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KR20250048269A - 선택적 hdac6 억제제로서의 디플루오로- 및 트리플루오로-아세틸 히드라지드 - Google Patents

선택적 hdac6 억제제로서의 디플루오로- 및 트리플루오로-아세틸 히드라지드 Download PDF

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KR20250048269A
KR20250048269A KR1020257005855A KR20257005855A KR20250048269A KR 20250048269 A KR20250048269 A KR 20250048269A KR 1020257005855 A KR1020257005855 A KR 1020257005855A KR 20257005855 A KR20257005855 A KR 20257005855A KR 20250048269 A KR20250048269 A KR 20250048269A
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KR
South Korea
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alkyl
compound
methyl
difluoroacetyl
triazol
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020257005855A
Other languages
English (en)
Inventor
마티아 마르치니
바바라 베르가니
에도아르도 셀루피카
지안루카 카프리니
파올라 코르델라
지안루카 포사티
일라리아 로치오
지오바니 산드로네
안드레아 스테베나치
크리스티앙 스텐퀼러
Original Assignee
이탈파마코 에스.피.에이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이탈파마코 에스.피.에이. filed Critical 이탈파마코 에스.피.에이.
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Abstract

본 발명은 히스톤 데아세틸라제 6(HDAC6)에서 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸의 효소 가수분해에 의해 동일 반응계에서 수득된 아실히드라지드에 관한 것이다.

Description

선택적 HDAC6 억제제로서의 디플루오로- 및 트리플루오로-아세틸 히드라지드
본 발명은 히스톤 데아세틸라제 6(histone deacetylase 6)(HDAC6)에서 모 프로드럭(parent prodrug) 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸의 효소 가수분해에 의해 동일 반응계(in situ)에서 수득된 아실히드라지드에 관한 것이다.
발명의 선행 기술
Zn 의존성 히스톤 데아세틸라제(HDAC)는 히스톤, 비히스톤 단백질 및 폴리아민에서 아세틸 또는 미리스토일 잔기의 제거를 촉매하는 11개의 진화적으로 관련된 가수분해효소의 계열이다(Biochemistry. 57, 3105-3114; Mol. Cell. Proteomics. 21, 100193; J. Genet. Genomics. 44, 243-250). 수많은 질환에 HDAC가 관여하는 것을 감안할 때, 제약 산업은 거의 20년 동안 HDAC 억제제들(HDACis) 개발을 추진해 왔으며, 그 노력으로 암 치료를 위한 5개 분자가 승인되었다(Br. J. Clin. Pharmacol. 87, 4577-4597). 불행히도, HDACis의 치료적 이점은 이러한 1세대 분자의 불량한 선택성으로 인해 모든 Zn 의존성 HDAC 계열 구성원을 억제하여 중요한 생리적 기능에도 영향을 미치는 부작용으로 인해 제한되어 왔다.
HDAC6은 Zn 의존성 HDAC의 11가지 인간 이소형 중에서 유일하게 2개의 상동 탠덤 촉매 도메인(CD1 및 CD2)과 아연 핑거 유비퀴틴 결합 도메인을 가지고 있어 두드러진다. 또한, HDAC6은 주로 세포질에 국한되어 있으며 그 주요 기질은 히스톤이 아니라 α-튜불린, Foxp3, Hsp90, β-카테닌, 코르타크틴 및 퍼옥시레독신과 같은 다양한 비히스톤 단백질이다. 흥미롭게도, HDAC6 KO 마우스는 생존 가능하고 번식력이 있으며 명백한 생리적 기능 장애를 보이지 않는다(Mol. Cell. Biol. 28, 1688-1701). 또한, 선택적 HDAC6 억제는 전임상 종과 인간 임상 시험 둘 모두에서 내약성이 우수한 것으로 입증되었다(Oncologist. 26, 184-e366).
HDAC6은 유비퀴틴-프로테아좀과 응집체 경로 둘 모두에서 면역 반응을 조절하고 신경병증 발병 및 알츠하이머병에 중요한 역할을 하기 때문에, 매우 특이적인 HDAC6 억제제의 식별에 많은 관심이 있다(J. Med. Chem. 64, 1362-1391).
고전적인 HDACi 약물작용발생단(pharmacophore)은 활성 부위 Zn 이온과 상호작용하는 아연 결합 기(zinc binding group: ZBG), 효소의 외부 영역과 상호작용하는 캡, ZBG를 캡에 연결하는 링커로 이루어진다. 대부분의 HDAC는 안정성과 안전성 문제가 내재된 화학 기인 ZBG로서 하이드록삼산 모이어티를 갖는다. 하이드록사메이트 기는 차선의 약동학 및 잠재적 유전독성과 관련된 대사 핫스팟이다.
WO2022/029041, WO2022/013728, WO2021/127643, WO2020/212479 및 WO2022/049496에는 하이드록사메이트에 대한 잠재적 대안으로서 옥사디아졸 기반 HDAC6 억제제가 개시되어 있지만 그 작용 메커니즘은 불분명하다.
본 발명자들은 디플루오로- 및 트리플루오로-아세틸 히드라지드를 HDAC6의 긴밀한 결합 억제제로서 확인하였으며, 적합하게 설계된 프로드럭으로부터 동일 반응계에서 형성될 때 효소와 함께 수명이 긴 복합체를 형성하였다.
본 발명자들은 놀랍게도 디플루오로메틸-1,3,4-옥사디아졸(DFMO) 및 트리플루오로메틸-1,3,4-옥사디아졸(TFMO)이 HDAC6의 기질이며, HDAC6이 이들을 해당 디플루오로- 또는 트리플루오로-아세틸 히드라지드로 가수분해할 수 있음을 발견하였다. 따라서, DFMO 및 TFMO는 아실히드라지드의 동일 반응계 생성을 위한 프로드럭으로서 선택되었다.
본 발명자들은 정상 상태 전 동역학(pre-steady state kinetics), 급속 크로마토그래피 및 질량 분석법을 사용하여 DFMO 및 TFMO 함유 화합물의 억제 메커니즘을 분석하여 HDAC6-촉매된 DFMO 및 TFMO 고리 수화/개환이 해당 아실히드라지드와 효소의 긴밀하고 수명이 긴 복합체를 형성한다는 것을 보여주었다. 효소로부터 해리되면 수화된 억제제는 결국 HDAC6과 재결합하여 이에 따라 추가 가수분해를 거쳐 친화도가 더 낮은 히드라지드 복합체를 생성할 수 있다.
