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KR930008197B1 - 신규의 형광성 염료 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

신규의 형광성 염료
제 1 도는 RNA가 있는 경우와 없는 경우에 PUR-1의 요오드염 용액에 대한 파장(nm)에 따른 흡광도의 변화를 그래프로 그린 것이다.
제 2 도는 RNA가 있는 경우와 없는 경우에 PUR-1의 p-톨루엔술포네이트 염 용액에 대한 파장에 따른 형광성의 변화를 그래프로 그린 것이다.
본 발명은 신규의 형광성 염료, 특히 우선적으로 핵산을 염색시키는 신규한 형광염료에 관한 것이다.
혈액에서 나온 기생체에 의한 감염으로 여러나라에서 건강상의 문제가 제기된다. 이러한 여러나라들은 혈액 또는 혈액 성분등과 같은 생체 샘플내에 들어있는 기생체를 검출하는데 사용 할 수 있는 장치 및 이 장치를 조작할 수 있는 기술자들을 모두 갖고 있지 못하다. 이러한 문제점들을 타개하기 위해 결과를 정확하고 쉽게 판독할 수 있으면서 비용이 적게들고 낮은 기술수준으로도 조작할 수 있는 기구가 개발되었다. 이러한 기구 중 하나는 혈액 샘플을 원심분리하였을때 혈구층중 하나에 뜰 수 있는 비중을 갖는 일반적으로 원통형인 물체(mass)가 들어있는 모세관 튜브로 구성된다. 이 물체는 기생체가 들어있는 세포(cells)를 집어넣는 튜브내에 얇은 환형 공간은 만들므로써 일정한 제한 구역내에서의 기생체가 증가되도록 만들 수 있는 것을 선택한다. 그런뒤 이 튜브를 현미경으로 조사하여 환형 구역내에 존재하는 기생체를 측정한다. 이러한 방법을 이용한 한 기구가 미합중국 특허 제 4,190,328호에 기재되어 있다. 실질적으로 이러한 방법을 사용할 수 있는 장치로는 QBC
Figure kpo00001
시스템(Becton Dickinson Primary Care Diagnostics)이 있다.
그러나 이러한 방법의 단점으로는 어떤 주어진 세포내에 존재하는 기생체의 주요부분에 염료를 부가하지 않기 때문에 이러한 기생체들을 검출하기 어렵다는 점이다. 기생체들은 특정한 숙주(host)내에서 여러가지 다른 발달단계를 거칠수 있다. 이러한 단계들이 사이를 구분하기는 어려우며 이렇게 하기위해서는 어느 정도의 연습과 숙련도가 필요하다. 특정한 단계가 존재하거나 그렇지 않은 것으로부터 감염의 상대적인 심각성 및 감염 단계를 알 수 있다.
미합중국 특허 제4,190,328호에는 기생체의 핵산을 염색하는 멤브레인 투과성 염료로서 아크리딘 오렌지가 기재되어 있다. 그러나, 이 아크리딘 오렌지는 다른 혈구내에서도 투과될 수 있으며 따라서 어느정도 유핵(nucleated)의 백혈구를 염색시킬 것이다. 따라서, 의료인이 감염의 단계를 판정하는 기술이 없을 경우에 아크리딘 오렌지같은 염료를 사용하면 틀린 판정을 내릴수도 있다.
혈액에서 나온 기생체를 분석하는 다른 방법은 실용단계에 사용하지는 않으나 연구용으로 사용할 수는 있다. 이 발명은 유동 혈구계산기(flow cytometer)와 티아졸 오렌지같은 맴브레인 투과성인 핵산 염료를 사용하는 것으로 이루어진다. 이 발명은 최근에 Makler와 그의 동료의 Cytometer, 8 : 568(1987)에 기재되어있다.
일반적으로, 이 방법은 환자로부터 혈액 샘플을 채취한뒤 티아졸 오렌지로 세포를 염색하는 것으로 이루어진다. 이렇게 염색한 세포를 FACScan
Figure kpo00002
(Becton Dickinson Immunocytometry System) 같은 유동 혈구 계산기에 넣어 실행한다. 세포들이 유도 혈구 계산기를 통과할때 한꺼번에 감지구역(sensing region)을 지나치는데 여기서 각 세포들은 아르곤 레이저로부터 보통 488nm인 흥분시기는 파장의 빛에 의해 주사된다. 각 세포로부터 방출된 형광 빛과 산란광은 광 검출기 같은 장치로 검출되며 각 세포는 검출된 모든 광신호를 기초로하여 확인한다.
