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KR970004938B1 - 서브틸리신 돌연변이체 - Google Patents

서브틸리신 돌연변이체 Download PDF

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KR970004938B1
KR970004938B1 KR1019910700677A KR910700677A KR970004938B1 KR 970004938 B1 KR970004938 B1 KR 970004938B1 KR 1019910700677 A KR1019910700677 A KR 1019910700677A KR 910700677 A KR910700677 A KR 910700677A KR 970004938 B1 KR970004938 B1 KR 970004938B1
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KR
South Korea
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subtilisin
bacillus
amino acid
mutant
sequence
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
KR1019910700677A
Other languages
English (en)
Inventor
로버트 마아크 칼드웰
데이빗 아론 에스텔
토마스 포올 그레이카
Original Assignee
젠엔코오 인터내셔날 인코포레이티드
로버트 어얼, 리이취
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27028376&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR970004938(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 젠엔코오 인터내셔날 인코포레이티드, 로버트 어얼, 리이취 filed Critical 젠엔코오 인터내셔날 인코포레이티드
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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
서브틸리신 돌연변이체
[도면의 간단한 설명]
제1도는 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신에 대한 DNA 및 아미노산 서열과 이유전자의 부분 제한 지도를 도시한다.
제2도는 바실루스 아밀로리퀴파시엔스, 바실루스 서브틸리신 varI168 및 바실루스 리케니포르미스(carlsbergensis)의 서브틸리신 중에서 보존된 아니노산 잔기를 도시한다.
제3a도 및 제3b도는 바실루스 아밀로리퀴파시엔스, 바실루스 서브틸리스 varI168 및 바실루스 리케니포르미스의 서브틸리신의 아니노산 서열을 도시한다.
제4도는 세가지 서브틸리신의 아미노산 서열을 도시한다. 맨 위의 줄은 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신(때로 서브틸리신 BPN'으로도 언급된다) 유래의 서브틸리신의 아미노산 서열을 나타낸다. 두번째 줄은 바실루스 렌투스 유래의 서브틸리신(PCT 공보 WO89/06276의 서브틸리신 309)의 아미노산 서열을 도시한다. 맨 아래줄은 CG-RYSA로 표시된 본 발명의 바람직한 구체예의 아미노산 서열을 나타낸다. 부호*는 서브틸리신 BPN'과 비교하여 특이한 아미노산 잔기의 부재를 나타낸다.
제5도는 플라스미드 PGGA274의 제조를 나타낸다.
제6도는 플라스미드 PGG-RYSA에 대한 중간체인 PGG-KVNA의 제조를 나타낸다.
제7도는 합성 바실루스 렌투스 서브틸리신 유전자를 제조하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드-이중나선법을 도시한다.
제8도는 바실루스 서브틸리신을 코드화하는 합성 유전자의 제조 스트래티지를 도시한다.
제9도는 카세트 동연변이 생성에 의하여 코돈 위치 +123에서 DNA를 치환하기 위하여 사용된 카세트를 도시한다. XXX는 위치 +123에 있는 아미노산 치환을 코드화하기 위해 변형된 코돈을 나타낸다.
제10도는 DNA 서열이 합성 DNA인, 본 발명의 D바람직하 구체예의 DNA와 아미노산 서열을 도시한다. 이 도면의 DNA는 위치 27에 이르기는, 위치 78에 세린, 위치 104에 타로신, 위치 124에 세린 및 위치 274에 알라닌을 코드화하기 위해 변형되었다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 전구 카르보닐 가수분해효소의 하나 이상의 아미노산 잔기, 특히 바실루스 아밀로리퀴파시엔스서브틸리신의 잔기 +123 및/또는 + 274에 해당하는 위치에 있는 것들이 상이한 아미노산으로 치환되어 있는 아미노산 서열을 가지는 신규한 카르보닐 가수분해 효소 돌연변리체에 관한것이다. 상기와 같은 돌연변이 카르보닐 가수분해 효소는 일반적으로, 자연발생 또는 재조합 카르보닐 가수분해 효소를 코드화하는 전구 DNA 서열을, 전구 아미노산 서열 단독의 또는 전구 아미노산 서열의 다른 치환 삽입 또는 결실과 조합하여 이들 아미노산 잔기주 하나 또는 2개의 치환을 코드화하도록 시험관 내 변형시킴으로써 얻어진다.
[발명의 배경]
세린 프로테아제는 카르보닐 가수분해 효소의 하위 그룹이다. 세린 프로테아제는 광범위한 특이성 및 생물학적인 기능을 가지고 있는 효소들의 여러가지 부류를 포함한다[stroud, R. M.(1974),74~88]. 세린 프로테아제의 기능적 다양성에도 불구하고, 그것의 촉매가 작은 효소의 최소한 2개지의 유전학적으로 뚜렷한 종류 : 서브틸리신과, 포유동물의 키모트립신 관련 및 상동성 박테리아 세린 프로테아제(예컨대 트립신 및트립신)에 의해 연구되었다. 이들 2종류의 세린 프로테아제는 현저하게 유사한 촉매 메카니즘을 나타낸다[Kraut, J.(1977),331~358]. 나아가, 비록 기본구조가 상호 관련이 없더라도, 상기 2종류의 효소의 3차구조는 함께 세린, 히스티딘 및 아스파르트산염으로 이루어지는 아미노산의 보존된 촉매적 트리애드(triad)를 형성한다.
서브틸리신은 다양한 바실루스종과 기타 미생물로부터 대량으로 분비되는 세린 엔도츠로테아제(MW 27, 500)이다. 서브틸리신의 단백직 서열을 최소한 4가지의 상이한 바실루스종으로부터 결정되었다.[Markland, F.S., et al(1983),1537~1540]. 2.5A 해상도에 대한 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 3차원 결정학적 구조가 또한 보고되고 있다[Wright, C.C., et al.(1969),235~242; Drenth, J., et al.(1972) ,177~181]. 이들 연구는 비록 서브틸리신이 포유동물의 세린 프로테아제와 유전학적으로 관련이 없다 하더라도, 유사한 활성부위 구조를 가지고 있다고 볼 수 있다. 공유 결합된 펩티드 저해제[Robertus, J.D., et al.(1972),2439~2449], 또는 생성물 복합체[Robertus, J.D., et al.(1976) ,1097~1103]를 함유하고 있는 서브틸리신의 X-선 결정구조를 이미 서브틸리신의 활성부위와 추정되는 기질 결합 클레프트(cleft)에 관한 정보를 제공해주었다. 또한, 서브틸리신의 잔기 222에 있는 메티오닌의 측쇄가 과산화수소에 의해 메티오닌-술폭시드로 전환되고[Stauffer, D.C., et al.(1965),, 5333~5338]. 잔기 221에 있는 세린의 측쇄가 화학적 변형에 의하여 시스테인으로 전환된[Polgar, et al/(1981),351~354] 것에 관한 최소한 한가지 보고쭌만 아니라, 서브틸리신에 대한 다수의 역학적 및 화학적 변형연구가 보고되어 있다[Philipp, M., et al.(1983)5~32 ; Svendsen, B.(1976),237~291 ; Markland, F.S. 상기 동일].
미국 특허 제4,760,025호 및 1985년 1월 9일에 공개된 EPO 공보 제0 130 756호는 각각 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 티로신-1, 아스파르트산염 +32, 아스파라긴 +155, 티로신 +104, 메티오닌 +222, 글리신 +166, 히스티딘 +64, 글리신 +169, 페닐알라닌 +189, 세린 +33, 세린 +221, 티로신 +217, 글루탐산염 +156 및 알라닌 +152의 위치에 해당하는 서브틸리신 아미노산 잔기들의 변형을 개시하고 있다. 1988년 1월 7일에 공개된 EPO 공보 제0 251 446호는 치환, 삽입 또는 결실에 의하여 변형될 수 있고, 미국특허 제4,760,025호에서 표시된 잔기에 대하여 유용한 서브틸리신 돌연변이체를 형성하기 위한 변형과 조합할 수 있는, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신 및 그것의 동등물에서 다른 아미노산 잔기를 개시하고 있다. 그러나, 본원에 표시한 특정 잔기는 이들 참고문헌에는 표시되어 있지 않다.
