KR910002854B1

KR910002854B1 - 효소의 고정방법

Info

Publication number: KR910002854B1
Application number: KR1019840004742A
Authority: KR
Inventors: 제이. 란테로 2세 오레스트
Original assignee: 마일즈 라보라토리즈 인코퍼레이티드; 칼 에이. 쿠츠바취
Priority date: 1983-08-10
Filing date: 1984-08-09
Publication date: 1991-05-06
Also published as: DK384384A; DK170825B1; KR850001529A; DE3462373D1; DK384384D0; ES534905A0; CA1210717A; EP0133531B1; ES8602934A1; JPS6058072A; JPH0218070B2; ATE25463T1; MX162801A; EP0133531A1

Abstract

내용 없음.

Description

효소의 고정방법

본 발명은 효소를 생산하는 미생물 또는 이 미생물에 의해 생산된 효소를 고정하는 방법에 관한 것이다.

미생물 세포에서 유래된 효소가 특이한 화학적 형질전환에 효과가 있다는 것은 이미 공지되어 있다. 이러한 형질전환을 수행하는데 있어서, 세포-유리 효소제, 파괴된 세포 또는 전체 세포가 생촉매물(biocatalyst) 공급원으로서 유효하게 사용될 수 있다. 유리 효소 또는 세포는 배취-형(batch-type) 공정에서는 유효하게 사용될 수 있으나 연속적인 공업적 규모의 공정에서는 사용될 수 없다. 예를들어, 글루코즈 이소머라제(glucose isomerase)에 의해 촉매되는 글루코즈의 프락토즈로의 전환반응 또는 슈크로즈 무타제(sucrose mutase)에 의해 촉매되는 슈크로즈의 팔라티노즈로의 전환반응에 있어서, 기질용액(글루코즈 또는 슈크로즈)을 생촉매물의 고정된 베드(bed)상 및 이를 통하여 전환반응의 생성물을 계속적으로 회수하는데 경제적으로 유리한 공정이 필요하다. 이러한 공정기술은 여러가지 형태의 고정된 생촉매물 제제에 대한 흥미를 증가시키고 있다.

예를 들어, 게스트렐리우스(Gestrelius)는 미합중국 특허 제 4,288,552호에서 글루타르알데하이드에 민감한 효소를 고정시키기 위한 폴리에틸렌이민 및 글루타르알데하이드의 용도에 대해 기술하고 있다. 이 방법의 개선법이 미합중국 특허 제 4,355,105호에 기술되어 있으며, 여기에서, 글루타르알데하이드에 민감하지 않은 세포내 효소를 우선 글루타르알데하이드와 접촉시키고 이어서 폴리에틸렌이민을 반응 배지에 도입하여 고정시킨다. 미합중국 특허, 제 4,167,447호에서는 효소 수용액을 pH 3 내지 7에서 물에 용해된 키토산과 함께 혼합하여 알칼리 또는 황산염 이온의 공급원을 가하여 침전시킬 수 있는 생성물을 형성함으로써 효소를 고정하는 방법에 대해 기술하고 있다. 이 특허에 기술된 방법의 또다른 태양에서, 고체 키토산을 디알데하이드와 같은 다작용성 교차-결합제와 교차-결합시키고 이어서, 효소수용액과 접촉시킨다. 무짤렐리(Muzzarelli)는 키틴 및 키토산 상에서 글루코즈 이소머라제를 포함하는 효소의 고정법에 대해 기술하였다[참조 : Enzyme Microb. Technol., 1980. Vol. 2, 1977년 7월]. 일본국 특허 제 51(1976)-128,474호에서는 폴리알데하이드로 계속 처리하면서 글루코즈 이소머라제를 생산하는 세균과 키토산을 혼합하는 공정을 포함하는 글루코즈 이소머라제 고정방법을 기술하였다. 미합중국 특허 제 4,094,743호에서는 불활성 지지체인 키토산을 디알데하이드로 처리하고 이와같이하여 처리된 지지체에 효소를 고정시켜 수성 배지에 불용성인 효소적으로 활성이 있는 생성물을 제조하는 방법에 대해 기술하고 있다.

