomą išradimą yra skirtas naudoti vaginolizino biologinio aktyvumo slopinimui arba neutralizacijai.
Kitas išradimo objektas yra gaunamas iš rekombinantinio viengrandžio antikūno fragmento preparatas, skirtas naudoti vaginolizino biologinio aktyvumo slopinimui arba neutralizacijai.
Šis preparatas yra skirtas naudoti infekcijos, tokios kaip Gardnerella vaginalis bakterijų sukelta bakterinė vaginozė, slopinimui. Tai yra, pateikiamo išradimo galima taikymo sritis yra scFv preparatų panaudojimas G.vaginalis sukeltos bakterinės vaginozės gydymui. Preparatai, turintys tokį aktyvumą, yra tinkami biofarmacinių rekombinantinių antikūnų gamybai ir potencialiam terapiniam panaudojimui.
Dar vienas išradimo objektas yra farmacinės kompozicijos, sudarytos iš efektyvaus šio išradimo preparato kiekio kombinacijoje su farmaciškai priimtinais nešikliais, skiedikliais, ekscipientais ar/ir pagalbinėmis medžiagomis, skirtomis pasekmių, sukeltų G.vaginalis infekcijos, profilaktikai ir/arba gydimui Konkrečiau, šio išradimo farmacinių kompozicijų galima taikymo sritis apima patologijas, sukeliančias priešlaikinį gimdymą, kuris lemia žemą naujagimių svorį, dubens uždegimo ligas, endometritą ir kitas ligas sukeltas G. vaginalis infekcijos.
Trumpas brėžiniu aprašymas:
Rekombinantinio antikūno fragmento (scFv) specifiško citolizinui VLY gavimas yra iliustruotas Fig. 1-5:
Fig.1 iliustruoja konstrukcijos VL-(G4S)4-VH, apimančios antikūno fragmentą (scFv), specifišką VLY citolizinui schematinį vaizdą. Linkeris O’ungtukas) yra (G4S)4.
Fig. 2 parodo rekombinantinio antikūno fragmento (scFv) elektroforezės vaizdą transformuotų E.coli ląstelių lizate. Iš NDS-PAGE matyti, kad scFv baltymas aptiktas netirpioje transformuotų E.coli ląstelių frakcijoje.
takelis - tirpi E.coli ląstelių frakcija;
takelis - netirpi E.coli ląstelių frakcija;
3 takelis - bendras E.coli ląstelių lizatas;
4- dažytas baltymų molekulinės masės standartas (kDa).
Fig. 3 parodo išgryninto rekombinantinio antikūno fragmento (scFv) elektroforezės poliakrilamide vaizdą.
takelis - 4 pg išgryninto scFv baltymo.
2, 3 takeliai - 10 pg išgryninto scFv baltymo iš dviejų skirtingų gryninimų.
M-molekulinės masės markeriai (nuo apačios 15, 20, 25, 30, 40, 50 kDa).
Fig. 4 parodo rekombinantinio antikūno fragmento scFv sąveiką su citolizinu VLY naudojant ELISA metodą. Rekombinantinio antikūno fragmento scFv reaktyvumas su citolizinu VLY naudojant ELISA metodą (kvadratai); teigiama kontrolė pilno ilgio monokloninio antikūno 9B4 reaktyvumas su citolizinu VLY (trikampiai).
Fig. 5 parodo rekombinantinio antikūno fragmento scFv eritrocitų hemolizės neutralizavimo aktyvumą, esant citolizinui VLY.
scFv neutralizuojantis aktyvumas įvertintas žmogaus eritrocitų hemolizės tyrimu. Teigiama kontrolė yra pilno ilgio 9B4 monokloninis antikūnas. Y ašyje parodytos OD reikšmės. X ašyje reakcijos yra pažymėtos numeriais:
1)5 ng/ml VLY ir 20 ng/ml 9B4 antikūno PBS tirpale;
2) 5 ng/ml VLY ir 200 ng/ml 9B4 antikūno PBS tirpale;
3) 5 ng/ml VLY ir 1000 ng/ml 9B4 antikūno PBS tirpale;
4) 5 ng/ml VLY and 500 ng/ml scFv PBS tirpale;
5) 5 ng/ml VLY and 1000 ng/ml scFv PBS tirpale;
6) 5 ng/ml VLY and 2000 ng/ml scFv PBS tirpale;
7) 5 ng/ml VLY and 5000 ng/ml scFv PBS tirpale;
8) 5 ng/ml VLY and 10000 ng/ml scFv PBS tirpale.
