LT4676B - 1-(3-aminoindazol-5-il)-3-fenilmetil-cikliniai karbamidai, naudojami kaip živ proteazės inhibitoriai - Google Patents

Description

IŠRADIMO SRITIS

Šis išradimas iš esmės yra susijęs su 1-(3-aminoindazol-5-il)-3fenilmetil-cikliniais karbamidais, kurie yra tinkami kaip ŽIV proteazės inhibitoriai, su farmacinėmis kompozicijomis ir diagnostiniais rinkiniais, j kuriuos įeina šie karbamidai, ir su jų panaudojimo būdais virusinių infekcijų gydymui arba kaip standartų bei reagentų tyrimams.

IŠRADIMO KILMĖ

Du skirtingi retrovirusai - žmogaus imunodeficito virusas (ŽIV) 1 tipo (ŽIV-1) arba 2 tipo (ŽIV-2) - buvo etiologiškai susieti su imunosupresine liga įgytuoju imunodeficito sindromu (AIDS). ŽIV seropozityvūs individai iš pradžių neturi ligos požymių, tačiau jiems išsivysto su AIDS susijęs kompleksas (ARC), po kurio seka AIDS. Ligos paveiktiems individams labai smarkiai slopinamas imunitetas, ir tai nulemia išsekimą, o galiausiai ir fatališkas savalaikes infekcijas.

AIDS liga yra ŽIV-1 arba ŽIV-2 viruso galutinis rezultatas, atsirandantis po viruso sudėtingo gyvenimo ciklo. Viruso gyvenimo ciklas prasideda prisijungus virusui prie žmogaus-šeimininko T-4 limfocitinės imuninės ląstelės per glikoproteino, esančio ant viruso apsauginio apvalkalo paviršiaus, ryši su CD4 glikoproteinu ant limfocito ląstelės. Kai prisijungimas Įvyksta, virusas nusimeta savo glikoproteininj apvalkalą, Įsiskverbia į šeimininko ląstelės membraną ir atidengia jos RNR. Viruso fermentas - atvirkštinė transkriptazė nukreipia RNR transkripcijos procesą j viengrandę DNR. Virusinė RNR degraduojama ir sukuriama antroji DNR grandinė. Ši dvigrandė DNR integruojama į žmogaus ląstelės genus, ir šie genai naudojami ląstelės reprodukcijai.

Šiuo atveju žmogaus ląstelė vykdo reprodukcijos procesą, panaudodama savo RNR polimerazę integruotos DNR transkribavimui Į virusinę RNR. Virusinė RNR transliuojama j prekursoriaus gag-pol sulietą poliproteiną. Tada šj poliproteiną skaldo ŽIV proteazės fermentas, ir gaunami subrendę virusiniai baltymai. Taigi, ŽIV proteazė yra atsakinga už reguliavimą kaskados skaldymų, kurie atveda į virusinės dalelės subrendimą į virusą, kuris turi pilną infekcijos gebą.

Tipiškas žmogaus imuninės sistemos atsakas, naikinantis Įsiskverbusi virusą, yra apsunkinamas, nes didžioji dalis viruso gyvenimo ciklo praeina latentinėje būsenoje imuninės ląstelės viduje. Be to, viruso atvirkštinė transkriptazė - fermentas, naudojamas naujos virusinės dalelės sudarymui, nėra labai specifinė ir sukelia transkripcijos klaidas, kurios duoda pastoviai besikeičiančius glikoproteinus ant viruso apsauginio apvalkalo paviršiaus.

Šio specifiškumo stoka sumažina imuninės sistemos efektyvumą, kadangi antikūnai, specifiškai gaminami prieš vieną glikoproteiną, gali būti nenaudingi prieš kitą glikoproteiną, ir taip sumažėja antikūnų, galinčių kovoti su virusu, skaičius. Virusas toliau reprodukuojamas, o imuninės sistemos atsakas vis silpnėja. Pagaliau ŽIV visiškai užvaldo organizmo imuninę sistemą, suteikdamas galimybę įsigalėti savalaikėms infekcijoms, ir nenaudojant priešvirusinių agentų, imunomoduliatorių arba ir vienų ir kitų, gali įvykti mirtis.

Viruso gyvenimo cikle yra mažiausiai trys kritiniai taškai, kurie buvo identifikuoti kaip galimi priešvirusinių vaistų taikiniai: (1) pradinis viruso prisijungimas prie T-4 limfocito arba makrofago vietos, (2) virusinės RNR transkripcija i virusinę DNR (atvirkštinė transkriptazė, AT) ir (3) naujos virusinės dalelės susirinkimas reprodukcijos metu (pvz., ŽIV asparto rūgšties proteazė arba ŽIV proteazė).

Retrovirusų genomai koduoja proteazę, kuri yra atsakinga už vieno arba daugiau poliproteinų pirmtakų, tokių kaip pol ir gag genų produktai, proteolitinį brendimą. Žr. VVellink, Arch. Viro!. 98, 1 (1988). Retrovirusinės proteazės dažniausiai subrandina gag pirmtaką į pagrindinius baltymus, ir taip pat subrandina pol pirmtaką j atvirkštinę transkriptazę ir retrovirusinę proteazę.

Infekuojančio viruso susiformavimui reikalingas tikslus pirmtako poliproteinų subrandinimas retrovirusinės proteazės pagalba. Buvo parodyta, kad in vitro mutagenezė, kurioje produkuojamas turintis proteazės trūkumą, virusas, duoda nesubrendusių pagrindinių formų produkciją, kurios nėra infekciškos. Žr. Crawford et ai., J. Virol. 53, 899 (1985); Katoh et ai., Virology 145, 280 (1985). Todėl retrovirusinės proteazės inhibicija yra patrauklus taikinys priešvirusinei terapijai. Žr. Mitsuya, Natų re 325, 775 (1987).

Galimybė inhibuoti virusinę proteazę sukuria būdą blokuoti viruso replikaciją, taigi ir virusinių ligų, tokių kaip AIDS gydymo būdą, kuris gali turėti mažiau pašalinių poveikių, būti efektyvesnis ir mažiau rezistentiškas vaistams, lyginant su dabartiniais gydymo būdais. Dėl to šiuo metu prekyboje yra trys ŽIV proteazės inhibitoriai - Roche sakvinaviras, Abbott’o ritonaviras ir Merck'o indinaviras, ir atliekami keleto potencialių proteazės inhibitorių klinikiniai tyrimai, pvz. Vertex VX-478, Agouron’o nelfinaviro, Japan Energy KNI-272 ir Ciba-Geigy CGP 61755.

Remiantis duomenimis apie šiuo metu prekyboje esančius ir klinikoje tiriamus proteazių inhibitorius, buvo ištirta daug įvairių junginių, galinčių būti ŽIV proteazės inhibitoriais. Viena struktūra - cikliniai karbamidai - atkreipė ypatingą dėmesį. Pavyzdžiui, PCT paraiškoje Nr. VVO94/19329 Lam ir kt. daugiausia aprašo ciklinius karbamidus, kurių formulė:

R^{4 %}N

O

JL -R

N

R⁷

HO OH ir tokių karbamidų gavimo budus. Nors šio išradimo junginiai patenka i Lam ir kt. aprašymą, jie nėra konkretizuoti.

Net ir turint gana sėkmingus dabartinius proteazės inhibitorius, buvo rasta, kad ŽIV pacientai gali pasidaryti rezistentiški atskiram proteazės inhibitoriui. Taigi, tolimesnei kovai su ŽIV infekcija yra pageidautina sukurti papildomus proteazės inhibitorius.

IŠRADIMO SANTRAUKA

Taigi, vienas šio išradimo tikslas yra pateikti naujus proteazes inhibitorius.

Kitas šio išradimo tikslas yra pateikti farmacines kompozicijas, pasižyminčias proteazes inhibavimo aktyvumu, kuriose yra farmaciškai tinkamas nešiklis ir bent vieno iš šio išradimo junginių arba jo farmaciškai tinkamos druskos, arba jo provaisto formos terapiškai efektyvus kiekis.

Dar kitas šio išradimo tikslas yra pateikti šio išradimo junginius arba jų farmacisškai tinkamas druskas, arba jų provaistų formas, skirtas ŽIV infekcijos gydymui.

Dar kitas šio išradimo tikslas yra pateikti naują derinį iš (a) vieno iš šio išradimo junginių ir (b) vieno arba daugiau junginių, pasirinktų iš grupės, susidedančios iš ŽIV atvirkštinės transkriptazės inhibitorių ir ŽIV proteazes inhibitorių, skirtą ŽIV infekcijos gydymui.

Dar kitas šio išradimo tikslas yra pateikti ŽIV inhibavimo kūno skysčio mėginyje būdą, kuris apima kūno skysčio mėginio apdorojimą šio išradimo junginio efektyviu kiekiu.

Dar kitas šio išradimo tikslas yra pateikti rinkinį arba talpą, kurioje yra bent vieno iš šio išradimo junginių toks kiekis, kuris yra efektyvus naudoti kaip standartas arba reagentas teste arba bandyme potencialaus vaisto, galinčio inhibuoti ŽIV proteazę, ŽIV augimą arba ir vieną ir kitą, nustatymui.