유사하게, 1989년 10월 19일에 공개된 PCT 공개번호 W089/09819와 WO89/09830은 서브틸리신을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 돌연변이 시킴으로써 만든 서브틸리신 효소를 개시하고 있다. 많은 아미노산 잔기가 상기 각각의 공보에서 그렇게 변형될 수 있는 것으로 확인된다. 그런, 상기 언급한 참고 문헌으로는 본 발명의 어떠한 잔기도 확인되지 않는다.
따라서, 본 발명의 목적은 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 위치 +123 및/또는 +274에 해당하는 전구 카르보닐 가수분해 효소의 아미노산 잔기가 치환되어 있는 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체를 제공하는 것이다. 이러한 돌연변이체는 일반적으로 이 돌연변이체의 아미노산이 유도되는 카르보닐 가수분해 효소 전구체의 특성과 상이한 성질을 최소한 한가지 갖는다.
본 발명의 추가 목적은 상기 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체를 코드화하는 DNA 서열과 그러한 돌연변이 DNA 서열을 함유하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 DNA를 발현시켜서 세포내적으로 또는 세포외적으로 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체를 생성할 수 있는 숙주세포를 제공하는 것이다.
[발명의 개요]
본 발명은 돌연변이체의 아미노산 서열이 유도되는 전구 카르보닐 가수분해 효소와 비교하여 상이한 단백질 가수분해 활성, 안정성 및/또는 성능 특성을 가지고 있는 비자연 발생 카르보닐 가수분해 또는 돌연변이체를 포함한다. 전구 카르보닐 가수분해 효소는 자연발생 카르보닐 가수분해 효소 재조합 가수분해 효소일 수 있다. 특이하게도, 그러한 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체는 전구 카르보닐 가수분해 효소의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 하나 또는 그 이상의 상이한 아미노산으로 대치시킴으로써 유도되는, 자연에서는 발견되지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 전구효소의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 위치 Asn+123 및/또는 Ala+274, 또는 다른 카르보닐 가수분해 효소 또는 서브틸리신의 동등한 아미노산 잔기에 해당한다.
본 발명은 또한 그러한 카르보닐 가수분해 효소 또는 서브틸리신 돌연변이체를 코드화 하는 돌연변이 DNA 서열을 포함한다.
상기 돌연변이 DNA 서열은 자연발생 또는 재조합 전구효소를 코드화하는 전구 DNA 서열로부터 유도된다. 돌연변이 DNA 서열은, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 위치 +123 및/또는 +274에 해당하는 전구 DNA 서열에 의해 코드화된 하나 또는 그 이상의 특이한 아미노산 잔기가 치환된것을 코드화하도록 전구 DNA 서열을 변현함으로써 유도된다. 이들 재조합 DNA 서열은 신규한 아미노산 서열과, 일반적으로 전구 카르보닐 가수분해 효소 DNA 서열에 의해 코드화된 효소의 특성과 상이한 한가지의 특성을 갖는 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체를 코드화 한다. 상이한 특성으로는 단백직 가수분해 활성, 안정성 및/또는 향상된 성능 특성이 있다.
본 발명은 또한 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 Asn+124에 동등한 위치에 세린같은 상이한 아미노산 잔기를 가지고 있는 원핵 및 진핵 서브틸리신과, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 위치 +274에 동등한 위치에 상이한 아미노산 잔기를 가지고 있는 서브틸리신을 포함한다.
나아가, 본 발명은 돌연변이 카르보닐 가수분해 효소 DNA 서열을 함유하는 발현벡터와, 상기 돌연변이체를 생성할 수 있는 상기 벡토로 형질전환된 숙주세포를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.
바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 +123에 동등한 아미노산 잔기에서 카르보닐 가수분해 효소 서브틸리신의 시험관 내 돌연변이가, 전구 서브틸리신을 능가하는 변경된 단백질 가수분해 활성을 나타내는 서브틸리신 돌연변이체를 생성하는 것으로 밝혀졌다.
또한 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 +274에 동등한 잔기에서의 시험관 내 돌연변이가 변경된 안정성, 예컨대 변형된 자가 단백질 가수분해 안정성을 나타내는 서브틸리신 돌연변이체를 생성한다는 것이 밝혀졌다. 어떤경우에는, 이들 후자의 돌연변이체가 세제 조성물에 사용되는 경우 증가된 능력을 나타내기도 한다.
카르보닐 가수분해 효소는(X는 산소 또는 질소이다)결합을 함유하고 있는 화합물을 가수분해하는 효소이다. 이 효소에는 자연발생 카르보닐 가수분해 효소와 재조합 카르보닐 가수분해 효소가 포함된다. 자연발생 카르보닐 가수분해 효소에는 기본적으로 가수분해 효소, 예컨대 서브틸리신 또는 메탈로프로테아제같은 펩티드 가수분해 효소가 포함된다. 펩티드 가수분해 효소로는 α-아미노아실펩티드 가수분해 효소, 아실아미노 가수분해 효소, 세린 카르복시펩티다아제,메탈로카르복시펩티다아제,티올 프로테나아제, 칼복실프로테이나아제 및 메탈로프로테아제가 있다. 세린, 메탈로, 티올 및 산 프로테아제 뿐만 아니라 엔도- 및 엑소-프로테아제도 포함된다.
재조합 카르보닐 가수분해 효소는 자연발생 카르보닐 가수분해 효소를 코드화하는 DNA 서열이 변형되어 카르보닐 가수분해 효소 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실을 코드화하는 돌연변이 DNA 서열을 생성하는 카르보닐 가수분해 효소를 말한다. 적당한 변형방법은 본원과, 1985년 1월 9일에 공개된 EPO 공개 제0 130 756호와 1988년 1월 7일 공개된 EPO 공개 제0 251 446호에 개시되어 있다.
서브틸리신은 일반적으로 단백질 또는 펩티드의 펩티드 결합을 절단하기 위해 작용하는 박테리아 또는 진균류의 카르보닐 가수분해 효소이다. 본원에 사용되는 '서브틸리신은 자연발생 서브틸리신 또는 재조합 서브틸리신을 의미한다. 자연발생 서브틸리신 시리즈는 다양한 미생물종에 의해 생성되어 때로 분비되는 것으로 알려져 있다. 이 시리즈에 속하는 것들의 아미노산 서열은 완전히 상동성을 보이지 않는다. 그러나, 이 시리즈의 서브틸리신은 동일하거나 유사한 타입의 단백질 가수분해 활성을 나타낸다. 이 종류의 세린 프로테아제는 세린 프로테아제의 카모트립신 관련류와는 구별되는 촉매 트라이애드를 규정하는 공통적인 아미노산 서열을 공유하고 있다. 서브틸리신과 키모트립신 관련 세린 프로테아제는 둘다 아스파르트산염, 히스티딘 및 세린으로 이루어지는 촉매 트라이애드를 가지고 있다. 서브틸리신 관련 프로테아제에서 아미노 말단에서부터 카르복시 말단쪽으로 판독되는 이들 아미노산의 상대적인 순서는 아스파르트산염-히스티딘-세린이다. 그러나 키모트립신 관련 프로테아제에서의 상대적인 순서는 히스티딘-아스파르트산염-세린이다. 그러므로, 본원에서 어급하는 서브틸리신은 서브틸리신 관련 프로테아제의 촉매 트라이애드를 가지고 있는 세리프로테아제를 의미한다. 그 실례로는 제3도에 도시된 서브틸리신과 PCT 공개 WO89/06276 및 EPO 공개 제0 283 075호에 기재된 것과 같은 것들이 있다.
재조합 서브틸리신은 서브틸리신을 코드화 하는 DNA 서열이 변형되어 자연발생 서브틸리신 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 코드화하는 돌연변이 DNA 서열을 생성하는 서브틸리신을 말한다. 그러한 돌연변이를 생성하는 적당한 방법 및 본원에 기재된 것들과 조합될 수 있는 방법들로는 EPO 골개 제0 130 756호 및 0 251 446호와 PCT 공개 WO89/06279, WO89/09830 및 WO89/09819에 기재된 것들이 있다.
