KR860002096B1 - 정맥 주사에 적합한 면역 글로부린의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

정맥 주사에 적합한 면역 글로부린의 제조방법

본 발명은 정맥 주사에 적합한 면역 글로부린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

면역 글로부린은 여러가지 병원체에 대한 항체 활성을 가지고 있기 대문에, 주사 질병으로 부터 보호하거나 또는 치료목적을 위하여 각종 항체가 부족한 환자에 투여된다. 면역 글로부린 조제는 두가지 형으로 개발되었는데, 한가지는 정맥주사용이고 다른 하나는 근육내주사용이며, 이 두가지 모두 임상적으로 널리 사용되고 있다.

정맥 투여형을 제조하는 공지의 방법에는, 조 면역 글로부린을 펩신 및 플라스민 같은 프로테아제로 처리하는 방법. 아실화 및 기타 화학적 방법에 의한 면역 글로부린의 화학적 변화를 이용하는 방법, 빛 폴리에틸렌글리콜, 플룰닉스(폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌공중합체)등을 사용하여, 혈장 또는 콘(Cohn)의 혈장분획의 분별을 이용하는 방법등이 있다.

펩신 처리 방법으로 수득된 정맥 투여용 면역 글로부린에서, 7S IgG는 펩신의 소화작용에 의하여 F(ab')₂로 변형되는데, 이는 생체내에서 매우 단명하므로 불리한 점을 가지고 있다. 플라스민 처리방법에서, 60 내지 70%의 면역 글로부린이 정상 글로부린의 형태로 남아있다 할지라도, 잔존량은 펩신 처리 경우에서와 같이 생성물의 생체내 수명을 감소시키는 저분자 물질로 전환된다. 화학적 변형의 경우에 있어서, 변형된 면역 글로부린이 반복 투여되어야 하는 때 안전상의 문제점이 유발되므로, 변형하는 기의형 및 기타 조건에 따라 새로운 항원성의 개발 가능성이 있다.

폴리에틸렌 글리콜 또는 플루로닉스에 의한 분별은, 일반적으로, 생체내에 존재하는 형태, 즉, 변형되지 않고 분해되지 않은 면역 글로부린을 회수하는데 가장 바람직한 방법이라고 믿어진다. 그 방법은 이미 폴슨 및 코발[일본 특허출원“고까이”(공개) 제46, 814/1975, 91, 321/1976 및 20, 415/1978호]에 상세히 기재되어 있다. 그러나, 폴리에틸렌 글리콜 또는 플루로닉스 분별이 공지의 조건하 수행된다면, 응집(aggregate)형 면역 글로부린을 함유하지 않으며 정맥 주사에 적합한 면역 글로부린 조제를 얻을 수 있으나, 항상 수율이 낮다. 그러므로, 수율을 향상시키는 것이 강력히 요구되고 있다.

본 발명자들은 수율을 감소시키는 원인을 밝히고자 연구를 행한 결과, 생 면역 글로부린에 낮은 농도로 폴리에틸렌 글리콜 또는 플루로닉을 첨가하여 응집형 면역 글로부린을 제거하는 단계에서 비 응집형 면역 글로부린도 동시에 제거된다는 사실을 발견하였다. 또한, 비교적 다량의 응집형 면역 글로부린을 함유하는 글로부린 물질이 폴리에틸렌글리콜 또는 플루로닉으로 분별되고, 비 응집형 면역 글로부린의 손실이 크게된다는 사실도 발견하였다.

본 발명자들은 또한 종래의 기술에 본래 존재하는 상술한 난제와 관련된 새로운 기술적인 문제점을 해결하기 위하여 노력을 기울인 결과, 응집형 면역 글로부린을 분리하기 위하여 생 면역 글로부린을 산처리한 후, 그 물질을 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체로 분별시킴으로써, 비 응집형 면역 글로부린의 수율이 현저히 향상됨을 발견하였다. 이 발견에 기초하여 본 발명은 이룩되었다.

본 발명의 목적은 혈장, 또는 혈장을 콘의 냉 알코올로 분별시켜 얻은 콘의 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ, 분획 Ⅱ+Ⅲ, 분획 Ⅱ 또는 분획 Ⅲ으로부터, 정맥 주사용으로 적합한 면역 글로부린을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 기타 목적 및 잇점은 하기의 기술에서 명백하게 될 것이다.

