KR910009901B1 - 하이브리드 인간 백혈구 인터페론 - Google Patents

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하이브리드 인간 백혈구 인터페론

제1도는 8개의 백혈구 인터페론("LeIF") 상보성 DNA("cDNA")클론의 코드화영역의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다.

제2도는 8가지 형태의 LeIF 클로닝된 cDNA(A 내지 H)의 제한 엔도뉴클레아제 지도이다.

제3도는 뉴클레오타이드 서열로부터 예상되는 8가지의 LeIF 단백질 서열의 비교도이다.

제4도는 성숙 백혈구 인터페론 A와 D의 아미노산 서열의 비교도이다.

제5도 및 제6도는 각각 마우스세포에서, 뇌심근염 바이러스(“EMC”) 및 소수포성 구내염 바이러스(“VSV”)에 대한 본 발명의 바람직한 하이브리드 백혈구 인터페론(“LeIF-A/D”)의 활성을 비교 시험한 결과를 나타낸 것이다.

제7도 및 제8도는 각각 마우스와 햄스터에서, EMC 바이러스 감염에 대하여 LeIF-A/D 및 다른 인터페론을 사용한 비교시험의 결과를 나타낸 것이다.

제9도는 I 및 J형태를 포함한 다섯가지 LeIF 단백질의 DNA 염기서열이다.

본 발명은 바이러스성 질환 및 종양성 질환(neoplastic disease)의 치료에 유용한 하이브리드 백혈구 인터페론을 재조합 DNA 기술에 의해 미생물학적으로 제조하는 방법 및 이러한 제조방법에서의 수단 및 최종 생성물에 관한 것이다.

비교적 균질한 백혈구 인터페론은 정상인이나 백혈병 환자의 백혈구로부터 수득된다. 이들 인터페론은 그들의 표적 세포에서 바이러스-저항성을 부여할 수 있는 강력한 능력으로 특징지워지는 단백질의 한 부류이다. 또한, 인터페론은 세포증식을 억제할 수 있고 면역반응을 조절할 수 있다. 이러한 특성에 의해 인터페론은 바이러스 감염증 및 악성종양 치료시의 치료제로서 임상적 사용이 제시되는 것이다.

더욱 최근에는, 하기 문헌에 기술된 바와같이 재조합 DNA 기술을 이용하여, 서로의 아미노산 서열이 70% 정도 동종성을 나타내는 다수의 상이한 백혈구 인터페론을 미생물학적으로 제조하게 되었다[참조:David V.Goeddel et al., Nature 290, 20-26(1981)]. 특히 LeIF A,B,C,D,F,G 및 H로 지정된 다양한 백혈구 인터페론의 아미노산 서열을 코드화하는 유전자는 각각 문헌[David V.Goeddel 및 Sidney Pestka; Koeffler, H.P. 및 Golde, D.W., Science 200, 1153-1154(1978)]에 기술된 세포라인(cell line) KG-1로부터 수득된다. 세포라인 KG-1은 ATCC 기탁번호 CPL 8031로 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(American type culture collection)에 기탁되어 있다. 세균성 발현을 위해 플라스미드성 베히클(plasmidic Vehicle)내에서 적절히 전개된 이러한 유전자들을 사용하여 숙주 세균, 바람직하게는 1978년 10월 28일자로 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에 기탁번호 31446으로 기탁되어 있는 이.콜라이 K-12균주(Strain) 294를 형질전환시킬 수 있다.

재조합 DNA 기술에서 작용자는 세균 및 다른 미생물에서, 때로는 세포당 다중 복제체에서 발견되는 이본쇄 DNA의 비-염색체성 루프인 플라스미드이다. 플라스미드 DNA에서 코드화되는 정보에는 대체로 하나 이상의 선택적 특성(예:세균의 경우, 선택 배지내에서 인지되며 선택적으로 성장하는 중요한 플라스미드를 함유하는 숙주세포의 클론을 가능케하는 항생물질에 대한 내성) 및 자세포에서 플라스미드를 복제시키는데 필요한 것, 즉 레플리콘(“replicon”)이 포함된다. 플라스미드의 유용성은 플라스미드가 하나 이상의 제한 엔도 뉴클레아제 또는 “제한 효소”(이들은 각각 플라스미드 DNA 상에서 상이한 부위를 인식한다)에 의해 특이적으로 전달될 수 있다는 점에 있다. 그러므로해서, 이종 유전자 또는 유전자 단편을 절단부위 또는 절단부위에 인접한 재작제된 말단부위에서 말단적 연결방법에 의해 플라스미드에 삽입시킬 수 있다. DNA 재조합은 세포밖에서 수행하지만, 생성된 “재조합” 플라스미드는 형질전환으로 알려진 과정을 통하여 세포내로 도입시킬 수 있으며, 형질 전환체를 성장시킴으로써 대량의 이종 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 수득한다. 더욱이, 유전자가, 코드화된 DNA 메시지의 전사 및 해독을 조정하는 플라스미드의 부위와 관련하여 적절히 삽입된 경우, 생성된 발현 베히클을 사용하여 실제적으로 삽입된 유전자가 코드화한 폴리펩타이드 서열을 생산할 수 있는데, 이 과정을 발현이라 한다.

발현은 RNA 폴리머라제에 의해 인식되고 결합되는 프로모터(promoter)영역에서 시작된다. 본 발명의 시행에 바람직한 트립토판 또는 “trp” 프로모터의 경우에서와 같이, 몇몇 경우에 프로모터 영역은 오퍼레이터(operator)영역에 의해 중복되어 연합된 프로모터-오퍼레이터 영역을 형성한다. 오퍼레이터는 특정 프로모터에서의 전사 개시의 빈도를 조절하는 소위 리프레서(repressor) 단백질에 의해 인식되는 DNA 서열이다. 폴리머라제 DNA를 따라 이동하여, 코드화 본쇄에 함유되어 있는 정보를 그의 5′ 말단으로부터 3′ 말단으로 전령 RNA로 전사시켜, 이를 다시 DNA가 코드화하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로 해독한다. 각각의 아미노산은 “구조 유전자”로 언급될 수 있는 부위, 즉, 발현된 생성물의 아미노산 서열을 코드화하는 부위내에서, 뉴클레오타이드 삼중자 또는 “코돈(codon)”에 의해 코드화된다. RNA 폴리머라제는 프로모터에 결합된 후, 먼저 리보좀(ribosome) 결합부위를 코드화하는 뉴클레오타이드, 및 이어서 해독 개시 또는 “출발”시그널(대체로 ATG, 생성된 전령 RNA에서는 AUG로 된다), 및 이어서 그의 구조 유전자 내의 뉴클레오타이드 코돈을 전사시킨다. 정지 코돈은 구조 유전자의 말단에서 전사되며, 계속해서 폴리머라제는, 정지 시그널의 존재로 인해 리보좀에 의해 해독되지 않은 상태로 남아있는 전령 RNA의 추가의 서열을 형성할 수 있다. 세균의 경우 대체로 mRNA가 형성되면 리보좀은 전령 RNA상의 결합부위에 결합하여, 이들은 해독 출발 시그널에서 시작하여 상기 언급한 정지 시그널에서 끝나는 코드화된 폴리펩타이드를 생산한다. 리보좀 결합 부위를 코드화하는 서열이 AUG 개시 코돈에 관하여 적절히 위치해 있는 경우 및 모든 나머지 코돈이 개시 코돈 다음에 차례대로 존재하는 경우 원하는 생성물이 생성된다. 얻어지는 생성물은 숙주세포를 용해시킨 다음 다른 세균 단백질로부터 적절히 정제하여 회수함으로써 수득할 수 있다.

여러 가지 백혈구 인터페론을 코드화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 관한 연구로, 특정의 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 절단부위의 존재 및 위치와 관련하여 이들중 대부분에 어느정도의 공통점이 있음을 알게 되었다. 본 발명에 따라, 이 공통점을 이용하여, DNA 재조합에 의해 모 유전자에 의해 코드화된 인터페론의 항 바이러스 특성 및 다른 특성을 어느정도 나타내리라고 기대할 수 있는 하이브리드 백혈구 인터페론의 미생물학적 생산에 유용한 신규의 하이브리드 유전자를 만들 수 있는 잇점을 취할 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 이러한 하이브리드 백혈구 인터페론은 모 유전자에 의해 코드화된 것 보다 증진된 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명에서 목적하고 있는 백혈구 인터페론 단백질의 부류를 코드화하는 모 백혈구 인터페론 유전자는 각각 자연적인 대립형질 차이를 나타낸다. 이들 차이는 전체 단백질 서열에서의 아미노산의 차이(들)에 의해 또는 상기 서열에서 아미노산(들)의 결손, 치환, 삽입, 역위 또는 첨가에 의해 설명될 수 있다. 본 발명에서의 각각의 모 백혈구 인터페론, 즉, 표지된 LeIF A, LeIF B…LeIF J등의 경우, 이러한 대립형질 차이는 이들을 정의하는 표지 또는 용어의 범주내에 있으므로 본 발명에 포함된다.

본 발명의 이들 목적 및 다른 목적 및 잇점을 얻을 수 있는 방법은 하기의 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 더욱 명백해질 것이다:

제1도는 8개의 백혈구 인터페론 상보성 DNA 클론의 코드화 영역의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다. 이들중에서 LeIF E로 상응하게 표지된 하나의 서열은 활성 백혈구 인터페론을 코드화하지 못하는 외견상의 “슈도유전자(pseudogene)”이고, LeIF G로 표지된 다른 하나는 상응하는 인터페론종에 대한 완전 서열보다 적은 서열을 함유한다. 각 LeIF에 대한 ATG 해독 개시 코돈 및 종결 삼중자에는 밑줄을 그었다.

