KR970007080B1

KR970007080B1 - 자체-완비된 다중-면역분석 진단시스템

Info

Publication number: KR970007080B1
Application number: KR1019890700596A
Authority: KR
Inventors: 비. 우르노비쯔 호워드
Original assignee: 칼립트 인크; 호워드, 비. 우루노비쯔
Priority date: 1987-08-05
Filing date: 1988-08-05
Publication date: 1997-05-02
Anticipated expiration: 2008-08-05
Also published as: NZ225711A; DE3854603T2; IL87393A; AU2306788A; WO1989001158A1; KR890702034A; JP2549305B2; EP0333801A4; ATE129346T1; DE3854603D1; ZA885777B; JPH02500543A; DK161689D0; EP0333801B1; DK161689A; AU628293B2; CA1339006C; EP0333801A1

Abstract

내용없음

Description

[발명의 명칭]

자체-완비된 다중-면역분석 진단시스템

[발명의 자세한 설명]

본 원은 1987년 8월 5일 출원된 미합중국 특허출원 일련번호- 제081,874호의 CIP건으로서, 따라서 참고로 상기건의 내용도 본원내에서 인용하기로 한다.

[발명의 분야]

본 발명은 면역반응 진단학 분야에 관한 것으로서, 보다 상세히 설명하자면 본 발명은 수성액체, 특히 혈액, 뇨등과 같은 생물학적 시료중에 존재하는 검체(analytes)를 면역학적으로 검출하는데 이용하기 위한 스트립(strips), 뿐만 아니라 그를 함유하는 키트 및 이들 스트립을 사용하는 방법에 관한 것이다.

[발명의 배경]

최근 들어 면역시약을 사용하는 반응을 기초로 한 검체의 검출 또는 정량 측정, 또는 그들 모두가 특히 의약시험 분야에서 상당히 중요한 위치를 차지하게 되었다. 통상적으로, 이들 방법에서는 검체를 함유할 것으로 예상되는 시료를 검체와의 특이한 면역반응성을 나타내는 물질, 예들들면 검체상에 존재하는 에피토프(epitope)에 대한 항체와 접촉시킨다.

검체가 시료중에 존재할 경우, 검체는 항체와 특이하게 결합하여 복합체를 형성하게 된다. 광범위한 ''디벨로퍼(developer)" 또는 "리포터(reporter)" 메카니즘이 제안된 바 있으며, 결합반응이 일어났는지 여부를 알아 내는데 이용되고 있다(참고, 예를들면 1982년 12월 28일 노이만(Neumann) 등에게 허여된 미합중국 특허 제4,366,242호, 1981년 7월 14일 해리스(Harris) 등에게 허여된 미합중국 특허 제4,278,653호, 1980년 6월 17일 주크(Zuk) 등에게 허여된 미합중국 특허 제4,208,479호).

상술한 방법들은 단일클로온 항체(MAbs)의 도입으로 인하여 보다 더 널리 이용되게 되었으며, 상기 단일클로온 항체는 코올러와 밀스타인이 개발한 기술(kohler & Milstein, "바람직한 특이성을 갖는 항체를 분비하는 융합 세포의 연속배양(Continuous Cultures of fused Cells Secreting Antibody of Preferred Specificity)", 네이취(Nature), (1975년), 256권, 495-7페이지)을 이용하여 수득할 수 있고, 이들은 그들이 결합하는 검체에 대하여 단일 특이성을 갖는다(예를 들면 1983년 3월 8일 데이비드(David) 등에게 허여된 미합중국 특허 제4,376,110호 참고하기 바람).

이들 방법이 창안됨에 따라 나날이 보다 더 나은 방법으로 그들을 응용하기 위한 조사가 병행되었으며, 그 결과 시험장치, 시험키트 등의 범위로까시 진전되었다(참고, 예를들면 1986년 11월 18일 호섬(Hossam) 등에게 허여된 미합중국 특허 제4,623,461호, 1975년 6월 10일 바그샤베(Bagshawe)에게 허여된 제3,888,629호, 1984년 7월 3일 본(Bohn) 등에게 허여된 제4,458,020호, 1985년 1월 29일 카츠(Katz) 등에게 허여된 제4,496,654호 및 1981년 12월 15일 피아직(Piasik) 등에게 허여된 제4,305,924호).

시험키트 또는 장치의 바람직한 특성들로서는 다음과 같은 것들을 들 수 있다.

1. 시험장치 또는 키트는 보관 및 사용이 용이하여야 한다.

2. 그릇된 양성 또는 그릇된 음성을 나타냄이 없이 명확한 결과를 제공하여야 한다.

3. 단시간내에 다수개의 시료들을 중복하여 선별할 수 있어야 한다.

4. 이상적으로는 사용자에게 그롯된 해독결과가 수득되지 않았다는 것을 확인시키는데 적절하게 이용되는 양성지표를 제공하여야 한다.

5. 복수개의 시험들을 동시에 실시할 수 있도록 하는 것이 바람직하다.

6. 바람직하기로는, 전체 혈액 또는 그의 분획 성분을 사용하도록 시험을 계획한다.

본 발명의 기본목적은 상술한 바람직한 특성들을 제공하는 시험스트립 및 시험키트를 제공하는 것이다.

[발명의 요약]

본 발명은 고체지지체, 고체지지체상의 첫번째 불연속 면에 결합되어 있는 항원성 물질, 양성 대조물로서의 고체 지지체상의 두번째 불연속면에 결합되어 있는 항-인체 항체, 및 음성 대조물로서의 고체 지지체상의 세번째 불연속 면에 결합되어 있는 인체내에서 자연적으로 생성되지 않는 항원에 대한 항체로 구성된, 인체로 부터 취한 시료내에서 항원성 물질의 존재를 검출하기 위한 시범 스트립을 제공한다.

본 발명은 부가적으로 고체지지체, 고체 지지체상의 첫번째 불연속 면에 결합되어 있는 천연(native) 인체항체의 면역 복합체 상태로 존재하는 항원물질에 대한 항체를 기제로 하는 시약(antibody-basedreagent), 양성 대조물로서의 고체 지지체상의 두번째 불연속면에 결합되어 있는 항-인체, 및 음성 대조물로서의 고체 지지체상의 세번째 불연속면에 결합되어 있는 인체내에서 자연적으로(naturally) 생성되지 않는 항원에 대한 항체로 구성된, 인체로 부터 취한 시료내에서 항원성 물질의 존재를 검출하

본 발명은 또한 상술한 시험스트립을 사용하여 인체로부터 취한 시료내에서 항원성 물질의 존재를 검출하는 방법도 제공한다.

따라서 본 발명은 수성 표본내에서 1종 이상의 검체의 전재를 면역학적으로 검출하기 위한 시험 스트립을 제공한다. 스트립장치는 자체의 표면상에 다수개의 불연속 면들을 갖는 고체지지체로 이루어져 있다. 상기 불연속 면들중 적어도 한개면이 검출 또는 정량 측정하고자 하는 검체에 대한 단일클로온 항체(또는 폴리클로온 항체, 1가 또는 2가 항체 단편, 하이브리드항체, 이형 2기능을 갖는 항체 또는 유전학적으로 조작하거나 또는 클로닝된 항체로부터 선택된 조합물)을 운반하는 시험면이다. 이때,

바람직한 구체예에 따르면 상기 양성 대조물을 면역학적 대조물로서, 대조 반응은 표본내에 따르면 상기 양성 대조물 대역내에 고정된 면역학적으로 특이한 상기 중의 짝간의 면역반응을 포함한다.

다른 바람직한 구체예에서는 시험 스트립이 음성 대조물, 즉 정상적인 표본이 존재할 경우에는 검출 가능한 표식을 유발하지 않으나, 시료가 비정상적인 경우에는 검출 가능한 표식을 유발하는 대조물질을 가진 면을 적어도 하나 포함한다.

