KR910004337B1

KR910004337B1 - 비타민 d 유도체 및 이를 함유하는 약제

Info

Publication number: KR910004337B1
Application number: KR1019860700644A
Authority: KR
Inventors: 에프. 드루카 헥터; 이게까와 노부오; 다나까 요꼬; 케이.슈노스 하인리히; 오스트렘 보울라
Original assignee: 위스콘신 알럼니 리서치 화운데이션; 존 알. 피케
Priority date: 1985-01-17
Filing date: 1986-01-15
Publication date: 1991-06-26
Also published as: AU5359786A; DK159273C; DK56490D0; DK162394C; EP0211863A4; DK159273B; DK162394B; DK443186D0; DK35889A; DK56490A; DK157007C; DE3687377T2; JPH0649092A; JPH0635474B2; JPH0737391B2; JPH0678354B2; DK157007B; DK35889D0; KR870700071A; WO1986004333A1

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

비탄민 D 유도체 및 이를 함유하는 약제

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 신규 비타민 D 유도체에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 2, 6-호모비타민에 관한 것이다.

더욱 특히, 본 발명은 하이드록실화 26-호모비타민에 관한 것이다.

비타민 D는 동물 및 인간에게서 칼슘 및 이의 대사를 조절하는 것으로 알려져 있으며, 비타민 D의 생물학적 효능은 생체내에서 그의 하이드록실화 유도체로의 대사전환에 의거한다는 것이 확실하게 입증되었다. 즉, 비타민 D₃는 생체내에서 하이드록실화되어 간장에서 25-하이드록시 비타민 D₃로 된후, 신장에서 1α, 25-디하이드록시 비타민 D₃로 전환된다. 현재 순환 호르몬 형태의 비타민 D로 인지되는 것은 후자 화합물이다.

이러한 형태의 비타민 D는, 장에서 칼슘 및 인의 운반을 촉진시키고, 뼈의 이동성(mobilization) 및 광화성(minerlization)을 촉진시키는 그의 생물학적 활성 때문에, 여러 가지 뼈의 질환 치료에 사용하기에 특히 적절한 중요한 약제학적 생성물이다.

[선행기술]

비타민 D 유도체 및 이의 제조방법과 용도는 특허 및 다른 문헌중 많은 참조문헌에 기술되어 있다. 예를들면, 미합중국 특허 제 3,565,924호에는 25-하이드혹시콜레칼키페롤이 기술되어 있고 ; 미합중국 특허 제 3,697,55 9호에는 1, 25-디하이드혹시콜레칼키페롤이 기술되어 있고 ; 미합중국 특허 제 3,741,996호에는 1α-하이드혹시콜레칼키페롤이 기술되어 있고 ; 미합중국 특허 제 3,786,062호에는 22- 데하이드로-25-하이드혹시콜레칼키페롤이 기술되어 있고 ; 미합중국 특허 제 3,880,894호에는 1, 25-디하이록시에르고칼키페롤이 기술되어 있고 ; 미합중국 특허 제 4,201,881호에는 24, 24-디플루오로-1α, 25-디하이드록시콜레칼키페롤이 기술되어 있고 ; 미합중국 특허 제 4,196,133호에는 24, 24-디플루오로-1α, 25-디하이드록시콜레칼키페롤이 기술되어 있다.

[본 발명의 설명]

이제 본 발명에 의해서, 신규한 비타민 D₃유도체가 뛰어난 비타민 D-유사활성을 나타내며, 공지된 용도(예를들면 상피소체기능 감퇴증, 골이영양증, 골연화증 및 골다공증과 같은 칼슘 및 인의 불균형을 발현하는 여러 질병의 치료)에 비타민 D₃뿐만 아니라 여러 비타민 D₃유도체의 대용물로서 쉽게 사용할 수 있다는 것이 밝혀졌다.

이러한 유도체는 26-호모비타민, 특히 1α, 25-디하이드록시-22E-데하디드로-26-호모비타민 D₃및 1α,25-디하이드록시-26-호모비타민 D₃이다.

본 발명의 화합물은 다음 일반식으로 편리하게 나낼 수 있다 :

상기식에서, R₁, R₂및 R₃는 수소, 탄소수 1 내지 약 4의 아실 및 벤조일로 이루어진 그룹중에서 각기 선택하고 ; R₄및 R₅는 수소이거나, 함께 탄소-탄소 이중결합을 형성한다.

본 발명의 가장 우수한 수행방법

본 발며의 화합물은 다음 반응도식과 설명에 나타난 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 되식 및 상세한 설명에서, 같은 번호는 같은 화합물을 나타낸다.