본 발명자들은 또한 DFMO 화합물에 결합된 HDAC6-CD2의 x선 결정 구조를 규명함으로써 이 메커니즘을 확인할 수 있었다. 본 발명자들은 놀랍게도 활성 부위에서의 전자 밀도가 모 프로드럭의 구조와 호환되지 않지만, 히드라지드(즉, 최종 가수분해 생성물)의 구조에는 완벽하게 적합할 수 있었다는 것을 발견하였다.
본 발명의 목적인 아실 히드라지드 함유 화합물은 효소 또는 세포에 직접 투여하면 활성화되지 않지만, DFMO 및 TFMO 프로드럭으로부터 동일 반응계에서 형성될 때는 인상적으로 강력하고 선택적이다.
프로드럭(DFMO 및 TFMO 함유 HDAC6 억제제)에 초점을 맞추어, 본 발명자들은 HDAC6이 다른 모든 HDAC에 비해 10000배 초과의 선택성을 가지며, 우수한 약물 유사 특성, 안전성 특징 및 시험관 내 및 생체 내 약리학적 활성을 갖는 분자를 식별할 수 있었다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖도록 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어들이 명확성 및/또는 쉬운 참조를 위해 본원에 정의되고; 따라서, 이러한 정의가 본원에 포함된다고 해서 당해 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것과 상당한 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
용어 "할로겐"은 본원에서 불소(F), 염소(Cl), 브롬(Br), 또는 요오드(I)를 지칭한다.
용어 "C1-C6 알킬"은 본원에서 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 분지형 또는 선형 탄화수소를 지칭한다. C1-C6 알킬 기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "아릴"은 본원에서 모노- 및 폴리-카르보사이클릭 방향족 고리 시스템(i)을 지칭하며, 여기서 폴리-카르보사이클릭 고리 시스템 내의 개별 카르보사이클릭 고리는 단일 결합에 의해 서로 융합되거나 부착될 수 있다. 적합한 아릴 기는 페닐, 나프틸 및 바이페닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "아릴옥시"는 본원에서 O-아릴 기를 지칭하고, 여기서 "아릴"은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "알콕시"는 본원에서 O-알킬 기를 지칭하고, 여기서 "알킬"은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "티오알콕시"는 본원에서 S-알킬 기를 지칭하고, 여기서 "알킬"은 상기 정의된 바와 같다. 바람직한 티오알콕시 기는 티오에톡시(-SEt) 또는 티오메톡시(-SMe)이고, 더욱 더 바람직하게는 티오메톡시이다. 다른 실시양태에서, 티오알콕시 기는 알킬 사슬의 비말단 탄화수소 단위 중 하나가 황 원자로 대체된 알킬 기를 지칭한다.
용어 "할로겐화"는 본원에서 할로겐 치환을 지칭하며, 다시 말해, 상기 알킬, 알콕시, 티오알콕시 기 중 어느 것이든 할로겐 원자로 완전히 또는 부분적으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 할로겐 원자는 F 또는 Cl이고, 더욱 바람직하게는 F이다.
용어 "사이클로알킬"은 본원에서 바람직하게는 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 탄화수소 고리를 지칭한다. 사이클로알킬의 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸이 포함된다.
용어 "아릴알킬"은 본원에서 정의된 바와 같은 아릴 라디칼이 본원에서 정의된 바와 같은 알킬 라디칼에 부착된 것을 지칭한다. 아릴알킬의 예로는 벤질이다.
용어 "중수소화"는 본원에서 중수소 치환을 지칭하며, 다시 말해, 수소 원자는 중수소로 부분적으로 또는 완전히 대체될 수 있다.
용어 "헤테로사이클"은 본원에서 포화 또는 불포화되고 탄소 원자와 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자로 이루어진 4, 5, 6, 7 또는 8원 모노사이클릭 고리를 지칭하며, 여기서 질소 및 황 헤테로원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 선택적으로 4차화될 수 있다. 헤테로사이클릭 고리는 부착으로 인해 안정적인 구조를 생성하는 경우, 어떠한 헤테로원자 또는 탄소 원자에도 부착될 수 있다. 상기 용어는 또한 상기 헤테로사이클릭 고리 중 어느 것이든 아릴 또는 또 다른 헤테로사이클에 융합된 임의의 바이사이클릭 시스템을 포함한다. 헤테로사이클릭 고리가 방향족사이클릭 고리인 경우, "헤테로방향족 고리"로 정의될 수 있다.
용어 "불포화 고리"는 본원에서 부분적으로 또는 완전히 불포화 고리를 지칭한다. 예를 들어, 불포화 C6 모노사이클릭 고리는 사이클로헥센, 사이클로헥사디엔 및 벤젠을 지칭한다.
용어 "치환된"은 본원에서 이러한 단일 또는 다중 치환이 화학적으로 허용되는 경우, 정의된(또는 정의되지 않은) 치환체로 단일 또는 다중 치환을 지칭한다.
용어 "생리학적으로 허용되는 부형제"는 본원에서 그 자체로는 어떠한 약리학적 효과도 없고 포유류, 바람직하게는 인간에게 투여할 때 부작용을 일으키지 않는 물질을 지칭한다. 생리학적으로 허용되는 부형제는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌(Handbook of Pharmaceutical Excipients, sixth edition 2009)에 개시되어 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염 또는 이의 유도체"는 본원에서 염화 또는 유도체화된 화합물의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고, 포유류, 바람직하게는 인간에게 투여할 때 부작용을 일으키지 않는 염 또는 유도체를 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 염은 무기염 또는 유기염일 수 있고; 약제학적으로 허용되는 염의 예로는 탄산염, 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 황산수소, 시트르산염, 말레산염, 푸마르산염, 트리플루오로아세트산염, 2-나프탈렌설폰산염, 및 파라톨루엔설폰산염이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용되는 염에 대한 추가 정보는 본원에 참조로 포함된 문헌(Handbook of pharmaceutical salts, P. Stahl, C. Wermuth, WILEY-VCH, 127-133, 2008)에서 찾을 수 있다. 약제학적으로 허용되는 유도체에는 에스테르, 에테르 및 N-옥사이드가 포함된다.
"포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)" 및 "함유하는(containing)"이라는 용어는 개방형 용어("포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미함)로 이해되어야 하며, "본질적으로 이루어진다", "본질적으로 이루어지는", "이루어진다" 또는 "이루어진"과 같은 용어도 뒷받침하는 것으로 간주되어야 한다.