제2도는 8가지 형태의 LeIF 클로닝된 cDNA(A 내지 H)의 제한 엔도뉴클레아제 지도를 도시한 것이다. 클론을 함유하는 플라스미드는 dC:dG 말단부가(tailing) 방법에 의해 작제된다[참조:Goeddel, D.V.et al., Nature 287, 411-416(1980)]. 그러므로, cDNA 삽입물은 Pst I을 사용하여 절단할 수 있으며, 즉, 각 삽입물의 각 말단은 pst I 제한 엔도뉴클레아제 절단부위이다. 각 cDNA 삽입물의 각 말단에서의 라인은 플랭킹(flanking) 단일중합성 dC:dG 말단이다. Pvu II, Eco RI 및 Bgl II 제한부위의 위치를 나타내었다. 도면에서 어두운 부분은 성숙 LeIF의 코드화 서열을 나타내고; 빗금친 부분은 시그널 펩타이드 코드화 서열을 나타내며; 공란 부분은 3′ 및 5′ 비코드화 서열을 나타낸다.

제3도는 뉴클레오타이드 서열로부터 예상되는 8가지의 LeIF 단백질 서열의 비교를 나타낸 것이다. IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature에 의해 추천된 1문자 약자를 사용한다: A, 알라닌; C, 시스테인; D, 아스파르트산; E, 글루탐산; F, 페닐알라닌, G, 글리신; H, 히스티딘; I, 이소로인신; K, 리신; L, 로이신; M, 메티오닌; N, 아스파라긴; P, 프롤린; Q, 굴루타민; R, 아르기닌; S, 세린; T, 트레오닌; V, 발린; W, 트립토판; 및 Y, 티로신. 번호는 아미노산 위치를 나타내며, 여기에서 S는 시그널 펩타이드를 나타낸다. LeIF A의 165개 아미노산 서열중의 44위치에서의 대시(-)는 다른 LeIF의 166개의 아미노산 서열에 LeIF A 서열을 맞추기 위해 도입한 것이다. LeIF E 서열은 그의 코드화 영역에서 여분의 뉴클레오타이드(제1도에서 187위치)를 무시한 채 결정한 것이다. 별표는 동일상내에서의 정지 코돈을 나타낸다. 모든 LeIF(슈도 유전자 LeIF E 제외)에 공통인 아미노산도 나타내었다. 밑줄친 잔기들은 인간의 섬유아세포 인터페론에도 존재하는 아미노산이다.

제1도에서 뉴클레오타이드 +1 내지 69는 제3도의 S 1 내지 S 23 아미노산에 상응한다. 제1도의 코돈 TGT(뉴클레오타이드 70 내지 72)는 제3도의 시스테인(C, 아미노산 1)에 상응한다. 제3도에서, Pvu II 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위는 LeIF A,B,D,F 및 G에서 아미노산 92와 93에 대한 코돈사이, 즉, 제1도의 뉴클레오타이드 346과 347 사이에 존재한다.

제4도는 성숙 백혈구 인터페론 A와 D의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이며, 여기에서 LeIF A에서의 아미노산 44의 결손을 대시로 나타냈다. LeIF D 아미노산에 대해서는 상응하는 LeIF A의 아미노산과는 다른 것만을 나타내었다: LeIF D의 아미노산 서열은 다른 부분에서는 LeIF A와 동일하다. 제4도는 또한 본 발명의 바람직한 하이브리드 백혈구 유전자를 제조하는데 사용되는 Bgl II 및 pvu II 제한 엔도뉴클레아제 절단부위의 상응하는 유전자상의 상대적 위치도 나타내었다.

제5도 및 제6도는 각각 마우스 세포에서, 뇌심근염 바이러스(“EMC”) 및 소수포성 구내염 바이러스(“VSV”)에 대한 본 발명의 바람직한 하이브리드 백혈구 인터페론(“LeIF-A/D”)의 활성을 비교시험하여 얻은 결과를 나타낸 것이다.

제7도 및 제8도는 각각 마우스와 햄스터에서, EMC 바이러스 감염에 대해 LeIF-A/D 및 다른 인터페론을 사용하여 비교시험한 결과를 나타낸 것이다. 제7도에서의 데이터는 감염시키기 3시간전에 복강내 투여한 결과이다. LeIF-A/D 및 LeIF-A의 용량은 WISH 세포상에서 역가측정한 결과이다.

제9도는 I 및 J형태를 포함한 다섯가지 LeIF 단백질의 DNA 서열을 도시한 것이다.

[바람직한 태양의 설명]

[사용되는 미생물]

기술된 연구에는 두 개의 미생물이 사용된다:미합중국 특허 제4190495호에 기술되어 있는 바와같은 이.콜라이 X1776, 및 영국 특허공보 제2055382A호에 기술되어 있는 것과 같은 이.콜라이 K-12 균주 294(end A, thi-, hsr-, hsm_K+). 이들 각각은 1979년 7월 3일 1978년 10월 28일자로 각각 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에 ATCC 기탁번호 제31537호 및 제31446호로 기탁되어 있다. 모든 재조합 DNA의 연구는 국립보건원(the National Institute of Health)의 지침에 따라 행한다.

본 발명의 가장 바람직한 태양에서, 본 발명은 상기 정의된 균주 이.콜라이 X1776 및 이.콜라이 K-12균주 294뿐만 아니라, 이.콜라이 B와 같은 다른 공지의 이.콜라이 균주를 포함한 이.콜라이, 또는 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(ATCC)과 같은 공인된 미생물 기탁기관에 기탁되어 있고, (잠재적으로) 이용가능한 다른 많은 미생물 균주(참조:ATCC 목록 및 독일연방공화국 공개공보(2644432)와 관련하여 기술한다. 이들 다른 미생물에는, 예를들어, 그의 내부의 이종 유전자 서열을 복제시키고 발현시킬 수 있는 플라스미드를 이용하는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스류, 및 예로써 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 및 세라티아 마르세산스(Serratia marcesans)가 언급될 수 있는 다른 엔테로박테리아세애(enterobacteriaceae)가 포함된다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모도, 효모 프로모터의 조절하에 이를 코드화하는 유전자를 발현시킴에 의해 본 발명의 인터페론 단백질을 제조하는데 있어 숙주 유기체로서 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따라, 개개의 모 유전자 및 그의 각 말단내에 공통적으로 존재하는 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 운반체 발현 플라스미드(벡터)에서의 동일한 부위와 함께 유리하게 취함에 의해, LeIF하이브리드를 제조한다. 예를들어, pLeIF A trp 25 발현 플라스미드의 xba I 내지 Pst I분해물의 큰(∼3900bp) 단편을 여러 가지 LeIF 모 유전자의 xba I 내지 Pvu II 및 Pvu II 내지 Pst I 분해물 단편과 연결시켜, 상응하는 하이브리드 LeIF가 수득되도록 작동시킬 수 있는 발현 플라스미드를 제공할 수 있다.

각 LeIF발현 플라스미드는 독립적으로 여러 가지의 LeIF 플라스미드, 예를들어 pLeIF A trp 25, pLeIF B trp 7, pLeIF C trp 35, pLeIF D trp 11, pLeIF F trp 1, pLeIF G, pLeIF H 및 pLeIF I 등(이들의 작제방법은 문헌[참조:Nature 287, 411(1980)]에 기술되어 있다)으로부터 분리된 분해물 단편을 사용하여 작게 하거나 pBR 322(이의 작제는 문헌[참조:Gene 2, 95(1977)]에 기술되어 있다)로부터 분리된 분해물 단편을 사용하여 작제한다. 이들 플라스미드중 일부에서, “trp”는 세균성 발현에 가장 바람직한 트립토판 프로모터-오퍼레이터 계를 나타낸다(참조:공개된 유럽 특허원 제36776호).

[제1성숙 백혈구 인터페론의 직접 발현]

성숙 인터페론 폴리펩타이드로서 LeIF A를 직접 발현시키는 방법에는 합성(N-말단) DNA와 상보성 DNA의 조합이 포함된다.

Sau-3a 제한 엔도뉴클레아제 부위를 편리하게는 LeIF A의 코돈 1과 2 사이에 위치하게 한다. 2개의 합성 데옥시올리고뉴클레오타이드는 ATG 해독 개시 코돈을 이입시켜, 아미노산 1(시스테인)에 대한 코돈을 복구하고 EcoRI 접착 말단을 생성하도록 고안된다. 이들 올리고머를 pL 31의 34bp Sau 3a-Ava II 단편에 연결시킨다. 생성된 45bp 생성물을 2개의 추가의 DNA 단편에 연결시켜, LeIF A를 코드화하고 EcoRI 및 Pst I 제한부위에 의해 결합되는 865bp 합성-천연 하이브리드 유전자를 작제한다. 이 유전자를 pBR322의 EcoRI 부위와 Pst I 부위 사이에 삽입시켜 플라스미드 pLeIF A1을 수득한다.