Šiuos ir kitus tikslus, kurie paaiškės iš toliau duodamo smulkaus aprašymo, išradėjai pasiekė atradę, kad I ir II formulių:

HO junginiai, jų farmaciškai tinkamos druskos arba jų provaisto formos yra efektyvūs proteazės inhibitoriai.

SMULKUS IŠRADIMO APRAŠYMAS

Taigi, pirmajame išradimo įgyvendinimo variante pateikiamas naujas I arba II formulės:

junginys, jo farmaciškai tinkama druska arba jo provaisto forma.

Tinkamiausiame šio išradimo įgyvendinimo variante pateikiamas naujas I formulės junginys.

Kitame tinkamiausiame šio išradimo įgyvendinimo variante pateikiamas naujas Ii formulės junginys.

Antrajame šio išradimo įgyvendinimo variante pateikiama nauja farmacinė kompozicija, susidedanti iš farmaciškai tinkamo nešiklio ir terapiškai efektyvaus kiekio I arba II formulės junginio, jo farmaciškai tinkamos druskos, arba jo provaisto formos.

Kitame tinkamiausiame įgyvendinimo variante junginys yra I formulės junginys.

Kitame tinkamiausiame Įgyvendinimo variante junginys yra II formulės junginys.

Trečiajame šio išradimo įgyvendinimo variante pateikiamas I arba II formulės junginys arba jo farmaciškai tinkamos druskos, arba jo provaisto formos, skirtas ŽIV infekcijos gydymui.

Kitame tinkamiausiame įgyvendinimo variante junginys yra I formulės junginys.

Kitame tinkamiausiame įgyvendinimo variante junginys yra II formulės junginys.

Ketvirtajame šio išradimo įgyvendinimo variante pateikiamas naujas derinys iš:

(a) I arba II formulės junginio; ir (b) bent vieno junginio, pasirinkto iš grupės, susidedančios iš ŽIV atvirkštinės transkriptazės inhibitorių ir ŽIV proteazės inhibitorių, skirtas ŽIV infekcijos gydymui.

Kitame tinkamiausiame įgyvendinimo variante junginys yra I formulės junginys.

Kitame tinkamiausiame įgyvendinimo variante junginys yra II formulės junginys.

Kitame tinkamiausiame įgyvendinimo variante atvirkštinės transkriptazės inhibitorius yra nukleozidinis atvirkštinės transkriptazės inhibitorius.

Dar labiau tinkamame jgyvendinimo variante nukleozidinis atvirkštinės transkriptazės inhibitorius yra pasirinktas iš AZT, 3TC, ddl, ddC ir d4T, o proteazės inhibitorius yra pasirinktas iš sakvinaviro, ritonaviro, indinaviro, VX478, nelfinaviro, KNI-272, CGP-61755 ir U-103017.

Kitame dar labiau tinkamame jgyvendinimo variante nukleozidinis atvirkštinės transkriptazės inhibitorius yra pasirinktas iš AZT ir 3TC, o proteazės inhibitorius yra pasirinktas iš sakvinaviro, ritonaviro ir indinaviro.

Dar labiau tinkamame įgyvendinimo variante nukleozidinis atvirkštinės transkriptazės inhibitorius yra AZT.

Kitame dar labiau tinkamame jgyvendinimo variante proteazės inhibitorius yra indinaviras.

Penktajame šio išradimo jgyvendinimo variante pateikiamas farmacinis rinkinys, tinkamas gydyti ŽIV infekcijai, kuris susideda iš terapiškai efektyvaus kiekio:

(a) I arba II formulės junginio; ir (b) bent vieno junginio, pasirinkto iš grupės, susidedančios iš ŽIV atvirkštinės transkriptazės inhibitorių ir ŽIV proteazės inhibitorių, esančių vienoje arba keliose steriliose talpose.

Kitame tinkamiausiame įgyvendinimo variante junginys yra I formulės junginys.

Kitame tinkamiausiame įgyvendinimo variante junginys yra II formulės junginys.

Šeštajame šio išradimo Įgyvendinimo variante pateikiamas naujas ŽIV , eančio kūno skysčio mėginyje, inhibavimo būdas, kuris apima kūno skysčio mėginio apdorojimą I arba II formulės junginio efektyviu kiekiu.

Septintajame šio išradimo Įgyvendinimo variante pateikiamas naujas rinkinys arba talpa, kurioje yra I arba II formulės junginio toks kiekis, kuris yra efektyvus naudoti kaip standartas arba kaip reagentas teste arba bandyme, nustatant potencialaus vaisto sugebėjimą inhibuoti ŽIV proteazę, ŽIV augimą arba ir vieną, ir kitą.

APIBRĖŽIMAI

Toliau duodami čia naudojami terminai ir išsireiškimai turi nurodytas reikšmes. Reikia turėti omenyje, kad šio išradimo junginiai turi asimetriškai pakeistą anglies atomą ir jie gali būti išskirti kaip optiškai aktyvūs arba kaip racemines formos. Specialistams žinoma kaip pagaminti optiškai aktyvias formas, pavyzdžiui, perskiriant racemines formas arba sintezės iš optiškai aktyvių pradinių medžiagų būdu. Jeigu konkreti stereochemija arba izomero forma nenurodyta, turimos omenyje visos chiralinės, diastereomerines, racemines formos ir visos geometrinių izomerų formos.

Čia naudojamas terminas ŽIV atvirkštinės transkriptazės inhibitorius” reiškia ir nukleozidinius, ir nenukleozidinius ŽIV atvirkštinės transkriptazės (AT) inhibitorius. Nukleozidinių AT inhibitorių pavyzdžiais yra (bet jais neapsiribojama) AZT, ddC, ddl d4T ir 3TC. Nenukleozidinių AT inhibitorių pavyzdžiais yra (bet jais neapsiribojama) viviradinas (Pharmacia and Upjohn

U901525), TIBO dariniai, BI-RG-587, nevirapinas, L-697,661, L Y 73497 ir Ro 18,893 (Roche).

Čia naudojamas terminas “ŽIV proteazės inhibitorius reiškia junginius, kurie inhibuoja ŽIV proteazę. Jų pavyzdžiais yra (bet jais neapsiribojama) sakvinaviras (Roche, Ro31-8959), ritonaviras (Abbott, ABT-538), indinaviras (Merck, MK-639), VX-478 (Vertex/Glaxo VVellcome), nelfinaviras (Agouron, AG-1343), KNI-272 (Japan Energy), CGP-61755 (Ciba-Geigy) ir U-103017 (Pharmacia and Upjohn). Papildomais pavyzdžiais yra ciklinės proteazės inhibitoriai, aprašyti WO 93/07128, WO 94/19329, WO 94/22840 ir PCT paraiškoje Nr. US96/03426.

Čia naudojamas terminas “farmaciškai tinkamos druskos reiškia išradime aprašytų junginių darinius, kai pagrindinis junginys yra modifikuojamas, pagaminant jo druskas su rūgštimis arba su bazėmis. Farmaciškai tinkamų druskų pavyzdžiais yra (bet jais neapsiribojama) bazinių liekanų, tokių kaip aminogrupę, mineralinių arba organinių rūgščių druskos; rūgštinių liekanų, tokių kaip karboksirūgšties grupė, šarminių metalų arba organinės druskos; ir pan. Farmaciškai tinkamos druskos apima įprastas netoksiškas druskas arba gautas pagrindinio junginio ketvirtines amonio druskas, pavyzdžiui, iš netoksiškų neorganinių arba organinių rūgščių. Pavyzdžiui, tokios įprastos netoksiškos druskos yra druskos, gautos iš neorganinių rūgščių, kaip antai vandenilio chlorido, vandenilio bromido, sulfato, sulfamo, fosfato, nitrato ir pan,; ir druskos, pagamintos iš organinių rūgščių, kaip antai acto, propiono, gintaro, glikolio, stearino, pieno, obuolių, vyno, citrinos, askorbo, pamo, maleino, hidroksimaleino, fenilacto, glutamo, benzenkarboksirūgšties, salicilo, sulfanilo, 2-acetoksibenzenkarboksirūgšties, fumaro, toluensulfonrūgšties;· metansulfonrūgšties, etandisulfonrūgšties, oksalo, izetiono ir pan. rūgščių.

Šio išradimo junginių farmaciškai tinkamos druskos gali būti susintetintos iš pagrindinio junginio, kuriame yra bazinė arba rūgštinė liekana, įprastais cheminiais būdais. Paprastai tokios druskos gali būti pagaminamos veikiant šių junginių laisvos rūgšties arba bazės formas atitinkamos bazės arba rūgšties stechiometriniu kiekiu vandenyje arba organiniame tirpiklyje, arba jų abiejų mišinyje; paprastai tinamiausios yra nevandeninės terpės, kaip antai eteris, etilacetatas, etanolis, izopropanolis arba acetonitrilas. Tinkamų druskų sąrašas yra randamas Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,

1985, p.1418, kuris čia duodamas kaip literatūros šaltinis.

Čia naudojama frazė “farmaciškai tinkami” reiškia tokius junginius, medžiagas, kompozicijas ir/arba dozuotas formas, kurios pagai medicinini sprendimą yra tinkamos naudoti sąlytyje su žmonių arba gyvūnų audiniais ir nerodo perdėto toksiškumo, suerzinimo, neduoda alerginio atsako arba kitokių problemų bei komplikacijų, ir atitinka priimtiną naudos/rizikos santyki.