또 다른 구체예에서는 시험 스트립이 표본내에 존재하는 1종 이상의 검체를 검출할 수 있도록 각기 다른 항체들 또는 항체들의 조합물을 함유하는 다수개의 분리된 시험면들을 함유한다.

또 다른 구체예에서는 시험스트립이 항체 또는 다른 검체들을 검출할 수 있도록 각기 다른 검체 또는 조합물들을 함유하는 다수개의 분리된 시험면들을 함유한다. 또 다른 구체예에서는 시험스트립이 항체 또는 다른 검체들을 검출할 수 있도록 각기 다른 검체 또는 조합물들을 함유하는 다수개의 분리된 시험면들을 함유한다.

나아가, 또 다른 구체예에 따르면 본발명은 시험키트를 제공한다.

상기 시험키트는 전술한 시험스트립 및 다수개의 액체 홀더(holder)로 구성된 시험 플레이트로 구성되며, 각 홀더들은 시험 스트립을 수용할 수 있고 시험면들 및 양성 대조물 대역 및 음성 대조물 대역이 만약 있다면 홀더들내에 미리 넣어둔 일련의 액체를 각각과 동시에 접촉할 수 있는 형태 및 크기를 가진다.

현재 바람직한 상기 키트의 구체예에 따르면, 시험 플레이트는 다수 개의 시험 스트립을 이용하여 시험하고자 하는 다수개의 표본들을 동시에 시험할 수 있도록 다수개의 액체 홀더로 구성되어 있다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 주체. 특히 인체로부터 취한 시료내에서 항원성 물질의 존재를 검출하기 위한 시험 스트립을 제공한다. 상기 시험 스트립은 고체지지체, 고체 지지체상의 첫번째 불연속 면에 결합되어 있는 항원성 물질, 양성조절자로서 고체지지체상의 두번째 불연속 면에 결합되어 있는 항-인체 항체, 및 음성조절자로서의 고체지지체상의 세번째 불연속면에 결합되어 있는 인체내에서 자연적으로 생성되지 않는 항원에 대한 항체로 구성된다. 이와같은 시험 스트립을 이용하여 시료내에 존재하는 항원성 물질의 양 또는 농도를 용이하게 정량적으로 측정할 수 있다.

본 발명은 또한 상술한 시험 스트립의 모든 구성성분들, 아울러 부가적으로 고체 지지체상의 네번째 불연속면에 결합되어 있는 천연인체 항체와의 면역 복합체 상태로 존재하는 항원성 물질에 대한 항체를 기제로 하는 시약을 함유하는 시험 스트립도 제공한다.

본 발명에 따른 한가지 구체에에 따르면, 항원성 물질은 비루스 또는 비루스 단백질로서, 그의 예로서는 HIV-1, HIV-l GAG 단백질, HIV-l ENV 당단백질, HIV-1 POL 단백질, HTLV-l GAG 단백질, HTLV-1 ENV 당단백질, HTLV-1 POL 단백질 또는 이들의 에피토프를 들 수 있다.

본 발명에 다른 시험 스트립내에 고체지지체 는 유리섬유 여과지, 니트로셀룰로오즈, 신터드 유리, 플라스틱, 합성중합체, 셀룰로오즈, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리테트라플루오로 에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 폴리비닐리딘 플루오라이드로 이루어진다.

본 발명의 특정한 구체예에서는 항체를 가제로 하는 시약을 포함하여, 이와 같은 시약은 단일클로온 항체, 폴리클로온 항체, 1가 또는 2가 항체 단편, 하이브리드 항체, 이형기능을 갖는 항체, 또는 유전학적으로 조작된 또는 클로닝된 항체를 함유한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서 시험스트립상의 항-인체 항체는 단일 클로온 항체이다.

본 발명의 바람직한 구체예약 마찬가지로, 시험 스트립상에 존재하는 인체내에서 자연적으로 생성되지 않는 항원은 합성 유기분자, 예를들면 디느트로페놀이다.

본 발명의 구체예에서는 1종 이상의 항-인체 항체, 자연적으로 생성되지 않는 항원에 대한 항체, 또는 항체를 기제로 하는 시약을 표지(label) 예를들면 방사성 아이소토프, 형광단, 발색단, 또는 검출 가능한 생성물을 생성하는 화학반응에 관여하는 효소를 사용하여 표지시킨다.

본 발명은 또한 그 고체지지체, 고체지지체상의 첫번째 불연속면에 결합되어 있는, 천연인체 항체와의 면역 복합체 상태로 존재하는 항원성 물질에 대한 항체를 기제로 하는 시약, 양성 대조물로서의 고체 지지체상의 두번째 불연속 면에 결합되어 있는 항-인체 항체 또는 기타 다른 적합한 항세포 구조물, 및 음성 대조물로서의 고체지지체상의 세번째 불연속면에 결합되어 있는 인체내에서 자연적으로 생성되지 않는 항원에 대한 항체로 구성된 인체로부터 취한 시료내에서 항원성 물질의 존재를 검출하기 위한 시험 스트립도 제공한다. 본 발명이 속하는 당해 기술분야에 숙련된 이들이라면 이와같은 시험 스트립을 사용하여 시료내에 존재하는 항원성 물질의 양 또는 농도를 용이하게 정량적으로 측정할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다.

나아가 본 발명은 시료 내에 존재하는 물질과 시험 스트립상에 존재하는 항체 및 재조합 항원을 비롯한 단백질과의 비-특이적인 및 특이적인 결합을 방지하여 그로부터 그릇된 결과가 초래되는 것을 예방하기 위한 목적으로 시험하고자 하는 시료를 예비처리하고, 생성된 예비처리만 시험하고자 하는 시료를 상술한 시험 스트립과 시험 스트립에 결합되어 있는 항원성 물질이 시료내에 존재하는 상기 항원에 대한 임의의 항체와 복합체를 형성하고, 아울러 항원성 물질 및 항체를 가제로 하는 시약 둘다가 결합되어 있는 시험 스트립인 경우에 있어서는 시료내에 존재하는 항원성 물질이 시험 스트립상에 존재하는 그에 대한 항체와 결합하도록 하는 조건들하에서 접촉시킨 후, 이어서 시험 스트립을 처리하여 항원성 물질에 대한 항체들 중 복합제를 형성하지 않은 항체를 제거하고, 생성된 처리한 시험 스트립을 항인체 항체가 시험 스트립에 결합되어 있는 임의의 인체 항체와 복합체를 형성할 수 있도록 하는 조건들하에서 표지된 항인체 항체와 접촉시킨 다음, 시험 스트립에 결합되어 있는 표지된 항인체 항체의 존재, 그로부터 항원성 물질의 존재 또는 그에대한 항체를 검출함으로써 시료 내의 항원성 물질의 존재를 검출하고, 이어서 시험 스트립상의 양성 및 음성 대조물에 의해 나타난 검출의 정확성을 증명하는 것을 특징으로 하는 인체로부터 얻은 시료 내에서 항원성 물질의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 부가적으로 시료내에 존재하는 물질과 시험 스트립상에 존재하는 항체를 비롯한 단백질각의 비-특이적인 결합 및 인체 항체와 항원성 물질간의 특이적인 결합을 방지하므로써 그릇된 결과가 초래되는 것을 예방하기 위하여 시험하고자 하는 시료를 예비 처리하고, 생성된 예비처리한 시료를 상술한 시험 스트립과, 시험 스트립에 결합되어 있는 항체를 가제로 하는 시약과 시료내에 존재하는 임의의 항원성 물질과 복합체를 형성하도록 하는 조건들하에 접촉시킨 후, 생성된 처리안 시험 스트립을 항원성 물질에 대한 표시된 항체와, 표시된 항체가 시험 스트립에 결합되어 있는 임의의 항원성 물질과 복합체를 형성하도록 하는 조건들하에서 접촉시키고, 시험 스트립에 결합되어 있는 항원성 물질의 존재, 그로부터 시료내에서의 항원성 물질의 존재를 검출한 다음, 이어서 시험 스트립상의 양성 및 음성대조물에 의해 나타난 검출의 정확성을 증명하는 것을 특정으로 하는 인체로부터 얻은 시료내에서 항원성 물질의 존재를 검출하는 방법도 제공한다.