계류중인 미합중국 특허원 제 467,851호(출원일 : 1983년 2월 24일)는 폴리아민 응결제 및 교차-결합제를 사용하여 생촉매물을 고정시키는 방법 및 판에 고정된 측면구멍을 제공하고 이들이 자유롭게 회전할 수 있도록 하는 실린더에 위치하는 로우터(rotor)로서 밀드 마찰판(milled friction plate)을 사용하는 구형화 장치(spheronizing device)를 이용하여 고정된 생성물을 연속적으로 구형화시키는 방법에 대해 기술하고 있다. 독일연방공화국 특허공보 제 21 37 042호에서는 효소조성물을 구형화하는 방법, 특히 세척제 산업에 유용한 효소조성물을 구형화하는 방법에 대해 기술하고 있다. 이러한 구형화에 이용되는 장치는 전술한 미합중국 특허원 제 467,851호에서는 기술된 장치와 유사하다.

미합중국 특허 제 4,283,496호에서는 플라보박테리움 아르보레센스(종 ; Flavobacterium arborescens)균주로부터 생산된 효소를 사용하여 글루코즈를 프락토즈로 전환시키는 방법에 대해 기술하고 있다.

본 발명의 방법은 피.루브룸(P.rubrum)에 의해 생산되는 슈크로즈 무타제외에도 바실루스 리체니포르미스(B. licheniformis), 스트렙토마이세스 올리바시어스(S.olivaceous) 및 에이.미쏘우리엔시스(A.missouriensis)에 의해 생산되는 글루코즈 이소머라제와 같은 많은 세포내 효소를 고정하는데 사용될 수 있다. 또한, 이 방법은 세포의 효소를 고정하는데도 사용될 수 있다. 예를들어, 플라보박테리움 아르보레센스 세포를 균질화하고 이들의 글루코즈 이소머라제 활성중 40%를 용해시켜 가용성 효소의 고정을 완결한다.

고정될 세포는 통상적으로 수성 영양 배지에서 성장하고 여과법 또는 원심분리법으로 농축하여 약 10중량%의 무수 물질을 함유하는 수성 배지를 생성한다. 폴리에틸렌디아민, 키토산과 글루타르알데하이드를 수성 배지에 가하여 세포를 함유하는 효소 또는파괴된 세포의 경우 세포의 효소를 응결시킨다. 사용되는 풀리에틸렌이민은 분자량이 적어도 약 500달톤이어야 하고 최대 분자량은 바람직하게는 약 100,000달톤이다. 바람직한 분자량 범위는 약 40,000 내지 60,000달톤이다. 저분자량(약 40,000달톤 이하)을 사용하여 수행되는 고정은 세포 응집을 일으키나 응집된 세포물질은 여과에 의해 쉽게 회수할 수 없다. 실제상으로는 고분자량의 PEI를 사용하여 수행하는 것과 동일한 화학적 성질을 갖는다. 세포 응집체의 물리적 성질은 다소 상이한데 세포 응집체는 여과지에 결합하는 경향이 있다. 또 다른 통상적인 회수법에는 원심분리법이 있다. 응집된 세포물질은 실질적으로는 불용성 형태이기 때문에 세포 응집체를 원심분리를 사용하여 회수할 수 있다. 이어서, 모여진 세포 응집체를 압출하여 통상적인 방법으로 형태를 만들어서 목적하는 고정된 효소 입자를 수득한다. 중합체의 1급 아미노그룹이 중합체의 총 아미노 그룹 함량의 적어도 약 10중량%, 바람직하게는 약 25중량%이다. 효소를 함유하는 배지에 가하기 전에 폴리에틸렌이민은 통상적으로 수용액으로, 바람직하게는 약 1 내지 10중량% 수용액으로 되게 한다. 이렇게 하여 PEI를 세포 혼합물에 충분히 혼합할 수 있게 한다. 통상적으로, 가해진 폴리에틸렌이민의 양은 고정된 효소 제제의 2 내지 22중량%이다.

배지에 글루타르알데하이드와 키토산 수용액을 가하여 교차-결합된 반응 생성물을 형성한다. 이들 반응물은 순서적으로 또는 동시에 가할 수 있다. 그러나, 고정된 효소 입자의 최대 경도(hardness)를 원할 경우, 글루타르알데하이드를 우선적으로 가해야 한다. 어떤 경우에는, 글루타르알데하이드는 효소를 부분적으로 비활성화시킬 수 있으므로, 최대 활성도를 원할 경우에는 키토산을 우선적으로 가한다.