Laikoma, kad “provaistai” apima bet kokius kovalentiškai prijungtus nešiklius, kurie atpalaiduoja šio išradimo veiklųjį pagrindinį I arba II, arba kitos formulės vaistą, arba junginius in vivo, kai toks provaistas yra duodamas žinduoliui. Šio išradimo junginio, pavyzdžiui, (I) formulės junginio, provaistai yra pagaminami modifikuojant junginyje esančias funkcines grupes taip, kad tokios modifikacijos yra suskaldomos arba įprastomis manipuliacijomis, arba in vivo iki pagrindinio junginio. Provaistais yra šio išradimo junginiai, kuriuose hidroksilo arba aminogrupė yra prijungta prie kokios nors grupės taip, kad kai tokį provaistą gauna žinduolis, jis suskyla, atitinkamai susidarant laisvai hidroksilo arba aminogrupei. Provaistų pavyzdžiais yra (bet jais neapsiribojama) I arba Ii formulės junginių alkoholinių ir amino funkcinių grupių acetato, formiato arba benzoato dariniai;

I arba II formulės junginių alkoholinių funkcinių grupių fosfato esteriai, dimetilglicino esteriai, aminoalkilbenzilo esteriai, aminoalkilo esteriai ir karboksialkilo esteriai; ir pan. Papildomais pavyzdžiais yra junginiai, kuriuose sujungiamos I arba II formulės junginių dvi hidroksilo grupės, susidarant epoksidui; -OCH₂SCH₂O-; -OC(=O)O-; -OCH₂O-; -OC(=S)O-; OC(=O)C(=O)O-; -OC(CH₃)₂O-; -OC((CH₂)₃NH₂)(CH₃)O-; OC(OCH₃)(CH₂CH₂CH₃)O-; arba -OS(=O)O-.

Laikoma, kad “stabilus junginys” ir “stabili struktūra reiškia junginį, kuris yra pakankamai atsparus, kad išlaikytų išskyrimą iš reakcijos mišinio iki tinkamo grynumo laipsnio ir pagaminimą efektyvaus terapinio agento kompozicijos. Šis išradimas apima tik stabilius junginius.

Terminas “pakeistas” reiškia, kad vienas arba daugiau vandenilių prie išsireiškime, kuriame naudojamas “pakeistas”, nurodyto atomo yra pakeisti kokiomis nors iš nurodytų grupių rinkinio su sąlyga, kad neviršijamas nurodyto atomo normalus valentingumas ir kad toks pakeitimas duoda stabilų jungini. Jeigu pakaitas yra ketogrupė (t.y. =0), tada prie to atomo yra pakeisti 2 vandeniliai.

“Terapiškai efektyvus kiekis reiškia toki šio išradimo junginio kieki arba junginių derinio kiekį, kuris apibrėžiamas kaip efektyviai inhibuojantis subjekto ŽIV infekciją arba gydantis ŽIV infekcijos simptomus. Pageidautina, kai junginių derinys būtų sinergetinis derinys. Sinergetinis efektas, kaip aprašyta, pavyzdžiui, Chou and Talalay, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55 (1984), yra tada, kai junginio poveikis (šiuo atveju ŽIV replikacijos inhibicija), vartojant ji derinyje, yra didesnis, nei junginių adityvinis efektas, vartojant juos kaip atskirus agentus. Paprastai sinergetinis efektas aiškiausiai pademonstruojamas, imant mažesnes nei optimalios junginių koncentracijas. Sinergetinis efektas gali pasireikšti derinio mažesniu citotoksiškumu, padidintu priešvirusiniu poveikiu arba kokiu nors kitu naudingu poveikiu, lyginant su atskirais komponentais.

Kitos išradimo ypatybės paaiškės iš tolimesnio pavyzdinių įgyvendinimo variantų aprašymo, kurie duodami išradimo iliustracijai ir jo neapriboja.

PAVYZDŽIAI

Pavyzdžiuose naudojami tokie sutrumpinimai: “°C” - Celsijaus laipsniai, “d” - dubletas, dd - dvigubas dubletas, ekv” - ekvivalentas arba ekvivalentai, “g” - gramas arba gramai, “mg” - miligramas arba miligramai, “ml” - mililitras arba mililitrai, “H” - vandenilis arba vandeniliai, “vai. - valanda arba valandos, “m - multipletas, “M” - molinė koncentracija, “min. - minutė arba minutės, “MHz - megahercas, “MS” - masių spektroskopija, “BMR” branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, “t - tripletas ir “PSC” plonasluoksnė chromatografija.

PAVYZDYS (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1-[5-(3-aminoindazol)metilj-5,6-dihidroksi-4,7bis[fenilmetil]-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-ono (I) gavimas

O

MeOTf, DCE virinimas su grįžtamu šaldytuvu

Junginys 1 gali būti pagamintas žinomais būdais. Pavyzdžiui, junginio 1 gavimas yra parodytas Rossano et ai (Tetr. Lett. 1995, 36(28), 4967, 4968), kuris duodamas kaip literatūros šaltinis, 1 schemoje. Papildomas junginio 1 gavimo būdas parodytas US patento Nr. 5,530,124, kuris duodamas kaip literatūros šaltinis, 6 pavyzdyje.’

A dalis: j junginio 1 (10,0 g: 27,3 mmol) suspensiją 1,2-dichloretane (100 ml) pridedama metiltriflato (3,4 ml, 30 mmol). Pavirinus su grįžtamu šaldytuvu per naktį, reakcijos mišinys plaunamas sočiu NaHCO₃, sočiu NaCI, džiovinamas (Na₂SO₄) ir nugarinamas, liekant 12,5 g geltonos alyvos. Po chromatografijos per kolonėlę (sparčiosios chromatografijos SiO₂; 25 %

EtOAc/heksanas) gaunama 7,86 g junginio 2, kuris yra gelsva alyva, išsikristalinanti stovint (75 % išeiga). Lyd. temp, = 97-100 °C. MH⁺ = 381.

B dalis: Į izokarbamido 2 (4,43 g; 11,7 mmol) ir 3-ciano-4fluorbenziibromido (5,00 g; 23,3 mmol) 0 °C temperatūros tirpalą DMF (50 ml) pridedama NaH (60 % mineralinėje alyvoje; 1,40 g; 35,0 mmol). Sušildžius iki kambario temperatūros ir pamaišius per naktį, reakcijos mišinys supilamas j 25 % Et₂O/EtOAc. Organinė fazė plaunama vandeniu (3x), sočiu NaCi, džiovinama (Na₂SO₄) ir nugarinama, liekant geltonai alyvai. Po chromatografijos per kolonėlę (sparčiosios chromatografijos SiO₂; 25 % EtOAc/heksanas) gaunama 5,55 g junginio 3, kuris yra bespalvė alyva (92 % išeiga). MH⁺ = 514.

C dalis: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1-[(3-ciano-4-fluorfenil)metil]-5,60-izopropiliden-4,7-bis-(4-fenilmetil)-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-onas (4).

Izotiokarbamido 3 (2,78 g; 5,41 mmol) ir benzilo bromido (1,93 ml; 16,2 mmol) tirpalas acetonitrile (15 ml) virinamas su grįžtamu šaldytuvu per naktį. Reakcijos mišinys nugarinamas ir chromatografuojamas per kolonėlę (sparčiosios chromatografijos SiO₂; 20 % EtOAc/heksanas); gaunama 3,02 g 4, kuris yra balta putų pavidalo medžiaga (95 % išeiga). MH⁺ = 560.

D dalis: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1-[5-(3-aminoindazol)metil]-5,6-0izopropiliden-4,7-bis-(4-fenilmetil)-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-onas (5).

Nitrilo 4 (3,02 g; 5,13 mmol) tirpalas n-BuOH (30 ml) ir hidrazinhidratas (6 ml) virinamas su grįžtamu šaldytuvu per naktį. Reakcijos mišinys supilamas j EtOAc ir plaunamas 10 % citrinos rūgštimi (2x), sočiu NaCI, sočiu NaHCO3, sočiu NaCi, džiovinamas (Na₂SO₄), ir nugarinus lieka 3,09 g 5, kuris yra balta putų pavidalo medžiaga (100 % išeiga). MH⁺ = 602.

E dalis: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1 -[5-(3-aminoindazol)metil]-5,6dihidroksi-4,7-bis-(fenilmetil)-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-onas (I).

Junginio 5 (3,09 g; 5,14 mmol) tirpalas 3 N HCI (10 ml) ir THF (40 ml) maišomas per naktį. Reakcijos mišinys supilamas j EtOAc ir plaunamas sočiu NaHCO₃, sočiu NaCi, džiovinamas (Na₂SO₄), ir nugarinus lieka oranžinė alyva. Po chromatografijos per kolonėlę (sparčiosios chromatografijos SiO₂, 7 % MeOH/CH₂CI₂ ir 0,8 % NH₄OH) gaunama 2,15 g rožinės stiklo pavidalo kietos medžiagos. Perkristalinūs iš 3:1 CH₂CI₂/Et₂O, gaunama 1,7 g (I), kuris yra švelniai rožiniai kristalai; jie džiovinami giliame vakuume per naktį 85 °C temperatūroje. Lyd. temp. 134-139 °C.