플라스미드 pGM 1은 결손 △LE1413을 함유하는 이.콜라이 트립토판 오페론을 운반하여[참조:G.F.Miozzari et al., J.Bacteriology133, 1457-1466(1978)], trp 프로모터-오퍼레이터계의 조절하에서, trp리이더(leader)의 첫 번째 6개 아미노산 및 trp E 폴리펩타이드(하이에서는 LE′라 칭한다)의 대략 마지막 3번째의 아미노산 뿐만 아니라 trp D 폴리펩타이드 전체로 이루어진 융합 단백질을 발현한다. 플라스미드 20㎍을, 5개 부위에서 플라스미드를 절단하는 제한효소 Pvu II로 분해시킨다. 다음, 유전자 단편을 후에 EcoRI 부위를 함유하는 플라스미드로 클로닝시키기 위한 EcoRI 절단부위를 제공하는 EcoRI 링커(서열의 자체 상보성 올리고뉴클레오타이드 pCATGAATTCATG로 이루어짐)와 결합시킨다. pGM 1으로부터 수득된 DNA 단편 20㎍을 200 피코몰의 5′-포스포릴화 합성 올리고뉴클레오타이드 pCATGAATTCATG 존재하에 20㎕ T₄DNA 리가제 완충액(20mM 트리스, pH 7.6, 0.5mM ATP, 10mM MgCl₂, 5mM 디티오 트레이톨)중, 4℃에서 밤새 10단위의 T₄DNA 리가제로 처리한다. 이어서 용액을 70℃에서 10분동안 가열하여 연결반응을 정지시킨다. 링커를 EcoRI 분해에 의해 절단하여, EcoRI 말단을 갖는 단편을 5퍼센트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(하이에서는 “PAGE”로 표시)을 이용하여 분리시키고 가장 큰 3개의 단편을, 먼저 에티디움 브로마이드로 염색한 다음 자외선으로 단편의 위치를 확인하여 목적하는 부분을 겔로부터 절단함으로써, 겔로부터 분리시킨다. 300 마이크로리터의 0.1×TBE와 함께 각 겔 단편을 투석망에 넣고 0.2×TBE 완충액(TBE 완충액은 H₂0 1리터당 10.8gm의 트리스 염기, 5.5gm의 붕산, 0.09gm의 Na₂EDTA를 함유한다)중에서 100V로 1시간동안 전기영동시킨다.

투석망으로부터 수용액을 회수하여 페놀로 추출한 다음 클로로포름으로 추출하여 0.2M 염화나트륨이 되게 한후 에탄올로 침전시켜 물중에서 DNA를 회수한다. EcoRI 접착 말단을 갖는 trp 프로모터-오퍼레이터 함유 유전자를 다음에 기술하는 방법으로 확인한 다음, 이 단편을 테트라사이클린 감수성 플라스미드에 삽입하면, 프로모터-오퍼레이터가 삽입됨에 따라 테트라사이클린 내성으로 된다.

플라스미드 pBRH 1[참조: R.I. Rodriguez, et al., Nucleic Acids Research 6, 3267-3287(1979)]은 앰피실린 내성 부위를 발현시키고 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 함유하지만, 이것이 프로모터와 연결되어 있지 않는 경우에는 테트라사이클린 내성부위를 발현시키지 못한다. 이 플라스미드는 따라서 테트라사이클린 감수성이다. EcoRI 부위에 프로모터-오퍼레이터 계를 도입시킴에 의해 플라스미드를 테트라사이클린 내성으로 만들 수 있다.

pBR H1을 EcoRI로 분해시킨 다음, 페놀추출 및 이어서 클로로포름 추출하여 효소를 제거하고, 에탄올로 침전시켜 물중에서 회수한다. 생성된 DNA 분자를, 별도의 반응 혼합물에서, 상기 수득한 3개의 DNA 단편 각각과 결합시켜 상기 기술한 바와같이 T₄DNA 리가제를 사용하여 연결시킨다. 반응혼합물에 존재하는 DNA를 사용하여 문헌[참조:V.Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 3455-3459(1974)]에 기술되어 있는 표준방법에 의해 적절한 이.콜라이 K-12 균주 294[참조:K.Backman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 4174-4198(1976)]를 형질전환시키고, 세균을 20㎍/ml 앰피실린 및 5㎍/ml 테트라사이클린을 함유하는 LB 평판배지상에 도말한다. 몇 개의 테트라사이클린-내성 콜로니를 선별하여, 플라스미드 DNA를 분리시킨 다음 목적하는 단편의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인한다. 생성된 플라스미드는 pBRH trp로 표시한다.

B형 간염(hepatitis B) 바이러스 제놈의 EcoRI 및 BamH I 분해 생성물을 통상적인 방법으로 수득한 다음 플라스미드 pGH 6[참조:D.V.Goeddel et al., Nature 281, 544(1979)]의 EcoRI 및 BamH I 부위에 클로닝시켜 플라스미드 pHS 32를 형성시킨다. 플라스미드 pHS 32를 Xba I으로 절단하여 페놀 추출 및 클로로포름 추출한 다음 에탄올로 침전시킨다. 그후, 이것을 0.1mM dTTP 및 0.1mM dCTP를 함유하는 30㎕ 폴리머라제 완충액(50mM 인산칼륨 pH 7.4, 7mM MgCl₂, 1mM β-머캅토에탄올)중에서 1㎕ 이.콜라이 폴리머라제 I클로노우 단편(베링거-만하임사 제품)으로 0℃에서 30분동안 및 이어서 37℃에서 2시간동안 처리한다. 이 처리로, Xba I 절단부위의 5′ 돌출 말단(protruding end)에 상보적인 4개의 뉴클레오타이드중 2개가 채워진다.

2개의 뉴클레오타이드 dC 및 dT를 이입시킴으로써 2개의 5′ 돌출 뉴클레오타이드를 갖는 말단이 형성된다. 이러한 플라스미드 pHS 32의 선형잔기는(페놀 및 클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨 후 물중에서 회수한 다음) EcoRI로 절단한다. 큰 플라스미드 단편을 PAGE에 의해 더 작은 EcoRI-Xba I 단편으로부터 분리하여 전기용출 시킨 다음 분리한다. pHS 32로부터의 이 DNA 단편(0.2㎍)을, 상기 기술한 것과 유사한 조건하에서, pBRH trp로부터 유도된 트립토판 오페론의 EcoRI-Taq I 단편(∼0.01㎍)에 연결시킨다.

상기 기술한 바와같이, pHS 32로부터의 단편을 EcoRI-Taq I 단편에 연결시키는 과정에 있어서, Taq I 돌출 말단은, 비록 이것이 완전히 와트슨-크리크(Watson-Crick) 염기쌍을 이루는 것은 아니지만, Xba I의 잔존 돌출말단에 연결된다:

이 연결반응 혼합물의 일부를 사용하여 이.콜라이 294 세포를 형질전환시킨 다음, 열처리하여 앰피실린을 함유하는 LB 평판배지상에 도말한다. 24개의 콜로니를 선별하여, 3ml의 LB 배지에서 성장시킨 다음 플라스미드를 분리시킨다. 이중에서 6개가 이.콜라이 촉매화 DNA 복구 및 복제를 통해 재생된 Xba I 부위를 갖는 것으로 밝혀졌다:

이들 플라스미드는 또한 EcoRI 및 Hpa I 둘다로 절단되는 경우 예상되는 제한 단편을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 이중 하나의 플라스미드 pTrp 14는, 다음에 설명하는 바와같이, 이종 폴리펩타이드의 발현에 사용된다.

플라스미드 pHGH 107[D.V. Goedded et al, Nature, 281, 544, (1979)]은 합성 DNA 단편으로부터 생성된 23개의 아미노산 코돈, 및 인체 성장 호르몬 전령 DNA의 역전사를 통해 생성된 상보성 DNA로부터 수득된 163개의 아미노산 코돈으로 이루어진 인체성장 호르몬에 대한 유전자를 함유한다. 이 유전자는, 인체 성장 호르몬의 “프리(pre)” 서열에 대한 코돈은 없지만, ATG 해독 개시코돈을 함유한다. 유전자는 상기 기술한 바와같이 10㎍의 pHGH 107로부터 EcoRI 및 이어서 이.콜라이 폴리머라제 I 클레노우 단편 및 dTTP 및 dATP로 처리한 후 분리시킨다. 페놀 및 클로로포름 추출하고 에탄올 침전시킨 후, 플라스미드를 BamHI로 처리한다.

인체 성장 호르몬(“HGH”) 유전자를 함유하는 단편은 PAGE에 이어서 전기용출시켜 분리한다. 생성된 DNA 단편은 또한 테트라사이클린 내성 구조 유전자의 첫 번째 350개의 뉴클레오타이드를 함유하지만, 테트라사이클린 프로모터-오퍼레이터 계가 없으므로, 계속해서 발현 플라스미드로 클로닝시키는 경우, 삽입물을 함유하는 플라스미드는 테트라사이클린 내성을 복구시킴으로써 위치를 정할 수 있다. 단편의 EcoRI 말단은 클레노우 폴리머라제 I 방법에 의해 채워지기 때문에, 단편은 1개의 평활말단과 1개의 접착말단을 가져, 나중에 발현 플라스미드에 삽입되는 경우 정확한 배향이 가능하게 된다.

