KR920007205B1 - 단순 포진 비루스 항원 측정용 세정 조성물, 테스트 키트 및 그 사용법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

단순 포진 비루스 항원 측정용 세정 조성물, 테스트 키트 및 그 사용법

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 세정용액 및 단순 포진 비루스의 검출을 위한 그 사용법에 관한 것이다 특히, 이 용액은 항원과 그 항체의 복합체로부터 비복합 물질을 분리하는 것에 의하여 단순 포진 비루스 항원을 검출하기 위하여 사용된다. 본 발명은 진단 절차에 있어서 유용하다. 또한 본 발명은, 세정용액을 포함하는 진단 테스트 키트에 관한 것이다.

[발명의 배경]

근년, 면역 분석법이 감염증의 존재를 검출하기 위하여 사용되고 있다. 이러한 분석법이 유용한 것이 되기위해서는, 특정만 유기체를 고도의 신뢰도를 가지고 검출할 수 있어야만 한다. 대부분의 경우에 있어서, 이것은 그 유기체에 고유한 항원과 그에 상응하는 항체의 분리 및 반응을 필요로 한다. 이러한 분석법이 상업적으로 성공적인 것이 되기위해서는, 또한 비교적 염가이고, 사용하기에 간단하고 신속할 필요가 있다.

면역 분석법에 의하여 검출될 수 있는 이러한 유기체의 하나로서 단순 포진 비루스를 들수 있다. 예방 접종 및 각종 항 비루스제를 사용하는 치료에 의한 각종 비루수들에 대한 제어가 증대되어왔음에도 불구하고, 단순 포진 비루스(이하, HSV로 약칭함)에 의한 감염은 여전히 중요한 문제로 남아있다. 두 유형의 HSV가 있으며, 유형 1은 주로 구강 주위에 발생하며, 유형 2는 주로 인체의 외음부 주위에 발생한다. 피부 감염증 및 비루스성 뇌염은 HSV 감염으로부터 유래하는 단지 2가지의 중대한 결과일 뿐이다.

HSV 감염의 만연성으로 인하여, 원인 비루스의 검출을 위한 신속하고 간단하며 신뢰성있는 테스트에 대한 상당한 관심이 있어왔다. 그러나, 공지의 진단 방법을 사용하는 경우, 종종 HSV와 구별될 수 없는 및몇 유사한 비루스들이 있다. 따라서 HSV-1 또는 HSV-2에 대한 유용한 진단 테스트는 단지 이들 비루스에 대해서만 특이적이어야 하며, 엡스타인-바(Epstein-Barr)비루스, 시토메갈로비루스(Cytomegalovir-us), 바리셀라 조스터(Varicella zoster) 비루스 또는 기타 어느 비루스상 같은 비루스들에 대해 민감하지 않아야 한다.

HSV는, 전기 영동, 응집 및 효소 결합 면역 흡착 분석법(enzyme-linked immunoassays; ELISA)을 포함하는 각종 분석 기술을 사용하여 검출되어왔다. 이들 기술에 있어서는, HSV 항원과 그에 대한 항체간에 면역학적 복합체가 형성되는 경우, 이 복합체는 검출 감도를 개선시키기 위해서 비복합 물질로 부터 통상적으로 분리된다. 분리는 여과, 원심 분리 또는 친화 크로마토그라피에 의해서 달성된다. 대부분의 경우에 있어서, 복합체는 어떠한 방식으로 불용화되며, 비복합물질을 게적하기 위해서 증류수, 인산 완충 식염수 용액 또는 비이온성 계면 활성제를 포함하는 다수의 용액으로 세정된다.

예를들면, 미합중국 특허 제 4,535,057호는, 단순 포진 비루수 항원과 같은 비루스 항원에 대한 고상(solid phase) 분석법을 개시하고 있으며, 여기서, 항체-항원 복합체는 상표-트윈(Tweeen) 20으로 시판되고 있는 비이온성 계면활성제를 함유하는 인산 완충 식염수 용액으로 수차례 세정된다(21 컬럼, 66-67행), 이러한 용액의 pH는, 일반적으로 7.0-7.5이다.

이러한 세정 용액이 면역학적 방법들에 있어서 통상적으로 사용되고는 있으나, 분석법에 있어서의 감도를 향상시키고, HSV의 검출에 있어서의 원하지 않는 백그라운드(background) 시고널을 감소시키기 위한 필요성이 계속적으로 존재하여 왔다.

[발명의 요약]

본 발명은, 단순 포진 비루스에 대한 분석법에 있어서 유용한 수용성 세정 용액을 사용하는 것에 의하여, 분석 방법중에 공지의 세정용액을 사용하는 경우의 단점들을 해소하고 있으며, 상기의 용액은 약 9-11.5의 pH를 갖으며 알콜아민 또는 그염과, 비이온성 계면 활성제로 본질적으로 이루어진다.

더우기, 본 발명은, A 면역학적 복합체를 형성시키기 위하여, 단순 포진 비루스 항원를 함유하고 있는 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 그에 대한 항체와 접촉시키고, B. 상기한 수용성 세정 용액을 사용하여 복합체로부터 비복합물질을 분리시키며, C. 샘플중의 단순 포진 비루스의 존재에 대한 지표로서 복합체의 존재를 검출하는 것으로 구성되는, 단순포진 비루수의 측정 방법을 제공한다.

단순 포진 비루스 항원의 측정에 유용한 진단 시험 키트는, (a) 상기한 세정 용액 및 (b) 단순 포진 비루수 항원에 대한 항체로 구성된다.

본 발명의 HSV에 대만 분석법은 사용하기에 신속하고 신뢰성이 있으며 용이하다. 예를들면, 이 방법은 실온에서 약 30분이내에 수행될 수 있다. 이 방법은, 예를들면, HSV 또는 HSV 감염 세포 또는 세포막으로부터 추출된 항원의 검출에 대하여 고도로 신뢰성이 있다.