[도 식]

본 발명의 방법은 다음과 같다 : 1α,3β-디메톡시메톡시-23, 24-디노르콜-5-엔-22-알을 비닐마그네슘 브로마이드와 반응시켜 알릴 알콜

을 생성한다. 이 알코올을 트리메틸 오르토-n-부틸레이트 및 촉매량의 프로피온산과 반응시킴으로써 클라이젠 재배열(Claisen rearrangement)시켜 우수한 수율(97%)로 에스테르

를 수득한다. 이 화합물

를, n-부틸리튬 및 THF로 처리한 후, 산소로 처리하고, 이어서 트리에틸 포스파이트로 환원시켜 분자중 C-25 위치에 하이드록실 그룹을 도입하여, 그의 엔오레이트 형태로 전환시킨다. 그후 이 27-에스테르

을, 수소화리튬알루미늄으로 연속처리하여 상응하는 디올을 생성한후, 메탄설포닐 클로라이드 및 피리딘으로 처리하여 메실레이트를 생성하고, 그후 수소화리튬알루미늄으로 처리하여 알코올

로 전환 시킨다.

산으로 처리하여 MOM 그룹을 제거하여(22e, 25ζ)-1α, 3β, 25-트리하이드록시-26-호모-콜레스타-5, 22-디엔

을 생성시키고, 이것을 아실화시켜 디아세테이트

을 생성시킨다. 이 화합물

을 N-브로모석신이미드 및, 그후 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드로 알릴계 브롬화시켜 5, 7, 22-트리엔

을 생성하고, 조사(irradiated)시키고 열을 가하여 이성화시켜 (22E) -데하이드록시-26-호모비타민 D₃

을 생성한다.

5, 22-디엔

을 선택적 수소화시켜 9-엔

를 생성하고, 이것을 상기와 같이 5, 7-디엔

으로 전환시킨후, (25ζ)-1α, 25-디하이드록시-26-호모비타민D₃

로 전환시킨다.

[방법의 상세한 설명]

다음 본 발명 방법의 상세한 설명에서, 융점은 고온 현미경으로 측정하고 보정하지 않았다.¹H-NMR스펙트럼은, 달리 명시되지 않는 한, Me₄Si를 내부표준으로 하여 CDC1₃중 히다찌 R-24A(60MHz)로 측정한다. 질량 스펙트럼은 70eV에서 시마쭈(Shimadzu) QP-1000 질량 분광계로 측정한다. UV 스펙트럼은 시마쭈UV-200 이중광선 분광계로 에탄올 용액중에서 측정한다. 컬럼 크로마토그라피는 실리카겔(E. Merck, Kieselgel 60 F₂₅₄, 0.25mm 두께) 상에서 수행한다. 통상적인 끝처리는 물로 희석시키고, 괄호안에 나타낸 유기용매로 추출하고, 추출물을 세척하여 중성으로 하고, 무수 황산 마그네슘상에서 건조시키고, 여과하고 감압하에서 용매를 제거하는 것을 의미한다. 다음 약자를 사용하는데 ; THP는 테트라하이드로피라닐이고 ; THF는 테트라하이드로푸란이며 ; ehter는 디에틸에테르이고, MeOH는 메탄올이고, MOM은 메톡시틸이고, LDA는 리튬디이소프로필아미드이다. 온도는 섭씨이다.

(22E, 25)-1α, 3β-디메톡시메틸오시-26-호모콜레스타-5, 22-디엔-2 7-오산 메틸 에스테르

톨루엔(6ml)중 알릴계 알코올

(390mg, 0.844mmol), 트리메틸오르토-n부틸레이트(0.7ml) 및 프로피온산(3방울)의 용액을 2시간동안 아르곤하에서 환류시킨다. 감압하에서 용매를 제거하여 조 생성물을 수득하고, 이것을 실리카겔(20g) 컬럼에 넣는다. 헥산-에틸아세테이트(5 : 1)로 용출하여 에스테르

(446mg, 97%)을 오일로서 수득한다.

¹H-NMR δ : 0.68(3H, s, 18-H₃), 0,88(3H, t, J=7Hz, -CH₂CH₃), 0.98(3H, d, J=6Hz, 21-H₃), β : 03(3H, s, 19-H₃), 3.38(3H, s, -OCH₃₎3.43(3H, s, -OCH₃), 3.68(3H, s, -CO₂, CH₃), 3.76(1H, m, 1β-H), 4.68(2H, s, 3β-O-CH₂-O-), 4.69(2H, ABq, J=7Hz, ΔAB=11Hz, 1α-O-CH₂-O), 5.27(2H, m, 22-H 및 23-H) 및 5.56(1H, m, 6-H).

