KR920000117B1 - 새로운 세라티오펩티다제와 그 제조방법 - Google Patents

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새로운 세라티오펩티다제와 그 제조방법

제1도는 본 발명에 따라 세라티아 마르세선스(Serratia marcescens ATCC 21074)로부터 세라티오 펩티다제유전자를 클로닝하는 선별공정도(a)와 서던표지(Southern blot)를 확인해주는 사진(b)이다.

제2도는 본 발명에 있어서 얻어진 초기클론(Clone)인 재조합 플라스미드 pSP 116으로부터 연속적으로 클론을 제조하는 공정도이다.

제3도는 본 발명에 있어서의 유전자 조작에 따른 재조합 플라스미드 pSP 119의 유전자지도이다.

제4도는 본 발명에 따른 세라티오펩티다제의 단백질을 코딩하는 유전자의 염기배열을 나타낸 것이다.

제5도는 본 발명에 따른 세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자의 3´말단부위인 전자종결부위의 2차구조(a)와 5´-특이염기서열(b)을 나타낸 것이다.

제6도는 본 발명에 따른 재조합 신규주로부터 생산된 세라티오펩티다제의 SDS-PAGE 확인사진(a)과 정제 단백질의 생화학적특징인 최적 pH 조건(b) 및 최적온도조건(c)을 나타낸 그래프이다.

제7도는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pSP 119를 가지는 대장균 HB101의 세라티오펩티다제의 시간별 생성을 나타낸 그래프(a)와 그의 구역별활성도 및 β-갈락토시다제의 활성에 의한 세포파괴여부를 조사하기 위한 그래프(b)이다.

제8도는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pSP 119를 가지는 세라티아 마르세선스 ATCC 21074 형질전환체와 그 모균주에 있어서이 배양시간별 세라티오펩티다제의 생산성향상을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 유전자조작에 의해 얻어지는 새로운 세라티오펩티다제의 제조에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 공지의 세라티아속 균주로부터 세라티오펩티다제 유전자를 클로닝하여 선별하고, 유전자조작에 의해 대장균 및 무균주로부터 얻어지는 세라티오펩티다제와 그의 제조방법에 관한 것이다.

세라티오펩티다제(Serratiopeptidase)는 소염효소제로써 널리 사용되고 있으며, 누에로부터 분리된 세라티아속(Serratia sp.)으로부터 분리된다.

이중 세라티아 마르세선스(Serratia marcescens ATCC 21074; Serratia sp. E-15)로부터 분리된 세라티오펩티다제는 전술한 바와같이 소염효소제로써 뿐만아니라, 비부강염등 여러 용도로서 사용되고 있다.

이와같은 세라티오펩티다제의 세라티아속 E-15로부터 순수분리된후 [Miyata 등, Agr. Biol. Chem. Vol, 34, p 310~318, 1970], 효소의 생화학적 특성이 밝혀졌으며, 또한 세라티아 마르세선스 ATCC 25419로부터도 많은 종류의 펩티다제가 분리, 동정되었다[Decedue등, Bio-chimica et Biophysica Acta, Vol 569, P293~301, 1979].

이와같은 세라티오펩티다제를 생산하는 세라티아속균주는 그람음성(gram-negative)균주로서, 많은 종류의 단백질을 배지내로 분리하며, 따라서 상대적으로 그 정제가 매우 용이한 것으로 알려져 있다.

한편, 이러한 세라티오펩티다제를 생산해내기 위해서, 종래에는 재래식 발효공법을 이용하여 대량생산을 하였으나, 최근에는 분자 생물학의 발전으로인해 이를 암호화하는 유전자를 대장균에 이식하여 목적하는 단백질을 안정되고도 대량적으로 생산할 수 있게되었다.

그러나, 지금까지의 유전자 조작 균주 및 조작된 유전자로부터 발현되는 단백질을 대장균체계(System)에서 이용하려할 때 가장 큰 단점으로는 목적산물의 체내축적으로 야기되는 발현산물의 불활성화 및 소실이 문제점으로 지적되고 있다.

그렇지만, 바실러스속(Bacillus sp.)과 같은 그람양성균은 단백질을 체외로 분비하는 특수한 기작이 알려져 있으며, 따라서 생성된 단백질의 안정적인 유지가 가능하게 되었다. 또한, 세라티아속으로부터 생성되는 단백질 분해효소나, 뉴클레아제(nuclease)등은 세라티아속이 그람-음성균임에도 불구하고 체외로 분비된다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 점에 착안하여 종래에 유전자조작으로부터 발현되는 단백질을 대장균을 이용하여 생성하고자할 때 목적산물의 체내축적으로인한 문제점을 해결하고자, 세라티아속 균주로부터 세라티오펩티다제 유전자를 분리해내고 이를 유전자조작에 의해 클로닝한 다음, 숙주미생물인 대장균으로부터 이의 체외분비를 가능하게 함으로써 세라티오펩티다제를 생성해내도록 하는데 그 목적이 있다.

이러한 본 발명의 목적을 수행하기 위해서 이해하여야 할 몇가지의 기본용어를 설명하기로 한다.

세라티아속(Serratia sp.)이라함은 세라티아속 E-15 또는 세라티아마르세선스 ATCC 21074를 뜻한다.

분비(Excretion)이라함은 생성된 단백질의 배지내로의 이동을 말한다.

오픈리딩프레임(Open reading frame)이라함은 본 발명에 있어서 세라티오펩티다제를 암호화하는 염기서열의 첫 ATG 개시 코돈으로부터 말단 TGA까지의 DNA를 말한다.

전구단백질Prepro-protein)이라함은 세라티오펩티다제가 세포내에서 만들어져서 배지내로 분비되기전에 세포지속에 존재하는 보다 큰 크기의 단백질을 말한다.

유전자지도(Restriction map)라함은 유전자를 제한효소로 절단하여 전기영동상으로 확인한 유전자구조를 말한다.