참고문헌에 기재된 바와같이 유핵 세포(태아의 적혈구 및 모든 백혈구 모두)를 염색하는 배경은 혈소판을 염색하는 것과 동일하다. 비록 백혈구를 염색하여 세포분석에서 "게이티드"아웃(gated out)할 수 있어도 유핵 적혈구 및 혈소판을 염색하여 게이티드아웃할 수 없기 때문에 세포를 가지고 있는 기생체를 판별하는 배경으로서 형광물질을 제공할 것이다.
따라서, 상술한 바와같은 방법을 실행하는 것을 향상시키는데 필요로하는 것은 유핵성 적혈구 및 백혈구, 혈소판을 전혀 염색하지 않거나 또는 아주 적게 염색하면서 혈액에서 나온 기생체들의 핵산을 우선적으로 염색하는 것이다.
본 발명은 다음 일반식을 갖는 핵산 염료로 구성된다.
Figure kpo00003
식중, R은 CH3및 CH2COO-로 구성된 그룹으로부터 선택되고 X-는 할라이드 같은 음이온, PO4 3-, SO4 2-, IO4 -, CLO4 -, NO3 -, NO2 -등과 같은 무기물이온 및 아세테이트, 글루코 -6-포스페이트, D-글루크로네이트 등과같은 유기물 이온, R은 각 위치에서 동일할 필요가 없다.
이 염료는 488nm에서 흥분되는데(최대 흥분, 460nm) 470-550nm사이의 핵산에서 형광을 발하며 478nm에서 최대 방출을 한다. 이 염료는 RNA 및 DNA 핵산 모두를 선택적으로 염색시킨다.
제 1 도는 RNA가 있는 경우와 없는 경우에 PUR-1의 요오드염 용액에 대한 파장(nm)에 따른 흡광도의 변화를 그래프로 그린 것이다.
제 2 도는 RNA가 있는 경우와 없는 경우에 PUR-1의 p-톨루엔 술포네이트 염 용액에 대한 파장에 따른 형광성의 변하를 그래프로 그린 것이다.
본 발명은 선택적으로 핵산을 염색하는 신규의 형광 염료로 이루어진다. 이 염료는 488nm에서 흥분되며 최대 478nm에서 방출한다. RNA가 존재하는 상태에서, 염료의 형광성의 증대는 7,000배 보다 크다. 이 염료의 양자 수율은 약 0.4이다.
이 염료는 표 1에 수록해놓은 다음과 같은 방법으로 합성하였다. 다른 언급이 없는 한 본문에서 취급되는 모든 화합물들은 Aldrich Chemical에서 구입할 수 있는 것이다. 중간생성물 (2) 및 (3)은 Neiman과 그의 동료의 Israel J,Chem.3 : 161 (1965)에 기재된 방법을 약간 변형시켜 제조한 것이다. 중간생성물 (4)는 Brooker와 그의 동료의 J.Am.Chem.Soc.67 : 1889(1945)의 방법으로 제조하였다.
Thomas Hoover의 모세관 융점 기구를 사용하여 융점을 측정한뒤 보정하지 않았다. IBM WP-200SY에 NMR 스텍트럼을 기록하고 테트라메틸실란에 대한 케미칼 쉬프트를 기록하였다. 다음과 같은 조건으로 Brownlee 시아노 4.6×220mm 컬럼을 이용한 광 다이오드 어레이 디텍션(200-600nm)을 갖는 Water 860 two pump시스템으로 반전상(reverse phase)이온 쌍 HPLC를 하여 분석하였다 : 처음으로 pH 6.5의 물내의 50mM 트리에틸암모늄 아세테이트에 5분간 넣어둔뒤 이어서 점차적으로 1시간동안 아세토나이트릴 내의 50mM 트리에틸암모늄 아세테이트에 1시간동안 넣어둔다. Duke 대학의 질량 분광분석기를 사용하여 선명도가 높은 질량 스펙트럼을 얻었다.
[표 1]
Figure kpo00004
3-메틸-6-(메틸티오)퓨린 (2)의 제조 :
둥근 바닥 플라스크에 6-(메틸티오)퓨린(1) 3gm, 메틸-p-톨루엔술포네이트 3.7gm 및 6ml디메틸포름아미드를 넣었다. 이 혼합물을 오일욕조에 넣고 맑은 황색 용액이 될때까지 110℃에서 2.5시간동안 가열하였다.