(22E, 25ζ)-1α, 3β-디메톡시메틸옥시-25-하이드록시-26-호모콜레스타-5, 22-디엔-27-오산 메틸에스테르

디이소프로필아민(0.13ml, 0,929mmol), 1.56M n-부틸리튬(0.59ml) 및 THF(2ml)로 제조한 LDA 용액에 THF(5ml)중 에스테르

(437mg, 0.800m mol)를 가하고, 이 혼합물을 30분동안 질소하 -78℃에서 교반시킨다. 이 용액에 산소를 발포시킨 후, 트리에틸 포스파이트(0.14ml, 0.817mmol)를 가한다. 통상적인 끝처리(에스테로 추출)호 조 생성물을 수득하고, 이것을 실리카겔(25g) 컬럼에 넣는다. 헥산-에틸아세테이트(5 : 1)로 용출하여 하이드록시 에스테르

(303mg, 67%)을 오일로서 수득한다.

¹H-NMR δ : 0.68(3H, s, 18-H₃), 0,85(3H, t, J=7Hz, -CH₂

), 0.98(3H, d, J=6Hz, 21-H₃), 1.02(3H, s, 19-H₃), 3.08(1H, bs, W_1/2=3Hz, -OH₃₎3.38(3H, s, -OCH₃), 3.42(3H, s, -OCH₃), 3.76(3H, s, CO₂H₃), 4.68(2H, s, 3β-O-CH₂-O-), 4.68(2H, ABq, J=7Hz, ΔAB=11Hz, 1α-O-CH₂-O-), 5.32(2H, m, 22-H 및 23-H) 및 5.55(1H, m, 6-H).

(22E, 25ζ)-1α, 3β-디메톡시메틸옥시-25-하이드록시-26-호모콜레스타-5 22-디엔

THF(5ml)중 하이드록시에스테르

(294mg, 0.539mmol)의 수소화리튬알루미늄(20mg, 0.526mmol)을 가하고, 이 혼합물을 30분동안 실온에서 교반시킨다. 통상적인 끝처리(에테르로 추출)로 조 디올을 수득한다. 이것을 30분동안 실온에서 메탄-설포닐 클로라이드(0.04ml, 0.517mmol) 및 피리딘(1.5 ml)로 처리한다. 통상적인 끝처리(에테르로 추출)호 조 메실레이트를 수득한다. THF(5ml)로 조 메실레이트 용액에 수소화리튬 알루미늄(20mg, 0.526mm ol)을 가하고, 혼합물을 30분동안 환류시킨다. 통상적인 끝처리(에테르로 추출)로 조 생서물을 수득하고, 이것을 실리카게(20g) 컬럼에 넣고, 헥산-에틸 아세테이트(5 : 1)로 용출하여 알코올

(190mg, 70%)을 오일로서 수득한다.

¹H-NMR δ : 0.71(3H, s, 18-H₃), 0,90(3H, t, J=7Hz, -CH₂

), 1.03(3H, d, J=6Hz, 21-H₃), 1.03(3H, s, 19-H₃), 1.12(3H, s, 27-H₃₎3.36(3H, s, -OCH₃), 3.40(3H, s, -OCH₃), 3.74(1H, m, 1β-H), 4.66(2H, s, 3β-O-CH₂-O-), 4.67(2H, ABq, J=7Hz, ΔAB=11Hz, 1α-O-CH₂-O-), 5.35(2H, m, 22-H 및 23-H) 및 5.54(1H, m, 6-H).

(22E, 25ζ)-1α,3β, 25-트리하이드록시-26-호모콜레스타-5, 22-디엔

THF(5ml)중 디메톡시메틸에스테르

(181mg, 0.349mmol)의 용액을 1.5시간동안 50℃에서 6N HC1(1ml)로 처리한다. 통상적인 끝처리(에틸 아세테이트로 추출)로 조 생성물을 수득하고, 이것을 실리카겔(15g) 컬럼에 넣는다. 헥산-에틸 아세테이트(1 : 2)로 용출하여 트리올

(147mg, 98%)을 수득한다.(헤산-디클로로메탄).

¹H-NMR δ : 0.69(3H, s, 18-H₃), 0,89(3H, t, J=7Hz, -CH₂

), 1.02(3H, s, 27-H₃), 3.85(1H, m, 1β-H), 3.98(1H, m, 3α-H) 5.40(2H, m, 22-H 및 23-H) 및 5.60(1H, m, 6-H).

