KR910007849B1 - 신균주 스트렙토마이세스 sp.Y-183 및 이로부터 생산되는 히단토인에이즈의 생산방법 - Google Patents

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Description

신균주 스트렙토마이세스 sp. Y-183 및 이로부터 생산되는 히단토인에이즈의 생산방법

제1도는 본 발명에 따른 히단토인에이즈의 활성에 대한 최적 pH를 나타낸 도면.

제2도는 본 발명에 따른 히단토인에이즈의 활성에 대한 pH 안정성의 범위를 나타낸 도면.

제3도는 본 발명에 따른 히단토인에이즈의 활성에 대한 최적온도를 나타낸 도면.

제4도는 본 발명에 따른 히단토인에이즈의 활성에 대한 열안정성의 범위를 나타낸 도면이다.

본 발명은 신균주인 스트랩토 마이세스 sp. Y-183 및 이로부터 생산되는 히단토인에이즈(Hydantoinase)에 관한 것이다.

본 발명에 따라 생산되는 히단토인에이즈는 히단토인 유도체들을 입체적으로 가수분해시켜 D-N-카바밀 아미노산으로 만드는 효소이다. 히단토인에이즈에 의해 분해된 D-N-카바밀 아미노산은 화학적인 방법 혹은 카바밀라아제의 효소에 의해 원하는 D- 아미노산으로 제조될 수 있고, 이러한 아미노산들은 베타락탐계 항생제인 아목시실린, 암피실린, 세팔렉신 등을 만드는데 필요한 중간물질인 D-P-하이드록시 페닐글라이신과 D-페닐글라이신 등으로 사용된다.

히단토인에이즈는 디하이드로피리미딘에이즈(D-hydropyimidinase, EC 3.5.2.2)로 명명되기도 하며, 동물, 식물, 미생물등에 널리 존재한다.

종래에 알려져 있는 히단토인에이즈는 효소의 생산균주로는 스트랩토마이세스 미타카엔시스(ATCC 15295)나 슈도모나스 스트리아타(IFO 12996) 및 슈도모나스 플로레슨스(DSM 84) 등이 있으며, 이들 미생물을 사용하여 D-N-카바밀 아미노산을 제조하는 방법은 미국 특허공보 제4,237,227호 등에 소개되어 있으나, 이러한 방법으로 공업적인 면에서 그 생산성이 불량하여 보다 우수한 효소활성을 갖는 신균주의 확보가 요구되었다.

이에 본 발명자들은 높은 효소활성을 갖는 우수한 균주를 확보하기 위해 여러 가지 토양으로부터 꾸준한 균주 스크리닝을 시도한 결과, 종래에 알려진 균주에 비해 효소활성이 월등히 높은 고수율의 D-N-카바밀 아미노산을 생산하는 새로운 균주를 분리하여 본 발명에 이르게 된 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 신균주인 스트렙토마이세스 sp. Y-183(Streptomyces sp. Y-183)은 경기도 평택군에서 채취한 토양으로부터 분리해낸 것으로서, 1989년 3월 24일자에 한국과학기술원 유전자공학세타의 유전자은행에 수탁(수탁번호 ; KCTC 8450P)하였다.

본 발명에 따른 신균주 스트렙토마이세스 sp. Y-183과, 공지의 히단토인에이즈 생산균주인 스트렙토마이세스 미타카엔시즈(기탁번호 ; ATCC 15295)에 대하여 이들의 균학적 특성을 비교한 결과, 다음과 같은 차이점이 있었다.

[표 1]

형태학적 특성비교

[표 2]

생리학적 성질비교

[표 3]

배양학적 성질비교

주 1)+--+++ : 생육정도, ± : 생육미약, - : 생육불능

주 2)탄소원동화성을 조사하기 위한 배지조성은 푸리드함 고도리부 (Pridham Gottlieb) 한천배지에 10%의 각종 탄소원을 여과 멸균한 후, 상기 한천배지에 1/10 양의 비율로 가하여 30℃에서 14일간 배양 하였다.