본 발명의 바람직한 구체예로서의 상술한 방법에서 항원성 물질로서의 비루스 또는 비루스 단백질이 또한 시료로서는 혈액, 혈청, 뇨등을 들 수 있다.

본 발명은 또한 상술한 방법에서 시험 스트립을 표지된 항인체 항체와 표지된 항인체 항체가 시험 스트립에 결합되어 있는 인체항체와 결합하도록 하는 조건들하에서 접촉시켜 확인단계를 실시하는 방법도 제공한다.

따라서, 본 발명은 개량된 시험 스트립 장치를 제공한다.

이와 같은 장치의 한가지 구체예가 첨부하는 도면 제1도에 (10)으로 나타내어져 있다. 상기 장치는 다수개의 해독 가능한 면들(12)(14) 및 (15)을 갖는 고체지지체(11)를 포함한다. 해독 가능한 지지체(11)은 고체 "침지막대"로 나타내어져 있으나, 실제로는 입방체, 벽돌형, 막대, 실린더, 프리즘, 다각형, 나선형, 구형 또는 이들이 부분적으로 조합된 형태를 비롯한 여하한 기하학적 형태를 취하여도 무방하다. 또한, 플라스틱, 금속, 종이 등과 같은 담체 장치 지지물질일수도 있으며, 폴리스

본 해독 가능하 면들(12)(14) 및 (15)는 분석방법으로 스트립을 분류조사하는 때에 복수개의 가능한 신호를 나타내도록 지지체(11)상에 분리도어 배열되어 있다. 해독 가능한 면들 중 적어도 한면이 시험 표본 내의 시험 검체와 면역반응을 일으키는 항체를 포함한다.

해독가능한 면들은 또한 시험항체 또는 시험검체와 반응하는 검체를 포함할 수도 있다. 아울러, 해독가능한 면들 중 적어도 한면은 시험 스트립이 시험 표본과 알맞게 접촉된 경우 검출 가능한 신호를 통해 그를 증명할 수 있도록 시험 표본과 반응하는 양성 대조물을 포함한다. 이때, 상기 양성 대조물은 표본내의 비검체 종들과 면역반응을 일으키는 면역학적 양성 대조물인 것이 바람직하다.

해독가능한 면들은 또한 음성 대조물, 즉 표본이 알맞게 취급되는 경우에는 표본각의 표식을 나타내지 않으나, 표본에 결함이 있거나 또는 잘못 취급된 경우에는 반응을 일으켜 신호를 나타내는 1종 이상의 시약들을 함유하는 불연속면을 포함할 수 있다.

양성 대조물면과 항체-함유면의 상대위치는 중요하다 할 수 있다. 시험 스트립(10)은 "침지막대''로서 사용된다. 사용시에는 기술자 또는 자동시험장치가 상부말단(16)으로 스트립을 붙들거나 ''들어서'' 액체표본 및 다른 시약내에 하부말단(17)을 먼저 침지시킨다. 이는 즉, 면(15) 보다도 면(12)가 상기 액체와 먼저 접촉하게 된다는 것을 의미한다.

따라서 표본과 시약이 정당하게 접촉되는 경우에만 양성 표식을 나타내는 양성 대조물을 가장 마지막에 접촉되도록 또는 최상부면, 예를 들면 제1도의 (15)에 위치시키는 것이 적당하다. 역으로 음성대조물이 존재하는 경우에는 그를 가장 먼저 접촉되도록 또는 최저부면, 예를 들면 제1도의 (12)에 위치시켜야 한다.

상기 양성 대조물 및 음성 대조물은 면역학적 특성을 지니는 것이 바람직하다. 즉, 면역학적 반응을 일으키는 기능을 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 예컨대 시형표본인 인체 혈청인 경우, 전형적인 양성대조물은 혈액 또는 그이 분획 성분들내에 항상 존재하는 통상적인 면역글로불린으로 처리할 수 있도록 고안된 부분일 수 있다.

시험시약부분(제1도의 (14))은 시험하고자 하는 검체에 대하여 특이한 적어도 1종의 항체를 가제로하여, 아울러 그를 함유한다. 매우 중요한 광범위한 검체에 대한 광범위한 항체들의 문헌에 발표되어 있으며 그들을 이용할 수 있다.

제2도에 대하여 설명하면, 제l도에 나타낸 시험 스트립이 변형되어 (21)로서 되시되어 있다. 스트립(21)온 또한 시험 플레이트(22)를 또한 포함하는 전체 분석키트(20)의 일부로서 나타내어져 있다.

스트립(21)은 지지체(11) 및 전술한 바 있는 해독 가능한 면들(12)(14) 및 (15) 및 또 다른 부가의 해독 가능한 면(24)를 포함한다. 상기 면(24)는 부가적인 대조물, 검체, 또는 부가적인 항체-함유 시험부분일 수 있으며, 아울러 시험결과를 부가적으로 확인 또는 검증할 수 있도록 면(14)의 동일한 항원에 대한 두번째 항체를 함유하거나 또는 두번째 항원-검체에 대한 항체를 함유할 수 있다. 이들 각종 시약들은 확실치 않은 결과를 줄 수 있는 중복-오염 등을 방지하도록 일반적으로 각종 영역들에 고정된다. 항체 또는 대부분의 검체들은 직접적인 흡착방법(제한된 시간동안 또는 시약 용액이 완전히 건조될 때까지 배양함) 또는 고상위의 반응성 기들과 화학적으로 커플링시켜 통상적으로 플라스틱, 탄수화물 중합체, 흡착섬유, 중합체-피복 금속구슬, 실라케켈, 종이, 유리필터 등에 고정시킨다. 최적 조건은 각각의 시약의 따라 고유하게 다르다.

통상적인 사용에 있어서, 시험스트립(21)은 (22)와 같은 시험 플레이트와 함께 동시에 사용된다. 시험 플레이트(22)는 여러가지 특성들을 갖는다. 그중 한가지로서, 시험 플레이트(22)는 (25)(26)(27)(28) 및 (29)와 같은 다수개의 액체 저장 웰을 함유한다. 정확한 숫자는 목적하는 분석 순석에 따라 수행하는데 필요한 각종 단계들에 적합하도록 선택된다.

다른 특성으로서, 스트립이 삽입될 수 있도록 각각의 웰의 크기가 고정되어 있다. 또 다른 특성으로서는 시험 스트립상에 존재하는 모든 해독 가능한 면들(12)(14) 및 (15), 또는 (12)(14)(24) 및 (15)를 완전히 감싸는데 적당한 깊이인 액체의 깊이(d)에 충분히 알맞도록 웰이 깊은 깊이를 갖는다. 사용시에는 시험 플레이트(22)의 웰들 중 1곳 이상에 내정된 프로토콜에 따라 내정된 양의 시약 및 시료들을 넣고, 이어서 다시 내정된 프로토콜에 따라 웰내에 시험 스트립을 삽입한다.

그 결과, 양성 및 음성 대조물들에 의한 결과들과 함께 해독 가능한 검출 표식이 생성된다. 상기 표식을 기초로 하여 검체가 시료내에 존재하는지의 여부 및 정확한 시험이 수행되었는지의 여부를 결정할 수 있다.

