KR840000127B1

KR840000127B1 - 이스타마이신의 제조방법

Info

Publication number: KR840000127B1
Application number: KR1019800001282A
Authority: KR
Inventors: 하마오 우메자와; 요시로 오까미; 싱이찌 곤도
Original assignee: 자이단 호징 비세이부스 가가쿠 겐규우 가이; 이찌카와 도쿠지
Priority date: 1980-03-27
Filing date: 1980-03-27
Publication date: 1984-02-16
Also published as: KR830002034A

Abstract

내용 없음.

Description

이스타마이신의 제조방법

제1도는 본 발명에 의한 이스타마이신 A 탄산염의 취화 칼륨정에서 측정한 적외선 흡수 스펙트럼의 곡선을 도시한 것이고,

제2도는 이스타마이신 B 탄산염의 취화 칼륨정에서 측정한 적외선 흡수 스펙트럼의 곡선을 도시한 것이고,

제3도는 본 발명에 의한 이스타마이신 Ao 탄산염의 취화 칼륨정에서 측정한 적외선 흡수 스펙트럼의 곡선을 도시한 것이고,

제4도는 이스타마이신 Bo 탄산염의 취화 칼륨정에서 측정한 적외선 흡수 스펙트럼의 곡선을 도시한 것이다.

본 발명은 스트렙토미아세스 속에 속하는 미생물을 배양하여 이 배양액으로 부터 제조한 이스타마이신 A, 이스타마이신 B, 이스타마이신 Ao와 이스타마이신 Bo로 표시되는 새로운 항생물질의 제조방법에 관한 것이고, 더우기 본 발명은 이스타마이신 생산균으로서 유용한 새로운 미생물에 관한 것이다.

박테리아와 진균류와 같은 여러가지 병원균은 사람, 동물과 식물에 질병을 일으키는 원인이 되었으며, 이에 대하여 여러가지 항생물질이 개발되어 왔고, 그 중 몇몇은 하나 또는 그 이상의 병원균에 대해 아주 높은 항균 활성을 가지나, 더 효과적인 치료제가 사람, 동물과 식물에서 병원균에 의하여 일어나는 많은 질병을 치료하는데 필요하였다.

본 발명의 목적은 사람과 동물에서 균감염을 치료하거나 외과용 물질과 기구를 살균하는데 항균물질로써 무수한 새로운 항생물질을 제공하는데 있고, 본 발명의 다른 목적은 이들 새로운 항생물질을 배양 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

그리고 종래 새롭고 유용한 항생물질을 제조하는데 많은 경비가 들었으며, 따라서 본 발명자는 일본 가나가와시 미우라반도 해안의 해저 흙에서 분리한 방선균에서 균주번호 SS-939호를 호기성 조건하에 배양했을 때, 균에 대하여 광범위한 항균활성을 갖는 네 다른 물질이 생성됨을 발견했다. 본 발명에서는 배양시 나온 이들 항균성 물질의 단리를 계속하고 이를 정제한다. 이들 단리된 물질을 화학적, 물리적 및 미생물학적으로 연구하여 보면 이들 단리된 물체는 공지의 항생물질보다 강한 항균작용을 나타내고, 저독성인 새로운 아미노글리코시드 항생물질임을 알 수 있다. 따라서 본 발명에서는 이들의 항생물질을 각각 이스타마이신 A, 이스타마이신 B, 이스타마이신 Ao와 이스타마이신 Bo로 명명했다.

본 발명의 첫 요지는 새로운 항생물질로써 이스타마이신 A, 이스타마이신 B, 이스타마이신 Ao, 이스타마이신 Bo와 이의 산부가염으로 부터 최소한 하나를 선택한 이스타마이신을 제공하는데 있다.

(a) 상기 이스타마이신 A는 실험식이 C₁₇H₃₅N₅O₅이고 이의 분자에 두 N-메틸기와 하나의 0-메틸기를 갖고 ; 물에서 이스타마이신 A 자외선 흡수 스펙트럼은 말단 흡수만을 나타내고 ; 물과 메탄올에 용해하나 에탄올이나 기타 일반 유기용매에 난용이거나 불용이고 ; 닌히드린 시약과 리돈-스미스시약과 양성 반응을 나타내고, n-부탄을-피리딘-초산-물(용적 6 : 4 : 2 : 4)로 전개한 셀루로즈 박층 크로마토 그라피에서 Rf 0.22 값을 나타내며 ; 이스타마이신A 헤미-탄산염은 융점은 명확치는 않으나 102-108℃에서 분해하는 무색분말이고 비선광도가

인 특징을 가지며 ; (b)상기 이스타마이신 B는 실험식이 C₁₇H₃₅N₅O₅이고 ; 이의 분자에 두 N-메틸기와 0-메틸기를 가지고 ; 물에서 이스타마이신B의 자외선 흡수 스펙트럼은 말단흡수만을 나타내고 ; 물과 메탄올에는 용해하나 에탄올이나 기타 일반 유기용매에서 난용이거나 불용이고 ; 닌히드린시약과 리돈-스미스시약과 양성 반응을 나타내고 ; n-부탄올-피리딘-초산-물(용적 6 : 4 : 2 : 4)로 전개한 셀루로즈 박층 크로마토그라피에서 Rf 0.25값을 나타내고 ; 이스타마이신 B 헤미-탄산염은 융점은 명확하지 않으나 112-114℃에서 분해하는 무색분말이고 비선광도가

인 특징을 가지며 ;

(c) 상기 이스타마이신 Ao는 실험식이 C₁₅H₃₂N₄O₄이고 ; 이의 분자에 두 N-메틸기와 0-메틸기를 가지고 ; 물에서 이스타마이신 Ao의 자외선 흡수 스펙트럼은 말단 흡수만을 나타내고 ; 물과 메탄올에서 용해하나 에탄올과 기타 일반 유기용매에서는 난용이거나 불용이고 ; 닌히드린 시약과 리돈-스미스 시약과 양성반응을 나타내고 ; 클로로포름-메탄올-17% 암모니아수(용적 2 : 1 : 1)의 하층 혼합물로 전개한 실리카겔 박층 크로마토그라피에서 Rf 0.36값을 나타내고 ; 이스타마이신 Ao 헤미-탄산염은 융점은 명확하지 않으나 111-114℃에서 분해하는 무색결정성분말이고 비선광도가

인 특징을 가지며 ;

(d) 상기 이스타마이신 Bo는 실험식이 C₁₅H₃₂N₄O₄이고 ; 이의 분자에 두 N-메틸기와 하나의 0-메틸기를 함유하고 ; 물에서 이스타마이신 Bo의 자외선 흡수 스펙트럼은 말단 흡수만을 나타내고 ; 물과 메탄올에 용해하나 에탄올과 기타 일반유기용매에는 난용이거나 불용이고 ; 닌히드린시약과 리돈-스미스시약과 양성반응을 나타내고 ; 클로로포름-메탄올-17% 암모니아수(용적 2 : 1 : 1)의 하층 혼합물로 전개한 실리카겔 박층 크로마토 그라피에서 Rf 0.14값을 나타내고 ; 이스타마이신 Bo 헤미-탄산염은 융점이 명확하지 않은 무색결정성 분말이고 비선광도가

인 특징을 갖는다.

이후부터 이스타마이신이란 술어는 다른 언급이 없는한 이스타마이신A, 이스타마이신B, 이스타마이신 Ao 또는 이스타마이신 Bo 또는 이의 혼합물을 뜻하며, 이의 이스타마이신 복합체는 다른 언급이 없는 한 이스타마이신 A, B, Ao와 Bo의 둘, 셋 또는 모두의 혼합물을 뜻한다.