본 명세서에서 사용되는 키토산이란 용어는 키틴을 강 알칼리로 N-탈아세틸화하고 가열하여 수득한 폴리아미노 폴리삭카라이드를 의미한다. 키틴은 분자내에서 1차 반복 단위가 2-데옥시-2-(아세틸아미노)-글루코즈인 폴리삭카라이드이다. 일반적으로, 키틴에서 6단위마다 약 1단위는 아세틸화되지 않는 반면, 키토산에서 모든 반복 단위가 반드시 아세틸화되지는 않는다. 비아세틸화의 정도는 탈아세틸화 반응의 정도에 따라 조절될 수 있다. 해산 무척추동물, 곤충류, 진균류 및 호모와 같이 자연에 광범위하게 분포되어 있는 키틴은 해산물 가공소로부터 풍부하게 얻을 수 있는 게, 새우, 바다가재, 가재 등의 껍질로부터 불순물을 제거하여 용이하게 제조된다. 통상적으로, 사용되는 키토산의 양은 고정된 효소 제제의 5 내지 22중량%, 바람직하게는 3.5 내지 10중량%이다. 키토산은 일반적으로 물에 불용성이기 때문에 효소함유 배지에 가하기 전에 수용액으로 되어야만 한다.

그러나 키토산은 희 수성산 예를들어, 포름산, 아세트산, 피루브산, 락트산, 말산, 시트르산 및 황산을 제외한 무기산(황산은 불용성 키토산 황산염 복합체를 형성한다)에 가용성이다. 키토산을 고정된 세포 복합체의 완전한 일부분이 되게 하는 것이 본 발명의 고정 방법에 유효하다. 그러므로, 사용전에 키토산을 수용액으로 해야 한다. 0.2 내지 1.0중량%의 키토산을 함유하는 용액이 바람직하고 키토산을 0.5% 아세트산 용액에 가하여 제조한다. 용액을 약 60℃로 가열하여 키토산의 용해를 보조한다. 가열후에 키토산 용액을 여과하여 불용성 잔사를 제거한다.

이 고정방법에 사용되는 글루타르알데하이드는 시약을 가하는 동안 효소를 억제하는 국소적인 농축 부분을 없애는데 이용된다. 글루타르알데하이드는 고정된 효소의 4 내지 26중량%, 바람직하게는 7 내지 15중량%로 사용된다.

생촉매물, 폴리에틸렌아민, 키토산 및 글루타르알데하이드를 합쳐서 액체/고체 분리기술에 의해 반응 배지로부터 제거하고 건조하여 입자로 분쇄하여 생촉매적 전환 반응에 사용할 수 있는 생체 활성인 반응 생성물을 형성한다. 그러나, 물질의 더 바람직한 형태는 고체 반응 생성물을 건조하여 약 68 내지 76중량%의 수분을 함유하는 습식 케이크를 형성하여 습식 케이트를, 판에 고정 벽을 제공하여 이 판이 자유롭게 회전할 수 있게 하는 실린더에 위치하는 구형화 장치의 회전판상에서 압출하여 얻을 수 있다. 여과 케이크를 입자를 구형화시키기 위해서 대략 목적하는 직경 크기의 회전 밀드판 상의 벽을 통하여 압축하여 여기서, 회전 밀드판은 실린더 벽에 대하여 경사 절단면(gradient cross section)을 가진 환상 또는 도넛츠-모양으로 배열되 있다. 압출물을 밀드판 상의 마찰력과 이동 세포체의 입자간 충돌 및 마찰에 의해 처음에는 짧은 조각으로 분쇄하고 이상적으로는 구형으로 분쇄한다. 물질의 특정한 형태는 회전판의 원심력과 물질과 밀드 표면사이의 탄젠트 마찰력에 좌우된다. 평평한 회전 표면은 압출물을 구르게(roll)하지 않고 판의 가장자리로 미끄러지게 한다. 운동성질이 상이하여 물질의 최종 형태는 평평한 판을 사용하는 것만큼 일정한 구형이 아니다. 상술한 형태의 구형화기(spheronizer)는 구형을 만드는 장치로 고정된 효소 압출물을 빠르게 작고, 밀도가 크고, 쉽게 조절되는 구형으로 전환시킨다.