본 발명에 따라, 혈장올 콘의 냉 알코올 분별시켜 얻은 콘의 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ, 분획 Ⅱ+Ⅲ, 분획 Ⅱ, 또는 분획 Ⅲ, 또는 혈장을, 4° 내지 15℃에서 30 내지 180분동안, pH 3. 2 내지 5. 0에서 산으로 처리하고, 생성된 물질에, pH 4. 6 내지 5. 4에서, 2000 내지 20, 000의 분자량을 갖는 알킬렌옥사이드 중합체 또는 공중합체를 4. 5 내지 5. 5%(W/V)의 농도로 가하고, 침전인 응집형 면역 글로부린을 제거하고, 실제로 비응집형 면역 글로부린을 함유하는 침전형의 비응집형 면역 글고부린을 회수하기 위하여, pH 8. 0 내지 9. 0에서, 상술한 중합에 또는 공중합체를 6 내지 13%(W/V)의 농도로 다시 가함을 특징으로 하는, 정맥 주사에 적합한 면역 글로부린을 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명에 출발물질로서 사용되는 혈장은, 항원성의 문제점의 견지에서, 인혈(human blood) 유래의 것이 바람직하다. 콘의 혈장 분획들 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ, Ⅱ+Ⅲ 및 Ⅲ은, 실제적으로, α-,β-, 및 Υ-글로부린(IhG, IgA, IgM)이다. 혈장 Υ-글로부린 분획은, 저널오브 클리니컬 인베스티게이션, 23, 417(1944) 및 미국 화학회지, 68, 479(1946)에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 냉 에탄올로 계속 침저시킴으로써 수득된다.

산처리는 출발 물질을 산성 조건하에서 유지함으로써 수행된다. 이 처리에 의하여, 원료중의 응집형 면역 글로부린이 우선, 비 응집형과 분리된다. 산조건은 pH 3. 2 내지 5. 0, 바람직하게는 3. 8 내지 4. 2이고, 이온 강도는 0. 002 내지 0. 30, 바람직하게는 0. 10 내지 0. 20이다. pH가 3.2 이하이면 단백질의 변성이 일어나고, 5. 0 이상이면 응집형 면역 글로부린의 상술한 분리작용이 불충분하게 일어나므로, 다른 pH 조건은 바람직하지 못하다. 단백질의 농도는 제한되지는 않으나, 조작의 용이성 때문에 2 내지 10%(W/V)가 바람직하다. 산 처리의 온도는 4° 내지 15℃이다. 온도가 4℃이하이면 상술한 분리작용이 불충분하고, 15℃를 초과하면 단백질의 분해가 일어나므로, 다른 온도는 바람직하지 않다. 산처리의 시간은 30 내지 180분이다. 처리시간이 30분보다 짧으면 상술한 분리가 불충분하게 되며, 너무 처리시간이 길면 시간이 낭비되며, 심지어는 바람직하지 못한 결과를 가져오는 수도 있다. 이 처리에 사용되는 산에는 염산, 인산 같은 무기산 및 아세트산 및 시트르산 같은 유기산이 있다.

상술한 바와같이 산처리를 한후, 고순도의 비응집형 면역 글로부린을 고수율로 제조하기 위하여, 2000 내지 20, 000의 분자량을 갖는 알킬렌 옥사이드 중합체 또는 공중합체를 사용하여 분별을 수행한다. 분별에 사용되는 알킬렌 옥사이드 중합체의 알킬렌기는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 부틸렌기 같은 1 내지 4개의 탄소원자를 갖는 기이다. 알킬렌 옥사이드 공중합체에는 폴리옥사에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 같이 2 이상의 알킬렌 옥사이드의 공중합체가 속한다.

본 발명자들은, 2000 내지 20, 000의 분자량을 갖는 알킬렌 옥사이드의 공중합체가 속한다.