비-사람 카르보닐 가수분해 효소와 그것을 코드화하는 DNA는 많은 원핵 및 진핵 유기체로부터 얻을 수 있다. 원핵 유기체의 적당한 실례로는 대장균 또는 슈도모나스()같은 그람 네가티브 유기체와, 마이크로코커스(또는 바실루스같은 그람 포지티브 박테리아가 있다. 카르보닐 가수분해 효소와 그것의 유전자를 얻을 수 있는 진행 유기체의 실례로는 맥주효모균()같은 효모, 아스페르길루스()종 같은 진균류, 및 예컨대 카르보닐 가수분해 효소 키모신을 코드화하는 유전자를 얻을 수 있는 소과 동물같은 비-사람 포유동물 공급원이 있다. 서브틸리신에 대해서는, 카르보닐 가수분해 효소 시리즈를, 이 시리즈의 구성원들 사이에서 완전한 상동성을 보이지는 않지만, 그럼에도 불구하고 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 나타내는 아미노산 서열을 가지고 있는 다양한 관련 종으로부터 얻을 수 있다. 그러므로, 본원에서 사용된 비-사람 카르보닐 가수분해 효소는 원핵 및 진핵 공급원과 직접 또는 간접적으로 관련된 카르보닐 가수분해 효소를 언급하는 기능적인 정의를 갖는다.
카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체는 전구 카르보닐 가수분해 효소의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는다. 전구 카르보닐 가수분해 효소로는 자연발생 카르보닐 가수분해 효소 및 재조합 카르보닐 가수분해 효소가 있다. 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체의 아미노산 서열은 전구 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입에 의하여 전구 가수분해 효소 아미노산 서열로부터 유도된다. 그러한 변형은 전구 카르보닐 가수분해 효소 및 그 자체의 조작이라기보다는 전구 카르보닐 가수분해 효소의 아미노산 서열을 코드화하는 전국 DNA 서열의 변형이다. 전구 DNA 서열의 그러한 조작에 적당한 방법으로는 본원과 EPO 공개 제0 130 756호 및 0 251 446호에 개시된 방법들이 있다.
바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 위치 +123 및 +274에 해당하는 특이한 잔기는 본원에서 치환을 위해 표시된다. 이들 아미노산 위치의 번호는 제1도에 표시된 성숙한 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신 서열을 특정하는 번호들이다. 그러나, 본 발명은 이 특정 서브틸리신의 돌연변이에만 한정되지 않으며, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신에서 특별히 표시된 잔기에 동등한위치에 있는 아미노산 잔기를 함유하는 전구 카르보닐 가수분해 효소에도 확대된다.
전구 카르보닐 가수분해 효소의 잔기(아미노산)는 그것이 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 특정 잔기 또는 그 잔기부분에 상동성이거나(즉, 1차 또는 3차 구조중 어느하나의 위치에 해당하거나), 유사한(즉, 조합, 반응, 또는 화학적으로 상호 반응할수 있는 동일한 또는 유사한 기능적 능력을 가지고 있는)것이라면 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 잔기에 동등하다.
1차구조와의 상동성을 수립하기 위하여, 전구 카르보닐 가수분해 효소의 아미노산 서열은 직접 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 1차 서열, 특히 그게 대한 서열이 알려져 있는 모든 서브틸리신(제2도)에서 불변하는 것으로 알려져 있는 잔기 세트와 비교된다. 일렬배열을 유지하기 위하여 필요한 삽입 및 결실을 허용하는(즉, 임의의 결실 및 삽입을 통한 보존된 잔기의 제거를 피할 수 있게 해주는) 보존된 서열의 일렬배열 후에, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 1차 서열의 특정 아미노산에 동등한 잔기가 규정된다. 보존된 잔기의 일렬배열은 그러한 잔기의 100%를 보존해야 하는 것이 바람직하다. 그러나, 75%보다 크거나 또는 50% 정도로 적게 보존된 잔기의 일렬배열은 또한 잔기의 규정에도 적당하다. 촉매 트라이애드. Asp32/His64/Ser221의 보존은 유지되어야 한다.
예를 들어, 제3도에서 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신, 바실루스 서브틸리신 Var.I168 및 바실루스 리케니포르미스(carlsbergensis) 유래의 서브틸리신의 아미노산 서열은 아미노산 서열들 사이의 최대량의 상동성을 제공하기 위하여 일렬 배열된다. 이들 서열은 비교결과 각 서열에 많은 보존된 잔기들이 함유되어 있는 것으로 나타난다. 이들 서열은 제2도에 표시된 잔기들이다.
그러므로 이런 보존된 잔기들은 바실루스 렌투스 유래의 서브틸리신(PCT공개 제 WO89/06279, 1989년 7월 13일 공개) 및 본원의 바람직한 서브틸리신 돌연변이체같은 다른 카르보닐 가수분해 효소에서, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 아미노산 잔기에 해당하는 동등한 아미노산 잔기를 규정하기 위해 사용될 수 있다. 이들 특정 아미노산 서열은 제4도에서 보존된 잔기의 최대 상등성을 얻기 위하여 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 서열과 일렬 배열된다. 제4도에서 알 수 있는 바와 같이, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신과 비교할때 바실루스 렌투스의 서열과 본 발명의 바람직한 서브틸리신 돌연변이체의 서열에는 많은 결실이 있다. 그러므로, 다른 서브틸리신에서 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 Val-165에 대한 동등한 아미노산은 Val-165 아래에 보이는 특정 이소로이신이다.
제4도에서, 위치 123에 있는 아미노산은 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신에서 아스파라긴이다. 바실루스 렌투스 서브틸리신에서 동등한 잔기는 도시된 특정 아스파라긴이다. 그러나, 본 발명의 바람직한 서브틸리신 돌연변이체에서, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 +123에 동등한 아미노산은 아스파라긴 이외의 아미노산이고, 바람직하게는 제4도에 도시된 세린이다.
유사하게 제4도에서, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 위치 +274에 있는 아미노산은 알라닌이다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 바실루스 랜투스 서브틸리신에서의 동등한 아미노산은 제4도에 도시된 특정 트레오닌이다. 본 발명의 특정한 바람직한 서브틸리신 돌연변이체에서 동등한 아미노산 위치 274는 제4도에 도시된 알라닌이다.
그러므로, 위치 +123과 +274는 바실루스 렌투스로부터의 서브틸리신과 본 발명의 바람직한 구체예에 대한 제4도의 1차 아미노산 서열에 의해 확인된다. 그러나, 다양한 다른 아미노산 잔기들은 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 특이한 아미노산에 동등하게 변형될 수 있다. 그러므로, 바람직한 구체예에서, 바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신의 위치 127에 있는 아미노산 라인신은 바실루스 렌투스 서브틸리신의 위치 27에서 동등한 라이신을 갖는다. 실시예에서 나타낸 바와같이, 본 발명의 바람직한 구체예중 하나를 포함하는 서브틸리신은 바실루스 렌투스 서브틸리신을 코드화하는 DNA 서열을 변형시킴으로써 유도되었다. DNA에 대한 그러한 변형은 바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신의 위치 123 및 274에 동등한 코돈의 변형을 포함하였다. 그러나, 2가지 다른 변형이 바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신의 잔기 27과 104에 동등한 위치에서 바실루스 렌투스 아미노산 서열에 대하여 이루어졌다. 그러므로, 제4도에서 알 수 있는 바와 같이, 바실루스 렌투스 서브틸리신의 동등한 잔기 27에 있는 라이신은 바람직한 구체예에서 아르기닌을 코드화하도록 변형되었다. 유사하게, 바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신의 티로신 104에 동등한 바실루스 렌투스의 104 위치에 있는 발린 잔기는 티로신을 토드화하도록 변형되었다. 그러므로, 제4도에 도시된 바람직한 구체예는 바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신의 위치 27, 104, 123 및 274에 동등한 바실루스 렌투스 서브틸리신의 잔기들을 변형시킴으로써 바실루스 렌투스 서브틸리신으로부터 유도된 아미노산 서열을 함유한다.
