KR870000239B1 - 야로비아 리폴리티카의 형질전환 방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 pBR 322중의 와이. 리폴리티카의 Sau 3A 부분 분해 유전자 라이브러리를 나타내고
제2도는 EcoRI로 분해된 와이. 리폴리티카 벌크 DNA와 방사성 pLD 25로 프로브된 pLD 25와의 사우던 하이브리드화(Southern hybridization)를 나타내며
제3도는 pLD 25의 제한지도이고
제4도는 Hind Ⅲ로 분해된 와이. 리폴리티카 형질전환체의 벌크 DNA와 방사성 PBR 322프로브의 사우던 하이브리드화를 나타내며
제5도는 pLD 23 및 pLD 24의 제한 분해도이고
제6도는 pLD 28의 제한지도이며
제7도는 pLD 40의 제한지도이며
제8도는 pLD 55와 pLD 40의 제한 분해 비교를 나타낸다.
본 발명은 야로비아 리폴리티카의 공업적 이용도의 확장을 위한 야로비아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)의 형질 전환 방법, 형질 전환에 유용한 벡터 및 그의 서브클론(Subcolnes), 특히 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)내에서 자율적으로 복제하고 야로비아 리폴리티카내에서는 융합되나 자율적으로 복제되지는 않는 벡터 : 상기 벡터를 함유하는 이. 콜라이 및 와이. 리폴리티카의 형질전환체 및 프로레인을 생성하는 그의 용도에 관한 것이다.
분자 클로닝(cloning)에 있어서, 숙주로서는 원핵생물(prokaryotes), 특히 이. 콜라이 및 최근에는 고초균(Bacillus subtilis)에 중점을 두어 왔다. 잡종성 DNA의 클로닝 및 발현용 숙주로서의 광범위한 용도에도 불구하고, 이. 콜라이는 그의 증식 배지중에 프로테인을 분비하지 못하므로 그 후의 분리가 어려운 문제점을 지니고 있는 것으로 알려져 있다. 그 프로테인은 세포 내에서 항상 그의 천연 상태 그대로 존재하지 않으며 봉입체(inclusion body)라 불리는 불용성 응집물로서 발견된다. 프로테인을 회수하기 위하여 세포를 파괴하면 프로테인이 독성물질에 오염되는 빈도가 높아진다.
상기의 관점에서, 단백질을 분비하지만 독소를 생성하지 않는 고초균을 대체숙주로 선택하였다. 그러나, 숙주로서의 고초균은 형질전환된 균주가 불안정하여 잡종성 DNA의 손실을 초래하고, 유입된 DNA가 숙주DNA와 공존할 수 있는 능력이 자주 감소되는 한계를 지니고 있다.
원핵 세포를 숙주로서 이용할 때 상기의 어려움이 있기 때문에, 진핵세포 특히 효모를 숙주세포로 이용하는 것에 관심을 돌리게 되었다. 공업적으로 중요한 효모는 독소가 없으며 아주 높은 밀도까지 증식할 수 있다. 몇가지 균종이 유전학적으로 잘 분리되며 프로테인을 분비할 수 있다.
효모, 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)의 첫번째 형질 전환은, LEU2를 코드화하는 효모 DNA의 클론화된 단편이 효모의 비가역 leu 2-돌연변이주를 LEU+표현형으로 형질전환시킬 수 있음을 입증한 힌넨등[Proc. Natl. Acad. Sci., 75, 1929∼1933(1978)]에 의해서 보고되었다. 이 형질전환은 DNA의 LEU 2단편을 함유하는 플라스미드의 크로모좀으로의 융합(integration)에 의한 결과이다. 융합에는 DNA의 동종단편사이의 재조합이 포함된다.
힌넨 등은 문헌("Overproduction of Microbial products", edited by krumphanzl et al., Academic Press, N.Y., ch 30, 1982)에서 효모 형질전환 방법을 설명하였다. 효모 형질 전환의 선행 조건은, 이. 콜라이 leu B 돌연변이의 보족에 의한 효모(Saccharomyces cerevisiae) LEU 2의 클로닝(cloning)에 관한 래츠킨 등[Ratzkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 487∼491(1977)]의 연구에 의해 밝혀졌다.
스요스탁 등(Sjostak et al., plasmid 2, 536∼554(1979))은 효모의 LEU 2 유전자 및 ΥDNA 단편을 함유하는 플라스미드 구조 및 그후의 플라스미드의 ΥDNA 부위로의 융합, 그 다음의 효모 형질전환 등을 밝혀냈다. 그들 연구는 ΥDNA를 지도로 나타내기 위한 유전 마커(marker)로서 DNA 부위로 삽입된 유전마커 LEU 2 유전자의 융합을 기본으로 하고 있다. ΥDNA의 Bgl Ⅱ-B 단편 및 Sal I-Xho I LEU 2 단편을 함유하는 보고된 플라스미드 pSZ 20의 하나는 효모내에서 효모 DNA의 단편을 클로닝하기에 유용한 벡터로서 확인되었다.
오르-웨버 등[Orr-Weaver et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 6354∼6358(1981)]은 pBR 322로 부터 유도된 직선 플라스미드의 고빈도 융합을 입증하였으며, 이들의 모두는 효모내에서 복제하지 않으며, 플라스미드가 효모 크로모좀과 동족인 DNA 서열내에서 절단되는 경우에, 맥주 효모균내에서, 융합에 의해서만 형질전환을 유도할 수 있다.
공업적으로 중요한 효모 균종인 야로비아 리폴리티카는 시트르산 및 단세포 프로테인을 제조하는 데에 이용된다. 또한 에리트리톨, 만니톨 및 이소프로필말산을 제조하는 데에도 이용될 수 있다. 야로비아 리폴리티카는 이용할 수 있는 탄소원이 제한된 스펙트럼과 같은, 어떤 유전적 결함을 지니고 있다. 와이. 리폴리티카의 전반적인 가치는 그와 같은 결합을 제거함으로써, 예를들어 다른 균종으로부터 수정된 DNA를 유도함으로써 높일 수 있다. 와이. 리폴리티카는 그의 증식 배지 중에 프로레인(알카리 프로테아제, 산 프로테아제 및 RNAse)을 분리하고 따라서 생성 세포를 차단하지 않고도 천연 그대로의 잡종성 프로테인을 회수할수 있기 때문에 특별한 관심의 대상이 되고 있다.
복제성 하이브리드 플라스미드 및 대장균 및 맥주효모균으로 부터 선택, 회수되는 대장균 하이브리드 플라스미드를 함유하는 맥주효모균의 형질전환에 유용한 시스템 은 문헌[Beggs, Nature 275, 104∼109(1978)]에 기술되어 있다. 쉬조삭카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactice)의 고 빈도 형질전환 시스템은 비치 등[Beach et al., Nature, 290, 140-142(1981)] 및 다스 등[Das et al., Current Genetics, 6, 123∼128(1982)]에 의해서 보고되었다.
와이. 리폴리티카의 동형인 부분 및 검출할 수 있는 유전 마커를 함유하는 DNA를 유도함으로써 와이. 리폴리티카의 형질전환 방법이 발견되었다. 그의 DNA 및 벡터가 와이. 리폴리티카, 그의 유용한 벡터 및 미생물 형질전환체에서 검출될 수 있는, 와이. 리폴리티마 DNA의 단편 또는, 택일적으로 및 바람직하게는, 와이. 리폴리티카 DNA의 단편을 함유하는 벡터를 와이. 리폴리티카내로 이입시키는 방법이 특별한 관심사이다. 일반적으로 이 형질전환 방법에 있어서, 와이. 리폴리티카 DNA 단편은 와이. 리폴리티카, 특히 상기의 선택성 마커에 상응하는 유전자가 돌연변이된 야로비아 리폴리티카에서 작용하는 선택적 마커를 함유한다. 본 발명의 특별한 관심 및 가치는, LEU2 유전자(효소 β-이소프로필말레이트데하이드로게나제. ECl. 1.1.85를 코드화하는) 또는, HIS 1 유전자(효소 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제. Ec 2.4.2.17를 코드화하는), 또는 URA 3 유전자(효소 오로티딘-5'-포스테이트 데카복실라제, Ec4.1.1.23을 코드화하는), 또는 XPR2 유전자(효소 알카리 외세포 프로테아제, Ec 3.4.21.l4를 코드화하는)와 같은 생합성 또는 대사성 효소를 코드화하는 유전자를 갖는 와이. 리폴리티카 DNA 단편 및 각각 LEU2-, his1-, Uro3-또는 Xpr2-돌연변이주를 갖는 야로비아 리폴리티카 균주의 용도에 있다.
본 발명에 기술되는 신규한 플라스미드(또는 벡터, 이 용어들은 본 명세서에서는 상호 교환하여 사용할 수 있다)는, 이. 콜라이내에서 그들을 증폭시키는 세균성 복제단위(replicon)의 존재 : 이. 콜라이 내에서 검출되고 작용하는 선택적 유전 마커의 존재, 생리학적으로 와이. 리폴리티카 및 자주 이. 콜라이 내에서 작용하는 구조 유전자의 존재 및 그들을 와이. 리폴리티카 게놈(genome)으로 통합시키는 와이. 리폴리티카 단편의 존재 등 공통으로 여러가지 특징을 갖는다 :
일반적으로, 본 발명을 위해, 유용한 벡터의 생성은 하이브리드 벡터, 예를들어, 생리학적으로 이종 미생물(예, 와이. 리폴리티카를 제외한 어느 균종), 바람직하게는 세균, 더바람직하게는 이. 콜라이 및 또한 와이. 리폴리티카중에서 작용하는 벡터의 제조를 기본으로 한다. 그와 같은 벡터는 미생물의 DNA 및 적어도 하나의 선택적 유전 마커를 포함한 와이. 리폴리티카의 크로모좀성 DNA의 단편(즉, 야로비아 리폴리티카 중에서 작용, 검출되는 유전자를 함유한다. 그렇게 만들어진 벡터는 와이. 리폴리티카 중의 동종성 크로모좀 서열과 상호작용하여 그의 크로모좀으로 융합되고, 드디어 형질전환을 끝낸다.
그 분야 전문가들이면, 효모(기원)의 하나이상의 유전자를 함유하는 벡터의 형성이 상기의 벡터, 융합체(integrant)로 부터의 형성 빈도 즉, 상기의 벡터를 함유하는 형질전환체, 및 특히 하나이상의 유전자를 갖는 융합체의 형성 빈도를 증가시킴을 이해할 것이다 : 다수의 유전자가 존재함으로써 효모에서의 벡터의 존재를 검출할 수 있는 가능성이 증가된다.
융합은 상기 벡터의 환상. 직선상 및 갭이 생긴-직선 형(gapped linear form)으로 이루어진다. 직선 및 갭이 생긴 직선 벡터는 환상 벡터보다는 높은 유용도로 융합된다. 따라서 벡터는 바람직하게는 하나의 절단개소, 즉, 기원 미생물의 DNA 벡터 또는 그밖에 와이. 리폴리티카 단편 성분의 벡터중에는 존재하지 않는 개소를 갖는다. 그와 같은 개소에서 직선화된 벡터는 동종성 크로모좀 서열에 융합되어 와이. 리폴리티카를형질전환시길 수 있는 높은 재조합성 말단을 갖는 겹가닥 DNA를 제작한다. 오르-웨버 등(위의 인용물중)이 맥주 효모균에서 나타낸 바와같이, 갭이 생긴 직선 플라스미드는 또한 융합될 수 있다. 그와 같은 플라스미드는 벡터의 와이. 리폴리티카 크로모좀성 DNA 단편 내에 2개의 제한 효소 절단개소를 만들므로써 제조된다. 하기에 기술되는 pLD 25의 경우에 있어서, 2개의 Bgl. Ⅱ개소가 존재하면 갭이 생긴 직선 플라스미드를 제조할 수 있다.
본 발명의 벡터의 가치는 그 안에 선택성 유전 마커, 와이. 리폴리티카에서 검출, 작용할 수 있는 검출마커 존재에 달려있다. 적합한 마커는 다음의 와이. 리폴리티카 유전자이다 : LEU2, ADE1, URA3, XPR2 및 HIS1. 그러나 그 분야 전문가들이면, 선택을 제공하는 어느 와이. 리폴리티카도 이용될 수 있음을 이해할 것이다. LEU2 유전자(그의 모두 또는 한 부분)가 특히 중요하다. 상기 유전자 또는 그의 부분은 와이. 리폴리티카의 크로모좀성 DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제, 예를들어 Sau 3A로 부분 분해함으로써 얻어진다. 상기의 벡터 또는 그의 서브클론(Subclone)은 랜덤(random) 단편의 DNA를 공지된 방법으로 삽입시킴으로써 벡터를 클로닝하는 와이. 리폴리티카의 제작을 가능하게 한다. 그와같은 와이. 리폴리티카 마커를 갖는 형질전환 DNA는 수용균에 선택적 증식 이점을 주거나 수용균 내에서 영양요구성 돌연변이(auxo-trophic mutation)를 조절할 수 있다.
