KR910005886B1 - 연골조직의 치료약제 - Google Patents

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내용 없음.

Description

연골조직의 치료약제

본 발명은 손상된 구혈조직의 치료를 촉진시키는 방법 및 치료약제에 관한 것으로, 특히 치료를 촉진시키기 위해 맥관형성인자를 손상된 부위에 적용시키는 방법에 관한 것이다.

구형조직, 특히 무릎이나 손목의 반월과 같은 섬유연골, 쇄골말단의 반월섬유연골, 또는 측두하학골의 반월섬유연골은 혈관부위에서 우연한 사고로 조직이 찢어지거나 또는 파열된 후, 외과수술로 인한 절개후의 경우를 제외하고는 혈관형성 및 치료가 어렵다는 사실은 이미 공지되어 있다. King, J. Bone의 문헌[Joint Surg., Vol. 18, pp. 333-342(1936)]에서는 손상된 개의 반월연골은 손상된 부위를 활액막과 통하게 하여 연속조직을 형성시킴으로써 치료될 수 있다는 것을 밝혔다. 이것은 cabaud et al의 문헌 [Am. J. Sports Med., Vol. 9(3), pp. 129-134(1981)]에도 교시되어 있다. 후자의 문헌은 말초활막조직에 연결되어 있는 혈관조직 손상에 의한 개 및 원숭이의 반월연골을 대상으로 치료가 수행되었으며 이 치료방법은 찢어진 깊은 부위에 대해서도 치료가 가능하였다. Heatley, J. Bone의 문헌[Joint Surg., Vol. 62-B, 397-402(1980)]에는 절개된 부위를 봉합하여 절단된 토끼의 반월연골을 치료하는 것에 대해서 교시하였으며 또한 혈관조직이 아닌 활액세포의 침입이 치료보다 앞서서 혈관이 아닌 상처내에서 행해진다는 사실을 교시하였다. Aruoczky 등의 문헌[Am. J. Sports Med., Vol. 19(2), pp. 90-95(1982)]에는 혈관이 인간의 무릎 반월연골의 말초부분 1/4중에서만 발견되며, 또한 혈액공급량은 너무나 빈약하여 섬유연골의 파열 후 자발적인 치료를 촉진시키는 염증반응을 지지할 수 없다는 결론을 내렸다.

맥관형성인자는 상처치료에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있으며[Rettura et al., FASEB abstract No. 4309, 61st annual meeting, Chicago, (1977)] 이것은 종양세포와 상처유체로부터 유도되었으며[Banda et al., Proc. Natl. Acad. Sic., USA, Vol. 79, pp. 7773-7777(1982), 미합중국특허 제 4,503,028호]: 망막세포로부터 유도되었다[D'Amore, Proc. Natl, Acad, Sic., USA, Vol. 78, pp. 3608-3072(1981)]. Folkmane 등[J. Exp. Med., Vol. 133, pp. 275-288(1971)]은 Walker 256 쥐의 복수종양으로부터 종양 맥관형성인자를 분리하였다. 이 인자는 모관성 내피세포에 대한 유사분열물질로서 RN아제에 의해 불활성화 되었다. Tuan 등의 문헌[Biochemistry, Vol. 12, pp. 3159-3165(1973)]는 Walker 256 종량의 비히스톤 단백질에서의 유사분열작용 및 맥관형성작용을 발견하였다.