동등한 잔기는 또한 그것의 3차 구조가 X-선 결정학에 의하여 결정되어 있는 전구 카르보닐 가수분해 효소에 대한 3차구조 수준에서 상동성을 측정함으로써 규정될 수 있다. 동등한 잔시는 그것에 대한 전구 카르보닐 가수분해 효소와 바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신의 특정 아미노산 잔기의 주사슬 원자들중 둘 또는 그 이상의 원자 좌표(N에 대해서 N,CA에대해서 CA,C에 대해 C,O에 대해 O)가 배열후 0.13nm, 바람직하게는 0.1nmso에 있는 그러한 잔기로서 규정된다. 배열은 바실루스 아닐로리퀴파시엔스에 대하여 의문의 카르보닐 가수분해 효소의 비-수소 단백질 원자의 원자 좌표가 가장 많이 중첩되도록 가장 좋은 모델이 배향되고 위치 결정된 다음에 이루어진다. 가장 좋은 모델은 활용 가능한 가장 높은 해상도에서의 실험적인 회절 데이타에 대하여 가장 낮은 R인자를 제공하는 결정학 모델이다.
바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신의 특정 잔기에 기능적으로 유사한 동등 잔기들은, 그것들의 단백질 구조, 기질 결합 또는 촉매작용을 바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신의 특정 잔기에 기인하여 규정된 방식으로 변경, 변형 또는 기여하도록 하는 구조를 채택할 수 있는 전구 카르보닐 가수분해 효소의 그러한 아미노산으로서 규정된다. 나아가, 동등 잔기들은 비록 주어진 잔기의 측사슬 원자중 최소한 2개의 원자좌표가 바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신의 해당하는 측사슬 원자들과 0.13nm 거리에 있는 정도의 유사한 위치를 차지하는 전구 카르보닐 가수분해 효소(이것에 대한 3차 구조는 X-선 결정학에 의하여 밝혀져 있다)의 그러한 잔기들이다. 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 3차원 구조의 좌표는 EPO 공보 제0 251 446호에 설명되어 있고, 상기 개략적으로 설명한 바와같이 3차 구조의 수준에 대하여 동등한 잔기들을 측정하기 위하여 사용될 수 있다.
치환, 삽입 또는 결실에 대하여 확인된 잔기들중 일부는 보존된 잔기인 한편, 나머지는 그렇지 못하다. 보존되지 않는 자기들의 경우에 하나 또는 그 이상의 아미노산의 대치는 자연에서 발견되는 것에 해당하지 않는 아미노산 서열을 가지는 돌연변이체를 유발하는 치환에 제한된다. 보존된 잔기의 경우에, 그러한 대치는 자연발생 서열을 유발하지 않아야 한다. 본 발명의 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체는 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체의 성숙한 형태 뿐만 아니라 그러한 가수분해 효소 돌연변이체의 프로 및 프레프로-형태도 포함한다. 프레프로-형태는 이것이 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체의 발현, 분비 및 성숙을 용이하게 하기 때문에 바람직한 구조이다.
프로서열은 제거될때 카르보닐 가수분해 효소의 성숙한형태의 외관을 초래하는 카르보닐 가수분해 효소의 성숙한 형태의 N-말단부에 결합된 아미노산의 서열을 말한다. 많은 단백질 가수분해 효소는 번역 프로효소 생성물로서 자연에서 발견되며, 번역후 프로세싱없이 프로효소로 발현된다. 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체, 특히 서브틸리신 돌연변이체를 생성하기 위해 바람직한 프로서열은, 다른 서브틸리신 프로 서열은 사욜될 수 있지만 바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신의 추정되는 프로 서열이다. 실시예에서, 바실루스 렌투스(ATCC 21536) 유래의 서브틸리신으로부터의 추정되는 프로 서열을 사용하였다.
신호서열 또는프레 서열은 카르보닐 가수분해 효소의 N-말단부 또는 기수분해 효소의 성숙 또는 프로형태의 분비에 참여할 수 있는 프로 가수분해 효소의 N-말단부에 결합된 아미노산의 어떠한 서열을 말한다. 신호 서열의 이러한 정의는 기능적인 정의이고, 서브틸리신 유전자 또는 다른 분비 가능한 카르보닐 가수분해 효소의 N-말단부에 의해 코드화되고, 자연적인 조건하에서 서브틸리신 또는 다른 카르보닐 가수분해 효소의 분비에 참여하는 그러하나 모든 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 그러한 서열들을 이용하여 본원에 규정된 바와 같은 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체의 분비를 실체화한다.
실시예에서 사용된 바람직한 신호 서열은 바실루스 렌투스(ATCC21536)의 서브틸리신의 신호 서열의 나머지에 융합된 바실루스 서브틸리틴 t으로부터의 신호 서열의 처음 7개의 아미노산 잔기를 포함한다.
카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체의 프레프로형태는 가수분해 효소의 아미노-말단에 작동 가능하게 연결된 프로 서열 및 프로 서열의 아미노산 말단에 작동 가능하게 연결된 프레 또는 신호서열을 갖는 가수분해 효소의 성숙한 형태로 구성된다.
발현벡터는 적당한 숙주에서 DNA의 발현을 실제화할 수 있는 적당한 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 구조물을 말한다. 그러한 제어 서열에는 전사를 초래하는 프로모터, 그러한 전사를 제어하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적당한 mRNA 리보좀 결합부위를 코드화하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열이 있다. 벡터는 플라스미드, 파지입자, 또는 간단한 잠재적인 게놈 삽입물일 수 있다. 일단 적당한 숙주안에 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과는 독립적으로 복제하여 기능하거나, 또는 어떤 경우에는, 게놈 자체안으로 통합될 수도 있다. 본 명세서에서는,플라스미드와 벡터는, 플라스미드가 현재 가장 흔히 사용되는 벡터형태이기 때문에, 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 동등하게 기능하며, 당해 기술분야에 알려져 있고, 또는 알려지게 될 다른 발현벡터 형태도 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에 사용된 숙주세포는 일반적으로 효소적인 활성인 엔도 프로테아제를 분비할 수 없도록 만드는 방법(EPO 공보 제0 130 756에 개시됨)에 의해 우선적으로 조작된 원핵 또는 진핵 숙주이다. 서브틸리신의 발현에 바람직한 숙주세포를 효소적으로 활성인 중성 프로테아제와 알칼리 프로테아제(서브틸리신)가 없는 바실루스 균주 BG2036이다. 균주 BG2036의 제조는 EPO 공보 제0 130 756에 상세하게 설명되어 있으며, 양, 엠. 와이. 등에 의해 설명되어 있다[Yang, M. Y., et al.(1984) ,15~21]. 서브틸리신을 발현하기위한 다른 숙주세포로는 바실루스 서브틸리신 I168{EPO 공보 제0 13. 756)이 있다.
숙주세포는 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조된 벡터로 형질전환된다. 그렇게 형질전환된 숙주세포는 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체를 코드화 하는 벡터를 복제하거나 소망하는 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체를 발현할 수 있다. 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체의 프레 또는 프레프로 형태를 코드화하는 벡터의 경우에, 그러한 돌연변이체는 발련되는 경우 전형적으로 숙주세포로부터 숙주세포 배지로 분비된다.