용어 "본질적으로 이루어진다", "본질적으로 이루어진"은 반폐쇄적 용어로 이해되어야 하며, 이는 본 발명의 신규한 특성에 영향을 미치는 다른 성분이 포함되지 않음을 의미한다(따라서, 선택적 부형제가 포함될 수 있음).
용어 "이루어진다", "이루어진"은 폐쇄적 용어로 이해되어야 한다.
용어 "이성질체"는 입체이성질체(또는 공간 이성질체), 즉 부분입체이성질체 및 거울상이성질체를 지칭한다.
도 1은 DFMO 고리 개방 및 관련 아실-히드라지드 및 히드라지드 형성에 대한 가설된 메커니즘을 나타낸다.
도 2는 긴 수명/긴밀한 복합체의 단리를 나타낸다(실시예 10).
디플루오로메틸-1,3,4-옥사디아졸(DFMO) 및 트리플루오로메틸-1,3,4-옥사디아졸(TFMO)은 HDAC6의 기질로 밝혀졌으며, 이는 이들을 해당 디플루오로- 또는 트리플루오로-아세틸 히드라지드로 가수분해할 수 있다.
일부 DFMO 및 TFMO 억제제를 HDAC6과 함께 인큐베이션하고 LC-MS에 의해 배지를 분석하는 동역학 연구가 수행되었다. 실제로, DFMO 화합물이 소멸되고 해당 아실히드라지드(질량 분석 연구의 표준으로서 사용됨)가 형성되는 것이 관찰되었다. 억제제 및 단백질 농도 측면에서 극한의 비생리학적 조건을 사용하여 히드라지드의 형성도 관찰되었다. 동일한 완충 배지에 동일한 시간 동안 효소 없이 용해된 동일한 DFMO 및 TFMO 억제제는 어떠한 분해 현상도 나타내지 않았다. 이러한 실험으로 DFMO 및 TFMO가 HDAC6의 기질로 간주될 수 있음을 확인한다.
DFMO 및 TFMO 화합물과 관련된 느린 결합/느린 방출 동역학에 흥미를 느껴, LC-HRMS와 관련된 스핀 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 긴밀한 결합 종을 식별하여 수명이 긴 억제제-HDAC6 복합체를 형성하였다(실시예 10 참조). DFMO 또는 TFMO 화합물과 함께 인큐베이션했을 때 zHDAC6-CD2와 공동 용출된 우세한 종은 해당 아실히드라지드였다. 이러한 수화물 형태 및 해당 히드라지드는 또한 효소에 결합되지 않은 유리 화합물을 함유하는 분획에서도 검출되었다. 흥미롭게도, DFMO 및 TFMO 모 화합물은 효소와 공동 용출되지 않았다.
흥미롭게도, 효소와 디플루오로메틸아실히드라지드를 직접 인큐베이션해도 효소 억제가 유도되지 않아서 이는 이러한 종이 동일 반응계에서 형성될 때만 활성화된다는 것을 시사한다. 대신에 본 데이터는 고친화도 종이 동일 반응계에서 형성된 아실히드라지드임을 시사한다.
분자 모델링과 결합된 결정학적 데이터는 가정된 메커니즘을 뒷받침한다. DFMO 함유 화합물을 공결정화할 때 히드라지드를 발견하였다. 가정된 히드라지드는 두 가지 후속 반응의 결과로서 형성될 수 있었다. 억제제가 촉매 포켓에 진입한 후, 활성 부위 Zn 양이온은 DFMO 모이어티의 CHF2 기에 직접 결합된 sp2 탄소 원자의 친전자적 거동을 향상시켜 금속 양이온 배위 구에 존재하는 것으로 모델링 연구에 의해 뒷받침되는 물 분자에 의한 친핵성 공격을 가능하게 할 수 있다. 수화된 중간체는 개환 반응에서 추가로 반응하여 아실-히드라지드를 생성할 수 있다(도 1, 단계 1). 결정 구조에서 검출된 히드라지드를 설명하기 위해, 효소가 촉매되거나 효소 활성 부위로부터 아실-히드라지드가 방출될 때 용액에서 발생할 수 있는 추가적인 가수분해 반응을 가정해야 한다. 제2 가수분해 반응이 실제로 효소 촉매화되는 경우, 아연 배위 구는 제2 물 분자의 유입에 의해 복구될 필요가 있다. 이어서, 금속 양이온은 아실 카르보닐을 활성화하여 표준 탈아세틸화와 히드라지드 및 디플루오로아세트산의 후속 방출을 가능하게 할 수 있다(도 1, 단계 2).
본 발명자들은 놀랍게도 DFMO 억제제가 HDAC6의 존재 하에 가수분해되어 실제 활성 선택적 HDAC6 억제제인 해당 디플루오로메틸아실히드라지드를 생성한다는 것을 발견하였다.