활성분취물은 단백질과 탄수화물의 혼합물이다. 동물 및 인간의 다양한 종양은 문헌[Phillips 및 Kumar, Int. J. Cancer, Vol. 23, pp. 82-88(1979)]에 기재된 바와 같이 맥관형성인자(들)를 생산하는 것으로 밝혀졌지만 이러한 인자들의 화학적 특성은 결정되지 않았다. Walker 256 종양으로부터 얻은 저분자량의 비단백질 성분은 맥관형성 및 유사분열을 하는 것으로 밝혀졌다. 이 사실은 Weiss 등의 문헌[Br. J. Cancer, Vol 40, pp. 493-496(1979)]에 기재되어 있다. 400-800달톤 분자량의 맥관형성인자는 Fenselau 등의 문헌[J. Biol. Chem., Vol. 256, pp. 9605-9611(1981)]의 방법에 따라 균일하게 정제되었지만 더 이상 특성화되지는 않았다. 인간의 폐종양세포는 고분자량의 담체와 활성성분으로 저분자량의 비단백질을 함유하는 맥관형성인자를 분비하는 것으로 밝혀졌다(Kumar 등의 문헌[Int. J. Cancer, Vol. 32, pp. 461-464(1983)]), Vallee 등의 문헌[Experientia, Vol. 41, pp. 1-15(1985)]에는 맥관형성활성이 Walker 256 종양으로부터의 3개의 분취물과 관련된다는 사실을 밝히고 있다. Tolbert 등에 의한 미합중국 특허 제 4,229,531호에는 인간선암 세포주 HT-29로부터 맥관형성인자를 생산하는 방법이 기술되어 있다. 헤파린 결합성장인자 베타도 공지된 맥관형성인자이다. 맥관형성물질로 알려진 맥관형성단백질은 인체 선암세포로부터 분리되어 특성화된 것이며(Fett 등 Biochem., Vol. 24, pp. 5480-5486(1985)) 이것은 본 발명에 사용하기 위해 선택된 물질이다.

즉, 이것은 하기식으로 표시되는 펩티드이다.

상기식의 펩티드와 실질적으로 동일한 맥관형성작용을 갖는, 치환된 또는 누락된 1 내지 수개의 아미노산을 함유하는 상기식 펩티드의 유도체 또는 그것의 맥관형성분체가 본 발명을 실시하는데 적합하다. 〈Glu 표시는 피로글루타민산부를 나타내는데 사용된 것이다.

유전공학기술 분야의 당업자들은 유전공학기술에 의해 쉽게 만들 수 있는 상기 펩티드 구조와 관련된 다양한 펩티드를 인식할 수 있다. 이러한 펩티드는 개시코돈 등에 의해 암호된 리더분체를 가질 수 있다. 그러므로 상기 구조와 동일한 각종 펩티드들은 통상의 유전공학기술을 통해 쉽게 얻을 수 있다.

열상, 파열 또는 절단 등의 상처가 생긴 후 반월의 구혈조직을 치료하는 개선된 방법이 발견되었는 바, 이 방법은 손상된 조직부근에 유효량의 맥관형성인자를 공급하는 것으로 구성된다. 바람직한 결과를 얻기 위해서 맥관형성인자와 약리적 허용비독성담체를 함유하는 조성물의 형태로 손상부위 또는 부위 부근에, 바람직하게는 손상부위와 접촉하도록 적용시킨다. 담체는 액체 또는 고체 예를들면 메틸셀룰로오스와 같은 중합체, 또는 에틸렌과 비닐아세테이트의 공중합체, 또는 장시간동안 맥관형성인자를 서서히 방출하도록 하는 다른 중합조성물이며, 조성물의 경우에 맥관형성인자는 조절방출 이식물의 형태이다. 본 발명의 방법은 특히 전술한 반월과 같은 섬유연골에 적용된다.

효과적인 투약량은 사용된 맥관형성인자의 종류와 순도에 따라 광범위하게 변한다. 순수한 맥관형성인자의 경우에 있어서, 인자가 급속히 방출되는 메틸셀룰로오스와 같은 담체와 함께 투여될 때 2-4mm 길이의 손상부위가 치료되기 위해서는 500-900ng이 필요하다. 특수한 경우에 있어서 효과적인 투약량의 최적범위는 관례적인 테스트에 의해 결정할 수 있다. 본 발명에 의하면 6-10주내에 치료가 완전하게 되기 때문에, 대략 동일한 기간동안, 즉 약 6-10주동안 맥관형성인자의 공급을 지연시키는 조절방출 이식물을 사용할 수 있다. 반월의 섬유연골 중심부의 상처부근에 맥관형성인자를 이식 또는 투여하면 신경맥관화 작용이 유발되며, 봉합물을 사용하지 않더라도 상처를 치료할 수 있다.

