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KR900004420B1 - 인터류킨-1에 대한 항체 - Google Patents

인터류킨-1에 대한 항체 Download PDF

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KR900004420B1
KR900004420B1 KR1019870012791A KR870012791A KR900004420B1 KR 900004420 B1 KR900004420 B1 KR 900004420B1 KR 1019870012791 A KR1019870012791 A KR 1019870012791A KR 870012791 A KR870012791 A KR 870012791A KR 900004420 B1 KR900004420 B1 KR 900004420B1
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KR
South Korea
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antibody
human
human interleukin
monoclonal antibody
antibodies
Prior art date
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KR1019870012791A
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KR880006357A (ko
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야스카즈 오오모또
켄지 나까무리
히사카즈 아오끼
요시카쯔 히라이
Original Assignee
오스카 세이야꾸 가부시기가이샤
오스카 아끼히꼬
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Publication date
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Publication of KR880006357A publication Critical patent/KR880006357A/ko
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Abstract

내용 없음.

Description

인터류킨-I에 대한 항체
본 발명은 인터류킨-1(Interleukin-1,IL-1)에 대한 항체에 관한 것이며, 더욱 상세히는 인간의 IL-1을 면역학적으로 정제, 정량할 수 있는 인간의 IL-1에 대한 신규의 항체에 관한 것이다.
인간의 IL-1은 대식단구세포 및 많은 다른 세포들로부터 생산되며, 다양한 분자형태 및 생물학적 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
현재 알려져 있는 인간의 IL-1으로서는 등전점이 서로 다른 IL-1α와 IL-1β가 있으며, 이를 IL-1의 일차구조가 규명되어져 있다.(내이쳐(Nature),135, P641(1985) : 저널 오브 익스피리멘탈 메쏘드(J.Exp.Med), 164, P237(1986) 등)의약품으로서 IL-1을 사용하기 위한 광범위한 연구가 수행되어져 왔으며, 특히 각종의 면역결핍에 기인한 질병들 및 비정상적인 면역반응에 대한 연구와 이들질병 및 이상에 대한 임상진단용 시료내의 IL-1의 정량에 대하여 주의가 집중되어 왔다.
현재,IL-1을 측정하는 기술로서 면역검정법이 알려져 있으며, 이 방법은 시료의 생물학적 활성을 측정하여 IL-1을 정량하는 방법이다. 그러나 이 방법은 절차가 복잡하고, 측정을. 방해하는 및가지 성분들을 항상 고려해야 할 필요성이 있다.
더우기 이방법은 IL-1α와 IL-1β가 똑같은 활성을 나타내므로 서로를 구별하여 정량할 수 없는 심각한 결점이 있다.
본 발명의 목적은 인간의 IL-lα와 IL-1β에 대한 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 각기 개별적으로 인간의 IL-1α와 IL-1β를 면역학적으로 정량하는 신규의 방법에 사용할 수 있는 인간의 IL-1에 대한 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비정상적으로 다량의 IL-1을 생산하는 각종 질병들을 치료하는데 유용하며,IL-1의 생물학적 활성을 억제하거나 중화시킬 수 있는 인간의 IL-1에 대한 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이러한 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 이러한 목적과 다른 특징들은 다음의 상세한 설명을 통하여 명백하여질 것이다.
본 발명은 인간의 IL-1α 또는 인간의 IL-1β와 특이적인 반응성을 갖고 있는 항체로서 특징지워지는 인간의 IL-1에 대한 모노클로날 항체(monoclonal anotibody) 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 높은 정확도 및 감도로 인간의 IL-1α와 인간의 IL-1β를개별적으로 서로 구별하여 용이하게 정량할 수 있는 신규의 면역검정법을 제공하는 것이다.
본 발명의 항체는 인간의 IL-1α와 인간의 IL-1β에 대하여 특이적으로, 본 발명의 항체의 사용은 친화크로마토그래피 등과 같은 IL-l을 정제하는 특수한 방법을 제공하게 된다.