제1 양태에 따르면, 본 발명은 화학식 I의 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이성질체에 관한 것이다:
[화학식 I]
상기 식에서,
W = H 또는 F이고,
G는 탄소 원자와 N, O, S 및 Se로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 이루어진 5원 헤테로방향족 고리로, 이는 선택적으로 C1-C3 알킬, 알콕시, 또는 티오알콕시, 이들의 할로겐화 유도체, 또는 할로겐, 또는 하이드록시로 치환되거나;
G는 화학식 Ia이고:
[화학식 Ia]
상기 식에서, X, X', Y 및 Y'는 CH, N, CF 또는 CCl로부터 독립적으로 선택되고;
Z = -CD2-, -CF2-, -CHR2-, -NH-, -S-이고;
R2 = H, 할로겐, 비치환되거나 하기로 치환된 C1-C6 알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬이고:
ㆍ 하이드록시, 카르보닐, C1-C3 알콕시, 아릴옥시 또는 티오알콕시, 또는 이들의 할로겐화 유도체;
ㆍ 할로겐;
ㆍ C1-C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체로 치환된 1차, 2차, 또는 3차 아민;
ㆍ 비치환되거나 C1-C3 알킬, 알콕시, 티오알콕시 또는 이들의 할로겐화 유도체, 또는 할로겐으로 치환된 페닐, 피리딜, 티오페닐, 푸란 또는 피롤; 또는
ㆍ 다음의 하위 구조 또는 이들의 할로겐화 유도체:
L은 부재, C1-C6 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시, -(CH2)m-CHR4-(CH2)o-, -(CH2)m-CH(NHR4)-(CH2)o-, -(CH2)m-NR4-(CH2)o- 또는 이들의 할로겐화 유도체이고;
여기서 m 및 o는 각각 독립적으로 0, 1 또는 2이거나;
L은 다음의 하위 구조식 (IIa) 내지 (IIf) 및 이들의 할로겐화 유도체 중에서 선택되고:
상기 식에서, a, b, c 및 d는 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3이고, a 및 b는 동시에 0이 될 수 없고;
Q는 CH2, NR4 또는 O이고;
상기 식에서, n은 0, 1, 또는 2이고;
Y"는 부재, C1-C2 알케닐이거나, 다음의 하위 구조 및 이들의 할로겐화 유도체 중에서 선택되고:
상기 식에서, a, b 및 Q는 상기 정의된 바와 같고;
R4 = H, 비치환되거나 하기로 치환된 C1-C4 알킬이고:
ㆍ 할로겐
ㆍ 비치환되거나 C1-C3 알킬, 알콕시, 티오알콕시 또는 이들의 할로겐화 유도체, 또는 할로겐으로 치환된 페닐, 피리딜, 티오페닐, 푸란 또는 피롤;
P는 비치환되거나 치환된, 방향족 또는 비방향족 5 내지 10원 헤테로사이클릭 고리이고, 여기서 상기 고리는 탄소 원자와 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자로 이루어지고;
R1은 부재, 할로겐, 비치환되거나 치환된 -C(=O)C1-C4 알킬, C1-C4 알킬, C4-C6 사이클로알케닐, C6-C12 아릴, 또는 N, O 및 S로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 9원 헤테로아릴이고;
단, 다음 화합물은 제외된다:
- 3-[2-[[4-[[(2,2-디플루오로아세틸)아미노]카르바모일]페닐]메틸]테트라졸-5-일]벤조산
- 2-((5-(6-아미노피리딘-3-일)-2H-테트라졸-2-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)피리미딘-5-카르보히드라지드
- tert-부틸 (5-(1-((6-(2-(2,2-디플루오로아세틸)히드라진-1-카르보닐)피리다진-3-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)피리딘-2-일)카르바메이트
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-4-((5,5-디메틸-2,4-디옥소-3-페닐이미다졸리딘-1-일)메틸)-3-플루오로벤조히드라지드
- 4-((5,5-디메틸-2,4-디옥소-3-페닐이미다졸리딘-1-일)메틸)-3-플루오로-N'-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤조히드라지드
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-4-((2,5-디옥소-3-페닐이미다졸리딘-1-일)메틸)-3-플루오로벤조히드라지드
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((1-(3-플루오로페닐)-8-(옥세탄-3-일)-2,4-디옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데칸-3-일)메틸)니코티노히드라지드
- 4-((1H-이미다졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)벤조히드라지드
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-4-(피리미딘-2-일아미노)벤조히드라지드
- 벤질 4-((5-(2-(2,2-디플루오로아세틸)히드라진-1-카르보닐)피리미딘-2-일)아미노)-4-페닐피페리딘-1-카르복실레이트
- 4-((1-(3-클로로-4-시아노페닐)-3,5-디메틸-1H-피라졸-4-일)메틸)-N'-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤조히드라지드.
바람직한 화합물의 또 다른 부류는 화학식 I의 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이성질체를 포함하고, 여기서 R2는 H이거나, 비치환되거나 하기로 치환된 C1-C3 알킬이다:
ㆍ C1-C3 알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬
ㆍ 하이드록시, 카르보닐, C1-C2 알콕시, 아릴옥시 또는 티오알콕시, 또는 이들의 할로겐화 유도체;
ㆍ 할로겐;
ㆍ C1-C3 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체로 치환된 1차, 2차, 또는 3차 아민;
ㆍ 비치환되거나 C1-C3 알킬, 알콕시, 티오알콕시 또는 이들의 할로겐화 유도체, 또는 할로겐으로 치환된 페닐, 피리딜, 티오페닐, 푸란 또는 피롤; 또는
ㆍ 다음의 하위 구조 또는 이들의 할로겐화 유도체:
.
바람직한 화합물의 또 다른 부류는 화학식 I의 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이성질체를 포함하고, 여기서 P는
이고,
상기 식에서,
A = C, N, O, S이고;
B = C, N이고;
D = C, N, O이고;
E = C, N, O이고;
M = C, N이고;
R5 및 R6은 독립적으로 -H, 할로겐, =O, C1-C6 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시, C3-C6 사이클로알킬, 또는 이들의 할로겐화 유도체로, 선택적으로 카르보닐 또는 카르복시로 치환되거나, R5 및 R6은 다음의 하위 구조 중에서 독립적으로 선택되고:
R3은 부재, -H, -OH 또는 -N(C1-C5 알킬)2로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, -LR1이거나, 다음의 하위 구조 중에서 선택되고:
R3 = -LR1인 경우, M에 대한 치환은 부재이고;
Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시, C3-C6 사이클로알킬, 또는 이들의 할로겐화 유도체이다.
바람직한 화합물의 또 다른 부류는 화학식 I의 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이성질체를 포함하고, 여기서 P는 다음의 하위 구조 중에서 선택된다:
상기 식에서, Ra 및 Rb는 제3항에 정의된 바와 같거나, -L-R1이고;
Rc는 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시, C3-C6 사이클로알킬, 또는 이들의 할로겐화 유도체, 또는 -NH2이다.
바람직한 화합물의 또 다른 부류는 화학식 I의 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이성질체를 포함하고, 여기서 R1은 다음의 하위 구조 중에서 선택된다:
상기 식에서, R6 및 R7은 -H, -D, -OH, C1-C4 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체, 할로겐, -(CH2)aNR'R", -NHR8, -C(=O)OR', -C(=O)R9, -C(=NH)R9, -NO2, -CN, -Ph, -SO2-N R'R", =O, =NR8, -SO2-C1-C4 알킬을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되거나,
R6 및 R7은 다음의 하위 구조 중에서 독립적으로 선택되고:
R8 = -H, -D, -OH, C1-C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체, -(CH2)aNR'R", -C(=O)OR', -C(=O)R9, -C(=NH)R9, -(CH2)aPh, -(CH2)aPy, -SO2-C1-C4 알킬이거나, R8은 다음의 하위 구조 중에서 선택되고:
R9 = -NR'R", C1-C4 알킬, 또는 이들의 할로겐화 유도체이거나, 다음의 하위 구조 중에서 선택되고:
R10 및 R11은 -H, C1-C4 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체, -OR', -C(=O)OR', -C(=O)R', 또는 할로겐으로부터 독립적으로 선택되고;
Q1은 CH2, O, S, NR8이고;
Q2 및 Q3은 독립적으로 CR'R", CF2, O, S, NR8이고;
R' 및 R"는 독립적으로 -H, C1-C4 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체이고;
a, b, c, 및 R8은 상기 정의된 바와 같다.