압출물은 바람직하게는 상술한 범위의 수분함량을 가져야 한다. 습도가 너무 낮으면 구형화 과정에서 입자를 파괴하여 너무 작은 크기의 입자를 형성한다. 너무 습도가 클 경우는 구형화 과정에서 뭉치고 덩어리져서 과다한 크기의 입자를 형성한다. 다음 실시예에 사용되는 구형화 장치는 일본 오사카 후지파달사에서 제작한 Marumerizer Q-230이란 상품명의 제품이다. 이 장치는 직경 23㎝의 로우터를 가지고 있다. 본 발명에서 사용되는 압출물로부터 구형을 형성하는 바람직한 탄젠트 속도는 4.5 내지 12m/초이다(탄젠트 속도=RPM÷60×πV×판의 직경). 따라서, 23㎝ 직경판의 회전은 목적하는 구형화 결과를 달성하기 위해서는 500 내지 1000 분해능(revolution)/분(min)이어야 한다. 회전 속도가 너무 클 경우, 판은 원치않는 입자의 압출된 효소 응집체를생성시키고 판을 너무 천천히 회전시킬 경우, 크기를 형성하고 구형화하는 힘인 충돌 및 마찰을 위한 충분한 운동량(momentum)이 회전 세포체내에 공급되지 않아, 목적하는 구형화가 달성되지 않는다. 세포 응집체의 구형화후에, 이 세포응집체를 통상적으로 유동 베드 건조기에서 건조한다.

구형화된 효소 응집체 입자의 효소활성도가 분쇄된 입자의 효소활성도와 거의 같거나 더 크다는 것은 구형화 과정이 입자에게 적절한 생촉매 활성을 제공한다는 면에서 유리하다는 것을 나타낸다. 불규칙한 형태보다 본질적으로 다루기 쉬운 구형입자를 제공하는 것외에도 이 과정에 의해 제조된 구형은 더 큰 물리적 인성을 가지며 반응관에서 효소생산력을 증가시킨다.

본 발명을 실시하는 방법을 다음 실시예에서 더 상세히 설명한다 :

약자 : PEI-폴리에틸렌이민

GA-글루타르알데하이드

Chit-키토산

[실시예 1]

옥수수 스팁(steep) 7%, 단맛의 유청(whey) 분말 1.4% 및 효모 추출물 15%로 구성된 액체 배지를 pH 8.3으로 조절하여 생성물 1000ℓ를 1500ℓ들이 발효관에 넣는다. 배지를 121℃에서 60분간 멸균하여 플라보박테리움 아르보레센스(F.arborescens)균주 ATCC 4358로 접종시켜 30℃에서 18시간 배양한다. 이어서 글루코즈 이소머라제 함유 세포를 자체-정제 보울(bowl)이 있는 westfala Model SAMR 5036 원심분리기로 원심분리하여 발효 육즙으로부터 농축시킨다. 농축물은 약 10% 무수물을 함유한다. 실질적으로 원심분리하는 동안 세포 파괴는 일어나지 않는다. 세포 슬러리 pH를 8.0으로 조절하고 이어서 70℃로 가열하여 70℃에서 15분간 유지시켜 약 25℃로 냉각한다. 글루코즈 이소머라제 활성은 열처리하는 동안 거의 비활성화되지 않는다. 열처리는 다음 2가지 작용을 한다 : 1) 고정시킨후 세포물질의 회수를 용이하게 하고 2) 세포와 함께-생산되는 프로테아제를 비활성화 시킨다.

열-처리된 세포 슬러리 200㎖에 교반하에 탈이온화수(DI-water) 1000㎖를 가하고 5%(W/V) PEI(P-600 Cardora Chemical Co.) 400㎖를 희석된 세포 슬러리에 가한다. PEI를 슬러리와 충분히 혼합한 후, 10%(W/V) 글루타르알데하이드(25% 시판용 글루타르알데하이드에서 제조한다) 20㎖를 슬러리와 충분히 혼합한다. 이어서, 200㎖의 01.25%(W/V) 키토산 용액을 가한다. 키토산 첨가후 pH는 7.8이고 희석한 수산화나트륨을 가하고 pH 8.0으로 조절한다. 이 고정 과정에서 pH는 7.0 내지 9.0이다. 특정한 미생물에 있어서는, pH 8.0을 선택한다. 왜냐하면 pH 7.5이하에서 응결과정이 pH 8.0에서 만큼 뚜렷하지 않기 때문이다. 적절한 양의 키토산을 혼합하여 DI 수중의 1% 용액을 만들어 키토산 용액을 제조한다. 이어서, 빙초산을 최종농도가 0.5%가 되게 하고 혼합물을 60℃로 가열하여 충분히 혼합한다. 실제로 모든 키토산이 가열 단계에서 용해된다. 이어서, 가열된 용액을 DI 수로 4배 희석하고 부흐너(Buchner) 펀넬 상에서 Sharkskin 여과지로 여과한다. 여액을 약 25℃로 냉각하여 pH를 조심스럽게 1N 수산화나트륨을 가하여 5.0으로 조절한다. 키토산을 가한후 슬러리를 1시간동안 방치한다. 1시간후에 세포체를 부흐너 펀넬 상에서 모아서 세포 케이크를 1.0㎜ 다이구멍을 통해 압출시킨다. 60℃에서 건조하여 압출된 물질을 탈수한후 30메쉬체를 통과하고 40메쉬체를 통과하지 않는 입자로 분쇄하여 글루코즈 이소머리제 활성도와 입자 인성(toughness)을 측정한다.