이 분석법은 고도로 민감하며, 낮은 백그라운드를 나타내고, 항원-항체 복합체를 포함하는 고체 지지체에 대한 항체의 비특이적 결합이 최소화 된다. 이들 장점들은, 약 9-11.5의 pH를 갖으며 알콜아민 또는그 염 및, 비이온성 계면 활성제로 구성되는 본 발명의 특별한 수용성 세정 용액을 사용하여 얻어진다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 수용성 세정 용액 및 표준 의학 기술과 미생물학적 기술을 이용해 환자로 부터 얻은 생물학적 샘플내 HSV의 존재를 측정하는 방법을 포함한다. 생물학적 샘플로는, 예를들어, 환자의 경관, 요도, 눈, 목구멍 또는 항문으로 부터 채집한 면봉 샘플 및 활액(synovial fluid)이나 병변액 같은 체액이 있다. 이렇게 얻은 생물학적 샘플은 측정될 항원이 함유되어있는 HSV 또는 HSV로 감염된 세포 또는 막을 함유하고 있다고 생각된다.

본 발명은 비루스 전체 또는 비루스로 감염된 세포 또는 막 전체를 검출하기 의하여 사용될 수 있으나, 비교적 단시간내에 높은 감도로 측정하기 위해서는, 비루스 또는 비루스 또는 비루스 감염 세포를 효과적으로 용해(lyse)시켜 충분한 항원을 방출시키는 것이 바람직하다.

본 발명으로 검출 가능한 항원 HSV-1 또는 HSV-2의 어느 것인가에 존재하거나 또는 두 비루스 균주(strain) 모두에 존재한다. 비리온(virion)중의 당단백은 본 발명에 따라 추출 및 검출될 수 있다.

추출 항원은, 미합중국 특허 제 4,430,437호 및 미합중국 특허 제 4,661,349호 그리고 유럽 특허 공개 번호 0 183 383호 중에 언급되여 있는 추출 방법 또는 시약을 포함하는 어떤 유용한 방법 또는 시약을 사용하여 얻어질 수 있다.

바람직한 추출 조성물은 약 8.5-12의 pH를 갖는다. 적당한 완충용액이나 염기를 사용해 원하는 pH를 얻을 수 있다. 어떤 완충용액은 완충 능력에 있어서 뿐 아니라 알칼리 조건을 제공하기에 충분히 강한 염기이다. 그렇지 못한 다른 완충용액에 있어서는, 상기한 pH를 얻기 위하여 강한 염기(수산화나트륨이나 수산화칼륨 같은 수산화물 )가 사용되고, 다음에 이 완충용액은 이 pH를 유지하는데 사용된다.

이 추출조성물은 하나 이상의 알콜아민이나 이것의 염을 최소한 약 0.05몰(mole), 바람직하게는 약 0.1-1몰의 양으로 함유한다. 유용한 알콜아민으로는 에탄올아민, 디에탄올아민, 프로판올아민, 트리에탄올아민 및 이것의 염(염산염, 황산염, 초산염, 피크린산염 및 옥살산염 같은)이 있다. 기타의 것들은 당 업계 숙련자에게 있어 명백할 것이다. 필요하다면 알콜아민이나 이것의 염의 혼합물이 사용될 수 있다.

본 조성물은 또한 알킬페놀과 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물인 하나 이상의 비이온성 계면활성제를 함유한다. 바람직한 알킬페놀은 페놀상의 선형이나 분지된 알킬 그룹에 1-20개의 탄소를 갖는다. 옥틸페놀이 가장 바람직하다. 일반적으로, 이들 화합물은 약 5-35개의 에틸렌 옥사이드 그룹을 갖는다. 이들 비이온성 게면활성제는 공지된 방법과 출발물질을 이용해 용이하게 제조되지만, 또한 여러가지의 것들이 상업적으로 입수될 수 있다.

기타 유용한 비이온성 계면활성제로는, TritonX-100 및 Triton N101 같이 상표명 Triton으로 시판되거나 상표명 Brij로 시판되는 것들과 같은 폴리옥시에틸렌에테르, 상표명 Tween(예를들어, Tween-20)으로 시판되는 것들과 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 유도체 및 상표명 Tergitol(예를들어, Tergitol NPX 및 NP-7)로 시판되는 것들과 같은 폴리글리콜 에테르가 있지만 이것에 제한되지 않는다. 기타 유용한 물질들은, 특히 계면활성제에 대한 표준 참고문헌인 McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, 1986 Edition, McCutcheon Division, Publishing Co., Glen Rock, N.J.를 참고한 후에는 당 업계의 숙련자에게 있어 명백할 것이다.

하나 이상의 비이온성 계면활성제는 최소한 약 1중량%(총 조성물 중량에 기준함), 바람직하게 약 4-10 중량%의 양으로 추출 조성물에 존재한다.

본 발명의 추출 조성물의 세번째 중요한 성분으로는 하나 이상의 콜산, 이것의 염 또는 이것의 유도체이다. 유용한 물질로는 콜산, 케노데옥시콜산, 데옥시콜산, 데옥시콜산나트륨, 케노데옥시콜산 칼륨, 콜산 암모늄 및 기타 당 업계의 숙련자에게 명백한 것들이 있지만 이것에 제한 되지 않는다. 이 성분은 최소한 약 0.2중량%(총 조성물 중량에 기준함), 바람직하게 약 0.5-5중량%의 양으로 본 조성물에 존재한다.

본 추출 조성물은 또한 음이온성 계면활성제를 최소한 약 0.1중량%(총 조성물 중량에 기준함), 바람직하게 약 O.2-1중량% 양으로 함유한다. 유용한 음이온성 계면활성제는 C_6-20알킬 설페이트 음이온 및 알칼리 금속(예를들어, 리튬, 나트륨 또는 칼륨)이나 암모늄 양이온으로 구성된 수용성이거나 물에 분산가능한 화합물들이 있지만 이것에 제한되지 않는다. 바람직하게, 상기 알킬은 C_6-12를 갖는다(예를들어, 선형 또는 분지된 헥실, 옥틸, 데실, 2-메틸헥실 및 도데실 그룹), 아릴 환에 C_6-10를 갖는 아릴설폰산 또는 이것의 염(상기 기술된 바와같은)이 또한 유용하다. 대표적인 음이온성 계면활성제로는 암모늄 도데실 설페이트, 소듐 도데실 설페이트, 루바듐 도데실 설페이트, 소듐 데실 설페이트, 리튬 헥실 설페이트, 포타슘 옥틸 설페이트 및 리튬 데실 실페이트가 있다.