예를들면, 전형적인 프로토콜에서는 인체 혈액중에 존재할 것으로 예상되는 병원체에 대한 항체를 가진 시험 스트립이 제작되기도 한다. 양성 대조물(15)은 통상적인 혈액 구성분에 대한 항체를 가지고, 음성 대조물(12)은 혈액중에서 통상적으로 발견되지는 않으나 오염체 등으로서 간주되는 물질에 대한 항체를 갖는다.

웰(25)에 미리 측정한 양의 희석제, 완충액, 또는 다른 유사한 수성 매질을 충전한다. 주어진 양의 환자혈액 또는 다른 체액을 웰(25)의 액체에 가하고 혼합한다. 이어서, 스트립을 웰(25)내의 액체중에 내장된 간격으로 삽입한다. 그 결과, 스트립(21)상의 시형 및 대조물면들이 액체 및 희석된 혈액 성분들과 접촉하게 된다. 그로부터 상술한 면들에서 항체와 혈액중의 임의의 적합한 종들간의 면역반응이 일어나게 된다.

시료웰(25) 및 기타 다른 웰들이 목적하지 않는 반응 등을 방지하도록 각종 시약들을 함유하여도 무방하다. 그와같은 시약들로서는 시료의 특성을 변화시킬 수 있는 물질, 또는 시료중의 바람직하지 못한 중복-반응 물질을 제거하거나 또는 그와 반응할 수 있는 물질들을 들 수 있다.

대부분의 면역진단 분석과 관련된 현행 문제점은 시료의 구성성분들과 피복된 그 체상(즉, 바탕)과의 바람직하지 못한 상호작용이다. 이러한 유형의 상호작용은 자주 음성시료가 그릇된 양성으로 해석되고 하는 결과를 초래한다. 두번째 고체상에서(특이적인 및 비특이적인) 바람직하지 못한 반응물들을 분별하여(통상적으로 시험 고상에 노출시키기 전에 시료를 예비배양함) 바탕을 최소화시킬 수도 있다. 항체공격 분석법인 경우에는 두번째 고상에 시료 또는 시험에서 반결되지 않는(즉, 무관한 특이성을 갖는) 검체에 대하여 특이적인 항체를 결합시킨다. 이와같은 유형의 두번째 고상은 항체, 고상, 차단시약 또는 3가지 중 임의의 것들의 조합물에 대하여 특이적인 및 비특이적인 바탕 성분들 둘다를 제거한다. 상기 두번째 고상은 분석시 임의의 단계 또는 모든 단계들에서 사용될 수 있으나, "디벨로퍼" 단계에서는 제외시키는 것이 바람직하다.

검체가 인체로부터 유래된 비루스 성분인 경우에는 두번째 고상 분배용 흡착 시약으로서 미리 감염시킨 인체 성분들을 사용할 수도 있다.

두번째 상의 외형은 반응의 역학에 따라 설계되어져야 한다. 흡착시약은 시료접시의 움푹 들어간 부분의 벽을 일부 용액들로 피복한다. 신속한 면역분석을 수행하기 위하여 바탕을 조절하는 중요한 단계는 초기의 고상과 시료의 혼합단계이다. 두번째 고상을 유리시켜 혼합용액내로 옮겨야 한다(임의의 기하학적 형태 또는 입자들을 갖는 두번째 스트립).

바람직한 방법은 시험 스트립을 침지하는 임의의 또는 모든 실(chamber) 또는 입자비이드(약 1-10마이크로미터 직경)의 현탁액으로 구성된 흡착 장치를 사용하는 것으로서, 그이 이점은 신속한 반응운동 및 반응물들의 최대확산을 가능케하도록 총표면적이 크다는 것이다. 시료를 흡착제가 피복된 입자들과 예비배양하여 시험 스트립에 노출시키기에 앞서 바탕 성분들을 재빨리 제거한다. 상술한 유형의 입자들을 제조하는 방법은 이하의 실시예에서 기술하기로 한다.

이어서, 시험 스트립을 웰(25)로부터 꺼내어 웰(26)내에 삽입한다. 웰(26)은 예컨대 방해물질등을 제거하기 위한 내정된 양의 세정용액을 함유할 수도 있다. 이어서, 시험 스트립을 검출계, 예를들면 표지된 항원 또는 항원등과 결합하고 있는 표지된 항체를 함유하는 웰(27)에 통과시킨다. 이어서, 스트립을 웰(29)로 옮겨 세정하고, 최종적으로 기질(예, 발색 시약)을 첨가하거나 또는 기질이 이미 존재하는 웰(30)으로 옮긴다. 일부 경우에 따라서는 스트립상의 과량의 액체를 제거하고, 기질을 곧바로 스트립에 참가할 수도 있다. 요구되는 또는 목적하는 다른 시약들을 함유하는 기타 다른 웰들이 존재할 수도 있다.

제3도는 시험블록(22)가 다수개의 웰세트(즉, 4세트)를 포함하여 4개의 시료웰(25), 4개의 세정웰(26) 등이 존재하도록 본 발명을 확충 변형시켜 예시하는 것으로서, 다수개의 시험 스트립을 사용하여 다수의 시료들을 동시에 시험할 수 있도록 한다.

제4도는 단지 시험방법의 순차적인 과정들을 나열 및 지적하는 전형적인 시험 프로토콜의 블록선도이다. 본 발명이 속하는 기술분야에 숙련된 이들이라면 본 발명이 특정한 항체, 시약, 특정한 시료 또는 특정한 이용화학으로만 제한되지 아니하며, 본 명세서내에 교수한 바로부터 벗어나지 않는 범위내에서 적합한 또 다른 수단을 이용할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다.

시험시약 부분(들)에서 사용하기에 적합한 항체는 단일클로온 항체, 다중 클로온 항체, 1가 또는 2가 항체 항체단편, 하이브리드 항체, 이형 2기능을 갖는 항체 또는 유전학적으로 조작되거나 또는 클로닝된 항체라는 것을 밝혀두는 바이다.

시험자체는 상술한 바와같이 표본중에 존재하는 1종 이상의 검체의 존재를 면역학적으로 검출하는 방법이다. 통상적으로 시험은 결합된 또는 결합되지 않은 표지물(label)을 검출 또는 정량측정하는데 이용되며, 검출된 표지물의 양은 표본중에 존재하는 검체의 양에 해당된다. 본 명세서내에서 기술하는 본 발명의 "면역분석 방법"은 특성에 따라 형광 편광을 면역-전자 현미경으로 조사하는 방법, 면역-형광 또는 형광을 이용한 면역분석법, 열복사 분석방법, 효소-결합 면역분석 또는 광자-계수 생체발광 또는 화학발광 분석법으로 실시할 수 있다. 효소-결합 면역분석법을 실시하는 경우, 효소는 통상적으로 알칼리성 포스파타제, 글루코오스 옥시다제, 호올스래디쉬 퍼옥시다제, 우레아제, 루시퍼라제, 및 갈락토시다제로 구성된 군으로 부터 선택된 것이 사용된다.