2개의 DNA 영역사이의 관곌르 설명할때 작동가능하게 연결된이란 용어는 단순히 2개의 DNA 영역이 상호 기능적으로 관련이 있음을 의미한다. 예를 들어, 만약 프레 서열이 신호 서열로서 작용한다면 펩티드에 작동가능하게 연결되어, 아마도 신호 서열의 절단을 포함하여 단백질의 성숙한 형태의 분비에 참여한다. 프로모터는 만약 이것이 서열의 전사를 조절한다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되며, 리보좀 결합부위는 만약 이것이 서열의 전사를 조절한다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
자연발생 전구 카르보닐 가수분해 효소를 코드화하는 유전자는 EPO 공보 제0 130 756호와 0 251 446호에 기재된 일반적인 방법을 따라 얻을 수 있다. 상기 문헌에 기재된 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 방법을 일반적으로 관심이 가수분해 효소 영역을 코드화하는 추정 서열을 가지고 표시된 프로브를 합성하는 단계, 가수 분해효소를 발현하는 유기체로부터 게놈 라이브러리를 제조하는 단계로, 그리고 프로브에의 혼성화에 의해 관심의 유전자에 대한 라이브러리를 스크링하는 단계로 이루어진다. 그런 다음 양성으로 혼성화하는 클론을 지도화 하고 서열화한다.
그런 다음 클론된 카르보닐 가수분해 효소를 사용하여 가수분해 효소를 발현시키기 위해 숙주세포를 형질전환시킨다. 그런 다음 가수분해 효소 유전자를 복사수가 높은 플라스미드에 결찰시킨다. 이 플라스미드는 그것이 잘 알려져 있는 플라스미드 복제에 필요한 요소들 : 의문의 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터(숙주에 의해 포로모터가 인지된다면, 즉, 전사된다면 유전자 자체의 동종 프로모터로 공급될 수 있다). 가수분해 효소 유전자 외부에 있거나 또는 이 유전자의 내재성 터미네이터 영역에 의해 공급되는 전사 종결 및 폴리아데닐화 영역(특정 진핵 숙주 세포의 가수분해 효소 유전자로부터 숙주에 의해 전사된 mRNA의 안정성에 필요하다), 및 바람직하게는, 항상물질-함유 배지에서는 성장에 의해 플라스미드-감염 숙부세포의 연속적인 배양을 유지하게 해주는 항생물질 내성 유전자와 같은 선택유전자를 함유하는 때에 숙주에서 복제된다. 그러나, 숙구 게놈안에 가수분해 효소 유전자의 복사물을 다수 통합시키는 것도 본 발명의 범주내에 있다. 이것은 특히 동종 재조합이 일어나기 쉬운 원핵 및 진핵 유기체에 의해 용이해진다.
또는 달리, 자연발생 또는 돌연변이 전구 카르보닐 가수분해 효소를 코드화하는 합성유전자기 제조될 수 있다. 그러한 접근법으로, 전구 가수분해 효소의 DNA 및/또는 아미노산 서열이 결정된다. 그런 다음 다중 중첩 합성 단일-스트랜드 DNA 단편이 합성되고, 이것은 혼성화 및 결찰시에 전구 가수분해 효소를 코드화하는 합성 DNA를 생성한다. 이 접근법은, 제한 부위의 천연 유전자가 코드화된 아미노산의 변화없이 DNA를 통해 포개어질 수 있어서 돌연변이체 카르보닐 가수분해 효소를 형성하기 위한 후속 변형이 용이해질 수 있다는 점에서 클로닝을 능가하는 여러가지 장점을 제공한다. 나아가, 합성접근법은 사용하고자 하는 특정 발현숙주에 대한 코돈 바이어스와 일치시키기 위하여 합성 유전자의 코돈 용도를 조정하는 것을 가능하게 한다. 합성 유전자 제조의 실례는 실시예에서 설명한다.
일단 자연발생 또는 전구 카르보닐 가수분해 효소 유전자가 클론되면, 자연발생 전구 카르보닐 가수분해 효소의 합성 이외의 유전자가 사용을 증강시키기 위하여 많은 변형이 이루어진다. 그러한 변형에는 EPO 공보 제0 130 756호에 개시된 바와같은 재조합 카르보닐 가수분해 효소의 제조와, 본원에 기재된 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체의 제조가 있다.
다음에 설명하는 카세트 돌연변이체 생성법은, 부위특정 돌연변이체 생성법을 포함한 다른 방법들이 사용될 수 있지만, 본 발명의 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체의 제조 및 확인을 용이하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 먼저, 가수분해 효소를 코드화하는 자연 발생 유전자를 얻어서 전체적으로 또는 부분적으로 서열화한다. 그런 다음 코드화된 효소의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 돌연변이체(결실, 삽입 또는 치환)가 일어나기를 소망하는 지점에 대하여 서열을 주사(scanning)한다. 상기 지점 양측의 서열을, 발현되는 경우 다양한 돌연변이체를 코드화할 올리고뉴클레오티드 푸울로 유전자의 짧은 단편을 대치하기 위한 제한부위의 존재여부에 대하여 조사한다. 그러한 제한부위는 바람직하게도 가수분해 효소 유전자내에 있는 유일한 부위여서 유전자 단편의 대치를 용이하게 한다. 그러나, 제한효소 소화에 의해 생성된 유전자 단편들이 적절한 순서로 재조립될 수만 있다면, 가수분해 효소 유전자에 과도하게 많지 않은 편리한 제한부위는 모두 사용할 수 있다. 만약 제한부위가 선택된 지점으로부터 편리한 거리내(10 내지 15 뉴클레오티드)에 있는 위치에 존재하지 않는다면, 그러한 부위는 코드화된 리딘 프레임 또는 아미노산이 최종구조에서 변화되지 않는 그런 방식으로 유전자에 있는 튜클레오티드를 치환함으로써 생성된다. 소망하는 서열에 일치시키기 위하여 서열을 변화시키기 위한 유전자의 돌연변이는 일반적으로 알려진 방법에 따라 M13 프라이머 여장에 의해 이루어진다. 두개의 편리한 제한부위 서열에 도달시키기 위해 적당한 플래킹 영역을 위치시키고 필요한 변화를 평가하는 작업은, 유전자 코드의 반복, 유전자의 제한효소 지도 및 다수의 상이한 제한효소에 의하여 일상적으로 이루어진다. 만약 편리한 플래킹 제한부위를 활용할 수 있다면, 상기 방법은 단지 그런 부위를 포함하지 않는 플래킹 영역과 관련되어서만 사용될 필요가 있음을 주의해야 한다.
자연-발생 DNA 또는 합성 DNA가 클론되면, 돌연변이시키고자 하는 위치 양측의 제한 부위는 동종의 제한효소로 소화되고, 다수의 말단끼리 상보하는 올리고뉴클레오티드 카세트가 유전자안으로 결찰된다. 돌연변이생성은, 동일한 제한 부위를 가지기위해 모든 올리고뉴클레오티드가 합성될 수 있고, 제한부위를 만들기 위하여 합성링커가 필요하지 않으므로, 상기 방법에 의하여 매우 단순화 된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질 가수분해 활성은 활성효소의 밀리그램당 펩티드 결합의 가수분해율로서 규정된다. 단백질 가수분해 활성을 측정하는 많은 과정이 잘 알려져 있다[K. M. Kalisz. Microbial Proteinases, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, A. Fiechtered, 1988].
발명의 한 측면으로, 발명의 목적은 전구 카르보닐 가수분해 효소와 비교하여 보다 큰(숫자상으로 큰) 단백질 가수분해 활성을 가짐으로써 표적기질에 대하여 효소가 보다 효과적으로 작용하는 것을 가능하게 하는 돌연변이 카르보닐 가수분해 효소를 보장하는 것이다. 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 +123에 동등한 잔기에서 서브틸리신-계 카르보닐 가수분해 효소를 유발하는 그러한 결과를 얻기 위해 유용한 특이한 아미노산들을 실시예에 나타낸다. 어떤 경우에는 단백질 가수분해 활성이 더 낮은 것이 바람직할 수도 있다. 그러한 경우에는 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 +123에 해당하는 잔기에서, 실시예에서 표시된 아미노산을 치환함으로써 단백질 가수분해 활성을 감소시킬 수 있다.