이상에서 대비해본 바와같이, 본 발명에 따른 스트렙토마이세스 sp. Y-183은 종래에 알려져 있는 히단토인에이즈 생산균주인 스트렙토마이세스 미타카엔시스(ATCC 15295)와 비교해 볼 때 그 균학적 특성이 서로 크게 다른것인 바, 본 발명자들은 이를 신균주로 분리 동정하게 된 것이다.

한편, 본 발명에 따른 신균주인 스트렙토마이세스 sp. Y-183으로부터 분리되는 효소인 히단토인에이즈는 분자량이 300, 000달톤이고, Km값이 1.17×10^-2M인 것으로서, 기질특성이 높고, 중성의 천연형 아미노산의 히단토인류에는 물론, 비천연형 페닐히단토인류에도 작용하며, 특히D형의 기질에 특이적으로 작용하여 대응하는 D-N- 카바밀 아미노산으로 가수분해시킨다.

본 발명에 따른 히단토인에이즈는 다음과 같은 공정에 따라 D-아미노산을 생산하게 된다. 즉, 알데히드로부터 부쳐러(Bucherer)방법에 의해 DL-5에 치환기를 갖는 히단토인을 유도하고, 여기에 히단토인에이즈를 작용시키면 D-N-카바밀 아미노산으로 가수분해된다.

이때 반응 pH를 8-9로 유지하면 기질인 히단토인의 화학적 라세미화 반응이 동시에 진행하기 때문에 DL-히단토인으로부터 정량적으로 D-N-카바밀 아미노산의 전환이 가능하다. 이것을 산성조건하에서 아질산으로 처리하면 정량적으로 D-아미노산이 생성된다.

이하, 본 발명에 따른 신균주인 스트렙토마이세스 sp. Y-183을 이용하여 히단토인에이즈를 생산해내는 방법을 기술해보면, 우선 그리세린 아스파라긴 한천배지에 스트렙토마이세스 sp. Y-183을 사면배지에서 성장시킨후, 종배양배지에 1백금 루프 접종시키고, 30℃에서 24시간동안 진탕배양하여 이를 0.5-1VVM의 통기량, 00-600rpm의 교반속도하에서 5%비율로 접종하여 30℃-35℃, pH 7.0에서 60시간 배양시킨다.

이렇게 배양된 용액을 원심분리하여 균체를 회수하고 이를 마쇄, 초음파, 자동분해 등으로 처리하여 세포추출액을 만든다.

이렇게하여 제조된 조효소액에 3%프로타민 설페이트를 처리하여 핵산을 제거시키고, 암모니움 설페이트 분획일 실시하여 효소활성이 높은 40-65% 분획을 취하여 완충액에 용해시킨다음, 48시간동안 투석시킨다.

이어서, 이 효소용액을 이온교환수지에 흡착시킨 후, 소디움 클로라이드로 용출시켜 효소활성이 가장 높은 부분의 히단토인에이즈를 얻는다.

본 발명에 있어서 히단토인 유도체들의 가수분해 정도를 알아보기 위하여 디하이드로우라실과 비교 측정한 결과, 다음 표 4와 같이 DL-P-하이드록시 페닐히단토인과 DL-5-페닐히단토인등의 기질에서 높은 활성을 나타냈다.

[표 4]

스트렙토마이세스 sp. Y-183가 생산하는 히단토인에이즈의 기질특이성

상기 표 4에 따르면, 본 발명의 히단토인에이즈는 DL-5-페닐히단토인 및 DL-p-하이드록시페닐히단토인에 대하여 특이적인 상대활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

또한, 정제된 히단토인에이즈의 활성에 대한 최적 pH와 pH 안정성의 범위를 조사한 결과, 첨부한 도면 제1도 및 제2도에서 보는 바와 같이, 최적 pH는 8.8에서 가장 높은 효소활성을 나타냈으며, pH 7-10범위에서 안정성을 나타냈다. 이때, 최적 pH와 pH 안정성의 범위를 측정하는 방법은 각각 공지의 방법에 따라 실시하였다.