그후, 발현 플라스미드 pTrp 14는 상기 제조한 HGH 유전자-함유 단편을 수용하도록 제조한다. 즉, pTrp 14를 Xbal으로 분해시키고 생성된 접착 말단을 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP를 사용하여 클레노우 폴리머라제 I방법으로 채운다. 페놀 및 클로로포름 추출하고 에탄올 침전시킨 후, 생성된 DNA는 BamHI로 처리하고 PAGE 및 전기용출시켜 생성된 큰 플라스미드 단편을 분리한다. pTrp 14-유도단편은 1개의 평활 말단과 1개의 접착말단을 가지므로, 상기 기술한 HGH 유전자-함유 단편과 함께 적절한 배향으로 재조합될 수 있다.

HGH 유전자 단편과 pTrp 14 △Xba-BamHI 단편을 결합시키고 상기 기술한 것과 유사한 조건하에서 연결시킨다. 채워진 XbaI 말단과 EcoRI 말단을 평활말단 연결법으로 함께 연결시켜 XbaI 및 EcoRI 부위 둘다를 재생시킨다 : 채워진 EcoRI 말단 HGH 유전자 개시

이러한 작제방법으로 또한 테트라사이클린 내성 유전자도 재생된다. 플라스미드 pHGH 107이 HGH 유전자의 상부에 위치한 프로모터(lac 프로모터)로부터 테트라사이클린 내성부위를 발현시키므로, 이 구성물인 플라스미드 pHGH 207은 트립토판 프로모터-오퍼레이터의 조절하에서 테트라사이클린 내성 부위에 대한 유전자의 발현을 가능케 한다. 이 연결 혼합물로 이.콜라이 294를 형질전환시킨 다음 5㎍/ml의 테트라 사이클린을 함유하는 LB 평판배지상에서 콜로니를 선별한다.

플라스미드 pHGH 207을 EcoRI로 분해시켜 trp 프로모터를 함유하는 300bp EcoPI 단편을 PAGE에 이어서 전기용출시켜 회수한다. 300bp EcoRI 단편은 이.콜라이 trp 프로모터, 오퍼레이터 및 trp 리이더 리보좀 결합부위는 함유하지만, 해독 개시부위에 대한 ATG 서열은 가지고 있지 않다. 이 DNA 단편을 pLeIF A의 EcoRI 부위에 클로닝시킨다.

상기 언급한 trp 단편은, trp 전사감쇄부위(attenuator)가 결손되어 발현도를 통제적으로 높일 수 있는 이.콜라이 트립토판 오페론 유사체이다. 변형된 trp 레귤론(regulon)을 함유하는 발현 플라스미드를, 프로모터-오퍼레이터 계를 억제시키기에 충분한 양으로 추가의 트립토판을 함유하는 영양배지내에서 예정된 정도로 성장시킬 수 있으며, 이어서 트립토판을 제거하여 계의 억제를 해제시키고 목적하는 생성물의 발현을 야기시킨다.

더욱 특히, 250㎍의 플라스미드 pL 31을 Pst I으로 분해시키고 6퍼센트 폴리아크릴아미드 겔상에서 겔 전기영동시켜 1000bp 삽입물을 분리시킨다. 약 40㎍의 삽입물을 겔로부터 전기용출시키고, 추가의 분해를 위해 3개의 분취량으로 나눈다:

a) 이 단편의 시료 16㎍을 37℃에서 45초동안 40단위의 Bgl II로 부분 분해시키고 반응 혼합물을 6퍼센트 폴리아크릴아미드 겔상에서 정제한다. 목적하는 670bp 단편 약 2㎍을 회수한다.

b) 1000bp Pst 1 삽입물의 다른 시료(8㎍)을 Ava II 및 Bgl II로 제한시킨다. 겔 전기영동후, 원하는 150bp 단편 1㎍을 회수한다.

c) 1000bp 16㎍을 Sau 3a 및 Ava II로 처리한다.

10퍼센트 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동 시킨후, 34bp 단편 약 0.25㎍(∼10pmole)을 회수한다. 2개의 목적하는 데옥시올리고뉴클레오타이드, 즉 5′-dAATTCATGTGT(단편 1)과, 5′-dGATCACACATG(단편 2)를 포스포트리에스테르 방법[참조; Maxam 및 Gilbert, Methods Enzymol. 65, 499-560(1980)]으로 합성한다. 단편 2는 다음과 같이 포스포릴화시킨다. 200㎕(∼40pmole)의 (r³²P)ATP(Amersham, 5000 Ci/mmole)를 건조시킨 다음, 100pmole의 DNA 단편 및 2단위의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 함유하는 30㎕의 60mM 트리스-HCl(pH 8), 10mM MgCl₂, 15mM β 머캅토에탄올에 재현탁시킨다. 37℃에서 15분후, 1㎕의 10mM ATP를 가하여 반응을 15분동안 더 진행시킨다. 그후 혼합물을 70℃에서 15분동안 가열한 다음, 100pmole의 5′-OH 단편 1 및 10pmole의 34bp Sau 3a-Ava II 단편과 합한다. 50㎕의 20mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨, 0.5mM ATP 및 10단위의 T4 DNA 리가제중, 4℃에서 5시간동안 연결반응시킨다. 혼합물을 6퍼센트 폴리아크릴 아미드 겔상에서 전기 영동시키고, 전기용출시켜 45bp 생성물을 회수한다. 860,000 세렌코프 Cpm을 회수하여(∼30ng, 1pmole), 0.5㎍(5pmole)의 150bp Ava II-Bgl II 단편 및 1㎍(2pmole)의 670bp Bgl II-Pst I 단편과 합한다. 20단위의 T4 DNA 리가제를 사용하여 20℃에서 16시간동안 연결반응시킨다. 리가제는 65℃로 10분동안 가열하여 실활시킨다.

그후, 혼합물을 EcoRI 및 Pst I으로 분해시켜 유전자의 중합체를 제거한다. 혼합물을 6퍼센트 플리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제한다. 36,000cpm(∼0.04pmole, 20ng)의 865bp생성물을 분리시킨다. 이것의 반(10ng)을 pBR 322(0.3㎍)의 EcoRI 부위와 Pst 1 부위 사이에서 연결시킨다. 이.콜라이 294를 형질전환시켜 70개의 테트라사이클린 내성이고 앰피실린 감수성인 형질전환체를 수득한다. 이들 형질전환체중 18개로부터 분리된 플라스미드 DNA를 EcoRI 및 Pst I으로 분해시킨다. 18개의 플라스미드중 16개가 길이 865bp의 EcoRI-Pst I 단편을 갖는다. 이들중의 하나, 즉 pLeIF A 1, 1㎍을 EcoRI로 분해시킨 다음, 상기 기술한 바와같이 제조한, 이.콜라이 trp 프로모터 및 trp 리이더 리보좀 결합부위를 함유하는 300bp EcoRI 단편(0.1㎍)에 연결시킨다. trp 프로모터를 함유하는 형질전환체는³²P-trp 프로브를 사용하여 문헌[참조:Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 72, 3961(1975)]에 기술된 그룬스타인-호그네스 콜로니 스크리닝 방법(Grunstein-Hogness colony screening procedure)으로 확인한다. trp 단편내에서 비대칭적으로 위치하는 Xba I 부위는, trp 프로모터가 LeIF A 유전자의 방향으로 배향되어 있는 제조합체의 결정을 가능하게 해준다.

IF 분석을 위해 다음과 같이 추출물을 제조한다. 1ml의 배양물을 5㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 L육즙에서 A₅₅₀이 약 1.0이 될 때까지 성장시킨 다음, 5㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 M9 배지 25ml에서 희석시킨다. A₅₅₀이 1.0에 도달하면 원심분리하여 10ml의 시료를 수거하고 세포펠렛을 1ml의 15퍼센트 슈크로오즈, 50mM 트리스-HCl(pH 8.0), 50mM EDTA에 현탁시킨다. 1mg의 리조자임(lysozyme)을 가하고, 0℃에서 5분후에, 세포를 초음파처리하여 파괴한다. 시료를 Sorvall SM-24 회전기에서 15,000 rpm으로 10분 동안 원심분리시킨다. 상등액에서의 인터페론 활성은 세포병변 효과(CPE)억제 시험에 의해 LeIF 표준물과 비교하여 측정한다. 4×10⁸단위/mg의 비활성을 갖는 LeIF를 사용하여 세포당 IF분자의 수를 측정한다[참조:Rubinstein et al., proc. Natl.Acad.Sci.(USA) 76, 640(1979)].

trp 프로모터가 원하는 배향하는 삽입된 클론 pLe IF A trp 25는 높은 활성도를 나타낸다(1리터당 2.5×10⁸단위정도로 높다). 이.콜라이 K-12 균주 294/pLe IF A trp 25에 의해 생성된 IF는 진정한 인체 LeIF와 유사하게 작용하므로; pH 2에서의 처리에 안정하고 토끼의 항-인간 백혈구 항체에 의해 중화된다. 이 인터페론은 약 20,000의 겉보기 분자량을 갖는다.