세린이 바실루스 아밀로리퀴파시엔스의 +123에 동등한 위치를 잔기가 아닌 그러한 전구 서브틸리신에 있어서, 전구체에서 위치 +123이 세린으로 치환되는 경우 가장 큰 단백질 가수분해 활성을 얻을 수 있다. 나아가, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 +123에 동등한 위치에 세린을 함유하는 자연발생 바실루스 서브틸리신은 존재하지 않는 것으로 알려져 있다. 이 위치에 있는 세린이 단백질 가수분해 활성을 증가시킨다는 발견을 토대로 하여, 당업자는 이 위치에 세린을 함유하고 있는 자연 돌연변이체를 확인하고 클론하기 위해 자연발생 바실루스 서브틸리신을 스크리닝할 수 있다. 그러한 자연 바실루스 서브틸리신 돌연변이체는 본 발명의 범주내에 있다.
카르보닐 가수분해 효소가 바실루스 이외의 것으로부터 유래하고, 세린이 전구효소의 +123에 존재하는 경우에, 치환은 단백질 가수분해 활성을 감소시키는 것일 수 있다. 이것은 예컨대, 카르보닐 가수분해 효소의 합성 활성이 요구되는 경우에(합성펩티드의 경우)유용하다. 그러한 합성의 생성물을 파괴할 수 있는 이 단백질 가수분해 활성을 감소시키는 것이 바람직한 경우도 있다.
발명의 다른 측면으로, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 +274에 동등한 잔기들이 세제조성물에서 효소의 전체적인 수행특성을 조절하는데 효하다. 그러므로, 실시예에서 설명한 것과 같이 동등한 위치 +274에 있는 바실루스 렌투스 서브틸리신의 트레오닌은 바람직한 구체예에서 돌연변이 효소의 성능을 증강시키기 위하여 알라닌으로 돌연변이될 수 있다. 또한 실시예에서 설명하는 바와 같이, 이 잔기를 트레오닌 이외의 다른 아미노산, 예컨대, 로이신, 세린, 발린 및 알라닌으로 치환하는 것은 돌연변이체의 안정성의 감소를 초래한다. 안정성의 그러한 감소는 돌연변이체의 자가촉매 분해의 결과인 것으로 여겨진다. 그러므로, 바실루스 서브틸리신의 +274에 동등한 잔기의 변형은 세제 조성물에서 효소의 전체 성능을 증강시킬수 있고, 효소의 전체 안정성을 조절할 수 있다.
발명의 이런 측면에서 볼때, 발명의 목적은 세제 조성물에 사용되는 경우, 전구 카르보닐 가수분해 효소와 비교하여 성능이 증강된 돌연변이 카르보닐 가수분해 효소를 보장하는 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 세제에서 증강된 성능은 야채즙 또는 혈액같은 특정효소 민감성 얼룩의 증가된 세척력으로서 규정된다. 이 세척력은 표준세척 주기후의 육안 평가에 의해 결정된다.
본 발명의 바람직한 구체예를 실시예에서 설명하기로 한다. 실시예에서, 바실루스 렌투스 서브틸리신의 위치 27에 있는 라이신은 아르기닌으로 치환되며, 위치 104에 있는 발린은 티로신으로 치환되고, 위치 123에 있는 아스파라긴은 세린으로 치환되며, 그리고 잔기 274의 트레오닌은 알라닌으로 치환된다. 비록 상기 효소의 안정성이 전수 바실루스 렌투스 서브틸리신과 비교하여 다소 감소되긴 하였지만, 세제 조성물에서의 이 효소 성능수준은 상당히 증강되어서, 대략 반정도의 효소를 사용했을때 변형되지 않은 바실루스 렌투스 서브틸리신과 비교하여 동일한 성능의 바실루스 렌투스 서브틸리신 돌연변이체가 얻어진다.
상기 및 기타 동연변이 서브틸리신을 사용하여 얻은 결과를 토대로 하여, 바실루스 아닐로리퀴파시엔스의 +123과 +274에 동등한 카르보닐 가수분해 효소 가수분해 효소의 잔기가 이들 효소의 단백질 가수분해 활성, 성능 및/ 또는 안정성에 중요한 것으로 나타난다.
본 발명의 많은 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체, 특히 서브틸리신은 다양한 세제 조성물의 제형에 유용하다. 많은 공지 화합물이 본 발명의 카르보닐 가수분해 효소 돌연변이체를 함유하는 조성물에 유용한 적당한 계면활성제이다. 그런것들로는 비이온성, 양이온성, 음이온성, 또는 양성 이온성 세제가 있다.[U.S.4, 404,128,Barry J. Anderson U.S. 4,261,868, Jiri Flora, et al.].
이런 기술분야는 세정 조성물로서 사용될 수 있는 상이한 제형에 정통하다.
본 발명의 서브틸리신은 약 0.1 내지 5중량%, 바람직하게는 .1내지 .05중량%의 수준에서 6.5에서 12.0 사이의 pH를 가지는 공지의 분말 및 액체세제로 제형될 수 있다. 이들 세제 세척 조성물은 또한 증강제 및 안정제 뿐만 아니라 프로테아제 및 아밀라아제 같은 다른 효소를 포함할 수 있다.
종래의 세척 조성물에 본 발명의 서브틸리신을 첨가함으로써 유발되는 어떠한 특정용도의 제한은 없다. 즉, 세제에 대해 적정한 온도 및 pH이면, 그 pH가 상기 범위내에 있고, 온도가 본 발명의 서브틸리신을 변성시키는 온도 아래에 있는 한, 본 발명의 조성물에도 적당하다. 또한, 본 발명의 서브틸리신은 세제없는 세척조성물에, 단독으로 또는 증강제 및 안정제와 조합하여 사용될수 있다.
다음은 실시예로서, 특허청구범위의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
고초균에서 바실루스 렌투스 서브틸리신 유전자를 발현시키기 위한 구조물
제5도에 도시된 플라스미드 pSAR은 고초균과 바실루스 아밀로리퀴파시엔스의 서브틸리신 유전자의 제7/제8신호서열 코돈에 있는 공통되는 Sau3A 제한부위를 경유하여 번역상의 융합체를 운반한다. 제5도에 도시된 바와같이, I-BamH I 2.0Kb 단편상에 있는 이 유전자를, pSAR-Q275R을 형성하기 위한 부위특정 돌연변이 생성에 사용하기 위한 단일 스트랜드의 주형 DNA를 분리하기 위하여 M13 mp19에 하위 클론시켰다. 돌연변이 생성 프로토콜은 본질적으로 참고문헌의 것과 동일하였고[Zoller, M., et al.(1983),468-500], 다음의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.
상기에서, 별표는 야생형 유전자 서열로부터의 변화를 나타내고, 밑줄은 Q275R을 코드화하는 특정 돌연변이 유전자에 대한 스크리닝에 사용하기 위해 도입한 Pst I 제한 엔도뉴클레아제를 나타낸다. 상기 변화는 (1) 이 위치에 있는 아미노산을 바실루스 렌투스 서브틸리신에서 발견된 아미노산으로 전환시키고, (2) 바실루스 렌투스(ATCC 21536)으로부터 pGG36에 유사하게 도입된 Pst I 부위를 경유하여 바실루스 렌투스의 성숙한 코딩영역에 pSAR의 터미네이터의 접속을 허용하기 위해 이루어졌다.
제5도에 도시된 플라스미드 pGG36은 셔틀 벡터 pBS42[Band, L., et al. (1984),17-21]에 표준방법에 의해 클론된 오나전한 서브틸리신 유전자를 코드화하는 바실루스 렌투스(ATCC 21536)로부터의 2.1Kb 게놈 DNA 단편을 함유한다.
이 서브틸리신에 대한 아미노산 서열은 PCT 공보 제90/06279의 서브틸리신에 대해 개시된 것과 동일하다. 이 유전자는 1) 상기 pSAR에 도입된 부위에 해당하는 상기 유저자의 동일위치에 Pst I 부위를 도입하고, 2) 위치 274의 트레오닌을 알라닌으로 치환하여 pGG36-T274A를 형성하기 위하여, 다음의 서열:
의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 부위특정 돌연변이체 생성에 대해 상기와 같이 M13에 하위클론시켰다.