(22E, 25ζ)-1α, 3β-디아세톡시-25-하이드록시-26-호모콜레스타-5, 22-디엔

피리딘(1ml)중 트리올

(100mg, 0.233mmol)의 용액을 15시간동안 실온에서 아세트산 무수물(1ml)로 처리한다. 통상적인 끝처리(에틸 아세테이트로 추출)로 조 생성물을 수득하고, 이것을 실리카겔(10g)의 컬럼에 넣는다. 헥산-에틸 아세테이트(5 : 1)로 용출하여 디아세테이트

(101mg, 85%)을 무정형 고체로서 수득한다.

¹H-NMR δ : 0.68(3H, s, 18-H₃), 0.88(3H, t, J=7Hz, -CH₂

), 0.98(3H, d, J=6Hz, 21-H₃), 1.08(3H, s, 19-H₃), 1.12(3H, s, 27-H₃₎2.03(3H, s, 아세틸), 4.98(1H, m, 3α-H), 5.06(1H, m, 1β-H), 5.37(2H, m, 22-H 및 23-H) 및 5.53(1H, m, 6-H).

(22E, 25ζ)-1α, 3β,25-트리하이드록시-26-호모콜레스타-5, 7, 22-트리엔

사염화탄소(3ml)중 5, 22-디엔

(38mg, 0.0739mmol) 및 n-브로모석신이미드(19mg, 0.107mmol)의 용액을 20분동안 아르곤하에서 환류시킨다. 0℃로 냉각시킨 후, 생성된 침전물을 여과한다. 여과액을 40℃ 미만에서 농축시키면 잔사가 남는다. 이 잔사의 THF(ml) 용액을 50분동안 실온에서 촉매량의 테트라-n-부틸 암모늄 플루오라이드의 용액으로 처리한다. 통상적인 끝처리(에틸 아세테이트 추출)로 조 트리엔을 수득한다. THF(5ml)중 상기 트리엔을 실온에서 14시간동안 5% KOH-MeOH(4ml)로 처리한다. 통상적인 끝처리(에틸 아세테이트로 추출)로 조 생서물을 수득하고, 예비 박층 크로마토그라피[벤젠-에틸아세테이트(1 : 1) 6회 전개]한다. Rf값 0.45의 밴드를 벗기고, 에틸 아세테이트로 용출한다. 용매를 제거하여 5, 7, 22-트리엔

(8.7ml, 40%)을 수득한다.

(22E, 25ζ)-1α, 25-디하이드록시-22-데하이드로-26-호모비타민 D₃

벤젠(9ml) 및 에탄올(40ml) 중 트리엔

(4.4mg, 0.0103mmol)의 용액을 25분동안 0℃ 아르곤하에서 Vycor 여과기를 통해 중압수은등으로 조사시킨다. 반응혼합물을 1시간동안 아르곤하에서 환류신킨다. 감압하에서 용매를 제거하여 조 생성물을 수득하고, 예비 박층 크로마토그라피[벤젠-엘틸 아세테이트(1 : 1), 6회 전개]한다. Rf값 0.49의 밴드를 벗기고, 에틸 아세테이트로 용출한다. 용매를 제거하여 비타민 D₃동족체

(0.91mg, 21%)을 수득한다.

MS m/z : 428(M⁺), 410, 392, 374, 338, 320, 287, 269, 141, 134, 123, 73.

¹H-NMR(400MHz) δ : 0.56(3H, s, 18-H₃), 0.91(3H, t, J=7.6Hz, -CH₂

), 1.04(3H, d, J=6.8Hz, 21-H₃), 1.13(3H, s, 27-H₃), 4.23(1H, m, W_1/2=18.4Hz, 3α-H) 4.43(1H, m, W_1/2=16.9Hz, 1β-H), 5.00(1H, bs, W_1/2=3. 2Hz, 19-H), 5.32(1H, bs, W_1/2=3.2Hz, 19-H), 5.37(2H, m, 22-H 및 23-H), 6.02(1H, d, J=11.5Hz, 7-H) 및 6.38(1H, d, J=11.Hz, 6-H).

(25ζ)-1α, 3β-디아세톡시-25-하이드록시-26-호모콜레스트-6-엔

에틸 아세테이트(4ml)중 5, 22-디엔

(35mg, 0.068mmol) 및 10% Pd-C(4mg)의 혼합물을 3시간동안 실온 수소화에서 교반시킨다. Pd 촉매를 여과하고, 여과액을 농축시켜 잔사를 남기고, 예비 박층 크로마토그라피[헥산-에틸아세테이트(2 : 1), 1회 전개]한다. Rf값이 0.46인 밴드를 벗기고, 에틸 아세테이트로 용출하여 5-엔

(30mg, 85%)을 무정형 고체로서 수드한다.