더우기 본 발명의 항체는 만성적 변형관절염, 갑상선염, 간염, 신장염 등과같은 만성적염증성 질병들과동맥경화증, 가와사끼병등과 같은 맥관염, 전파성 맥관내 응고증후군(DIC), 혈액암등의 IL-1을 비정상적으로 다량 생산하는 각종 질병들을 치료하는데 유용하고, 인간의 IL-1의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 유형을 포함하고 있다.
이 항체는 상기의 질병들에 의하여 생산된 인간의 IL-1의 촉진된 활성을 억제시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 항체는 이들 질병의 치료와 예방에 유용한 의약품으로 제공될 수 있다.
본 발명의 항체는 면역항원으로서 인간의 IL-1α 또는 인간의 IL-1β를 사용하여 제조될 수 있다.
더욱 상세히는 본 발명의 항체는 예를들면 항원으로 포유동물을 면역시키고, 포유동물의 형질구(면역된세포)와 포유동물의 형질세포 종세포를 융합시켜 하이브리도마(hybridoma) 세포를 얻은 다음, 세포를 클로닝(cloning)시키고, 인간의 IL-1α 또는 IL-1β를 인식하는 원하는 항체를 생산하는 클론을 선발한 후,이 클론을 배양하여 제조할 수 있다. 상기의 절차에서 면역항원으로서 사용되는 인간의 IL-1α 또는 인간의 IL-1β에는 특별한 제한은 없다.
예를들면, 이러한 목적을 위해서는 비트로법(Vitro법 : 체외법)으로 유도된 인간의 IL-1α 내지 인간의 IL-1β를 함유하는 배양상등액 또는 정제된 표준생산물과 유전공학 기술로 제조된 IL-1α 또는 인간의IL-1β, 그리고 인간의 IL-1과 같은 아미노산 서열로 구성된 부분을 갖는 합성폴리펩타이드등이 유용하게사용될 수 있다.
항원으로 면역시키는 포유동물의 종류에는 특별한 제한은 없다. 그러나 사용되는 형질세포종세포와 포유동물의 세포간의 융합에 대한 순응성(amenability)을 고려하여 적절한 동물을 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로 쥐와 토끼가 유용하게 사용될 수 있다.
이러한 포유동물들은 통상적인 방법에 따라 면역되어, 예를들면 정맥내, 피하내, 복강내로 항원을 투여하게 되며, 더욱 상세히는 2-14일마다 수차례에 걸쳐 항원을 투여하여 총투여량이 약 100-500μg/동물이 되도록 한다. 통상적인 보조제도 필요에 따라 투여될 수 있다.
면역 항원의 최종투여 후 3일째에 비장세포를 제거하여 면역된 세포로 사용하는 것이 바람직하다.
면역된 세포들과 융합시키는 다른 숙주세포로서의 포유동물의 형질세포종세포로서는, P3(P3/×63-Ag8)[내이쳐,256,495-497(1975) ], P3-U1[커렌트토픽스 인 마이크로바이올리지 앤드 임뮤놀러지, 81,1-7(1978)], NS-1[유러피안 저널 오브 임뮤놀러지,6,511-519(1976)], SP 2/0〔내이쳐,276,269-270(1978)], FO[저널 오브 임뮤놀러지칼 메쓰드스,35,1-2l(1980)], X63,6, 53,[저널 오브 임뮤놀러지, 123 ,1548-1550(1979)], S194[저널 오브 익스피라멘탈 메쏘드스,148,313-323(1978)], 쥐의 R210[내이쳐,277,131-133(1979)] 등과 같은 골수종 세포들을 포함하여 각종의 쌜라인(Cell line)들이 알려져 있다.
면역된 세포들과 형질세포종 세포사이의 융합은 밀스테인등(Milstenin)의 방법(메쏘드인 엔자이몰러지,73권, P3(1981))과 같은 기본적으로 공지인 방법들에 의하여 공지인 방법들에 의하여 수행된다.