표지물 자체는 실질적으로 여하한 검출 가능한 종들일 수 있으며, 그의 예로서는 발색 화합물, 방사성 아소토프, 효소 또는 형광, 발광, 생체발광, 화학발광, 인광 또는 강자성 물질을 들 수 있다. 검체는 실질적으로 상술한 방법을 이용하여 검출할 수 있는 임의의 화합물 또는 생물체, 즉 약제, 호르몬, 비타민, 효소, 리간드, 당단백질 및 지방 단백질을 포함한 단백질, 항체, 폴리사카라이드, 세포 또는 조직항원, 또는 박테리아, 원충류, 기생충, 진균류, 비루스, 혈액 세포성분, 혈액 액체성분 또는 상술한 것들중 임의의 것의 성분일 수 있다. 다수개의 검체를 검출하는 바람직한 구체예에 있어서, 특히 바람직한 것으로서는 천연 분리물, 유전학적으로. 조작한 재조합체 또는 화합합성하여 정제한 HIV-l GAG 단백질, HIV-l ENN 당단백질, HIV-1 POL 단백질, HTLV-1 GAG 단백질, HIV-l ENN 당단백질, 및 HTLV-l POL 단백질을 들 수 있다. 상술한 검체들은 또한 또다른 분석방법에 있어서는 실제 검출 시약으로서 시험 스트립에 결합될 수도 있다.

표본은 혈액 또는 그의 분획성분, 뇨, 타액, 질분비물, 정액, 점막, 양수, 눈물, 위장액 및 배설물, 그름, 흉막 삼출액, 폐동맥맥, 조직추출물등과 같은 포유류, 조류, 뱀류, 수륙양서동물, 절기동물로 부터 취한 것일 수 있다.

또다른 구체예에 있어서, 시험하고자 하는 표본 또는 시료가 공업용 시료, 예를 들면 공업용 폐기 화합물 또는 물일 수도 있고, 아울러 검체는 상기 표본 또는 시료내에 존재하는 산업공해 또는 독성 화합물일 수 있다.

이하에는 실시예들을 기술하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하며, 단 이들 실시예가 뒤이어 기술하여 특허청구의 범위에서 정의하는 본발명의 범위를 어느 면으로든지 제한하는 것으로 해석되어서는 아니되며, 그를 의도하는 것도 아님을 밝혀두는 바이다.

[도면에 간단한 설명]

제1도는 각종 대역들 및 면들을 반모형적으로 나타내는 본 발명에 따른 시험 스트립의 투시도이다.

제2도는 시료 시험 플레이트와 함께 본발명에 따른 시험 스트립의 또다른 구체예의 투시 및 반모형도이다.

제3도는 다수개의 표본들을 동시에 시험할 수 있도록 변형시킨 시험 플레이트의 투시 도이다.

제4도는 본 발명에 따라 이용 가능한 전형적인 시험 프로토콜(protocaol)의 블록선도이다.

[실시예 1]

그릇된 양성을 최소화시키는 한가시 분석법에서의 인체 항-HIV-1 항체의 검출

(I. 시험막대의 제조)

96-웰 조직 배양 프렐이트(코스타)(Costar), 카탈로그 #3096)의 뚜껑으로 부터 시험 스트립 원형을 제작한다. 납땜 인두상에 부착된 날카로운 칼을 이용하여 뚜껑으로 부터 스트립등를 절달하여 스트립이 각각 한층 높은 주변 그리고 둘러싸인 8개의 인접한 원들을 함유하도록 한다. 스트립이 또한 고도의 흡착성을 지닌 고체상(예, 나일론 멤브레인 또는 니트로셀룰로오스 종이)을 함유하도록 지지체 단편으로 사용할 수도 있다. 상기 스트립을 완충액중에서 세정하고, 공기건조시킨다. DNP 1(CB 6 생쥐 1gG l, 디니트로페놀에 대한 특이성을 지님) 및 항-HigG(CB 6 생쥐 1gG 1, 인체 면역글로불린 G에 대한 특이성을 지님)로 지정한 단일클로온 항체를 닥터 파오-민-로(Dr. Pao-Min Loh)의 실험실(아이오아 대학)로 부터 입수하고, 항-HIV GAG(생쥐 IgG l, 인체 면역결핍증 비루스-1에 대한 특이성을 지님)는 에피로프 인코오포레이티드(Epjitope, Inc)(카달로그 $5001)로부터 구입하였다. 각각의 검체에 대한 특이성을 갖는 MAba의 칵테일을 이용할 수도 있다. 이때, MAbs는 트리스 완충 식염수(TBS, 0.15M NaCl, 0.05M 트리스, pH 7.2) 중에 100 마이크

HIV-1(리톤 바이오네틱스(Litton Bionetics), HTIV-3, 카탈로그 $ 37225, 1 밀리그램/ml, NP40 불활성화시킨 것)은 TBS 중에 2 마이크르그램/ml 농도로 만든다. 그중 10마이크로리터를 직접 지정된 원형 단편에 도포한다.

시약들의 순서는 다음과 같다;

항-인체 IgG(양성 대조물)(상부)

항-HIV GAG(비루스 항체 복합체 검출)

HIV-1(항체 검출)

항-DNP(음성 대조물)(저부)

막대를 45℃ 오븐내에 수평으로 위치시키고 용액이 도포되어 있는 면을 위로 하여 약 30분간 항체 및 항원을 건조시킨다. 이어서 막대를 15분간 보호용액(0.3% 트윈, lmg/ml 소혈청 알부민, BSA 및 0.1% 소듬 아지드를 함유하는 TBS)중에 넣는다.

(Ⅱ. 흡착제 비이드의 제조)

고체 표면상의 변성된 단백질과(또는 고체표면과 직접) 결합하는 특정한 시료의 친화도 특성을 최소화시키기 위한 목적으로, 라텍스 폴리스티렌 입자들을 단일클로온 항-DNP항체와 공유 결합시켰다(비루스 검체가 직접 흡착되거나 또는 화학적으로 커플링 된 경우에는 정제한 인체 T-세포 혈장 멤브레인도 또한 라텍스 입자들과 케플링시킬 수 있다).

또한 비특이적인 흡착제를 기타 다른 고상 또는 실(Chamber) 벽상에 직접 피복할 수도 있다.

항체는 PBS(0.1M 인산염-완충 식염수, pH 7.2, 판덱스 레보러 토리즈 퍼블리쉬드 리서어춰 리포트 4호(1984), "수용성 카르보디이미드 방법을 이용한 라텍스 입자들과 항원의 커플링'', 마카엘 이. 졸리, 피에이취. 디.) 중에 200마이크로그램/ml 농도로 만들었다. 항체용액을 가하여 세정하고, 라텍트 입자들(판텍스, 에피콘 카르복실-폴리스티렌 입자, 카탈로그 #31-010-1)을 침전시킨다. 상기 용액을 연화시킨 후 초음파 수욕중에 20초간 노출시킨다. 비이드의 최종농도는 0.5%이었다. 고체 카로보디이미드(시그마, 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필]-파르보디이미드, 카탈로그 #E-7750)를 가하여 최종 농도를 약 5밀리그램/ml로 만든다.·용액을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 회전시키고, 세정(PBS 사용)한 후, 3회 원심분리하여 펠릿(12,000×g, 3분간 실온)으로 만든다. 최종 비이드 용액은 보호완충액중에 0.01%-0.5%(w/v) 농도로 만든다.

(Ⅲ. 시료접시)

상표 시아노크릴레이트 접착제를 사용한 용매 용접 플라스틱 크뱃(엘카이 프로덕츠, 카탈로그 $127-1010-400)을 이용하여 시료 접시이 형태를 만든다. 상기 크뱃은 1cm×1cm×4.5cm 규격을 갖는다. 본 실시예에서, 접시는 7개의 크뱃(뚜껑과 더불어)을 함유한다. 분실시예에서 첫번째, 격실은 상술한 흡착제 비이드 약 0.1%를 함유하는 보호 완충액중에 용해시킨 약 1.0마이크로그램/ml의 불활성화시킨 HIV-1(리톤 바이오네틱스, HTLV-3, 카탈로그 $37225, 1 밀리그램/ml, NP 40 불할성화 시킨것) 2.5ml를 함유한다. 두번째 격실은 25ml의 세정용액(TBS/0.3%트윈)을 함유한다. 세번째 격실은 인체혈액표본을 희석시키기 위한 혼합용액(약 0.1% 흡착제 비이드를 함유하는 보호용액 2.5ml)을 함유한다. 네번째 격실은 2.5ml의 세정용액(TBS/0.3% 트윈)을 함유한다. 다섯번째 격실은 2.5ml의 전개 접합체 용액, 약 0.1%흡착제비이드를 함유하는 보호용액중에 1 : 500으로 희석한 알칼리성 포스파타제(잭슨 이뮤노리서어춰 랩스, 카탈로그 #109-5576)와 커플링시킨 폴리클로온 염소 항-인체 면역글로불린을 함유한다. 여섯번째 격실은 2.5ml의 세정용액(TBS/0.3% 트윈)을 함유한다. 일곱번째 격실은 2.5ml의 예비기질 세정용액(pH l0알칼리성 완충액)을 함유한다.