돌연변이 pSAR -Q275R과 pGG36-T274A 유전자는 제5도에 도시된 바와 같이, 개별적으로 pBS42에 다시 하위클론시킨 뒤 Pst I/BamH I 소화시키고, 단편 분리 및 결찰시켜 플라스미드 GG-A274 B,amy.term.을 제조하였다(모든 과정은 표준방법에 의해 수행함).
합성 DNA 링커는 다음 서열:
5'-G-ATC-GTC-GCG-TCG-ACC-GCA-CTA-CTC-ATT-TCT-GTT-GCT-TTT-AGT-TCA-T-3'
및
5-CGA-TGA-ACT-AAA-AGC-AAC-AGA-AAT-GAG-TAG-TGC-GGT-CGA-CGC-GAC-3
의 상보하는 단일 스트랜드의 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 제6도에 도시된 2중 스트랜드 DNA 단편 #2를 만듬으로써 제조하였다.
이 이중나선 링커의 움푹 들어간 좌측- 및 우측-끝은 각각 단편 #1(pSAR로부터 유래)의 Sau3A 끝과 단편 #3(pGG-A274 B. amy. term으로부터 유래)의 ClaI 끝에 상보한다. 이들 3단편을 pSAR-Q275R로부터의 단편 A와 조합한후, 표준방법에 따라, 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제로 소화하여 단편을 분리시키고 결찰시켜 플라스미르 pGG-KVNA를 제조하였다. GG-KVNA라는 표시는 이 서브틸리신이 위치 27에는 라이신(K)을, 위치 104에는 발린(V)을, 위치 123에는 아스파라긴(N)을 함유하고, 위치 274에는 알라닌(A)으로 트레오닌이 이환되어 있는 pGG-36에 의해 코드화된 서브틸리신을 함유하는 것을 나타낸다.
실시예 2
pGG-KVNA의 변형
제6도에 도시된 바와 같이, GG-KVNA 유전자(2.1kb EcoR I-BamH I 단편)를 M13에 하위클론하여 다음의 서열을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 부위 특정 돌연변이 생성을 계속해서 3회 수행하였다.
및
별표는 야생성 유전자 서열로부터의 변화를 나타낸다. 밑줄은 연결된 R27, Y104 및 S123 돌연변이의 존재를 스크린하기 위해 사용된 도입된 Xba I 부위((a)에서)와 Nhe I 부위((b)와 (c)에서)를 나타낸다. 또한 윗줄은 파괴된 Sph I 부위를 나타낸다. 마지막으로, 2.1kb GG-RYSA 유전자를 고초균 숙주에서의 발현을 위해 pBS42에 다시 하위클론하였다.
그 결과 형성된 플라스미드를 pGG-RYSA로 표시하였고, 이 표시는 pGG-KVNA 플라스미드에서 4개의 잔기가 변형되었음을 나타낸다. 즉, 위치 27에서 라이신(K)은 아르기닌(R)으로, 위치 104에서 발린(V)의 티로신(Y)으로, 그리고 위치 123에서 아스파라긴(N)은 세리(S)으로 변형되었다. 위치 274에서 앞서 치환되었던 알라닌은 이 과정에서 변형되지 않았다.
위치 27에 있는 라이신은, 서브틸리신 309의 아미노산 서열화를 토대로 하여 아르기닌으로 치환시켰다. PCT 공보 제WO 89/06279호에서 나타나 있는 바와 같이, 라이신은 위치 27에 위치한다. 그러나, 이 서브틸리신 단백질을 독립적으로 서열화한 후의 초기 데이타는 위치 27에 있는 잔기가 아르기닌인 것으로 나타났다. 잔기 104에서 발린에 대한 티로신의 치환의 경우, 이 치환은 앞서 바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신(때로 BPN'으로 언급된다)에 대해 얻은 결과를 토대로 하여 효소의 pH 활성 프로필을 저하시켰고 성능을 증가시켰다. 위치 123에서 세린으로 아스파라긴을 대치시킨것을 이하 얻어진 결과를 토대로 한 것이다. 이하 얻어진 결과에서는 위치 123에서 세린의 치환이 밀접하게 관련된 돌연변이체에서 효소의 단백질 가수분해 활성을 최대한한 것으로 측정되었다.
실시예 3
합성 바실루스 렌투스 서브틸리신 유전자의 제조
바실루스 렌쿠스 서브틸리신의 아미노산 서열을 코드화하는 DNA를, 또한 합성 DNA 서열을 코드화하는 유전자를 제조함으로써 제조하였다.
플라스미드 pGG36으로부터의 2.1kb HindIII 게놈 단편을 서열화하였다. 성숙한 유전자 생성물(GG36 서브틸리신)의 추론된 아미노산 서열을 사용하여 다음의 특성을 가지는 합성 성숙 코딩 서열을 고안하였다.
(1) 일반적으로, 7개의 상이한 고초균 유전자에서 각각의 아미노산에 대하여 가장 자주 발견되는 코돈(Maruyama, T., et al., (1986),Supplemantpp. r151-r197의 표 2, 코돈용의 일람표 참조)을, 또다른 코돈이 유전자내에서 편리하게 위치한 제한부위 인자부위를 결과하는 경우를 제외하고 사용하였다; (2) ~0.8kb 성숙한 코딩영엿의 대략 매 40-60b.p. 마다 공평하게 공간위치된 유일한 제한부위들을 도입하는 결과를 초래하는, 2 또는 3개의 특이적으로 선택된 코돈의 조합을 사용하였다. 이들 부위는 (a) 후속 단계에서의 카세트 돌연변이 생성 및 스크리닝 연구와 (b) 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 구조물 제조를 용이하게 하기 위하여 선택하였다; (3) 코돈 274-274를 덮도록 유일한 Pst I 인지부위를 고안하여, 동일한 3개의 코돈상에 유사하게 변형된 바실루스 아밀로리퀴파시엔스의 유전자의 터미네이터 서열까지의 접속과, 위치 274에서 알라닌으로 트레오닌을 치환하는 것을 가능하게 하였다; 그리고 (4) 성숙한 코돈 잔기 9-10을 커버하도록 유일한 Nru I 부위를 도입하여, 짧은 합성 이중나선 DNA 링커를 경유하여 GG36의 프레-프로 코딩 서열에의 접속을 가능하게 하였다. 이런 고안을 토대로 하여, 올리고뉴클레오티드(올리고)를, 주어진 ~60b.p. 코딩영역에 대한 코딩 및 비코딩 올리고의 어닐링시에, 그 결과를 이중나선 DNA 단편이 그것의 끝에서 유전자의 다음 이중나선 단편의 끝에 상보하는 단일 스트랜드 영역을 가지도록 합성하였다(제7도 참조).
상술한 바와같이 총 36개의 별도의 올리고(18의 개개의 이중나선을 구성함)를 실행에 사용하여, 그 결과 ~0.8kb 이준나선 합성 성숙 코딩영역을 얻었다(제8도에서 단편 3).
마지막으로, (제8도에서 단편 2를 생성하는) 어닐링시에 5' 끝에서 Nco I 부위를 가지며(성숙한 코돈 5-6에서 GG36의 Nco I 부위에 상보한다), 그의 3' 끝에서 Nru I 부위를 가지는(단편 3의 3'의 5' 끝에 상보한다) 하나의 추가의 쌍 또는 합성 올리고를 합성하였다.
고초균 프로모터와 신호서열의 나머지를 코드화하는 GG36의 서열에 접속된 신호서열을 처음 7개의 아미노산, 완전한 프로서열 및 처음 6개의 성숙한 아미노산(GG-KVNA로부텅의 단편 1), 성숙한 잔기 7-274를 코드화하는 합성 유전자(단편 2+3) 및 바실루스 아밀로리퀴파시엔스의 터니네이터 영역(최종 성숙한 유전자 코돈 279를 포함한다; 단편 4)으로 구성되는 완전한 발현단위를 얻기 휘아여 제6도에서 설명된 바와 같이 4-단계 결찰로서 제조하였다.