추줄 조성물중 선택적인 성분은 알칼리 금속, 암모늄 또는 알칼리토류염 같은 하나 이상의 무기염이다. 대표적인 염으로는 염화나트륨(가장 바람직함), 염화칼륨 염화암모늠, 염화칼슘, 황산 암모늄, 황산 바륨및 기타 당업계의 숙련자에게 명백한 것들이 있지만 이것에 제한되지 않는다. 염은, 바람직하게는 최소한 약 0.3몰, 더욱 바람직하게는 약 0.5-2몰의 양으로 존재한다.

항원 추출은 임의의 적당한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 목적을 위하여 특별히 설계된 적당한 추출 장치중에서 추출이 수행되는 것이다. 다수의 이러한 장치가 해당기술분야에 알려져있으며, 예를들면, 미합중국 특허 제 4,746,614호를 들수 있다.

생물학적 샘플(여과되거나 또는 여과되지 않은)은, 포진(herpes) 항원(추출되었거나, 또는 감염된 세포전체 또는 비리온 전체)의 존재를 측정하기 위해서 다수의 분석 방법중 어느것으로 처리될 수 있다. 이러한 방법으로는, 배양 기술, 역면역 전기 영동법(counterimmunoelectrophoresis) 및 혈청학적 테스트를 들수 있으나, 바람직하지 못하며, 어떤 경우에만 단지 선택될 수 있다.

바람직하게는, HSV 항원은 면역 분석법을 사용하여 검출되며, 여기서 항원은 하나 이상의 적당한 항체와 면역학적으로 반응되어 면역학적 복합체를 형성한다. HSV-1 또는 HSV-2중의 어느 하나 또는 양자모두로 부터의 항원이 검출될 수 있다. 바람직하게는, 양자가 동시에 검출되는 것이다. 본 발명의 세정 용액을 사용하여 복합체로 부터 비복합 물질이 분리된후, 복합체는 적당한 방사계(radiometric)시약, 비색계(colorimetric)시약, 형광계 시약 또는 효소가 라벨(label)된 시약을 이용해 검출된다. 어떤 경우에, 시약은 항원에 대해 라벨된 항체이며, 또다른 경우에, 라벨된 항-항체는 항원과 반응하는 라벨되지 않은 항체에대한 것이다.

바람직한 구체예에서, 복합체는 피복되거나 피복되지않은 어떤 형태의 고체 지지체상에 고정화된 다음 적당한 추출 방법으로 처리된다. 기타의 분석법은 상기 복합체의 최소한 하나의 반응물(항체와 같은)이 복합체 형성동안에 함께 응집하는 어면 형태의 라벨되거나 라벨되지않은 입자에 부착될때 면역학적 복합체의 응집을 포함한다. 이러한 응집분석법이 유럽 특허출원 공개 번호 제 0 183 215호에 기재되어 있다.

유용한 분석법의 예로는 경쟁적연 면역분석, 방사성동위원소 표식 면역분석(방사성 동위원소 표식 면역침강반응 포함) 또는 효소 결합 면역 흡착 분석(또는 소위 "ELISA")이 있다. 이러한 분석 방법이 일반적으로 U.S 특허 제 4,430,437호에 기재되어 있으며, 기타의 것에 너무 많이 기재되어 있어 다 언급할 수없다. 사용된 HSV 항체는 어느 한쪽의 항원 또는 몇개의 항원에 대한 것일수 있으며, 바람직하게는 비리온 또는 세포로 부터 추출된 항원에 대한 것이다. 하나의 구체예에서, 항체는 HSV-1 또는 HSV-2둘중 어느 것의 단일 당단백에 대한 것이다. 다른 구체예에서, 다른 항체들의 혼합물은 HSV-1과 HSV-2 양자로 부터 유래되는 당단백과 같은 여러 항원에 대한 것이다. 바람직한 세번째 구체예에서, HSV-1과 HSV-2 양자로 부터의 특이적인 당단백과 반응성인 단일 항체가 사용된다.

상기 분석에 사용된 항체는 구입할 수 있거나 공지된 방법을 이용해 제조될 수 있는 다클론이나 단클론항체일 수 있다. 바람직한 항체는 단클론 항체이다. 하나의 이러한 단클론 항체는 표준 방법을 이용해 하이브리도마 셀 라인 283--2A1-lD4-2C3(ATCC 기탁 HB-9684)으로 부터 얻어진다.

유용한 고체상(phase)면역분석에서, 추줄된 당단백 항원은 유리아만이나 설프하이드릴 그룹과 반응하는 입자상의 반응성 그룹과 공유 반응하거나 흡착함에 의해 작은 중합 입자상에 "포획(captured)"된다. 다음에 포획된 항원은 적당한 항체의 반응하여 결합된 면역학적 복합체를 형성한다. 복합되지앓은 물질은 미세다공성 막 여과기를 이용해 분리된다.

결과의 면역학적 복합체로부터 복합되지않은 물질을 분리하는데 또한 사용되는 피복되거나 피복되지않은 미세 다공성 막 여과기상에 추출된 항원을 포획하는 것에 의해 바람직한 면역분석이 행해진다. 계면활성제가 피복된 미세 다공성 막을 사용해 다른 면역분석이 행해진다. 가장 바람직하게는, 미세 다공성 막은 다음 실시예 2에 표시된 바와같은 피복되지않거나 처리되지않은 나일론 재료이다.