[추가의 백혈구 인터페론에 대한 cDNA의 분리]

완전히 특정화된 LeIF A cDNA-함유 플라스미드로부터의 DNA를 Pst I으로 절단하여, 전기영동적으로 분리해 낸 다음,³²P를 사용하여 문헌[참조:Taylor et al., Biochem.Biophys.Acta. 442, 324(1976)]에 기술된 방법으로 표지한다. 생성된 방사능 표지된 DNA를 프로브로 사용하여 동일반응계 콜로니스크리닝 방법[상기 Grunstein 등의 문헌 참조]으로 추가의 이.콜라이 294 형질전환체를 선별한다. 콜로니를 분리시켜 여러 가지의 양으로 프로브로 하이브리드화 시킨다. 이들 콜로니 및 상기 언급한 10개의 하이브리드화 콜로니로부터의 플라스미드 DNA를 Pst로 절단하여 분리시키고 3개의 상이한 방법으로 특정화한다. 첫째로, 이들 Pst 단편은 효소 Bgl II, Pvu II 및 EcoRI를 사용하여 그들의 제한 엔도뉴클레아제 분해방식으로 특정화시킨다. 이 분석으로 적어도 8개의 상이한 형태(LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeIF G 및 LeIF H)가 분류되는데, 이것으로 현재까지 알려진 LeIF A의 프리서열 및 코드화 서열에 관한 여러 가지 제한 절단물의 위치를 추측할 수 있다. 이들중의 하나인 LeIF D는 문헌[참조: Nagata et al., Nature 284, 316(1980)]에 보고된 것과 동일한 것으로 생각된다.

둘째로, DNAs중 일부를, KG-1 세포 RNA를 함유하는 폴리-A로부터 LeIF mRNA를 선택적으로 제거할 수 있는 능력에 대해, 하기 문헌에 기술된 하이브리드화 선별 시험에 의해 시험한다[참조:Cleveland et al., Cell 20, 95(1980)]. 이 시험 방법에 의해 LeIF A,B,C 및 F가 양성으로 나타났다. 셋째로, 제일 마지막의 Pst 단편을 발현 플라스미드에 삽입하여, 이 플라스미드로 이.콜라이 294를 형질전환시켜, 단편을 발현시킨다. 전구체 인터페론이라고 생각되는 발현생성물은 CPE 시험에 의해 인터페론 활성에 대해, 비록 LeIF F 단편의 경우에는 최저의 활성을 나타내긴 했지만, 모두 양성으로 나타났다. 상기 기술된 것 이외에 모든 형태의 LeIF가 서열화되었다.

[제2의 성숙 백혈구 인터페론]

성숙 LeIF B에 대한 유전자로 이루어진 분리된 단편의 서열은 A와 B형태의 첫 번째 14개의 뉴클레오타이드가 동일한 것으로 나타났다. 따라서, trp-프로모터-오퍼레이터, 리보좀 결합부위 및 LeIF(A=B) 유전자의 개시부분을 함유하고 있는 pLEif A 25로부터 단편을 분리시킨 다음, 이를 발현 플라스미드에서 B서열의 나머지 부분과 결합시킬 수 있다.

제7a도에 나타낸 서열로부터 약 950bp의 Sau 3a 내지 Pst I 단편을 수득하기 위해서는, 하나 이상의 개재(intervening) Sau 3a 제한 부위의 존재로 인해 여러 단계가 필요하다. 즉:

1. 하기 단편들을 분리시킨다: a) Sau 3a에서 EcoRI까지의 110bp; b) EcoRI에서 Xba까지의 132bp; c) Xba에서 Pst까지의 700bp이상.

2. 단편(1a)와 (1b)를 연결시키고 Xba 및 Bgl II로 절단하여 Sau 3a 및 Xba 말단을 통한 자체-중합 반응을 예방한다(해당하는 Sau 3a 부위는 Bgl II 부위내에 있으며; Bgl II를 절단하여 Sau 3a 접착 말단을 남긴다). 242bp 단편을 분리시킨다.

3. 상기 (2)의 생성물과 (1c)의 단편을 연결시키고 Pst I 및 Bgl II로 절단하여 자체-중합반응을 재차 예방한다. 제7a도의 Sau 3a에서 Pst I까지인 약 950bp 단편을 분리시킨다. 이 단편은 LeIF A와 공통되지 않는 LeIF B 유전자의 부분을 함유한다.

4. LeIF A의 trp프로모터-오퍼레이터,리보좀 결합부위, ATG 출발 시그널 및 시스테인 코돈으로 이루어진 약 300bp의 단편(Hind III에서 Sau 3a까지)을 pLeIF A25로부터 분리시킨다.

5. Pst I에서 Hind III까지의 약 3600bp의 단편을 pBR 322로부터 분리시킨다. 이 단편은 레플리콘을 함유하며 테트라사이클린 내성 부위는 코드화하지만 앰피실린 내성부위는 코드화하지 않는다.

6. 단계 3, 4 및 5에서 수득된 단편들을 삼중연결시키고 생성된 플라스미드로 이.콜라이 K-12 균주 294를 형질전환시킨다.

형질전환체를 문헌[참조:Birnboim et al., Nucleic Acid Research Z, 1513(1979)]에 기술된 방법으로 미니스크리닝한 다음, 플라스미드 시료를 EcoRI로 분해시킨다. 분해 결과 하기의 특징을 갖는 3개의 단편이 수득된다: 1) EcoRI-EcoRI trp 프로모터 단편; 2) pL4의 EcoRI에서 EcoRI까지의 내부 단편; 및 3) pL4의 단백질 해독 출발 시그널에서 EcoRI까지의 단편.

CPE 시험에서, 상기 방식으로 제조된 클론으로부터의 세균 추출물은 전형적으로 A₅₅₀=1에서 1ℓ당 약 10×10⁶단위의 인터페론 활성으로 시험한다. 이 방식으로 제조된 대표적인 하나의 클론은 294/pLIF B trp 7이다.

[추가의 성숙 백혈구 인터페론]

다른 LeIF형태로 이루어진 추가의 완전한 길이의 유전자 단편을 만들어, LeIF A의 경우에서와 같이 발현시키기 위한 발현 베히클내에 넣는다. 통상의 방식에 의한 완전한 서열화로, 상기 기술한 바와 같이, 제한 절단에 의한 프리서열의 제거, 및 합성 DNA 단편의 연결에 의해 프리서열 제거에서 손실된 N-말단 아미노산에 대한 코돈의 대체를 사용하는 시도에 대한 편리한 방법이 가능하도록 제한부위가 성숙 인터페론 형태의 첫 번째 아미노산 코돈에 충분히 가까이 존재하는지 여부를 확인할 수 있다. 그렇지 않다면, 클레이드 등의 방법(상기 참조)을 사용할 수 있다. 간단히 말하자면, 이 방법은 프리서열을 함유하는 단편을 성숙 폴리펩타이드의 첫 번째 아미노산에 대한 코돈이 시작되는 위치 바로 앞에서 정확하게 절단하는 것으로 이루어지는데, 이 방법은 다음과 같다:

1. 이본쇄 DNA를 그 위치 주위의 영역에서 일본쇄 DNA로 전환시키고; 2. 일본쇄 DNA 상보성 프라이머(primer)를 단계(a)에서 생성된 일본쇄 영역에 하이브리드화시키는데, 여기에서 프라이머의 5′ 말단은 목적하는 절단부위에 인접한 뉴클레오타이드에 반대 방향으로 놓이게 하고; 3. 프라이머로부터 3′ 방향으로 놓여져 있는, 단계 1에서 제거된 두 번째 본쇄의 부분을, 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신을 함유하는데 옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 존재하에 DNA 폴리머라제와 반응시킴에 의해 복구시킨 다음; 4. 목적하는 절단부위 이외에 돌출되어 있는, 잔존하는 DNA의 일본쇄 부분은 분해시킨다.

그후 코드화 분쇄의 3′ 말단에서 해독 출발 시그널 ATG로 종결되는 짧은 길이의 합성 DNA를 예를들어 평활 말단 연결법으로, 성숙 인터페론에 대해 제조된 유전자에 연결시키고, 유전자를 발현 플라스미드내에 삽입시켜 프로모터 및 이것과 연관된 리보좀 결합부위의 조절하에 있게 한다. 상기 사용한 것과 유사한 방식으로, LeIF C 및 LeIF D를 코드화하는 유전자 단편들을 직접적인 세균 발현을 위해 적절하게 배치한다. 이들 추가의 백혈구 인터페론의 발현 방법에는, 각 경우, pLeIF A25로부터의 LeIF A의 trp 프로모터-오퍼레이터, 리보좀 결합부위, ATG 출발 시그널 및 시스테인 코돈으로 이루어진 약 300bp의 단편(Hind III에서 Sau 3a까지)을 사용하는 방법이 포함된다. 여기에, 모든 것에 대해 공통인 개시 시스테인 이외의 그들 각각의 아미노산 서열을 코드화하는 추가의 인터페론 유전자로부터의 유전자 단편을 결합시킨다. 생성된 플라스미드 각각을 사용하여 이.콜라이 K-2 균주 294를 형질전환시킨다. 각각의 유전자를 형성시키는 연결방법은 다음과 같다:

[LeIF C]

pLeIF C로부터 다음의 단편들을 분리시킨다:

(a) Sau 3a에서 Sau 96까지의 35bp 단편.

(b) Sau 96에서 Pst I까지의 900bp 이상의 단편.

(c) 상기의 파트 N(4)에서와 같이, pLeIF A-25로부터 약 300bp의 단편(Hind III-Sau 3a)을 분리시킨다.

(d) 상기 파트 N(5)의 약 3600bp 단편을 분리시킨다.

작제방법 :

(1) 단편(a)와 (c)를 연결시킨다. Bgl II 및 Hind III로 절단하여 약 335bp의 생성물을 분리시킨다.

(2) (1)과 (b)와 (d)를 삼중 연결시킨 다음 생성된 플라스미드로 이.콜라이를 형질전환시킨다.

이러한 방식으로 제조된 대표적인 클론은 이.콜라이 K-12 균주 294/pLeIF C trp 35이다.