(Ⅳ. 분석)

격실(chamber) #3의 두껑을 제거한다. 1방울의 혈액(손가락을 란셋으로 찔러 수득하거나, 또는 1-50마이크로리터의 혈청을 사용할 수도 있다)을 세번째 크벳내에 떨군다. 각각의 격실을 각각의 자체 뚜껑으로 덮고, 접시 전체를 여러시간동안 부드럽게 진탕하여 혈액과 비이드 용액이 혼합되도록 한다. 접시를 그의 원래 정치위치로 되돌리고, 격실 #1의 뚜껑을 벗긴다, 혈액은 격실 #3에서 배양하고, 반면에, 시험 스트립은 격실 #1내에 침지시킨다. 시험 스트립과 함께 용액을 부드럽게 교반하고, 42℃에서 약 20분간 배양한다. 이때 해독가능한 부분이 용매상에 최대로 노출되도록 주의를 기울여야 한다. 스트립을 크벳 #2로 옮겨 약 10초간 세정한다. 스트립을 혈액 1흡착제 혼합물을 함유하는 크벳 #3으로 옮긴다. 상기 용액을 부드립게 혼합하고, 스트립을 42℃에서 약 30분간 배양한다.

스트립을 크뱃 #4로 옮기고, 약 10초간 세정한다. 스트립을 크벳 #5로 옮긴다. (매 1분 마다) 약 5초간 부드럽게 교반하면서 스트립을 배양한다. 총 약 10분간 배양한 후, 스트립을 크벳 #6으로 옮기고, 약 10초간 부드럽게 교반한다. 스트립을 크벳 #7로 옮기고, 약 10초간 세정한다. 스트립을 꺼내어, 가볍게 두드려서 각량의 액체를 제거한다. 1방울(약 50마이크로리터)의 기질(5-브로모-4-클로로-3-인 돌리 포스메이트, 시그마 카탈로그 #B-0766, 알칼리성 완충액중, pH 10)을 각각의 읽기 쉬운 면에 가한다. 약 10분 경과후 각각의 해독 가능한 면의 발색반응을 관찰하여 양성(청색) 또는 음성(색상이 나타나지 않음)으로 기록한다.

(V. 해석)

항-DNP MAb(음성 대조물)를 함유하는 단편이 무색으로 남아있는 경우에만 분석이 정확하다고 할 수 있다. 흡착제 비이드가 그릇된 양성반응을 유발하는 모든 물질들을 제거하여야 하며, 음성 대조물을 함유하는 해독가능한 면을 이용하여 그와 같은 기능을 확인한다.

항-HIg 단편은 혈액시료 중에 존재하는 인체 면역글로불린과 결합하여야 한다. 상기 반응은 양성임에 틀림없거나, 또는 시험시약이 제기능을 발휘하지 못한 무료의 그롯된 시험이다. HIV-1 단편내의 양성 청색은 혈액시료중에 존재하는 HIV-1에 대한 항체가 존재한다는 것을 나타낸다. 항-HIV 단편내의 양성반응은 비루스가 인체 항-HⅣ 항체악 복합체를 형성하여 존재한다는 것을 뒷받침한다.

[실시예 2]

인체 항-HⅣ-1 항체의 검출

그룻된 양성의 최소화

(I. 시험막대의 제조)

96-웰조직 배양 플레이트(코스타(Costar), 카탈로그 #3096)의 뚜껑으로 부터 시험스트립 원형을 구조한다.

납땜 인두상에 부착된 날카로운 칼을 이용하여 뚜껑으로 부터 스트립들을 절단하여 스트립이 각각 한층 높인 주변그리고 둘러싸인 8개의 인접한 원들을 함유하도록 한다. 스트립이 고도의 흡착성을 지닌 고체상(예, 나일론 멤브레인 또는 나트로셀룰로오스 종이)을 함유하도록 지지체 단편으로 사용할 수도 있었으며, 또한 우묵하게 들어간 반응면들을 갖도록 구조할 수도 있다. 상기 스트립을 완충액중에서 세정하고, 공기전조시 킨다.

DNP 1로 지정한 단일클로온 항체(CB6 생쥐 IgG 1, 디니크로페놀에 대한 특이성을 지님) 및 항-HlgG(CB 6 생쥐 lgG l, 인체 면역글로불린 G에 대한 특이성을 지님)를 사용하였다.

각각의 검체에 대한 특이성을 갖는 MAbs의 칵테일을 이용할 수도 있다. 이때, MAbs는 트리스완충식염수(TBS, 0.15MNaCl, 0.05M 트리스pH 7.2) 중에 100마이크로그램/ml의 농도로 만들고, 그 중 10마이크로리터를 직접 지정된 원형 단편들에 도포한다. HIV-1(리톤 바이오네틱스(Litton Bionetics)), HTLV-3, 카탈로그 #37225, 1 밀리그램/ml, NP40 불활성화시킨 것)은 TBS 중에 2 마이크로그램/ml 농도로 만든다. 그중 10마이크로리터를 직접 저장된 원형 단편에 도포한다.

시약들의 손서는 다음과 같다.

항-인체 IgG(양성 대조물)(상부)

HIV-1(항체 검출)(중간부분)

항-DNP(음성 대조물)(저부)

막대를 45℃오븐 내에 수평으로 위치시키고 용액이 도포되어 있는 면을 위로하여 약 30분간 항체를 건조시킨다. 이어서, 막대를 15분간 보호용액(0.3% 트윈, lmg/ml 소혈청 알부민, BSA 및 0.1% 소듬 아지드를 함유하는 TBS) 중에 넣는다

(Ⅱ. 흡착제 비이드의 제조)

고체 표면상의 변성된 단백질과(또는 고체표면과 직접) 결합하는 특정한 시료의 친화도 특성을 최소화시키기 위한 목적으로, 라텍스 폴리스티렌입자들을 단일클로온 항-DNP항체와 공유 결합시켰다.(비루스 검체가 직접 흡착되거나 또는 화학적으로 커플링된 경우에는 정제한 인체 T-세포 혈창 멤브레인 또는 베타-갈락토시다제와 같은 재조합 DNA유사단백질로 또한 라텍스 입자들과 커플링시킬 수 있다).

또한, 비특이적인 흡착제를 기타 다른 고상 또는 실(chamber) 벽상에 직접 피복할수도 있다. 항체는 PBS(0.1M 인산염 0 완충 식염수, pH 7.2, 판덱스 레보러토리즈 퍼블리쉬드 리서어취 리포트 4호(1984), "수용성 카르보디이미드 방법을 이용한 라텍스 입자들과 항원을 커플링", 미카엘이. 졸리, 피에이취, 디.) 중에 200마이크로그램/ml 농도로 만들었다. 항체용액을 가하여 세정하고, 라텍스 입자들(판덱스, 에피콘 카르복실-폴리스테렌 입자, 카탈로그 #31-010-1)을 침전시킨다. 상기 용액을 연화시킨 후, 초음파 수욕중에 20초간 노출시킨다. 비이드의 최종 농도는 0.5%이었다. 고체 카르보디이미드(시그마, 1-에틸-3-3-디메틸아미노프로필-카르보디이미드, 카탈로그 #E-7750)를 가하여 최종농도를 약 5밀리그램/ml로 만든다. 용액을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 회전시키고, 세정(PBS 사용)한후, 3회 원심분리하여 펠릿(12,000×g, 3분간, 실온)으로 만든다. 최종 비이드 용액은 보호 완충액중에 0.01-0.5%(w/v) 농도로 만든다.