염기서열(sequence)이란 특정한 단백질을 암호화할 수 있는 특정한 오프리딩프레임(Open reading frame)의 DNA 배열을 말한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 세라티아 마르세선스로부터 생산되는 세라티오펩티다제에 있어서, 프리(pre), 프로(pro) 및 성숙형으로 구성된 분자량이 38,588달톤인 전구형 세라티오펩티다제를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 세라티아 마르세선스로부터 생산되는 세라티오펩티다제에 있어서, 어떤 전서열 및 개시코돈에 의한 아미노산을 수반하지 않는 분자량이 약 33,500달톤인 성숙형 세라티오펩티다제를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 세라티오펩티다제를 제조하는 방법에도 특징이 있는바, 세라티아 마르세선스 ATCC 21074의 숙주 DNA를 제한효소 BanHI으로 절단하여 유전자조작에 의해 상기의 분자량 약 33,500달톤을 갖는 성숙형 세라티오펩티다제를 제조할 수 있다.

이때 상기 세라티오펩티다제는 그 초기의 생성 세라티오펩티다제가 전구(prepro)형태이고, 상기의 성숙형 세라티오펩티다제는 조작된 유전자로 형질전환된 숙주미생물의 체외로 분비되어 그 배양액으로부터 수득되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 분자량이 약 33,500달톤인 세라티오펩티다제를 코딩하는 1059개의 염기쌍으로 구성된 유전자를 그 특징으로 한다.

이러한 세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자는 첫째, 그의 5´말단부위에 23개의 프리(pre)형태의 아미노산을 코딩하는 유전자를 가지고 있으며, 둘째, 프리(pre)형태의 아미노산이 met-pro-ala-gln-arg-met-arg-ser-val-ile-pro-pro-tyr-met-leu-arg-ala-leu-leu-thr-arg-tyr-ala의 서열을 가지고, 셋째, 33,500달톤의 세라티오펩티다제와 전구(prepro)형태의 단백질을 코딩하는데 필요한 프로모터(promoter)부위를 가지고 있으며, 넷째, 그 프로모터는 GGT CAC GAC GGC GTA CCA GCT GCT GCA GCG GCG CAT GCT GCG CGC CGA CGC GCC GCC GTG CAA CCT GCT GCT GCA TGG CCG GTT GGC GGT ACC ACC GCC TCG GAG CGC GCA TCA GTC CCA CAA CAA GAC CAC CCC GGC GGT GAG CAC GCA TAA CCA CAG GCT TTA TGA CGA GTA GAC TAC ACT TAG GCT CAG TGC ATT CAT TCG ATG AGG TAA ATT TTT TGC CTA AGG AGA GCC ACT인 염기서열이고, 다섯째, 그 활성부위에서 5´GAC/AAC/GGC/GGC/GTG/ CAC/CTC/AAC/TCC /GGC/ATT/CCC/AAC/CGC/GCG/TTC/TAC 3´의 염기서열을 가지며, 여섯째, 그 전사종결코돈뒤에 연속적인 3개의 전자종결고리(transcription terminator)를 가지고 있으며, 일곱째, 상기 전자종결고리는 5´G C G A G G G A G G C T T C G C T A C A T T T C C C A A C T - G G C A G G G C C A G C G C G C A A T T T G C A T G T A T - CACGCCGGAGCAACGCATGCGCCTGAA TCAGTTGCTGAATCAGACGCTGCCGTACGCC3´염기서열을 가지고 있는 것을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 유전자 종결부위의 염기서열이 5´GCGAGGGAGGCTTCGCTACATTT CCCAACT-G G C A G G G C C A G C G C G C A A T T T G C A T G T A T - CACGCCGGAGCAACGCATGCGCCTGAATCAGTTGCTGAATCAGACGCTGCCGTACGCC3´ 씨퀀스(Sequence)를 포함한다.

또한, 본 발명은 1.7kb의 세라티아 마르세선스로부터 유래된 프로모터, 유전자 및 전사종결부위를 함유하고 있는 대장균 HB101에서 안정적으로 세라티오펩티다제를 발현시키는 재조합 플라스미드 pSP 119를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기의 세라티오펩티다제를 발현시키는 재조합 플라스미드 pSP 119를 가지는 형질전환체로서, 대장균 SNUDZ 119(E. coil SNUDZ 119)로 명명된 균주로 포함하는바, 이 대장균 SNUDZ 119는 1990년 2월 2일자로 한국과학기술원 유전공학센터 유전자은행에 기탁번호 제KCTC 8480P호로 기탁되었다.

또한, 본 발명은 상기의 세라티오펩티다제를 발현시키는 재조합 플라스미드 pSP 119를 모균주내로 역도입시킨 형질전환체로서, 세라티아 마르세선스 SNUDZ 119(Serrtia marcescens SNUDZ 119)로 명명된 균주를 포함하는바, 이 세라티아 마르세선스 SNUDZ 119는 1990년 2월 2일자로 한국과학기술원 유전공학센터 유전자은행에 기탁번호 제KCTC 8471P호로 기탁되었다.

이와같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따르면, 이미 세라티오펩티다제의 분비균주로 알려져 있는 공지의 세라티아 마르세선스 ATCC 21074로부터 숙주 DNA를 절단하여 유전자조작에 의해 세라티오펩티다제 유전자를 클로닝 및 선별하고, 대장균 HB101에서 안정적으로 세라티오펩티다제를 발현시키는 재조합 플라스미드 분리한 다음, 이를 대장균 HB101에 형질전환시켜서 형질전환체인 신균주 대장균 SNUDZ 119(기탁번호:KCTC 8480P)를 얻거나, 모균주인, 세라티아 마르세선스에 형질전환시켜 형질전화체인 신균주 마르세선스 SNUDZ 119(기탁번호:KCTC 8481P)를 얻어내고, 얻어진 신균주로부터 체외로 분비되는 배양액에서 상기와 같은 새로운 세라티오펩티다제를 제조할 수가 있다.