본 발명에서 이스타마이신A, 이스타마이신B, 이스타마이신 Ao와 이스타마이신 Bo 물질은 단독 아니면 이들 물질의 최소한 둘의 혼합물이고, 이는 묽은 용액, 조(粗) 농축물, 조고체, 정제된 고체로서 유리 염기형태나 무기산 또는 유기산과 산부가염 형태로 존재한다.

전술한 성질을 포함한 이스타마이신의 물리-화학적 성질은 다음에 더 상세히 설명한다.

이스타마이신 A는 염기성 화합물이고, 이의 탄산염으로 단리된 이스타마이신 A는 융점은 명확하지 않으나 102-108℃에서 분해하는 무색 분말이고, 비선광도는

을 나타내고, 원소분석치는 분자식 C₁₇H₃₅N₅O₅·1/2H₂CO₃의 이론치(C 49.99%, H8.63%, N16.65%, O24.73%)와 일치하고, 또한 이 분자식은 고분해질량분석(실측치 : m/e 389.2588 ; C₁₅H₃₅N₅O₅의 이론치 : m/e 389.2635)에 의하여 확인되었다. 취화 칼륨정에서 측정한 이스타마이신 A 헤미-탄산염의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 제1도에 도시되었다. 수용액에서 측정한 이스타마이신A 헤미-탄산염의 자외선 흡수 스펙트럼은 말단 흡수만을 나타낸다.

중수중에서 측정한 이스타마이신 A 헤미-탄산염의 양자(¹H) 핵자기 공명 흡수 스펙트럼(외부표준 : TMS, pD5.4)에서 δ3.20(S, N-CH₃), 3.57(S,N-CH₃), 3.89(S,)-CH₃), 4.50(S, CH₂)와 5.80(d, J=3.5 Hz, CH)로 특징을 나타낸다. 이스타마이신 A는 물과 메탄올에 용해하나 에탄올과 기타 일반 유기용매에는 난용이거나 불용이고 이는 닌히드린 반응 및 리돈-스미스반응에 양성을 나타낸다. 이스타마이신 A는 n-부탄올-피리딘-초산-물(용적으로 6 : 4 : 2 : 4)의 혼합용매로 전개한 셀루로즈 박층 크로마토그라피(Avicel, Funakoshi Yakahin/Co.)로 Rf 0.22에서 단일점을 나타내고, 이는 후술한 이스타마이신의 셀루로즈 박층 크로마토그라피의 Rf 0.25와 명백히 구별된다. 개미산-초산-물(용적으로 25 : 75 : 900)을 사용한 고전압지 전기 영동(泳動)(3,300볼트, 15분)에서, 알라닌의 이동도를 1.0으로 할때 두 이타마이신A와 이스타마이신B의 이동도는 동일하게 2.15를 나타내므로서 구별되지 않는다.

이스타마이신B는 이들의 성질에 있어 이스타마이신 A와 매우 유사하고, 이스타마이신 B도 염기성 화합물이고 그 탄산염으로 명확한 융점은 없으나, 112-114℃에서 분해하는 무색분말이고, 비선광도는

을 나타내고, 이의 원소분석치는 분자식 C₁₇H₃₅N₅O₅·1/2 H₂CO₃의 이론치(C49.99%, H8.63%, N16.65%, O24.7%)와 일치하며, 또한 이 분자식은 고분해질량 분석에 의하여 확인되었다(실측치 : m/e 389.2625 ; C₁₇H₃₅N₅O₅의 이론치 : m/e 389.2635). 취화칼륨정에서 측정한 이스타마이신B의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 제2도에 도시되어 있다.

수용액에서 측정한 이스타마이신B 헤미-탄산염의 자외선 흡수 스펙트럼은 말단 흡수만을 나타낸다.

중수에서 측정한 이스타마이신B 헤미-탄산염의 양자(¹H) 핵자기공명 흡수 스펙트럼(외부표준 : TMS, pD5.4)에서 δ3.26(S, N-CH₃), 3.59(S, N-CH₃), 3.95(S, O -CH₃), 4.57(S, CH₂)와 5.96(d, J=3.5Hz, CH)로 특징적 표시를 나타낸다. 이스타마이신A와 유사하게, 이스타마이신B도 물과 메탄올에서 용해하나 에탄올과 기타 일반 유기용매에서 난용이거나 불용이고, 이는 닌히드린반응 및 리돈-스머스 반응에 양성이다. 전술한 바와 같이, 이스타마이신 B는 셀루로즈 박충 크로마토그라피에 의하여 이스타마이신 A와 구별할 수 있다.

또한 이스타마이신 Ao도 염기성 화합물이고, 이의 헤미-탄산염으로 단리된 이스타마이신 Ao는 명확한 융점은 없으나 111-114℃에서 분해하는 무색 결정성 분말이고, 비선광도는

을 나타내고, 이의 원소분석은 분자식 C₁₅H₃₂N₄O₄·1/2H₂CO₃의 이론치(C51.22%, H9.15%, N15.24%)와 일치한다. 취화칼륨정에서 측정한 이스타마이신 Ao 헤미-탄산염의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 제3도에 도시되어 있다. 수용액에서 측정한 이스타마이신 Ao 헤드-탄산염의 자외선 흡수 스펙트럼은 말단 흡수만을 나타낸다. 중수에서 측정한 이스타마이신 Ao 혜미-탄산염의 양자(¹H) 핵 자기 공명 흡수 스펙트럼(외부표준 : TMS, pD5.0)에서, δ3.23(S, N-CH₃), 3.28(S, N-CH₃), 3.94(S, O-CH₃)와 5.86(d, J=4Hz, CH)로 특징적 표시를 나타낸다. 이스타마이신 Ao는 물과 메탄올에 용해하나 에탄올과 기타 일반유기용매에 난용이거나 불용이고, 이는 닌히드린반응 및 리돈-스미스반응에서 양성을 나타낸다. 이스타마이신 Ao는 클로로포름-메탄올-17% 암모니아수(용적으로 2 : 1 : 1) 혼합물의 하층으로 전개한 실리카겔 박층 크로마토그라피로 Rf 0.36에서 단일점을 나타낸다. 개미산-초산-물(용적으로 1 : 3 : 36)을 사용한 고전압지 전기영등(3,300볼트, 15분)에서, 알라닌의 이동도가 1.0이면 이스타마이신 Ao의 상대 이동도는 2.35이다.

이스타마이신 Bo도 염기성 화합물이고, 헤미-탄산염으로 단리된 이스타마이신 Bo는 명확한 융점은 없는 무색 결정성 분말이고, 비선광도는

을 나타내고 이의 원소분석은 분자식 C₁₅H₃₂N₄O₄·1/2H₂O의 이론치(C49.98%, H9.20%, N15.04%)와 일치한다. 이 분자식은 고분해질량분석에 의하여 확인되었다(실측치 : m/e 332.2384 ; C₁₅H₃₂N₄O₄의 이론치 : m/e 332.2421). 취화칼륨정에서 측정한 이스타마이신 Bo의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 제4도에 도시되어 있다. 수용액에서 측정한 이스타마이신 Bo 헤미-탄산염의 자외선 흡수 스펙트럼은 말단 흡수만을 나타낸다. 중수에서 측정한 이스타마이신 Bo 헤미-탄산염의 양자(1H) 핵자기 공명 흡수 스펙트럼(외부표준 : TMS, p^D5.2)에서 δ3.21(S, N-CH₃), 3.28(S, N-CH₃), 3.91(S, O-CH₃)와 5.92(d, J=3.5Hz, CH)로 특징적 표시를 나타낸다. 이스타마이신 Bo는 물과 메탄올에 용해하나 에탄올과 기타 일반유기용매에서 난용이거나 불용이고, 이는 닌히드린반응 및 리돈-스미스 반응에서 양성을 나타낸다.