하기의 특정 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예]

체중이 5kg 내지 7kg인 뉴질랜드산 백색토끼 수컷 97마리를 각각 다른 우리에 가두고 표준 음식물을 공급하는데 단, 예방책으로서 수술전 후에 음료수에 테트라사이클린을 첨가하였다.

아세프로마진 말레이트(Tech America Group, Inc., Elwood, Ks : 2-아세틸-10-(3-디메틸아미노-프로필)페노티아진 수소말레이트)를 체중 1kg당 1.5mg 그리고 케타민(Bristol Laboratories, Syracuse, NY : DL-2-(0-클로로페닐)-2-(메틸아미노)시클로헥사논 하이드로클로라이드)를 체중 1kg당 25mg을 근육내 주사하고, 1%의 크실로케인(Astra Pharmaceutical Products, Ins., Westborough, MA : 아세트아미도, 2-(디에틸아미노)-N-(2,6-디메틸페닐)-모노히드로클로라이드) 2cc을 국소 피하 주사하여 토끼를 마취시켰다. 우측 하단부를 자르고, 70% 알코올 용액에 함침시킨 후 멸균된 수건으로 닦았다. 측면의 파라차텔라피부 및 지지구를 절단하여 슬연골을 노출시켰다. 파텔라를 의학적으로 탈구시키고, 비골신경건조직을 분리한 후 무릎을 고정시켰다. 10배율인 쌍안경이 달인 분석 현미경으로 마이크로스킨후크를 반월의 앞면각에 놓았다. 반월을 앞쪽으로 끌어당기자, 앞에서 세 번째의 측면반월이 보였다. 외과용 칼을 사용하여 반월막으로부터 2mm 거리에서 출발하는 반월체내에서 약 0.8mm×2.5mm의 수평포켓을 분리하였다. 포켓을 섬유연골체의 중간 세 번째 부위내의 조직표면에서 뒤쪽으로 연장시켰다. 활액의 외상을 최소화시키기 위해서 주의를 기울였다. 메틸셀룰로오스(400Cp)를 오토클래이브 처리한 뒤, 4℃에서 하룻밤동안 교반하면서 멸균수중에 용해시켰다(1% W/V). 동결건조시킨 맥관형성인자의 염유리 샘플을 4℃에서 2시간동안 완만하게 교반시켜서 1% 메틸셀룰로오스 중에 현탁시켰다. 10㎕를 청결건소상태의 마일라 시이트에 놓고 층흐름 조건하에서 공기 건조시킨 후, 각각 100ng의 맥관형성인자를 함유하는 직경 3mm의 디스크 투명 펠릿을 형성시켰다. 펠릿을 함유하는 시이트를 멸균시킨 정방형 페트리접시에 놓은 뒤, 건조기에 넣고 60분간 동결건조시켜서 펠릿을 완전히 건조시켰다. 맥관형성인자를 함유하지 않는 대조용 메틸셀룰로오스 디스크를 제조하였다. 멸균건조하에서, 집게를 사용하여 플라스틱 시이트로부터 디스크를 개별적으로 분리하고, 접은 뒤 이들은 각각 20 게이지 니들의 뾰족한 단부에 꽂았다.

샘플을 파지하고 있는 20게이지 니들의 뾰족한 단부를 토끼의 섬유연골포켓내로 삽입하고 20게이지 니들을 갖는 밀폐기구를 사용하여 니들로부터 디스크를 배출시킨 뒤 샘플을 반월조직내로 정확히 옮기고, 반월조직내의 샘플에 충격을 주었다. 1mm 나이프로 포켓의 중간을 잘라 수직의 열상을 자극시켰다.

무릎을 펴게하고, 파텔라를 감소시킨 후 조직을 1ℓ당 500mg을 함유하는 0.9% 생리적 식염수 용액에 담그었다. 지지구를 8개의 3-0 바이크릴 흡수성 봉합물에 의해 단속적 형상으로 봉합하고 피부는 4-0 바이크릴 봉합물에 의해 연속적 형상으로 봉합하였다. 토끼를 우리안에서 자유롭게 뛰놀도록한 뒤 표준 음식물을 공급하였다. 테트라사이클린을 수술전과 후에 음료수에 첨가하였다.