더욱 상세히는 융합 반응은 일본의 혈구응집성 바이러스(HVJ) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 통상적인 융합촉진제가 존재하는 통상적인 영양배지중에서 수행될 수 있다.
향상된 융합효율을 얻기 위하여 원한다면, 다이메틸 술폭사이드 등과 같은 보조제를 배지에 가할 수도있다.
면역된 세포들과 형질세포종 세포들은 통상적인 비율로 사용된다.
예를들면, 면역된 세포를은 형질세포종 세포들에 대하여 1-10배의 양으로 사용된다.
융합시키기 위하여 유용하게 사용되는 배지의 예로서는 형질세포종 세포들을 증식시키는데 통상적으로 사용되는 RPMI-1640 배지와 MEM 배지가 있으며, 또한 이러한 유형의 세포들을 배양시키는데 사용되는 각종의 다른 배지들도 사용될 수 있다.
일반적으로 태아송아지 혈청(FCS)과 같은 혈청보충제를 가한 배지를 사용하는 것이 바람직하며, 이 성분은 후에 제거되게 된다.
융합을 일으키게 하기 위하여 미리 정량된 양의 면역된 세포들과 형질세포종 세포들을 배지중에서 철저히 교반한 후, 배지에 대하여 약 30-60W/V%의 농도로 미리 37℃로 조절한 분자량이 약 1000二6000인 PEG용액을 가한다. ·
이어서, 적당한 배저를 배양물에 수시로 가하고, 원심분리하여 매회상등액을 제거한다.이러한 절차의 반복으로 원하는 하이브리도마를 얻는다.
이렇게 얻어진 원하는 하이브리도마를 HAT배지(하이포싼씬, 아머노프레린, 티미딘함유)와 같은 통상적인 선별배지 중에서 배양하여 분리한다. HAT 배지중에서 통상적으로 수일에서 수주일의 소정기간동안 배양하여 원하는 하이브리도마 세포이외의 세포(예를들면, 융합되지 않은 세포들)를 소멸시킨다.
이렇게하여 얻어진 하이브리도마 새포를 통상적인 제한 희석법으로 처리하여 원하는 항체를 생산하는 클론을 회수하고, 이렇게하여 모노클로날 항체를 생산하게 된다.
이 항체를 생산하는 클론은 HLISA법(엥발 Engval1, E.) 메쏘드인 엔자몰러지,70,419-439(1980)),플래크법 (plague method), 스포트법(spot method), 응집반응법, 오크터로니법 (Ohchterlony method) 방사능표식면역검정법(RIA) ˝하이브리도마 메쏘드 앤드 모노클로날 앤터바디스", 리서취 앤드 디벨로프먼트사 발행, P30-53,1982,3,5)등과 같은 항체를 검출하는데 통상적으로 사용되는 각종의 방법들을 사용하여 검출한다.
이렇게하여 얻어진, 인간의 IL-1α 또는 인간의 IL-1를 인식하는 원하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상적인 배지중에서 2차 배양시킬 수도 있으며, 액체 질소를 사용하여 생존기간을 상당히 연장시킬 수도 있다.
원하는 본 발명의 항체는, 통상적인 방법으로 하이브리도마를 배양한 상등액 또는 하이브리도마를 증식시키는데 유리한 동물에 이 하이브리도마를 투여하여 이 포유동물의 복수로부터 모아지게 된다.
전자의 방법은 고도로 정제된 항체를 제조하는데 적합하며, 후자의 방법은 항체의 다량생산에 적합하다. 원한다면, 본 발명의 항체를 염석, 젤여과, 친화크로마토그라피등의 통상적인 방법을 사용하여 용이하게 정제할 수도 있다.
이렇게하여 얻어진 본 발명의 모노클보날 항체는 인간의 IL-1α 또는 인간의 IL-1β에 대하여 특이적인 반응성을 갖고 있다.