상기의 단편은 이. 콜라이 및 와이. 리폴리티카 내에서 생리적으로 기능을 발휘하는 벡터를 제조할 수 있기 때문에 완전한 LEU2 유전자를 포함하는 와이. 리폴리티카 DNA단편을 이용하는 것이 일반적으로는 바람직하다. 그러나 본 발명 방법의 연속 지도에 완전한 LEU2 유전자를 갖는 와이. 리폴리티카 DNA 단편을 반드시 이용할 필요는 없다. 그것은 충분량의 야생형 서열(Wild type sequence)을 포함하는 DNA 단편을 이용하여 수용균내에 융합시킬때, 야생형 유전자를 생성하기 위해서만 필요하다. 이. 콜라이 내에서 기능을 발휘하지 않는 상기의 단편이 와이. 리폴리티카에서 검출된다.
또한 본 발명에서 유용한 벡터 제조의 중요성은 HIS 1 유전자를 포함하는 와이. 리폴리티카 크로모좀성 DNA의 완전한 Bam HI 분해 또는 URA 3 유전자를 포함하는 와이. 리폴리티카 크로모좀성 DNA의 부분적 Sau 3A 분해에 의해서 얻어지는 와이. 리폴리티카 DNA 단편에 있다. 상기 단편은 연결될 수 있는 말단을 함유하여, 직선으로 연결될 경우, 예를들어 Bam HI. YEp 24를 사용할 경우에, 이. 콜라이 맥주효모균 벡터는(Botstein et al., Gene 8, 17∼24, 1979) HIS1 유전자 또는 URA3 유전자를 운반하는 하이브리드 벡터를 제공한다.
본 명세서에 기술하는 신규한 벡터를 이용하는 경우에, 와이. 리폴리티카의 랜덤 단편은, 산탄 총법("sh-otgun" technique)에 의해서 그 안에 삽입될 수 있다. 생성되는 벡터는 여러가지 돌연변이주 및 표준방법으로 선택되는 형질전환용 물체를 형질전환시키기 위해 이용될 수 있다. 예를들어, LEU2를 함유하는 벡터는 URA3와 같은 다른 와이. 리폴리티카 유전자를 클론하는데 사용될 수 있다. 선택된 어느 형질전환체중의 생성되는 클론화된 URA3 유전자는 이어서 LEU2 유전자로부터 서브클론화되어 효과적인 와이. 리폴리티카 벡터로서 쓰일 수 있다.
일반적으로 세균성(예, 이. 콜라이) 플라스미드 복제기원 및 상기 세균의 선택적 유전 마커는 공지된 방법에 의해 와이. 리폴리티카 중에서 선택, 및 검출될 수 있는 와이. 리폴리티카 유전자의 모두 또는 부분과 결합된다. 이. 콜라이 클로닝 시스템은 이. 콜라이의 증식 및 증폭에 의해서 쉽게 대량의 플라스미드 DNA를 생성할 수 있고, 대장균내에서 벡터 및 유전자 라이브러리의 구조화를 가능하게 하기 때문에 특히 유용하다.
본 명세서에 기술되는 플라스미드는 DNA 재조합 방법론에서 벡터로서 유용하다. 예를들어, 플라스미드를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 연결될 수 있는 말단을 갖는 직선 DNA로 만들고, 이어서 이 직선 DNA를 연결될 수 있는 말단을 갖는 외인성 유전자와 반응시킴으르써 여러가지 유전자가 벡터중으로 삽입될 수 있다. 이어서 생성되는 플라스미드는 적절한 조건하에서 배양시에, 목적하는 생성물을 생성하는 적절한 숙주 미생물 예를들어 맥주효모균 및 와이. 리폴리티카와 같은 효모로 이입되어 목적하는 생성물을 제조하게 된다. 와이. 리폴리티카의 LEU2 유전자를 함유하는 플라스미드 pLD 24 및 pLD 28 각각은 와이. 리폴리티카 수용균중에서 선택, 검출될 수 있다. 따라서 그들을 와이. 리폴리티카 클로닝 벡터의 제조에 이용할 수 있다.
또한, 본 명세서에 기술된 플라스미드는 미생물, 특히 와이, 리폴리티카의 발효특성을 개선시킴으로써 그의 고유의 결함을 극복시켜 공업적 유용성을 증가시킨다. 예를들어, 여러가지 탄소원의 이용을 코드화하는 유전자는 플라스미드내로 삽입될 수 있으며, 생성된 플라스미드는 와이. 리폴리티카와 같은 적당한 숙주로 형질전환되어 이 숙주의 영양 특성을 변형시킴으로써, 와이. 리폴리티카의 이용 가능한 탄소원의 범위를 넓힌다. 이 목적에 필요한 벡터, 예를들어 플라스미드 또는 코스미드는 DNA재조합 기술분야 전문가들에게 잘 알려진 기법으로 제작될 수 있다. 특정의 페리-플라스미드성 효소를 코드화하는 와이. 리-폴리티카 DNA 서열은 공지된 방법으로 분리되며 예를들어, pLD 25 또는 그의 유도체내로 삽입된다. 목적하는 구조의 유전자, 예를들어, 말타제 유전자는 적절하게는 페리플라스믹 효소의 DNA 서열과 융합될 수 있으며 생성되는 플라스미드는 와이. 리폴리티카내로 이입, 형질전환되어 본 발명의 방법에 의해 와이. 리폴리티카의 크로모좀의 하나로 통합될 수 있다. 배양시에, 그렇게 생성된 형질 전환체는 말토즈를 글루코즈로 가수분해시킬 수 있으며, 바람직한 특성을 모체에 의해 지배당하지 않는다.
플라스미드 pLD 25는 이. 콜라이내에서 자발적으로 복제, 융합되지만 와이. 리폴리티카내에서는 자발적으로 복제되지 않는다. 플라스미드 pBR 322를 복제시키는 이. 콜라이내로 삽입시킴으로써 얻어지는 와이. 리폴리티카 DNA 단편은 바람직하게는 두 가지의 뚜렷한 특성을 지닌다 : 첫째는, 와이. 리폴리티카, 바람직하게는 이. 콜라이내에서 생리학적으로 기능을 발휘하고 와이. 리폴리티카에서 검출되는 구조적 유전자가 존재하는 점이고. 둘째는, 와이. 리폴리티카 구조 유전자에서의 결합을 수정할 목적으로 와이. 리폴리티카 숙주 균주로 이입되는 DNA 서열에 접하는 부분중에 유일한 제한 개소(즉, 기원 이. 콜라이 플라스미드 또는 그밖의 와이. 리폴리티카 숙주 단편에는 준재하지 않는)를 소유하는 점이다. 형질전환을 높은 빈도로 이루기 위해서는 유일한 제한 개소를 갖는 것이 꼭 필요하다.
와이. 리폴리티카의 HIS1 유전자를 운반하는 각각의 하기에 기술된 플라스미드 pLD 21 및 pLD 23는, Bam HI으로 와이. 리폴리티카의 크로모좀성 DNA를 완전히 분해시킴으로써 얻어지는 단편이 YEp 24 및 pBR 322로 삽입되어 얻어진다.
플라스미드 pLD 25는 이. 콜라이 leu B-돌연변이를 보족하는 와이. 리폴리티카 DNA의 단편을 함유하고 플라스미드 pLD 21 및 pLD 23은 이. 콜라이 hisG-돌연변이를 보족하는 단편을 함유한다.
또한 플라스미드 pLD 28은 이. 콜라이내에서 자발적으로 복제되고, 와이. 리폴리티카내에서 융합되나 자발적으로 복제되지는 않는다. 플라스미드 pLD 28은 와이. 리폴리티카 LEU2 유전자를 함유하는 Sal 1 단전을 YEp 24의 Sal I개소에 삽입시킴으로써 얻어진다. 플라스미드 pLD 28은 주지한 바와 같이 LEU 2돌연변이주에서 선택할 수 있는 와이. 리폴리티카증의 통합 벡터, Ura 3 또는 LEU 2 돌연변이주에서 선택할수 있는 맥주 효모균 중의 멀티카피 플라스미드 및 암피실린 내성 또는 PylF 돌연변이주 중의 맥주 효모균 URA 3 유전자의 적절한 기능 또는 leuB 돌연변이주 중의 와이. 리폴리티카 LEU 2 유전자의 약하지만 감지할 수 있는 기능에 따라 선택할 수 있는 이. 콜라이 증의 멀티카피 플라스미드이다.
플라스미드 pLD 25 및 pLD 28은 이. 콜라이 및 와이. 리폴리티카용 슈틀 벡터(Shuttle vector)이다. 그들은 이. 콜라이에서 DNA 복제할 수 있는 세균 서열 및 효모에서 융합될 수 있는 세균 서열을 함유한다 : 예를들어, 그들은 이. 콜라이 기원의 복제 및 와이. 리폴리티카 부위의 동족체를 함유한다. 슈틀(Shuttle)이란 용어는 이. 콜라이중에 구축된 상기 벡터가 와이. 리폴리티카 크로모좀으로 융합되고 이. 콜라이 중에 다시 유도되어 환을 이루는 것을 의미한다. 이들 슈틀 벡터는 이. 콜라아 중에서 돌연변이의 보족 및 맥주효모균 또는 와이. 리폴리티카 중에서 돌연변이주의 직접 보족에 의해서 와이. 리폴리티카 유전자의 클로닝을 가능하게 한다. 이러한 현상은 기능적 LEU 2 유전자 생성물이 이종성 시스템 모두에서 형성됨을 나타낸다. 이러한 와이. 리폴리티카중에서 직접 보족의 발견으로 돌연변이를 확인할 수 있는 어느 유전자의 클로닝이 가능하게 되었다.
하기에 기술되는 플라스미드 pLD 40은, 와이. 리폴리티카의 LEU2 부위를 함유하는 소단편을 pBR322의 EcoRI 부위로 삽입시킴으로씨 구축되며, 상기 단편은 pLD 25의 EcoRI 부분분해에 의해서 얻어졌다. URA 3를 함유하는 플라스미드 pLD55는 와이. 리폴리티카의 URA3 유전자를 pLD40의 Bam HI 개소로 삽입시킴으로써 얻어졌다.
제1도 pBR 중의 와이. 리폴리티카의 Sau 3A 부분 분해유전자 라이브러리. 이 아가로즈 겔은, 라이브러리(LIB로 표지된)가 2.3kb λ-Hind Ⅲ 표준품(STD 표지된) 바로 위로 이주하는 삽입 DNA가 없는 플라스미드로 슈퍼코일된 몇가지 pBR322를 함유하는 반면에, 나머지 분자는 상기의 4.3kb 표준품 위에 거의 연속 도말로서 이주하는 와이. 리폴리티카 DNA의 다양한(4∼10kb) 크기로 분할된 삽입물을 함유함을 나타낸다. 가운데 레인(lane)은 절단되지 않은 플라스미드(pLD21)를 함유하여 2개의 뚜렷한 밴드를 나타낸다.
제2도. Eco RI로 분해된 와이. 리폴리티카 벌크 DNA와 방사성 pLD25로 프로브된 pLD25와의 사우던 하이드리드화(Southern hybridization) pLD25의 b,c 및 d로 라벨된 3개의 내부밴드는 총 와이, 리폴리티카 DNA의 동일한 크기로 절단된 동족체를 나타낸다. 야로비아 리플리티카 레인중의 2개의 희미한 밴드(1 및 2로 표지된)는 추측하기로는 플라스미드밴드 a 및 e의 소 야로비아 리폴리티카 부분에 동족관계이다. STD로 표시된 레인은 λ-Hind Ⅲ사이즈 표품을 함유한다. P로 표지된 레인은 약 2μg의 EcoRI분해 pLD25를 함유하고 "Y1"로 표시된 레인은 약 1μg의 총 와이. 리폴리티카 DNA를 함유한다. pBR322를 프로브로서 이용하는 유사한 사우던 실험에 있어서 pLD25로 부터의 a 및 e밴드만이 하이브리드화 되었다.