3, 6, 8, 9, 12, 26주 간격으로 치사량의 아세프로마진 말레이트 3mg/kg과 케타민 50mg/kg을 정맥내 주사하여 토끼를 죽였다. 슬연골을 분석 현미경을 사용하여 관찰한 후, 관찰결과를 기록하였다. 관찰자는 이식된 샘플을 발견하지 못하였다. 신경맥관형성 여부에 따라 결과의 등급을 매겼다. 신경맥관형성이 양성으로 나타낸 샘플에 대해서는 포켓 및 나이프 컷 존부(＂치료＂)에 대한 두 번째 관찰결과를 기록하였다.

계속적인 관찰기록을 위해 샘플을 10% 중성 완충 포르말린 용액에 저장하였다. 반월 및 그 밑의 뼈를 통과하는 횡단면의 석회질을 제거하고, 매립한 뒤 광현미경 분석을 위해 헤마토크실린과 에로신으로 염색하였다.

신경맥관형성은 맥관형성인자가 이식된 섬유연골 중 39-75(52%)에서 발견되었다. 신경맥관형성은 이식포켓의 방향으로 섬유연골체와 내부호른에 대하여 접촉활액으로부터 성장하는 혈액관을 가진 연결조직의 패너스에 따라 특징을 나타내었다. 포켓식도와 나이프 컷의 봉합(＂치료＂)은 39(21%)의 신경맥관형성 반월 중 8개에서 일어났다. ＂치료＂는 포켓을 과배양하고 식도를 없애기에 충분히 강력한 연결조직 패너스 생성에 따라 이차적으로 나타났다. 반월의 내부호른을 좁히면 ＂상처조직＂의 치료단축이 일어나기도 하지만 강력한 반응을 수반하기도 한다.

신경맥관형성이 없는 맥관형성 무릎은 수술 후 어떤 변화도 없었으며 패너스 또는 혈액관이 없이 행한 이식당일과 동일한 것으로 나타났다. 포켓과 나이프 컷은 변화를 일으키지 않았으며 메틸셀룰로오스도 발견되지 않았다.

대조군에서, 22개의 무릎 중 20개(91%)가 신경맥관형성이 없는 외과수술 당일과 동일한 것으로 나타났으며 포켓 또는 나이프 컷에서도 전혀 변화가 없는 것으로 나타났다. 두 개의 무릎(9%)에서 연결조직의 패너스가 내부호른상에서 포켓 및 나이프 컷을 향하여 자라고 있는 것으로 나타났다. 혈관은 나타나지 않았으며 연결조직은 포켓 또는 나이프 컷에 도달하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 이러한 혈관은 양성인 것으로 등급을 매겼다.

맥관형성인자와 대조군사이의 통계적 차이는 상당히 컸다.

맥관형성인자군에서, 신경맥관형성은 4주전에 죽인 동물에서는 27%(8마리 중 3마리), 6-10주 중에 죽인 동물에서는 57%(30 또는 53), 10주 이후에 죽인 동물에서는 43%(14마리 중 6마리)에서 나타났다. 치료시간에 대한 분석결과는 하기 표1에 요약한다.

대조군에서는, 두 개의 ＂양성＂반응이 6주 및 8주에서 나타났다.

[표 1]

헤마토크실린 에오신으로 염색한 조직단편은 말초혈액으로부터 반월성 섬유연골을 침범하는 느슨한 섬유아세포 조직에 의해 둘러싸인 커다란 관형채널임을 확인하였다. 돌출된 맥관을 갖는 활액조직을 반월표면에 부착시켰다. 또한, 새로운 연골세포로 나타나는 특이한 조직이 침범조직과 정상의 섬유연골 사이의 계면에서 확인되었다.

맥관형성인자의 담체로서 토끼 알부민과 함께 에틸렌 : 비닐아세테이트 공중합체(60 : 40)를 사용하여 비슷한 결과를 얻었다.