본 발명의 항체물은 인간의 IL-1의 생물학적 활성을 중화시키는 작용을 하는 유형의 것들도 포함하고있다.
이러한 항체들은 생물학적 활성을 갖는 인간의 IL-1을 특이적으로 정량하는데 적합하다.
이러한 항체들 특히 IL-l 분자의 IL-1 수용체 결함 부위를 인식할 수 있는 항체물은 IL-1을 비정상적으로 다량생산하는 각종 질병들의 치료에 효과적이다. ·
이를 항체들은 예를들면, 샌드위치법과 같은 면역검정법에 있어서 대단히 유용하다.
또한 본 발명의 항체들은 액체상 또는 고체상계에서 특히 높은 반응성을, 갖는 유형의 것물을 포함하고 있다.
이들 항체를은 액체상 또는 면역검정법에서 대단히 유용하게 사용될 수 있다.본 발명의 항체물 중에서도, 바람직한 예를들면 다음과 같다.
1) 인간의 IL-1β의 아미노산 번호 121-140의 서열에 대한 인식부위를 갖고 있는 항체.
2) 인간의 IL-1β의 아이노산 번호 24-82의 서열에 대한 인식부위를 갖고 있는 항체.
3) 인간의 IL-1β의 아미노산 번호 83-102의 서열에 대한 인식부위를 갖고 있는 항체.
4) 인간의 IL-1β의 아미노산 번호 145-143의 서열에 대한 인식부위를 갖고 있는 항체.
본 발명은 인간의 IL-1α 또는 인간의 IL-1β에 대하여 특이적인 모노클로날 항체를 제공한다.
이 항체의 사용은, 예를들면 면역검정법을 사용하여 임상시료내에 저농도로 함유되어 있는 인간의 IL-1α 또는 인간의 IL－1β를 높은 감도와 특이성을 가지고 정확하게 정량할 수 있는 방법을 제공한다.
지금부터, 다음의 실시예를 사용하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이것은 결코 본 발명을 제한하려는 것은 아니라는 점을 강조한다.
[실시예 1]
인간의 IL-1β에 대한 항체의 제조
유전자 재조합 기술(바이오케미스트리,58, NO.8, P840(1986) : EPO NO.187991)로 얻은 인간의IL-1β(10μg)를 완전 프레운드 보조제(complete Freund's adjuvant)를 사용하여 BALB/C계 쥐의 복막내로 투여한다.
동물을 면역시키기 위하여 불완전 보조제와 함께 인터류킨을 3-4주마다 2차례 같은 양으로 투여한다.
그로부터 3-4주후에 생리식염수내에 인간의 IL-lβ가 30μg 함유되어 있는 용액을 동물의 정맥내로 투여하여 최종적으로 면역시킨다.
그로부터 3-4일후에 면역된 동물로부터 모은 비장세포물과 골수종 세포들(P3U1, 커렌트 트픽스 인 마이크로바이을러지 앤드 임뮤놀러지,81,1-7(l978))을 10 : 1의 비로 사용하고, 물리에틸렌글리콜(PEG4000)을 첨가하여 통상적인 방법(예를들면, 메쏘드 인 엔자이물러지,73, P3(1981)참조)에 따라 세포융합을 시킨다.
원하는 하이브리도마 세포물을 HAT 배지로부터 선발한다.
상등액을 인간의 IL-1β와 퍼록시다제로 표시한 염소의 항-쥐 글루불린(E·Y·Lab 제품)으로 도포한 96-웰의 마이크로클레이트를 사용한 효소면역검정법으로 시험하여 인간의 IL－1β에 대한 원하는 항체물을 생산하는 세포들을 검출한다.
이 세포물을 제한 회석법을 사용하여 반복적으로 클로닝시켜서 원하는 항체를 생산하는 7개의 클론을 얻는다.