본 발명자들은, 2000 내지 20, 000의 분자량을 갖는 알킬렌 옥사이드 중합체 또는 공중합체를 사용하는 분별에서, pH 조건은 매우 중요한 요인이며, 면역 글로부린의 수율 및 순도는, 4. 6 내지 5. 4, 바람직하게는 4. 8 내지 5. 2의 매우 제한된 범위에서만 현저하게 향상됨을 발견하였다. 이것은 또한, 분칙 Ⅱ+Ⅲ 페이스트를 0. 6% 염화나트륨 수용액에 단백질 농도 5%로 용해시키고, 생성된 용액을 pH 3. 5에서, 60분간 산으로 처리하고, 그 용액을 4. 0 내지 6. 0 범위의 변화된 pH에서 폴리에틸렌 글리콜(5%농도)로 분별하고, 비응집형 면역 글로부린의 수율 및 순도를 측정함으로써 얻은 실험결과 (표 1)로부터 명백히 알 수 있다.

[표 1]

폴리에틸렌 글리콜 분별의 pH조건

평균 분자량이 15, 000인 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 폴리에틸렌 글리콜 대신 사용하는 경우, 다른 pH 조건에서 보다 상술한 pH 조건에서 더 고수율 및 고순도의 비 응집형 면역 글로부린이 수득된다.

상기의 중합체 또는 공중합체를 4. 5 내지 5. 5%, 바람직하게는 5%(W/V)의 농도로 출발물질에 가하고, 침전된 불순물, 즉, 응집형 면역 글로부린을 원심분리(1, 000∼5, 000rpm) 같은 종래의 방법으로 제거한다. 분별된 상등액에 상기의 중합체 또는 공중합체를 6 내지 13%의 농도로 또 가한다. pH를 8. 0내지 9. 0으로 조절함으로써, 목적하는 비응집형 면역 글로부린이 침전되는데, 원심분리(1000내지 5000rpm) 같은 종래의 방법으로 회수될 수 있다. 상기 조건하 목적 화합물의 회수율은 60% 이상이다. 형성된 침전을, 예를들어, 0. 6%염화 나트륨, 2%만니트 및 1% 알부민이 혼합된 0. 02M 아세테이트 완충 용액 또는 생리적 식염수에 다시 용해시키고, 생성된 용액을 임상적 용도에 적합한 정맥 면역 글로부린 용액을 얻기 위하여, 세균 여과기를 통과시킨다. 이 용액중의 면역 글로부린은, 용액을 소량씩 바이알에 나우어 동결건조 시키는 경우에도 그의 성질이 변화하지 않는다. 따라서 생성물을 장기간 보존하고자 할 경우, 동결건조된 조제형으로 만들 수 있다.

본 발명에 의하여 제조된 면역 글로부린은 실제적으로 비 응집형 면역 글로부린을 함유하며, 5%농도 용액으로 분석하였을 때, 항보체 활성은 20유닛 이하이며, IgG의 경우 순도는 90%이상이다.

본 발명은 실시예를 참고로 하여 더 상세히 설명될 것이나 본 발명을 한정하지 않는다.

실시예에서, 면역 글로부린의 회수율은 단일 면역 확산 및 셀롤로오즈 아세테이트 막을 사용하는 전기 이동에 의하여 측정된다. 항보체 활성은 코바르 및 메이어버법[실험 면역화학, p225(1961)] 및 니시오까 및 오까다법[면역생화학, p. 103(1971), 교리쓰 출판사]에 의하여 분석된다.

[실시예 1]

냉알코올 분별에 의하여 얻어진 콘의 분획 Ⅱ+Ⅲ 페이스트(1kg)를 10ℓ의 0. 6% 염화나트륨 수용액에 용해시킨다. 1N염산을 사용하여 용액의 pH를 3. 8로 조절하고, 산 처리를 행하기 위하여 4℃에서 60분간 교반시킨다. 용액에, 500g의 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 4, 000)을 가한다. 폴리에틸렌 글리콜을 용해시키면서, 1N 수산화나트륨 수용액을 사용하여 용액의 pH를 점차로 증가시킨다. pH가 5. 0에 도달하자마자, 침전을 원심분리(4, 000rpm)로 제거하면 맑은 상등액이 얻어진다. 분획 Ⅱ+Ⅲ을 기초로 할때, 상등액에서 IgG의 회수율은 85%이고, IgG의 순도는 97%이다, 상등액에, 500g의 폴리에틸렌 글리콜(분자량 4, 000)을 가한다. 온화하게 저어주면서, 1N 수산화나트륨 용액을 사용하여 상등액의 pH를 8. 5로 조절한다. 상기의 조건하 침전된 면역 글로부린을 원심분리(4, 000rpm)로 회수한다. 전체 회수된 침전을 1%인(human) 알부민을 함유하는 0. 02M 아세테이트 완충용액(pH 6. 6)에 용해시키고, 동일한 용매를 사용하여 농도를 5%로 조절한다. 밀리포어 여과기(밀리포어 주식회사)를 통과시켜 용액을 멸균시키고, 작은 용익내에 무균적으로 분산시킨다. 분산액의 반을 즉시 동결건조시켜 건조조제를 얻는다.