냉각한뒤에 이 용액에 물 20ml를 넣고 20ml에테르로 세번 추출하여 반응하지 않은 출발물질을 제거하였다. 결합된 에테르성 부분들을 물 20ml로 역-추출한뒤 수성층을 20ml에테르로 세척하고 처음의 수성용액과 합했다. 이 용액에 KOH를 부가하여 PH13의 염기성 용액으로 만들었다. 몇분이 지난후에 용액에서 백색 결정형 고체가 침전되었다. 이 고체를 여과해내 물로 세척한 뒤 공기건조시켰다. 이 백색 고체는 3-메틸-6-(메틸티오)퓨린 (2)로 판명되었다.
3.7-디메틸-6-(메틸티오)퓨린 P-톨루엔술포네이트(3)의 제조 :
둥근바닥 플라스크에 0.80gm의 3-메틸-6-(메틸티오)퓨린 (2)와 0.95gm의 메틸 p-톨루엔술포네이트를 넣었다. 이 혼합물을 100℃ 오일욕조에 넣고 대강 가열하였다. 이 균일하게 만들어진 용액을 냉각시킨뒤 아세톤과 에테르로 세척하였다. 이렇게 세척한 후에, 반응 혼합물이 무정형(amorphous)의 백색 고체로 나타나기 시작했다. 유기 세척물들을 합하여 백색의 결정형 고체가 만들어졌다. 이 물질(3)을 무정형 고체와 합하고 정제하지 않은 채로 PUR-1 합성하는데 사용하였다.
2.3-디메틸벤조티아졸륨 아이오다이드(4)의 제조 :
교반용 금속 막대와 환류 응축기가 달린 둥근바닥 플라스크에 매틸 아이오다이드 4.8gm과 2-메틸벤조티아졸 5gm을 넣었다. 이 플라스크를 오일욕조에 넣어 16시간동안 80℃로 가열하였다. 분홍빛을 띤 백색 고체(4)를 냉각, 분쇄, 아세톤 세척한뒤 여과 하였다.
PUR-1의 제조 :
교반용 자석막대와 환류 응축기가 장치된 둥근 바닥 플라스크에 2.3-디메틸벤조티아졸륨 아이오다이드(4) 1.28gm, 약 1.50gm (4.4mM)의 크루드 한 3.7-디메틸-6-(메틸티오) 퓨리늄 p-톨루엔술포네이트(3), 메탄올 20ml 및 트리에틸아민 0.5ml을 넣었다. 이 혼합물을 약 45분간 환류시켜 황색 고체가 들어있는 붉은색 용액을 만들었다. 이 물질을 냉각, 여과한뒤 메탄올과 에탄올로 세척하여 다음 일반식을 갖는 노란-오렌지색 고체를 얻었다 :
Figure kpo00005
이 물질은 3-메틸-2-[(3,7-디메틸-6-퓨리닐리덴)-메틸]-벤조티아졸륨(PUR-1)으로 판명되었다. PUR-1은 바람직한 염료의 예이며 다음과 같은 특성을 갖는다. mp=340-345℃, NMR (CD3OD) δ 3.97(s,3H), 3.99(s,3H), 4.27(s,3H), 6.56(s,1H), 7.39(t,1H), 7.57(d,1H), 7.80(d,1H), 8.04(d,1H), 8.54(s,1H), 및 8.85(s,1H) ; HPLC (한 성분에 대한 체류시간 30분), UV max. =448nm, C16H16N5W1I1(M+)에 대한 선명도가 높은 FAB-MS 이론치-310,1126. 실측치-310,1136.
2,3-디메틸벤조티아졸륨 아이오다이드 대신에 2,3-디메틸벤조티아졸륨 p-톨루엔술포네이트를 사용하여 p-톨루엔 술포네이트염을 만들었다. 200MHz 2NMR분광기로 확인할때 PUR-1의 p-톨루엔술포네이트염은 다음과 같은 특성을 갖는다. NMR(CD3OD) ; δ 8.66(s,1H) ; 8.31(s,1H) ; 7.9-7.2(m,8H) ; 6.55(s,1H) ; 4.28(s,3H) ; 4.03(s,3H) ; 3.98(s,3H) ; 2.30(s,3H).