제3도. pLD25의 제한 지도. 단일 몇 몇가지 이중 제한 분해를 근거로 하는 부분 제한지도를 나타낸다. 괄호안의 개소는 서로에 관해 규제받지 않았다. 나타난 모든 사이즈는 아가로즈 겔 관찰을 근거로 한 근사값이다. 얇은 선은 pBR322 DNA를 나타내고(12시에서 EcoRI개소와의 표준 포오맷(fornmt)에 있어서)굵은 선은 와이. 리폴리티카로부터 얻어지는 삽입 DNA를 나타낸다. 삽입체는 3EcoRN(RV)·8AraI(A-그러나 오직 하나만이 그려져 있다). 1Sph I (Sp), 1Kpn I (K), 2Sal I (S), 4EcoRI(RI), 2Xho I(X) 및 2클로즈-투게더(Close-together) Bgl Ⅱ(B) 가소를 갖는다. 삽입체에는 Hind Ⅲ, Cla I, Bam HI 및 Nru I개소가 부족하다. leu 2라 표시된 Eco RI 말단과 접하고 있는 2.3kb 서브클론은 PBR 322의 EcoRI 개소에서 오직 1방향으로 이. 콜라이에서 기능을 발휘한다.
제4도. Hind Ⅲ로 분해된 야로비아 리폴리티카 형질전환체로 부터 분리된 벌크 DNA와 방사성 pBR322 프로브의 사우던 하이브리드화. 네개의 서로 다른 형질전환체로 부터 분리된 총 DNA를 Hind Ⅲ로 분해시키고 모 균주를 아가로즈 겔상에 접종하고 표지된 pBR322로 프로브한다. 와이. 리폴리티카 형질전환체 #6는 접촉, 환상의 pLD25로 형질전환된 배양물로부터 랜덤하게 선택되었다. 형질전환체 11,12 및 15는 KpnI-직선 pLD25로 형질전한된 배양물로 부터 선택되었다. 모든 야로비아 리폴리티카 형질전환체는 23kb 길이보다 좀더 큰, 보다 강한것(1)과 9.3kb λ-Hind Ⅲ 표품과 동일한 사이즈의 보다 약한 것 (2)의 2개의 하이브리드화 밴드로 나타난다. PC로 표시된 레인은 프로브에 뚜렷한 하이브리드화가 없는 모 (PC 30827 : ATCC 20688) DNA를 함유한다.
제5도. pLD23 및 pLD24의 제한 분해.
이 아가로즈 겔은 바깔 좌측레인중의 λ-Hind Ⅲ 사이즈 표품 및 각각 a) Eco RI.. b) Bam HI. c) 효소처리하지 않은 pLD23(보족 이. 콜라이 his G 돌연변이주) 및 pLD24(보족하지 못한)를 함유한다. 각각의 레인 b는 pBR322에 상응하는 좀더 큰 밴드 및 와이. 리폴리티카 Bam HI 삽입을 나타내는 약간 작은 밴드(약 4kb)의 2개의 클로즈-투게더 Bam HI 밴드를 함유한다.
제6도. pLD28의 제한지도. LEU2 부위를 함유하는 5.3kb 와이. 리폴리티카 Sal I조각 이외에. 이 플라스미드는 효모로 부터 유래된 2μ의 플라스미드 복제기원을 갖는 2.2kb Eco RI 조각과 pBR322의 상응하는 개소로 삽입된 맥주효모균 URA3 유전자를 갖는 1.1kb Hind Ⅲ 조각을 함유한다.
제7도. pLD40의 제한지도. 제한 개소의 약자는 상기의 도면에서와 같다. 그외에, Nco I(N), Apa I(Ap) 및 Bst XI(Bs)의 개소가 더 그려져 있다. 단편을 함유하는 와이. 리폴리티카 LEU2는 2.3 및 2.3kb사이에 있으며 pBR322의 EcoRI 개소로 삽입되었다. pBR322 중의 제한 개소는 나타나 있지 않다.
제8도. pLD55와 pLD40의 제한 분해 비교.
이 겔의 레인(λ-Hind Ⅲ사이즈-표준품 이외에)은 a) 비분해된 pLD55 b) Apo I로 분해된 pLD55 c)Eco RI으로 분해된 pLD40 d) Eco RI으로 분해된 pLD55 e) Apa I으로 분해된 pLD55 및 f) 비분해된 pLD55이다. 이들 분해는 클론화된 URA3 함유 부위가 2개의 Eco RI 개소를 가지며 약 4kb길이임을 나타낸다.
[플라스미드]
플라스미드 pLD25는 이. 콜라이 및 와이. 리폴리티카에서 선택성 유전 마커를 함유하며, 이. 콜라이 복제플라스미드 pBR322, 멀터카피 플라스미드로 부터 유도된다. 그것은 Sau 3A에 의한 와이. 리폴리티카 크로모좀성 DNA의 부분해로 얻어지는 약 6.6kb 단편을 pBR322의 Bam HI 개소내로 삽입시킴으로써 구성된다. 또한 플라스미드 pLD28, pLD25의 서브클론은 이. 콜라이, 와이. 리폴리티카 및 맥주효모균에서의 선택성 유전마커를 함유하며, YEp24로 부터 유도된다. 그것은 야로비아 리폴리티카 LEU2 유전자를 함유하는 약 5.3kb Sal I 단편을 YEP24의 Sal I개소에 삽입시킴으로서 구성된다.
플라스미드 pLD40 또한 pLD25의 서브클론은 pLD25로 부터 분리되는 각 2.3 또는 2.4kb Eco RI 부분 분해단편을 pBR322의 Eco RI개소내로 삽입시킴으로써 얻어진다.
[미생물]
이용되는 미생물은 이. 콜라이주 및 와이. 리폴리티카 균주이며, 이들 균주는 각각 이. 콜라이 Jc-355[Clork et al., Molec, Gen, Genet, 105, 1(1969) obteined as strain No. 869 from the E. Coli Genetic stock centrr Yale University] 및 와이. 리폴리티카 PC-30827[기탁기관 : 한국 종균협회, 기탁일 : 1984. 12. 4. 기탁번호 : KFCC-10124]로서 화이자 인코퍼레이티드의 배양 채집물중에서 확인된다. 상기의 와이 리폴리티카는 제이. 알. 드재브의 특허원 제539,363호(1983년 10월 6일)의 것이다. 벡터 pBR 322중의 와이. 리폴리티카의 유전자 라이브 러리의 생성에 이용되는 미생물, 이. 콜라이 Mc 1061은 카사다반등(Casadaban et al., J. Mol. Biol.138, 179∼207(1980))에 의해서 밝혀졌다. 대장균 Mc1061은 높은 빈도로 형질전환될수 있으므로 특히 이 목적에 유용하다. 다른 미생물이 이. 콜라이 1061 대신 이용될 수 있다. 안정한 미생물로서 대표적인 것이 이. 콜라이 HB101(NRRLB 11371)과 같은 제한 마이너스이고, 또한 ATCC 33694로서 유용한 이. 콜라이주이며, 이들은 형질전환을 위하여 콤피턴트(competent)세포로 될 수 있다.
로이신 및 우라실 유전자중에서 검출되는 이. 콜라이주(DB6507, ATCC35673 HB101의 Tn5삽입 돌연변이주, 디. 보트스레인르로 부터)는 leuB pyr F74: Tn5 hsd R-M-이고 또한 프롤린을 필요로 한다.
하기 미생물은 이미 기탁되었으며, 영구 보관된 ATCC(록크빌, 미릴랜드, 미국)으로 부터 이용할 수 있다.
ATCC20688(기탁번호 : KFCC-10124)-와이. 리폴리티카 PC-30827
ATCC 20687(기탁번호 : KFCC-10123)-PLD25로 형질 전환된 와이. 리폴리티카 PC-30827
ATCC39464(기탁번호 : KFCC-10126)-pLD25로 형질 전환된 이. 콜라이 JC-355
ATCC20718(기탁번호 : KFCC-10125) pLD55로 형질 전환된 와이. 리폴리티카 PC-30827.
이들 균주는 기탁물의 영속성을 부여해주는 인가된 기탁기구이면서 본 사건이 특허로서 인정되면 대중적으로 쉽게 이용할 수 있게 해주는 록크빌, 메릴랜드 거주의 ATCC에 있는 부타페스트 조약하에 기탁되었다. 37 CFR 1.14 및 35USC 122 및 본건이 출원된 국가의 외국특허법에 따라 미합중국 상표 청장이 지정한 사람은 이 기탁물을 본 사건의 계류기간 동안 사용할 수 있다. 기탁된 미생물의 공공이용에 관한 모든 제제조처는 본 특허가 인정됨에 따라 필연적으로 풀릴 것이다.
와이. 리폴리티카 ATCC 20688(기탁번호 : KFCC-10124)의 분류학적 연구는 하기의 설명을 제시한 닥터엘. 에이치. 항(L.H. Huamg)에 의해 이루어졌다. 이용되는 배지 및 방법은 제이. 로더(J. Lodderin "TheYeasts", second edition, N. Holland Publishing Co., Amsterdan, 1970)에 의해서 제시된 것들이다. 균종 칸디다 리폴리티카[또한 반 데르 발트 및 폰 아르크. 안토니 반 루벤후크에 의해 삭카로 마이콥시스 리폴리티카로서 알려지고 : 최근에 야로비아 리폴리티카(빅커함 등)로서 분류됨 46,517∼521, 1980]를 위한 배양물 CBS 599를 비교용으로 준비하였다.
균주 PC-30827(기탁번호 : KFCC-10124)은 로이신 및 우라실을 필요로 하기 때문에(제이. 알. 드제브)149mg/L 및 20mg/L의 농도에서 로이신 에틸 에스테르 및 우라실 모두를 각각 하기의 정해진 배지중에 가하였다 : 탄소 화합물의 동화용 기본 배지, 질산 칼륨의 동화용 육즙(broth), 증식용 비타민-프리(free) 육즙 및 증식자극에 대한 비타민 효과 테스트용 육즙. 로이신과 비교하기 기한 로이신 에틸 에스테르를 탄소원으로서 이용한다. 다른 배지는 유기 물질이며 지지체없이 증식을 증진시켜야 한다. 균주 CBS-599에서는 지지체가 있거나 또는 없는 상기에서 정의한 배지가 또한 이용되었다.
하기 설명에서와 같이, 배양물은 대부분의 배양적 및 형태학적 특징을 지니고 있다. 약간의 차이가 확인되었다. 예를들어 글루코즈-효모 추출물-펩톤 한천상의 균주 CBS-599의 스트릭크(streake) 배양물을 약간 거칠게 또는 약간 주름지게 하고 균주 PC-30827의 직선배양물은 정교하게 주름잡았다. 균주 PC-30827은 옥수수가루 한천상에서 중식이 불량하게 나타났으며 균주 CBS-599와 비교할 때 진짜 균사를 거의 생성하지 못했다.
균주 CBS-599의 경우에, 정의된 배지가 로이신 에틸 에스테르 및 우라실로 보족된 결과는 시트르산이 보족없이 이용되는 것을 제외하고는 보족이 없는 그것과 동일하지만 보족을 함유하는 배지중에서와는 동일하지 않다. 이것은 보족이 탄소 또는 질소원으로서 이용되지 않음을 나타내며, 따라서 균주 PC-30827(기탁번호 : KFCC-10124)용의 정의된 배지를 더 이용할 수 있다.
균주 CBS-599와 비교할 때, 균주 PC-30827(기탁번호 : KFCC-10124)은 석신산, D-글루시톨 및 글리세롤 상에서 비교적 높은 증식을 나타냈으며 : 비타민 부재 배지 및 살리신상에서는 낮은 증식을 나타내었고 : 증식을 자극하기 위한 티아민 상에서 높은 증식을 나타냈다. 균주 PC-30827(기탁번호 : KFCC-10124)은 L-소르보즈상에서 증식하지 않는 반면 균주 CBS-599는 L-소르보즈상에서 증식하였다.
균주 PC-30827(기탁번호 : KFCC-10124) 및 CBS-599사이의 생화학적 실험에서 여러가지 다른 점이 나타났다. 돌연변이 균주 PC-30827(기탁번호 : KFCC-10124)은 생화학적 실험의 대부분을 CBS-599형의 배양물과 공유하였다. 그 결과를 효모(참조 Ed. J. Lodder, 1970)중의 반우덴 및 버클리(Van Udem and Bu-ckley)가 제기한 칸디다(Candida)종에 적용할 경우에, 두 균주의 각각은 칸디다 리폴리티카-불완전한 상태의 야로비아 리폴리티카에 속한다.