이러한, 본 발명에 있어서의 세라티오펩티다제를 제조하기 위해서는 세라티오펩티다제 유전자 조작기술에 의해서 다음의 몇가지 공정을 연속적으로 수행하여야만 대장균에서의 발현, 분비, 분리, 동정 및 염기서열 분석이 가능하게 된다.

이러한 공정들은 모두가 본 발명에 있어서의 주요과정이 되는데, 이를 공정별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

A.세라티오펩티다제 유전자의 클로닝 및 선별

세라티오펩티다제의 분비균주로 이미 공지된 세라티아 마르세선스 ATCC 21074를 배양하여 원심분리한 후, 세포를 라이소자임(lysozyme)이 함유된 완충용액에 녹여 부분용해시키고, 이온성 세제(ionic detergent)가 함유된 완충용액에 20분간 방치함으로써 세포를 완전용해시킨다.

용해된 상기 반응물을 동량의 페놀/클로로포름 추출액을 첨가하여 10분간 진탕시켜, 원심분리하고, 상등액을 취한다.

위과정을 2~3회 반복한후, 최종의 상등액에 차가운 에탄올을 최종농도가 70%가 되도록 하여, 유리막대로 저으면, 세라티아 마르세선스 균의 염색체 DNA를 얻을 수있다.

이 추출된 DNA를 제한효소 BamHI으로 절단한 후, 또한 BamHI으로 절단된 플라스미드 클로닝 벡터인 pUC9과 접합(ligation)시킨후, 대장균 HB101에 형질전환시켰다.

이 형질전환체를 37℃에서 하룻밤 배양시킨후, 얻어진 균을 10% 카제인(casein)이 함유된 배지에 옮겨, 맑고 투명한 환(zone)을 보이는 균주를 선별하였다.

한편, 형질전환체 약 10,000개 중에서, 1개의 균주 즉, 형질전환체인 대장균 SNUDZ 116(E. coil SNUDZ 116)으로 명명된 균주가 콜로니(colony)주위에 환을 형성함으로써, 세라티오펩티다제를 생성하는 유전자가 대장균에 이식되었으며, 이식된 대장균은 모균주에서 유래한 세라티오펩티다제를 안정하게 생성하였음을 보여주었다.

이러한 공정은 첨부도면 제1a도에 나타내었으며, 제1b도에서는 상기에서 실시한 서던표지에 의한 방사선 감광사진(m a b c d e로 표시된 사진)과 아가로스 전기영동(A B C D E로 표시된 사진)을 나타낸 것이다.

이와같이 본 발명에서는 초기 클로닝된 세라티오펩티다제 유전자를 함유한 대장균 HB101을 대장균 SNUDZ라 명명하였다.

상기와 같은 공정에 의해 얻어진 형질전환체인 대장균 SNUDZ 116은 다음과 같은 특성을 갖는다. 첫째, 항생제 앰피실린(ampicillin)에 내성을 가진다. 둘째, 4.8kb의 세라티오펩티다제 유전자를 함유하고 있다. 셋째, 클로닝된 세라티오펩티다제를 체외로 분비한다.

B. 세라티오펩티다제 유전자의 동정 및 서브클로닝(Subcloning)

상기 선별된 균주에서 재조합 플라스미드를 공지의 알칼리방법(Birnboim과 Doly, 1979, Nucleic Acids Res, 7; 1513-1523) 및 CsCl-EtBr 농도구배원심분리법(Maniatis등 1982, in Molecular Cloning)에 의해 분리하였다. 이 분리된 플라스미드를 본 발명에서는 재조합 플라스미드 pSP 116이라 명명하고, 동정하였다.

상기 재조합 플라스미드 pSP 116을 클로닝시 사용한 동일한 제한효소 BamHI으로 처리하여 아가로스 전기영동으로 확인한결과 4.8kb의 외래유전자(foreign DNA)를 함유하고 있었다.

이 유전자를 분리하여 방사선 동위원소를 이용하여, 표지한후, 공지의 하이브리다이제이션(hybridization)를 실시하였다.(Southern, 1975. J.Mol.Biol. 98:503~517).

도면 제1b도는 이 결과를 보여준다. 제1b도에서 보듯이, 유래된 4.8kb 유전자는 모균주의 유전자 집단에서, 오직 한 개의 양성표지(positve-band)를 보임으로써, 이 유전자가 모균주인 세라티오펩티다제로부터 유래되었음을 보여준다.

따라서, 상기와 같이 확인된 재조합 플라스미드 pSP 116은 다음과 같은 몇가지의 특성을 지닌다.

첫째, 재조합 플라스미드 pSP 116은 4.8kb의 세라티아 마르세선스로부터 유래한 유전자를 함유하며, 둘째, 이 4.8kb의 유전자는 대장균 HB101에서 안정적으로 발현되며, 이 발현산물은 세라티오펩티다제의 일종이고, 셋째, 재조합 플라스미드 pSP 116은 앰피실린에 저항성을 가지는 유전자를 함유한다.

상기의 재조합 플라스미드 pSP 116은 4.8kb의 큰 외래 유전자를 함유하고 있으므로 세라티오펩티다제를 생성하기 위한 최소한의 길이를 알아보기 위해, 여러 제한효소 및 유전자 변형효소 Ba131을 사용하여, 서브클로닝하였다.

제2도는 이러한 서브클로닝의 방법을 보여준다. 먼저 pSP 116의 HincII위치를 제한효소 HincII로 절단한 후, 큰 절편을 재접합하여 재조합 플라스미드 pSP 117을 만들었다.