Detalus išradimo aprašymas
Rekombinantinio antikūno fragmento scFv konstravimas buvo pradėtas nuo genetinės medžiagos (RNR) išskyrimo iš hibridomos 9B4 (DSM ACC2991). Buvo naudotos tokios procedūros:
1) RNR išskyrimas iš hibridomos 9B4 - totalinė RNR buvo išskirta iš hibridomos 9B4 (DSM ACC 2991) ląstelių naudojant vienos stadijos techniką kaip aprašyta anksčiau [Chomczynski and Sacchi, Anai Biochem, 1987, 162, pp. 156159], Ląstelių homogenatas gaunamas, naudojant guanidino tiocianatą , o RNR ekstrahuojama fenolio-chloroformo mišiniu, esant rūgštiniam pH. RNR toliau yra nusodinama izopropanoliu.
2) Pirmosios kDNR grandinės sintezė - pirmoji kDNR grandinė yra sintetinama naudojant RNR-prikiausomą DNR polimerazę (atvirkštinę transkriptazę), kartu su matrica poli(A)+RNR ir pradmenimis oligo(dT) nukleotidais .
3) Galutinė kDNR buvo amplifikuota, naudojant PGR ir specifinius pradmenis imunoglobulinų variabilaus (kintamo) domeno sekoms.
Pelių imunoglobulinų sunkiosios grandinės pastovios srities pradmenį: 5’-TTAATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC ir pelės imunoglobulino sunkiosios grandinės FR1 srities stipriai degeneruotą pradmenį: 5’CATATGSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (R - pažymi A/G; S - C/G; N - A, C, G, T). Pelės kapa grandinės imunoglobulinų pastoviosios srities pradmenį: 5’TTAGGATACAGTTGGTGCAGCATC ir pelės kapa grandinės imunoglobulinų pastovaus FR1 regiono universalų degeneruotą pradmenį: 5’15 CATATGGAYATTGTGMTSACMCARVVCTMCA (R - pažymi A/G; S - C/G; W A/T; M-A/C; Y-C/T).
4) PGR produktai buvo klonuoti į vektorinę plazmidę ir nukleotidų seka buvo nustatyta sekoskaitos būdu. Sekos analizuotos, naudojant BLASTN programą ir GenBank bei IgBLAST duomenų bazes.
5) Buvo sukonstruotas scFv fragmentas, įvedant linkerinę (jungtuko) seką (G4S)4 tarp domeno VL (variabilios (kintamos) pelių imunoglobulinų lengvosios grandinės L srities) ir domeno VH (variabilios (kintamos) pelės imunoglobulino sunkiosios grandinės H srities). Galutinė konstrukcija koduojanti VL-(G4S)4-VH buvo įklonuota į ekspresijos vektorių pET28a(+) [Merck, Darmstadt, Vokietija].
Konstrukcija scFv apima (His)6 inkarinę seką baltymo N-gale. Galutine plazmidę buvo transformuotas E.coli BL21(DE3) kamienas. Rekombinantinio scFv biosintezė buvo indukuota 0.5 mM IPTG.
6) Nustatyta tokia scFv amino rūgščių seka (SEQ ID: NO.2):
DIVMTQTTSHLSVSLGDRVTIACKASAHINNWLAWYQQKPGNAPSLLIAGAT GLETGVPSRFSGSGSGKDFTLSISSLQTEDVATYYCQQYWDTPYTFGGGT KLEIRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLEQSGPGLVAPSESLTITCTVS GFSLNSYGVHWVRQPPGKGLEVWGVMWAGGNTSYNSALMSRLSISKDNS KSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCARARGAMDYWGQGTSVTVSS
7) Po indukcijos gauti intarpiniai kūneliai su scFv baltymu buvo solubilizuoti naudojant chaotropinius agentus. Oksidacinė renatūracija disulfidinių jungčių formavimuisi buvo atlikta arba skiedimo būdu arba kolonėlėje, kaip oksidatorių naudojant redukuoto ir oksiduoto glutationo porą arba dvivalenčio vario Cu (II) jonus. Renatūruotas scFv baltymas buvo išgrynintas naudojant metalo chelatinę afininę chromatografiją. Kai kurios scFv baltymo savybės aprašytos toliau prie atitinkamų pavyzdžių.