PAVYZDYS (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1-[5-(3-aminoindazol)metil]-5,6-dihidroksi-4,7bis[(4-metilfenil)metil]-3-fenilmeti!-2H-1,3-diazapin-2-ono (II) gavimas

A dalis: (2R,3S,4S,5R)-2,5-Bis(2,2-dimetilhidrazo)-1,6-bis(4-metilfenil)3,4-O-izopropilidenheksandiolis (10).

Pradinis hidrazonas gali būti pagaminamas pagal Rossano et ai (žr.3a formulę Tetr. Lett. 1995, 36(28),4967-70 4968 puslapyje), kuris duodamas kaip literatūros šaltinis.

Į p-ksileną (57 ml; 464 mmol) 15 °C temperatūroje per 5 min. sulašinamas antr.-butillitis (95 ml; 123 mmol; 1,3 M cikloheksane). Tirpalas atšaldomas iki -15 °C ir sulašinamas THF (30 ml). Pamaišius 1 vai., sulašinamas hidrazono (10,2 g; 42 mmol) tirpalas THF (30 ml). Reakcijos mišinys pamaišomas 20 min. ir sušildomas iki 0 °C. Šis tirpalas atsargiai suskaldomas vandeniu ir ekstrahuojamas EtOAc. Sumaišyti organiniai sluoksniai ekstrahuojami 1N HCI, ir sumaišytos vandeninės frakcijos stipriai pašarminamos 50 % vandeniniu NaOH. Gautas mišinys ekstrahuojamas EtOAc, plaunamas sočiu NaCI ir džiovinamas (MgSO₄). Sumažintame slėgyje nugarinus tirpiklj, gaunamas bis-hidrazinas 10, kuris yra alyva (19,25 g; 99 %):

¹H BMR (CDCI3) δ 7,08 (s, 8H), 4,09 (s, 2H), 3,02 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 2,67 (m, 4H), 2,31 (s, 6H), 2,17 (s, 12H), 1,43 (s, 6H); IR (KBr) v 2980, 1680, 1510, 1240 cm'¹; MSGMS (ESI) m/z: 455 (M + H⁺, 6 %), 228 (M+2H⁺, 100 %); DSGMS išskaičiuota pagal C27H₄₃N₄O₂ (M + H⁺) 455,3386; rasta 455,3393.

B dalis: (2R,3S,4S,5R)-2,5-Diamino-1,6-bis(4-metilfenil)-3,4-Oizopropilidenheksandiolis (11).

| bis-hidrazino 10 (18,64 g; 41 mmol) tirpalą metanolyje (150 ml) pridedama Renėjaus nikelio (20 g, 50 % suspensija), j šią suspensiją prileidžiama vandenilio (1724 kPa) ir šildoma 100 °C temperatūroje 16 vai. Suspensija atšaldoma, nufiltruojama per celitą, ir sumažintame slėgyje nugarinamas tirpiklis. Po chromatografijos (silikagelis, 10 % metanolis/CH₂CI₂) gaunamas diaminas 11, kuris yra alyva (12,49 g: 83 %): ¹H BMR (CDCb) δ 7,08 (ab, J = 8,1 Hz, Δν = 15,2 Hz, 8H), 4,01 (s, 2H), 2,94 (m, 2H), 2,77 (ΑΒΧ A dalis, JAB = 13,4 Hz, Jax = 4,6 Hz, 2H), 2,51 (ΑΒΧ B dalis, Jab = 13,4 Hz, JBX = 9,7 Hz, 2H), 2,32 (s, 6H), 1,45 (s, 6H): IR (KBr) v 2980, 2920, 1510 cm'¹; MSGMS (ES!) m/z: 369 (M + H⁺, 16 %), 185 (M+2H ⁺ , 100 %); DSGMS išskaičiuota pagal C23H₃₃N₂O₂ (M + H⁺) 369,2542; rasta 369,2534.

C dalis: (4R,5S_l6S,7R)-Heksahidro-5,6-O-izopropiliden-4,7-bis[(4metilfenil)metil]-2H-1,3-diazapin-2-onas (12).

j diamino 11 (12,48 g; 33,9 mmol) tirpalą 1,1,2,2-tetrachloretane (130 ml) pridedama 1.1’-karbonildiimidazolo (5,67 g; 35 mmol). Po 10 min. šis tirpalas per 45 min. sulašinamas j 1,1,2,2-tetrachloretaną (600 ml) virinant su grįžtamu šaldytuvu. Tirpalas atšaldomas, plaunamas vandeniu, sočiu NaCI ir džiovinamas (MgSO₄). Sumažintame slėgyje nugarinamas tirpiklis, liekana chromatografuojama (silikagelis, 33 % etilacetatas/heksanas), po to perkristalinama (etilacetatas/heksanas), ir gaunamas ciklinis karbamidas 12, kuris yra balta kieta medžiaga (6,18 g; 46 %): lyd. temp. 228-230 °C; ¹H BMR (CDCI₃) δ 7,12 (pl.s, 8H), 4,93 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 4,25 (s, 2H), 3,50 (m, 2H),

3,01 (apytikris d, J = 13,2 Hz, 2H), 2,78 (apytikris t, J = 11,8 Hz, 2H), 2,33 (s,

6H), 1,54 (s, 6H); IR (KBr) v 3260, 2930, 1670, 1090 cm'¹; MSGMS (ESI) m/z;

395 (M + H⁺, 100 %); DSGMS išskaičiuota pagal C₂₄H3iN₂O3 (M + H⁺) 395,2335; rasta 395,2333.

D dalis: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-5,6-O-izopropiliden-4,7-bis[(4metilfenil)metil]-1-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-onas (13).

Į ciklinio karbamido 12 (3,0 g; 7,6 mmol) ir benzilo bromido (1,59 g, 9,3 mmol) tirpalą THF (300 ml) 0 °C temperatūroje per 30 min. sulašinamas kalio t-butoksidas (8,4 ml; 8,4 mmol, 1,0 M THF). Tirpalui leidžiama sušilti iki kambario temperatūros ir maišoma par naktj. Reakcijos mišinys praskiedžiamas sočiu NaCI ir ekstrahuojamas EtOAc. Sumaišyti organiniai sluoksniai plaunami sočiu NaCI ir džiovinami (MgSO₄). Sumažintame slėgyje nugarinus tirpiklį, liekana chromatografuojama (silikagelis, 25 % etilacetatas/heksanas), ir gaunamas ciklinis karbamidas 13, kuris yra stiklo pavidalo medžiaga (2,57 g; 70 %): Ή BMR (CDCb) δ 7,28 (m, 3H), 7,15 (m,

10H), 5,12 (d, J = 14,6 Hz, 1H), 4,88 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 4,23 (m, 1H), 3,75 (m, 2H), 3,47 (m, 1H), 3,01 (m, 3H), 2,86 (d, J = 14,6 Hz, 1H), 2,66 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,45 (s, 3H), 1,40 (s, 3H); IR (KBr) v 2930, 1650, 1240, 1090 cm'¹; MSGMS (ESI) m/z; 485 (M + H⁺, 100 %); DSGMS išskaičiuota pagal C31H37N2O3 (M + H⁺) 485,2804; rasta 485,2789.

E dalis: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1 -[(3-ciano-4-fluorfenil]metil]-5,6-Oizopropiliden-4,7-bis[(4-metilfenil)metil]-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-onas (14).

j ciklinio karbamido 13 (2,30 g; 4,75 mmol) ir 3-ciano-4-fluorbenzilo bromido (1,07 g, 5,0 mmol) tirpalą THF (200 ml) 0 °C temperatūroje pridedama kalio t-butoksido (4,8 ml; 4,8 mmol, 1,0 M THF). Tirpalui leidžiama sušilti iki kambario temperatūros ir maišoma par naktį. Reakcijos mišinys praskiedžiamas sočiu NaCI ir ekstrahuojamas EtOAc. Sumaišyti organiniai sluoksniai plaunami sočiu NaCI ir džiovinami (MgSO₄). Sumažintame slėgyje nugarinus tirpikli, liekana chromatografuojama (silikagelis, 25 % etilacetatas/heksanas), ir gaunamas ciklinis karbamidas 14, kuris yra stiklo pavidalo medžiaga (2,43 g; 82 %): Ή BMR (CDCI₃) δ 7,33 (m, 5H), 7,13 (d, J = 7,7 Hz, 4H), 6,95 (m, 7H), 4,-89 (d, J =14,3 Hz, 1H), 4,46 (d, J = 14,3 Hz, 1H), 3,97 (m, 1H), 3,78 (m, 3H), 3,65 (d, J = 14,3 Hz, 1H), 3,07 (d, J = 14,3 Hz, 1H), 2,83 (m, 4H), 2,36 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,44 (s, 3H), 1,38 (s, 3H); IR (KBr) v 2980, 2930, 2240, 1630, 1230, cm'¹; CIMS (NH₄) m/z; 635 (M + NH?, 100 %); DSGMS išskaičiuota pagal C39H₄iN₃O₃F (M + H⁴) 618,3132; rasta 618,3119.

F dalis: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1 -[5-(3-aminoindazol)metilj-5,6-Oizopropiliden-4,7-bis[(4-metilfenil)metil]-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-onas (15).