이스타마이신 Bo는 클로로포름-메탄올-15% 암모니아수(용적으로 2 : 1 : 1) 혼합물의 하층으로 전개한 상기 실리카겔 박층 크로마트그라피로 Rf 0.14에서 단일점을 나타낸다. 이스타마이신 Ao에 대하여 상술한 바와 같은 상기 고전압지 전기영동에서, 이스타마이신 Bo는 이들의 이동도가 2.35로 동일하기 때문에 이스타마이신 Ao와 구별하기 어렵다.

구조적 관찰에서 이스타마이신A에 대한 본 발명에 의하여 나타난 화학구조식은 다음과 같다 :

이스타마이신 B에 대한 화학구조식은 다음과 같다.

이스타마이신 Ao에 대한 화학구조식은 다음과 같다.

이스타마이신 Ao의 화학적 구조를 더 연구해 보면, 중성 pH 보다 더 높은 이의 수용액에서 이스타마이신 Ao는 일반식(Ⅲ)으로 나타나는 반면에, 중성 pH(양자형) 보다 더 낮은 이의 수용액에서 이스타마이신 Ao는 상기 일반식(Ⅳ)으로 나타난다. 이스타마이신 Bo의 구조식은 다음과 같다.

이스타마이신 A, 이스타마이신 B, 이스타마이신 Ao와 이스타마이신 Bo는 각각 이의 유리염기 또는 수화물이나 탄산염으로 통상 얻을 수 있으며, 이들은 일반적인 방법으로 약학적으로 수용할 수 있는 산과 반응시켜 약학적으로 수용할 수 있는 산부가염으로 변환시킬 수 있다. 이스타마이신의 약학적으로 수용할 수 있는 산부 가염은 염산, 취산, 황산, 인산, 질산, 설폰산 등과 같은 무기산이나, 초산, 말산, 구연산, 아스코르브산, 메탄설폰산 등과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 이스타마이신 A와 이스타마이신 B는 하기 표 1에 표시된 이들 물질의 항균 스펙트라로 명백히 나타난 바와 같이, 광범위한 그람-양성균에 대하여 높은 항균활성을 갖는다. 이스타마이신 A와 이스타마이신 B는 그람-음성 및 그람-양성균의 성장을 강하게 저지하고, 여러가지 균에 대하여 이스타마이신 A와 이스타마이신 B의 최저발육저지농도(mcg/ml)는 17시간동안 37℃의 온도에서 배양시킨 영양 한천 평판상에서 표준연속 희석방법에 의하여 측정한다.

[표 1]

이스타마이신 Ao와 이스타마이신 Bo의 항균 활성은 이스타마이신 A와 이스타마이신B와 동일한 방법으로 영양 한천 평판상에서 표준연속희석 방법에 의하여 측정하며, 이스타마이신 Ao와 이스타마이신 Bo는 매우 약한 활성을 나타낸다. 시험균으로써 바실루스 서브틸리스를 사용할 때 이스타마이신 Ao의 항균활성은 이스타마이신A의 것과 같이 약 1/200배로 높고 이스타마이신 Bo의 항균활성도 이스타마이신B의 것과 같이 약 1/200배로 높다는 것을 알 수 있다.

100mg/μg의 이스타마이신 A, 이스타마이신 B, 이스타마이신 Ao 또는 이스타마이신 Bo을 쥐의 정맥내로 투약했을 때 내약력이 있었다.

상술한 이스타마이신 A와 B로 성질로 보아, 이스타마이신 A와 B는 포르티미신A[알, 오카치등의 항생제, vol.30, p541(1977)]와 스포라리신(티. 도우시 등의 항생제, vol. 32, p173(1979)]과 몇가지 점에서 유사함을 알 수 있다.

그러나 이스타마이신들은 분자에 C-메틸기를 함유하지 않으나 N-메틸기는 함유하므로 이들 공지 항생물질과 이스타마이신 A와 B는 완전히 구별되며, 따라서 이스타마이신 A와 B와 이스타마이신 Ao와 Bo는 새로운 항생물질임을 알 수 있다.

본 발명의 둘째 요지에 의하면 항생 이스타마이신 복합체의 제조 방법을 제공하는데, 이는 실제량의 이스타마이신이 생성되어 배양액에 축적될 때까지, 탄소와 질소원을 함유하는 배양액에서 호기성 조건하에 스트렙토마이서속에 속하는 이스타마이신의 생산균을 배양시켜서 하는 이스타마이신의 제조방법을 뜻하며, 본 발명의 둘째 요지인 이 방법은 배양액으로 부터 이스타마이신 복합체를 채취하는 단계를 뜻한다. 여기서 이스타마이신 복합체란 둘, 셋 또는 넷의 이스타마이신 A, B, Ao와 Bo의 혼합물을 뜻한다.

본 발명의 둘째 요지를 상세히 설명하면, 이스타마이신A가 배양액에서 언급한 생산균에 의하여 생성되고 축적될 때까지 탄소와 질소원을 함유하는 배양액으로부터 호기성 조건하에 스트렙토마이스속에 속하는 이스타마이신A의 생산균을 배양시켜서 하는 이스타마이신A를 제조하는 방법이며, 또한 배지에서 언급한 생산균에 의하여 이스타마이신 B가 생성되고 축적될 때까지, 탄소와 질소원을 함유하는 배양액으로 부터 호기성 조건하에 스트렙토마이서 속에 속하는 이스타마이신 B의 생산균을 배양하여서 하는 이스타마이신 B의 제조방법이고, 배지에서 이스타마이신 Ao가 언급한 생산균에 의하여 생성되고 축적될 때까지 탄소와 질소원을 함유하는 배양액으로 부터 호기성 조건하에 스트렙토마이서 이스타마이신 Ao의 생산균을 배양하여서 하는 이스타마이신 Ao를 제조하는 방법이고, 또한 배지에서 언급한 생산균에 의하여 이스타마이신 Bo가 생성되고 축적될 때까지 탄소와 질소원을 함유하는 배양액으로 부터 호기성 조격하에 스트렙토마이서 이스타마이신 Bo의 생산균을 배양하여서 하는 이스타마이신 B의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 둘째 요지에 따른 방법에 순수한 이스타마이신 A, 순수한 이스타마이신 B, 순수한 이스타마이신 Ao, 순수한 이스타마이신 Bo 같은 이스타마이신이나 아니면 이들의 조생성물 또는 용액이나 고체 또는 이들 이스타마이신 A, B, Ao와 Bo의 최소한 둘로 된 혼합물과 같은 이스타마이신을 채취하는 단계가 포함된다.

이스타마이신-생성균을 예로 들면, 1978년 8월 일본 가나가와시의 미우라반도 해안의 해저에서 수집된 해저토로 본 발명의 방법에 의하여 단리시킨 방선균으로 이는 균주번호 SS-939호로 표시되었으며, 이러한 균주는 다음과 같은 균학적 성상을 갖는다.