250㎖ 엘렌마이어 플라스크에 효소 0.1g를 넣고 기질 50㎖ [2M 글루코즈, 20mM MgSO₄·7H₂O 0.5mM COCl₂·6H₂O 및 20mM HEPES(N-2-하이드록시에틸-피페라진-N'-2-에탄노설폰산) 완충액(pH 8.0)을 가하여 입자에서 글루코즈 이소머라제 활성도를 측정한다. 건조한 입자를 실온에서 약 1시간동안 수화시킨다. 이어서, 플라스크를 60℃ 수욕에 방치한다. 플라스크를 입자가 이동할 수 있는 속도로 수욕 진탕기에서 진탕한다. 10분 및 70분후에 시료 혼합물로부터 시료 0.1㎖를 채취하여 0.1M HCIO₄, 4.0㎖를 가한다. 시료 0.05㎖를 5% 시스테인 0.5㎖ 및 75% H₂SO₄4.5㎖와 37℃에서 30분간 배양하여 412㎚에서 흡광도를 측정하는 시스테인 -H₂SO₄방법(Dische, Z.J. Biological Chemistry, Vol. 181,p.379, 1949)으로 형성된 프락토즈 양을 측정한다. 고정된 글루코즈 이소머라제 활성도의 단위(IGIU)는 분당 1μmole의 프락토즈를 생산하는 효소의 양이다.

Instron Universal Tester Model 1102를 사용하여 pH 8.0의 2M 글루코즈에서 수화된 20 내지 40메쉬입자를 압축하는데 필요한 일의 양을 측정하여 입자인성을 결정한다. 이 방법의 상세한 설명은 계류중인 미합중국 특허원 제 467,851호에 기술되어 있다. 입자인성은 ㎏-in의 단위로 표시한다.

상술한 고정방법으로 200㎖ 세포 슬러리를 처리하여 421 IGIU/g의 활성도 및 3.9㎏-in의 입자인성을 가진 무수물 21.1g을 생성한다.

[실시예 2 내지 5]

글루타르알데하이드와 키토산을 가하기 전에 실시예 1의 열-처리된 세포 슬러리에 농도를 각기 달리한 PEI를 가한다. 시약을 하개 고정시킨후, 세포체를 실시예 1과 같이 모으고 압출하여 건조시킨다. 다음 표 (1)은 여러가지 농도의 PEI에서의 입자 통합성(integrity)과 활성도를 나타낸다. 고정된 효소의 입자 통합성 및 수율은 PEI의 농도가 증가함에 따라 개선되어지는 것을 알 수 있다.

[표 1]

* 실시예 1의 입자인성에 대한 %

[실시예 6 내지 24]

PEI를 실시예 1과 같이 첨가한후 세포 슬러리에 각기 다른 농도의 글루타르알데하이드를 가한다. 2개의 PEI 농도에서의 활성도 및 입자 통합성을 표 2에 기재하였다. 글루타르알데하이드의 농도가 증가함에 따라 입자인성이 증가되는 것을 알 수 있다. 활성도는 글루타르알데하이드 농도와 역관계를 보이고 있다. 겉보기 활성도에서의 감소는 효소반응의 기질과 생성물의 세포체 운반 저항성을 증가시키는 세포성분과 반응할 수 있는 효소 또는 글루타르알데하이드를 비활성화하는 방법으로 글루타르알데하이드와 효소를 화학반응시킨 결과일 수 있다. 또한, 표 2의 결과는 고정된 효소제는 PEI의레벨이 높을수록 더 많이 얻어진다는 것을 보여주고 있다.