¹H-NMR δ : 0.66(3H, s, 18-H₃), 0.88(3H, t, J=7Hz, -CH₂

), 1.08(3H, s, 19-H₃), 1.12(3H, s, 27-H₃), 2.02(3H, s, 아세틸), 4.97(1H, m, 3α-H), 5.04(1H, m, 1β-H), 5.51(1H, m, 6-H).

(25ζ)-1α, 25-디하이드록시-26-호모비타민 D₃

5-엔(22mg, 0.0426mmol)을 화합물(7)에 대해 기술된 바와같이 5, 7-디엔(10)(6.7mg 37%)으로 전환시킨다.

디엔

(4.8mg, 0.0112mmol)을 화합물

에 대해 기술된 바와같이 비타민 D₃동족체

(1.3mg, 27%)로 전환시킨다.

MS m/z : 430(M⁺), 412, 394, 379, 376, 287, 269, 251, 152, 134, 115, 73, 55.

필요할 경우, 본 발명의 화합물은 본 분야의 전문가들에게 명백한 적절한 용매(예를들면 헥산, 에테르, 알코올 또는 그의 혼합물)로 결정화하여 결정형태로 쉽게 수득할 수 있다.

[생물학적 활성]

1α, 25-(OH)₂-26-호모 D₃화합물의 뼈의 칼슘 이동 활성

숫컷 이유(weanling) fot틀를 홀쯔만 캄파니(Holtzman Co. 위스콘신주 매디슨)에서 구입하고, 수다 등(Suda et al, J. Nutrition 100 : 1049 : 1970)에 기술된 바와같이 3주동안 임의량의 저 칼슘, 비타민 D₃결핍 식이와 물을 먹인다. 그후 랫트를 각각 6마리씩 4그룹으로 나누고, 치사시키기 7시간전에 95% 에탄올(0.05ml)중 용해된 1α, 25-(OH)₂-26-호모 D₃, 1α, 25-(OH)₂-(22E)Δ²²-26-호모 D₃및 1α, 25-(OH)₂D₃각각 (650pmole)을 경정맥공내(intrajungularly)로 투여한다. 대조그룹 랫트는 치사시키기 7시간전에 95% 에탄올(0.05ml)를 투여한다. 그후 이들의 목을 잘라 죽이고, 혈액을 모으고 원심분리시켜 혈청을 얻는다. 혈청 칼슘 농도는 0.1% 염화란탄 존재하에 원자흡수분광계(Perkin-Elmer Model 214)로 측정한다. 결과를 다음 표에 나타낸다.

[표 1]

*) 평균으로부터 표준편차

b)는 a) P 0.001와 현저히 다르다.

비타민 D-결핍동물의 비타민 D 반응계에서, 본 발며의 화합물이 순환호르몬 형태의 비타민인 1α, 25-하이드록시 비타민 D₃와 동일한 활성을 나타낸다는 것을 상기 자료에서 결론지을 수 있다.

본 발명의 화합물은 그의 칼켐(calcemic) 활성 때문에 멸균 비경구용액으로 주사하거나, 정맥내 또는 소화관으로 경구투여하거나, 또는 좌제 또는 경피내로 쉽게 투여할 수 있다. 비타민 D-유사활성의 생리적 칼슘 균형 반응 특징을 얻기 위해서는 약 0.1 내지 약 2.5㎍의 용량이 효과적이며, 약 0.1 내지 0.5㎍이 적절하다.

1α, 25-디하이드록시 비타민 D₃(1α, 25-(OH)₂D₃) 및 그의 구조적 동족체인 1α-하이드록시 비타민 D₃(1α-OH-D₃)가, 그의 우수한 상기 칼켐활성이외에, 또한 강력한 항암활성을 나타낸다는 것이 최근 밝혀졌다. 구체적으로는, 상기 화합물이 인간의 악성세포(예를들면 배양액증 백혈병 세포)를 비악성 대식세포로 분화시키는데 유효하며, 이러한 화합물을 투여하면 백혈병에 걸린 마우스(대조그룹을 비교하여)의 수명이 연장되고 백혈병환자의 증상이 현저하게 개선되는 것을 나타냄으로써, 시험관내 세포에 대한 항암 활성과 생체내에서의 유리한 효과를 관련지을 수 있다는 것이 나타났다. 이러한 관찰에 의거하여, 1α-하이드록실화 비타민 D화합물은 유백혈병성 질병치료의 치료제로서 제안되었다(참조 : Suda 등, 미합중국 특허 제 4,391,802호).