음이온 교환방법을 이용하여 아이오다이드 형태로부터 다른 염 형태들을 만들었다. 대략적으로 Brownlee Aquapore Anion 10×250mm컬럼을 통해 1분당 2.0ml로 유출물을 펌핑하였다. 이 컬럼을 약 100ml의 물로 세척하고 이어서 교환하려고 하는 나트륨의 0.10M 음이온 염 용액 10ml를 사용하여 평형상태로 만들었다. 물200ml로 컬럼내에 있는 과량의 완충액을 빼냈다. 염료의 아이오다이드염을 컬럼에 넣고 물과 아세토나이트릴 1 : 1용액 및 물을 사용하여 용출시켰다.
이러한 방법으로 다음의 표 2에 수록한 PUR-1의 염을 만들었다.
[표 2]
Figure kpo00006
이러한 방법으로 만든 PUR-1의 PO4 3-및 SO4 2-형은 PUR-1의 아이오다이드 형태보다 더 잘 녹는다는 것을 발견하였다. 따라서, 분석하기위해 혈액 또는 기타 혈액성분들을 집어넣는 모세관 튜브를 피복할 때 아이오다이드 형태 보다는 이러한 형태의 PUR-1들을 사용하는 것이 바람직하다.
질소에 붙어있는 메틸 그룹중 하나 또는 모두를 CH2COO-로 치환시키면 PUR-1의 아이오다이드 형태의 용해도를 향상시킬 수도 있다. 이렇게 하기위해 화합물 3을 합성하는데 있어 메틸 p-톨루엔술포네이트 대신 브로모아세트산을 치환할 수도 있다.
제 1 도에서 메탄올 내의 PUR-1의 p-톨루엔술포네이트염 1mM 용액을 만들었다. 이 용액을 PBS(인산염으로 완충시킨 살린)에 2×10-5의 농도로 희석시키거나 또는 PBS 1ml당 1mg의 RNA(토룰라 효모, Sigma Chimical Co.)를 함유하는 용액에 2×10-5M의 농도로 희석시켰다. RNA가 없는 경우 최대 흡광도는 448nm(ε=6.3×104M-1cm-1)이였고 RNA가 있는 경우의 최대 흡광도는 459nm(ε=6.0×104M-1cm-1)이었다.
제 2 도에서, PBS 내의 PUR-1 용액(100μM)을 만들었다. 3ml 큐벳에 PBS 2.97ml와 PUR-1 용액 30ml를 넣었다. 흥분파장을 460nm로 하여 이 용액의 형광 방출을 측정하였다. RNA가 없는 경우에는 형광을 목격할 수 없었다. 두번째 큐벳에 PBS 2.97ml, RNA 용액(1mg/ml, 0.3ml) 및 PUR-1 의 용액 30μℓ를 넣었다. 상기한 바와같이 형광방출을 측정하였다. 최대 478nm에서 넓은 방출 커브가 만들어졌으며 대략적인 양자 수율은 0.4였다.
본 명세서에서 언급된 모든 공고 및 특허출원은 본 발명에 포함되는 업계의 일반적인 기술 수준을 나타낸다.
업계의 숙련자들은 본 청구범위의 영역 또는 의도에서 벗어남이 없이 본 발명을 변형, 개조할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

Claims (9)

  1. 다음 일반식을 갖는 화합물
    Figure kpo00007
    식중, R은 CH3및 CH2COO-로 구성된 그룹으로부터 선택되고, X-는 음이온, n은 정수.
  2. 제 1 항에 있어서, 음이온이 할라이드인 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, 음이온이 PO4 3-, SO4 2-, IO4 -, ClO4 -, NO3 -및 NO2 -로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서, 음이온이 아세테이트, 글루코스-6-포스페이트 및 D-글루크로네이트로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물.
  5. 제 2 항에 있어서, X-가 I-이고 R이 CH3인 화합물.
  6. 제 3 항에 있어서, X-가 I-이고 R이 PO4 3-또는 SO4 2-인 화합물.
  7. 생물학적 샘플과 제 1 항의 화합물을 접촉시키는 것으로 구성된 생물학적 샘플내의 핵산을 염색하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 샘플이 혈액 또는 혈액 성분인 방법.
  9. 다음 일반식을 갖는 화합물.
    Figure kpo00008
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