Šiuo išradimu buvo nustatyta, kad rekombinantinis antikūno fragmentas, kilęs iš hibridomos 9B4, atpažįsta amino rūgščių seką SEQ ID: No.1:
MNNTKFYRNAAMLLLAGATIIPOCLAAPAMAAPAAKDSEPTASCAAKKDSLNNYL
WDLQYDKTNILARHGETIDNKFSSDSFNKGDEFVWEHQKKNITNTTSNLSVTSA
NDDRVYPGALFRADQNLMDNMPSLISANRAPITLSVDLPGFHGGESAVTVQRPT
KSSVTSAVNGLVSKWNAQYAASHHVAARMQYDSASAQSMSQLKAKFGADFAKI
GVPLKIDFDAVHKGEKQTQIVNFKQTYYTVSVDAPDSPADFFAPCTTPESLKSRG VDSKRPPVYVSNVAYGRSMYVKFDTRSKSTDFQAAVEAAIKGVEIKPNTEFHRIL QNTSVTAVILGGSANGAAKVITGNVDTLKALIQEGANLSTSSPAVPIAYTTSFVKD NEVATLQTNSDYVETKVSSYRDGYLTLDHRGAYVARYYIYWDEYGTEIDGTPYV RSRAWEGNGKYRTAHFNTTIQFKGNVHNLRIKLVEKTGLVWEPWRTVYDRSDLP
LVRQRTIKNWGTTLWPRVAETVKND.
Ši amino rūgščių seka pilnai atitinka VLY citolizino seką iš Gardnerella vaginalis, kuri buvo nustatyta ir paskelbta anksčiau (GenBank Nr. EU697812, EU 697811). Skirtingi Gardnerella vaginalis kamienai gali ekspresuoti šiek tiek skirtingus VLY variantus, kurie gali skirtis nuo sekos SEQ ID: No.1 viena arba keliomis amino rūgštimis.
Išradimo įgyvendinimo pavyzdžiai
Žemiau pateikiama informacija apie konkrečius pavyzdžius, parodančius, kokiu būdu buvo gautas rekombinantinis antikūno fragmentas scFv prieš VLY citoliziną bei scFv savybių nustatymo pavyzdžiai. Ši informacija pateikiama iliustratyvumo tikslais ir neapriboja išradimo apimties.
pavyzdys mRNR išgryninimas iš hibridomos 9B4 ląstelių ir DNR sekos, koduojančios VLY specifinio antikūno fragmentą, klonavimas
Hibridomos 9B4 (DSM ACC 2991) ląstelės (3x106 ląstelių) buvo praplautos steriliu šaltu PBS buferiniu tirpalu ir suardytos tirpale D, turinčiame guanidino tiocianato. RNR išgryninta iš homogenato, panaudojant fenolio-chloroformo mišinį, kurio pH
5. Pridėjus kiekvieną reagentą, tirpalas gerai išmaišomas, mėgintuvėlį apverčiant kelis kartus. Tirpalas laikytas 15 min. lede. Mėgintuvėlis centrifuguotas, ir surinkta apatinė vandeninė fazė, kurioje yra RNR. Pridėtas lygus tūris izopropanolio, tirpalas gerai sumaišytas, ir RNR išsodinta, palaikius 1 vai. -20°C temperatūroje. RNR surinkta centrifuguojant, praplauta 75 % etanolio tirpalu, ištirpinta vandenyje, apdorotame DEPC, ir saugota -70°C temperatūroje.