수다 등이 시험관 이러한 공지된 1α-하이드록시 비타민 D 화합물, 즉 1α-하이드록시 비타민 D₃(1α-OH-D₃) 및 1α,25-디하드록시 비타민 D₃(1α-OH-D₃)는 백혈병 세포의 분화를 일으키는데 참으로 매우 효과적이지만, 이들을 백혈병 치료제로 사용할 경우, 심각한 단정은 이들 물질의 고유한, 피할수 없은 고 칼켐 활성이다. 즉, 널리 알려져 있는 가장 강력한 비타민-유도 백혈병 치료제인 1α, 25-(OH)₂D₃)는 또한 가장 강력한 칼켐제이며, 1α-OH-D₃의 백혈병 치로 효능은 마찬가지로 고 칼켐 활성과 관련되어 있다. 백혈병 치료제로서 유효한 투여농도(예를들면 수다 등 특허의 실시예에 명시된 바와같이 1㎍/일)로 이러한 화합물을 투여할 경우, 반드시 심각한 약제 합병증(특히 이미 쇠약증에 걸린 환자에게서)을 수반하는 상승된, 잠재적으로 과도한, 칼슘 농도를 초래하게 된다. 칼슘 농도를 상승시키는 공지된 1α-하이드록시 비타민 D 화합물의 높은 고유효능에 때문에, 이들은 백혈병 치료제로서 사용할 수 없을 것이다.

만성 질병 상태의 바람직한 치료방법은 명백하게, 혈청 칼슘농도를 상승시키는 그의 효능에 비교하여, 백혈병 세포의 분화를 일으키는 효능이 증진된 화합물의 칼켐 활성에 대해 높은 백혈병 치료활성을 특징으로 하는 화합물을 투여하는 것이다.

본 발명의 화합물은 또한 악성세포를 비악성 세포로 분화시키는데(즉, 백혈병 세포분화롤 측정한 종양치료활성) 선택적 활성인데 칼슘대사에 대한 그의 효과는1α-디하이드록시 비타민 D₃보다 더 활성적인 것은 아니다. 이 독특한 뜻밖의 결합된 특성 때문에, 본 발명의 신규한 측쇄 호모비타민 D 화합물은 백혈병 및 다른 종양중에 우수하고 바람직한 약제이다.

재야액중에서 성장시킨 인간의 전골수구성 백혈병세포(HL-60세포)에 투여할 경우, 본 발명의 측쇄 호모비타민 D 화합물은 이러한 세포를 대식세포(단핵세포)로 분화시킨다. 분화 활성을 측정하기 위한 여러 표준분석에서, 이러한 화합물은 널리 공지된 가장 활성인 비타민 D 유도체인 1α, 25-(OH)₂D₃보다 더 유효한 것으로 나타난다. 이러한 분석은 다으뫄같이 수행한다.

호모비타민 D 화합물의 분화활성분석

인간의 전골수구성 백혈병 세포라인(line) (HL-60)을 10용적%의 가열 비활성화시킨 송아지태아 혈청, 페니실린(100㎍/ml), 스트렙토마이신(100㎍/ml) 및 푼지존(fungizone) (0.25㎍/ml)을 보충시킨 RPMI 1640 배지(Gibco, Grand Island, NY)중 현탁 배양액에 보유한다. 세포를 5% CO₂의 습한대기 중에서 배양한다. 세포 생육성을 표준 분석법[예를들면 트리판 청 제한법(try pan blue exclusion)]으로 분석한다. 형태 측정을 라이트 착색 슬라이드 표본(Wright stained slide preparation)상으로 수행한다.

세포를 조직 배양접시의 매질(10ml)중 1.5 내지 2x10⁵세포/ml로 파종한다. 시험 화합물을 100% 에탄올중 용액으로 가하며, 각각의 배양접시중 총 에탄올 농도가 0.2%를 넘지 않도록 한다. 대조 배양액은 같은 농도의 에탄올로 처리한다. 시험 화합물로 배양한지 4일(96시간)후, 세포를 이들 배양접시로부터 거두어, 세포수와 생육성을 측정한다. 시험 비타민 D 유도체로 유도된 분화도는 단핵세포의 푼코날(funchonal) 및 효서 표식자 특성을 나타내는 세포%로 표기한다. 분석된 두 표식자는 a) 죽은 효모를 식작용시키는 세포의 능력 및 b) 파볼(pharbol) 에스테르로 자극시킬 시, 과산화물을 생성하는(니트로테트라잘륨 불루를 환원) 세포의 능력이다.