그리고, 제3도 및 제4도에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 히단토인에이즈는 최적온도는 45℃부근에서 가장 높은 효소활성을 나타냈으며, 온도안정성의 범위는 45℃까지는 안정했으나 50℃이상에서 효소활성을 잃기 시작했다. 최적온도 및 온도안정성의 범위를 측정하는 방법 역시 각각 공지된 방법에 따라 실시하였다.

본 발명에 따른 신균주 스트렙토마이세스 sp. Y-183으로부터 분리 정제된 히단토인에이즈와 공지균주인 슈도모나스 스트리아타 IFO 12996 및 슈도모나스 플로레슨스 DSM 84로부터 정제된 히단토인에이즈의 효소학적 성질을 비교해 보면 다음과 같다.

[표 5]

히단토인에이즈의 효소학적 성질비교

한편, 본 발명에 따른 히단토인에이즈의 효소작용을 저해하는 물질로는 금속킬레이트 화합물인 8-하이드록시퀴놀린, 1,10-페난스로린등이 있으며, 황화수소화합물인 P-클로로머큐리벤조익산도 효소활성을 저해하는 것으로 나타났다.

[표 6]

효소활성을 저해하는 물질 및 그 저해율

본 발명에 있어서 효소의 활성을 측정하기 위해서는 DL-5-(2-메틸오에틸)히단토인을 기질로 사용하여 pH 8.0, 30℃에서 20분간 반응시킨 뒤, 파라디메틸아미노벤즈알데하이드로 발색시켜 측정한다.

이때, 효소 1유니트는 분당 1마이크로몰의 N-카바밀-D-메치오닌을 생성하는 효소의 양으로 결정한다.

반응기질로 사용되는 히단토인 유도체들의 기질농도는 0.1-30% 사이에서 선택하며, 반응 pH는 7-10으로 한다.

이때, pH가 7 이하인 경우에는 반응율이 매우 낮아지게 되는데, 이는 반응 pH가 낮으면 기질인 DL-히단토인 유도체의 라세미화 반응이 일어나지 않아서 N-카바밀-D-아미노산의 생성율이 낮아지기 때문이다.

반응이 진행됨에 따라 반응액의 pH가 떨어지므로 적당한 시간에 반응액을 알칼리 조건으로 유지시켜 주기 위해 암모니아, 소디움 카보네이트 등을 가하여 주는 것이 좋다.

반응온도는 미생물의 효소종류에 따라 다르나 20℃-60℃ 온도에서 진탕 또는 교반 조건하에서 수행되는 것이 바람직하다.

반응시간 역시 이용되는 미생물의 종류에 따라 다르나 보통 5-100시간이 적당하다.

반응액에서 생성된 D-N-카바밀 아미노산을 분리할 때는 아미노산의 등전점을 이용하거나 이온교환수지를 이용하여 분리한다.

즉, 생성물이 N-카바밀-D-메치오닌, N-카바밀-D-페닐알라닌과 같은 소수성인 아미노산일 경우에는 반응액을 우선 pH 5로 조절한후 원심분리하여 미반응기질이나 단백질과 같은 불용성 물질을 제거시키고 여액을 다시 pH2-4로 보정시키면 원하는 D-N-카바밀 아미노산이 침전된다.

그러나, N-카바밀-D-세린, N-카바밀-D-알라닌과 같은 친수성인 아미노산을 분리하고자 할 때는 이온교환수지를 이용하는 것이 좋다.