(Ⅲ. 시료접시)

시아노클릴레이트 접착제를 사용한 용매 용접 플라스틱 크벳(엘카이 프로덕츠, 카탈로그 127-1010-400)을 이용하여 시료접시의 형태를 만든다. 상기 크벳은 1cm×1cm×4.5cm 규격을 갖는다.

본 실시예에서 접시는 6개의 크벳(뚜껑과 더불어)을 함유한다. 본 실시예에서, 첫번째 격실(chamber)은 인체혈액표본을 희석시키기 위한 혼합용액(약 0.1% 흡착제 비이드를 함유하는 보호용액 25ml)을 함유한다. 두번째 격실은 2.5ml의 세정용액(TBS/0.3% 트윈)을 함유한다. 세번째 격실은 2.5ml의 전개접합체 보호용액중에 1 : 500으로 회석한 알칼리성 포스파타제(잭슨 이뮤노리서어취 랩스, 카탈로그 #109-5576)와 커플링시킨 폴리클로온 염소 항-인체 면역 글로불린을 함유한다. 네번째 격실은 2.5ml의 세정용액(TBS/0.3% 트윈)을 함유한다. 다섯번째 격실은 2.5ml의 예비기질 세정용액(pHl0, 알칼리성 완충액)을 함유한다. 여섯번째 실은 1ml의 기질용액(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 시그마 카탈로그 #B-0766, 알칼리성 완충액중, pH l0)을 함유한다.

(Ⅳ. 분석)

시료접시를 42℃ 수욕중에서 평형시킨다. 첫번째 격실에 5마이크로리터(5-200마이크로리터를 사용할수 있음)의 혈청 또는 혈장을 가한다. 격실 #1내의 시료를 42℃(40-45℃를 이용할 수 있음)에서 3분간 배양한다. 용액을 시험 스트립과 함께 부드럽게 교반하고, 42℃에서 약 45분간 배양한다. 이때 해독가능한 면이 용매상에 최대로 노출되도록 주의를 기울여야 한다. 스트립을 격실 #2로 옮겨 약 1-10초간 세정한다. 스트립을 격실 #3으로 옮기다 약 5초간 부드럽게 교반한 후, 스트립을 42℃에서 약 45분간 배양한다. 스트립을 격실 #4로 옮기고, 약 1-10초간 부드럽게 교반한다. 스트립을 격실 #5로 옮기고, 약 1-10초간 세정한다.

시료접시 전체를 42℃ 수욕으로부터 꺼내어 실온의 벤치상에 위치시킨다. 스트립을 격실 #6으로 옮기고, 실온에서 10-20분간 배양한다. 각각의 색상 가능한 면의 발색반응을 양성(청색) 또는 음성(색상이 나타나지 않음)으로 기록한다.

3가지 이중맹시험을 실시하여 환자 혈청중의 HIV-1에 대한 항체들의 존재를 측정한다.

시험 A : 50개의 혈청시료(페랄타(Peralta) 암센타, 미합중국 캘리포니아주 오클랜드 소재) 중 25개가 HIV-1항체(주로 gp41에 대한 것만)에 대하여 웨스턴 블롯(WB)양성을 나타내었다. 나머지 25개는 WB 음성 수혈자의 혈청 푸울로부터 유래된 것으로 나타났다. 상기 시험은 WB결과와 비교하여 시료들 100%에 대하여 음성 또는 양성으로 정확하게 구별하였다.

시험 B : 시험 B에서는 21개의 HIV-1 WB 양성 혈액 시료 및 7개의 양성 혈액시료(미합중국 매사추세츠주 보스톤에 소재하는 매사추세츠 종합병원 혈액은행에서 아보트(Abbott) HIV-1 항체 시험하여 선별한 것)에 대하여 시험을 실시하였다. 이 실험에서는 21개의 모든 WB 양성 시료들이 23개의 음성시료들과 함께 확인되었다. 7개의 그릇된 양성 시료들이 이 시험에서는 모두 음성을 나타내었다.

시험 C : 시험 C에 의해 9개의 HIV-1 WE 양성 혈액 시료(NYU 의학센타) 및 10개의 WB 음성 시료들이 정확하게 확인 분류되있다. 2개의 HIV-1 항체 양성 정액 시료, 2개의 타액시료 및 1개의 노시료 또한 이 시험에서 양성을 나타내었다.

[실시예 3]

환자의 혈청중에 존재하는 HⅥ-1 P 24 항원의 검출

(I. 시험막대의 제조)

시험막대는 실시예 1에서와 동일하다. 다음과 같은 단일클로온 항체들 : 1 F 8(칼립테(Calypte) 바이오메디칼 컴패니제의 항 HIV-l GAG 단일클로온 항체, IgG 1), 항-HIgG 및 항-DNP을 막대에 흡착시킨다. 이때, MAbs는 트리스 완충 식염수중에 100mg/ml 농도로 만들고, 그중 10마이크로리터를 지정된 원형단편에 직접 도포한다.

MAbs의 순서는 다음과 같다;

항-인체 IgG(양성 대조물)(상부)

항-HlV GAG(P 24를 검출)(중간부분)

항-DNP(음성 대조물)(저부)

용액이 도포되어 있는 면을 위로하여 막대를 45℃의 오브내에 수평으로 위치시키고, 약 60분간 항체들을 흡착시킨다. 막대를 보호용액(PBS, 5% 말혈청) 중에 최소한 15분간 위치시킨다.

(Ⅱ. 흡착제 바이드의 제조)

고체표면상의 변성된 단백질과 (또는 고체 표면과 직접) 결합하는 특정한 시료의 친화도 특성을 최소화시키기 위한 목적으로 또한 잊네 항-GAG 오염물질(복합체내에 존재하거나 또는 용해되는 것)을 제거하기 위해서, 라텍스 폴리스틸렌입자들을 재조합 HIV-1P 24 GAG단백질과 공유결합시킨다. 상기 재조합 항원은 PBS 중에 100-200 마이크로그램/ml 농도로 만들어진다. 항원용액을 가하여 세정하고, 라텍스 입자들을 침전시킨다. 용액을 연화시킨 후, 20초간 노출시킨다. 바이드의 최종 농도는 0.5%이었다. 고체 카르보디이미드(시그마, 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]-카르보디이미드, 카탈로그 #E-7750)를 가하여 최종농도를 약 5밀리그램/ml로 만든다. 용액을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 회전시키고, 세정(PBS 사용)한 후 3회 원심분리하여 펠릿(12, 000×g, 3분간, 실온)으로 만든다.

최종 비이드 용액은 보호 완충액중에 0.01%-0.5%(w/v) 농도로 만든다.

(Ⅲ. 시료접시)

첫번째 격실은 상술한 재조합 항원 흡착제 비이드 약 0.1%를 함유하는 보호 완충액 2.5ml를 함유한다. 두번째 격실은 2.5ml의 세정 용액(TBS)을 함유한다. 세번째 격실은 2.5ml의 세정용액(TBS)을 함유한다. 세번째 격실은 2.5ml의 전개 전합체 용액, 보호용액중에 1 : 500으로 희석한 알칼리성 포스파타제와 키플링된 폴리클로온 염소 항-HIV-l GAG를 함유한다. 네번째 격실은 2.5ml의 세정용액(TBS)을 함유한다. 다섯번째 격실은 2.5ml의 예비기질 세정요액(pH l0 알칼리성 완충액)을 함유한다.