[표 2]

* 표 1참조

[실시예 25 내지 30]

키토산 농도를 다양하게 하여 고정을 수행한다. 2개의 다른 농도의 PEI 및 글루타르알데하이드를 사용하여 실시예 1의 방법으로 수행한다. 활성도와 입자인성에 대한 효과를 표3에 기재하였다. 키토산의 농도를 증가시킴에 따라 2가지 PEI 농도에서의 활성도 및 입자인성이 개선된다. 글루타르알데하이드의 농도가 높을수록 입자인성이 개선되며 활성도는 높은 키토산 농도에서 개선되지 않는다. 3번째 PEI 농도에서의 여러가지 키토산 온도를 고정과정에 사용하였다(실시예 28 내지 30). 표 3의 결과는 키토산의 최적 농도이상에서 효소 회수율은 감소된다는 것을 보여준다.

[표 3]

* 표 1참조

[실시예 31 내지 35]

실시예 1에 기술된 고정 과정에서 여러가지 분자량의 PEI 시료를 사용한다. 표 4의 결과는 높은 분자량의 PEI가 가장 잘 작용하는 것을 보여주고 있다. 저분자량 PEI를 사용하는 고정은 통상적인 여과법으로 회수할 수 없는 응결된 세포체의 형태를 생성한다. PEI 및/또는 글루타르알데하이드 및/또는 키토산의 농도를 변경시켜 적절한 응결체를 수득할 수 있다.

[표 4]

* 50% 고체로서의 PEI(Kodak 제품)

** 표 1참조

[실시예 36 내지 40]

실시예 1에서 가한 글루타르알데하이드와 키토산의 순서를 바꾼다. 표 5는 여러가지 농도의 PEI에서 글루타르알데하이드와 키토산의 첨가순서를 바꾸어 관찰한 활성도 및 입자 인성을 나타낸 것이다. 다소 입자 인성은 감소 될지라도 글루타르알데하이드를 마지막에 가할 경우는 더 큰 고정된 효소 활성도를 얻는다.

[표 5]

* 표 1참조

[실시예 41]

실시예 1에 기술된 바대로 제조한, 열-처리된 세포 슬러리를 2배 용적의 물로 희석한다. 세포 슬러리에 실시예 1의 방법을 사용하여 비희석된 세포 슬러리 1ℓ당 PEI 15g, 키토산 2.5g 및 글루타르알데하이드 7.5g을 가한다. 세포체를 모아서 12인치 바스킷트 원심분리기에서 약 75% 습도로 탈수한다. 발효를 가능한 한 동일조건하에서 수행하나 여러가지 발효로부터 분리한 세포는 고정된 세포체의 구성에 있어서 완전히 동일하지 않다. 그러므로, 배취(batch)에 따라 구형 입자를 형성하는 바람직한 습도는 71 내지 75% 범위에서 다양하다. 판에 고정된 벽을 제공하고 이 판의 회전을 자유롭게 하는 실린더에 위치하는 로우터(rotor)로서 밀드 마찰판(milled friction plate)을 포함하는 구형화 장치(spheronizing maschine)의 분석판 상에서 1.0㎜ 다이를 통하여 세포 케이크를 압출한다. 밀드 판은 직경이 23㎝이고 2㎜ 피치 및 1㎜ 높이의 구조에서 작용한다. 판을 600RPM의 속도로 회전시켜 약 2분동안 7.2m/초의 탄젠트 속도를 제공하게 하고 구형화된 압출물을 원심력에 의한 분리를 통하여 구형화 장치로부터 방출시킨다. 구형화된 입자를 유동 베드 건조기(Aeromatic AG, Model No.1)에서 약 68℃의 유입 공기온도로 건조시킨다. 이 과정에서 세포 슬러리 1ℓ당 108g의 무수물을 생성한다. 고정된 글루코즈 이소머라제 제제를 20/40 메쉬 크기의 입자 1g당 437 IGIU에서 분석한 결과 이 제제는 442 입자 인성(실시예 1을 100으로 하여 비교함)을 갖는다. 이 고정된 효소중 10g(30/40 메쉬)을 4.1mM 마그네슘과 250ppm SO₂를 함유하는 pH 8.0의 40%(W/W) DS(무수 고체) 글루코즈에서 25℃로 1시간동안 수화시킨다.

이어서 수화된 효소 슬러리를 60℃ 수욕에 약 2시간 방치하여 100×1.5㎝의 유리 피복된 컬럼으로 이행시킨다. 효소 입자를 컬럼에 가하기 전에 유리섬유(glass wool)의 작은 마개를 밑바닥에 넣고 5㎖의 20/40메쉬 알루미나 입자를 가한다. 컬럼 온도를 60℃로 유지한다. 이어서, 글루코즈 이소머라제 제제를 42 내지 44%의 프락토즈 전환을 유지하는 유출속도로 베드(bed)를 통하여 여과한다. 표6은 시간에 대한 활성도 및 효소 1g당 42% 프락토즈의 무수 고체 g으로 표시하는 생산성을 나타낸다. 활성도 분해도는 약 58일이 반감기에 도달하는데 필요하다는 것을 보여준다. 반감기에서는 약 5,060g의 DS(42% 프락토즈)가 고정된 효소 1g당 생산된다.