바람직한 화합물의 또 다른 부류는 화학식 I의 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이성질체를 포함하고, 여기서 R1은 다음의 하위 구조 중에서 선택된다:
상기 식에서, R6 및 R7은 -H, -D, -OH, C1-C4 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체, 할로겐, -(CH2)aNR'R", -NHR8, -C(=O)R9, -NO2, -Ph, -SO2-NR'R", =O, =NR8, -SO2-C1-C4 알킬을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 독립적으로 다음의 하위 구조 중에서 선택되고:
R8 = -H, -D, -OH, C1-C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체, -(CH2)aNR'R", -C(=O)OR', -C(=O)R9, -C(=NH)R9, -SO2-C1-C4 알킬이거나, R8은 다음의 하위 구조 중에서 선택되고:
R9 = -NR'R", C1-C4 알킬, 또는 이들의 할로겐화 유도체이거나, 다음의 하위 구조 중에서 선택되고:
R10 및 R11은 -H, C1-C4 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체, -OR', -C(=O)OR', -C(=O)R', 또는 할로겐으로부터 독립적으로 선택되고;
Q1은 CH2, O, S, NR8이고;
Q2 및 Q3은 독립적으로 CR'R", CF2, O, S, NR8이고;
R' 및 R"는 독립적으로 -H, C1-C4 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체이고;
a, b, c, 및 R8은 상기 정의된 바와 같다.
바람직한 화합물의 또 다른 부류는 화학식 I의 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이성질체를 포함하고, 여기서 R1은 다음의 하위 구조 중에서 선택된다:
상기 식에서, a, b는 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3이고, a 및 b는 동시에 0이 될 수 없고;
Z1은 CH2, NH, 또는 O이고;
R1의 적어도 하나의 H는 할로겐, -(CH2)n-Q4-Q5-Rd로 선택적으로 치환되고;
n = 0, 1 또는 2이고;
Q4 = 부재, -SO2-, -NH-, -N(C1-C5 알킬)-, -NHC(=O)-, -N(C1-C5 알킬)C(=O)- 또는 -C(=O)-이고;
Q5 = 부재, C1-C5 알킬렌, -NH-, -(C1-C5 알킬렌)-NH-C(=O)- 또는 -N(C1-C5 알킬)이고;
Rd = -OH, C1-C5 알킬, C1-C5 할로알킬, -NR'R", C1-C5 알콕시, 1 내지 3개의 N을 포함하는 5 또는 6원 헤테로아릴이고,
상기 식에서, e 및 f는 독립적으로 1 또는 2이고;
M1은 CH2, O, NH 또는 SO2이고, M2는 CH 또는 N이고, 여기서 Rd의 적어도 하나의 H는 OH, 할로겐, C1-C5 알킬, C1-C5 할로알킬, -C(=O)-( C1-C5 알킬), -C(=O)O(C1-C5 알킬); -NH-C(=O)-O(C1-C5 알킬), -NR'R"로 선택적으로 치환되고,
상기 식에서, g 및 h는 독립적으로 0 또는 1이지만, 동시에 0이 될 수 없고;
M4는 CH2, O, NH이고, M4의 적어도 하나의 H는 할로겐, C1-C5 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 -C(=O)-O(C1-C5 알킬)로 선택적으로 치환되고;
R' 및 R"는 독립적으로 -H 또는 C1-C4 알킬이다.
다음의 화학식 I의 화합물이 바람직하다:
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-4-((4-(4-((4,5-디하이드로-1H-이미다졸-2-일)아미노)페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)벤조히드라지드(화합물 1)
- 4-((4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-3-플루오로벤조히드라지드(화합물 2)
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-(p-톨릴)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 8)
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-(m-톨릴)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 9)
- N-(3-(1-(4-(2-(2,2-디플루오로아세틸)히드라진-1-카르보닐)-2-플루오로벤질)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)페닐)아세트아미드(화합물 12)
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-페닐-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 13)
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-(2-플루오로페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 14)
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-5-플루오로-6-((4-(피리딘-2-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 15)
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((5-페닐-2H-테트라졸-2-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 16)
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((5-(티오펜-2-일)-2H-테트라졸-2-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 17)
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-(3-플루오로페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 18)
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-(티오펜-2-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 19)
- N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-(피리딘-2-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 20)
- 6-((4-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)니코티노히드라지드(화합물 27)
- 4-(1-(4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-3-플루오로벤조히드라지드(화합물 30)
- 4-((4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-2-클로로-N'-(2,2-디플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 31)
- 4-((4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 32)
- 6-((4-(1H-인다졸-4-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)니코티노히드라지드(화합물 34)
- 4-((4-(1H-인돌-4-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-3-플루오로벤조히드라지드(화합물 36)
- 4-((4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-3-클로로-N'-(2,2-디플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 37)
- 6-((4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)니코티노히드라지드(화합물 38)
- 6-(1-(4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)니코티노히드라지드(화합물 39)
- 6-((4-(1H-인다졸-4-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-5-플루오로니코티노히드라지드(화합물 40)
- 4-((4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-3,5-디플루오로-N'-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 42)
- 4-((4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-3-플루오로-N'-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 43)
- 4-((4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-2-플루오로-N'-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 44)
- 4-((4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 45)
- 4-((4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-3,5-디플루오로벤조히드라지드(화합물 46)
- 4-((4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-3-플루오로벤조히드라지드(화합물 47)
- 5-[[4-(2-아미노-1,3-벤조티아졸-6-일)트리아졸-1-일]메틸]-N'-(2,2-디플루오로아세틸)티오펜-2-카르보히드라지드(화합물 48)
- 5-[[4-(6-아미노피리딘-3-일)트리아졸-1-일]메틸]-N'-(2,2-디플루오로아세틸)티오펜-2-카르보히드라지드(화합물 49).
본 발명의 화합물은 하나 이상의 키랄 중심(비대칭 탄소 원자)을 포함할 수 있으며, 따라서 이들은 거울상이성질체 및/또는 부분입체이성질체 형태로 존재할 수 있다.