Bendra RNR, išgryninta iš hibridomos 9B4 ląstelių, panaudota kDNR pirmos grandinės sintezei. DNR pėdsakai RNR mėginyje pašalinti, pridėjus fermento
DNazėsI (be RNazės). Paruošta be DNR priemaišų RNR (0,5 pg) sumaišyta su oligo (dT)18 pradmeniu ir inkubuota su fermentu nuo RNR priklausoma DNR polimeraze (atvirkštine transkriptaze). Reakcija sustabdyta, pakaitinus reakcijos mišinį 70°C 5 min. kDNR, koduojanti kintamą monokloninio antikūno iš hibridomos 9B4 sritį, buvo gauta, panaudojus šias specifinių pradmenų poras: 1) pelės sunkiosios grandinės kintamos srities pradmuo: 5’TTAATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC ir pelės sunkiosios grandinės FR1 srities išsigimęs pradmuo: 5’-CATATGSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (R - A/G; S - C/G; N - A, C, G, T); 2) pelės kapa grandinės pastoviosios srities pradmuo: 5’TTAGGATACAGTTGGTGCAGCATC ir pelės kapa grandinės FR1 srities universalus išsigimęs pradmuo 5’-CATATGGAYATTGTGMTSACMCARV\/CTMCA (R - A/G; S - C/G; W - A/T; M - A/C; Y - C/T). Kiekviename PGR reakcijos mišinyje yra: kDNR (pirma grandinė), 5' ir 3‘ pradmenys, dNTP, Taq polimerazė. Gautas PCR produktas išgrynintas iš agarozės gelio ir klonuotas į pJET1.2 klonavimo vektorių (Fermentas, Vilnius, Lietuva). Liguota DNR transformuotos
E.coli DH10B ląstelės ir išbraukytos ant LB agaro su 100 pg/ml ampicilino. Kolonijos išaugintos nuo agaro lėkštelių , iš jų išgrynintos plazmidės ir restrikcinės analizės būdu patikrinta, ar plazmidės turi reikiamą DNR intarpą. Intarpų nukleotidų seka nustatyta sekoskaitos būdu. Kiekvienai IgG grandinei nustatyta nukleotidų intarpų seka iš penkių klonų ir aptikta, jog sekos yra vienodos. Jungtuko seka, koduojanti (G4S)4, ir restrikcijos endonukleazių taikiniai įterpti, panaudojus PGR. DNR fragmentai, koduojantys VL ir VH, buvo sulieti ir gauta genetinė konstrukcija, koduojanti amino rūgščių seką VL-(G4S)4-VH, schematiškai parodytą Fig.1.
pavyzdys
Raiškos plazmidžių konstravimas ir rekombinantinio scFv raiška E.coli ląstelėse.
DNR fragmentas, koduojantis VL-(G4S)4-VH, klonuotas į raiškos vektorių pET28(+). Gautąja raiškos plazmide pET28, turinčia scFv, transformuotos E.coli BL21(DE3) ląstelės, ir transfekuotos bakterijos išbraukytos ant LB agaro lėkštelių su 25 pg/ml kanamicino. Ląstelės, transformuotos raiškos plazmide, augintos 500 ml LB terpės su kanamicinu. Ląstelių kultūrai pasiekus OD6oo 0,8-1,0, tikslinio geno raiška pradėta, pridėjus iki 0,5 mM IPTG (izopropilo β-D-tiogalaktozidas). Ląstelės augintos 2,5 vai. 37°C temperatūroje ir surinktos centrifuguojant. Dalis ląstelių suspenduota Tris-EDTA (TE) buferiniame tirpale ir suardytos ultragarsu. Suardytos ląstelės centrifuguotos, o supernatantas (tirpi ląstelių frakcija) ir nuosėdos (netirpi ląstelių frakcija) analizuotos 12% natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforeze (NDS-PAGE). Gelis nudažytas dažu Coomassie Blue. 27,5 kDa tikslinis baltymas scFv aptiktas netirpioje E.coli ląstelių frakcijoje (Fig. 2). Tikslinis baltymas sudarė apie 35 % nuo bendrų ląstelės baltymų ir apie 80 % nuo netirpių ląstelės baltymų. Gauti rezultatai rodo, kad E.coli ląstelėse gaminamas scFv patenka į intarpinius kūnelius.
pavyzdys
Rekombinantinio scFv gryninimas
E.coli biomasė su tiksliniu baltymu scFV buvo homogenizuota 100 ml (santykiu
1:10, biomasė:buferinis tirpalas) 0,1 M Tris-HCI, pH 7,0, esant 5 mM EDTA 0,1 g lizocimo, 0,1 ml Triton Χ-100, 1,0 ml 100 mM fenilmetilsulfofluorido (PMSF) ir 0,7 ml 2-merkaptoetanolio. Homogenizatas buvo maišomas 30 min. kambario temperatūroje, ląstelės suardytos ultragarsu ir nucentifuguotos 25 min., 24.500g. Likusios nuosėdos du kartus praplautos 100 ml 1 M NaCI, 0.1% Tween 80 ir 100 ml distiliuotu vandeniu. Po kiekvieno plovimo ciklo suspensija centrifuguota 25 min., 24.500g.