[LeIF D]

pLeIF D로부터 다음의 단편들을 분리시킨다:

(a) Sau 3a에서 Ava II까지의 35bp 단편.

(b) Ava II에서 Bgl II까지의 150bp 단편.

(c) Bgl II에서 Pst I까지의 약 700bp 단편.

pLeIF A25로부터 다음의 단편을 분리시킨다:

(d) Hind III에서 Sau 3a까지의 300bp 단편.

pBR 322로부터 다음의 단편을 분리시킨다:

(e) Hind III에서 Pst I까지의 약 3600bp 단편.

작제방법 :

(1) (a)와 (b)를 연결시킨 다음, Bgl II로 절단하여, 185bp의 생성물(1)을 정제한다.

(2) (1)과 (d)를 연결시킨 다음, Hind III 및 Bgl II로 절단하여, 약 500bp의 생성물(2)를 정제한다.

(3) (2)와 (c)와 (e)를 연결시킨 다음, 생성된 플라스미드로 이.콜라이를 형질전환시킨다.

이러한 방식으로 제조된 대표적인 클론은 이.콜라이 K-12 균주 294/pLeIF D trp 11이다.

[LeIF F]

LeIF B 및 LeIF F의 아미노산 1 내지 13의 완전한 동종성에 의해 편리하게 제조된 제조합체를 통해, LeIF F를 함유하는 단편을 직접 발현용으로 제조할 수 있다. 적절히 배치된 말단을 갖는 trp 프로모터-함유 단편(a)를 상기 기술된 pHGH 207으로부터, Pst I 및 Xba I으로 분해시킨 다음 약 1050bp의 단편을 분리시킴에 의해 수득한다. 두 번째 단편(b)는 플라스미드 pHKY 10(테트라 사이클린 내성 프로모터와 구조 유전자 사이에 Bgl II 부위를 함유하는 pBR322의 유도체)을 Pst I 및 Bgl II 분해시킴으로써 생성된 더 큰 단편으로서 수득된다. 단편(a)는 앰피실린 내성을 코드화하는 유전자의 약 절반을 함유하고; 단편 (b)는 앰피실린 내성을 코드화하는 유전자의 나머지 부분, 및 관련된 프로모터를 제외하고는 테트라 사이클린 내성에 대한 전 유전자를 함유한다. 단편(a)와 (b)를 T4 리가제를 사용하여 결합시키고 생성물을 Xba I 및 Bgl II로 처리하여 이합체화를 제거하여, trp 프로모터-오퍼레이터, 및 테트라사이클린 및 앰피실린 내성에 대한 유전자로 이루어진 단편(c)를 제조한다.

약 580bp의 단편(d)는 pLeIF F를 Ava II 및 Bgl II로 분해시킴으로써 수득된다. 이것은 LeIF F의 아미노산 14 내지 166에 대한 코돈을 함유한다.

단편(e) (49bp)는 pLeIF B를 Xba I 및 Ava II로 분해시킴으로써 수득된다. 단편(e)는 LeIF F의 아미노산 1 내지 13을 코드화한다.

단편(c),(d) 및 (e)를 T4 리가제 존재하에 삼중 연결시킨다. 각 단편들의 접착성 말단은, 혼성 플라스미드가 정확하게 환상화되도록 하여, 성숙 LeIF F에 대한 유전자와 함께 trp 프로모터-오퍼레이터의 조절하에 테트라사이클린 내성 유전자가 존재하여, 목적하는 플라스미드로 형질전환된 세균이 테트라사이클린-함유 평판상에서 선별될 수 있도록 한다. 이러한 방식으로 제조된 대표적인 클론은 이.콜라이 K-12 균주 294/pLeIF F trp 1이다.

[LeIF H]

완전한 LeIF H 유전자를 다음과 같이 성숙 백혈구 인터페론으로서 발현되도록 배치시킬 수 있다:

1. 플라스미드 pLeIF H를 Hae II 및 Rsa I으로 분해시켜 시그널 펩타이드 아미노산 10에서 3′ 비코드화 영역까지인 816bp 단편을 분리시킨다.

2. 단편을 변성시킨 다음, 합성 데옥시리보올리고 뉴클레오타이드 프라이머 5′-dATG TGT AAT CTG TCT를 사용하여 클레노우 단편과 함께 복구 합성시킨다[참조:Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65, 168(1970)]. 이 일반적인 방법은 또한 1980년 9월 25일에 출원된 괴델(Goeddel) 등의 미합중국 특허원 제190799호에도 기술되어 있다.

3. 수득되는 생성물을 Sau 3a로 절단하여 아미노산 1 내지 150을 나타내는 452bp 단편을 분리시킨다.

4. pLeIF H를 Sau 3a 및 Pst I으로 분해시키고 생성된 500bp 단편을 분리하여 코드화 서열의 말단까지의 150개의 아미노산을 코드화하는 유전자를 수득한다.

5. 단계(3) 및 (4)에서 분리된 단편들을 연결시켜 LeIF H의 166개의 아미노산을 코드화하는 하기의 단편을 생성시킨다:

6. pLeIF A trp 25를 Xbal으로 분해시키고, DNA 폴리머라제 I으로 평활 말단화시킨 다음, 생성물을 Pst I으로 분해시킨다. 생성된 큰 단편을 분리시켜 단계(5)의 생성물과 연결하여, 이.콜라이 K-12균주 294 또는 다른 숙주 세균을 형질전환시키면 성숙 LeIF H를 발현시킬 수 있는 발현 플라스미드를 생성시킬 수 있다.

[LeIF I]

문헌[참조:Lawn et al., Cell 15, 1157(1978)]에 기술된 방법에 따라 작제된 인간 제놈의 파지 λ 챠론(Charon) 4A 재조합체 저장물을 문헌[참조:Lawn et al., 상기 참조 및 Maniatis et al., Cell 15, 687(1978)]에 기술된 방법에 따라 백혈구 인터페론 유전자에 대해 스크리닝한다. cDNA 클론 LeIF A로부터 유도된 방사성 LeIF 프로브[참조:Goeddel et al., Nature 287, 411(1980)]를 사용하여 약 500,000 플라그를 스크리닝한다. 이 스크리닝으로 6개의 LeIF제놈 클론이 수득된다. 재스크리닝 및 플라그 정제한 다음, 이들 클론중 하나인 λ HLeIF 2를 추가의 분석을 위해 선택한다.

상기 기술된 방법을 사용하여, 다른 프로브도 유리하게 사용하여 인간 제놈으로부터 추가의 LeIF클론을 분리시킬 수 있다. 이들을 또한 사용하여 본 발명에 따른 추가의 백혈구 인터페론 단백질을 생성시킬 수 있다.

1. 제놈 클론(λ HLeIF 2)의 2000bp EcoRI 단편을 pBR 325의 EcoRI 부위에서 서브클로닝(subcloning)시킨다. 생성된 플라스미드 LeIF I를 EcoRI로 절단하여 2000bp 단편을 분리시킨다. 데옥시 올리고뉴클레오타이드 dAATTCTGCAG(EcoRI〉PstI 전환자)를 2000bp EcoRI 단편에 연결시킨 다음, 수득된 생성물을 Pst I으로 절단하여 Pst I 말단을 함유하는 2000bp 단편을 수득한다. 이 단편을 Sau 96으로 절단하여 1개의 Pst I 말단과 1개의 Sau 96 말단을 갖는 1100bp 단편을 분리시킨다.

2. 플라스미드 pLeIF C trp 35를 Pst I 및 Xba I으로 분해시킨다. 큰 단편을 분리한다.

3. pLeIF C trp 35로부터 생성된 작은 Xba I-Pst I 단편을 Xba I 및 Sau 96으로 분해시킨다. 40bp의 Xba I-Sau 96 단편을 분리한다.

4. 단계 1), 2) 및 3)에서 분리된 단편들을 연결시켜 발현 플라스미드 pLeIF I trp 1을 수득한다.

[LeIF J]

1. 플라스미드 pLeIF J는 LeIF J 유전자 서열을 포함하는 인간 제놈 DNA의 3.8kb Hind III 단편을 함유한다. 이 플라스미드로부터 760bp Dde I-Rsa I 단편을 분리한다.

2. 플라스미드 PLeIF B trp 7을 Hind III 및 Dde I으로 절단한 다음 340bp Hind III-Dde I 단편을 분리시킨다.

3. 플라스미드 pBR 322를 Pst I으로 절단하여, DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편)과 함께 배양하여 평활 말단화시킨 다음, Hind III로 분해시킨다. 큰(∼3600bp) 단편을 분리한다.