(a) 현미경적 형태

한천 배지상에서 잘 자란 SS-939호는 단순히 분기(分技)하고, 잘 신장한 기저균사로 부터, 직상 또는 약간 만곡한 기균사(氣菌絲)를 신장시키고, 성숙된 기균사는 10-50의 포자 체인 첨단에서 나온다. 포자의 형태는 원통형(1미크론넓이×4-5미크론길이)이다. 나선상이나 차축분기는 관찰되지 않는다. 전자현미경으로 보면 포자의 표면은 평활하고 바늘상 또는 모상(毛狀) 구조는 없다. 편조 또는 포자낭 둘다 볼 수 없으므로, SS-939호 균주는 전형적인 스트렙토마이서류이다.

(b) 각종 배지상의 특징

(1) 서당-질산염한천배지(27℃에서 배양) : 약한 무색의 발육상에 백색의 기균사를 생기게 하고, 점차적으로 청록색을 띤 회색(미국 콘테이너 코포레이숀에 의하여 발간된 "컬러 하모니 맨뉴엘"에 표시된 컬러표준에 의하여 17ec, 청색액 : 다른 언급이 없는 한 동일한 컬러표준은 후술한다)으로 변한다.

배지에 현저한 확산성 색소는 생성되지 않는다.

(2) 글리세린 아스파라진 한천배지(27℃에서 배양) : 상기 (1)에서 언급한 서당-질산염 한천배지와 거의 같으며 기균사는 착생하지 않는다.

(3) 전분 한천배지(27℃에서 배양) : 상기 (1)에서 언급한 서당-질산염 한천배지와 거의 같으며 기균사가 착생되고, 균발육주변의 전분은 투명으로 된다.

(4) 티로신 한천배지(37℃에서 배양) : 상기 (1)과 (2)에 나타난 매체와 거의 같으며 멜라닌 색소가 생성된다.

(5) 영양 한천배지(27℃에서 배양) : 무색 발육에 백색의 기균사를 착생시키고, 배지는 다갈색을 이룬다.

(6) 효모 추출물-맥아 추출물 한천배지(27℃에서 배양) : 무색 발육에 백색의 기균사를 착생시키고 기균사는 백색이고, 다음 청록색을 띤 회색(19dc, 초록색액)으로 된다. 배지는 다갈색을 나타낸다.

(7) 귀리-옥수수 한천배지(27℃에서 배양) : 무색 발육에 백색을 띤 청회색(17ec, 청색액)을 갖는 기균사가 착생된다.

(c) 생리적 성질

(1) 성장온도 : 20-41℃에서 성장

(2) 전분의 가수분해 : 전분은 전분매체에서 가수분해한다.

(3) 탈지유의 응고와 펩톤화는 거의 나타나지 않는다.

(4) 멜라닌 색소의 형성 : 티로신 한천배지와 펩톤-효모 추출물-철 한천배지에 생성된다

(d) 성장용 탄소원의 동화성(프리드함-고톨리에브 매체에서 평가)

글루코스와 이노시톨만이 동화할 수 있고, 아라비노스, D-키실로스, 서당, 람노스, 라피노스와 D-만니톨은 동화하지 않고, D-프럭토스의 동화는 거의 어렵다.

SS-939호 균주의 상기 언급한 특징을 요약하면, 이러한 균주는 스트렙토마이서류에 속하고, 기균사에 나선사는 없고, 발색체의 특징을 갖는다. 상기 언급한 성상에서, SS-939호 균주는 국제 스트렙토마이서보호(ISP)와 베르기의 세균감정법, 1974에 언급한 공지의 스트렙토마이서와 비교된다. SS-939호 균주의 특징은 스트렙트마이서 비리도크로모겐과 거의 유사하다. 그러나 SS-939호 균주가 나선사를 만들지 않고 키실로스, 아라비노스, 람노스, 프럭토스, 라핀노스와 만니톨을 이용할 수 없으므로 에스. 비리도크로모겐과 다르다. 이들 사이의 식별할 수 있는 다른 차이는 SS-939호 균주에 의하여 생성된 포자의 표면이 바늘상이 아닌 것이고 다음으로 스트렙토마이서 비리디파시엔스는 발색성을 가지지 않고, SS-939호 균주의 것과 유사한 색의 기균사를 만든다. 그러나 이들은 SS-939호 균사가 기균사에서 나선사를 만들지 않고 성장용 탄소원으로써 프럭토스와 서당을 등화할 수 없으므로 서로 구별할 수 있다. 기타 SS-939호 균주의 특징적인 탄소원 동화성을 이용할 수 있는 성질을 나타내는 공지된 종류의 스트레토마이스는 없다.

따라서 SS-939호 균주는 새로운 종류로서 스트렙토마이서 텐지마리엔시스로 명명한다.

스트렙토마이스 텐지마리엔시스 SS-939호 균주는 1979년 4월 21일 이후 번호 FERM-P4932로 일본 이바라기시 츄구바-균의 공업과학과 기술소개업소인 일본 공식기구 "배양연구기구"에 있으며, 또한 ATCC번호 31603으로 미국 워싱톤 디. 씨. 에 있는 미국형 배양균수집소에 있다.

변성균의 변이는 인공적 아니면 자연적조건하에 자주 일어난다. 따라서 본 발명은 SS-939호 균주와 이의 변이균을 이들이 이스타마이신을 생성시키는 한 사용한다.

이스타마이신은 이스타마이신-생산균인 스트렙토마이서, 예를 들면 스트렙토마이서 텐지마리엔시스류(FERM-P 4932 또는 ATCC 번호 31603)의 포자나 균을 호기성 배양시켜 얻을 수 있다. 본 발명의 제조 방법을 행하는데 있어, 이스타마이신-생산균인 포자 또는 균은 균류와 동화할 수 있는 영양물원인 적합한 배지에서 배양한 다음 이스타마이신, 즉 최소한 하나의 이스타마이신 A, B, Ao와 Bo를 함유하는 배양액을 얻을 때까지 호기성 조건하에 배양시킨다. 일반적으로 보통 방선균을 배양시키는 데 사용된 배지의 영양물을 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들면 시판되고 있는 콩가루, 땅콩 분말, 목화씨앗분말, 건조효모, 펩톤, 고기추출물, 카제인, 옥수수를 담근 액체, 질산 나트륨, 황산암모늄등은 질소원으로 유용하고, 탄소원으로는 글루코즈, 전분, 글리세린, 말토스, 덱스트린, 서당, 유당 등과 같은 탄수화물과 콩유와 지방이 유용하다.

또한 염화 나트륨, 탄산칼슘, 황산 마그네슘, 염화망간과인산염과 같은 무기염은 물론 각종 아미노산등을 사용할 수 있다. 방선균을 배양하는데 사용할 수 있는 영양물은 이것이 이스타마이신을 제조할 때 이스타마이신-생산균과 동화할 수 있으면 본 발명에 사용할 수 있다.

이스타마이신의 대량 생산에는 액체통기 배양이 바람직하고, 배양온도는 이스타마이신 생산균을 발육시키고, 생산시킬 수 있는 범위에서 적용할 수 있고, 바람직한 온도는 25-30℃이다. 배양은 통상 충분한 기간동안 충분한 양의 이스타마이신이 축적될때까지 계속한다. 배양시간은 통상 2-7일이다.