Oksidacinė renatūracija: Nuosėdos, gautos po paskutinio plovimo ir turinčios scFv baltymą, tirpinamos 10 mM Tris-HCI, pH 7,0 buferiniame tirpale, turinčiame 7M guanidino hidrochlorido. Suspensija maišoma per naktį 4°C, centrifuguojama 25 min. 40,000g ir supernatantas skiedžiamas 10 mM Tris-HCI buferiniu tirpalu (pH 7.0), turinčiu 6 M GuHCI iki bendro baltymo koncentracijos 1 mg/ml, po to pridedamas CUSO4 tirpalas iki 20 μΜ koncentracijos. Renatūracija vykdoma apie 1 valandą kambario temperatūroje. Reakcija stabdoma, pridedant EDTA tirpalo iki 10mM galutinės koncentracijos. Baltymų tirpalas centrifuguojamas 25 min. 40.000g ir sorbuojamas ant Sephadex G-25 kolonėlės, nupusiausvyrintos 25 mM TRIS buferiniu tirpalu, pH 8,0, turinčiu 0,25M Na2SO4. Tikslinį baltymą turinčios frakcijos surenkamos, apjungiamos ir sorbuojamos ant Ni (II) NTA sorbentu pakrautos kolonėlės. Naudotas sorbcijos buferinis tirpalas 25 mM TRIS, pH 8,0, o desorbcija atliekama tuo pačiu buferiniu tirpalu su 1M imidazolo. Tikslinį baltymą turinčios frakcijos apjungiamos, dializuojamos prieš 20 mM TRIS, 50mM NaCI, pH 8,0 ir filtruojamos 0,22pm filtru tolimesniam saugojimui. Išgryninto rekombinantinio scFv NDS-PAGE elektroforezė parodyta Fig.3.
Stabilus baltyminis preparatas, gaunamas pervedant išgrynintą antikūno fragmentą scFv į saugojimui tinkamą tirpalą (formuluotę), susidedančią iš parinktos buferinės sistemos, baltymo stabilizacijai ir izotoniškumui palaikyti reikalingų druskų, detergentų, antioksidantų ir kitų pagalbinių medžiagų.
Apskaičiuota baltymo scFv molekulinė masė yra 25,182 kDa, teorinis izoelektrinis taškas pi yra 6,99. Eksperimentiškai nustatyta (pagal NDS-PAGE) molekulinė masė yra apie 25,5 kDa. Fluorescenciniu metodu nustatyta scFv baltymo lydymosi (denatūracijos) temperatūra Tm yra apie 55°C, naudojant citratinio buferinio tirpalo sistemą. Papildomai baltymo identiškumo nustatymas buvo patvirtintas imunoblotingo (WB) ir imunofermentinės analizės (ELISA) metodais, naudojant sąveiką su antigenu (VLY).
pavyzdys
Rekombinantinio scFv specifiškumo nustatymas
Rekombinantinio scFv, kilusio iš hibridomos 9B4, specifiškumas nustatytas naudojant imunofermentinės analizės metodą (ELISA). Rekombinantinis išgrynintas scFv buvo praskiestas ir išpilstytas į 96-šulinėlių plokštelę, padengtą rekombinantiniu VLY baltymu. Po vienos vai. inkubacijos kambario temperatūroje VLY-surištas scFv buvo nustatytas, inkubuojant su pelės monokloniniu antikūnu prieš (His)s seką ir krienų peroksidaze (HRP) pažymėtu antriniu antikūnu (IgG konjugatu prieš pelės imunoglobulinus). Fermentinė reakcija buvo išryškinta naudojant paruoštą TMB substratą. Optinis tankis buvo matuojamas 405 nm bangos ilgyje. Teigiama kontrolė buvo naudojamas praskiestas pilno ilgio monokloninis antikūnas 9B4, inkubuotas 96-šulinėlių plokštelėje, padengtoje rekombinantiniu VLY baltymu. Plokštelės išryškintos HRP-lgG konjugatu prieš pelės imunoglobulinus ir TMB substratu. Fig.4. iliustruoja rekombinantinio scFv ir pilno ilgio antikūno 9B4 titravimo kreives mikrotitravimo plokštelėse, padengtose rekombinantiniu VLY. Šis eksperimentinis rezultatas parodo rekombinantinio scFv specifiškumą VLY vaginolizinui.