[균주 CBS-599]
글루코즈-효모추출물-펩톤 수상에서의 증식
20℃에서 3일 후에 세포는 난형(ovoid)으로 되고, 하나 내지 세개의 버드(bud)로 난형을 신장시킨다. 난형세포는 5-16 × 3-7μm이며, 신장된 세포는 30μm까지 이다. 슈도마이셀리움이 존재하고 : 펠리클(pellicle)이 존재하며 : 앙금이 생긴다.
글루코즈-효모추출물-펩톤 한천상에서의 증식
28℃에서 한달 후에 배양물에 크림이 생기고, 부풀게 되며 약간 우툴두툴 해지거나 또는 약간 주름이 지고 표면은 혼탁하거나 또는 축축하다.
옥수수가루 한천상에서의 달마우(Dalmau) 평판 배양
증식은 완만하고, 회색을 띈다. 슈도마이셀리움 및 마이셀리움이 존재한다. 하나, 쌍 또는 3개의 난형블라스토스포아(blastospore)가 하이파에(hyphae)슈도하이파에 상에서 종기에 형성되며, 때로 나선형태로 형성된다.
발효 : 글루코즈, 갈락토즈, 수크로즈, 말토즈, 트레할로즈 및 락토즈상에서 네가티브.
탄소화함물의 동화 : 기본 배지(기본 배지에 로이신 에틸 에스테르 및 우라실 첨가)
질산칼륨의 동화(로이신 에틸 에스테르 및 우라실이 존재하거나 존재하지 않음) : 네가티브.
비타민 부재 배지중의 증식(토이신 에틸 에스 테르 및 우라실이 존재하거나 존재하지 않음) : 약하게 증식함.
비타민 자극 증식 : 로이신 에틸 에스테르 및 우라실이 들어 있거나 들어있지 않는 육즙중의 티아민은 증식을 자극한다.
염화나트륨 내성 : 11% 내지 12%
증식의 최대 온도 : 37℃ 내지 45℃
글루코즈-효모 추출물-펩톤 수중의 증식 : 28℃에서 3일 후에 세포는 난형으로 되고, 하나 내지 세개의 버드(bud)로 난형을 신장시키며, 드물게, 타원형이다. 난형세포는 5-14×3-6㎛이며, 신장된 세포는 25㎛까지이다. 슈도마이셀리움이 존재하고 : 펠리클(pellicle)이 존재하며 : 앙금이 생긴다.
글루코즈-효모 추출물-펩톤 한천상의 증식
28°에서 한달 후에 스트릭크(Streake) 배양물에 크림이 생기고, 부풀며, 선명히 주름지고, 표면은 혼탁된다.
옥수수 가루 한천상의 달마우(Dalmau) 평판 배양
증식상태는 나쁘고, 회색을 띈다. 슈도마이셀리움이 드물게 존재한다. 진정한 마이셀리움이 드물게 존재한다. 구상의 블라스토스포아에 하나 또는 쌍의 난형이 종기에형성되며, 때로 그룹으로 형성된다.
발효 : 글루코즈, 갈락토즈, 수크로즈, 말토즈, 트레할로그 및 락토즈상에서 네가티브.
탄소 화합물의 동화 : (기본 배지에 로이신 에틸 에스테르 및 우라실 첨가)
질산 칼륨의 동화 : (+로이신 에틸 에스테르 및 우라실) : 네가티브.
비타민 부재 배지중의 증식 : (+로이신 에틸 에스테르 및 우라실) : 네가티브.
비타민 자극 증식 : 로화신 에틸 에스테르 및 우라실이 들어있는 육즙중의 티아민은 증식을 약간 자극하거나 자극하지 않는다.
염화나트륨 내성 : 11% 내지 12%
증식의 최대온도 : 37℃내지 45℃
와이. 리폴리티카 PC-30827(기탁번호 : KFCC-10124)은 드문 가역 돌연변이 leu2-35를 함유한다. 와이. 리폴리티카 LEU2 유전자는 효소 β-이소프로필말레이트 데하이드로게나제 (ECl.1.1.18)를 코드화하고 이. 콜라이중의 leu8 유전자 및 맥주효모군 중의 LEU2 유전자에 의해 코드화된다. pLD25를 이. 콜라이 JC-355 및 와이. 리폴리티카 ATCC 20688(기탁번호 : KFCC-10124) 각각에 삽입시켜 이. 콜라이 JC-355 및 와이. 리폴리티카 ATCC 20688(기탁번호 : KFCC-10124) 각각에 pLD25를 함유하는 형질전환체를 생성하였다. 그들은 화이자 인코퍼레이티드 컬처 콜렉션을 통해 F.D. 27534 및 F.D. 27533으로 확인되었다. 각각의 형질전환체는 ATCC에 기탁되었으며, 각각 승인번호 ATCC 39464(기탁번호 : KFCC-10126) 및 ATCC 20687(기탁번호 : KFCC-10123)을 취득하였다.
와이. 리폴리티카 균주 NRRL Y-1094, 야생균주(즉, 통상적으로 미생물 분야의 전문가들에 의해 통상적으로 이용되는 균주)로 부터의 크로모좀성 DNA는 헤레포드 등(Hereford et al., cel1 18, 1261∼1271(1979))의 방법으로 얻어졌다.
본 발명의 신규한 플라스미드 pLD25는 직선 pBR 322를 와이. 리폴리티카 크로모좀성 DNA의 Sau 3A부분 분해물과 T4리가제로 연결시킴으로써 구성된다. pBR 322를 CsCl-에티듐 브로마이드 구배중의 원심분리로 분리하여, 세균성 DNA로 부터 공유적으로 가까워진 슈퍼코일드된 pBR 322를 분리하였다. 제한 엔도뉴클레아제 BamHI으로 pBR322의 테트라사이클린 내성 유전자(TCR)내를 절단하여 스티키(sticky) 말단을 갖고 표현형으르서 암피실린 내성(AmpR)이 없어진 직선 pBR322를 제조하였다. 벡터의 겔(아가로즈)전기영동은 세균성 DNA가 거의 부재하는 것으로 나타났다. 이어서 직선 pBR322를 바람직하게는 알카리성 포스파타제로 처리하여 그후의 자가 연결, 예를들어 재폐환 및 벡터 DNA의 이중합체 형성을 방지한다. pLD25의 2차 성분은 야생의 와이. 리폴리티카균주 NRRL Y-1094의 크로모좀성 DNA를 점성 말단 즉, pBR322의 BamHI 절단말단에 보족적인 거의 랜덤한 단편을 생성시키는 제한 엔도뉴클레아제 Sau 3A로 부분 분해시킴으로써 얻어진다. 아가로즈 겔로부터 모아진 4 내지 10kb 범위내의 DNA를 RamHI로 절단되고 알카리성 포스파타제로 처리된 벡터 pBR322와 연결하기 전에 정지된 방법으로 정제하였다.
본 발명의 방법에서는 DNA단편의 크기를 제한하지 않는다. 상기 DNA 단편은 검출할 수 있는 마커, 예를들어, LEU2 유전자의 모두 또는 충분한 부분을 함유한다. 또한, 그들은 이. 콜라이플라스미드, 특히, pBR322의 제한 엔드뉴클레아제 절단에 의해 생성되는 말단에 보족적인 점성 말단을 함유한다. 벡터 DNA 및 와이. 리폴리티카 크로모좀성 DNA의 부분적 Sau 3A 분해물은 코팩터(cofactor)로서 ATP의 존재하에서 T4리가제로 연결된다.
연결 혼합물은 먼저 아주 높은 형질전한 빈도릍 나타내고 hsd R-hsd M+인 이. 콜라이 Mc1061를 형질전환시키고(Casdabam et al., J. Mol, Biol. 138, 179∼207, 1980). 따라서 상기 이. 콜라이 중에 와이. 리폴리티카 유전자 라이브러리를 제공한다.이. 콜라이 Mc1061의 암피실린-내성 형질전환체는 암피실린과 L한천 펑판상에서 함께 증식되어 수득된다. 모아진 배양물을 1ℓ의 암피실린 함유 배지중에서 증식시켰다. 혼합된 플라스미드를 표준방법으로 분리하여 유전자 라이브러리를 생성하였다. 상기 라이브러리의 샘플을 이 콜라이 Jc-355내로 형질 전환시켰다. 형질전환체는 암피실린 내성을 기준으로 선택되었다. 이어서 이들 형질 전환체를 로이신이 부족한 합성 배지에서 복제시켰다. 또는, 형질전환 혼합물은 암피실린을 함유하고 로이신이 부족한 합성 배지상에 직접 피복할 수 있었다. 그렇게 선택된 여러가지 형질전환체로 로이신 기본유기영양(prototroph)이었다. 상기 형질전환체중의 플라스미드는 표준방법으로 분리되며 pLD25로서 명명되었다.
희귀한 로이신 기본 유기영양의 형질전환체로 부터 만들어지고 Hind Ⅲ 및 Sal I으로 분해되어 분석된 플라스미드 미니제제는 약 6.6kb의 삽입 사이즈를 나타내는 2개의 거대 단편 및 pBR322의 거대 3.7kb 단편을 함유함이 발견되었다. 또한, 소 단편(pBR322의 Sal I개소로 부터 제3도에 나타낸 삽입물의 보다 가까운 Sal I부위까지)이 발견되었다. 플라스미드 pLD25의 사우던 블롯 하이브리드화(Southern blot hyb-ridizations)(southern, J. Mol. Biol 98, 503∼517, 1975)와 와이. 리폴리티카의 Eco RI-분해크로모좀성 DNA의 하이브리드화와의 비교는 클론화 삽입체 내부의 세개의 단편이 크로모좀성 DNA에서 확인될 수 있음을 보여준다.
인택트 pLD25 및 kpn I-절단 pLD25로 와이. 리폴리티카를 형질전환시키는 실험으로 그들이 융합 또는 독립적으로 복제하는 pLD25를 함유하는지를 결정하였다(LEU2-함유 플라스미드). 크로모좀성 DNA는 로이신 기본유기영양의 형질전환체 및 모 와이. 리폴리티카 ATCC20688(기탁번호 : KFCC-10124)로 부터 제조된다. DNA 샘플을 Hind Ⅲ로 절단하여, 0.5% 아가로즈 겔상에 넣고, 방사성 pBR322를 이용, 사우던 블롯 기법으로 분석하여 샘플 중의 플라스미드 pLD25의 존재를 측정하였다. 모 와이. 리폴리티카균주와 프로브사이의 동종성은 발견되지 않았다. pLD25(pBR 322 단편내의)에는 하나의 Hind Ⅲ 개소가 있고, 와이. 리폴리티카 단편에는 없기 때문에, pLD25가 형질전환체증에서 독립적으로 복제될 경우에는 pLD25 크기의 하나의 밴드(약 11kb)가 나타날 것이다. 그와 같은 밴드가 없으면 형질전환체 모두가 융합체이다. 환상, 직선화 및 갭이 생긴 직선화 플라스미드는 동종의 크로모좀성 서열과의 재조합에 의해서 와이. 리폴리티카를 형질전환시킬 수 있다. 그러나, 형질전환 빈도는 인택트플라스미드-처리 세포에서 보다 Kpn Ⅰ-Cut 절단 플라스미드-처리 세포에서 훨씬 높으며 더욱, 맥주 효모균에 대해 오르-위버 등에 의해 기슬된 바와 같이(Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 6354∼6358, 1981) 융합성 형질전환이 와이. 리폴리티카에서도 일어났음을 나타낸다. 상기에 언급된 사우던 블롯은 직선 분자로 부터 유도된 융합 형질전환체의 구조가 환상분자(즉, 플라스미드)로 부터 유도된 형질전환체의 구조와 동일하게 작용함을 보여준다. 더욱 사우던 블롯실험은 인택트-플라스미드 처리물로 부터 생성되는 희귀한 형질전환체의 몇가지가 pBR322-하이브리드화 물질이 부족되고, 유전자 전환 또는 이중 제조합이 발생되었음을 보여 주었다.
본 명세서에 기술된 형질전환 시스템의 유용도는 환을 완성할 수 있는 와이. 리폴리티카로 부터 이. 콜라이까지 상기 형질전환 시스템중의 기술된 융합 플라스미드의 슈틀링(shuttling)에서 입증된다. 더우기, 융합성 슈를 벡터(Shuttle vector)는 유전자 라이브러리를 구성하고, 이어서 야로비아 리폴리티카 수용균중에서 선택 또는 스크리닝함으로써 목적하는 와이. 리폴리티카 유전자를 클로닝할 수 있다.