이스타마이신A와 이스타마이신B의 정량은 공지의 항생물질 정량에 통상 사용되고 있는 원통 평판법에 의하여 시험균으로서 바실러스 서브티리스 PCI 219를 사용하여 할 수 있다. 후술한 실시예 3에서 얻은 정제이스타마이신A의 시료를 mg당 1000mcg(단위)로서 표준물질로 했다. 그리고 실시예 3으로부터 얻은 정제 이스타마이신 B의 시료는 3170mcg(단위)/mg의 역가를 나타낸다.

또한 이스타마이신 Ao와 이스타마이신 Bo의 정량은 시험균으로서 바실러스 서브틸리스 PCI 219를 사용하여 공지의 항생물질 정량에 통상 사용되고 있는 원통 평판법에 의하여 한다. 본 발명에서 얻은 정제 이스타마이신 Ao의 시료는 5mcg(단위)/mg의 역가를 가지고, 정제 이스타마이신 Bo의 시료는 10mcg(단위)/mg의 역가를 가지며, 정제 이스타마이신 A의 시료는 1000mcg(단위)/mg의 역가를 가짐을 알 수 있다.

이스타마이신A, 이스타마이신B, 이스타마이신Ao와 이스타마이신 Bo 및 이들의 산부가염은 물에 쉽게 용해되고, 이스타마이신 복합체는 주로 이스타마이신생산균의 배양액에서 용액으로 존재한다. 수용액인 이스타마이신A와 이스타마이신B 및 이스타마이신Ao와 Bo은 부탄올, 초산부틸, 클로로포름등의 유기용매로 추출되지 않기 때문에 이들 유기용매는 필요에 따라 배양물로부터 불순물을 제거하는데 이용할 수 있다. 배양액 또는 이스타마이신 수용액중의 이스타마이신 복합체는 각종 흡착제를 사용하여 채취할 수 있다. 활성탄을 흡착제로서 사용할 때 탄소로 흡착된 이스타마이신은 약산성수, 약산성메탄올수, 약산성프로판올수, 약산성 아세톤수등으로 용출된다.

이스타마이신은 이들이 염기성이기 때문에, 수율이 좋게 양이온-교환수지에 흡착 용출된다. 이 방법은 대량의 배양액으로부터 이스타마이신을 채취하는데 가장 적합한 방법이다. 이에 이용할 수 있는 양이온-교환체로서는 카르복실산을 활성기로 하는 암베르라이트 IRC-50, CG-50(미국 롬 앤드 하스회사제품), 레와티트 CNP(서독 바이엘회사 제품), CM-세파덱스(스웨덴, 팜마시아제품)등의 H형, Na형, NH₄형 및 이들의 혼합형이 사용되고 있고, 흡착된 항생물질은 산성수, 묽은 암모니아수 또는 무기염의 수용액과 처리하여 좋은 수율로 용출되며, 통상 용출하는데는 0.2N-1N의 염산과 0.2N-1N의 암모니아수가 사용된다. 이스타마이신 A와 이스타마이신B 및 이스타마이신 Ao와 이스타마이신 Bo는 음이온-교환수지로 실제적으로 흡착시킬 수 없기 때문에 이스타마이신의 산성 용액을 중화시키거나 산성 불순물을 제거하는데 적당히 사용할 수 있다.

이렇게 채취한 이스타마이신 복합체로부터 분리하여 이스타마이신 A, 이스타마이신B, 이스타마이신Ao, 이스타마이신 Bo를 얻기 위하여 클로로포름-메탄올-17% 암모니아수(2 : 1 : 1) 하층을 혼합용액으로 전개한 실리카겔 박층 크로마토그라피에서 이스타마이신 A가 Rf 0.17에서 단일점을 나타내고, 이스타마이신 B는 Rf 0.11에서 단일점을 나타내고, 이스타마이신 Ao는 Rf 0.36에서, 이스타마이신 Bo는 Rf 0.14에서 단일점을 나타내는 이스타마이신의 특징을 이용하여, 클로로포름-메탄올-17% 암모니아수(용적으로 2 : 1 : 1)의 하층을 혼합용매 또는 몇몇 유사한 혼합용매로 전개한 실리카겔 컬럼 크로마토그라피하므로서 이들을 서로 분리할 수 있다. 이스타마이신A와 이스타마이신B를 분리시키기 위하여 n-부탄올-피리딘-초산-물(6 : 2 : 2 : 4)의 혼합용매로 전개한 셀루로즈 박층 크로마토그라피에서 이스타마이신 A는 Rf 0.22에서 단일점을 나타내는 반면에 이스타마이신 B는 Rf 0.25에서 단일점을 나타 내는 이스타마이신A와 B의 특징을 이용하여, n-부탄올-피리딘-초산-물(용적 6 : 4 : 2 : 4)의 혼합용매로 전개한 셀루로즈 컬럼에서 크로마토그라피로 단리시킨다. 크로마토그라피 단리방법은 이스타마이신의 단리 정제 및 이스타마이신의 채취에 이용할 수 있다. 이스타마이신 A, B, Ao, 또는 Bo는 상술한 추출방법과 크로마토그라피단리방법을 반복하는 방법 또는 적당히 조합하여 이용하므로서 정제된 상태에서 단리시킬 수 있다.

이스타마이신 복합체의 채취와 각 이스타마이신의 단리 및 정제를 위하여 다음 방법이 바람직하다 : 이스타마이신-생산균의 배양액에 염산을 첨가하여 pH 2.0으로 조절한 다음, 여과하고 여액을 암베르라이트 IRC-50(NH₄형)과 같은 양이온-교환수지의 컬럼에 연속적으로 통과시키면 수지에 이스타마이신이 흡착된다. 이 수지를 수세한 다음 1N 암모니아수로 용출시킨다. 활성 용출액을 서로 모우고 감압하에 농축하고 농축액을 암베르라이트 CG-50과 같은 양이온-교환수지의 컬럼에 연속적으로 통과시키면 수지에 이스타마이신이 흡착된다. 이 수지를 수세한 후 0.2N 암모니아수로 세척한 다음 0.4N 암모니아수로 용출시킨다. 실제량의 이스타마이신B를 함유하는 활성부분을 서로 결합시키고 진공에서 농축건조시키면 이스타마이신B의 생분말을 얻는다. 이 생분말을 실리카겔의 컬럼 크로마토그라피를 되풀이하면 정제된 이스타마이신B의 무색분말을 얻는다.

실제량의 이스타마이신A 및 적당량의 이스타마이신Ao와 Bo를 함유하는 활성부분을 서로 혼합하고 진공에서 농축건조하면 이스타마이신A, Ao와 Bo로 된 조분말을 얻는다. 이 조분말을 클로로포름-메탄올-8.5% 암모니아수(용적으로 2 : 1 : 1)의 혼합용매로 전개하여 실리카겔 컬럼 크로마토그라피한다.

이스타마이신 Ao만 함유하는 용출액의 이러한 활성부분을 서로 혼합하고 진공농축시키고, 농축액을 암베르라이트 CG-50(NH₄형)과 같은 양이온-교환수지의 컬럼으로 통과시킨후 0.5N 암모니아수로 수지를 용출시킨다. 이스타마이신 Ao만 함유하는 이렇게 용출된 활성부분을 서로 혼합하고, 진공에서 농축건조하면 정제된 이스타마이신A의 무색 결정성 분말을 얻는다.