이 pSP 117을 제한효소 BamHI으로 절단한 후, Ba131효소를 사용하여 양쪽방향으로 주어진 시간동안 반응시킨후, 재접합하여 전지분유를 함유한 배지에서 환을 보이는 균주만을 선별하고, 그중에서 최소의 크기를 가진 두 균주를 분리하고, 플라스미드를 분리하여 재조합 플라스미드 pSP 119와 pSP 118을 만들었다. 또한, 상기 재조합 플라스미드 pSP 118로부터 플라스미드 pSP 120을 만들기 위하여 제한효소 HindIII를 사용하여 절단한후 상기와 같이 Ba131을 처리하였다.

다음 표 1은 이와같이 얻어진 각 클론들의 특징과, 유전자 절편의 크기, 형질발현등의 유무를 나타낸다.

[표 1]

상기 중에서 플라스미드 pSP 120은 클로닝벡터(Clon-ing vector)자체에서 유래된 형질발현 기구중의 하나인 락토오스(lactose)프로모터가 제거되었음에도 불구하고 단백질 분해능을 지니고 있으므로, 세라티오펩티다제를 생산하는 유전자는 자체적으로 기능할 수 있는 프로모터를 가지고 있으며, 이는 대장균에서 능히 발현에 관여하고, 작동되는 것으로 밝혀졌다.

제3도 상기 여러 재조합 플라스미드중 pSP 119의 유전자 지도를 나타낸다. 플라스미드 pSP 119는 세라티오펩티다제 코딩(Coding)하는 유전자로서 1.7kb의 크기를 가지고 있으며, 항생제 앰피실린에 저항성이 있고, 유전자내에 흔히 있는 제한효소인 EcoRI이나, BamHI, HindIII등이 없다는 특징이 있다.

C. 세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자의 염기서열분석

상기한 세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자의 염기서열을 밝히기 위하여 공지의 방법인 다이데옥시체인 종결법(dideoxy chain-termination methods:Sanger et al, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74:5463-5467) 및 연속적 유전자 크기줄임법(DaLe et al. 1985. Plasmid, 13:31-40)을 사용하였다.

먼저 플라스미드 pSP 119로부터 제한효소 SspI과 HindIII를 사용하여, 1.7kb의 외래 유전자를 분리한 후, 이를 M13 파아지의 복제형(Replicative form)의 HincII와 HindIII에 접합시킨 형질전환시켰다.

이때 나온 플라크(Plaque)중에서 투명한 플라크(Colorless plaque)를 선별한 다음, 복제형 플라스미드를 분리하여 동정하고, 이로부터 외가닥으로된 파아지 수퍼코일(Supercoil)DNA를 추출하였다.

여기에, 합성 올리고머(Oligomer)인 RD20(5´-CGACGGCCAGTGAATT CCCC-3´)을 접합시켜 제한효소 EcoRI으로 처리하여 선형으로 만든다음, 유전자변형효소인 T4 DNA 중합효소의 3´→5´의 엑소뉴클레아제(exonuclease)이 기능을 이용하여 다양한 크기의 선형 외가닥 DNA를 얻었다.

여기서 말단헥산 전이효소(Terminal deoxynucleotidyl transferase; TdT)를 이용하여, 3´ 말단에 수개의 dG를 연결시키고, 다시 자체접합을 시험관에서 원형으로 만든후 M13파아지에 다시 형질전화시꼈다.

그 다음에는 이를 37℃ 항온기에서 하룻밤 방치시킨 후, 얻어진 플라크를 선별하여 다양한 크기의 외가닥 원형 DNA를 아가로스 전기영동에 의해 확인한다음, 이 외가닥 원형 DNA만 순수 분리하였다.

이 DNA를 클레누(Klenow) 효소법이나, 시쿼나제(Sequnase)법 (Toneguzzo et al, 1988, Biotechnique, 6:460-469)을 이용하여, 염기서열을 분석하였다.

제4도는 이렇게 얻어진 세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자 염기서열을 보여준다. 제4도에서 나타낸 유전자 염기서열은 아래의 몇가지 특징을 보였다.

첫째, 세라티오펩티다제 유전자는 352개의 아미노산을 코딩하는 1059개의 염기로 구성되어 있으며, 둘째, 따라서 세라티오펩티다제는 352개의 아미노산으로 구성되어 있고, 이는 계산값으로 분자량 약 38,588달톤이다. 셋째, 352개의 아미노산으로 만들어지는 분자량 38,588달톤은 실험치인 분자량 33,500달톤보다 크며, 이는 이 유전자가 성숙형으로 변형되기 이전의 형태인 전구(prepro)형으로 되어있다는 것을 나타낸다. 넷째, 본 발명에서 나타난 세라티오펩티다제는 대장균에서 형질발현이 되며, 이는 모균주인 세라티아 마르세선스에서 유래된 형질발현기구인 프로모터를 사용하며, -10 지역으로서 4´-TTCATT-3´을, -35 지역으로서 5´-CTTTATG-3´을 가지며, 개시코돈으로부터 윗쪽으로 8염기 위에 있는 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno)서열로서 AGGA를 가지고 있다. 다섯째, 전사종결코돈으로 TGA를 가지며, 이로부터 아랫쪽으로 약 8염기 뒤에, 전사종결고리(transcri-ption terminator)가 존재하며, 이와같은 전자종결고리가 3개로서 연속적으로 나타난다. 여섯째, 본 발명에 사용된 세라티오펩티다제 유전자는, 이미 공지된 그람 양성균 주인 바실러스 속으로부터 분리된 여러 중성단백질 분해효소(neutral protease)와 활성부위(active site region) 근처에 매우 잘 보존된 염기서열을 보이는데, 특히 17개 아미노산중 14개가 매우 잘 보존(conserved)되어 있다는 것이다.

첨부도면 제5도는 상기의 특징을 갖는 제4도의 염기서열에서 3´의 전사종결부위 뒤의 전사종결고리(a)와 5´의 유전자 발현기구인 -10, -35 및 샤인달가르노 염기서열(b)를 보여준다.