최종적으로, 이 완전한 길이의 혼성 유전자의 성숙한 코딩영역에 3개의 추가와 별도의 돌연변이체를 유발시켰다. 먼저, 위치 27의 라이신을 아르기닌으로 치환시키고, 두번째로 위치 104의 발린을 티로신으로 치환시켰으며, 마지막으로 위치 123의 아스파라긴을 세린으로 치환시켰다. 그 결과 형성된 플라스미드를 pBC3-RYSA로 표시한다. 다음 실시예는 합성 유전자의 위치 123을 변형시키기 위해 사용된 방법을 설명한다. 유사한 방법을 이 합성 유전자의 위23 변이체의 상대적인 치 27과 104를 변형시키기 위하여 사용하였다.
실시예 4
위치 123 돌연변이체의 제조
부위 특정 돌연변이 생성(M13에서의 프라이머 연장 돌연변이 생성)을 경유하여 3개의 표현형 사일런트 돌연변이체를 유발시킴으로써 실시예 3으로부터의 합성 유전자의 코돈 111/112상에 Xho I 부위를 도입하였다. 그 결과 형성된 플라스미드 pX123(제9도)을 Xho I과 Ava I으로 소화시켜 큰 벡터-함유 단편을 아가로오스 겔로부터 전기용출에 의하여 분리하였다. 상보하는 합성 올리고뉴클레오티드를 pX123 큰 단편과 어닐링하고 결찰시켜 대장균주 MM294에 형질전환시켰다. 이들 카세트는 개별적으로 위치 123에 모든 20개의 자연발생 아미노산을 코드화하였고, 또한 pX123에서 Xho I과 Ava I부위 사이에 놓여 있는 유일한 Sph I 부위를 파괴한 사일런트 돌연변이를 함유하였다. 대장균 형질전환체로부터의 결과의 플라스미드를 유일한 Sph I 부위의 소실에 대하여 스크린하였다. 제한분석에 의해 양성을 보인 것들(즉, Sph I 음성을 나타낸것들)을 서열화 하여, 소망하는 위치 123 돌연변이의 존재를 확인하여 셔틀벡터 pBS42에 하위클론시키고 발현을 위해 고초균 BG2036에 형질전화시켰다.
실시예 5
다양한 +123 돌연변이체들의 활성
상기와 같이 변형된 +123 돌연변이체들에 의해 코드화된 서브틸리신 돌연변이체 각각의 단백질 가수분해 활성을, 배양 브로스를 원심분리시켜 얻은 상청액 0.04ml과, 0.1M Tris pH8.60 중의 1% w/v 카세트인 0.56ml을 혼합함으로써 측정하였다. 37℃에서 20분 인큐베이션한 다음, 반응액을 10% 트리클로로 아세트산(TCA)으로 침전시킴으로써 팍치시켰다. 10% TCA로 침전시킨 후 상청액에 대한 280nm의 과정에서의 흡광도로부터 활성을 측정하였다.
효소 BC3-RYSA를 코드하는 합성 유전자의 DNA 서열을 최종확인하는 과정에서, 위치 78에 세린(바실루스 렌투스 서브틸리신의 위치 78에 있는 아미노산) 대신 플로린이 있는 것으로 나타났다. 위치 123 돌연변이의 초기특성은 이 효소, BC3-RPYA(위치 78에 프롤린이 있음)에서 시험하였고, 그 결과는 표 I에 나타낸다. 그런 다음 위치 78의 아미노산을 다시 세린으로 변화시켜, 유전자의 그 위치에 해당하는 합성 DNA 이중나선을 대치시킴으로써 제10도에 도시된 DNA 및 아미노산 서열을 형성하였다.
알 수 있는 바와 같이, 위치 +123에서 Ser으로 Asn을 치환시키는 것은 단백질 가수분해 활성의 실질적인 증가를 초래한다. 본원에서 논의된 다양한 서브틸리신들 사이의 관계를 위치 27,78,104,123 및 274에 대하여 표 II에 요약한다.
실시예 6
위치 274 돌연변이체의 안정성
BC3-RPY(바실루스 렌투스 서브틸리신의 위치 27에 아르기닌, 위치 78에 프롤린, 위치 104에 티로신)의 위치 274 돌연변이체의 안정성을 표 III에 나타낸다. 데이타는 60분동안 50mM EDTA에서 37℃에서 인큐베이션한 후에 남아있는 퍼센트로 활성이다.
이 위치에서의 돌연변이체는 명백히 효소의 안정성에 영향을 미친다. 비록 알라닌 돌연변이가 이 위치의 세린 또는 트레오닌처럼 안정하지는 않았지만, 이 효소는 기재된 사용조건하에서 바실루스 렌투스 서브틸리신에 비교하여 월등한 성능을 제공하였다. 상이한 적용에 대해서는 위치 274의 다른 아미노산을 사용할 수 있다.
실시예 7
세제 조성물
다음의 조성을 가지는 분무 건조된 인산염 세제 과립을 제조하였다 :
* 알코올 및 모노에톡실레이트 알코올으 제거됨
** mg 활성효소/g(2.0mg 활성효소/g 스톡)
조성물의 물중의 0.1중량% 용액의 pH는 10.0이었다. 본 발명의 서브틸리신 돌연변이체(제7도)를 포함한 조성물은 갤론(gag)경도(3:1 Ca/Mg)당 6과립으로 95℉(35℃)에서 세척할때, 0.068mg 활성효소/g 생성물의 바실루스 렌투스와 비교하여 효소-민감 균주의 월등한 세척력을 나타냈다.
본 발명의 전반에 걸쳐서 참고는 통상 1- 및 3-문자코드에 의해 다양한 아미노산에 대하여 이루어진다. 그러한 코드는 참고문헌에 나타나 있다[Thomas E. Creighton, eds. W.N. Freeman, N.Y.(1983),p.3].
당업자들에게는, 전반적인 본 발명의 이해로 다양한 변화 및 동등한 변형이, 첨부된 특허청구범위에 의헤 규전된 바와 같이 본 발명의 범주로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있다는 것이 명백할 것이다.
모든 공개물은 보원에 참고문헌으로서 삽입한다.

Claims (12)

  1. 바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신 전구체에서 상기 섭틸리신의 +123 또는 +274에 해당되는 위치에 있는 아미노산 잔기를 상이한 아미노산으로 치환함으로써 상기 전구체로부터 유도되는, 천연상태에서 발견되지 않은 아미노산 서열을 포함하는 서브틸리신 돌연변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 치환이 +123에 해당되는 위치에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 서브틸리신 돌연변이체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 서브틸리신 돌연변이체에서 상기 +123위치의 아미노산 잔기가 세린인 것을 특징으로 하는 서브틸리신 돌연변이체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이체가 바실루스 서브틸리신으로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 서브틸리신 돌연변이체.
  5. 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 +123 위치에 해당되는 아미노산 잔기가 세린으로 변화되어 있는, 자연발생 서브틸리신 전구체 또는 돌연변이 바실루스 서브틸리신 전구체로부터 유도되는, 단백질 가수분해 활성이 개선된 바실루스 서브틸리신 돌연변이체.
  6. 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 서브틸리신의 +123에 해당되는 위치에 세린을 포함하는 바실루스 서브틸리신.
  7. 하기의 아미노산 서열을 가지고 있는 바실루스 서브틸리신 돌연변이체:
  8. 제7항의 서브틸리신 돌연변이체를 코드화하는 DNA.
  9. a) 비이온성, 양이온성, 음이온성 또는 양성이온성 계면활성제; 및 b) 바실루스 아닐로리퀴파시엔스 서브틸리신 전구체에서 상기 서브틸리신의 +123 또는 +274에 해당되는 위치에 있는 아미노산 잔기를 상이한 아미노산으로 치환함으로써 상기 전구체로부터 유도되는, 천연상태에서 발견되지 않은 아미노산 서열을 포함하는 0.01 내지 5중량%의 서브틸리신 돌연변이체를 활성 성분으로 포함하는, 단백질 분해성 효소 세척용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 서브틸리신이 하기의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물:
  11. 제9항에 있어서, 계면활성제가 세제를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 분무 건조된 세제과립을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
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