각각의 클론으로부터 얻은 항체의 특성을 다음의 방법으로 측정하였다.
(1) 항체의 아강(Subclass)
쥐의 항체 아강 검출키트(바이오－래드사 제품)를 사용하여 측정하였다.
(2) 항체 생산수준
세포농도가 최고조에 도달하였을 매의 하이브리도마의 배양상등액 내의 양을 IgG(μg/ml)로 표시하였다.
(3) 효능다음의 절차에 따라 측정하었다.
RIA : 요오도겐법(Iodogen method : B.B.R.C.,80,849-857(1978))에 따라 100μ1(약 10000cpm)의 125I로 표시한 인간의 IL-1β,100μ1의 하이브리도마 배양상등액의 희석액과 0.01% NaN3,5mMEDTA 및 0.1% BSA를 함유하는 PBS 100μ1을 함께 혼합한 다음, 4℃에서 반응시켰다.
이 반응 혼합물에 담체단백질로서 정상적인 염소의 혈청 50μl과 20% PEG의 PBS용액 600μl을 가하고, 혼합물을 교반한 후, 얼음 배쓰에 20분동안 방치한 다음 원심분리시킨다.
침전물의 방사능을 감마계수기를 사용하여 측정한다.
침전물의 15％가125I로 포시된 IL-1β인 배양 상등액의 회석비를 RIA 효능으로 정하였다.
EIA : 20μg/ml의 농도로 조절된 인간의 IL-1β를 96-웰 마이크로플레이트(100μl/웰)의 웰속에 넣은 다음, 실온에서 1시간동안 방치하였다. 플레이트를 PBS로 씻어내고 비톡이적인 흡착을 차단시키기 위하여 플레이트에 BSA를 투여한 다음, PBS-트윈 20으로 씻어낸다. 하이브리도마 배양 상등액의 희석액을 웰(100μl/웰)속에 넣고,37℃에서 2시간동안 반응시킨후, 씻어낸다.
퍼톡시다제로 표시된 항-쥐 면역글로불린(Cappel Labs사 제품×5000)을 100μ1/웰의 양으로 각 웰속에 넣은 다음 상기와 같은 조건하에서 반응시킨다. 플레이트를 씻어낸 후, 플레이트상의 효소활성을 비색분석법으로 측정한다.
OD492=1.0인 배양 상등액의 희석비를 EIA효능으로 정하였다.
RIA/IgG와 EIA/IgG： 이것은 RIA효능과 EIA효능을 항체 생산수준으로 나누어 얻은 값이다. RIA/IgG는 액체상계 내에서 본 발명의 항체의 반응성(125I로 표시한 인간의 IL-1β에 대한)을 나타내고, EIA/IgG는 고체상계내에서 본 발명의 항체의 반응성(고체상의 형태로 구성된 인간의 IL-1β에 대한)을 나타낸다.
(4) 분자량
하이드리도마를 쥐의 복막내에서 배양하고,IgG 정제 키트(MOPS키트, 바이오-래드사 제품)를 사용하여 복수로부터 정제하여 모은 IgG1 분액의 분자량(SDS-PAGE로 측정한 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 분자량의 합)을 측정하였다.
(5) 교차(Cross)반응성 ·
유전공학기술로 제조한 인간의 재조합 단백질을 사용한 웨스턴 블로팅(Western blotting)(Rroc, Natl,Acad, Sci., U.S.A.,76,4350(1979) : Anal.Biochem.,l12,195(198l))으로 측정하였다.
부호 " "는 교차 반응성이 존재하지 않음을 나타낸다.
(6) 결합 상수(kd)
스카차드 불롯(Scatchard blot) 분석법으로 측정하였다.
(7) 중화활성
LAF활성(저널 오브 임뮤놀러지, 116,1466(1976))으로부터 측정하였다. 부호 "+"는 중화활성이 존재함을 나타낸다.
표 1은 상기와 같이하여 측정한 특성들을 나타낸다.