제5a도에서 보면 3개의 연속적인 전사종결고리가 보이는데, 위에있는 지역 I, II, III의 일차원적인 염기서열이 그 아래에 있는 비교적 안정적인 2차구조를 이루게되므로서 강력한 전사종결을 유도한다.

또한, 제5b도에서는 형질발현기구로서 5´말단의 비전사지역 내에 있는 각 구역별 특이염기서열을 나타낸 것인데, -10, -35 및 샤인 달가르노 서열을 보여주며, 해독개시코돈인 ATG이후의 프리(pre), 프로(pro)지역 및 성숙형 세라티오펩티다제의 코딩부위를 나타내 보여주고 있다.

D. 재조합 세라티오펩티다제의 분리 및 동정

세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자를 함유한 재조합 플라스미드 pSP119를 가진 대장균 HB101을 2ℓ의 LB배지에서 배양한 후 균체를 수거하였다. 이를 100mM Tris-HCl(pH 7.0)의 완충용액에 녹인 후, 프렌치압력기(French press)로서 기계적으로 세포를 파괴한 후, 상등액을 15,000×g로 원심분리하여 수거하였다.

이 상등액을 이용하여 초미립여과(ultrafiltration), DEAE-세파로스(DEAE-Sepharose) 및 세파덱스(Sephadex) G-100의 수지를 연속적으로 통과시켜 정제 세라티오펩티다제를 얻었다. 다음의 표 2는 그 정제결과를 나타낸다.

[표 2]

상기와 같이 정제된 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드(SDS-polyacrylamide:SDS-DAGE) 전기영동법에 의해 측정한 결과 분자량이 약 33,500달톤으로 판명되었으며, 이는 염기서열분석에서 보인 바와 같이, 전구형태(prepor-form)인 38,588달톤 보다 작은 완성형(mature-form)임을 나타낸다.

제6a도는 이렇게 생산된 세라티오펩티다제의 SDS-PAGE확대사진을 나타낸다. 또한 이 정제 세라티오펩티다제는 최적 활성이 온도 50℃, pH 8.5에서 보여졌으며, 제6b도와 제6c도는 각각 이를 나타낸다.

이와 같이 본 발명에서 얻어진 새로운 세라티오펩티다제는 몇가지 점에서 공지의 효소와 다른점이 있다. 즉, 분자량이 약 33,500달톤으로서, Nakahama등(1986, Nucleic Acids Res.14; 5843-5855)의 51,000달톤이나 Yanagida등(1986.J.Bact eriol.166;937-944)의 43,000달톤과 크기에 있어서 다르고, 또 본 발명에서 밝혀진 세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자의 크기는 1059염기쌍으로서, 상기 두 종류의 공지의 그것보다 상대적으로 작고 DNA염기서열이 다르다는 점에서 확연히 구별된다.

또한, 유전자의 구조에 있어서, 본 발명에서 밝혀진 세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자가 5´말단에서 건구부위, 즉 프리프로(prepro)가 존재하는 반면, 상기의 Nakahama 등의 그것은 5´말단에 오직 프로(pro)부위만 있고, 또한 Yanagida등의 그것은 5´말단에 프리(pre)가, 3´말단에 프로(pro)가 있음으로서, 그 구조에 있어서 현격한 차이를 보이고 있음으로 보아, 본 발명에서 밝혀진 세라티오펩티다제는 지금까지 보고되지 않은 전혀 새로운 것임을 알 수 있으며, 이는 미국의 유전자은행 컴퓨터에 수록된 20,000개의 염기서열과 비교하였을때도 전혀 동일한 염기서열이 존재하지 않는 것으로 확인되었다.

E. 재조합 세라티오펩티다제의 대장균에서의 형질발현 및 세포의 분비

상기 재조합 플라스미드 pSP119를 함유하는 대장균 HB101인 대장균 SNUDZ119(기탁번호:KCTC 8480P)를 2ℓ의 LB배지에서 배양시켜서 성장곡선 및 세라티오펩티다제의 발현을 조사하였다.

제7도는 이와 관련된 것인 바, 제7a도는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pSP119를 가지는 대장균 HB101인 대장균 SNUDZ119에 대한 세라티오펩티다제의 시간별 생성을 나타낸 그래프로서, 배양시간별 성장곡선(●-●)과 24시간 배양후부터의 세포외활성(▲-▲)이 늘어나며, 세포내활성(■-■)은 감소함을 알 수 있다. 또한 세포에 연결된(Cell-bound)(○-○) 활성을 배양 후 18시간 이후에 현격히 감소됨을 알 수 있다.

또한, 제7b도의 (b)는 24시간 이후의 세포성장에 따른 세라티오펩티다제의 구역별활성도 및 β-갈락토시다제의 활성에 의한 세포파괴여부를 조사하기 위한 것으로서, 이로부터 세포외활성(■-■)이 늘어나며, 세포내활성(△-△)은 감소하지만, 세포사이의 공간(periplasm)에서의 활성(●-●)은 거의 변화가 없다.

또 90%이상의 β-갈락토시다제가 세포내(△-△)에 존재하고, 세포외(●-●)에는 거의 존재하지 않음으로서, 장시간의 배양에도 불구하고 세포의 용해가 일어나지 않음을 알 수가 있다.

제7도에서 보는 바와 같이 생성된 세라티오펩티다제의 생체외 분비는 그람-음성균에서는 좀처럼 일어나지 않는 현상으로서, 이러한 것이 본 발명의 매카니즘중에서 가장 큰 장점중의 하나이다.

F. 재조합 플라스미드 pSP119의 모균주내로의 역도입 및 발현

재조합 플라스미드 pSP119는 전술한 바와 같이 자체의 프로모터를 가지고 있으며, 또한 유전자가 세라티아속으로부터 유래되었으므로, 이 플라스미드를 모균주인 세라티아 마르세선스 ATCC 21047에 역도입(back-transfor-mation)시키면, 모균주의 세라티오펩티다제의 생산능력이 향상될 수 있다.