[실시예]
물질 및 방법 :
Bam HI, Sal I, Bgl Ⅱ, Hind Ⅲ 및 Sau 3A를 포함한 대부분의 제한효소는 T4 DNA리가제 및 이. 콜라이 폴리머라제 I과 같이 뉴 잉글랜드 바이오랩스(NEB)로 부터 구입된다. Apa Ⅰ은 베링거 만하임(Boehringer-Mannheim)으로부터 구입된다. 모든 효소를 각각의 제조업자가 밝힌 그들의 용도에 적합한 조건에 따라 사용하였다. Sal Ⅰ은 또한 세균성 알카리 포스파타제, Kpn I 및 Xho I과 마찬가지로 베세스다 리서치 라보라트리즈(BRL)로 부터 얻어졌다. 세균성 알카리 포스파타제를 직선 플라스미드 DNA μg당 약 100단위로 65℃의 Bam HI 검정 완충액중에서 2시간 동안 사용하였다. 제한분해는 트리스-보레이트-EDTA 완충액을 사용하여 액침 0.8% 아가로즈 겔중의 전기영동으로 분석하였다(maniatis et al., "Molec-ular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982).
배지 :
이. 콜라이가 풍부한 배지는 리터당 10g 박토-트립톤, 5g 박토-효모 추출물 및 5g NaCl을 함유하는 L육즙(pH7.5)이었다. 이. 콜라이가 최소인 배지는 0.33% 덱스트로즈를 함유하는 56염이었다(Low, J. Bact-eriol 113, 798∼812, 1973). 아미노산 또는 염기는 필요에 따라 50μg/ml로 보충되었다. 박테리아(세균)는 37℃에서 증식시켰다.
효모가 풍부한 배지는 1% 박토-효모 추출물, 2% 박토-펩톤, 및 2% 덱스트로즈를 함유하는 YPO였다. 효모가 최소인 배지, SD는 아미노산이 부재인 0.67% 박토-효모 니트로겐 염기 및 2% 덱스트로즈를 함유하였다. 합성 완전 배지는 모르타르 및 막자(pestle) 중에서 다음 물질을 갈아 만든 870mg/ℓ의 분말 스톡보충물을 함유한다 : 각각 2g의 아데닌 설페이트, 우라실, 트립토판, 히스티딘-HCl, 아르기닌-HCl 및 메티오닌, 3g 티로신, 6g 로이신, 5g 페닐알라닌, 20g 스레오닌, 3g 리신, 영향 실험 또는 선택을 위하여, 적합한 성분은 완전 배지에서 빼버렸다. 와이. 리폴리티카를 28℃에서 증식시켰다.
와이. 리폴리티카 크로모좀성 DNA의 분리 :
a. 클로닝 퀄리티 DNA. 야생균주 NRRL Y-1094를 28℃에서 진탕 페른바흐(Fernbach) 플라스크중의 4×300ml의 YPD중에서 ml당 1 내지 2×108세포로 증식시키고, 이어서 신선한 상태의 배양기에 15μl로 접종하였다. 하기의 모든 세포조작은 28℃ 또는 실온에서 수행하였다. 세포를 원심분리로 모으고, 50ml 1M NaCl 중에서 세척한 다음, 다시 원심분리시켰다. 이어서 50ml의 0.2M 트리스(하이도록시메틸)아미노메탄-HCl(트리스-HCl) pH8.5, 0.02M 에틸렌 디아민테트 라아세트 산 (EDTA), 1M NaCl 및 0.1M 2-머캅토 에탄올 중에서 15분간 "예비-스페로플라스팅(pre Spheroplating)" 배양시키고 원심분리로 모았다. 세포거환을 지모리아제 5000(Zymolyase 5000) (Kirin Breweries, Japan) ml당 1mg을 함유하는 40ml의 1M NaCl중에 재현탁시키고 45분간 배양시켰다. 이때에, 물로 희석함에 따른 세포용해에 의해 세포의 90% 이상이 스페로플라스트로 전환되었음을 현미경으로 탐지하였다.
스페로플라스트를 원심분리하여 총 16ml 1M NaCl중의 4개튜브에 재현탁시켰다. 0.1mg/ml프로테인아제 K를 함유하는 40ml의 용해(lysis)완충액[50mM 트리스 PH6.8, 100mM NaCl, 100mM EDTA, 0.5% 나트륨 도데실설페이트(SDS)]를 가하고, 용해물을 37℃에서 1.5시간동안 배양시켰다. 용해물을 동일 용적의 페놀 : 클로로포름(1 : 1)으로 추출하였다. 이어서 9000rpm에서 원심분리하여 상을 분리하고, 수상을 다시 페놀-클로로포름으로 추출하였다. 최종의 수상을 2용적의 에탄올과 혼합하여 DNA의 거대 침전물을 생성시켰다. 액체를 버리고, 진공 건조시키기 전에 거환을 70% 및 100% 에탄올로 행구었다. 건조건환 ' 65℃의 8ml TE(100mM 트리스-HCl pH8,1mM EDTA)중에 재용해시키고 이어서 300μl의 RNAse A(1mg/ml. 5분 증류)로 37℃에서 1시간동안 RNAse 분해시켰다. 이 물질을 페놀-클로로포름으로 2회 추출하고 상기에서와 같이 에탄올로 침전시켰다. 진공건조시키기 전에 최종 침전물을 에테르로 헹궜다.
DNA 거환을 상기와 같이 TE중에 재용해시키고 2ml 100XTE를 가하고 이어서 29.04g에 물을 가하였다. 이 용액을 37.67g의 CsCl에 가하고, 원심분리튜브로 옮긴다음 VTi 50회전자를 이용하여 벡크만 L8∼70초 원심분리기중, 15℃, 40,000rpm에서 17시간 회전시켰다. 튜브의 기저로 부터 약1.25ml을 함유하는 적하분획으로부터 구배를 모으고 이어서 니들로 채취하였다. 0.5mcg/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 아가로즈겔상에 샘플을 넣고 진행시킴으로써 분획의 DNA를 검정하였으며, 분획 16,17 및 18(26은 제외)을 보관하였다. 이들 DNA-함유 분획을 모아서, 1×TE의 4개 변화에 대해 투석시키고 에탄올로 침전시켰다. DNA를 0.6ml 1×TE중에 재용해시키고 260nm에서의 흡광도측정으로 120μg의 DNA를 함유함을 확인하였다.
b : 사우던 블롯용 DNA 우리들은 SDS 스테로 플라스트 용해 및 맥주효모균 미니-프렙법에 의한 칼륨아세테이트 처리(Compilied in Sherman et al "Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1981)가 와이. 리폴리티카 DNA를 얻는데는 편리함을 발견하였다.
플라스미드 DNA의 제조. 세균성 플라스미드 DNA를 홀메즈등(Holmes et al., Amal. Biochem. 114, 193∼l97(1981))의 급증류법으로 제조하였다. CsCl-에티듐브로 마이드 구배중의 그후의 원심분리는 대규모 제조시에만 수행하였다. DNA 제제는 멸군 TE완충액중 4℃에서 보관하였다.
이. 콜라이형질전환. 다게르트등(Dagert et al., Gene 6, 23∼28(1979))의 CaCl2법을 이용하였다. 일야로 CaCl2-처리된 세포 및 짧게 처리된 세포를 형질전환에 이용하였다.
사우던 블롯 실헌. DNA니트로셀룰로즈(사우던 1975)에 전달된 DNA를 6×Scp 완충액(20×Scp 스톡은 2.0M NaCl, 0.6M Na2HPO4, 및 0.2M EDTA pH6.2), 1% 사크로실 및 40μg/ml 변성된 송아지 흉선 또는 이. 콜라이 DNA중의 32p-표지 "닉크 전달된"프로브에 하이브리드화시켰다. 마니아티스등의 닉크 전달법이 이. 콜라이폴리머라제 I과 함께 사용되었다.
와이. 리폴리티카 DNA의 Sau 3A 부분 분해물의 제조
프로토콜에 따라 37℃에서 0.5시간동안 DNA μg당 0.05, 0.1, 0.2 및 0.4효소단위를 이용하여 각각 4개의 튜브에서 약 15μg의 이 DNA를 제한효소 Sau 3A(뉴 잉글랜드 바이오랩스)부분 분해하였다. 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중단시키고 이어서 0.8% 준비된 아가로즈 겔상에 놓았다. 4 내지 10킬로 베이스사이즈 범위내의 DNA(베세스다 리서치 랩스로부터 얻어지는 Hind Ⅱ- cut λ 사이즈 표품과 비교시)를 겔로부터 모아서 전기용출시키고, DE 52칼럼상에서 정제하고(Yang et a1., Methods in Enzymology,68,. 176, 1979) Bam HI-Cut. 알카리 포스파타제-처리 벡터 pBR 322와 연결하기 전에 에탄올로 침전시켰다.
벡터 PBR 322중의 와이. 리폴리티가 유전자 라이브러리의 구성
이. 콜라이주 MC 1061을 형질전환시키기 위해 약 1μg의 DNA를 함유하는 연결 혼합물을 사용하여(Cas-adaban et al., J. Mol. Biol. 138, 179∼207, 1980) 와이. 리폴리티카 유전자 라이브러리를 제작하였다. 형질전환 혼합물은 10μg/ml 암피실린이 함유된 L 한천 평판성에 약 1.4×104콜로니를 생성하였다. 50콜로니를 한개의 평판상에 놓고 5mg/ml 테트라사이클린으로 내성실험을 하기 위하여 복사피복하였다. 44(88%)가 민감한 것은 그들 대부분이 pBR 322의 tetR유전자를 차단하는 Bam HI 개소중의 삽입을 함유하고 있음을 나타낸다. 랜덤하게 선택된 ampR콜로니 18로부터 미니-규모의 플라스미드 제제를 Hind Ⅲ 및 Sal 이 중분해 및 Bam HI 분해의 제한효소 분해로 실험하였다. 10개의 플라스미드는 평균 약 7킬로베이스의 삽입체를 가졌다.
약 1.4×104대장균 형질전환 콜로니를 함유하는 48 암피실린 평판을 LB 및 10μg/ml 암피실린에 복사피복하였다. 복사물을 각각 5ml 0.85% NaCl로 세척하였다. 모아진 세포를 원심분리로 덩어리로 만든 다음 11ml LB 및 2.5ml 80%글리세롤중에 재현탁시켰다. 페른바흐(Fernzach) 플라스크중의 1ℓ의 LB 및 10μg/ml 암피실린을 함유하는 2개의 배양물에 각각 4ml의 모아진 세균을 넣어주고, 나머지 세균은 -70℃에서 보관하였다.
PBR 322중의 Sau 3A 부분 분해 단편의 와이. 러폴리티카 유전자 라이브러리로서 나타내지는 플라스미드 DNA를 준비하는데 상기 배양물을 사용하였다.
이. 콜라이 돌연변이주종의 유전자 라이브러리 스크리닝
서로 다른 유전 마커용의 여러가지 이. 콜라이종 돌연변이주를 유전자 라이브러리로 형질전환시켰다. 유전적 보족물을 얻기 위하여, 2개의 주요 인자가 필요하다 : (1), 상응하는 와이. 리폴리티카 유전자는 라이브러리중에 적어도 하나의 플라스미드상 인택트를 함유해야 하며 : (2), 와이. 리폴리티카 유전자는 이. 콜라이 세포중에서 충분하게 작용할 수 있어야 한다. 적절한 배지상에 각각의 마커를 위한 직접 선택 또는 암피실린 내성을 위한 개시 선택에 의해서 라이브러리를 스크리닝하고 이어서 선택성 배지상에 복사피복하였다. 각각의 유전 마커를 실험하기 위하여, 적어도 105형질 전환체를 실험하였다. 균주 LEU 2유전자를 연속적으로 콜론시키는 데에 균주 JC 355를 사용하였다.
선택적 배지상에서 증식하는 어느 이. 콜라이 콜로니를 "재-형질전환"실험으로 더욱 실험하였다.