Figure kpo00001
[표 1](계속)
Figure kpo00002
(8) 결합부위의 측정
인간의 IL-1β의 다음과 같은 절편들을 EPO NO.187991에서 기술된 인간의 IL-1β를 제조하는 방법으로 제조하였다.
절편
N-10 : 아미노산 번호 11-153으로 구성된 인간의 IL-1β의 폴리펩타이드.
N-16 : 아미노산 번호 17-153으로 구성된 인간의 IL-1β의 폴리펩타이드.
N-23 : 아미노산 번호 24-153으로 구성된 인간의 IL-1β의 폴리펩타이드.
C-82 : 아미노산 번호 1-82으로 구성된 인간의 IL-1β의 폴리펩타이드.
C-102 : 아미노산 번호 1-102으로 구성된 인간의 IL-1β의 폴리펩타이드.
C-120 : 아미노산 번호 1-120으로 구성된 인간의 IL-1β의 폴리펩타이드.
C-140 : 아미노산 번호 1-140으로 구성된 인간의 IL-1β의 폴러펩타이드.
C-144 ： 아미노산 번호 1-144으로 구성된 인간의 IL-1β의 폴리펩타이드.
C-148 : 아미노산 번호 1-148으로 구성된 인간의 IL-1β의 폴리펩다이드.
인간의 IL-β를 발현하는 대장균 또는 각각의 절편들에 100μl의 6.25mM 트리스 완충용액(PH6.8,2% SDS,5% 2ME,10% 글리세롤,0.001% BPB를 함유)을 가하여 용액으로 만든 다음, 100℃로 2분간 끊여서 전기영동용의 시료를 얻는다. 이렇게 제조한 시료들을 블롯팅으로 본 발명의 항체들에 대한 반응성을 시험하였다.
표2는 그 결과를 나타낸다.
[표 2]
Figure kpo00003
표2는 다음과 같은 사실을 나타내고 있다.
항체 ANOC 201,206,207은 인간의 IL-1β의 아미노산 번호 121-140의 서열에 대한 인식부위를 갖고있으며, 항체 ANOC 202와 204는 아미노산 번호 24-82의 서열, 향체 ANOC 203은 아미노산 번호 83-102의 서열, 그리고 항체 ANOC 205는 아미노산 번호 145-148의 서열에 대한 인식부위를 각기 갖고 있다..
(9) 본 발명의 항체에 대한 입체 장해시험
본 발명의 항체 각각을 요오드 겐법에 의하여 125I로 표시하여, 표시된 항체를 얻었다.
본 발명의 항체 각각을 물리적 흡착법(Clin,Chem.Acta.,135,263(1983))에 의하여 폴리스티렌 구슬(직경6.4mm)에 흡착시켜 불용화 항체를 얻었다. 불용화된 항체를 1% BSA와 0.01% 티머로 살이 함유된 0.5ml의 PBS용액중의 인간의 IL-1β20ng과 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. 상기에서 얻은 약 100000cpm으로 표시된 항체를 함유하는 위에서와 꼭같은 PBS용액(0.5ml)을 반응후 씻어낸 구슬에 가하고, 37℃에서 2시간동안 진탕하여 반응시켰다. 구슬을 씻어낸후, 항체들 사이의 반응성(불용화 항체-인간의 IL-1β-표시된 항체의 샌드위치 형태의 형성여부에 관계없이)을 측정하기 위하여 구슬의 방사능을 계측하였다. 그 결과 항체 ANOC 201,206과 207사이에 어떠한 샌드위치 형태도 형성되지 않았으며, 이것은 이들 항체들이 IL-1β의 똑같은 부위를 본질적으로 인식한다는 사실을 나타내고 있다. 시험된 다른 모든 항체들 사이의반응에 있어서도 장해는 결코 발견되지 않았다.(항체 그 자신들과의 반응은 제외)