4. 단편 1), 2) 및 3)에서 분리된 단편들을 연결시켜 발현 플라스미드 pLeIF J trp 1을 수득한다. 하기에 작제에 사용되는 방법 및 물질들은 상기 설명에서와 동일하다. 하기 표 1은 본 발명의 하이브리드 LeIF플라스미드의 특정 작제에 대한 상세한 설명을 제공한다:

[표 1]

표 1에 관하여, 첫 번째 기술된 4개의 하이브리드 LeIF는 2개의 LeIF 발현 플라스미드로부터 생성된 것이다. LeIF A와 D cDNA에 대해 공통인 Bal II 부위를 사용하여 LeIF A의 63개의 아미노 말단 아미노산 및 LeIF D의 102개의 카복시 말단 아미노산을 코드화하는 발현 플라스미드 pLeIF trp AD(Bgl II)를 작제한다. 동일한 부위를 사용하여 LeIF D의 64개의 아미노 말단 아미노산 및 LeIF A의 102개의 카복시 말단 아미노산을 코드화하는 발현 플라스미드 pLeIF trp DA(Bgl II)를 작제한다. Pvu II 부위를 사용하여 2개의 다른 하이브리드 인터페론 발현 플라스미드를 작제한다: LeIF A의 91개의 아미노 말단 아미노산 및 LeIF D의 74개의 카복시 말단 아미노산을 코드화하는 발현 플라스미드 pLeIF trp AD(Pvu II), 및 LeIF D의 92개의 아미노 말단 아미노산 및 LeIF A의 74개의 카복시 말단 아미노산을 코드화하는 발현 플라스미드 pLeIF trp DA(Pvu II). 간단히 말하면 다음과 같다:

pLeIF AD trp(Pvu II): pLeIF A trp25의 Xba I 및 Pst I 분해물의 큰(∼3900bp) 단편을 pLeIF A trp11의 288bp Xba I-Pvu II 단편 및 pLeIF D trp11의 약 550bp Pvu II-Pst I 단편과 연결시킨다.

pLeIF DA trp(Pvu II): pLeIF A trp25의 Xba I 및 Pst I 분해물의 큰(∼3900bp) 단편을 pLeIF D trp25의 285bp Xba I-Pvu II 단편 및 pLeIF A trp25의 약 550bp Pvu II-Pst I 단편과 연결시킨다.

pLeIF AD trp(Bgl II): pLeIF A trp25의 Bgl II 및 Pst I 분해물의 큰 단편을 pLeIF D trp11의 ∼600bp Bgl II -Pst I 단편과 연결시킨다.

pLeIF DA trp(Bgl II): pLeIF D trp11의 Bgl II 및 Pst I 분해물의 큰 단편을, pLeIF A trp25를 Pst I으로 전달한 다음 Bgl II로 부분 분해시킴으로써 수득한 약 700bp 단편과 연결시킨다.

15개의 하이브리드에서: pLeIF AB trp(Pvu II): pLeIF A trp25의 Xba I 및 Pst I 분해물의 큰(∼3900bp) 단편을 pLeIF A trp25의 285bp Xba I-Pvu II 단편 및 pLeIF B trp7의 약 750bp Pvu II(부분)-Pst I 단편과 연결시킨다.

유사한 방식으로, 표 1에 나타낸 다음 작제물들도 정의된다. 추가의 예로서, LeIF C 및/또는 LeIF H 부분을 함유하는 하이브리드를 작제함에 있어서, 유전자 서열의 대략 뉴클레오타이드 294(즉, GCTGC)에 존재하는 통상적인 BbV I 부위를 유리하게 취할 수도 있다.

유사한 방식으로, 다른 신규의 하이브리드 백혈구 인터페론의 미생물학적 발현에 적절한 플라스미드는, 천연적으로 존재하는 백혈구 인터페론의 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 코드화하는 이본쇄 DNA를 적절히 조작함으로써 제조할 수 있다. 즉, 첫 번째 이본쇄 DNA 단편은, 첫 번째의 자연적으로 존재하는 백혈구 인터페론 아미노산 서열 및 이로부터 3′ 방향으로 앞서는 그의 아미노산의 상당 부분의 아미노 말단을 코드화하도록 선택된다.

단편은 첫 번째 백혈구 인터페론의 아미노산 “n”(n 아미노산의 첫 번째 인터페론의 아미노산 서열의 상당 부분을 구성한다)에 대한 코돈에 인접하게 위치한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유한다. 제한 엔도뉴클레아제로 절단하면 첫 번째 인터페론의 아미노 말단 및, 대략 n 아미노산에 대한 코돈으로 이루어진 단편이 수득된다. 두 번째의 상이한 백혈구 인터페론의 아미노산 서열에 대한 코돈의 일부 또는 전부로 이루어진 두 번째 단편은, 단편이 아미노산 수(두번째 인터페론의 아미노 말단으로부터 시작하여)가 약 166-n인 두 번째 인터페론의 아미노산에 대한 코돈에 인접하게 위치한 동일한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 절단부위를 함유하도록 선택된다. 두 번째 단편을 제한 엔도뉴클레아제로 절단하면 첫 번째 단편의 분해 생성물의 “n” 말단 부분에 상보적인 생성물이 수득되어, 두 번째 단편의 분해 생성물을 첫 번째 단편의 분해 생성물에 연결시켜 제한 엔도뉴클레아제 인식부위를 다시 생성시킬 수 있고 초기 분해에서 손실된 첫 번째 인터페론의 아미노산 n에 대한 코돈을 재구성할 수 있다. 두 번째 단편의 제한 엔도뉴클레아제 분해 생성물은 바람직하게는 3′ 방향으로 절단시킴으로써 생성된 말단으로부터 두 번째 백혈구 인터페론의 카복시 말단을 코드화하는 뉴클레오타이드까지 진행한다.

또한, 천연적으로 존재하는 백혈구 인터페론 2개 이상의 아미노산 서열의 상당부분을 함유하는 하이브리드는, 예를들어, 상기 언급한 두 번째 단편을 추가로 첫 번째 단편으로부터 하향으로 두 번째 제한 엔도뉴클레아제 부위(두번째 부위는 세 번셉 백혈구 인터페론등의 카복시 말단 부위를 코드화하는 단편내에서 유사하게 위치한 부위와 동일하다)를 함유하게 선택하여 제조할 수 있다. 언급한 예에서, 연속적인 제한 엔도뉴클레아제 작동의 생성물들을 삼중 연결시켜 첫 번째 인터페론의 아미노 말단부위, 두 번째 인터페론의 중간범위의 아미노산 서열 및 세 번째 인터페론의 카복시 말단부위(또는 첫 번째와 세 번째 인터페론이 동일한 경우 첫 번째 인터페론을 다르게 변화시켜서)를 코드화하는 하이브리드 유전자를 생성시킬 수 있다.

바람직하게는, 상기 언급한 첫 번째 단편은 발현 플라스미드 즉, 첫 번째 백혈구 인터페론의 아미노 말단 부위에 대한 코돈에 대해 ATG 또는 다른 해독개시 코돈 및 프로모터 또는 프로모터-오퍼레이터 계가 선행되는 발현 플라스미드로부터 유도된다. 결과로서, 상기 기술한 조작 작업의 최종 생성물은, 플라스미드로 형질전환된 세균 또는 다른 미생물 유기체에서 하이브리드 유전자에 대해 코드화 되는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 플라스미드이다. 미생물 발현을 위해 하이브리드 유전자를 배치시키는 다른 방법은 본 분야의 숙련가에게는 명백할 것이다.

본 발명의 바람직한 태양에서, 하이브리드 유전자는, 제3도에 도시된 바와 같이 LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeIF G 및 LeIF H로 이루어진 그룹중에서 선택된 2개 이상의 상이한 백혈구 인터페론으로부터 유도된 실질적인 아미노산 서열의 접합물을 구성하는 약 165 내지 166개의 아미노산인 신규 백혈구 인터페론 아미노산 서열을 코드화한다. 가장 바람직하게는, 하이브리드 유전자에 의해 코드화되는 신규 백혈구 인터페론은 제3도의 서열 “A11”에서 지적한 바와 같이 명시되어 있고 위치되어 있는 아미노산으로 이루어진다. 본 발명에 따라 제조된 플라스미드의 발현 생성물은 하기 기술하는 생물학적 활성 측정법에서와 마찬가지로, 통상의 방식으로 항 바이러스 활성에 대해 시험할 수 있다.

[항바이러스 활성의 측정]

이.콜라이 K-12 균주 294는 편리하게는, 독립적 플라스미드 pLeIF trp A25, pLeIF trp D, pLeIF trp A/D(Bgl II) 및 pLeIF trp D/A(Bgl II)로 형질전환시킨다. 형질전환체는 별도로 5mg/ml의 테트라사이클린을 함유하는 L육즙에서 5ml 배양물로 A₅₅₀이 약 1.0이 될때까지 성장시킨 다음, 5㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 M9 배지 1ℓ로 희석한다. A₅₅₀이 1.0에 도달하면 세포를 수거하여 세포 펠렛을 15% 슈크로오즈, 50mM 트리스-HCl(pH 8.0), 50mM EDTA의 10ml 용액에 현탁시킨다. 리조자임 10mg을 가하고, 0℃에서 5분 후, 세포를 초음파 처리하여 파괴한다. 시료를 Sorvall SM-24 회전기에서 15,000rpm으로 10분 동안 원심분리시킨다. 상등액에서의 인터페론 활성을 항바이러스 활성에 대해 시험한다.

인체 세포라인(WISH)상에서 역가 측정한 이들 인터페론 배양물 1ℓ당의 활성 수율은 표 2에 나타내었으며, 이 표로부터 LeIF-A/D 활성이 다른 인터페론보다 훨씬 많은 양으로 생성됨을 명백하게 알 수 있다. 이 차이는 LeIF-A/D의 고유활성이 더 크거나 이 인터페론의 mg 단백질로 표현된 수율이 더 많기 때문일 것이다. 유전적인 연결(link-up)은 이들 인터페론 모두에 대해 동일하므로, LeIF-A/D가 다른 인터페론들보다 근본적으로 더 큰 활성을 가지고 있음이 가장 유력한 것 같다.