이 실험을 위하여, 선택적 배지상에서 증식하는 균주의 5ml 배양물로부터 플라스미드를 제조하였다. 이어서 플라스미드 미니 프렙을 모체, 돌연변이 이. 콜라이종을 형질전환시키기 위해 사용하였다. 선택적 배지상에 많은 암피실린-내성 형질전환체가 존재(콜로니는 소수이거나 존재하지 않음)하는 것으로 원래의 콜로니가 목적하는 와이. 리폴리티카 유전자를 함유하지 않으며 대부분이 기본 유기영양성의 돌연변이 때문에 증식하였다고 결론지을 수 있다. 또한 모든 암피실린 내성 콜로니가 시험되는 유전자용 선택 배지상에서 증식하는 경우에는, 기원 콜로니로부터 얻어지는 플라스미드가 이. 콜라이 돌연변이를 보족하는 삽입체를 함유하고 있다고 결론지을 수 있다. pBR 322로의 삽입체를 함유하는 JC 355(LeuB 6)의 7로 이신-독립 형질전환체 모두가 발견되었다. 이들 2개의 콜로니로부터 얻어지는 플라스미드 미니-제제는 재형질전환 실험에서 100%(37/37 및 31/31) 암피실린-내성 로이신 기본 유기 영양의 형질전환체를 생성하였다. 이 플라스미드를 pLD 25라 명명하였다.
이. 콜라이 leuB 6-보족 DNA는 와이. 리폴리티카로 부터 유래되었다는 증명.
pLD 25로부터 얻어지는 삽입 DNA가 와이. 리폴리티카로부터 유래되었다는 것을 입증하기 위하여, 사우던(1975) 블롯 실험을 수행하였다. 와이. 리폴리티카 총 DNA의 신규한 제제는 마지막 CsCl 구배공정을 거치지 않고 제조되었다. 와이. 리폴리티카 DNA의 EcoRI의 분해패턴은 pLD 25중의 삽입체의 내부 3개 밴드와 동일하게 나타났다(제2도).
pLD 25중의 삽입체의 특징화
pLD 25의 부분 제한지도는 여러개의 통상효소를 사용하여 유도하였다(제3도). 플라스미드중에 함유되는 와이. 리폴리티카 DNA의 총량은 약 6.6kb로 측정되었다.
호질전환프로토콜. 맥주 효모균의 형질 전환에 이용되는 담체 DNA로 리튬 아세테이트법(Ito et al., J. Bacterial 153, 163∼168, 1983)의 변형이 와이. 리폴리티카 형질전환에 적용되었다. 로그페이스 배양물 3-10×107세포/ml가 통상 로그페이스(1×107세포/ml) 배양물보다 더 많은 형질 전환체를 생성하였다. 50ml YPO 배양물을 덩어리로 만들어서 10ml의 10mH 트리스, 1mM EDTA(pH7.5)중에 재현탁시켰다. 그들을다시 덩어리로 만들어서 2 내지 3 용적의 상기 완충액 및 0.1M 리튬 아세테이트중에 재현탁시키고 28℃의 신규한 브룬스윕크 롤러 드럼(Brunsalick roller drum)상에서 1시간동안 가볍게 혼합하였다. Li-처리된 세포를 0.1 내지 1.0ml의 세포. 1μg의 형질전환용 플라스미드 및 50μg 이형담체 DNA(사이즈범위는 아가로즈 겔상에서 0.5 내지 9kb로 나타났다)를 함유하는 여러가지 형질전환용 튜브로 분리하였다. 형질전환튜브를 28℃에서 30분간 방치하였다가 7용적의 PEG 시약(40% 폴리에틸렌 글리콜 4000, 0.1M LiAc, 10mM 트리스, 1mM EDTA (pH7.5)-필터 여과된 것)을 첨가하였다. 첨가하고 28℃에서 1시간 후, 열펄스(통상적으로 37℃에서 5분간)를 사용하였다. 마지막으로 세포를 3000rpm에서 2분간 원심분리시키고 물중에 재현탁시킨 다음, 적절한 배지상에 피복하였다.
pLD 28의 구조
각각 2μg의 pLD 25및 YEp 24(ATCC 37051)의 혼합물을 50μl의 Sal I완충액중의 6.25단위 Sal I과 함께 37℃에서 1.5시간동안 배양시켰다. 이어서 분해물을 동일 용적의 페놀로 추출하고 계속해서 에테르(1.5ml)로 3회 추출하였다. DNA를 충분량의 염화나트륨 및 절대 에탄올을 가하여 침전시킴으로써 0.1M 염화나트륨 및 70% 에탄올 농도를 만들었다. DNA를 회수하여 동일용적의 TE완충액중에 용해시켰다. 이어서 10μl의 DNA용액을 20μl반응용적중의 T4 DNA리가제로 14℃에서 1시간 처리하였다. 목적하는 재조합플라스미드의 선택은 하기 공정에 따라 이. 콜라이 DB 6507을 형질전환시켜 수행하였다. 형질전환 혼합물을 트레오닌, 프롤린 및 로이신(우라실은 제외)을 함유하는 11 이. 콜라이 합성배지 평판상에 피복하였다. 평판당 100 콜로니 이상을 수득하였다. 생성된 형질 전환체를 로이신-결핍 평판에 복사 피복하여 각각의 플라스미드상에 와이. 리폴리티카 LEU2 유전자가 존재하는지를 실험하였다. 로이신을 가하지 않고 서서히 증식하는 그들 콜로니를 단일 콜로니를 위해 암피실린 평판상에 피복하고 테트라사이클린 민감도를 실험하였다. 암피실린 내성이고, 테트라사이클린 민감성인 24콜로니를 미나-플라스미드 제조에 사용하였다. 플라스미드 DNA제제를 분석, Sdl I로 분해시켜 2개의 기대밴드(YEp 24로부터 7.5kb, LEU 2로부터 5.3kb)를 얻었고 Eco RI 분해로 5개의 기대밴드(제6도)를 얻었다. 2개의 플라스미드는 적절한 패턴을 갖는다. 첫번째 플라스미드를 보관하였으며 pLD28로 명명하였다.
pLD25 또는 pLD28의 어느 것보다 더 작은 LEU2단편을 갖는 pLD40/플라스미드의 구성
약 25μg의 pLD 25를 200μl중의 제한효소 20단위로 처리함으로써 pLD25의 부분적 EcoRI 분해를 수행하였으며 9,12,15,18 및 21분에 분취량을 채취하였다. 각각의 시점에서, 20%의 총 용적을 33mM EDTA를 함유하는 겔 샘플 완충액 중에 넣고(희석후에) 반응을 중단시켰다. 겔상에서 진행하였으며 목적하는 밴드(2.3kb λ Hind Ⅲ 사이즈-표품보다 약간 천천히 이동하는) 면도날로 절단, 회수하였다. 그 밴드를 투석백 (bag)중에서 전기용출시키고 미니칼럼 (Schleicher and Schuell Elutip-D)상에서 정 제하였다.
LEU2-함유 밴드를 클론화하는데 사용되는 벡터는 EcoRI-분해된, 세균성 알카리 포스파타제-처리된 pBR 322였다. 벡터 및 삽입 DNA를 T4 DNA 리가제와 결합시키고 생성되는 혼합물을 사용하여 이. 콜라이종 MC 1061을 양피실린 내성으로 형질전환시켰다. EcoRI 제한엔도뉴클레아기로 분해시킴으로써 플라스미드 미니-제제를 실험하였다. 처음 34 제제중의 4개가 목적하는 삽입체를 함유하였다. 각각의 플라스미드중의 삽입체의 방향을 실험하기 위하여, Hind Ⅲ 및 Xho I로 이중분해하였다. 3개는 pLD 40의 방향이었고(제7도). 하나는 역 방향이었다. 그것을 pLD41로 명명하였다. 이들 두개의 플라스미드를 이. 콜라이 JC355로 형질전환시켜(거대 규모 제제를 MC1061중에서 제조한 후에) 와이. 리폴리티카 LEU2 유전자의 발현을 실험하였다. 놀랍게도, pLD40을 함유하는 형질전환체는 로이신 결핍 배지상에서 월등한 증식을 나타내었으나(pLD25 또는 pLD28을 함유하는 형질전환체보다 더 좋은) pLD41을 함유하는 형질전환체는 로이신을 가하지 않고는 증식하지 않았다. 이 실험용의 세균성 완전배지는 56/2와 함께 비타민 B1, 글루코즈, 히스티딘, 아르기닌, 메티오닌, 로이신 및 20μg/ml 암피실린으로 이루어졌다. pLD40중의 LEU2유전자의 전사는 디. 스투버 및 에이치. 부야르드(D. stuber and H. Bujard)(1981, Proc. Natl. Acad. Sci., 78:167∼171)의 카운터 -글락와이즈 프로모터 P1(Counter-Clockwise Promotor P1)에 의해서 촉진되었다. pLD25 및 pLD28(pLD40과 비교할 때)중의 와이. 리폴리티카 LEU2 유전자의 보다 낮은 수준의 세균성 발현은 와이. 리폴리티카 DNA의 단편이 약한 세균성 프로모터로서 작용하기 때문일 수 있다.
와이. 리폴리티카 leu2돌연변이주를 pLD25로 형질전환. 제이. 알. 드제브에 의해 구성된 와이. 리폴리티카 균종 PC-30827(MATA leu 2-35 Ura 3-11) ATCC 20688(기탁번호 KFCC-10124)을 pLD25중의 클론화된 LEU2 유전자의 수용균으로써 사용하였다. 증식의 후기 단기 배양물은 초기의 로그 상 세포보다 더 많은 형질전환체를 생성함을 알 수 있었다. 이 사실은 약 동일 수의 후기 상 세포에 대한 초기 상 세포를 DNA로 처리하고 로이신-결핍 평판상에 피복할 경우에도 마찬가지였다. 유일한 절단 개소의 절단 또는 와이. 리폴리티카 DNA 중의 소 갭(Bal Ⅱ-Cut)을 이탈시킴으로써 직선화된 플라스미드는 인택트 pLD25 또는 pBR322중의 Hind Ⅲ 제한 개소의 절단에 의해서 직선화된 플라스미드보다도 더 많은 형질전환체를 생성하였다. 이들 후자의 결과는 오르-웨버 등이 개발한 맥주 효모균중의 융합성 형질전환 시스템과 유사하다. 형질전환중에 이용되는 음파 파쇄된 대장균 DNA를 pLD25에 가하는 공정은 거재 분자량 또는 담체부재 DNA부가의 경우 보다도 더 많은 형질전환체를 생성하였다. 세포와 DNA 및 폴리에틸렌 글리콜의 배양에 따른 가열기간 및 온도의 미소한 차이는 형질전환체의 생성에 거의 영향을 주지 않는 것으로 나타난다. 형질전환체의 안전성. 야로비아 리폴리티카 ATCC-20687(기탁번호 : KFCC-10123)중의 pLD25를 함유하는 형질전환체 콜로니를(본 명세서에서는 DL10으로 나타내었다) 단일 콜로니로 분리하기 위하여 YPD 평판상에 피복하고 이어서 비선택적으로 YPD 평판상에서 증식시켰다. 생성된 YPD 배양 평판을 로이신-결핍합성 배지상으로 복사시켰다. 약 50의 잘-분리된 콜로니 모두는 로이신 결핍이었고, 형질전환체의 안정성을 입증하였다.
pLD25의 융합 검출을 위한 사우던 블릇
와이. 리폴리티카 형질전환체는 안정하였고 자주 공여체 플라스미드 DNA의 직선화에 의해서 상당히 증가되었다. 이것은 오르-웨버등의 맥주효모균에서 발견된 바와 같이 플라스미드가 공여체 DNA의 말단과 동일한 개소의 크로모좀성 DNA에 융합된 결과로 형질전환체가 생성되었음을 나타낸다. 와이. 리폴리티카 DNA의 Hind Ⅲ 분해의 사우던 블롯 실험(제4도)은 인택트 또는 직선화된 플라스미드로 부터 생성된 형질전환 체중의 pBR322과 동일한 2개의 밴드의 동종체를 나타냈다. 한개의 밴드가 23킬로베이스 λ 사이즈 표품보다 긴 것은 플라스미드가 크로모좀성 DNA로 융합된 증거이다.
와이. 리폴리티카 HISI 유전자의 클로닝(cloning)
유전자 라이브러리 구성. 벡터 YEp 24 (Botstein et al., Gene 8, 17∼24, 1979)를 BamHI으로 분해하고 pER322에서 상기 기술한 바와 같이 알카리 포스파타제로 처리하였다. 연결반응에 사용된 삽입 DNA는 상기와 같이 와이. 리폴리티카 NRRL Y-1094로 부터 얻어진 와이. 리폴리티카 크로모좀성 DNA의 완전한 BamHI 분해물이었다. 크로모좀성 DNA 분해물을 연결하기 전에는 크기-분할하지 않고, 페놀만으로 추출하였다. 이. 콜라이종 MC1061의 약 27,000암피실린-내성 형질전환체 콜로니의 모두를 연결 생성물을 이용하여 수득하였다. 이들 모아진 형질전환체 콜로니의 배양물로부터 얻어진 플라스미드 DNA를 YEp 24중의 와이. 리폴리티카의 Bam HI 단편 라이브러리로서 분해하였다. 삽입 빈도는 95%(19/20 형질전환체는 테트라사이클린-민감성을 나타냈다)였고, 평군 삽입 사이즈는 4.2kb였다.