(10) 섬유아세포의 IL-1 수용체에 대한 IL-1β의 결합억제(시험 A)6-웰 플레이트(1×106 세포/웰)에서거의 균일하게 성장한 BALB/C3T3 섬유아세포(ATCC CCL-163)를 8500cpm/웰의 125I로 표시한 IL-1β(볼톤과 헌티법(Biochem.J.,133,529,1973)에 의하여 제조한 특이적 활성이 최소 250μci/μg인 단백질) 및 10% FCS가 보층된 D-MEM 중에서 37℃로 사전배양하여 얻은 본 발명의 항체(항-IL-1β 모노클로날항체)와 37℃에서 4시간동안 반응시켰다. 다음에는 50μl의 쥐혈청과 250μ1의 20% PEG를 4℃에서 20분동안 상기의 반응혼합물과 반응시켰다. 플레이트를 원심분리(12000r.p.m.15분)하여 침전물(결합된 생성물)을 얻었다. 상등액(결합되지 않은 생성물)을 침전물로부터 분리하였다. 결합 반응성을 감마계수기로 측정하였다. 섬유아세포의 IL-수용체에 대한 결합에 따른 IL-lβ를 억제시키는 본 발명의 항체의 활성(%)를 다음의 식으로부터 계산하였다.
Figure kpo00004
여기서, A : 본 발명의 항체를 사용하지 않은 비교에 대한 방사능, B : 플레이트상에 비특이적으로 흡착된 방사능, C : 본 발명의 항체의 사용에 기인한 방사능.
이 시험에서, 값 A는 3895cpm/웰이고, 값 C는 301cpm이었다. 표3은 본 발명의 항체 즉 ANOC 203및 205에 의하여 얻어진 결과를 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00005
표3은 125I로 표시된 IL-1β가 IL-1수용체에 결합되는 것을 본 발명의 항체 ANOC 203이 억제한다는사실을 나타내고 있으며, 본 항체가 IL-1β의 IL-1수용체에 대한 결합부위를 인식한다는 것을 암시하고있다. 본 발명의 항체 ANOC 205는 본질적으로 억제활성이 없다. 이것은 항체 ANOC 205가 IL-1수용체에 대한 결합부위와는 다른 어떤 부위를 인식한다는 사실을 나타낸다.
(11) 섬유 아세포의 IL-l수용체에 대한 결합억제(시험 B)
섬유 아세포가 성장하고 있는 각 웰속에 125I로 표시된 IL-1α,10ng/ml의 IL-1β 및 본 발명의 항체의 특정량을 넣고, 이 혼합물을 상기의 절차(10)에서와 같은 방법으로 반응시켰다. 절차(10)에서와 같이 원심분리 시킨후, 웰의 방사능을 계측하여 섬유 아세포의 lL-수용체에 대한 결합에 따른 IL-1β를 억제시키는 본 발명의 항체의 활성(%)을 계산하였다. 이 시험에서 값 A는 8273cpm/웰이고, 값 C는 410cpm이었다. 표4는 본 발명의 항체 즉 ANOC 203 및 205에 의하여 얻어진 결과를 나타낸다.
[표 4]
Figure kpo00006
표4는 다음과 같은 사실을 나타내고 있다.
IL-1β는 IL-1수용체에 결합하므로 125I로 표시한 IL-1α를 억제시키며, 본 발명의 항체 ANOC 203은 IL-1β가 IL-1수용체와 결합하는 부의를 인식하므로 회복된 결합억제 활성을 나타내게 된다. 본 발명의 항체 ANOC 205는 IL-1수용체에 대한 IL-1β의 결합부위를 인식하지 못하므로 회복된 결합활성을 나타내지 못한다는 것은 분명하다.