J ciklinio karbamido 14 (2,40 g; 3,89 mmol) tirpalą n-butanolyje (40 ml) pridedama hidrazino monohidrato (19,8 g; 395 mmol), ir gautas tirpalas virinamas su grįžtamu šaldytuvu per naktį. Mišinys praskiedžiamas vandeniu ir ekstrahuojamas EtOAc. Sumaišyti organiniai sluoksniai plaunami sočiu NaCI ir džiovinami (MgSO₄). Tirpiklis nugarinamas sumažintame slėgyje ir liekana chromatografuojama (silikagelis, 10 % metanolis/metileno chloridas); gaunamas aminoindazolas 15, kuris yra balta kieta medžiaga (2,34 g; 95 %): lyd. temp. 120-124 °C; ¹H BMR (CDCb) δ 7,25 (m, 12H), 6,97 (t, J = 7,7 Hz, 4H), 4,98 (dd, J = 14,3, 2,0 Hz, 2H), 3,80 (s, 2H), 3,76 (m, 2H), 3,27 (d, J = 14,3 Hz, 1H), 3,09 (d, J = 14,3 Hz, 1H), 2,86 (m, 4H), 2,35 (s, 6H), 1,32 (s, 6H); IR (KBr) v 3310, 2930, 1630, 1430, 1230 cm’’; CIMS (NH4) m/z: 630 (M + H ⁺ , 100 %); DSGMS išskaičiuota pagal C39H₄₄N₅O₃ (M + H⁺) 630,3444; rasta 630,3428.

G dalis: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1-[5-(3-aminoindazol)metii]-5,6dihidroksi-4,7-bis[(4-metilfenil)metilj-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-onas (II).

Ciklinis karbamidas 15 (1,90 g; 3,02 mmoi) ištirpinamas 10 % kone. HCI metanolyje (40 mi). Po 2 vai. pridedama sotaus vandeninio Na₂CO₃, ir suspensija ekstrahuojama EtOAc. Sumaišyti organiniai sluoksniai plaunami sočiu NaCI ir džiovinami (MgSO₄). Sumažintame slėgyje nugarinamas tirpiklis, liekana chromatografuojama (silikagelis, 10 % metanolis/metileno chloridas) ir gaunamas norimas junginys, kuris yra balta kieta medžiaga (1,71 g; 96 %); lyd. temp. 142-146 °C; ¹H BMR (CD₃OD) δ 7,37 (s, 1H), 7,28 (m,'

3H), 7,22 (s, 2H), 7,15 (m, 6H), 6,94 (m, 4H), 4,77 (d, J = 14,3 Hz, 1H), 4,72 (d, J = 14,3 Hz, 1H), 3,59 (m, 2H), 3,51 (pl.s, 2H), 3,11 (d, J = 14,3 Hz, 1H),

2,93 (m, 5H), 2,31 (pl.s, 6H); IR (KBr) v 3330, 2920, 1610, 1470, 1230 cm’¹;

CIMS (NH₃) m/z: 590 (M + H ⁺ , 100 %); DSGMS išskaičiuota pagal C36H4oN503 (M + H⁺) 590,3131; rasta 590,3132; Anai. (Ο36Η₃₉Ν₅Ο₃) C, H, N.

PANAUDOJIMO GALIMYBĖS

I ir II formulių junginiai pasižymi ŽIV proteazę inhibuojančiu aktyvumu ir todėl yra tinkami kaip priešvirusiniai agentai ŽIV infekcijos ir su ja susijusių ligų gydymui. I ir II formulių junginiai pasižymi ŽIV proteazę inhibuojančiu aktyvumu ir yra veiksmingi kaip ŽIV augimo inhibitoriai. Šio išradimo junginių sugebėjimas inhibuoti virusų augimą arba infektyvumą yra pademonstruotas standartiniame virusų augimo arba infektyvumo teste, pavyzdžiui, naudojant žemiau aprašytą testą.

Šio išradimo I ir II formulių junginiai taip pat tinka ŽIV inhibavimui ex vivo mėginyje, kuriame yra ŽIV arba kuris turėjo sąlytį su ŽIV. Taigi šio išradimo junginiai gali būti naudojami ŽIV inhibavimui organizmo skysčio mėginyje (pavyzdžiui, serumo arba sėklos mėginyje), kuriame yra ŽIV, kuris įtariamas turintis ŽIV arba kuris turėjo sąlytį su ŽIV.

Šiame išradime pateikiami junginiai taip pat yra tinkami naudoti kaip standartiniai arba etaloniniai junginiai testuose arba tyrimuose, nustatant kokio nors agento sugebėjimą inhibuoti viruso klono replikaciją ir/arba ŽIV proteazę, pavyzdžiui, vaistų -paieškos programose. Taigi šio išradimo junginiai gali būti naudojami kaip kontrolinis arba etaloninis junginys tokiuose bandymuose ir kaip kokybės kontrolės standartas. Šio išradimo junginiai gali būti pateikiami komerciniuose rinkiniuse arba talpose, skirtose panaudoti kaip toks standartas arba etaloninis junginys.

Kadangi šio išradimo junginiai pasižymi specifiškumu ŽIV proteazei, šio išradimo junginiai taip pat gali būti tinkami kaip diagnostiniai reagentai diagnostiniuose testuose ŽIV proteazei aptikti. Taigi, šios proteazės aktyvumo inhibavimas teste (tokiame kaip aprašyta šiame išradime) šio išradimo junginiu parodys, kad yra ŽIV proteazės ir ŽIV viruso.

Čia naudojami sutrumpinimai “ug reiškia mikrogramą, “mg miligramą, “g - gramą, “μΙ” - mikrolitrą, “ml - mililitrą, “I” - litrą, “nM nanomolinę, “μΜ” - mikromolinę, mM - milimolinę, M” - molinę koncentracijas, o “nm - nanometrą. “Sigma reiškia St. Louis, MO SigmaAldrich korporaciją.

ŽIV RNR TYRIMAS

DNR plazmidės ir in vitro RNR transkriptai:

pDAB 72 plazmidė, turinti ir gag, ir pol BH10 (bp 113-1816) sekas, klonuota j PTZ 19R, buvo pagaminta pagal Erickson-Viitanen et ai. AIDS Research and Human Retroviruses 1989, 5, 577. Prieš generuojant j in vitro RNR transkriptus ši plazmidė buvo linearizuota Bam Hl, naudojant Riboprobe Gemini sistemos II rinkinį (Promega) su T7 RNR polimeraze. Sintezuota RNR buvo gryninama veikiant RNAzės neturinčia DNAze (Promega), ekstrahuojant fenoliu-chloroformu ir nusodinant etanoliu. RNR transkriptai buvo ištirpinami vandenyje ir laikomi -70 °C temperatūroje. RNR koncentracija nustatoma iš Α₂6ο.

Mėginiai:

Po sintezės Applied Biošystems (Foster City, CA) DNR sintezatoriumi, prijungiant biotiną prie oligonukleotido 5’ galo, panaudojant Cocuzza, Tet.

Lett. 1989, 30, 6287 biotin-fosforamiditinj reagentą, biotinilinti tiriamieji mėginiai buvo gryninami didelio slėgio skysčių chromatografijos (HPLC) metodu. gag biotinilintas tiriamasis mėginys (5-biotinCTAGCTCCCTGCTTGCCCATACTA 3’) buvo komplementarus ΗΧΒ2 889-912 nukleotidams, o pol biotinilintas tiriamasis mėginys (5’-biotin21

CCCTATCAl l l l IGGTTTCCAT 3’) buvo komplementarus ΗΧΒ2 2374-2395 nukleotidams. Su šarmine fosfataze konjuguoti oligonukleotidai, naudojami kaip kontrolinis mėginys, buvo pagaminti panaudojant Syngene (San Diego, CA). pol kontrolinis mėginys (5' CTGTCTTACTTTGATAAAACCTC 3’) buvo komplementarus ΗΧΒ2 2403-2425 nukleotidams. gag kontrolinis mėginys (5’ CCCAGTATTTGTCTACAGCCTTCT 3’) buvo komplementarus ΗΧΒ2 950-973 nukleotidams. Visos nukleotidų padėtys yra tokios kaip Genbank Genetic Sequence Data Bank'e, kas buvo nustatyta panaudojant Genetics Computer Group Sequence Analysis programinį paketą (Devereau Nucleic Acids Research 1984, 12, 387). Kontroliniai mėginiai buvo pagaminti kaip 0,5 μΜ ruošiniai 2 x SSC (0,3 M NaCI, 0,03 M natrio citrato), 0,05 M Tris pH 8,8, 1 mg/ml BSA. Biotinilinti tiriamieji mėginiai buvo pagaminti kaip 100 μΜ ruošiniai vandenyje.

Streptavidinu padengtos plokštelės:

Streptavidinu padengtos plokštelės buvo gautos iš Du Pont

Biotechnology Systems (Boston, MA).