일반적으로, 어떤 형태의 고체 지지체(바람직하게는 상기된 바와같은 막 또는 비드(bead)를 이용한 본발명의 바람직힌 구체예에 있어서의 본석은 다음과 같이 행해진다. 추출된 항원은 유리, 셀룰로스, 세라믹 또는 중합 물질 같은 고체 지지체와 접촉된다. 바람직하게, 이 지지체는 추출된 항원이 과한 인큐베이션이나 기타 조건을 조절함없이 빠르게 결합하게될 어느 천연 중합물질이나 합성 중합물질로 구성된다. 유용한 중합체로는 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌아민, 셀룰로수 물질 및 에틸렌성 불포화 비닐 단량체로 제조된 부가 중합제 및 기타 당 업계에 공지된 것들이 있다. 일반적으로, 막이 양전하를 띤다면, 양이온 그룹은 4차 암모늄염, 4차 포스포늄 염, 4차 설포늄 염, 4차 피리디늄 염, 4차 피리미다늄염 또는 4차 이미다졸륨 염이며 4차 암모늄 염이 바람직하다.

하나의 바람직한 구체예는 미세 마공성 막상에 입자를 사용하며, 여기서 입자와 막의 양자가 추줄된 항원을 포획하는 것이다.

상기 지지체는 비드(bead), 젤(gel), 필름(film) 또는 막 같은 어느 적당한 형태로 구성될 수 있다. 본원에 기술된 미세다공성 막이 바람직하다. 일반적으로, 이 막은 약 0.1-20㎛의 평균 포어(pore)크기를 갖는다.

본 원에 기술된 지지체는 본 분석을 실행하기 위해 기타 기구(병, 테스트 튜브, 면봉, 비이커 또는 컵)와 함께 사용될 수 있다. 선택적으로 및 바람직하게는, 지지체는 상기 분석을 행할 수 있고 모든 액체를 수용할 수 있는 일회용 테스트 장치에 잘 들어맞는 미세 다공성 막이다. 유용한 테스트 장치와 형태가 U.S. 특허 제 3,825,410호, 제 3,888,629호, 제 3,970,429호 및 제 4,446,232호와 같은 당 업계의 문헌에 공지되어 있다. 특히 유용한 장치가 유럽 특허 공개 번호 제 280 558호에 기재되어 있다.

항원이 지지체와 접촉한후 거의 즉각적으로 항원은 지지체에 결합된다. 항원이 지지체에 부착된 생물학적결합 화합물(항체같은)을 통해 결합되지 않는 것을 의미하는, 직접적인 방식으로 결합이 이루어질 수 있거나 또는 이러한 결합 화합물을 통해 간접적으로 결합이 이루어질 수 있다. 미결합 물질들은 본 발명의 세정용액을 사용하여 세정 제거될 수 있다(이하에 기재).

그러므로, 약 10분내, 바람직하게는 10-120초의 접촉시간내에, 결합된 항원이 HSV 항원에 대한 적당한항체(또는 이것의 혼합물)와 접촉하여 지지체상에 면역학적 복합체를 형성시킨다. 만약 분석이 일회용 테스트 장치를 이용해 행해진다면, 지지체는 항원이 막에 결합할때 샘플내 액체 및 복합되지않은 물질이 흘러나갈 수 있는 미세 다공성 막이다.

바람직한 구체예에서, 항원에 대한 항체가 검사를 위해 라벨된다. 유용한 라벨이 당 업계에 공지되었으며 이것으로는 적당한 방법과 기구를 이용해 직접 또는 간접으로 검사할 수 있는 화학적 또는 생물학적 화합물뿐 아니라 검사가능한 종류를 제공하는 또다른 화학적 또는 특이적 결합반응에 의해 검출될 수 있는 화합물이있다. 유용한 라벨의 예로는 방사성 동위원소, 효소, 조효소, 효소 억제제, 형광성 화합물, 코펙터(cofactor), 화학 발광성 화합물, 인광성 화합물, 비오틴 또는 그것의 유도체, 아비딘 또는 그것의 유도체, 페리틴, 자화 가능한 입자, 염색한 입자 및 기타 당 업계의 숙련자에게 명백한 것들이 있다. 방사성 동위원소 또는 효소는 바람직한 라벨이다. 공지된 기술을 이용해 이러한 라벨을 항체에 부착할 수 있다. 라벨이 직접적으로 검출될 수 없을 때, 검출 가능한 반응 생성물이나 특이적 결합 생성물을 얻기 위해 또 다른 시약이나 화합물이 필요하다. 예를들어, 라벨이 비오틴일때, 이것은 효소와 결합되어 있는 아버딘라 반응하여 검출 가능한 종류를 제공할 수 있다. 라벨이 글루코스 옥시다제, 우레아제, 퍼옥시다제, 알칼리포스파타제및 기타와 같은 효소일때, 기질 및 염로제공 시약이 또한 필요하다. 퍼옥시다제 및 알칼리 포스파타제가 특히 유용하다.

특히 바람직한 구체예에서, 라벨이 퍼옥시다제이며, 분석의 어느 단계에서 과산화수소와 염료 제공 조성물중의 적당한 염료 형성 시약을 부가하여 검출 가능한 염료를 제공한다. 예를들어, 유용한 염료제공 시약으로는 테트라메틸벤지딘과 이것의 유도체, 및 트리아릴이미다졸 루코(leuco) 염로(U.S. 특허 제 4,089,747호에 기재되어 있음)같은 루코 염료 또는 퍼옥시다제와 과산화수소의 존재중에서 반응하여 염료를 제공하는 기타 화합물(즉, 퍼옥시다제의 촉매적 작용후에 반응하여 염료를 제공하는 화합물이 있다.

다른 구체예에서, 상기 단순포진 비루수 항체가 라벨되지않으며 지지체에 결합되어 형성된 항체-항원 복합체의 검출은 검출을 위해 적당하게 라벨되고(상기와 같이) HSV 항체에 대해 특이적인 두번째 항체(다음에 기술됨)를 이용해 이루어진다.

분석에 사용된 항체는 지지체에 대한 비특이적인 상호작용을 감소시키는 하나 이상의 블록킹 단백질과의 혼합물로 공급될 수 있다. 유용한 단백질이 공지되었으며 이런 것으로는 예를들어 카제인, α-카제인, 송치(fetal bovine)의 혈청 및 돼지의 감마 글로불린이 있다. 하나의 유용한 블록킹 조성물은 비면역학적 블록킹 단백질과 양성(amphoteric)계면활성제를 함유한다.