본 발명에서는 재조합 플라스미드 pSP119를 모균주인 세라티아 마르세선스 ATCC 21074에 역도입하여 형질발현시킨 결과, 세라티오펩티다제의 생성능(productivity)이 2배가 증가된 균주를 얻을 수 있었다.

제8도는 이 결과를 나타낸 것으로서, 제8도에서 보듯 이 모균주에 비해 월등히 향상된 생성능력을 볼 수 있다. 이 균주를 본 발명에서는 세라티아 마르세선스 SNUDZ 119(기탁번호:KCTC 8481P)라 명명하였다.

[실시예 1]

[세라티오펩티다제 유전자의 클로닝 및 선별]

세라티오펩티다제를 생성하는 모균주인 세라티아 마르세선스 ATCC 2074를 2ℓ의 LB배지(10g yeast extract, 5g 트립톤, 5g NaCl)에서 37℃ 조건으로 하룻밤 배양한 후, 균체를 6,000rpm에서 10분간 회수하였다. 이를 VS용액 0.15M NaCl, 0.1M EDTA(pH 8.0)과 25% 수크로오스(Sucrose) 및 100mg의 라이소자임(lysozyme)이 함유된 완충용액에 현탁시켜 37℃에서 30분간 방치시켰다.

여기서 150ml의 TSS완충용액(0.1M Tris-HCl(pH9.0) 0.1M NaCl, 1% SDS)을 첨가하여, 세포를 용해시킨 후 NaCl을 최종농도 1M이 되게 첨가하였다.

이 용액에 동량의 포화 페놀/클로로포름(1M Tris-HCl(pH 9.0)+페놀+클로로포름)을 넣어, 세 번 추출하고, 상등액을 9,000rpm에서 원심분리하여 회수하였다.

이 상등액에 차가운 에탄올을 2배 부피로 넣어 유리 막대로 저으면서 모균주의 염색체 DNA를 분리하고, 이를 10ml의 TE(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA에 녹여, 200㎍/㎖의 단백질분해효소 K(proteinase K)를 처리하고, 페놀/클로로포름 추출한후, 에탄올 침전시켰다.

이 모균주의 염색체 2㎍ DNA를 고농도염기완충용액(High salt buffer(H SB):10mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 10mM DTT)에 넣고, 제한효소 BamHI으로 완전 절단한 후, 같은 방법으로 절단된 클로닝벡터 pUC9과 혼합하여 완충용액(10mM Tris-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 0.5mM ATP)속에서 T₄DNA 접합요소(ligase)를 사용하여 라이게이션하였다.

이 DNA를 대장균 HB101에 형질 전환하여 카제인 최소 배지(Casein-Minimal Plate; 0.5g yeast extract, 0.3g MgSO4, 7H2O, 1.36g KH2PO4, 20g글루코오스, 10g카제인, 15g아가:1ℓ)나 3% 전지분유를 함유한 배지에서 키워서, 투명한 환을 보이는 균주를 선별하였다.

이중 한 균주가 둥근 투명한 환을 보였는데, 이로부터 재조합 플라스미드를 분리하고, 이를 pSP116이라 명명하였다.

[실시예 2]

[서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization)에 의한 재조합 유전자의 동정]

서던 하이브리다이제이션은 서던(Southern)과 마니아티스(Maniatis)등의 공지의 방법에 의해 수행하였다. 먼저, 플라스미드 pSP116을 제한 효소 BamHI으로 절단한 후, 0.8% 아가로스 전기영동법으로 4.8kb의 외래유전자를 분리하였다.

방사선 표식자(Probe)를 만들기 위하여 이 외래유전자 0.2㎍을 33mM 트리스-아세테이트(pH 7.9), 66mM 포타슘아세테이트, 10mM 마그네슘아세테이트, 100㎍/ml BSA 0.15mM DTT가 함유된 완충용액에 넣고, 여기에 0.25유니트의 T4DNA중합효소를 넣어, 3´→5´엑소뉴클레아제를 37℃에서 70분간 작용시켰다.

여기에 각각 2mM의 dGTP, dATP, dTTP를 첨가하고, 4×10^-nmoles의 α-P32-dCTP(300Ci/mmole)를 넣어, 37℃에서 40분간 더 반응시켰다. 이 반응 혼합액을 70℃에서 5분간 방치하여 효소를 불활성화시킨 후, 스펀칼럼(spun-Column)을 통과시켜 정제하였다.

한편, 모균주로부터 추출된 염색체 DNA를 BamHI으로 완전 절단하여 0.8% 아가로스상에서 분리하고, 이를 나이트로셀룰로오스(nitrocellulose)상으로 절단시킨 후, 마이아티스등의 공지의 방법에 의해 하이브리다이제이션을 실시하였다.

요약하면, 하이브리다이제이션은 50% 포름아마이드(formamide), 4×STE(1×ST5=0.15M Nacl, 5mM Tris-HCl, pH 8.0), 1×Denhart용액(0.02% BSA, 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피로리돈), 변성 연어 정액 DNA(0.5mg/ml), 0.01% Nappi 및 0.1% SDS용액에서 48시간 수행하였다.

하이브리다이제이션 확인을 위해 나이트로셀룰로오스 필터를 20~25℃의 50% 포름아마이드 및 0.2×SSC(1×SSC=0.15M NaCl, 0.015M Na-Citrate)용액에서 6~8시간 세척한 후, 다시 1×SSC로 세척하고 건조하여 X-선 필름에 감광시켰다.

[실시예 3]

[재조합 플라스미드 pSP116으로부터 여러 서브클론의 제조]

4.8kb의 큰 외래유전자를 가진 pSP116에서 보다 작은 크기의 세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자를 얻기 위해 여러효소를 사용하여 pSP116의 여러 효소를 사용하여 크기를 줄였다.