Ląstelės ir virusu ruošiniai:

MT-2 ir MT-4 ląstelės buvo laikomos RPMI 1640, i kurią pridėta 5 % fetalinio veršiuko serumo (FCS) MT-2 ląstelių atveju arba 10 % FCS MT-4 ląstelių atveju, 2 mM L-glutamino ir 50 pg/ml gentamicino (visi reagentai iš Gibco). ŽIV-1 RF buvo dauginamas MT-4 ląstelėse toje pačioje terpėje. Virusų ruošiniai buvo pagaminti, praėjus maždaug 10 dienų po MT-4 ląstelių ūmios infekcijos, ir laikomi kaip aiikvotos -70 °C temperatūroje. ŽIV-1 (RF) ruošinių infekcijos titrai buvo 1-3x10⁷ PFU (plokšteles suformuojančių vienetų)/ml, kurie buvo išmatuoti, panaudojant plokštelių testą su MT-2 ląstelėmis (žr. toliau), Kiekviena panaudota infekcijai viruso ruošinio alikvuota, buvo atšildoma tik vieną kartą.

Priešvirusinio efektyvumo įvertinimui ląstelės, kurios bus infekuojamos, buvo perkultivuotos vieną dieną prieš infekciją. Infekcijos dieną ląstelės buvo resuspenduotos imant 5x10⁵ ląstelių/ml RPMI, 5 % FCS tūrinės infekcijos atveju arba imant 2x10⁶ ląstelių/ml Dulbecco modifikuotoje Eagles terpėje su 5 % FCS mikrotitro plokštelėms infekuoti. Pridedama viruso ir kultivuojama 3 dienas 37 °C temperatūroje.

ŽIV RNR tyrimas:

Ląstelių lizatai arba išgryninta RNR 3M arba 5M GED buvo sumaišyta su 5M GED ir tiriamuoju mėginiu, gaunant 3M galutinę guanidinio izotiocianato koncentraciją ir 30 nM galutinę biotino oligonukleotido koncentraciją. Hibridizacija buvo vykdoma uždarose U pavidalo dugną turinčiose 96 duobučių audinių kultūrų plokštelėse (Nunc arba Costar) 16-20 vai. 37 °C temperatūroje. RNR hibridizacijos reakcijų mišiniai buvo praskiesti 3 kartus dejonizuotu vandeniu iki 1M galutinės guanidinio izotiocianato koncentracijos ir paimtos alikvotos (150 μΙ) supilstytos j streptavidinu padengtas mikrotitro plokštelių duobutes. Tiriamojo mėginio ir tiriamojo mėginio-RNR hibrido susirišimui su imobilizuotu streptavidinu buvo leidžiama vykti 2 vai. kambario temperatūroje, po to plokštelės buvo plaunamos 6 kartus DuPont ELISA plokštelių plovimo buferiu (fosfatinis buferis su NaCI (PBS), 0,05 % Tween 20). Antroji kontrolinio mėginio hibridizacija su imobilizuotu tiriamojo mėginio ir hibridizuotos tiriamosios RNR kompleksu buvo vykdoma perplautoje, straptavidinu padengtoje duobutėje, pridedant 120 μΙ hibridizacijos mišinio, kuriame yra 4xSSC, 0,66 % Triton'o X 100, 6,66 % dejonizuoto formamido, 1 mg/ml BSA ir 5 nM kontrolinio mėginio. Po 1 vai. hibridizacijos 37 °C temperatūroje plokštelės vėl plaunamos 6 kartus. Imobilizuotos šarminės fosfatazės aktyvumas buvo nustatomas pridedant 100 μΙ 0,2 mM 4-metilumbeliferilfosfato (MUBP, JBL Scientific) δ buferyje (2,5 M dietanolaminas, pH 8,9 (JBL Scientific), 10 mM MgCh, 5 mM cinko acetato dihidratas ir 5 mM N-hidroksietiletilendiamintriacto rūgštis). Plokštelės buvo inkubuojamos 37 °C temperatūroje. Fluorescencija matuojama esant 450 nm bangos ilgiui mikroplokštelių fluorimetru (Dynateck), žadinant 365 nm bangos ilgio šviesa.

Mikroplokšteliu testu paremtas junginio įvertinimas bandyme su ŽIV-1 infekuotomis MT-2 ląstelėmis

Tiriamieji junginiai buvo ištirpinti DMSO ir praskiesta kultivavimo terpe iki dvigubai didesnės už testuojamą koncentracijos (maksimali DMSO koncentracija yra 2 %). Po to junginio trigubi serijiniai praskiedimai kultivavimo terpėje atliekami tiesiogiai mikrotitro plokštelėse (Nunc) su U pavidalo dugnais. Praskiedus junginį, pridedama MT-2 ląstelių (50 μΙ), kad galutinė koncentracija būtų 5x10⁵ ląstelių/ml (1x10⁵ ląstelių/duobutėje). Ląstelės inkubuojamos su junginiais 30 minučių 37 °C temperatūroje CO₂ inkubatoriuje. Priešvirusinio poveikio įvertinimui į kultivavimo duobutes, kuriose yra ląstelės ir atitinkamai praskiesti tiriamieji junginiai, pridedama atitinkamai praskiesto ŽIV-1 (RF) viruso ruošinio (50 μΙ). Galutinis tūris kiekvienoje duobutėje yra 200 μΙ. Aštuonios duobutės kiekvienoje plokštelėje buvo neužkrečiamos, vietoj viruso pridedant 50 μΙ terpės, o aštuonios duobutės buvo užkrečiamos nepridedant priešvirusinio junginio. Junginio toksiškumo įvertinimui buvo kultivuojamos lygiagrečios plokštelės neužkrėstos virusu.

Po 3 dienų kultivavimo 37 °C temperatūroje drėgnoje kameroje, esančioje CO₂ inkubatoriaus viduje, iš ŽIV užkrėstų plokštelių išimamas mišinys, paliekant po 25 μΙ terpės duobutėje. I kiekvienoje duobutėje esančias ląsteles ir likusią terpę pridedama 37 μΙ 5M GED turinčio biotinilinto tiriamojo mėginio, kad būtų 3M GED ir 30 nm tiriamojo mėginio galutinės koncentracijos. Tiriamojo mėginio hibridiazcija su ŽIV RNR ląstelių lizate buvo vykdoma toje pačioje mikroplokšteiės duobutėje, naudojamoje viruso kultivavimui, užsandarinant plokštelę plokštelių sandarikliu (Costar) ir inkubuojant 16-20 vai. 37 °C temperatūros inkubatoriuje. Po to į kiekvieną duobutę pridedama distiliuoto vandens, praskiedžiant hibridizacijos reakcijos mišinį tris kartus, ir šio praskiesto mišinio 150 μΙ įpilama į streptavidinu padengtą mikrotitro plokštelę. ŽIV RNR kiekis nustatomas aukščiau aprašytu metodu. Norint nustatyti virusinės RNR kiekį, gautą infekcijos metu, kiekvienai mikrotitro plokštelei nustatoma standartinė kreivė, gaunama pridedant žinomus pDAB 72 in vitro RNR transkripto kiekius į duobutes, kuriose yra lizuotos neinfekuotos ląstelės.

Norint standartizuoti viruso inokuliantą, naudojamą įvertinant junginio priešvirusinį aktyvumą, buvo pasirinkti viruso praskiedimai, kurie duoda IC₉₀ (junginio koncentracija, kurios reikia, kad ŽIV RNR kiekis sumažėtų 90 %) reikšmę 0,2 ąg/ml dideoksicitidino (ddC). IC₉₀ reikšmės kitiems priešvirusiniams junginiams, kurie yra daugiau arba mažiau veiksmingi už ddC, buvo gaunamos naudojant keletą ŽIV-1 (RF) ruošinių pagal šią metodiką. Ši viruso koncentracija atitiko = 3x10⁵ PFU (išmatuotą pagal plokštelių testą su MT-2 ląstelėmis) tiriamajai duobutei ir paprastai davė apie 75 % virusinės RNR maksimalaus kiekio, gaunamo esant bet kokiam virusiniam inokuiiatui. ŽIV RNR testui IC₉₀ reikšmės buvo nustatomos iš gryno signalo (infekuotų ląstelių mėginių signalas minus neinfekuotų mėginių signalas) procentinio sumažėjimo RNR teste, palyginus su grynu infekuotų nepaveiktų ląstelių signalu toje pačioje kultivavimo plokštelėje (8 duobučių vidurkis). Apie atskirų infekcijų ir RNR testų realizavimo reikšmingumą buvo sprendžiama remiantis trimis kriterijais. Buvo reikalaujama, kad virusinė infekcija duotų RNR testo signalą lygų arba didesnį nei signalas, gaunamas imant 2 ng pDAB 72 in vitro RNR transkripto. ddC l₉₀ rikšmė, nustatyta kiekvienama bandyme turi būti tarp 0,1 ir 0,3 ąg/mi. Pagaliau virusinės RNR, produkuotos esant efektyviam proteazės inhibitoriui, kiekis ties plato turi būti mažesnis nei 10 % kiekio, gaunamo neinhrbuotos infekcijos atveju. Junginys buvo laikomas aktyviu, jei buvo nustatyta, kad jo IC₉₀ yra mažesnė už 1 μΜ.

Priešvirusinio veiksmingumo testuose visos manipuliacijos mikrotitro plokštelėse, pridėjus iš pradžių 2x didesnes junginio tirpalo koncentracijas j atskirą duobučių eilutę, buvo vykdomos naudojant Perkin Elmer/Cetus ProPette.