이스타마이신A를 함유하는 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그라피로부터 용출한 이러한 활성부분을 서로 혼합하고 진공에서 농축시킨다. 이렇게 얻은 농축액을 다시 실리카겔의 컬럼 크로마토그라피하고, 이스타마이신A 만 함유하는 활성부분을 서로 혼합하고 농축건조하면 정제된 이스타마이신A의 무색분말을 얻으며, 이스타마이신 Bo만 함유하는 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그라피로부터 용출한 이러한 활성부분을 서로 혼합하고 진공에서 농축하고, 생성된 농축액을 0.5N 암모니아수로 전개하여 암베르라이트 CG-50(NH₄형)과 같은 양이온-교환수지의 컬럼 크로마토그라피한다. 이스타마이신B만 함유하는 활성 용출액을 서로 혼합하고 진공에서 농축건조하면 정제된 이스타마이신 Bo의 무색 결정성 분말을 얻는다.

이스타마이신 A, B, Ao와 Bo를 구조적으로 연구하여 보면, 이스타마이신Ao는 이스타마이신 A의 디-글리실 유도체이고, 이스타마이신 Bo는 이스타마이신B의 디-글리실 유도체인 것으로 나타난다(전술한 일반식(Ⅲ), (Ⅳ), (Ⅴ)와 일반식(Ⅰ), (Ⅱ)의 비교), 그러므로, 본 발명의 이스타마이신Ao와 이스타마이신Bo를 공지 방법으로 이스타마이신 Ao 또는 이스타마이신 Bo의 4-위치에서 메틸 아미노기에 존재하는 아미노기와 글리신 분자를 축합시켜서 각각 이스타마이신A와 이스타마이신B로 변환시킬 수 있다. 이러한 변환은 이스타마이신A와 이스타마이신B가 이스타마이신Ao와 Bo 보다 더 높은 항균활성을 가지고 화학요법제로서 더 유용하기 때문에 가치가 있다.

그외 이스타마이신Ao와 이스타마이신 Bo는 알카리 조건하에 각각 이스타마이신 A와 이스타마디신 B를 가수분해하여 제조할 수 있다. 본 발명의 세번째 요지는 이스타마이신A로부터 이스타마이신 Ao 또는 이스타마이신B로부터 이스타마이신 Bo를 제조하는 방법을 제조하는데 이는 알카리 조건하에 물에서 용액으로이스타마이신A 또는 이스타마이신B를 가수분해시켜서 이스타마이신 Ao 또는 이스타마이신 Bo를 제조함을 뜻한다. 본 발명에 따른 이스타마이신A 또는 이스타마이신B의 알카리 가수 분해는 알카리금속이나 알카리 토류 금속수산화물 또는 탄산염, 예를 들면 수산화 나트륨, 수산화 칼륨과 수산화바륨과 같은 알카리의 존재하에 이스타마이신A 또는 이스타마이신B의 수용액을 50-110℃ 온도에서 가열시켜서 하는 것이 효과적이다. 수산화 알카리 금속과 같은 알카리는 0.1-4M의 농축물로 존재하고, 가수분해는 1-3시간내에 완성할 수 있다. 예를 들면 이스타마이신A 또는 이스타마이신B의 가수분해는 1시간동안 100℃에서 4M 수산화나트륨을 함유하는 물에서 또는 0.5M 수산화바륨을 함유하는 물에서 3시간동안 100℃에서 이를 가열시켜 성취할 수 있다. 이들 반응조건하에서 이스타마이신 Ao 또는 이스타마이신 Bo의 글리코시드 결합은 깨어지지 않는다. 또한 알카리 가수분해는 이스타마이신A 또는 이스타마이신B를 함유하는 여액 또는 배양액에서 행하여도 좋다.

본 발명의 이스타마이신A와 이스타마이신B는 동물에 대하여 높은 항균 활성을 가지고 저독성을 가진다. 따라서 이스타마이신 A와 B는 항생물질로서 공지된 항생물질과 유사한 유용성을 가지며, 공지의 약학적 형태로 만들어 공지의 항생물질과 같은 방법으로 투약한다. 또한 본 발명의 다른 요지는 안전하고 효과적인 항균양인 최소한 하나의 이스타마이신A, 이스타마이신B와 이의 산부가염을 약학적으로 허용할 수 있는 담체와 혼합하여서 된 약학적 조성물을 제공하는데 있다. 더우기 본발명은 박테리아가 증식하기 쉬운 동물에 최소한 하나의 이스타마이신A, 이스타마이신B와 이의 산부가염을 항균적으로 효과적인 양을 투약하여서 하는 박테리아증식 억제방법을 제공한다. 약을 적용하는 여러가지 요인은 예를 들어 나이, 체중, 성별, 음식물, 투약시간, 배설물의 비율, 약조성물, 반응감도와 질병상태에 따라 전문가가 선택한다. 나열된 조건에 대한 최적 적응비율은 일반적인 투약측정시험을 사용하여 전문가가 선택할 수 있다.

상술한 바와 같이, 스트렙토마이스 텐지마리엔시즈 균주 SS-939호(FERM-P 4932, ATCC번호 31603)은 새로운 항생물질, 이스타마이신을 제조하는데 유용한 새로운 균이고 전술한 균학적 성질을 갖는다. 또한 본 발명에 의하면 기균사의 색조는 백색에서 청록색을 띤 회색으로 점차적으로 변하는 특성을 가지며, 기균사는 나선상이 아니며, 포자표면이 평활하여 발색성이 있고 탄소원으로 글루코스와 이노시톨은 동화하나 아라비노스, D-키실로즈, 서당, 람노스, 라피노스와 D-만니톨은 동화하지않고, 이스타마이신A, B, Ao와 Bo를 제조할 수 있는 특징을 갖는데, 이는 실질적으로 순수하게 분리된 FERM-P 4932 또는 ATCC번호 31603으로 표시되는 스트렙토마이서 텐지마리엔시스 그자체에 있다.

이 SS-939호 균주는 10mcg/mg의 가나마이신A를 함유한 MY배지(1%의 말토스, 0.4%의 효모 추출물, 1.5%의 한천 pH7.2)에서, 일본 가나가와시, 미우라 반도 해안에서 수집한 해저토를 27℃로 3일간 배양시켜서 생육한 방선균을 모우고, 다시 탄수화물 동화성 시험배지(프리람-고틀리브 배지)에 1%의 글루코스, 키실로스, 아라비노스, 람노스, 라피노스 또는 이노시톨을 각각 함유시키고, 이 노시톨을 함유하는 배지에서 이노시틀을 동화시켜서 생육한 방선균을 분리시키므로서 에스. 테지마리에시스와 같은 악티노마이세트류를 얻을 수 있다.

전술한 방법을 사용하여 어려움없이 본 분야의 전문가는 완전한 정도로 본 발명을 이용할 수 있다. 본 발명을 실시예를 들어 구체적으로 설명하면 다음과 같고, 다음에는 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

한천 사면 배지에 배양한 스트렙토마이서 텐지마리엔시스 SS-939호 균주(FERM-P 4932, ATCC번호 31603과 동일함)를 1.0% 전분, 0.2%글루코즈, 1.0% 콩가루, 0.3% 염화나트륨, 0.1% 인산 이칼륨과 0.1% 황산 마그네슘(7H₂O)으로된 액체배지(110ml, 용량 500ml의 삼각플라스크에 넣는다)에 접종한 다음, 48시간동안 27℃에서 회전시키고 흔들면서 배양시키면 배양종자를 얻는다. 이 배양종자(220ml)를 2.0% 전분, 0.2% 글루코스, 2.0% 콩가루, 0.3% 염화 나트륨, 0.1% 인산 이칼 륨과 0.1% 황산 마그네슘(7H₂O)으로 된 15리터의 액체배지를 함유하는 30리터의 자 퍼멘터(Jar. Fermentors)에 접종시키고, 72시간동안 27℃에서 공기를 주입(분당공기 15리터)하고 교반(300r. p. m.) 하면서 배양시킨다. 6개의 자페먼터로부터 수집된 배양액을 함께 모우고 염산으로 pH2.0으로 조정한 다음 여과하면 99리터의 여액(2.5mcg/mg)을 얻는다. 12리터의 암베르라이트 IRC-50(NH₄형)(미국 롬 앤드 하스 회사의 제품)을 충전한 탑에 이 여액을 통과시켜 흡착시킨후, 24리터의 물로 세척한 다음, 1N 암모니아수로 용출시킨다. 활성 용출액(3리터)을 서로 혼합하고 진공에서 농축건조하면, 3.51g의 조(粗) 분말(역가 61mcg/mg)을 얻는다.