이어서, 불용성 물질을 제거한 반응액을 음이온 교환수지에 통과시켜 원하고자 하는 물질을 흡착시킨후 묽은 염산으로 용출시키고, 이 용출액을 중성으로 만든 후 감압하에서 농축시키면 원하고자 하는 아미노산이 결정화 한다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

다음과 같은 배지조성으로 이루어진 종배양배지를 100ml씩 각각 5분획으로 나누고, 여기에다 성장한 스트렙토마이세스 sp. Y-183 1백금 루프를 접종시킨 다음, 30℃에서 30시간 동안 진탕배양한다.

이어서, 14.5ℓ 발효조의 발효배지 10ℓ에 접종시키고 pH7.0 및 30℃에서 0.5VVM의 통기량과 400rpm교반속도하에서 60시간 동안 배양한다.

배양중 pH는 염산과 암모니아로 유지한다.

(종배지의 조성)

효모엑기스 2.5g, 소이톤 15g, 육즙 1g, 황산암모늄 5g, 디하이드로우라실 3g, 염화칼륨 6g, 인산제 2칼륨 0.2g, 염화망간 0.2g, 글리세롤 10ml, 증류수 1ℓ, pH 7.0

(발효배지의 조성)

효모엑기스 10g, 디하이드로우라실 3g, 염화칼륨 6g, 인산제 2칼륨 0.2g, 염화망간 0.2g, 글리세롤 10ml, 어육즙 5g, 증류수 1ℓ, pH 7.0

이때, 배양시간에 따른 효소활성도는 다음 표 7에서 알 수 있는 바와 같이 48시간 배양하였을 때 최대 효소활성도를 나타낸다.

[표 7]

배양시간에 따른 효소활성도

[실시예 2]

사용균주 및 배양배지는 상기 실시예 1의 종배양배지에서 디하이드로우라실을 가하지 않을 배지를 사용하는 것 이외는 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 100ml 삼각플라스크에 20ml씩 배지를 분주한후 히단토인유도체들을 각각 60mg씩 가하고, pH 7.0으로 조절하여 121℃에서 15분간 가압멸균한다.

여기에다 글리세린 아스파라긴 한천배지에서 생육한 스트렙토마이세스 sp. Y-183 1백금 루프로 접종하고, 30℃에서 48시간 동안 진탕배양한후 균체를 회수하여 효소활성도를 측정한 결과, 표 8과 같이 디하이드로우라실을 가한 배지에서 가장 높은 효소활성도를 나타냈다.

이는 디하이드로우라실이 히단토인에이즈 효소를 생성하는데 필요한 유도물질이기 때문인 것으로 확인되었으며 이를 발효배지에도 첨가하여 효소활성을 증가시켰다.

[표 8]

효소생성에 미치는 유도체들의 영향

[실시예 3]

상기 실시예 1과 동일한 종배양배지를 사용하여 100ml 삼각플라스크에 20ml씩 배지를 분주한후 pH 7.0으로 조절하여 121℃에서 15분간 가압멸균한다.

이어서, 글리세린 아스파라긴 한천배지에서 생육한 스트렙토마이세스 sp. Y-183 1백금 루프를 접종하고 30℃에서 48시간 동안 진탕배양하는 과정에서 인산제 2칼륨을 각각 1mg, 2mg, 4mg씩 24시간, 36시간, 48시간마다 가하여 스트렙토마이세스 sp. Y-183의 균체증식량을 측정한다. 그결과, 표 9과 같이 12시간마다 2mg씩 가했을 때 가장 많은 균체를 얻었으며, 이때 효소활성도 역시 높았다.