단독으로 또는 서로 혼합된 모든 가능한 광학 이성질체는 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명의 제2 목적은 약제로서 사용하기 위한 상기 화학식 I의 화합물이다.
본 발명의 제3 목적은 HDAC6에 의해 조절되는 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 상기 화합물이다.
본 발명의 화합물은 바람직하게는, 예를 들어, 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease)과 같지만 이에 제한되지 않는 유전적으로 유래된 말초 신경병증, 약물 유발(화학요법 또는 항생제, 예컨대 메트로니다졸 및 플루오로퀴놀론 계열) 및 당뇨병 또는 나병과 같은 전신 질환으로 인한 말초 신경병증 치료, 또는 일반적으로 중증 축삭 수송 결핍과 관련된 말초 신경병증의 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물은 화학요법 관련 인지 장애(chemotherapy-related cognitive impairment: CRCI)의 치료에도 유용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 바람직하게는 이식 거부 반응, GVHD, 근염, 비정상적인 림프구 기능과 관련된 질환, 다발성 골수종, 비호지킨 림프종, 말초 신경병증, 자가면역 질환, 염증성 질환, 암 및 신경퇴행성 질환, 안구 질환(예를 들어, 포도막염)의 치료에 유용하다.
본 발명은 또한 상술한 질환들의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 대한 것이다.
일반 합성 경로
본 발명에 기재된 화합물은 당해 기술분야의 숙련가에게 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
기재된 화합물의 합성에 사용된 모든 출발 물질, 시약, 산, 염기, 용매 및 촉매는 상업적으로 입수 가능하다.
반응 진행은 TLC, HPLC, UPLC 또는 HPLC-MS 분석으로 모니터링하였다.
아실히드라지드는 히스톤 데아세틸라제 6(HDAC6)에서 모 프로드럭 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸의 효소 가수분해에 의해 동일 반응계에서 수득된다.
마찬가지로, 덜 효율적이지만, 2-(디플루오로메틸)- 및 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸은 수성 산성(TFA) 또는 염기성(LiOH 또는 메탄올성 암모니아) 조건에서 가수분해되어 각각 디플루오로- 및 트리플루오로-아세틸 히드라지드를 생성할 수 있다.
2-(디플루오로메틸)- 및 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸 모이어티는 문헌(Marchini, M. et al, 2021, "2-(4-((5-(benzo[b]thiophen-3-yl)-1H-tetrazol-1-yl)methyl)phenyl)-5-(difluoromethyl)-1,3,4-oxadiazole delivatives and similar compounds as selective inhibitors of histone deacetylase 6 (HDAC6) for use in treating e.g. peripheral neuropathy", WO2022029041; Lee, J. K. et al, "Novel compounds as histone deacetylase 6 inhibitor, and pharmaceutical composition comprising the same", WO2022013728; Vara Salazar, Y. I. et al, 2020, "1,3,4-oxadiazole delivatives as histone deacetylase inhibitors", WO2020212479; Yates, C., 2018, "Metalloenzyme inhibitor compounds" WO201816)에 기재된 바와 같이 합성되었다. 대부분의 경우에, 해당 히드라지드는 아실화제와 탈수제 둘 모두로서 작용하는 과량의 디플루오로아세트산 또는 트리플루오로아세트산 무수물로 처리되었다(Lee, J. et al, 2017; "1,3,4-Oxadiazole sulfonamide derivatives as histone deacetylase 6 inhibitors and their pharmaceutical composition and preparation"; WO2017018805). 일부 경우에, 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸 모이어티를 해당 테트라졸로부터 출발하여 제조하였으며, 이는 디플루오로아세트산 또는 트리플루오로아세트산 무수물의 존재 하에 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸로 전환되었다(Vereshchagin et al Rus. J. Org. Chem. 2007, 43(11), 1710 - 1714). 더욱이, 아실히드라지드는 버지스 시약(Burgess' reagent)(Lee, J. et al, "1,3,4-Oxadiazole derivative compounds as histone deacetylase 6 inhibitor, and the pharmaceutical composition comprising the same", WO201723133), 또는 토실 클로라이드(Ito M. et al, 2019, "Heterocylic compound", WO2019027054)와 같은 다른 탈수 시약의 존재 하에 옥사디아졸로 전환될 수 있다.
아실히드라지드를 제조하는 다른 방법에는 거의 화학량론적인 양의 디플루오로아세트산 또는 트리플루오로아세트산 무수물의 존재 하에 히드라지드를 아실화하거나(Lee, J. et al, 2017; "1,3,4-Oxadiazole sulfonamide derivatives as histone deacetylase 6 inhibitors and their pharmaceutical composition and preparation"; WO2017018805), 일반적인 아미드 커플링 절차 및 시약을 사용하여, 즉 HATU 또는 HOBt/EDC 하이드로클로라이드를 사용하는 활성화된 에스테르를 통해(Ito M. et al, 2019, "Heterocylic compound", WO2019027054) 또는 아실클로라이드를 통해(Shchekotikhin et al Rus. J. Org. Chem. 2007, 43(11), 1686 - 1695) 디플루오로아세틸 또는 트리플루오로아세틸 히드라지드로 카르복실산을 기능화하는 것이 포함된다. 모든 합성 경로는 반응식 1에 요약되어 있다.
반응식 1 - 디플루오로- 또는 트리플루오로-아세틸 히드라지드 및 프로드럭 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸 모이어티의 합성 a
a 시약 및 조건: (a) DFAA 또는 TFAA; (b) DFAA 또는 TFAA; (c) TsCl 또는 버지스 시약; (d) TFA, 물; (e) NH3(MeOH 중 7 M 용액), 물 또는 LiOH, THF/물; (f) HDAC6; (g) HATU 또는 HOBt, EDC; (h) SOCl2; (i) 디플루오로아세틸 또는 트리플루오로아세틸 히드라지드.
본 발명의 아실히드라지드 대상은 해당 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸의 분해에 의해 수득되었다. 모 화합물의 합성은 달리 언급되지 않는 한, 문헌에 기재된 바와 같이 수득되었다.