이 조분말을 100ml의 물에 용해시키고, 생성된 용액을 300ml의 음이온-교환수지, Dowex 1-X4(OH형)(미국 다우케미칼회사의 제품)을 채운 탑(내경 40mm)에 통과시킨 다음, 물로 탑을 전개시키고, 탑에서 유출된 첫 유출액(200ml)을 버리고, 다음 유출액(880ml)을 모아서, 이스타마이신을 흡착시키기 위해 150ml의 암베르라이트 CG-50(NH₄형)을 충전한 탑(내경 25mm)에 통과시킨다. 이 양이온-교환수지 탑을 물(300ml)로 세척한 다음, 900ml의 0.2N 암모니아수로 용출시킨후, 900ml의 0.4N 암모니아수로 용출시킨다. 용출액을 18ml-유분기에 수집한다. 활성유분 Nos. 66-80을 혼합하고, 감압하에 농축건조시키면 이스타마이신 A와 B로 된 210mg의 백색분말을 얻는다(역가 460mcg/mg) 분획 Nos. 28-65를 유사한 방법으로 제조하면 이스타마이신 A, B, Ao와 Bo 이외의 수종의 다른 항생물질이 용리된다.

[실시예 2]

실시예 1에서와 같은 방법으로 스트렙토마이서 텐지마리엔시스를 배양시켜서 얻은 여액(150리터, 자 퍼멘터 10분기)을 20리터의 암베르라이트 IRC-50(NH₄형) 이 충전된 탑에 통과시켜서 흡착시키고, 물(40리터)로 세척한후, 1N 암모니아수로 용출하고, 활성 용출액을 감압하에 농축건조 시키면, 4.1g의 조분말(역가 240mcg/mg)을 얻는다.

이 조분말을 20ml의 물에 용해시키고, 이 수용액을 200ml의 Dowex 1-X4(OH형)을 충전한 탑(내경 30mm)에 넣고, 다음 물로 탑을 전개시킨다. 첫 유출물(270ml)을 버리고, 다음 유출물(270ml)을 모은 다음, 이를 150ml의 암베르라이트 CG-50(NH₄형)의 탑으로 통과시켜서 흡착시키고, 150mL의 물로 세척한 다음, 900ml의 0.2N 암모니아수와 9000ml의 0.4N 암모니아수로 용출한다. 용출액을 18ml씩 분획하고, 분획 Nos. 55-90을 함께혼합하고, 감압하에 농축건조하면 이스타마이신A와 B로 된 980mg의 백색분말(역가 940mcg/mg)을 얻는다.

[실시예 3]

상기 실시예 2에서 얻은 이스타마이신A와 B를 함유하는 980ml의 백색 분말(역가 940mcg/mg)을 15ml의 n-부탄올-피리딘-초산-물(용적으로 6 : 4 : 2 : 2)의 혼합물에 흡수시키고, 생성된 용액을 60g의 셀루로즈분말(아비셀, 푸라코시 야구힌회사의 제품)을 충전한 탑(내경 25mm)에 넣고, 셀루로즈 탑을 먼저 1200ml의 n-부탄올-피리딘-초산-물(용적으로 6 : 4 : 2 : 2)의 혼합물로 전개한 다음, 600ml의 n-부탄올-피리딘-초산-물(용적으로 6 : 4 : 2 : 4)의 혼합물로 전개시킨다. 용출액을 10ml씩 분획하고, 분획 Nos. 45 - 74에 이스타마이신B만 용출되고, 분획 Nos. 114 - 154에 이스타마이신A만 용출되고, 분획 Nos. 75 - 113에 이스타마이신A외 B가 혼합물로 용출된다.

상술한 분획 Nos. 45-74를 혼합하고, 감압하에 농축건조하면 분말을 얻는데, 이를 5ml의 물에 용해시킨다. 이렇게 얻은 이스타마이신 B의 수용액을 25ml의 암베르라이트 CG-50(NH₄형)을 충전시킨 탑에 통과시켜 흡착시키고, 25ml의 물로 세척한후, 0.4N 암모니아수로 용출시킨다. 활성 용출액(40ml)을 감압하에 농축 건조시키면 15.3mg의 정제 분말인 이스타마이신 B(역가 3170mcg/mg)를 얻는다.

상술한 분획 Nos. 114 - 154를 혼합하고, 감압하에 농축건조시키면 분말을 얻는데, 이를 5ml의 물에 용해시킨다. 이렇게 얻은 이스타마이신A 수용액을 25ml의 암베르라이트 CG-50(NH₄형)을 충전한 탑에 통과시켜 흡착시키고 25ml의 물로 세척한후, 0.4N 암모니아수로 용출시킨다. 활성 용출액(45ml)을 감압하에 농축 건조시키면, 50mg의 정제 분말(역가 1000mcg/mg)을 얻는다.

[실시예 4]

한천 사면 배지에 배양한 스트렙토마이서 텐지마리엔시스 SS-939호 균주(FERM-P 4932, ATCC번호 31603과 동일함)을 1.0% 전분, 0.2%글루코스, 1.0% 콩분말, 0.3% 염화나트륨, 0.1% 인산이칼륨과 0.1% 황산 마그네슘(7H₂O)으로 된 액체배지(500ml의 삼각플라스크중 110ml)에 접종하고, 흔들고 회전시키면서 48시간동안 27℃에서 배양하면 배양종자를 얻는다. 이 배양종자(220ml)를 2.0% 전분, 0.2% 글루코스, 2.0% 콩분말, 0.2% 팔미틴산 나트륨, 0.3% 염화 나트륨, 0.1% 인산 이칼륨과 0.1% 황산 마그네슘(7H₂O)으로 된 15리터의 액체 배지를 함유하는 30리터의 자 퍼멘터에 접종하고, 공기를 주입하고(분당 15리터의 공기), 교반(300r. p. m.) 하면서, 72시간 27℃에서 배양시킨다.

이렇게 생성된 배양액을 10개의 자 퍼멘터로부터 모우고, 염산으로 pH2.0으로 조정한 다음 여과하면, 150ml의 여액(역가 6mcg/mg)을 얻는다. 이 여액을 12리터의 암베르라이트 IRC-50(NH₄형)을 충전한 탑에 통과시켜서 흡착시키고, 24리터의 물로 세척한후, 1N 암모니아수로 용출시킨다. 활성 용출액(5.6리터)을 함께 혼합하고 감압하에 농축시킨다. 생성된 농축액을 200ml 암베르라이트 CG-50(NH₄형)을 충전한 탑에 200ml의 넣어 물로 세척한 후, 1200ml의 0.2N암모니아수로 세척한 다음, 1200ml의 0.4N 암모니아수로 용출시키고, 용출액을 18ml씩 분획한다.