[표 9]

인산제 2칼륨 농도에 미치는 균체증식의 영향

[실시예 4]

스트렙토마이세스 sp. Y-183과 공지균주의 효소활성을 비교하기 위하여 스트렙토마이세스 sp. Y-183과 스트렙토마이세스 미타카엔시스 ATCC 15295는 실시예 1과 동일한 종배양배지를 사용하고, 슈도모나스 스트리아타 IFO 12996에 대해서는 육즙 20g, 글리세롤6g, 히단토인 1g, 인산제 2칼륨 2g, 황산마그네슘 1g, 염화칼슘 40mg,황산철 20mg,황산망간 20mg,황산구리 20mg, 증류수 1ℓ, pH 5.5인 배지를 사용하되 100ml 삼각플라스크에 상기의 배지를 20ml씩 분주한 후, pH를 조절하고 121℃에서 15분간 가압멸균한 다음, 생육한 각각의 종균을 1백금 접종한다.

또한, 슈도모나스 스트리아타인 경우는 30℃에서 24시간 동안 진탕배양한 후 균체를 회수하여 효소활성을 측정하였으며, 스트렙토마이세스 sp. Y-183과 스트렙토마이세스 미타카엔시스는 30℃에서 48시간 동안 진탕배양한 후 균체를 회수하여 효소활성을 측정한 결과 표 10과 같이 본 발명의 균주가 가장 높은 효소활성을 나타냈다.

[표 10]

스트렙토마이세스 sp. Y-183과 공지균주의 효소활성비교

[실시예 5]

실시예 1의 종배양배지 및 발효배지와 동일한 배지를 사용하여 10ℓ의 발효배지에서 48시간 동안 배양시킨 스트렙토마이세스 sp. Y-183의 균체를 30,000rpm에서 20분간 원심분리하여 회수하고, 회수한 균체(400g)를 20mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 세척한 후, 다시 인산완충 용액(2ℓ, pH8.0)에 현탁시켜 초음파 파쇄기를 이용하여 4시간 동안 균체를 파쇄시킨다.

이 파쇄된 균체액을 원심분리하여 균체박을 제거한 후 상등액(2.2ℓ)을 조효소액으로 사용하여 이하 전조작을 4℃에서 행한다.

이 조효소액에 3% 프로타민 설페이트용액을 0.1% 가하여 30분 동안 교반시키고 원심분리하여 핵산을 제거한 후, 한외여과기를 이용하여 0.5ℓ로 농축시킨다.

농축된 조효소액에 황산암모늄을 가하여 40-65%의 분획을 취한다음, 원심분리하여 얻은 침전물을 20mM 인산완충액에 녹이고 동일한 완충용액으로 48시간 투석시킨다.

투석한 효소액을 미리 20mM TRIS-HCL 완충용액(pH 8.0)으로 평형시킨 DEAE-SEPHAROSE CL6B 칼럼(16ø×40cm)에 흡착시킨후 50mM TRIS-HCL 완충용액으로 세척하고, 이 완충용액을 함유하는 100mM, 200mM, 300mM, 400mM, 500mM의 염화나트륨 농도로 용출시킨 후, 효소활성이 높은 부분(400mM)을 모아 동일한 완충용액에 투석시켜 정제한 효소액을 얻는다.

다음 표 11은 정제결과를 나타낸 것으로 조효소액으로부터 약 9배의 효소활성을 증가시켰다.

[표 11]

히단토인에이즈의 정제도

Claims (4)

1. 히단토이에이즈(Hydantoinase)를 생산하는 것을 특징으로 하는 신균주 스트렙토마이세스 sp. Y-183(수탁번호 : KCYC 8450P).
2. 신균주 스트렙토마이세스 sp. Y-183(수탁번호 : KCYC 8450P)이 생산해 내는 것을 특징으로 하는 히단토인에이즈.
3. 발효배지에서 신균주 스트렙토마이세스 sp. Y-183(수탁번호 : KCTC 8450P)을 배양하고, 그 균체로부터 히단토인에이즈를 분리정제해 내는 것을 특징으로 하는 히단토인에이즈의 생산방법.
4. 제3항에 있어서, 발효배지로는 0.3%의 디하이드로 우라실이 포함되어 있는 것을 사용함을 특징으로 하는 방법.

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