[pH 8.0, 25℃에서 4.1mM Mg²⁺및 250ppm SO₂를 함유한는 40% DS(W/W) 글루코즈를 사용한 60℃에서의 플라보박테리움 아르보레센스(F.arborescens)의 안정성 및 생산성(더 상세한 사항은 실시예 41을 참조)]

[표 6]

[실시예 42]

이 실시예는 세포의 효소를 고정하는 방법을 설명한다. 플라보박테리움 아르보레센스의 세포 육즙을 통상적인 방법으로 원심분리한다. 세포 슬러리를 DI 수로 희석하여 배양육즙의 34용적%가 되게 한다. 희석한 세포 슬러리를 8,000 내지 10,000 psi에서 Manton-Gaulin 균등기로 균질화한다. 세포물질을 3번 균등기에 통과시킨다. 균질화에 의한 효소의 용해도를 다음의 표에 기재하였다.

[표 7]

이어서, 3번 균질화한 세포물질을 다음 방법으로 고정한다. 균질화된 세포 슬러리 10ℓ를 pH 8.0으로 조절하고 70℃에서 15분간 배양시켜 약 25℃로 냉각한다. 5% PEI(p-600, Cordova) 1038㎖를 가하고 교차-결합시키고 이어서, 3,460㎖의 0.25% 키토산을 가하고 최종적으로 10% 글루타르알데하이드 347㎖를 가한다. 세포 혼합물의 pH를 8.0으로 조절한다. 글루타르알데하이드를 첨가하자 마자 등명한 상등액에 의해 판단되어지는 바와 같이 완전한 세포 응집이 일어난다. 응집된 세포물질을 12% 바스킷트 원심분리기에서 모은다. 이어서, 세포 케이크를 압출하여 실시예 41에 기술된 공정으로 구형 입자로 모양을 형성한다.

여액에 잔류하는 글루코즈 이소머라제 활성도는 총 활성도의 단지 4%에 불과하다(표 7). 이 결과는 실질적으로 모든 가용성 활성도가 고정되었음을 보여준다. 고정 결과는다음 표와 같다.

[표 8]