[표 2]

포유동물 세포라인의 범위에서 여러 가지 인터페론의 효능을 측정한다(인간, WISH; 아프리카 녹색 원숭이, VERO; 햄스터 섬유아세포, BHK; 래비트의 신장 세포, RK-13; 마우스, L-929; 및 소의 신장, MDBK 세포). 인터페론의 상대적 활성을 비교하기 위해서, 여러 가지 세포상에서 그들의 활성은 WISH 세포상에서의 그들의 활성을 100으로 간주해서 상대적으로 계산한다. 표 3의 결과는 LeIF-A/D가 VERO 및 L-292 세포에서 매우 높은 활성을 갖는 반면에, LeIF-D/A는 이들 세포라인에서 낮은 활성을 가짐을 나타낸다. 이들 결과는 한 분자(LeIF-A/D)내에서 LeIF-A의 N-말단 부분과 LeIF-D의 C-말단 부분의 조합이 하이브리드 단백질에, 여러 포유동물종에서 명백한 특정 활성을 부여함을 시사한다. 또한, 이들 특정은 단순히 모 인터페론의 특성의 합은 아니다. 이는 L-929 세포상에서의 활성의 경우에(표 3), LeIF-A와 LeIF-D의 혼합물 뿐만 아니라 다른 하이브리드인 LeIF-D/A도 유의적인 활성을 나타내지 않는 것으로부터 명백하게 알 수 있다.

[표 3]

다른 바이러스에 대한 LeIF-A/D 활성도 또한 시험한다. 제5도의 데이터는 L-세포의 EMC 바이러스 감염에 대한 항바이러스 효과를 나타내고 제6도의 데이터는 L-세포의 VSV 감염에 대한 효과를 나타낸다. 이들 데이터로부터 LeIF-A/D의 더 큰 활성은 하나의 바이러스(VSV)에 한정되지 않으며 그의 더 큰 활성은 많은 바이러스에 대해 일반적인 특성임을 알 수 있다. 보통 사람의 연층(buffy-coat) 인터페론 제품은 마우스 세포에 대해 효과를 갖지 않는다(참조 표 2). 따라서 CD-1 마우스의 EMC 바이러스 감염에 대한 LeIF-A/D의 활성을 측정한다. 제7도에 도시된 결과는, LeIF-A/D가 치명적인 EMC 바이러스 감염에 대해 매우 효능이 있으며, 세포라인에서의 활성으로부터 예상한 바와 같이(표 2) LeIF-A 역시 항바이러스 활성을 가짐을 나타낸다. 제7도의 데이터는 감염시키기 3시간 전에 복강내로 처리한 결과이다. LeIF-A/D 및 LeIF-A의 용량은 WISH상에서 역가측정한 바와 같다.

햄스터의 치명적인 바이러스 감염도 LeIF-A/D 및 LeIF-A에 의해 영향받는데(제8도), LeIF-A/D가 가장 효과적이고, 연층 인터페론은 단지 통계학적으로 유의적이 아닌 작은 효과만을 나타낸다. 제8도의 경우, 모든 인터페론은 감염시키기 3시간 전에 WISH 세포상에서 역가 측정한 5×10⁵㎍/kg의 용량으로 복강내 투여한다.

이들 결과는, 포유동물종 범위내에서 LeIF-A/D의 현저한 항바이러스 효과는 세포배양물에만 한정된 것이 아니고 치명적인 바이러스 감염에서도 관찰됨을 나타낸다.

EMC 바이러스는, 예를들어 구제역(foot and mouth disease) 및 소아마비를 일으키는 피코나 바이러스(Picornavirus) 부류인 대표적인 바이러스 부류에 대한 항바이러스 효과로 예상될 수 있는 항바이러스 효과를 설명하는데 있어서의 모델 계로 생각될 수 있다. VSV 바이러스는, 예를들어 공수병을 일으키는 라브도 바이러스(rhabdovirus) 부류인 대표적인 바이러스 부류에 대한 항 바이러스 효과로 예상될 수 있는 항바이러스 효과를 설명하는데 있어서의 모델 계로 생각될 수 있다.

표 4는 WISH 및 MDBK 세포상에서 본 발명의 여러 가지 LeIF 하이브리드의 활성 및 이의 활성비를 표로 만든 것이다:

[표 4]

[비경구 투여]

본 발명의 하이브리드 백혈구 인터페론은 항종양 또는 항바이러스 치료를 필요로 하는 환자 및 면역억제반응을 나타내는 환자에게 비경구적으로 투여할 수 있다. 용량 및 용량비는 인체유도물질의 임상적 연구에서 현재 사용되는 것과 비슷한데, 예를들어, 1일 약(1-10)×10⁶단위, 및 1% 이상의 순도를 갖는 물질의 경우에는 1일 5×10⁷단위까지이다. 상기 기술한 원숭이 연구에서 예비지적사항은 세균적으로 수득한 LeIF의 용량은 LeIF 이외의 인체 단백질(백혈구-유도물질에서 이 단백질은 불안, 온도상승 등과 같은 역효과를 나타내는 발열물질로서 작용할 수 있다)의 필수적인 부재로 인해 효과를 상당히 더 증가시킬 수 있음을 시사한다.

본 발명에서 준용하여 적용할 수 있는 비경구 투여형인 거의 균질인 세균성 LeIF에 대한 적절한 투여형태의 예로서, 2×10⁸μ/mg의 비활성을 갖는 LeIF 3mg을 25ml의 5N 혈청 알부민(인체)-Usp에 용해시키고, 용액을 세균학적 여과기에 통과시킨 다음 여과된 용액을, 각 바이알이 비경구 투여에 적절한 순수한 인터페론 6×10⁶단위를 함유하도록 무균적으로 100바이알로 분배시킨다. 바이알은 사용하기 전에 냉소(∼20℃)에서 보관하는 것이 바람직하다.

본 발명의 화합물은 공지의 방법에 따라 제형화하여 약제학적으로 유용한 조성물을 제조할 수 있는데, 여기에서 본 발명의 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용되는 담체 베히클과의 혼합물 형태로 합한다. 적절한 베히클 및 이들의 제형은 본 발명에서 참조로 인용한 하기 문헌에 기술되어 있다[참조:E.W.Martin, Remington′s Pharmaceutical Sciences]. 이러한 조성물은 숙주에게 효과적으로 투여하기에 적절한 약제학적으로 허용되는 조성물을 제조하는데 유효한 량의 본 발명의 인터페론 단백질을 적당한 량의 베히클과 함께 함유한다.

Claims (10)

1. 대략 165 내지 166개의 아미노산으로 이루어지며, 그의 아미노산 서열은, 아미노산 종류 및 수에서, 자연적으로 존재하는 상이한 백혈구 인터페론의 아-서열들에 상응하는 별개의 아-서열들로 차례대로 이루어져 있으며, 전체적인 조성면에서는 자연적으로 존재하는 백혈구 인터페론의 아미노산 서열과는 다른 폴리펩타이드를 코드화하는 본쇄를 함유하는 이본쇄 DNA.
2. 제1항에 있어서, 코드화된 폴리펩타이드의 N-말단 부분은 필수적으로 LeIF-D의 아미노산 1 내지 92로 이루어지고, 이의 카복시 말단 부분은 필수적으로 LeIF-A의 아미노산 92 내지 165로 이루어지는 이본쇄 DNA.
3. 제1항에 있어서, 코드화된 폴리펩타이드의 N-말단 부분은 필수적으로 LeIF-A의 아미노산 1 내지 91로 이루어지고, 이의 카복시 말단 부분은 필수적으로 LeIF-D의 아미노산 93 내지 166로 이루어지는 이본쇄 DNA.
4. 제1항에 있어서, 코드화된 폴리펩타이드의 N-말단 부분은 필수적으로 LeIF-D의 아미노산 1 내지 63으로 이루어지고, 이의 카복시 말단 부분은 필수적으로 LeIF-A의 아미노산 63 내지 165로 이루어지는 이본쇄 DNA.
5. 제1항에 있어서, 코드화된 폴리펩타이드의 N-말단 부분은 필수적으로 LeIF-A의 아미노산 1 내지 62으로 이루어지고, 이의 카복시 말단 부분은 필수적으로 LeIF-D의 아미노산 64 내지 166로 이루어지는 이본쇄 DNA.
6. 제1항에 있어서, 코드화된 폴리펩타이드의 N-말단 부분은 필수적으로 LeIF-A의 아미노산 1 내지 91로 이루어지고, 이의 카복시 말단 부분은 필수적으로 LeIF-B의 아미노산 93 내지 166로 이루어지는 이본쇄 DNA.
7. 제1항에 있어서, 코드화된 폴리펩타이드의 N-말단 부분은 필수적으로 LeIF-A의 아미노산 1 내지 91로 이루어지고, 이의 카복시 말단 부분은 필수적으로 LeIF-F의 아미노산 93 내지 166로 이루어지는 이본쇄 DNA.
8. 형질전환체 미생물중에서, 제1 내지 7항중 어느 한 항에 따른 DNA 서열로 코드화된 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 복제가능한 플라스미드 발현 베히클.
9. pLeIF AD trp(Bgl II), pLeIF AD trp(Pvu II), pLeIF DA trp(Bgl II) 및 pLeIF DA trp(Pvu II)로 이루어진 그룹중에서 선택된 플라스미드.
10. pLeIF AB(Pvu II) 및 pLeIF AF(Pvu II)로 이루어진 그룹중에서 선택된 플라스미드.

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