pavyzdys scFv neutralizuojančio aktyvumo tyrimas
Eritrocitų hemolizė in vitro [Cauci S, Monte R, Ropele M et ai., Mol Microbiol, 1,993, 9, pp. 1143-1155.] panaudota rekombinantinio scFv neutralizuojančio VLY aktyvumui ištirti. Žmogaus eritrocitų suspensija (1 ml) buvo inkubuota 15 min. 22°C temperatūroje šiuose reakcijos mišiniuose:
1) Fosfatinis buferinis tirpalas PBS, pH 7,4 (eritrocitų hemolizės nėra);
2) Dejonizuotas vanduo (100 % eritrocitų hemolizė);
3) PBS su 5 ng/ml VLY (100 % eritrocitų hemolizė);
4) 5 ng/ml VLY ir 20 ng/ml 9B4 antikūno PBS tirpale;
5) 5 ng/ml VLY ir 200 ng/ml 9B4 antikūno PBS tirpale;
6) 5 ng/ml VLY ir 1000 ng/ml 9B4 antikūno PBS tirpale;
7) 5 ng/ml VLY and 500 ng/ml scFv PBS tirpale;
8) 5 ng/ml VLY and 1000 ng/ml scFv PBS tirpale;
9) 5 ng/ml VLY and 2000 ng/ml scFv PBS tirpale;
10) 5 ng/ml VLY and 5000 ng/ml scFv PBS tirpale;
11) 5 ng/ml VLY and 10000 ng/ml scFv PBS tirpale.
Po Inkubacijos eritrocitų suspensija centrifuguota 3 min., 1000xg ir pamatuotas tirpalo optinis tankis OD, esant 415 nm bangos ilgiui. Didelės optinio tankio reikšmės (OD>2,0) rodo, kad įvyko eritrocitų hemolizė. Mažos OD reikšmės (OD<0,2) rodo, kad eritrocitai buvo apsaugoti nuo suardymo. Į eritrocitų suspensiją pridėjus 5 ng/ml rekombinantinio VLY, eritrocitai buvo pilnai suardyti (OD=2,5). Kai į mišinį buvo pridėta 20 ng/ml 9B4 antikūno ar 5000 ng/ml rekombinantinio scFv, eritrocitai buvo pilnai apsaugoti nuo hemolizės (Fig. 5). Gauti rezultatai rodo, jog tiek pilno ilgio 9B4 antikūnas, tiek rekombinantinis scFv neutralizavo VLY citolitinį aktyvumą. 9B4 antikūnas pasižymėjo didesniu neutralizuojančiu aktyvumu nei scFv, nes VLY neutralizacijai jo reikėjo mažesnės koncentracijos.
Farmacine kompozicija su scFv baltymu pagal šį išradimą gali savo sudėtyje turėti vieną arba kelis tokių komponentų:
- nešiklį, kuris gali būti polihidroksiliai alkoholiai (pvz. manitolis, sorbitolis), įvairūs monosacharidai (pvz. gliukozė), disacharidai (pvz. sacharozė);
- buferinę substanciją reikiamos pH reikšmės palaikymui (pvz. acetatas, fosfatas, TRIS, HEPES);
- druskų priedus kompozicijos izotoniškumui palaikyti (pvz. natrio chloridas);
- detergentą, apsaugantį nuo baltymo degradacijos skystis-oras skiriamoje riboje, (pvz. polisorbatas 80, polisorbatas 20, įvairūs Pluronic tipo junginiai);
- stabilizatorių, tokį kaip polietilenglikoliai, polivinilpirolidonai, amino rūgštys (pvz. L-metioninas, L-argininas, L-histindinas, L-glutationo rūgštis, Lasparagino rūgštis);
- chelatuojantį agentą, tokį kaip EDTA, EGTA, IDA;
- antimikrobinį agentą (pvz. benzolo dariniai, tokie kaip krezolas, benzilo alkoholis);
- SH agentą (pvz. gliutationas, cisteinas, acetilcisteinas)
- kitas tinkamas pagalbines medžiagas.
Apibendrinant gautus duomenis išryškėja, kad rekombinantinis antikūno fragmentas scFv, kilęs iš hibridomos 9B4, pasižymi specifiškumu VLY citolizinui iš G.vaginalis bakterijų ir efektyviai neutralizuoja pastarojo citolitinį aktyvumą. Dėl to šis rekombinantinis antikūno fragmentas scFv gali būti naudojamas terapiniais ir profilaktiniais tikslais gydant patologijas, sukeltas G.vaginalis infekcijos, arba išvengiant jų. Gauti viengrandžiai antikūno fragmentai (scFv) atskleidė privalumus prieš monokloninius antikūnus, gaminant scFv paprastesnių ir pigesniu bakterinės biosintezės būdu. Be to maža scFv molekulinė masė potencialiai lemia stipresnį terapinį poveikį dėl efektyvesnio scFv patekimo į infekuotus audinius.
Dar daugiau, panaudojant gautas DNR sekas, koduojančias scFv, gali būti sukonstruoti naujos struktūros humanizuoti antikūnai, kurie galės neutralizuoti VLY citolizino biologinį aktyvumą. Kadangi VLY yra pagrindinis G.vaginalis virulentiškumo faktorius, jo neutralizavimas gali būti efektyvus kelias gydyti infekcijos sukeltą patologiją.