HIS1 유전자의 분리. 돌연변이주 이. 콜라이 유전자를 보족하는 와이. 리폴리티카를 발견하기 위해서 많은 다른 대장균 영양요구 변이주를 형절전환 시키는데에 Bam HI 라이브러리를 사용하였다. 이. 콜라이 hisG1 돌연변이주 AT2535의 2개의 형질전환체 콜로니(#4517 대장균 제네틱 스톡 센터(예일 유니버시티)로서 얻어진것)를 히스티딘이 부족하고 암피실린이 함유된 합성 배지상에서 분리하였다. 콜로니는 벡터중의 약 4kb의 삽입체로 이루어진 동일한 플라스미드 pLD21을 함유하였다. 재형질전환 실험은 복제에 의해서 허스티딘-독립성으로 측정된 pLD21과 419/419 암피실린-내성 형질전환체에서 양성이었다. 사우던 하이브리드화 실험은 두 개의 삽입 단편뿐만 아니라 pLD 21중의 BamHI 삽입체가 BamHI 및 EcoRI 이중분해로 생성되며 유사하게 절단된 와이. 리폴리티카 크로모좀성 DNA의 단편과 함께 이동한 것으로 나타났다.
다른 대립유전자의 HisG가 pLD 21에 의해 보족될 수 있는지를 실험하기 위해서, HisG 유전자로의 TnlO삽입을 함유하는 이. 콜라이 NK5526(이. 콜라이 제네틱 스톡. 센터 #6416)을 플라스미드로 형질전한시켰다. 모든 암피실린-내성 형질전환 콜로니는 히스티딘 오패론(operon)중의 하향 유전자상에서 TnlO의 극성효과를 기대하는 것과 같이 히스티딘이 없는 배지에 복사 피복시킴으로써 느린 증식을 나타냈다. 히스티딘이 결여되고 암피실린이 들어있는 정의된 배지상에서 형질전환체를 직접 선택하는 것이 불가능한데, 이는 강력한 극성 효과때문으르 추측된다.
pLD21증의 와이. 리폴리카티카 DNA삽입은 이. 콜라이의 hisG 돌연변이를 보족할 수 있기 때문에, 우리들은 와이. 리폴리티카 DNA가 이. 콜라이 내에서 기능을 발휘하는 타입중의 와이. 리폴리티카 HIR1 유전자를 함유한다고 결론지었다.
발현상의 방향의 영향. 와이. 리폴리티카 삽입 DNA가 벡터 YEp 24와는 독립적으로 작용하는 지를 실험하기 위해서, BamHI 조각을 pBR322로 서브클론시켰다. 양(兩) 방향의 삽입은 EcoRI 분해패턴에 의해서 결정되었다(제5도). 플라스미드 pLD23, pBR322의 EcoRI 개소로부터 EcoRI개소를 더 갖는 플라스미드는 앞에서 사용된 두 개의 hisG 이. 콜라이 돌연변이주를 부족한 반면에, pLD24, 다른 방향은 돌연변이를 보족하지 못했다. 따라서 플라스미드상의 서열이 이. 콜라이 시스템중의 와이. 리폴리티카 HIS1 유전자의 유효한 발현에 필요하다. pBR322의 tetR프로모터가 필요한 성분이다.
크로모좀성 DNA의 확장된 단편으로 형질전환시킴 LEU2 유전자(플라스미드 분해로 부터 정제된 겔)를 함유하는 와이. 리폴리티카 DNA의 약 5.3 또는 5.4kb Sal I단편이 와이. 리폴리티카 leu2 돌연변이 수용균을 높은 빈도(μg당 1000 형질환체 이상)로 기본유기영양화 시킬 수 있음이 발견되었다. 이 융합은 직선 플라스미드와의 형질 전환으로 다른 종류의 재조합이 일어남을 나타낸다. 그것이 와이. 리폴리티카 DNA부위내에서 목적하는 서열이 삽입되고 또한 숙주로 세균성 벡터를 이입하지 않고도 목적하는 서열이 융합되는 기회를 부여해준다. 이런 유형의 시스템은 알. 로트스테인(R. Rothstein, Methods in Enzymology 101:202(1983))의 맥주 효모균에서 개발되었다. 와이. 리폴리티카 크로모좀성 DNA제제는 거대분자량 및 약간 절단된 분자량 모두가 LEU 2 형질전환체를 얻기 위해 사용되었다.
URA3 유전자의 클로닝
처음 스텝에는 pBR322중의 유전자 라이브러리의 구성을 위해 상기 기술한 공정에 따라 pLD40의 BamHI개소중의 와이. 리폴리티카 DNA의 Sau 3A 부분 분해의 유전자 라이브러리의 구성이 포함된다.
형질전환을 높은 빈도로 얻기 위해, 그리고 라이브러리중의 분자를 LEU2 부위에서 융합시키기 위해, 라이브러러 DNA를 모벡터 pLD40의 LEU2 부위에서 절단하는 효소 Apa I으로 분해하였다(미자의 URA3 유전자 자체가 Apa I개소를 함유하는지가 알려지지 않았기 때문에, 라이브러리 DNA샘플의 부분적 Apa I 분해를 또한 수행하여 그렇게 생성된 분자의 몇개가 한개의 개소에서만 절단 되었음을 입증하였다. 그러나 부분적 분해는 필요하지 않았다).
야로비아 리폴리티카 URA3 돌연변이주를 pLD40 라이브러리로 형질전환시킴
YPD 육즙증의 야로비아 리폴리티카 균주 PC30827(ATCC 20688)의 50ml 배양물, 수용균을 600nm에서 OD 4.9로 증식시켰다. 이것은 상기의 형질전환프로토콜에서와 같이 pH7.5의 TE 왁충액에서 세척하는 공정에 계속되는 0.9ml 세포의 팩된(packed) 용적에 해당하였다. 이어서 TE증의 2배 용적의 리튬 아세테이트중에 현탁시키고, 롤라드럼(rollar drum)상, 30℃에서 1시간동안 약하게 혼합한 다음 3개의 형질전환 튜브에 분할하였다. 각각의 튜브(15ml, 코닝폴리스티렌원리분리 튜브)에 0.9ml의 세포 현탁제, 300μg(100μl)의 음파 파쇄된 이종성 대장균 담체 DNA 및 6μg의 Apa I-처리된 라이브러리 DNA를 넣었다. 형질전환 튜브를 30℃에서 30분간 배양시키고 이어서 7ml의 PEG 시약과 혼합한 다음 한시간 더 배양시켰다. 이어서 세포를 3000rpm에서 2분간 원심분리시킨 후에 37℃의 열속으로 10분간 처리하였다. 각각의 튜브중의 세포를 0.6ml의 멸균수에 재현탁시킨 다음, 로이신이 결핍된 합성 완전 배지의 12평판상에 피복하였다. 3일후에, 로이신 결핍 배지상에 총 약 10,000콜로니가 증식하였다. 형질전환 시험과 평행하게 수행한(그렇지 않으면 형질 전환된 세포와 똑같이 처리된 이들 세포상에서 DNA는 사용하지 않았다) 네가티브 조절 평판은 증식성 로이신-독립 콜로니는 전혀 함유하지 않았다.
36형질 전환 평판을 우라실-결핍성 합성 배지에 복사피복하였다. 우라실-독립인 하나의 콜로니만이 다음날 발견되었다. 이 콜로니를 더욱 진행시켜서 하기와 같은 URA3 유전자를 회수하였다. 2차 형질전환 실험은 플라스미드(즉 로이신-독립성)를 첨가한 세포용 1차 선택보다 차라리 우라실-독립성용 직 적 선택이 가능한지를 결정하기 위해서 수행하였다. 이 2차 실험은 1차와 유사하나 형질전환하는 DNA의 μg당 5000내지 10,000 형질전환체의 보다 높은 형질 전환빈도를 나타냈다. 3개의 부가 URA3 형질전환체는 우라실-결핍 배지상의 직접 선택에 의한 이 실험에서 또한 로이신-선택과 연이은 스크리닝에 의해서 얻어졌다.
플라스미드 pLD55를 함유하는 URA3의 회수
1차 우라실-독립 형질전환체의 50ml YPD 배양물을 일야 증식시킨 다음 상기와 같이 페놀-클트로포름 및 프로테아세법을 이용하여 DNA 제조용으로 모았다. 약3μg(7%)의 이 크로모좀성 DNA제제를 효소 Apa I으로 완전하게 분해하고, 이어서 페놀, 페놀-클로로포름 및 클로로포름-이소아밀 알코올로 추출한 다음 에탄올로 침전시켰다.이 DNA를 80μl 총 용적중에서 T4 DNA 리가제로 연결시켰다. 10μl의 이 반응물을 사용하여 100μl의 콤피턴트 이. 콜라이종 Mc1061을 암피실린-내성으로 형질전환시켰다. 9 형질전환체로부터 이. 콜라이 미 나-플라스미드 제제를 만들어 제한 분석용으로 사용하였다. 절단가능한 DNA를 생성하는 모든 7가지 제제는 호소 Apa I 및 EcoRI과 동일한 제한 패턴을 함유하고 있다(제8도). 효소분해가 이루어지기에 충분한 맑기(clean)를 갖추지 못한 것으로 추측되는 2가지 제제는 다른 7가지와 같이 동일하게 이동하는 슈퍼코일드 플라스미드를 지녔다. 회수된 플라스미드는 3개의 다른 밴드외에 pLD40중에 삽입 LEU2의 특징적인 2개의 EcoRI 밴드를 함유하였다.
pLD40중의 URA 3-함유 삽입체를 나타내는(약 5 내지 1kb)겔의 정확성을 위하여 Apa I개소는 결여되었고 2 EcoRI 개소를 함유하였다.
사실 플라스미드가 URA3 유전자를 함유한다는 것을 입증하기 위하여, 재형질전환 실험을 실시하였다. 미니-프렙 Apa I 분해물을 와이. 리폴리티카 수용균을 형질전환시키는데에 이용하였다. 이 형질전환 혼합물의 부분을 우라실 결핍 배지상 및 로이신 결핍 배지상에 각각 약 100형질 전환체로 피복한 평판을 다른 배지로 복사 피복하기 위하여 선택하였다. 로이신-선택 콜로니의 모두는 또한 로이신 독립성이었다. 이 후자의 결과는 타겟 부위에서 형질전환되는 DNA의 퇴화 및 재생에 대한 어떤 가정에 의해 설명될 수 있다(as in Orr-Weaver, et al., Methods in Enzymology 101:228[1983]). 로이신-독립 형질전환체의 모두가 또한 우라실-독립성이기 때문에. LEU2 부위에서 플라스미드의 융합은 Ura3 돌연변이를 보족하고 pLD55로 명명된 플라스미드는 와이. 리폴리티카의 URA3 유전자를 함유하였다.
슈틀링(Shuttling)의 증명
DNA는 상기의 페놀-클로로포름/프로테아제 법에 의해, 단 염화 세슘 구배는 적용하지 않고, 와이. 리폴리티카 형질전환체 및 pLD25(ATCC 20687)로 부터 제조되었다. 분리된 소수 μg의 DNA를 효소 kpn I(형질전환체를 만들기 위해 사용된 동일한 효소)로 분해하고, 페놀로 추출한 다음, 슈라이헤르 및 슈엘 엘루팁-D 미니 칼럼 (Schleicher and schuell Elutip-D minicolum)상에서 정제하고, 이어서 T4 DNA리가제를 사용하여 연결시켰다.