지지체에 결합된 면역학적 복합체의 형성을 촉진하기 위해, 항체와 항원은 일반적으로 약 15-30℃ 온도에서 10분간 인큐베이트된다. 바람직하게는, 인큐베이션은 상온(즉 l8-25℃)에서 5분간 행해진다.

인큐베이션후, 그리고 항원-항체 접촉후 약 10분내에 결합된 복합체를 수용성 세정용액으로 한번 이상 세정한다. 본 발명의 세정용액을 사용하여 적어도 1회 이상의 이러한 세정을 행한다(이하에 기재).

상기 기술된 구체예에서, HSV 항체가 라벨된 경우, 세척후의 분석 과정은 적당한 시야을 부가한 후에 라벨을 직접 또는 간접적으로 검출하는 것이다. 이것은 결합된 복합체를 세척한후 비교적 빠르게 행해진다. 필요하다면, 라벨 검출은 시약이 이러한 라벨 검출을 보장한다면 인큐메이션으로써 촉진될 수 있다. 다음에 라벨은 적당한 시간후에 표준 장치와 방법을 이용해 검출된다.

HSV 항체가 라벨되지않은 경우, 결합된 복합체를 세정한 후에, 이것을 라벨되지않은 항체에 대한 항체와 접촉시킨다. 이러한 두번째 항체(즉 항-항체)는 상기 기술된 어느 라벨로 적당하게 라벨되며 상기 기술된 블록킹 조성물과 함께 공급될 수 있다. 항체는 단클론이거나 다클론일 수 있고 통상적으로 구입되거나 공지된 방법을 이용해 제조될 수 있다.

이러한 접촉후에, 지지체에 결합된 결과의 항원-항체-항체 복합체를 약 15-30℃ 온도에서 약 10분간 인큐베이트한다. 바람직하게는, 인큐베이션을 상온에서 약 5분간 행한다.

복합되지 않은 물질들을 제거하기 위하여 그 이상의 세정이 수행되며, 적당한 효소 기질이나 다른 필요한 시약들이 검출 가능한 종류들을 제공하도록 첨가된다. 결합된 항원-항체-라벨된 항체 복합체는, 이어서, 표준적인 방사성계, 비색계, 형광계 또는 다른 검출 기술을 사용하여 지지체상에서 검출된다.

본 발명의 세정 용액은, 상기한 바와 같은 낮은 백그라운드 및 높은 감도를 개선시키기 위해서 본 발명의 방법을 통하여 시종일관 일회 이상 사용될 수 있다. 게다가, 본 발명의 세정 용액이 적어도 1회 이상 사용되는 한, 표준 세정 용액도 본 방법에서 사용될 수 있으며, 바람직하게는 그것이 첫번째 세정 단계에서 사용되는 것이다.

본 발명의 수용성 세정 용액은 약 9-11.5, 바람직하게는 약 10-11의 pH를 갖는다. 이러한 pH는 하나 이상의 적당한 완충용액 또는 강염기를 사용하여 얻어질 수 있다. 유용한 염기로서는, 알칼리 금속 또는 수산화 암모늄(수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화 암모늄 및 기타 당해 분야에 공지된 것들과 같은)을 들수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 어떤 경우에 있어서는, 원하는 수준가지 pH를 상승시키는 것에 있어서 완충용액만으로 충분하지만, 어떤 다른 경우에 있어서는, pH를 상승시키는 것에 있어서 강염기가 필요하며, 그후, 그 pH를 유지시키기 위하여 완충 용액이 필요하다 예를들어. 알콜아민 또는 그 염이 사용되며 약 9.5이상의 pH가 소망되는 경우, 수산화 니트륨과 같은 강염기가 용액의 pH를 상승시키기 위하여필요하다.

이 세정 용액은 알콜아민 또는 그 염 약 0.05몰 이상, 바람직하게는 약 0.1-1몰로 본질적으로 이루어진다. 유용한 알콜아민으로서는, 에탄올아민, 디에탄올아민, 프로판올아민, 트리에탄올아민 및 그 염들(염산염, 황산염, 초산염, 피크린산염, 옥살산염과 같은)을 들수 있다. 해당분야의 숙련자에 있어서는 다른 것들도 용이하게 명백할 것이다. 알콜아민류 또는 그 염류의 혼합물들도 원하다면 사용될 수 있다. 에탄올아민 또는 그 염이 특히 바람직하다.

세정 용액은 또한, 적어도 약 0.05중량%(전체의 용액 중량기준), 바람직하게는 약 0.1-2중량%의 양으로 존재하는 하나 이상의 물에 수용성 또는 분산성인 비이온성 계면활성제를 포함한다. 유용한 계면활성제로서는, 상표명 Triton(예컨대, TritonX-100), 또는 상표명 Brij(예컨대, Brij 30)로서 시판되는 것과 같은 폴리옥시에틸렌 에테르류, 상표명 Tween(예컨대, Tween 20, Tween 21, Tween 40)으로서 시판되는 것과 같은 폴리옥시에틸렌소르비탄류, 상표명 Tergitol(예컨대, Tergitol NP-7)로서 시판되는 폴리글리콜에테르류, 그리고 폴리에틸렌 글리콜류를 들수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

특히 유용한 비이온성 계면활성제는 상기한 폴리에틸렌 에테르류와 폴리옥시에틸렌 소르비탄류, 특히 트윈 20(상표명)이다. 다른 유용한 계면활성제들은 계면활성제에 대한 표준적인 참조 문헌인 McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, 1986판, McCutcheon Division Publishing Co, Glen Rock, N.J.를 참조하는 것에 의하여, 당해 분야의 숙련자는 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 대표적인 세정 용액과 그 제조 방법을 이하의 실시예 1에서 설명한다.