Claims (7)
- IŠRADIMO APIBRĖŽTIS1. Rekombinantinis viengrandžio antikūno fragmentas, atpažįstantis aminorūgščių sekąSEO ID: NO.1:5 MNNTKFYRNAAMLLLAGATIIPOCLAAPAMAAPAAKDSEPTASCAAKKDSLNNYL WDLQYDKTNILARHGETIDNKFSSDSFNKGDEFVWEHQKKNITNTTSNLSVTSA NDDRVYPGALFRADONLMDNMPSLISANRAPITLSVDLPGFHGGESAVTVORPT KSSVTSAVNGLVSKWNAQYAASHHVAARMQYDSASAQSMSQLKAKFGADFAKI GVPLKIDFDAVHKGEKQTQIVNFKQTYYTVSVDAPDSPADFFAPCTTPESLKSRG10 VDSKRPPVYVSNVAYGRSMYVKFDTRSKSTDFOAAVEAAIKGVEIKPNTEFHRIL ONTSVTAVILGGSANGAAKVITGNVDTLKALIOEGANLSTSSPAVPIAYTTSFVKD NEVATLQTNSDYVETKVSSYRDGYLTLDHRGAYVARYYIYWDEYGTEIDGTPYV RSRAWEGNGKYRTAHFNTTIQFKGNVHNLRIKLVEKTGLVWEPWRTVYDRSDLP LVRQRTIKNWGTTLWPRVAETVKND15 arba į ją panašią seką, kurios identiškumas yra bent 95%.
- 2. Antikūno fragmentas pagal 1 punktą, turintis aminorūgščių sekąSEO ID: No. 2: DIVMTQTTSHLSVSLGDRVTIACKASAHINNWLAWYQQKPGNAPSLLIAGATGLET GVPSRFSGSGSGKDFTLSISSLQTEDVATYYCQQYWDTPYTFGGGTKLEIRGGG20 GSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLEQSGPGLVAPSESLTITCTVSGFSLNSYGVH WVRQPPGKGLEWVGVMWAGGNTSYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQT DDTAIYYCARARGAMDYWGQGTSVTVSS arba į ją panašią seką, kurios homologiškumas yra bent 95%.25
- 3. Antikūno fragmentas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, skirtas naudoti vaginolizino biologinio aktyvumo slopinimui arba neutralizacijai.
- 4. Preparatas, apimantis rekombinantinį viengrandį antikūno fragmentą pagal bet kurį iš 1-2 punktų, skirtas naudoti vaginolizino biologinio aktyvumo slopinimui arba30 neutralizacijai.
- 5. Preparatas pagal 4 punktą, skirtas naudoti infekcijos, tokios kaip Gardnerella vaginalis bakterijų sukelta bakterinė vaginozė, slopinimui.35
- 6. Farmacinė kompozicija, apimanti preparato pagal 4 punktą efektyvų kiekį derinyje su farmaciniu požiūriu priimtinu nešikliu, skiedikliu, ekscipientu ir/arba pagalbinėmis medžiagomis.
- 7. Farmacinė kompozicija pagal 6 punktą, skirta naudoti buklių, sukeltų40 Gardnerella vaginalis infekcijos, profilaktikai ir/arba gydymui.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2010104A LT5855B (lt) | 2010-12-07 | 2010-12-07 | Rekombinantinis viengrandžio antikūno fragmentas, neutralizuojantis vaginolizino citolitinį aktyvumą |
| PCT/LT2011/000004 WO2012078014A1 (en) | 2010-12-07 | 2011-03-28 | Recombinant single-chain antibody fragment neutralizing the cytolytic activity of vaginolysin |
| EP11718794A EP2563810A1 (en) | 2010-12-07 | 2011-03-28 | Recombinant single-chain antibody fragment neutralizing the cytolytic activity of vaginolysin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2010104A LT5855B (lt) | 2010-12-07 | 2010-12-07 | Rekombinantinis viengrandžio antikūno fragmentas, neutralizuojantis vaginolizino citolitinį aktyvumą |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT2010104A LT2010104A (lt) | 2012-06-25 |
| LT5855B true LT5855B (lt) | 2012-08-27 |
Family
ID=44227537
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2010104A LT5855B (lt) | 2010-12-07 | 2010-12-07 | Rekombinantinis viengrandžio antikūno fragmentas, neutralizuojantis vaginolizino citolitinį aktyvumą |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2563810A1 (lt) |
| LT (1) | LT5855B (lt) |
| WO (1) | WO2012078014A1 (lt) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105517572B (zh) * | 2013-07-05 | 2019-05-31 | 华盛顿大学商业中心 | 用于治疗癌症的中和可溶性mic的单克隆抗体 |