다른 곳에 설명되지 않은 1,2,3-트리아졸 기반 화합물은 2-(4-(브로모메틸)아릴)-5-(디플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸 또는 2-(4-(브로모메틸)아릴)-5-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸 공통 중간체에 의존하며, 그 제조가 설명되어 있다(Marchini, M. et al, 2021, "2-(4-((5-(benzo[b]thiophen-3-yl)-1H-tetrazol-1-yl)methyl)phenyl)-5-(difluoromethyl)-1,3,4-oxadiazole delivatives and similar compounds as selective inhibitors of histone deacetylase 6 (HDAC6) for use in treating e.g. peripheral neuropathy", WO2022029041). 메틸 또는 에틸 에스테르를 히드라진으로 처리하여 해당 히드라지드를 수득하였고, 이를 상기 기재된 바와 같은 디플루오로메틸- 및 트리플루오로메틸-1,3,4-옥사디아졸 모이어티로 전환하였다. 이어서, N-브로모석신이미드와 아조비스이소부티로니트릴(AIBN) 또는 디벤조일 퍼옥사이드(BPO)를 촉매로서 사용하여 벤질 위치에서 브롬화함으로써 브로모메틸 중간체를 수득하였다(반응식 2).
반응식 2 - 2-(4-(브로모메틸)아릴)-5-(디플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸 또는 2-(4-(브로모메틸)아릴)-5-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸 공통 중간체의 합성 a
a 시약 및 조건: (a) N2H4ㆍH2O, MeOH, 환류; (b) DFAA 또는 TFAA, DMF, 실온; (c) NBS, AIBN 또는 BPO, CCl4, 80℃
아지드화나트륨의 존재 하에 브롬화물의 아지드로의 전환 및 적절한 알킨을 사용한 원-포트 CuAAC 클릭 반응으로 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸을 포함하는 1,2,3-트리아졸 함유 생성물을 생성하였다.
반응식 3 - 1,2,3-트리아졸 함유 화합물의 합성 a
a 시약 및 조건: (a) NaN3, DMF, 1h, 실온; (b) CuSO4ㆍ5H2O, 아스코르브산나트륨, DMF:H2O(1:1), 16h, 40C; (c) Pd(dppf)Cl2, CuI, Et3N, DMF; (d) TBAF, DMF 또는 K2CO3, MeOH; (e) K2CO3, MeOH에 이어서 Ohira-Bestmann 시약.
비상업용 아릴 알킨은 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II) (Pd(dppf)Cl2) 및 구리(I) 요오드화물을 촉매로서 사용하여 트리에틸아민의 존재 하에 적합한 아릴 할라이드를 에티닐(트리메틸)실란과 반응시키는 소노가시라 커플링(Sonogashira coupling)(A. G. Sams et al Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21(11), 3407-3410)에 이어서 메탄올 중 테트라부틸암모늄 플루오라이드(TBAF) 또는 탄산칼륨으로 TMS 보호를 절단하여 제조하였다. 지방족 알킨의 합성은 메탄올 중 탄산칼륨을 사용하여 Ohira-Bestmann 조건 하에 해당 알데히드에서 출발하여 수행하였다(, M., Carreira, E. M. Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59(3), 1192 - 1196).
중심 스캐폴드로서 테트라졸을 함유하는 화합물은 염기로서 탄산칼륨을 사용하여 실온에서 밤새 DMF 중 공통 중간체인 2-(4-(브로모메틸)아릴)-5-(디플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸을 적절하게 치환된 테트라졸과 반응시키는 친핵성 치환에 의해 합성되었다(반응식 4 참조). 반응은 크로마토그래피 방법으로 효율적으로 분리할 수 있는 위치이성질체 생성물의 혼합물을 제공한다. 2,5-이치환된 테트라졸은 일반적으로 두 위치이성질체 중에서 가장 풍부하다. 공통 중간체인 메틸브로마이드-유도체는 1,2,3-트리아졸 코어 함유 화합물에 대해 기재된 바와 같이 합성되었다(반응식 2).
반응식 4 - 중심 스캐폴드로서 테트라졸을 갖는 화합물의 합성. a
a 시약 및 조건: (a) K2CO3, DMF, 16h, 실온; (b) NaN3, NH4Cl.
사용된 치환된 테트라졸의 대부분은 상업적으로 입수 가능하였다. 비상업용 빌딩 블록은 염화암모늄의 존재 하에 과량의 아지드화나트륨과 반응시켜 해당 카르보니트릴로부터 합성하였다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 설명하기 위한 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 2-(4-(브로모메틸)-3-클로로페닐)-5-(디플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸(중간체 C)의 합성
단계 1
메틸 3-클로로-4-메틸벤조에이트(10 g, 54.1 mmol, 1 당량)를 MeOH에 용해시키고, 히드라진 수화물(5 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 5시간에 걸쳐 교반 하에 환류시킨 후, UPLC로 히드라지드로 전환하였다. 원하는 중간체가 침전되었다. 이어서 여과하여 수집하고, 신선한 MeOH로 세척하였다. 미정제 잔류물을 DMF에 용해시키고, 혼합물을 0℃까지 냉각시켰다. DFAA(2.5 당량)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였고, 완전 전환이 관찰되었다. 반응 혼합물을 포화 수성 NaHCO3으로 희석하였다. 생성물은 고체로서 침전되었고, 여과하여 수집하고, 물로 헹구고 진공 하에 건조시켰다(8.47 g, 34.6 mmol, 64% 수율).
단계 2
70 mL 사염화탄소 중 2-(3-클로로-4-메틸페닐)-5-(디플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸(3.44 g, 14 mmol, 1 당량) 및 N-브로모석신이미드(1.1 당량)의 혼합물을 완전히 용해될 때까지 아르곤 하에 교반하였다. 이어서, AIBN(0.015 당량)을 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 70℃에서 밤새 교반하였다. 전환 후 LCMS가 뒤따랐다. 혼합물을 실온에 도달하도록 하고, DCM으로 희석하고, 포화 수성 NaHCO3, 물 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, 헥산/EtOAc, 0 내지 15%)로 정제하여 원하는 생성물을 백색 고체(2.9 g, 8.9 mmol, 63% 수율)로서 수득하였다.
다음 화합물은 동일한 절차에 따라 제조하였다:
다음 유사한 중간체의 합성은 다른 곳에 기재되어 있다(Marchini, M. et al, 2022, WO2022029041, 실시예 1).