먼저 pSP116을 상기의 HSB에 녹인 후 제한효소 BamHI으로 37℃에서 2시간 절단하여 큰 절편을 3.5% 폴리아크릴아미드 전기영동하여 분리한 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 0.5mM ATP, 1000유니트의 T4RNA 접합효소 및 2 유니트의 T4DNA 접합효소하에서 접합시킨 후, 대장균 HB101에 형질전환시켜, 전지분유함유 배지에서 투명환을 보이는 균주를 선별하였다.

이를 pSP117이라 명명하고, 이 pSP117을 BamHI으로 절단한 후, Ba131 완충용액[12mM CaCl2, 12mM MgCl2, 0.2M NaCl, 20mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA]에서 1유니트의 Ba131효소로 적당한 시간간격으로 절단하였다.

이들을 다시 합친후, 페놀/클로로포름 추출하고 에탄올 침전시켰다. 이 DNA를 전술한 바 있는 T4 DNA중합 효소완충액에 녹여, T4 DNA중합효소로서 양말단을 무디게 만든 후 접합시켜서 형질전환시키고, 상기와 같이 형질전환시켜 재조합 플라스미드 pSP119 및 pSP118을 만들었다.

또, 재조합 플라스미드 pSP120을 제조하기 위하여 pSP118을 HindIII으로 절단하고 상기와 같이 반응시켰다(제2도 참조).

[실시예 4]

[세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자의 염기서열분석]

상기의 재조합 플라스미드 pSP119로부터 제한효소 Ssp I과 HindIII을 사용하여, 1.7kb의 절편을 3.5% 폴리아크릴 아미드 전기영동으로부터 회수하였다. 이를 동일한 효소인 HindIII과 무딘끝(blunt-ent)을 만드는 제한효소 HincII를 사용하여 절단된 M13파아지의 복제형 DNA에 접합시켜 삽입하였다.

이를 대장균 JM101에 형질전환시켜 여러 플라크를 얻었다. 이 플라크를 JM101이 있는 2YT배지(16g 트립톤, 8g yeast extract, 5g NaCl)배지에서 6시간 키운후 12,000rpm에서 2분간 원심분리하여 상등액을 얻고, 이 상등액 25μ ℓ를 SDS전개 완충용액(2.7ml 글리세롤, 0.3ml 10×TBE, 1ml 1% SDS, 1ml 0.5M EDTA, 1mg BPB/3ml)5μ ℓ와 섞어 0.8% 아가로스에서 12시간 전개시켜 DNA의 크기를 결정하였다.

공지의 데일(Dale)방법에 의해 연속적으로 절단된 파아지 DNA를 얻었다. 즉 상기 재조합 파아지 DNA 1㎍을 0.5 A260의 올리고머(RD20:5´-CGACGGCCAGTGAATTCCCC-3´)와 결합시켜 부분적으로 이중가닥을 만든 후, 다시 제한효소 EcoRI으로 42℃에서 2시간 동안, T4 DNA 중합효소 완충용액(33mM 트리스-아세테이트, pH 7.8 66mM K-아세테이트, 10mM Mg-아세테이트)하에서 절단한 후, 여기에 1유니트의 T4 DNA 중합효소를 첨가하여 10분간격으로 3´→5´엑소뉴클레아제로 절단하고, 또한 여기에 1mM의 dGTP 및 13유니트의 TdT를 첨가하여 호모폴리머 테일링(homopolymer tailing)하였다.

이 DNA를 다시 회수하여 상기의 RD20과 다시 결합시키고 T4 DNA접합효소 하에서 접합시킨 다음, 상기와 같이 형질전환시키고, DNA의 크기를 분석하였다. 이렇게 제조된 다양한 크기의 외래유전자인 세라티오펩티다제 유전자를 함유한 파지 외가닥 유전자는 중첩된 부위를 가지고 있으며, 이를 공지의 생거(Sanger)방법에 의해 염기서열을 결정하였다.

[실시예 5]

[대장균으로부터 세라티오펩티다제의 순수분리]

재조합 플라스미드 pSP119를 함유한 대장균 HB101을 2ℓ의 LB배지에서 배양시킨 후, 균체를 6,000rpm에서 10분간 원심분리하여 회수하였다.

이 균체를 50ml의 10mM Tris-HCl(pH7.4)에 녹인 후 프렌치압력기로 분쇄하여 용해시켰다. 이를 15,000×g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 얻고, 여기에 20% 최종농도의 암모늄설페이트를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 방치하였다.

이를 12,000×g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 다시 회수하고, 초미립여과(10K)시켰다. 이 농축된 용액을 다시 DEAT-세파로오스(Sepharose)수지(2.5×10. 5cm, 50ml/hr)를 통과시킨 후 10mM 인산염 완충용액으로 용출시켰다. 용출된 용액을 다시 초미립여과시키고, 이를 다시 세파덱스 G-100(Sephadex G-100)겔(2.5×40cm)을 통과시켜 세라티오펩티다제를 순수분리하였다.

[실시예 6]

[재조합 플라스미드를 가지는 대장균으로부터 세라티오펩티다제의 발현]

상기의 여러 서브클론들을 LB배지에서 하룻밤 37℃에서 배양한 후 세포를 원심분리하여 수거하고, 이를 전술한 바와 같이 프렌치압력기로 용해시켜서 15.5% SDS-폴리아크릴아미드 전기영동하였다.

이 결과 33,500달톤의 분자량을 가진 단백질을 가진 단백질이 확인되었으며, 이 전개 샘플이 있는 젤을 10mM Tris-HCl(pH8.0)에서 하룻밤 방치시킨 후 SDS를 제거하고, 3% 전지분유를 함유한 아가와 접착시켰더니 투명한 띠가 보였는 바, 이로부터 형질발현이 확인되었다.

[실시예 7]

[재조합 플라스미드 pSP119의 모균주내로의 역도입 및 발현]

모균주의 생산능력을 향상시키기 위하여 재조합 플라스미드 pSP119를 세라티아 마르세선스 ATCC 21074에 역도입(back-transform)하였다.