DOZĖS IR VAISTINĖS FORMOS

Šio išradimo priešvirusiniai junginiai gali būti vartojami virusinių infekcijų gydymui bet kokiais būdais, kurie duoda veikliojo agento kontaktą su agento veikimo vieta, t.y, virusine proteaze, žinduolio organizme, Jie gali būti vartojami bet kokiais įprastais vaistams vartoti tinkamais būdais arba kaip individualūs terapiniai agentai, arba terapinių agentų derinyje. Jie gali būti vartojami vieni, bet geriausia juos vartoti su farmaciniu nešikliu, pasirenkamu remiantis pasirinktu vartojimu būdu ir įprasta farmacine paktika.

Aišku, kad vartojamos dozės turi priklausyti nuo žinomų faktorių, tokių kaip konkretaus agento farmakodinaminės charakteristikos ir jo vartojimo būdas, recipiento amžius, sveikatos stovis ir svoris, simptomų prigimtis ir laipsnis; konkurentinio gydymo rūšis; gydymo dažnis ir norimas efektas. Galima laukti, kad veikliojo ingrediento dienos dozė bus nuo maždaug 0,001 iki maždaug 1000 mg kilogramui kūno masės, tinkamiausioms dozėms esant 0,1-30 mg/kg ribose.

Vartojimui tinkamų kompozicijų dozuotose formose yra nuo maždaug 1 mg iki maždaug 100 mg veikliojo ingrediento dozuotame vienete. Šiose vaistinėse kompozicijose veikliojo ingrediento kiekis paprastai sudaro maždaug 0,5-95 % bendros kompozicijos masės. Veiklusis ingredientas gali būti vartojamas peroraliniu būdu kietų dozuotų formų, kaip antai kapsulių, tablečių ir miltelių, pavidalu arba skystų dozuotų formų, kaip antai eleksyrų, sirupų ir suspensijų, pavidalu. Jis taip pat gali būti vartojamas ir parenteriniu būdu sterilių skystų dozuotų formų pavidalu.

Želatinos kapsulėse yra veiklusis ingredientas ir miltelių pavidalo nešikliai, kaip antai laktozė, krakmolas, celiuliozės dariniai, magnio stearatas, stearino rūgštis ir pan. Panašūs skiedikliai gali būti naudojami gaminant presuotas tabletes. Ir tabletės, ir kapsulės gali būti pagaminamos kaip prolonguoto veikimo produktai, suteikiantys galimybę išsiskirti veikliajai medžiagai valandų bėgyje. Presuotos tabletės gali būti padengiamos cukrumi arba plėvele, norint paslėpti nemalonų skoni ir apsaugoti tabletę nuo atmosferos poveikio, arba padengiamos enteriniu apvalkalu, norint gauti selektyvų suirimą virškinimo trakte. Peroralinio vartojimo skystose dozuotose formose, norint padidinti jų priimtinumą pacientui, gali būti spalvą ir skoni suteikiančių medžiagų.

Parenterinių tirpalų atveju tinkamais nešikliais paprastai yra vanduo, tinkamas aliejus, fiziologinis druskos tirpalas, vandeninė dekstrozė (gliukozė) ir giminingų cukrų tirpalai, bei glikoliai, kaip antai propileno glikolis arba polietilenglikoliai. Parenterinio vartojimo tirpaluose paprastai yra vandenyje tirpi veikliojo ingrediento druska, tinkami stabilizavimo agentai ir, jeigu reikia, buferio medžiagos. Tinkamais stabilizavimo agentais yra antioksidantai, kaip antai rūgštusis natrio sulfitas, natrio sulfitas arba askorbo rūgštis, vieni arba jų deriniai. Taip pat naudojama citrinos rūgštis ir jos druskos bei natrio EDTA. Be to, parenteriniuose tirpaluose gali būti apsaugos medžiagos, kaip antai benzalkonio chloridas, metil- arba propii-parabenas ir chlorbutanolis. Tinkami farmaciniai nešikliai yra aprašyti Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra, kuris yra standartinis šios srities literatūros šaltinis.

Toliau parodytos tinkamos vartoti šio išradimo junginių farmacinės dozuotos formos:

Kapsulės

Daug vienetinių kapsulių gali būti pagaminama užpildant standartines dvipuses kietos želatinos kapsules, j kievieną jų įpilant 100 mg veikliojo ingrediento miltelių, 150 mg laktozės, 50 mg celiuliozės ir 6 mg magnio stearato.

Minkštos želatinos kapsulės

Gali būti pagaminamas veikliojo ingrediento mišinys maistiniame aliejuje, kaip antai sojos pupelių aliejuje, medvilnės sėklų aliejuje arba alyvų aliejuje, ir suleidžiamas teigiamo postūmio siurbliu į želatiną, pagaminant minkštas želatinos kapsules, kuriose yra 100 mg veikliojo ingrediento. Po to tokios kapsulės turi būti plaunamos ir džiovinamos.

Tabletės

Daug tablečių gai būti pagaminama pagal įprastas metodikas taip, kad dozuotame vienete būtų 100 mg veikliojo ingrediento, 0,2 mg koloidinio silicio dioksido, 5 mg magnio stearato, 275 mg mikrokristalinės celiuliozės, 11 mg krakmolo ir 98,8 mg laktozės. Priimtinumo padidinimui arba norint suteikti uždelstą absorbciją tabletės gali būti atitinkamai padengiamos.

Suspensijos

Vandeninės peroralinio vartojimo suspensijos gali būti pagaminamos taip, kad jų 5 ml tūryje būtų 25 mg smulkiai susmulkinto veikliojo ingrediento, 200 mg natrio karbometilceliuliozės, 5 mg natrio benzoato, 1,0 g sorbitolio tirpalo (U.S.P) ir 0,025 g vanilino.

Tirpalas injekcijoms

Injekcijoms tinkama parenterinė kompozicija gali būti pagaminama maišant 1,5 masės % veikliojo ingrediento 10 tūrio % propileno glikolyje ir vandenyje. Šis tirpalas sterilizuojamas pagal įprastas metodikas.

(a) ir (b) KOMPONENTŲ DERINYS

Kiekvienas šio išradimo agentas nepriklausomai gali būti bet kokioje dozuotoje formoje, tokioje kaip aprašyta aukščiau, ir taip pat gali būti vartojamas įvairiais būdais kaip aprašyta aukščiau. Tolimesniame aprašyme laikoma, kad komponentas (b) atitinka vieną arba daugiau aukščiau aprašytų agentų. Taigi, jeigu komponentai (a) ir (b) turi būti traktuojami kaip tas pats komponentas arba nepriklausomai vienas nuo kito, kiekvienas (b) komponento agentas taip pat gali būti traktuojamas kaip tas pats arba nepriklausomai vienas nuo kito.

Šio išradimo (a) ir (b) komponentai gali būti sudedami kartu viename dozuotame vienete (t.y. sudėti' vienoje kapsulėje, tabletėje, miltelyje, skystyje ir 1.1.) kaip' produktas-derinys. Jeigu (a) ir (b) komponentai nėra sumaišyti kartu viename dozuotame vienete, (a) komponentas gali būti vartojamas tuo pačiu metu kaip ir (b) komponentas arba bet kokia tvarka: pavyzdžiui, šio išradimo (a) komponentas gali būti vartojamas pirmas, o po to vartojamas (b) komponentas, arba jie gali būti vartojami atvirkščia tvarka. Jeigu (b) komponente yra daugiau nei vienas agentas, pvz. vienas AT inhibitorius ir vienas proteazės inhibitorius, šie agentai gali būti vartojami kartu arba bet kokia tvarka. Jeigu vartojama ne vienu metu, geriausia (a) ir (b) komponentus vartoti mažiau nei vienos valandos bėgyje vieną nuo kito. Tinkamiausias (a) ir (b) komponentų vartojimo būdas yra peroralinis. Čia naudojami terminai “peroralinis agentas, “peroralinis inhibitorius”, “peroralinis junginys arba pan. reiškia junginius, kurie gali būti vartojami peroraliniu būdu. Nors pageidautina, kad (a) ir (b) komponentai būtų vartojami tuo pačiu būdu (t.y., pavyzdžiui, abu peroraliniu būdu) arba dozuota forma, jeigu norima, jie gali būti vartojami skirtingais būdais (t.y. vienas produkto-derinio komponentas gaii būti vartojamas peroraliniu būdu, o antrasis komponentas gali būti vartojamas intraveniniu būdu) arba dozuotomis formomis.

Patyrusiam gydytojui-praktikui bus aišku, kad dozės tokioje šio išradimo kombinuotoje terapijoje gali kisti priklausomai nuo jvairių faktorių, tokių kaip konkretaus agento farmakodinaminės charakteristikos ir jo vartojimo būdas bei forma, recipiento amžius, sveikatos stovis ir svoris, simptomų prigimtis ir laipsnis, konkurentinio gydymo rūšis, gydymo dažnis ir norimas efektas, kaip aprašyta aukščiau.Tinkamas šio išradimo (a) ir (b) komponentų dozes nesunkiai nustatys patyręs gydytojas-praktikas remiantis šiuo aprašymu. Pagal bendrus nurodymus tipiška kiekvieno komponento dienos dozė gali būti maždaug 100 mg - 1,5 g. Jegu (b) komponentas yra daugiau nei vienas junginys, tada tipiška kiekvieno (b) komponento agento dienos dozė gali būti maždaug 100 mg - 1,5 g. Pagal bendrus nurodymus, jeigu (a) komponento ir (b) komponento junginiai yra vartojami derinyje, kiekvieno komponento dozės gali būti sumažintos maždaug 70-80 %, lyginant su įprasta komponento doze, kai jis vartojamas vienas kaip atskiras agentas ŽIV infekcijai gydyti.