Elvax구의 토끼 알부민 최적 함량 확인방법

토끼의 알부민과 공중합체(Elvax 40p) 다량을 함유하는 일련의 펠릿을 만들어 함유된 맥관형성인자를 방출하는데 최적합한 공중합체 : 알부민의 비를 결정하였다. 토끼 혈청알부민 50mg과 소정량의 [¹²⁵I]로 표지화된 맥관형성인자를 1ml의 물에 용해시키고, 멸균튜브내로 0.22μ의 필터를 통해 여과시켜서 멸균처리하였다. 멸균용액을 냉동 및 동결건조시켰다. 토끼의 알부민은 맥관형성인자 방출의 벌크담체 및 작용제로서 작용하며, 토끼에서 추출된 것으로서 이것은 토끼에 이식된 후에 어떠한 면역반응도 일으키지 않아야 한다. 동결건조된 알부민 맥관형성인자 고형물을 멸균조건하에서 혼합하여 균질분말을 얻었다. 입자크기의 균일성은 제조효율에도 중요하다. 디클로로메탄(100mg의 공중합체) 중의 10% 공중합체 용액 1ml를 소정량의 분말을 함유하는 튜브에 가하고 튜브를 밀폐한 후 성분을 약 10분동안 소용돌이 혼합기로 고속으로 교반시켜 균일 현택액을 제조하였다. 이 현택액을 18 게이지 스틸니들이 장착된 5ml의 1회용 주사기내에 주입하였다. 현탁액을 드라이아이스/에탄올 배스 중에서 -78℃로 냉각시킨 50ml 비이커중의 20ml의 무수에탄올에 니들형적하기를 통해 액적형태로 압출하였다. 액적은 냉각 에탄올과 접촉하여 구형으로 겔화되어 비이커의 에탄올로 추출함에 따라 비이드는 백색으로 변하였다. 새로운 에탄올 용액 중에서 하룻밤동안 항온 배양한 후 펠릿을 흐름후드 중에서 공기 건조시켰다.

이러한 방식으로 제조한 펠릿(약 50개)은 크기가 약 1mm³이었다. 이러한 펠릿으로부터 맥관형성인자의 방출속도는 37℃하의 생리식염수 중에서 이들을 항온 배향시켜서 측정하고 시간에 따른[¹²⁵I] 맥관형성인자의 방출률을 측정하였다. 1-10중량%의 알부민을 함유하는 펠릿을 첫날에 맥관형성인자 소량을 방출하였으며 그 후에는 방출하지 않았다. 방출된 물질은 펠릿 표면상에 잔류하였다. 40-50중량%의 알부민을 함유하는 펠릿은 첫날에 다량(58 및 77%)의 맥관형성인자를 방출한 반면, 30%의 알부민 펠릿은 중간정도의 적당한 방출률을 나타내었다. 이러한 정보로부터, 2중량부의 공중합체 및 1중량부의 토끼 알부민으로 구성된 조성물을 사용하여 1펠릿가당 10ng-10mg의 맥관형성인자를 함유하는 펠릿을 제조한다.

반월포켓의 이식물로서 메틸셀룰로오스 펠릿 대신에 2 : 1 공중합체 : 알부민 펠릿으로부터 절단한 피라밋 형상의 시험편을 사용하여 전술한 외과수술 공정을 수행하고 : 총 100ng의 맥관형성인자를 함유하는 하나 또는 두 개의 시험편을 집게를 사용하여 각 포맷에 넣음으로써 펠릿의 효과를 시험하였다. 대조군은 맥관형성인자를 함유하지 않았다. p-3 니들상의 하나의 4/0 바이크릴 또는 6/0 프롤린 봉합물을 사용하여 포켓을 봉합하였다. 8주째에 동물을 죽이고 반월의 치료 및 신경맥관형성에 대해 조사하였다.

[표 2]

알부민과 다른 중합체와의 혼합물을 조절방출성 이식물 중의 맥관형성인자의 담체로서 사용할 수 있다. 각 경우에 있어서, 최적효과를 나타내는 비율은 간단한 시험에 의해 결정할 수 있다.

Claims (1)

1. 하기식의 폴리펩티드와 약리학적 허용담체를 포함하는 이식물 형태의 파열된 연골치료용 약제 :