이는 마니아티스(Maniatis)등의 CaCl2방법을 변형하여 실시하였는바, 먼저 모균주 세라티아 마르세선스 ATCC 21074를 LB배지에서 하룻밤 진탕배양시킨 다음, 이를 A600=0.6이 되게 다시 배양시킨 후, 원심분리하여 균체를 회수하였다.

이 균체를 100mM CaCl2로 수회 씻은 다음, 65℃에서 약 1분간 방치하고, 0℃로 옮겼다. 여기에 순수분리한 재조합 플라스미드 pSP119를 1㎍ 넣어 0℃에서 1시간 방치시킨 후 다시 42℃에서 90초동안 열을 가하였다.

여기에 신선한 LB배지를 첨가하여 37℃에서 1시간 진탕배양시킨 후, 이를 600㎍/ml의 앰피실린과 전지 분유가 들어있는 LB배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양하였다.

출현된 균주중 투명환이 큰 것을 골라 도입된 플라스미드의 유무 및 안정성을 검사하였고, 얻어진 균주를 세라티아 마르세선스 SNUDZ119(기탁번호:KCTC 8481P)라 명명하였다.

Claims (17)

1. 세라티아 마르세선스로부터 생산되는 세라티오펩티다제에 있어서, 프리(pre), 프로(pro) 및 성숙형으로 구성된 분자량이 38,588달톤인 전구형 세라티오펩티다제.
2. 세라티아 마르세선스로부터 생산되는 세라티오펩티다제에 있어서, 어떤 전서열 및 개시코돈에 의한 아미노산을 수반하지 않는 분자량이 약 33,500달톤인 성숙형 세라티오펩티다제.
3. 세라티아 마르세선스 ATCC 21074의 숙주 DNA를 제한 효소 BamHI으로 절단하여 유전자 조작에 의해 분자량 약 33,500달톤을 갖는 성숙형 세라티오펩티다제를 제조하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 세라티오펩티다제를 그 초기의 생성 세라티오펩티다제가 전구(prepro)형태로 제조됨을 특징으로 하는 세라티오펩티다제의 제조방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 성숙형 세라티오펩티다제는 조작된 유전자로 형질전환된 숙주미생물의 체외로 분비되어 그 배양액으로부터 수득됨을 특징으로 하는 세라티오펩티다제의 제조방법.
6. 분자량이 33,500달톤인 세라티오펩티다제를 코딩하며, 1059개의 염기쌍으로 구성된 유전자.
7. 제6항에 있어서, 상기 세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자는 그의 5´말단 부위에 23개의 프리(pre)형태의 아미노산을 코딩하는 유전자를 가진 것임을 특징으로 하는 유전자.
8. 제7항에 있어서, 상기 프리(pre)형태의 아미노산은 met-pro-ala-gln-arg-met-arg-ser-val-ile-pro-pro-tyr-met-leu-arg-ala-leu-leu-thr-ar g-tyr-ala 서열을 가지는 것임을 특징으로 하는 유전자.
9. 제6항에 있어서, 상기 유전자는 33,500달톤의 세라티오펩티다제와 전구(prepro)형태의 단백질을 코딩하는데 필요한 프로모터부위를 가진 것임을 특징으로 하는 유전자.
10. 제9항에 있어서, 상기 프로모터는 GGT CAC GAC GGC GTA CCA GCT GCT GCA GCG GCG CAT GCT GCG CGC CGA CGC GCC GCC GTG CAA CCT GCT GCT GCA TGG CCG GTT GGC GGT ACC ACC GCC TCG GAG CGA GCA TCA GTC CCA CAA GAC CAC CCC GGC GGT GAG CAC GCA TAA CCA CAG GCT TTA TGA CGA GTA GAC TAC ACT TAG GCT CAG TGC ATT CAT TCG ATG AGG TAA ATT TTT TGC CTA AGG AGA GCC ACT인 것을 특징으로 하는 유전자.
11. 제6항에 있어서, 상기 세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자는 그 활성부위에서 5´GAC/AAC/GGC/GGC/GTG/CAC/CTC/AAC/TCC/GGC/ATT/CCC/AAC/CGC/G CG/TTC/TAC 3´의 염기서열을 가지는 것을 특징으로하는 유전자.
12. 제6항에 있어서, 상기 세라티오펩티다제를 코딩하는 유전자는 그 전사종결코돈 뒤에 연속적인 3개의 전사 종결고리를 가지고 있는 것임을 특징으로 하는 유전자.
13. 제12항에 있어서, 상기 전사종결고리는 5´GCGAGGGAGGCTTCGCTACAT TTCCCCAACTGGCAGGGCCAGCGCGCAATTTGCATGTATCACGCCGGAGCA ACGCATGCGCCTGAATCAGTTGCTGAATCAGACGCTGCCGTACGCC3´의 염기서열을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 유전자.
14. 유전자 종결부위의 염기서열이 5´GCGAGGGAGGCTTCGCTACAT TTCCC AACTGGCAGGGCCAGCGCGCAATTTGCATGTATCACGCCGGAGCAACGC ATGCGCCTGAATCAGTTGCTGAATCAGACGCTGCCGTAC GCC3´씨퀀스.
15. 유전자 크기가 1.7kb인 세라티아 마르세선스로부터 유래된 프로모터, 유전자 및 전사종결부위를 함유하고 대장균 HB101에서 안정적으로 세라티오펩티다제를 발현시키는 재조합 플라스미드 pSP119.
16. 세라티오펩티다제를 발현시키는 재조합 플라스미드 pSP119를 가지는 대장균 SNUDZ119(기탁번호:KCTC8480P, 기탁일자:1990.2.2).
17. 세라티오펩티다제를 발현시키는 재조합 플라스미드 pSP119를 가지는 세라티아 마르세선스 SNUDZ119(기탁번호:KCTC 8481P, 기탁일자:1990.2.2).

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