(V. 분석)

20마이트로리터의 해리 완충액(lMHCl-글리산 완충액)을 함유하는 얕은 웰에 100마이크로리터의 환자시료(혈액, 혈정, 혈장)을 가한다. 이어서 상기 용액을 격실 #1로 옮긴다. 용액을 시험 스트립과 함께 부드럽고 교반하고, 42℃에서 약 20분간 배양한다. 이때, 해독가능한 부분이 용매상에 최대로 노출되도록 주의를 기울어야 한다. 스트립을 격실 #2로 옮겨 약 10초간 세정한다. 스트립을 격실 #3으로 옮기고, 약 5초간 부드럽게 교반한다. 스트립을 42℃에서 약 20분간 배양한다. 스트립을 격실 #4로 옮

1방울(약 50마이크로리터)의 기질(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 시그마 카탈로그 #B-0766, 알칼리성 완충액중, pHl0)을 각각의 해독가능한 면에 가한다. 약 10분 경과후 각각의 해독 가능한 면의 발색반응을 관찰하여 양성(청색) 또는 음성(색상이 나타나지 않음)으로 기록한다.

Claims

a) 고체지지체, b) 고체지지체상의 첫번째 불연속면에 결합되어 있는 항원성 물질, c) 양성 대조물로서의 고체지지체상의 두번째 불연속 면에 결합되어 있는 항-인체 항체 및 d) 음성 대조물으로서의 고체지지체상의 세번째 불연속 면에 결합되어 있는 인체내에서 자연적으로 생성되지 않는 항원에 대한 항체로 구성된, 인체로부터 취한 시료내에서 항원성 물질의 존재를 검출하기 위한 스트립.
제1항에 있어서, 고체 지지체상의 네번째 불연속 면에 결합되어 있는 천연 인체 항체와의 면역복합체 상태로 존재하는 항원 물질에 대한 항체를 기제로 하는 시약을 부가적으로 포함하는 시험스트립.
제1항에 있어서, 항원성 물질이 비루스 또는 비루스 단백질인 시험 스트립.
제3항에 있어서, 항원성 물질이 HIV-1, HIV-1 GAG 단백질, HIV-l ENV 당단백질, HIV-1 POL 단백질, HTLV-I GAG 단백질, HTLV-l ENV 당단백질, HTLV-1 POL 단백질, 또는 이들의 에파토프로 부터 선택되는 것인 시험 스트립.
제1항에 있어서 고체 지지체가 유리섬유 여과지, 니트로셀룰로오스, 신터드유리, 플라스틱, 합성중합체, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리 테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 폴리비닐리딘 플루 오라이드로부터 선택되는 물질로 구성되는 시험 스트립.
제2항에 있어서 항체를 기제로 하는 시약이 단일클로온 항체, 폴리클로온 항체, 1가 또는 2가 항체 단편, 하이브리드 항체, 이형 기능을 갖는 항체, 또는 유전학적으로 조작하거나 또는 클로닝된 항체로부터 선택되는 것인 시험 스트립.
제1항에 있어서 항-인체 항체가 단일클로온 항체인 시험 스트립.
제1항에 있어서 인체내에서 자연적으로 생성되지 않는 항원이 합성 유기분자인 시험 스트립.
제8항에 있어서, 합성 유기분자가 디니트로페놀인 시험 스트립.
제1항에 있어서, 자연적으로 생성되지 않는 항원에 대한 항체 또는 항-인체 항체를 표지(1abel)시킨 시험 스트립.
제2항에 있어서, 항체를 기제로 하는 시약을 표지시킨 시험 스트립.
a) 고체지지체, b) 고체 지지체상의 첫번째 불연속면에 결합되어 있는 천연 인체 항체와이 면역복합체 상대로 존재하는 항원성 물질에 대한 항체를 기제로 하는 시약, c) 양성 대조물로서의, 고체 지지체상의 두번째 불연속면에 결합되어 있는 항-인체 항체 및 d) 음성 대조물로서의 고체 지지체상의 세번째 불연속면에 결합되어 있는 인체내에서 자연적으로 생성되지 않는 항원에 대한 항체로 구성된 인체로 부터 취한 시료 내에 항원성 물질의 존재를 검출하기 위한 시험 스트립.
a) 시료 내에 존재하는 물질과 시험 스트립상에 존재하는 항체 및 재조합 항원을 비롯한 단백질과의 비-특이적인 및 특이적인 결합을 방지하여 그릇된 결과가 초래되는 것을 예방할 수 있도록 시험하고자 하는 시료를 예비처리하고, b) 생성된 예비처리안 시료를 제1항 또는 제2항에서 정의한 시험 스트립과 시험 스트립에 결합되어 있는 항원성 물질이 시료 내에 존재하는 그에 대한 임의의 항체와 복합체를 형성하도록 하고, 아울러 제2항에 정의한 시험 스트립인 경우에 있어서는 시료내에 존재하는항원성 물질이 시험 스트립상에 존재하는 상체와도 결합하도록 하는 조건들하에서 접촉시키고, c) 이어서, 항원성 물질에 대한 복합체를 형성하지 않은 항체가 제거되도록 시험 스트립을 처리하고, d) 생성된 처리한 시험 스트립을 표지된 항인체 항체와 항 인체항체가 시험 스트립에 결합되어 있는 임의의인체 항체와 복합체를 형성하도록 하는 조건들하에서 접촉시키고, e) 시험 스트립에 결합되어 있는 표지된 항인체 항체의 존재, 그로부터 시료 내의 항원성 물질의 존재를 검출하고, f) 시험 스트립상의 양성 및 음성 대조물에 의해 나타난 검출의 정확성을 입증하고 것으로 구성되는 인체로부터 취한 시료내에서 항원성 물질의 존재를 검출하는 방법.
a) 시료 내에 존재하는 성분과 시험 스트립상에 존재하는 항체를 비롯한 단백질과의 비-특이적인 결합 및 인체 항체와 항원성 물질과의 특이적인 결합을 방지하여, 그로부터 그릇된 결과가 초래되는 것을 예방하도록 시험하고자 하는 시료를 예비 처리하고 b) 생성된 예비처리한 시료를 제12항에서 정의한 시험 스트립과, 시험 스트립과 결합하고 있는 항체를 기제로 하는 시약이 시료 내에 존재하는 임의의 항원성 물질과 복합체를 형성하도록 하는 조건들하에서 접촉시키고, c) 생성된 처리안 시험 스트립을 항원성 물질에 대한 표지된 항체와, 표지된 항체가 시험 스트립에 결합되어 있는 임의의 항원성물질과 복합체를 형성하도록 하느 조건들하에서 접촉시키고, d) 시험 스트립에 결합되어 있는 항원성물질에 대한 표지된 항인체 항체의 존재 및 그로부터 시료 내의 항원성 물질의 존재를 검출하고 및 e)시험 스트립상의 양성 및 음성 대조물에 의해 나타난 검출의 정확성을 입증 하는 것으로 구성되는 인체로 부터 취한 시료내에서 항원성 물질의 존재를 검출하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 항원성 물질이 비루스 또는 비루스 단백질인 단백.
제13항 또는 제14항에 있어서, 시료가 혈액, 혈청 또는 뇨인 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 단계(e)의 증명이 시험 스트립을 표지된 항인체 항체와, 표지된 항인체 항체와 시험 스트립에 결합되어 있는 인체 항체가 결합하도록 하는 조건들하에서, 접촉시키는 것인 방법.