분획 Nos. 80-166을 혼합하고, 감압하에 농축건조하면 240mg의 이스타마이신 조분말역가)380mcg/mg)을 얻는다. 정제되고 역가가 1350mcg/mg인 이스타마이신B의 백색분말을 얻을때까지 이 조분말을 클로로포름-메탄올-8.5% 암모니아수(2 : 1 : 1) 혼합물의 하층으로 전개하는 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 되풀이한다. 수율 25mg.

분획 Nos. 107-124를 혼합하고 감압하에 농축건조하면 이스타마이신A, Ao와 Bo를 함유하는 380mg의 조분말(역가 180mcg/mg)을 얻는다. 이 조분말을 38g의 실리카겔(60, 독일 이. 메르크회사의 제품)을 사용하여 컬럼크로마토그라피하고 클로로포름-메탄올-8.5% 암모니아수(용적으로 2 : 1 : 1)의 하층을 혼합용매로 하여 전개한다. 실리카겔 컬럼으로부터의 용출액을 5ml씩 분획한다.

분획 Nos. 54-61을 혼합하고 감압하에 농축한 다음 3ml의 암베르라이트(NH₄형)의 탑에 흡착시키고, 0.5N 암모니아수로 용출하고, 활성 용출액을 감압하에 농축건조하면 정제된 이스타마이신 Ao의 무색 결정성 분말(역가 5mcg/mg)을 얻는다. 수율 25mg.

분획 Nos. 65-76%을 혼합하고 감압하에 농축한 다음, 실리카겔(10g) 크로마토그라피하여 정제하고, 클로로포름-메탄올-8.5% 암모니아수(2 : 1 : 1) 혼합용매 하층으로 전개한다. 이러한 방법으로 정제된 이스타마이신A의 무색분말(역가 1000mcg/mg)을 수율 23mg으로 얻는다.

분획 Nos. 77-90을 혼합하고 감압하에 농축한 다음, 3ml의 암베르라이트 CG-50(NH₄형)을 충전한 탑에 통과시켜서 흡착시키고, 0.5N 암모니아수로 용출시키고, 활성 용출액을 감압하에 농축건조하면 정제된 이스타마이신 Bo의 무색 결정성 분말(역가 10mcg/mg)을 얻는다. 수율 18mg.

[실시예 5]

이 실시예와 다음 실시예는 알카리 가수분해에 의하여 이스타마이신 A 또는 이스타마이신 B로부터 이스타마이신 Ao 또는 Bo의 제조를 예를 든 것이다.

2ml의 물에 20mg의 이스타마이신A를 용해시킨 용액을 300mg의 수산화 바륨(Ba(OH)₂.8H₂O)을 혼합하고, 이스타마이신 A의 알카리 가수분해를 효과적으로 하기 위하여 혼합물을 밀폐관에서 3시간동안 100℃에서 가열한다. 반응혼합물을 고체 이산화탄소를 가하여 중화한 다음 여과하고, 여액을 3ml의 암베르라이트 CG-50(NH₄형)의 탑에 통과 흡착시키고, 0.5N 암모니아수로 용출시킨다. 활성 용출액을 감압하에 농축건조하면 16mg의 무색결정성 분말인 정제된 이스타마이신A를 얻는다.

이스타마이신B(20mg)를 상술한 방법과 같은 방법으로 알카리 가수분해하면, 정제된 이스타마이신Bo의 무색결정성 분말을 15mg 얻는다.

[실시예 6]

1.0% 전분, 0.2% 글루코스, 1.0% 콩분말, 0.3% 염화나트륨, 0.1% 인산 이칼륨과 0.1% 황산 마그네슘(7H₂O)으로 된 액체 배지(pH7.0, 50리터)에 한천 사면배지에 배양한 스트레토마이서 텐지마리엔시스 SS-939호 균주(FERM-P 4932)를 접종하고, 28℃에서시 24간동안 공기를 주입하고(분당공기 50리터) 교반(200r. p. m.) 하면서 배양하면 배양종자가 생성된다. 이 배양종자 20리터를 4.0% 전분, 0.4% 글루코스, 5.0% 소맥배아, 0.6% 탄산칼슘과 0.3% 염화 나트륨으로 된 1000리터 액체 배지(pH7.0)를 함유하는 용량 2톤의 스테인레스 스틸 배양탱크이 접종하고 28℃에서 108시간 동안 공기를 주입하고(분당공기 800리터), 교반(280r. p. m.)하면서 배양시킨다.

이렇게 얻은 배양액(pH7.3)을 염산으로 pH2.0으로 조정한 다음 여과하고, 여액에 수산화 나트륨 수용액을 가하여 중화하면 850리터의 배양액(pH 6.2, 역가 105mg/ml)을 얻는다. 이 배양액을 55리터의 암베르라이트 IRC-50(NH₄형)의 탑에 통과시켜서 흡착시키고, 300리터의 물로 세척한후, 1.1N 암모니아수로 용출하고, 첫 용출액(38리터)을 버리고, 다음 용출액(188리터)을 수집한 다음, 감압하에 2.8리터까지 농축한다.

농축액에 475.2g의 수산화 바륨(Ba(OH)₂. 8H₂O)을 가한 다음, 환류하에 3시간동안 110℃로 가열하고, 반응혼합물에 1960ml의 2N 황산을 가하여 중화한 다음 여과하고, 이 여액을 15리터의 암베르라이트 CG-50(NH₄형)의 탑에 통과시켜 흡착시키고, 45리터의 물로 세척한후, 하기에 표시된 각 농도의 암모니아수로 순차적으로 용출하고 용출액을 33리터씩 분획한다.

분획 Nos. 82-104를 수집하고 감압하에 농축건조하면 이스타마이신 Ao를 함유하는 38.05g의 조분말을 얻는다. 또한 분획 Nos.105-134를 수집하고, 감압하에 농축 건조하면 이스타마이신 Bo를 함유하는 19.19g의조분말을 얻는다.

[실시예 7]

실시예 6에서 얻은 이스타마이신Ao(2.0g)의 조분말을 180g의 실리카겔의 컬럼을 사용하여 컬럼 크로마토그라피하고 클로로포름-메탄올-8.5% 암모니아수(용적으로 2 : 1 : 1)로 된 하층을 전개용매로 한 실리카겔(180g) 컬럼 크로마토그라피로 정제하고, 용출액을 25-ml씩 분획한다.

분획 Nos.65-104를 감압하여 농축건조하면 정제된 이스타마이신Ao의 무색 결정성 분말을 얻는다. 수율 566mg.

실시예 6에서 얻은 이스타마이신 Bo(2.0g)의 조분말을 상기와 같은 방법으로 실리카겔 컬럼 크로마토그라피하여 정제하고 용출액을 23ml씩 분획한다. 분획 Nos. 73-170을 감압하에 농축건조하면 정제된 이스타마이신 Bo의 무색 결정성 분말을 얻는다. 수율 1369mg.

Claims

탄소와 질소원을 함유하는 배양액에서 호기성 조건하에 스트렙토마이세스 텐지마리엔시스 SS-939호 균주를 배양하여 실제량의 이스타마이신을 배양액에 축적시킨 다음, 이 배양액으로부터 이스타마이신A, 이스타마이신B, 이스타마이신Ao 또는 이스타마이신Bo 및 이들 이스타마이신A, B, Ao와 Bo의 최소한 둘의 혼합물을 채취함을 특징으로 하는 이스타마이신의 제조방법.