단순 포진 비루스를 측정하기 위한 바람직한 방법은,

A. 일회용 테스트 장치내의 고체 지지체를 생물학적 샘플로부터 추출된 항원인 HSV항원을 함유하는 것으로 추정되는 용액과, 항원이 고체 지지체에 결합되기에 충분한 시간 동안 접촉시키고,

B. 본 발명의 수용성 세정 용액을 사용하여 결합된 항원으로부터 비결합 물질을 세정해 내며,

C. 고체 지지체에 결합된 면역학적 복합체를 형성시키기 위하여, 결합된 항원을 그에 대한 항체와 접촉시키고,

D. 수용성 세정 용액(바람직하게는, 본 발명의 세정 용액)을 사용하여 복합체로부터 복합되지 않은 물질을 분리해 내며,

E. 샘플중의 단순 포진 비루스의 존재에 대한 지표기로서 결합된 복합체의 존재를 측정하는 것으로 구성된다.

필요하다면, 하나 이상의 기타 시약, 진단 설비편(pieces) 또는 기타 유용한 물질로 또한 구성된 진단용테스트 키트의 일부분으로서 본 발명의 세정 용액이 공급될 수 있다. 일반적으로, 이러한 키트는 최소한 단순포진 비루스의 항원에 대한 항체(라벨되거나 라벨되지 않음]를 포함한다. 이것은 또한 항-항체(필요하다면), 추출 조성물, 추출 장치, 테스트 장치, 염료 제공 시약이나 조성물, 피멧, 사용 설명서, 면봉 및 기타분석을 행하는데 유용한 어느 성분들을 포함한다. 이러한 성분들은 어느 적당한 방법으로 포장되어 하나 이상의 포장물이나 용기로 제공될 수 있다.

다음 물질, 조성물 및 용액을 다음 실시예에 사용했으며 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되지만 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

[항체 제조]

와 그의 동료(Nature, 256, pp 495-497, 1975)에 의해 기술된 공지의 방법을 이용해 HSV에 대한 단클론 항체를 생성하는 하이브리도마 셀을 제조하였다. HSV-1과 HSV-2 둘다의 공통 당단백 항원상의 에피토프에 반응하는 단클론 항체를 생성하는 하이브리도마 셀 라인을 얻었다. 이 하이브리도마 셀 라인을 ATCC HB-9684로서 기탁 하였다.

[항원 제조]

양성(positive) 대조로서 사용하기 위한 항원을 제조하기 위해, HSV-1 균주 F와 HSV-2 균주 G를 HEP-2 셀(ATCC CCL-23 내에서 각각 배양시켰다. 감염된 셀을 저속 원심분리에 의해 펠릿 (pellet)화하고 이 펠릿을 50㎖ Corex튜브내 인산 완중 식염수 용액으로 15㎖부피까지 재현탁시켰다. 재현탁된 셀을 초음파 파쇄하고, 15분간 아미노메틸트리옥살렌(500㎎/㎖)에 노출시킨 다음 일정한 교반하에 15분간 자외선에 노출시켰다.

HSV-1과 HSV-2 항원(UV에 의해 불활성화되고 세정제에 의해 용해됨)이 들어있는 테스트 장치의 양성 대조 웰(well)을 소의 혈청 알부민(O.1중량%) 및 친수성 중합체(5중량%)와 혼합하여 테스트 웰의 여과막에 항침시켰다.

[항체 접합체 제조]

Yoshitake와 그의 동료. Eur.J.Biochem.,101, 395(1979)에 기재되어있는 방법을 이용해 HSV에 대한 단클론 항체를 양고추냉이 퍼욱시다제에 접합시켰다. α-카제인 0.5중량%), Tween 20 비이온성 계면활성제(0.1중량%), 티메로살 방부제(0.01중량%) 및 p-메톡시페놀(100밀리몰)을 함유하는 블록킹 조성물을 결과하는 접합체와 혼합한 다음 여과 제군시켰다. 상기 용액내 최종 항체 농도는 1.5㎍/㎖이었다. 이것을 소의 혈청 알부민(1중량%)과 함께 저장하였다. 테스트 장치의 음성(negative) 대조 웰에 쓰이는 접합체는 상기된 방법을 이용해 제조되고 퍼옥시다제로 라벨된 크레아틴 키나제에 대한 항체이었다.

[루코 염료제공 조성물]

본 조성물은 과산화수소수(10밀리몰), 2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-4,5-비스(4-메톡시페닐)이미다졸 루코 염료(0.005중량%), 폴리(비닐피롤리돈)(1중량%),4'-하이드록아세트아닐리드(5밀리몰) 및 디에틸렌트 리아아민펜타아세트산(10밀리몰)을 함유하였다.

[과산화수소 용액]

과산화수소(10중량%), 디에틸렌트티아민펜타아세트산(0.005중량%) 및 방부제(0.01중량%)을 함유하는 수성 용액을 제조하였다.

[추출 조성물]

추출 조성물을 물중에 다음의 성분들을 혼합하여 제조하였다 : Nonidet NP-40 비이온성 계면활성제(5중량%, 상표명), 데옥시콜산나트륨(0.75중량%), 소디움 도데실 설페이트 음이온성 졔면활성제(0.4중량%) 및 영화 나트륨(1몰). 이 조성물의 pH는 12N의수산화 나트륨을 사용하여 10.75로 조절하였다.

[인산 완충 식염수 용액]

염화나트륨(0.15몰). 인산중수소나트륨(0.01몰) 및 인산수소나트륨(pH7.2, 0.04몰)으로부터 상기 용액(0.05몰)을 제조하였다.

[블로킹 조성물]

α-카제인(0.5중량%), Tween 20(상표명. 0.1중량%), p-메톡시페놀(100밀리몰) 및 방부제(0.01중량%)를 함유하는 수성의 블록킹 조성물을 제조하였다. 3개의 테스트 웰이 있는 일회용 테스트 장치를 분석에 사용했다. 이러한 테스트 장치는 각각의 테스트 웰내에 피복도지 않은 미세 다공성의 나일론 막(Pall Corp.의 BiodyneA)을 가졌다.