a) 분화활성에 대한 식작용분석

거둔 세로를 20% AB 혈청 및 20% 송아지 태아 혈청 함유 RPMI 배지에 재현탁시켜, 2x10⁶세포/ml 함유 제제를 수득한다. 그후, 상기 세포현탁액[0.5ml(10⁶세포)]에 트리판 청으로 착색시킨 열사 사카로마이세스 케레비시애 세포(Saccharomyces cerevisiae, 1x0⁸세포)의 현탁액(0.5ml, 포스페이트-완충 염수중)을 가한다. 이 혼합물을 1시간동안 37℃에서 배양시킨후, 식세포수(세포내적으로 나타나는 트리판 청 착색 효모로 측정한)를 세고, 존재하는 총 생육 세포%로 표시한다. 이 "식세포 %"는 시험 화합물로 유도된 분화%를 나타낸다. 결과를 다음 표 2에 요약한다.

[표 2]

여러 농도의 비타민 D 화합물로 처리한 HL-60

세포 배양액중에서 생성된 식세포(분화된 %)

a : 대조그룹농도 : 세포배양액을 용매인 에탄올로만 처리한다.

b : 이 컬럼에 표시된 결과는 각각 2회 실시한, 다른 3 실험의 평균 ±SEM을 나타낸다.

*1α, 25-디하이드록시-26-호모비타민 D₃

**1α, 25-디하이드록시-22E-데하이드로-26-호모비타민 D₃

표 2 의 결과는 이 호모화합물이 1α, 25-(OH)₂D₃보다 백혈병 세포의 분화도가 더 크다. 예를들면, 10^-8농도에서, 호모 화합물은 분화도가 70℃인 반면, 동일한 온도에서 1α, 25-(OH)₂D₃는 분화도가 단지 약 47%이다. 분화도가 50%가 되려면, 호모 화합물의 농도는 1X10^-9M이 필요하지만, 1α, 25-(OH)₂D₃는 약1X10^-8M(즉, 효능이 차이가 약 10배)이 필요하다.

b) 분화활성에 대한 NBT-환원분석

이 분석은, 파볼 에스테르로 자극시킬시, 니트로블루테트라졸륨(NBT) 시약을 청-검정색 침전물(포르마잔)로 환원시키는 단핵세포-유사 백혈병 세포의 능력에 의거한다. 이 분석은 엔(Yen)등 [참조 : J.cellular Physiol.

277(1984)]의 총괄 방법으로 수행한다. 이 세포를 상기와 같이 거둔후, RPMI 배지에 현탁시키고 ; 이 현탁액(약1.4x10⁶세포/ml 함유) 0.2ml에 니트로블루 테트라졸륨(NBT) 시약을 가한다. [NBT 시약은 포스테이트-완충 염수 50ml중 니티로블루 테트라졸륨 50mg을 함유하는 용액을 4β-포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(0.5mg/ml)함유 아세톤/물(1 : 1)용액(10㎕)와 혼합시켜 제조한다]. 수조중에 30분동안 정치시킨 후, 분화된 세포(즉, NBT 환원의 포르마잔 청 침사를 나타내는 세포)를 혈구계로 세고, 존재하는 총 생육포 %로 표시한다. 이 분석의 결과를 다음 표 3에 나타낸다.

[표 3]

여러 농도의 비타민 D 화합물로 처리한 후, 니트로블루테트라졸륨(NBT)

환원활성을 나타내는 HL-60 세포 배양액중 세포 %

b : 이 컬럼에 표시된 결과는 각각 2회 실시한, 다른 3실험의 평균 ±SEM을 나타낸다.

*1α, 25-디하이드록시-26-호모비타민 D₃

**1α, 25-디하이드록시-22E-데하이드로-26-호모비타민 D₃

표 3의 결과는 또한 시럼관내에서 인간의 골수성 백혈구 세포를 정상세포로 분화시키는데 있어서, 시험한 호모 화합물이 1α, 25-(OH)₂D₃보다 더 활성임을 나타낸다. 이 NBT 환원 분석으로 측정하여 백혈병 세포를 60% 분화시키려면, 호모화합물의 농도는 2X10^-9M이 필요하지만, 동일한 분화도가 되려면, 1α, 25-(OH)₂D₃는 3.5X10^-8M(즉, 효능의 차이가 17배)이 필요하다.

즉, 상기 두 분석은 백혈병 세포의 분화를 일으키는 호모비타민 D 화합물의 강력한 효능을 확인하였다. 이외에, 상기 결과는, 이 분화활성에서, 이러한 D 화합물은 1α, 25-(OH)₂D₃보다 현저하게 더 강력함을 나타낸다.