출발물질로부터 IgG의 최종 수율은 84%인데 비해, 출발물질을 pH3. 8에서 산처리를 제외한 경우에는 63%이다. 알부민을 더 가하는 것을 제외하고, 순도는 95%이다. 액상조제 및 동결건조된 조제용액의 항보체 활성(단백질 농도 5%)은 각각 14 및 16이다.

5% 용액을 체중 약 20g인 5마리의 생쥐에 1ml/마리의 양으로 투여한다. 1주일간의 관찰기간 동안 체중 감소 및 입모(立毛)에 있어서 비정상적인 것이 관찰되지 않았다. 동결건조제를 4℃에서 1년간 보존한후 시험해 보았으나, 초기의 조제와 비교할때 용해도 및 항보체 활성에서 아무 변화도 관찰되지 않았다.

[실시예 2]

냉 메탄올 분별에 의하여 수득된 콘의 분획 Ⅱ 페이스트(500g)을 10l의 0. 1% 염화나트륨 용액에 용해시킨다. 응집형을 함유하지 않는 면역 글로부린을 실시예 1과 유사한 방법으로 회수한다. 산처리(pH 3. 8)를 생략한 경우의 62%와 비교할 때 IgGㅇ의 수율은 80%이다. 순도는 97%이다.

실시예 1과 유사한 방법으로 상기에서 얻은 면역 글로부린을 단백질 농도 5%로 0. 5% 염화나트륨 용액에 용해시킨다. 1% 만니트를 가한후, 용액을 세균 여과기를 통과시켜 동결 건조시킨다. 동결 건조제를 단백질 농도 5%로 주사용 증류수에 용해시킨다. 이 농도의 항보체 활성은 13인 것으로 밝혀졌다.

[실시예 3]

폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 4, 000) 대신 동량의 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(평균 분자량 15, 000)를 사용하는 것만 제외하고, 실시예 1의 절차를 반복한다. 면역 글로부린은 실시예 1과 동일한 결과로 회수된다.

Claims (6)

1. 혈장을, 콘의 냉 알코올 분별시켜 얻은 콘의 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ, 분획 Ⅱ+Ⅲ, 분획 Ⅱ 또는 분획 Ⅲ, 또는 혈장을, pH 3. 2내지 5. 0 및 4°내지 15℃에서 30내지 180분간 산으로 처리하고, 생성된 물질에, pH 4. 6내지 5. 4에서, 분자량 2, 000내지 20, 000의 알킬렌 옥사이드 중합체 또는 공중합체를 4. 5내지 5. 5%(W/V)의 농도로 가하고, 침전된 응집형 면역 글로부린을 제거하고, 실제로 응집형 면역 글로부린을 함유하지 않는 비응집형 면역 글로부린의 침전을 회수하기 위하여, pH 8. 0내지 9. 0에서, 상기 중합체 또는 공중합체를 6내지 13%(W/V)의 농도로 다시 첨가함을 특징으로 하는 정맥 주사에 적합한 면역 글로부린의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 산 처리의 단백질 농도가 2내지 10%(W/V)임을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 산이 염산, 인산, 아세트산, 시트르산임을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 혈장이 인혈 유래의 것임을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 알킬렌 옥사이드 중합체가 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 부틸렌기를 가짐을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 알킬렌 옥사이드 공중합체가 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체임을 특징으로 하는 방법.