[실시예 1]

[세정 용액]

본 발명의 세정 용액을 물중에 다음 성분들을 혼합하여 제조하였다 : Tween 20비이온성 계면활성제(상표명. 0.1중량%)와 티메로살 방부제(0.01중량%), 에탄올아민 염산염(0.26몰) 및 티메로살 방부제(0.01중량%). 이 용액의 pH를 12N의 수산화 나트륨을 가하여 10.75로 상승시켰다.

[실시예 2]

[HSV-1 및 HSV-2dp 대한 분석]

본 실시예에는 HSV-1과 HSV-2 둘다나 또는 둘 중 하나를 함유하고 있는 환자의 샘플을 이용하는 본발명의 방법을 설명한다. 각 환자에 대해 2개의 면봉을 이용해 몇몇 진료소와 병원의 여러 환자들로부터 샘플을 얻었다. 진료소나 병원의 Surecell테스트 장치로 본 발명을 실행하는데 하나의 면봉을 사용하며 표준 배양 기술을 이용한 확정 테스트에 두번째 면봉을 사용했다.

각 환자로부터 얻은 첫번째 면봉을 추출 튜브에 넣고, 상기한 추출 조성물(1μ1)을 부가하였다. 이 면봉을 l-2분동안 추출용액에 넣고 소용돌이치게한후에 결과의 추출물을 여과 장치[상층의 폴리에스테르플러그. 중간층의 l0㎛ HDC(상표명. Pal1 Corp.) 및 하층의 5㎛ Loprodyne여과기(Pall Corp.)로 구성됨]에 의해 미리 여과시켰다.

다음에 미리 여과된 추출물(200㎕)을 각 테스트 장치의 각각의 웰에 놓아 어느 HSV항원이 웰내의 막에 흡착되도록하였다.

테스트 웰을 실시예 1의 세정 용액(l20㎕)으로 세정하고 상기된 과산화수소 용액(120㎕)을 각각에 부가하여 비특이적인 어느 옥시다제를 제거하였다. 웰을 세정 용액(120㎕)으로 다시 세정하였다. 상기 기술된 블록킹 조성물내 라벨된 항-크레아틴 키나제 접합체(3㎕/㎖)의 샘플(40㎕)을 각 테스트 장치의 음성재조웰에 부가하였다. 항-HSV접합체의 샘플(40㎕)을 각 테스트 장치의 나머지 2개 웰에 부가하였다.

항체-항원의 복합체를 만들기위해 상온에서 5분간 인큐베이션한 후에, 웰을 실시예 1의 세정 용액으로 2번(각각 200㎕) 세정하였다.

상기 언급된 루코 염료 조성물 (40㎕)을 각 테스트 웰에 부가하고 상온에서 5분간 인큐베이션한 후에, 샘플내 HSV 항원의 존재 지표로서 상기 막상의 적색을 띤 염료의 존재를 평가하였다. 테스트된 환자의 샘플에 대해, 강도(진짜(true)양성과 거짓(false)음성의 총합으로 나눈 진짜 양성)는 83%였고 특이성(진짜 음성과 거짓양성의 총합으로 나눈 진짜 음성)은 100%였다. 상기 방법의 모든 양성 결과를 배양 결과에 의해 확인했다.

[실시예 3-5]

비교 실시예 본 발명의 세가지 세정 용액을 단순 포진 비루스에 대한 본 발명의 범위 밖의 세가지 세정용액과 비교하였다.

[재료]

실시예 3 : 세정 용액을 실시예 1에서의 그것과 같게 제조하였다.

실시예 4 : 세정 용액을, Tween 20 대신에 Tergitol 7(상표명, 0.1중량%)을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에서의 그것과 같았다.

실시예 5 : 세정 용액을, Tween 20 대신에 TritonX-100(0.1중량%)을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에서의 그것과 같았다.

대조 A : 이 세정 용액은 수산화 나트륨의 수용액(1몰, pH6.86)이었다.

대조 B : 이 세정 용액은 에탄올아민 염산염(0.1몰), 염화나트륨(0.26몰) 및 TWeen 20 비이온성 계면활성제(상표명, 0.1중량%)를 함유하였으며, pH는 8이었다.

대조 C : 이 세정 용액은 염화 나트륨(1몰) 및 TritonX-100 비이온성 계면활성제(0.1중량%)를 함유하였으며, pH는 6.86이었다.

[분석]

테스트 샘플을 다음과 같이 제조하였다 : 항원과 셀(40㎕)을 함유하는 1 : 40 희석의 HSV 셀 용해물(상기한)을 상기한 추출 조성물(3960㎕)과 혼합하고, 실온에서 2분간 인큐베이션하였다. 이 혼합물을 여과 장치[상층의 폴리데ㄷ스테르 플러그, 중간의 10㎛ HDC(상표명. Pall Corp.) 및 하부의 5㎛ Loprodyne여과기(pall Corp.)로 구성됨]를 통하여 사전 여과시키고, 샘플(200㎕)을 Surecell테스트 장치의 각 테스트 웰에 부가 하였다. 하나의 웰은 음성 대조로 사용되었으며 다른 2개의 웰은 분석용 테스트 웰로서 사용되었다.

단지 추출 조성물만을 함유하는 백그라운드 샘플(각각 200㎕)을 또한, 테스트 장치에 부가하였다.

각 세정 용액(120㎕)을 장치의 테스트 웰에 부가하고, 이어서, 과산화 수소 용액(120㎕)을 부가하였으며, 두번째 세정 용액(120㎕)을 부가하였다. 상기한 블륵킹 용액중의 퍼옥시다제 표지 항-HSV접합체(1.5㎍/㎖)를 함유하는 용액(40㎕)을, 이어서 각 장치의 테스트 웰에 부가하였다. 퍼옥시다제 표지 항-크레아딘 키나제 접합체를 함유하는 용액(40㎕, 3㎍/㎖)을, 각각의 음성대조 웰에 부가하였다. 실온해서 5분간 인큐베이션한후, 각각의 웰을 세정 용액(매회 120㎕)으로 2회 세정하였다. 상기한 루코 염료 제공조성물(40㎕)을 각 웰에 부가하고, 이어서 실온에서 5분간 다시 인큐베이션하였다. 테스트 웰 막상의 색농도는 육안관찰하였으며, 색 농드를 관찰할 수 없는 경우는 0으로하고 색 농도가 가장 높은 경우를 l0으로하여, 0-10까지 등급을 매겼다. 이 분석 결과는 각각의 장치에 대한 2개의 테스트 웰의 평균치를 나타낸다.