이 분화활성은 인간의 백혈병 세포(HL-60) 경우로 표시되기 때문에, 인간의 백혈병 치료에 이 신규한 호모비타민 D 화합물을 효과적으로 사용할 수 있는 것이 명백하다. 동시에, 이화합물은 칼켐 활성을 증진 시키지 않지만, 약 1α, 25-(OH)₂D₃만큼 활성이다. 이 신규하고 바람직한 생물학적 특성에 의하여, 이러한 측쇄 호모화합물은 악성질병의 치료에 우수한 치료제로서 작용할 것이다.

인간의 백혈병을 치료할 경우, 본 발명의 호모비타민 D 화합물을 백혈병세포를 대식세포로 분화시키기에 충분한 용량으로 환자에게 투여한다. 적절한 용량은 1일 0.2 내지 5㎍인데, 본 분야에 공지된 바와같이 질병의 중증도 또는, 환자의 반응 또는 증세에 따라 용량을 조절할 수 있다.

치료할 경우, 화합물의 용량형태는 본 분야에 공지된 비독성 약제학적으로 허용되는 담체와 이들을 결합시켜 제조할 수 있다. 이러한 담체는 고형 또는 액형(예를들어, 옥수수전분, 락토오즈, 수크로즈, 낙화시유, 올리브유, 참깨유 및 물)일 수 있다. 고형 담체를 사용할 경우, 본 발명의 화합물은 정제 캡슐제, 신제, 트로치 또는 로젠지일 수 있다. 용량 형태는 또한 보조제(예를들면 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 윤활제, 용액 촉진제)를 함유할 수도 있다. 이들은 또한 다른 요법적으로 중요한 물질을 함유할 수도 있다.

환자에게 투여하는 특정용량의 용량범위는 처리할 특정한 질병상태에 의거하지만, 최종결과는 특정한 경우, 환자의 물리적 크기 및 이러한 약제의 용법적 용도에서 본 분야의 전문가들에게 공지된 다른 요소에 의거해야 한다는 것을 인지햐야 한다.

이 화합물은 주사로, 또는 적절한 멸균 액제로 정맥내 주입하여, 또는 식도관을 통해 경구 형태로 투여하는 것이 바람직하다.

Claims

다음 일반식의 화합물.

상기식에서, R₁, R₂및 R₃는 수소, 탄소수 1 내지 약 4의 아실 및 벤종일로 이루어진 그룹중에서 선택하고 ; R₄및 R₅는 수소이거나, 함께 탄소-탄소 이중결합을 형성한다.
제 1 항에 있어서, R₁, R₂및 R₃는 수소이고, R₄및 R₅는 수소인 화합물.
제 2 항에 있어서, 결정형태인 화합물.
제 2 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 형태의 화합물.
제 1 항에 있어서, R₁, R₂및 R₃는 수소이고, R₄및 R₅가 함께 탄소-탄소 이중결합을 형성하는 화합물.
제 5 항에 있어서, 결정형태인 화합물.
제 4 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 형태의 화합물.
제 4 항에 있어서, Δ²²결합이 E배위인 화합물.
다음 일반식의 화합물.

상기식에서, R은 수소, 탄소수 1 내지 약 4의 아실, 벤조일 및 메톡시메틸로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
다음 일반식의 화합물.

상기식에서, R₁, R₂및 R₃는 수소, 탄소수 1 내지 약 4의 아실 및 벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택하고 ; R₄및 R₅는 탄소-탄소 이중결합을 형성하는 화합물.
하기 일반식을 갖는 적어도 하나의 1α-하이드록시 비타민 D 유도체와 약제학적으로 허용되는 비-독성 담체를 함유함을 특징으로 하는, 악성 세포 분화를 유발 증진시키는 약제.

상기식에서, R₁, R₂및 R₃는 수소, 탄소수 1 내지 약 4의 아실 및 벤조일로 이루어진 그룹중에서 선택하고 ; R₄및 R₅는 각기 수소이거나, 함께탄소-탄소 이중결합을 형성하는 화합물.
칼켐 활성에 대한 종양 치료활성비가 높은, 하기 일반식의 화합물과 약제학적으로 허용되는 담체를 함유함을 특징으로 하는, 종양성 질환 치료용 약제.

상기식에서, R₁, R₂및 R₃는 수소, 탄소수 1 내지 약 4의 아실 및 벤조일중에서 선택되고 ; R₄및 R₅는 각기 수소이거나, 함께탄소-탄소 이중결합을 형성한다.