* 표 1참조

Claims

고정된 효소 또는 고정된 효소를 함유하는 세균 세포물질을 함유하는 수성 배지에 분자량이 적어도 약 500달톤이고 중합체의 아미노 그룹중의 1급 아미노 그룹의 함량이 적어도 10중량%인 폴리에틸렌아민(PEI) 수용액을 가하고; 글루타르알데하이드와 키토산 수용액을 수성 배지에 가하여 교차-결합된 반응 생성물을 형성하고; 교차-결합된 반응 생성물을 수성 배지로부터 회수하고, 건조시켜 고정된 효소 제제를 제공함을 포함하여, 슈크로즈 무타제와 글루코즈 이소머라제로 이루어진 그룹으로부터 선택되며 생촉매 활성을 지닌 고정된 효소를 함유하는 고정된 효소 제제를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 폴리에틸렌이민의 분자량 범위가 40,000 내지 60,000 달톤인 방법.
제1항에 있어서, 폴리에틸렌이민을 수성 배지에 가하기 전에 1 내지 10중량%의 수용액으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 폴리에틸렌이민의 양이 고정된 효소 제제의 2 내지 22중량%인 방법.
제1항에 있어서, 사용된 키토산의 양이 고정된 효소 제제의 0.5 내지 22중량%인 방법.
제5항에 있어서, 키토산의 양이 고정된 효소 제제의 3.5 내지 10중량%인 방법.
제1항에 있어서 사용된 글루타르알데하이드의 양이 고정된 효소 제제의 4 내지 26중량%인 방법.
제7항에 있어서, 글루타르알데하이드의 양이 고정된 효소 제제의 7 내지 15중량%인 방법.
제1항의 방법에 의해 제조된 고정된 효소 제제.
고정된 효소를 생산하는 세포체를 함유하는 수성 배지에 분자량이 40,000 내지 60,000 달톤이고 중합체의 아미노 그룹중의 1급 아미노 그룹의 함량이 적어도 10중량%인 1 내지 10중량%의 폴리에틸렌이민 수용액을 충분량 가하여 폴리에틸렌이민 양이 고정된 효소 제제의 2 내지 22중량%가 되도록 하고; 고정된 효소 제제의 7 내지 15중량%의 글루타르알데하이드 및 키토산의 양이 고정된 효소 제제의 3.5 내지 10중량%가 되도록 하는 양의 키토산 수용액을 수성 배지에 가하여 교차-결합된 반응 생성물을 생성하고; 수성 배지로부터 교차-결합된 반응 생성물을 회수하고, 건조시켜 고정된 효소 제제를 제공함을 포함하여, 슈크로즈 무타제 및 글루코즈 이소머라제로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 생촉매 활성을 지닌 고정된 효소를 함유하는 고정된 효소 제제를 제조하는 방법.
고정된 효소 또는 고정된 효소를 함유하는 세균 세포물질을 함유하는 수성 배지에 분자량이 적어도 500 달톤이고 중합체의 아미노 그룹중의 1급 아미노 그룹의 함량이 적어도 10중량%인 폴리에틸렌이민 수용액을 가하고; 고정된 효소 제제의 4 내지 26%의 글루타르 알데하이드 및 키토산의 양이 고정된 효소 제제의 0.5 내지 22중량%가 되도록 하는 양의 키토산 수용액을 가하여 교차-결합된 반응 생성물을 형성하고; 교차-결합된 반응 생성물을 수성 배지로부터 회수하고, 부분적으로 건조시켜 습식 케이크를 형성하고; 판에 고정된 벽을 제공하고 이판이 자유롭게 회전할 수 있게 하는 실린더에 위치하는 로우터로서 밀드 마찰판을 포함하는 구형화 장치의 회전판상의 구멍을 통하여 습식 케이크를 압출하여 회전시킴으로써 구형의 고정된 효소 제제를 형성함을 포함하여, 슈크로즈 무타제 및 글루코즈 이소머라제로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 생촉매 활성을 지닌 고정된 효소를 함유하는 구형의 고정된 효소 제제를 제조하는 방법.
제11항에 있어서, 습식 케이크가 68 내지 76중량%의 수분을 함유하는 방법.
제11항에 있어서, 판을 4.5 내지 12m/sec의 접선 속도를 제공하기에 충분한 속도로 회전시키는 방법.
고정된 효소를 생산하는 세포물질을 함유하는 수성 배지에 분자량이 40,000 내지 60,000 달톤 범위내이고 중합체의 아미노 그룹중의 1급 아미노 그룹의 함량이 적어도 10중량%인 1 내지 10중량%의 폴리에틸렌이민 수용액을 폴리에틸렌이민의 양이 고정된 효소 제제의 2 내지 22중량%가 되도록 가하고; 고정된 효소 제제의 7 내지 15중량%의 글루타르알데하이드 및 키토산의 양이 고정된 효소 제제의 3.5 내지 10중량%가 되도록 하는 양의 키토산 수용액을 수성 배지에 가하여 교차-결합된 반응 생성물을 형성하고; 교차-결합된 반응 생성물을 회수하고, 부분적으로 건조시켜 수분 함량이 약 68 내지 76중량%인 습식 케이크를 형성하고; 판에 고정된 벽을 제공하고 이 판이 자유롭게 회전할 수 있게 하는 실린더에 위치하는 로우터로서 밀드 마찰판을 포함하는 구형화 장치의 회전판상의 구멍을 통하여 습식 케이크를 압출(이때, 판은 압출하는 동안 4.5 내지 12m/sec의 접신 속도를 제공하는 속도와 목적하는 생성물이 생성되기에 충분한 시간동안 회전한다)시킴을 포함하여, 슈크로즈 무타제 및 글루코즈 이소머라제로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 생촉매 활성을 지닌 고정된 효소를 함유하는 구형의 효소 제제를 제조하는 방법.
제14항에 있어서, 세포가 글루코즈 이소머라제를 생산할 수 있는 플라보박테리움 아르보레센스(F. arborescens) 균주인 방법.
제15항에 있어서, 균주가 ATCC 4358인 방법.
제1항에 있어서, 수성 배지가 효소를 함유하는 세균 세포물질을 함유하는 방법.
제1항에 있어서, 세균 세포가 글루코즈 이소머라제를 생성할 수 있는 플라보박테리움 아르보레센스(F. arborescens) 균주인 방법.
제18항에 있어서, 균주가 ATCC 4358인 방법.