[표]

이들 결과들은, 낮은 pH(즉, 9미만)를 갖는 세정 용액이 허용될 수 없을 정도로 높은 백그라운드 뿐만 아니라 높은 시그널을 제공한다는 것을 나타낸다. 실시예 3-5의 세정 용액은 모두 허용 가능한 색 농도 및 바람직하게 낮은 백그라운드를 제공하였다.

더 이상의 실험결과, TritonX-100을 함유하는 세정 용액이 예외적으로 양호한 보존 안정성을 갖는 다는 것을 나타내었다.

본 발명을 그에 관한 바람직한 구체예들에 대한 특정한 언급으로 상세히 설명하였으나, 본 발명의 정신 및 영역내에서 본 발명에 대한 변형 및 수정이 수행될 수 있다는 사실을 이해하여야 할 것이다.

Claims (20)

1. 약 9-11.5의 pH를 갖으며, 알콜아민 또는 그 염과 비이온성 계면활성제로 구성되는, 단순 포진 비루스(Herpes simplex virus)에 대한 분석에 유용한 수용성 세정 용액.
2. 제1항에 있어서, 약 10-11의 PH를 갖는 수용성 세정 용액.
3. 제1항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄, 폴리글리콜 에테르 또는 폴리에틸렌 글리콜인 수용성 세정 용액.
4. 제1항에 있어서, 약 10-11의 pH를 갖으며, 에탄올아민 또는 그 염과, 비이온성 계면활성제로서 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트 또는 옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올로 구성되는, 수용성 세정 용액.
5. 다음과 같이 구성되는 단순 포진 비루스의 측정 방법 : A. 면역학적 복합체를 형성시키기 위하여, 단순 포진 비루스 항원을 함유하는 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 그에 대한 항체와 접촉시키고, B. 약 9-11.5의 pH를 갖으며, 알콜아민 또는 그 염 및, 비이온성 계면활성제로 구성되는 수용성 세정 용액을 사용하여 복합체로부터 비복합 물질을 분리시키며, C. 샘플중의 단순 포진 비루스의 존재에 대한 지표로서 복합체의 존재를 검출한다.
6. 제5항에 있어서, 단순 포진 비루스 항체가 검출을 위하여 라벨(label)되는 측정 방법.
7. 제6항에 있어서, 단순 포진 비루스 항체가 효소로 라벨되는 측정 방법.
8. 제7항에 있어서, 효소 라벨이 퍼옥시다제 또는 알칼린 포스파타제인 측정 방법.
9. 제5항에 있어서, 단순 포진 비루스 항체가 라벨되지 않으며, 항체-항원 복합체가 검출을 위하여 라벨된 항-항체를 사용하여 측정되는 방법.
10. 제5항에 있어서, 복합체로부터 비복합 물질을 분리시키기 위하여 미세 다공성 막으로 구성되는 일회용 테스트 장치를 전체적으로 또는 부분적으로 사용하여 수행되는 측정 방법.
11. 다음과 같이 구성되는 단순 포진 비루스 항원의 측정 방법 : A. 일회용 테스트 장치내의 미세 다공성막을 단순 포진 비루스를 함유하는 것으로 추정되는 생물학적 샘플로부터 추출된 항원인 단순 포진 비루스 항원을 함유하는 것으로 추정되는 용액과, 항원이 막에 결합되기에 충분한 시간 동안 접촉시키고, B. 약 9-11.5의 pH를 갖으며, 알콜아민 또는 그 염 및, 비이온성 계면활성제로 구성되는 수용성 세정 용액을 사용하여, 결합된 항원으로부터 미결합 물질을 세정시켜내며, C. 막에 결합된 면역학적 복합체를 형성시키기 위하여, 결합된 항원을 항체와 접촉시키고, D. 수용성 세정 용액을 사용하여 복합체로부터 비복합 물질을 분리시킨후, E. 샘플중의 단순 포진 비루스의 존재에 대한 지표로서 결합된 복합체의 존재를 검출한다.
12. 제11항에 있어서, 단계 D에서 사용된 수용성 세정 용액이 약 9-11.5의 pH를 갖으며, 알콜아민 또는 그 염과 비이온성 계면활성제로 구성되는 측정 방법.
13. 제12항에 있어서, 단계 B와 D에서의 세정 용액이 동일한 측정 방법.
14. 제11항에 있어서, 세정 용액중의 비이온성 계면활성제가 폴리에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄, 폴리글리콜 에테르 또는 폴리에틸렌 글리콜인 측정 방법.
15. 제14항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트 또는 옥틸페녹시 폴리에톡시 에탄올인 측정 방법.
16. 제11항에 있어서, 항체가 퍼옥시다제로 라벨되며, 복합체의 측정이 퍼옥시다제 및 과산화 수소의 존재하에 염료를 제공하는 염료제공 조성물을 첨가하는 것에 의하여 성취되는 측정 방법.
17. 다음과 같이 구성되는 단순 포진 비루스의 측정에 유용한 진단 테스트 키트 : (a) 약 9-11.5의 pH를 갖으며, 알콜아민 또는 그 염 및, 비이온성 계면활성제로 구성되는 세정 용액과, (b) 단순 포진 비루스 항원에 대한 항체.
18. 제17항에 있어서, 항체가 검출을 위하여 라벨되는 키트.
19. 제17항에 있어서, 분석을 위한 일회용 테스트 장치를 또한 포함하는 키트.
20. 제17항에 있어서, 단순 포진 비루스 항체에 대한 항체를 또한 포함하는 키트.