배지(ml당 50μg DNA 이상) 및 저(10μg/ml 이하) 농도에서의 연결은 확인용 세균성 형질전환에서 성공적이었다. 상기와 같이 이. 콜라이주 Mc1061을 암피실린 내성으로 형질전환시키기 위해서 연결 혼합물을 사용하였다. 이. 콜라이 형질전환체 10이상을 모아서 미니-플라스 미드 제조공정을 수행하였다. 이들의 대부분은 pLD25로 제한 패턴에 의해서 확인되는 플라스미드를 함유하였다. 소수가 pLD25의 kpn I개소에서 다른 조각의 DNA 삽입체를 함유하였다. 이들 여분의 조각은 연결동안 직선 벡터로 삽입되는 와이. 리폴리티카 DNA의 다른 kpn I 단편이었다. 이차 실시 예에는 플라스미드 pLD28이 포함되며 와이. 리폴리티카와 맥주효모균 사이의 유전 기능의 차이를 설명하고 있다. 와이. 리폴리티카 균주 ATCC20688(기탁번호 : KFCC-10124)을 Bgl Ⅱ-절단 pLD28로 형질전환시켜, 로이신-결여 합성 배지상에서 선택되는 균주 DL11를 생성시켰다. 우라실-결여 합성 배지에 복사 피복할 경우에, 맥주 효모균 유전자가 상응하는 와이. 리폴리티카 돌연변이를 보족하지 않았음을 입증할 수 있도록(효소 검정 실험은 와이. 리폴리티카 URA3 유전자가 맥주효모군 URA3 유전자와 동일한 효소를 코드화함을 나타내기 때문) 증식이 확인되지 않았다. 회수된 플라스미드가 소 Bg1 Ⅱ 단편이 부족한 경우에 효소 Bgl Ⅱ를 사용하는 것을 제외하고는 상기와 같이 플라스미드를 와이. 리폴리티카로 부터 회수하였다. 와이. 리폴리티카 LEU2 유전자가 맥주 효모균중에서 작용하는지를 실험하기 위해서, 디. 보트스테인'즈 라보라토리에서 구성되고 플라스미드용 숙주로서 널리 사용되는(참조, 예, Guarente and Ptashne 1981 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2199, 유사한 균주는 ATCC 44773 및 ATCC 44774를 이용할 수 있다) 균주 DB745를 pLD28로 형질전환시키고, 우라실-결핍 배지상에서 회수하였다. 맥주 효모균 형질전환체를 로이신-결핍 배지에 복사 피복하여 로이신을 첨가하지 않은 상태에서 서서히 증식함을 발견하였다. 우라실 결핍 평판상에서 보다 로이신-결핍 평판상에서 24 내지 48시간 늦게 형질 전환이 일어났으며, 자주 약간 낮은 형질전환이 일어났다. 따라서, 맥주효모균중의 멀티카피 플라스미드상에서일 경우에. 와이. 리폴리티카 LEU2 유전자는 약하게 작용할 수 있다.
와이. 리폴리티카중에서 작용할 상기 유전자를 찾음으르써 라이브러리로부터 와이. 리폴리티카 유전자를 얻는 방법의 일반성이 와이. 리폴리티카 프로테아제 유전자 및 와이. 리폴리티카 아데닌 유전자의 성공적 형질전환에 의해 더욱 입증되었다.
상기의 pLD40-기저 라이브러리 및 본 발명의 슈틀링 시스템을 사용하여, 와이. 리폴리티카 프로테아제 유전자(XPR2)를 성공적으로 클론화 하였다. 이용된 공정은 URA3의 클로닝에 관한 상기의 공정과 유사하였다. XDR2는 분비된 알카리 프로테아제의 구조 유전자이다. (Sims and Ogrydziak, J. Bacteriol, 145, 404, 1981). 유전 마커 leu2, adel 및 xpr2를 포함하는 와이. 리폴리티카의 수용균주는 표준 유전기술(Og-rydziak et al., Mol. Gem. Genetics, 229, 1978)에 의해서 구조화 되었다. leu2 돌연변이가 본 명세서에 기술되었고, 여러가지의 xpr2 대립유전자 및 adel 대립유전자가 오그리드자크(참조 : Sins and Ogrydziak, loc. cit)에 의해 기탁된 ATCC 승인 No. 46026-46028 및 46067-46070으로부터 이용될 수 있다.
라이브러리는 알. 파커등의 에티듐 브로마이드 부분 분해법에 따라 효소 Bgl Ⅱ를 사용하여 처리되었다. 적당한 양의 Bgl Ⅱ효소, 에티듐 브로마이드 및 사용할 DNA를 결정하기 위하여, μl당 0.005 내지 1μl 농도의 에티듐 브로마이드를 튜브당 4효소 단위를 함유하는 10μl중의 약 1μg 라이브러리 DNA와 함께 사용하였다. 배양시간은 37℃에서 1시간이었다. 에티듐 브로마이드 μ1당 약 0.5μg을 함유하는 튜브는 분자당 하나의 절단이상을 나타내는 좀더 작은 단편을 제작하지 않고도 라이브러리증의 플라스미드의 연결을 많이 생성할 수 있음을 나타냈다. 라이브리러 DNA를 형질전환 시키기 위하여 이 비율의 성분을 감소시켰다. 라이브러리 DNA를 이렇게 처리함으로써 그렇지 않으면 목적하는 융합 개소(LEU2 부위) 및 목적하는 비공지된 유전자(XPR2) 모두가 직선화(Bgl Ⅱ)를 위해 사용되는 효소용 개소를 가지는 경우에 발생할 수 있는 문제를 막을 수 있다. 그렇게 처리된 DNA로부터 얻어진 형질전환체는 게놈의 LEU2 또는 XPR2 부분에서 융합될 수 있다. 상기와 동일한 형질전환법을 이용하여, 우리들은 로이신-결핍 합성 배지상에서 80,000콜로니 이상을 얻었다. 이들을 탈지 우유 인디케이터 평판에 복사-피복하였다(D. Ogrydziak et al. Genetics, 87, 621, 1977) 탈지 우유 평판상에 맑은 대가 형성되는 것을 프로테아제 양성 형질전환체로 인지하였다.
더욱, 와이. 리폴리티카의 아데닌 유전자를 보족에 의해 클론화하였다. 이중 돌연변이주 수용균(leu2 adel)을 상기와 같이 형질전환시키고, ADE1을 분리하기 위해 로이신 독립 콜로니를 배지로 복사피복하였다. ADE1-함유 플라스미드를 형질전환체로부터 회수하고 재형질전환으로 입증하였다.
Claims (23)
- 야로비아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)와 동종의 부분 및 검출할 수 있는 유전 마커(genetic marker)를 함유하는 DNA를 야로비아 리폴리티카내로 이입시킴을 특징으로 하여 야로비아 리폴리티카를 형질전환시키는 방법.
- 제1항에 있어서, DNA가 야로비아 리폴리티카 DNA의 단편을 함유하고, 이 DNA가 야로비아 리폴리티카중에서 검출될 수 있는 방법.
- 제2항에 있어서, DNA가 야로비아 리폴리티카 DNA의 단편을 함유하는 벡터(vector)인 방법.
- 제3항에 있어서, 벡터가 야로비아 리폴리티카 단편을 함유하는 자발적으로 복제하는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 플라스미드이고, 이 단편이 야로비아 리폴리티카증에서 생리학적으로 작용하는 유전자를 갖는 방법.
- 제1항에 있어서, 야로비아 리폴리티카가 야로비아 리폴리티카 ATCC20688 [기탁기관 : 한국 종균협회 기탁일 : 1984. 12. 4. 기탁번호 : KFCC-10124]인 방법.
- 야로비아 리폴리티카의 크로모좀성 DNA와 동종의 부분 및 검출할 수 있는 유전마커를 함유하는 플라스미드 DNA를 이. 콜라이내로 이입시킴을 특징으로 하여, 이. 콜라이내에서 자발적으로 복제하는 벡터를 제조하는 방법.
- 제6항에 있어서, 야로비아 리폴리티카의 플라스미드 크로모좀성 DNA를 이. 콜라이내로 이입시키고 이 크로모좀성 DNA가 야로비아 리폴리티카중에서 검출될 수 있는 선택적 유전마커를 갖음을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 야로비아 리폴리티카 DNA가 이. 콜라이 및 야로비아 리폴리티카 모두에서 작용하는 유전자를 포함하는 야로비아 리폴리티카 DNA 단편을 함유하는 방법.
- 제7항에 있어서, DNA가 야로비아 리폴리티카의 LEU2, HIS1 또는 URA3 유전자를 포함하는 방법.
- 제6 내지 9항중의 어느 하나에 있어서, 이. 콜라이 플라스미드가 복제플라스미드 pBR322를 함유하는 방법.
- (1) 야로비아 리폴리티카 및 이. 콜라이내에서 생리학적으로 작용하고 야로비아 리폴리티카내에서 검출될 수 있는 구조 유전자와, (2) 야로비아 리폴리티카 숙주내로 이입되는 DNA 서열에 접하는 부위에 유일한 제한부위를 갖는 야로비아 리폴리티카 DNA 단편을 이. 콜라이 복제 플라스미드 pBR322로 삽입시킴을 특징으로 하여, 제3도에 도시된 엔도뉴클레아제 절단 지도로 나타내지는 플라스미드 pLD25를 제조하는 방법.
- 플라스미드 pBR322를 제한효소로 직선화하고, 이 직선 pBR322를 야로비아 리폴리티카와 동종인 부분 및 검출할 수 있는 유전마커를 함유하는 DNA와 연결하여, 이 생성물로 이. 콜라이 돌연변이주를 형질전환시켜 작용성의 야로비아 리폴리티카 유전자를 검출할 수 있도록함을 특징으로 하여, 야로비아 리폴리티카를 형질전환시키는 벡터를 제조하는 방법.
- 제6항에 정의된 벡터를 야로비아 리폴러티카내로 이입시킴을 특징으로 하여, 선택성 마커에 상응하는 유전자에서 돌연변이를 갖는 야로비아 리폴리티카 형질전환체를 제조하는 방법.
- 야로비아 리폴리티카 ATCC20688(기탁번호 : KFCC-10124)을 제11항에서 정의된 플라스미드 pLD25로 형질전환시킴을 특징으로 하여, 야로비아 리폴리티카내에 pLD25를 함유하는 야로비아 리폴리티카 ATCC20687[기탁기관 : 한국 종균협회, 기탁일 : 1984. 12. 4. 기탁번호 : KFCC-10123] 형질전환체를 제조하는 방법.
- 이. 콜라이 JC-355를 제11항에서 정의된 플라스미드 pLD25로 형질전환시킴을 특징으로 하여, 이. 콜라이 JC-355내에 pLD25를 함유하는 이. 콜라이 ATCC39464[기탁기관 : 한국 종균 협회. 기탁일 : 1984. 12. 4. 기탁번호 : KFCC-10126] 형질전환체를 제조하는 방법.
- 야로비아 리폴리티카 LEU2 유전자를 함유하는 Sal I 단편을 YEP24의 Sal I 부위에 삽입시킴을 특징으로 하여, 제6도에 도시된 엔도뉴클레아제 절단지도를 갖는 플라스미드 pLD28을 제조하는 방법.
- 야로비아 리폴리티카의 URA3 유전자를 플라스미드 pLD40의 BamHI 부위에 삽입시킴을 특징으로 하여, 제8도에 도시된 제한 패턴에 의해 특징지어지는 플라스미드 pLD55를 제조하는 방법.
- 이. 콜라이 내에 제8항에서 정의된 벡터를 이입시킴을 특징으로 하여 이. 콜라이 형질전환체를 제조하는 방법.
- 야로비아 리폴리티카를 제17항에서 정의된 플라스미드 pLD55로 형질전환시킴을 특징으로 하여, 야로비아 리폴리티카내에 pLD55를 함유하는 야로비아 리폴리티카 ATCC 20718[기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1984. 12. 4. 기탁번호 : KFCC-10125] 형질전환체를 제조하는 방법.
- pLD25의 부분 EcoRI 분해로 얻어지고 야로비아 리폴리티카의 LEU2 부위를 함유하는 DNA 단편을 플라스미드 pBR322의 EcoRI 부위에 삽입시킴을 특징으로 하여, 제7도에 도시된 제한 엔도뉴클레아제지도로 특징지어지는 플라스미드 pLD40을 제조하는 방법.
- 야로비아 리플리티카와 동종의 부분 및 검출할 수 있는 유전마커를 함유하는 DNA를 야로비아 리폴리티카내로 이입시킴을 특징으로 하여, 야로비아 리폴리티카중의 돌연변이주의 보족에 의해 유전자를 클로닝(cloning)하는 방법.
- 제21항에 있어서, 야로비아 리폴리티카가 상기의 선택적 마커에 상응하는 유전자에서 돌연변이를 갖는 방법.
- 제22항에 있어서, 돌연변이가 야로비아 리폴리티카 LEU2, 또는 URA3 유전자에서 일어나는 방법.
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