[실시예 2]
인간의 IL-1α에 대한 항체의 제조
인간의 IL-1α에 대한 원하는 항체를 생산하는 클론을 인간의 IL-1β에 대하여 상기에서 사용한것과 같은 방법(내이쳐,315,P641(1985))으로 제조한 인간의 IL-1α를 면역항원으로 사용하여 실시예 1에서와 같은 방법으르 얻었다.IL-1α에 대한 본 발명의 항체 ANOC 301을 클론으로부터 얻었다. 이 항체는 다음과 같은 특성을 가지고 있다.
아강 : IgG2a
항체 생산수준 : 75μg/ml
효능 : RIA×3200
EIA × 2000
교차반응성 : IL-2, IL-1β, GM-CSF 및 TNF에 대한 어떠한 교차 반응성도 없음.
결합상수(kd) : 3.6×10-3M/L
중화활성 : 활성이 있음.
실시예에서 얻은 4개의 하이브리드 쎌라인은 1987.11.5일자로 퍼멘테이션 리서취 인스티튜트, 에이전시오브 인더스트리알 사이엔스 앤드 테크 늘러지(Fermentation Research Institute, Agency of Indastrial Science and Technology)에 기탁되어졌으며, 기탁명 및 번호는 각기 다음과 같다.
Figure kpo00007

Claims (13)

  1. 인간의 인터류킨 -1α 또는 인간의 인터류킨 -1β에 대하여 특이적인 활성을 갖는 항체로서 특징지워지는 인간의 인터류킨 -1에 대한 모노클로날 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 항체가 인간의 인터류킨 -1α에 대하여 특이적인 활성을 갓는 모노클로날 항체.
  3. 제 1 항에 있어서, 항체가 인간의 인터류킨 -1β에 대하여 특이적인 활성을 갖는 모노클로날 항체.
  4. 제 1 항에 있어서, 항체가 인간의 인터류킨 -1의 생물학적 활성을 중화시키는 활성을 갖는 모노클로날 항체. , ·
  5. 제1 항에 있어서, 항체가 인간의 인터류킨 -1β의 아미노산 번호 12l-140의 서열에 대한 인식부위를 갖고 있는 모노클로날 항체.
  6. 제 1 항에 있어서, 항체가 인간의 인터류킨 -1β의 아미노산 번호 24-82의 서열에 대한 인식부위를 갖고 있는 모노클로날 항체.
  7. 제 1 항에 있어서, 항체가 인간의 인터류킨 -1β의 아미노산 번호 83-102의 서열에 대한 인식부위를갖고 있는 모노클로날 항체.
  8. 제 1 항에 있어서, 항체가 인간의 인터류 -1β의 아미노산 번호 145-148의 서열에 대한 인식부위를 갖고 있는 모노클로날 항체.
  9. 제 1 항에 있어서, 항체가 하이브리드 쎌라인 KFCC-10534(FERM BP-1551)에 의해서 생산되는 모노클로날 항체.
  10. 제 1 항에 있어서, 항체가 하이브리드 쎌라인 KFCC-10535(FERM BP-1552)에 의해서 생산되는 모노클로날 항체.
  11. 제 1 항에 있어서, 항체가 하이브리드 씰라인 KFCC-10536(FERM BP-1553)에 의해서 생산되는 모노클로날 항체.
  12. 제 1 항에 있어서, 항체가 하이브리드 쎌라인 KFCC-10537(FERM BP-1554)에 의해서 생산되는 모노클로날 항체. ·
  13. 면역 항원으로서 인간의 인터류킨 -1α 또는 인간의 인터류킨 -1β를 사용하여 포유동물을 면역시키고, 면역된 세포와 포유동물의 형질세포종 세포를 융합시켜 하이브리도마 세포를 얻은 다음 클로닝시킨후, 인간의 인터류킨 -1α 또는 인간의 인터류킨 --1β를 인식하는 원하는 항체를 생산하는 클론을 선발하여 배양시키는 것을 특징으로 하는 인간의 인터류킨 -1α 또는 인간의 인터류킨 -1β에 대하여 특이적인 반응성을 갖는 모노클로날 항체의 제조방법.
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