Šio išradimo produktai-deriniai gali būti pagaminami taip, kad nors veiklieji ingredientai yra sukomponuoti viename dozuotame vienete, fizinis kontaktas tarp veikliųjų ingedientų yra minimizuotas. Norint minimizuoti kontaktą, pavyzdžiui, kai produktas yra vartojamas peroraliniu būdu, vienas veiklusis ingredientas gali būti padengiamas enteriniu apvalkalu. Padengus vieną iš veikliųjų ingredientų enteriniu apvalkalu, galima ne tik minimizuoti kontaktą tarp derinio veikliųjų ingredientų, bet taip pat ir kontroliuoti vieno iš šių komponentų išsiskyrimą virškinimo trakte taip, kad vienas iš šių komponentų neišsiskirs skrandyje, bet išsiskirs žarnyne.

Kitame šio išradimo įgyvendinimo variante, kuriame yra pageidautinas peroralinis vartojimas, pateikiamas produktas-derinys, kurio vienas veiklusis ingredientas yra padengtas prolonguotą išsiskyrimą suteikiančia medžiaga, užtikrinančia prolonguotą išsiskyrimą per visą virškinimo traktą, ir taip pat tarnaujančia fizinio kontakto tarp derinio veikliųjų ingredientų minimizavimui. Be to, prolonguoto išsiskyrimo komponentas gali būti padengtas dar ir enteriniu apvalkalu, kad šio komponento išsiskyrimas būtų tik žarnyne, Dar viena strategija galėtų apimti produkto-derinio vaistinę formą, kurioje vienas komponentas yra padengtas prolonguoto išsiskyrimo medžiaga ir/arba enterinio išsiskyrimo polimeru, o antrasis komponentas yra taip pat padengtas polimeru, tokiu kaip mažo klampumo hidroksipropilmetilceliulioze arba kita šioje srityje žinoma atitinkama medžiaga, norint dar geriau atskirti veikliuosius komponentus. Padengimas polimerais sukuria papildomą barjerą sąveikai su kitu komponentu. Kiekvienoje vaistinėje formoje, kurioje apsaugoma nuo kontakto tarp (a) ir (b) komponentų dėl padengimo arba dėl kokios nors kitos medžiagos, taip pat galima apsaugoti ir nuo (b) komponento atskirų agentų kontakto.

Šio išradimo produktų-derinių dozuotos formos, kuriose vienas veiklusis ingredientas yra padengtas enteriniu apvalkalu, gali būti tablečių formos, kuriose enteriniu apvalkalu padengtasis komponentas ir kitas veiklusis ingredientas yra sumaišyti ir po to supresuoti į tabletę, arba kuriose enteriniu apvalkalu padengtasis komponentas yra supresuotas viename tabletės sluoksnyje, o antrasis veiklusis ingredientas yra supresuotas kitame sluoksnyje. Esant reikalui, norint dar labiau atskirti šiuos abu sluoksnius, gali būti vienas arba daugiau placebo sluoksnių taip, kad tarp veikliųjų ingredientų sluoksnių yra placebo sluoksnis. Be to, šio išradimo dozuotos formos gali būti kapsulės, kuriose vienas veiklusis ingredientas yra supresuotas į tabletę arba daugelio mikrotablečių, dalelų, granulių arba apsaugotų dalelių formoje, kurios yra padengtos enteriniu apvalkalu. Tokios enteriniu apvalkalu padengtos mikrotabletės, dalelės, granulės arba apsaugotos dalelės yra sudedamos j kapsulę arba įpresuojamos į kapsulę granuliuojant antrąjį veiklųjį ingredientą,

Remiantis šiuo aprašymu šie ir kiti kontakto tarp produkto-derinio komponentų, kai vartojama atskiroje dozuotoje formoje arba vartojama atskirų formų pavidalu, bet tuo pačiu metu arba tuo pačiu būdu kartu, minimizavimo būdai yra nesunkiai suprantami šios srities specialistams.

Šis išradimas taip pat apima ŽIV infekcijai gydyti tinkančius farmacinius rinkinius, kuriuose yra farmacinės kompozicijos, turinčios (a) komponento junginio ir vieno arba daugiau (b) komponento junginių, terapiškai efektyvus kiekis vienoje arba keliose steriliose talpose. Šios talpos gali būti sterilizuojamos panaudojant įprastą, specialistams gerai žinomą sterilizavimo metodiką. Komponentas (a) ir komponentas (b) gali būti toje pačioje sterilioje talpoje arba atskirose steriliose talpose. Sterilios medžiagų talpos gali būti atskiros talpos arba, jeigu pageidaujama, viena arba daugiau talpų, susidedančių iš kelių skyrių. Komponentas (a) ir komponentas (b) gali būti atskiri arba fiziškai sujungti j vieną dozuotą formą arba vienetą, kaip aprašyta aukščiau. Į tokius rinkinius, jeigu pageidaujama, gali įeiti dar ir vienas arba daugiau įvairių įprastų farmacinių rinkinių komponentų, tokių kaip, pavyzdžiui, vienas arba daugiau farmaciškai tinkamų nešiklių, papildomų indų komponentams sumaišyti ir 1.1., kas yra nesunkiai suprantama šios srities specialistams. J rinkinį taip pat gali įeiti instrukcijos (arba kaip įdėtiniai lapeliai, arba kaip etiketės), nurodančios vartojamų komponentų kiekius, kaip vartoti vaistą ir/arba nurodymus kaip sumaišyti komponentus.

Savaime suprantama, kad aukščiau duotų patarimų pagrindu yra galimos įvairios šio išradimo modifikacijos. Todėl turi būti suprantama, kad toliau duodamos apibrėžties ribose šis išradimas gali būti įgyvendinamas ir kitaip nei čia konkrečiai aprašyta.

Claims (20)

1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

   1. Junginys, kurio formulė I arba II:

   jo farmaciškai tinkama druska arba jo provaisto forma.
2. 2. Junginys pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo kad jo formulė yra I.
3. 3. Junginys pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo formulė yra II.
4. 4. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad j ją Įeina farmaciškai tinkamas nešiklis ir junginio pagal 1 punktą arba jo farmaciškai tinkamos druskos, arba jo provaisto formos terapiškai efektyvus kiekis.
5. 5. Kompozicija pagal 4 punktą, besiskirianti tuo, kad joje yra I formulės junginys.
6. 6. Kompozicija pagal 4 punktą, besiskirianti tuo, kad joje yra II formulės junginys.
7. 7. Junginys, kurio formulė I arba II:

   arba jo farmaciškai tinkama druska, arba jo provaisto forma, skirta panaudoti ŽIV infekcijos gydymui.
8. 8. Junginys pagal 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad junginio formulė yra I.
9. 9. Junginys pagal 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad junginio formulė yra II.
10. 10. Derinys iš junginio, kurio formulė I arba II:

    arba jo farmaciškai tinkamos druskos, arba jo provaisto formos ir bent vieno junginio, pasirinkto iš grupės, susidedančios iš ŽIV atvirkštinės transkriptazės inhibitoriaus ir ŽIV proteazės inhibitoriaus, skirtas panaudoti ŽIV infekcijos gydymui.
11. 11. Derinys pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad junginio formulė yra I.
12. 12. Derinys pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad junginio formulė yra II.
13. 13. Derinys pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad atvirkštinės transkriptazės inhibitorius yra nukleozidinis atvirkštinės transkriptazės inhibitorius.
14. 14. Derinys pagal 13 punktą, besiskiriantis tuo, kad nukleozidini atvirkštinės transkriptazės inhibitorių pasirenka iš AZT, 3TC, ddl, ddC ir d4T, o proteazės inhibitorių pasirenka iš sakvinaviro, ritonaviro, indinaviro, VX-478, nelfinaviro, KNI-272, CGF-61755 ir U-103017.
15. 15. Derinys pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad nukleozidinj atvirkštinės transkriptazės inhibitorių pasirenka iš AZT ir 3TC, o proteazės inhibitorių pasirenka iš sakvinaviro, ritonaviro ir indinaviro.
16. 16. Derinys pagal 15 punktą, besiskiriantis tuo, kad nukleozidinis atvirkštinės transkriptazės inhibitorius yra AZT.
17. 17. Derinys pagal 15 punktą, besiskiriantis tuo, kad proteazės inhibitorius yra indinaviras.
18. 18. Farmacinis rinkinys, tinkantis ŽIV infekcijai gydyti, besiski - r i a n t i s tuo, kad jis susideda iš terapiškai efektyvaus kiekio:

    (a) junginio pagal 1 punktą ir (b) bent vieno junginio, pasirinkto iš grupės, susidedančios iš ŽIV atvirkštinės transkriptazės inhibitoriaus ir ŽIV proteazės inhibitoriaus, esančių vienoje arba daugiau sterilių talpų.
19. 19. Rinkinys pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad (a) komponentas yra I formulės junginys.
20. 20. Rinkinys pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad (a) komponentas yra II formulės junginys.