| CN104173985A (zh) * | 2014-09-02 | 2014-12-03 | 郭书堂 | 一种治疗妇女产后受凉的药及其制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010095917A1 (en) | 2009-02-23 | 2010-08-26 | Biotechnologijos Institutas | Monoclonal antibodies against vaginolysin |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009117373A2 (en) * | 2008-03-15 | 2009-09-24 | Columbia University | Treatment and prevention of gardnerella vaginalis infections |
-
2010
- 2010-12-07 LT LT2010104A patent/LT5855B/lt not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-03-28 WO PCT/LT2011/000004 patent/WO2012078014A1/en not_active Ceased
- 2011-03-28 EP EP11718794A patent/EP2563810A1/en not_active Ceased
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010095917A1 (en) | 2009-02-23 | 2010-08-26 | Biotechnologijos Institutas | Monoclonal antibodies against vaginolysin |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BREKKE OH, SANDLIE I.: "Therapeutic antibodies for human diseases at the dawn of the twenty-first century.", NAT REV DRUG DISCOV., 2002, pages 52 - 62 |
| MOUSLI M. ET AL.: "A recombinant single-chain antibody fragment that neutralizes toxin II from the venom of the scorpion Androctonus australis hector", FEBS LETTERS, 1999, pages 183 - 188, XP004259062, DOI: doi:10.1016/S0014-5793(98)01647-0 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2563810A1 (en) | 2013-03-06 |
| LT2010104A (lt) | 2012-06-25 |
| WO2012078014A1 (en) | 2012-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112409483B (zh) | 抗pd-l1纳米抗体 | |
| CN103619875B (zh) | 免疫球蛋白结构域的工程改造 | |
| EP1529063B1 (en) | Antibodies anti-c5 component of the complement system and their use | |
| CN111201243B (zh) | 对bcma具有高亲和力的抗bcma抗体和包含其的用于治疗癌症的药物组合物 | |
| US9193792B2 (en) | Recombinant antibody structures binding to and blocking the activity of vascular endothelial growth factor 2 (VEGFR—2/KDR) | |
| US20080038256A1 (en) | Anti-hgf/sf humanized antibody and method for the preparation thereof | |
| CN106459187A (zh) | 用于抗葡萄球菌剂的吞噬细胞递送的组合物和方法 | |
| AU2021205561A1 (en) | New polypeptide complex | |
| CN114380906A (zh) | 一种抗il-17a的单域抗体及其用途 | |
| CN107614762A (zh) | 一种由噬菌体表达的单链变异片段抗体库 | |
| US9809645B2 (en) | Anti-Staphylococcus antibody, method for manufacturing same, and usage of same | |
| AU2022263683A1 (en) | Anti-masp2 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof | |
| KR20150134319A (ko) | 인간화 항 hmgb1 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 | |
| CN101155832A (zh) | 抗体的改良方法 | |
| KR102229083B1 (ko) | huTNFR1 상호작용의 1가 억제제 | |
| LT5855B (lt) | Rekombinantinis viengrandžio antikūno fragmentas, neutralizuojantis vaginolizino citolitinį aktyvumą | |
| Moricoli et al. | Blocking monocyte transmigration in in vitro system by a human antibody scFv anti-CD99. Efficient large scale purification from periplasmic inclusion bodies in E. coli expression system | |
| KR102490823B1 (ko) | 탄저균 보호항원에 특이적인 인간화 항체 및 이의 제조방법 | |
| CN120795147B (zh) | 一种抗TNF-α的纳米抗体及其制备方法和应用 | |
| CN114292333B (zh) | 一种牛源抗金黄色葡萄球菌凝固酶Coa的单链抗体、制备方法和应用 | |
| WO2020053627A1 (en) | Targeted single domain antibodies with catalytic activity (t-can) | |
| US20250011413A1 (en) | Products and methods for the diagnosis and treatment of heparin-induced thrombocytopenia | |
| CN110407942B (zh) | 针对kn044的单域抗体 | |
| Zhu et al. | Expression of a humanized single-chain variable fragment antibody targeting chronic myeloid leukemia cells in Escherichia coli and its characterization | |
| CN114621354A (zh) | Fab-白蛋白结合肽融合蛋白及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 20231207 |