실시예 2. 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸을 디플루오로 또는 트리플루오로아세틸 히드라지드로 전환하기 위한 일반 절차 A
암모니아(MeOH 중 7 M 용액, 10 당량)를 DMSO 중 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸 함유 모 화합물(0.16 mmol, 1 당량, 0.2 M)의 용액에 첨가하였다. 이어서, 물(과량, 1.5 내지 3 mL/mmol)을 생성된 혼합물에 첨가하고, 30 내지 70℃까지 가열하고, 2일 동안 교반하여 완전한 전환을 달성한다. 암모니아와 물을 진공 상태 하에 제거하고, 잔류물을 분취용 HPLC로 정제한다.
다음 화합물은 일반 절차 A에 따라 제조하였다. 모 화합물의 합성은 나타낸 바와 같이 다른 곳에서 설명되었다:
실시예 3. 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸을 디플루오로 또는 트리플루오로아세틸 히드라지드로 전환하기 위한 일반 절차 B
2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸 함유 화합물(1 당량, 0.07 M)을 DMSO/물 95:5에 용해시킨다. TFA(60 당량)를 혼합물에 첨가하고 3일에 걸쳐 실온에서 교반하여 완전한 전환을 달성한다. 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 분취용 HPLC로 정제한다.
다음 화합물은 일반 절차 B에 따라 제조하였다. 모 화합물의 합성은 나타낸 바와 같이 다른 곳에서 설명되었다:
실시예 4. CuAAC 클릭 반응 및 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸을 플루오로 또는 트리플루오로아세틸 히드라지드로 원-포트 전환하기 위한 일반 절차 C
시약 A(중간체 A 내지 J 실시예 1, 0.26 mmol, 1 당량)를 1 mL의 DMSO에 용해시켰다. 아지드화나트륨(0.26 mmol, 1 당량)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 알킨(0.26 mmol, 1 당량) 및 황산구리(II)(물 중 1 M, 0.2 당량) 및 (+)-L-아스코르브산나트륨(물 중 0.5 M, 0.4 당량)의 용액을 순차적으로 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하여 출발 시약의 완전한 소모를 달성했으며 UPLC 또는/및 TLC로 모니터링하였다(2 내지 12시간). MeOH 중 0.5 mL의 7 M 암모니아 용액과 0.5 mL의 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하여 휘발성 용매를 제거하고, 잔류물을 분취용 HPLC로 정제하였다. 일부 경우에, 프로드럭도 단리할 수 있었다.
다음 화합물은 일반 절차 C에 따라 제조하였다. 알킨 빌딩-블록의 합성은, 상업적으로 입수 가능하지 않을 때, 나타낸 바와 같이 다른 곳에서 설명되었다:
실시예 5. 테트라졸 친핵성 치환 및 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸을 디플루오로 또는 트리플루오로아세틸 히드라지드로 전환하기 위한 원-포트 전환에 대한 일반 절차 D
테트라졸(0.34 mmol, 1 당량)을 2 mL DMF에 용해시켰다. 적합한 시약(중간체 A 내지 J, 실시예 1, 1 당량) 및 탄산칼륨(2 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안(또는 완전히 전환될 때까지) 교반한 후, 메탄올성 암모니아(7 M, 5 당량) 및 과량의 물을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하고, 농축하여 분취용 HPLC에 보냈다.
다음 화합물은 일반 절차 D에 따라 제조하였다. 프로드럭의 합성은 또한 나타낸 바와 같이 다른 곳에서 설명되었다:
실시예 6. 4-(1-(4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-3-플루오로벤조히드라지드(화합물 30) 및 6-(1-(1-(4-(5-(디플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-2-플루오로페닐)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)벤조[d]티아졸-2-아민(화합물 30-A)의 합성
단계 A
THF(20 mL) 중 메틸 3-플루오로-4-포르밀벤조에이트(1 g, 5.49 mmol, 1 당량)의 용액을 -70℃까지 냉각시켰다. 메틸마그네슘 브로마이드(1 당량)를 적가하고, 생성된 혼합물을 -70℃에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 반응을 NH4Cl 수용액으로 켄칭하고, MTBE로 추출하였다. 유기 층을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 미정제물을 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, 헥산/EtOAc 0 내지 30%)로 정제하여 원하는 생성물(1.09 g; 5.49 mmol, 100% 수율)을 수득하였다.
단계 B
메틸 3-플루오로-4-(1-하이드록시에틸)벤조에이트(1.09 g; 5.49 mmol, 1 당량)를 20 mL DCM에 용해시켰다. 트리에틸아민(2 당량) 및 메탄설포닐 클로라이드(1.2 당량)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 완전한 전환이 관찰되었다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다.
미정제 중간체 메실레이트를 10 mL DMSO에 용해시키고, 아지드화나트륨(1 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 45분에 걸쳐 교반한 다음, MTBE로 희석하고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 이와 같이 수득된 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다(1.2 g, 5.38 mmol, 98% 수율).
단계 C
히드라지드 1수화물(6 당량)을 10 mL MeOH 중 메틸 4-(1-아지도에틸)-3-플루오로벤조에이트(1.2 g, 5.38 mmol, 1 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반 하에 환류시킨 다음, 증발하여 건조시켰다.
중간체 히드라지드를 5 mL DMF에 용해시키고, 디플루오로아세트산 무수물(2.5 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 수성 NaHCO3으로 희석하고, MTBE로 추출한다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 미정제물을 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, 헥산/EtOAc 0 내지 15%)로 정제하여 원하는 생성물(860 mg, 3.04 mmol, 56% 수율)을 수득하였다.
단계 D
6-브로모-1,3-벤조티아졸-2-아민(8 g, 34.9 mmol, 1 당량)을 75 mL 디옥산에 용해시켰다. 트리에틸아민(2 당량)을 첨가하고, 혼합물을 Ar로 탈기하였다. 요오드화구리(0.1 당량) 및 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II) DCM 복합체(0.1 당량)를 첨가하고, 혼합물을 다시 탈기하였다. 에티닐(트리메틸)실란(3 당량)을 첨가하고, 혼합물을 95℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 실온에 도달하도록 한 다음, EtOAc로 희석하고, 셀라이트 상에서 여과하였다. 여과액을 5% NH3 수용액으로 세척한 다음, 포화 수성 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 이어서, 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 건조시켰다. 미정제물을 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, 20 내지 50% Hex/EtOAc)로 정제하여 7.38 g의 원하는 중간체(29.9 mmol, 86% 수율)를 수득하였다.
단계 E
6-((트리메틸실릴)에티닐)벤조[d]티아졸-2-아민(7.38 g, 29.9 mmol, 1 당량)을 75 mL MeOH에 현탁시키고, 탄산칼륨(1.5 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하여 완전한 전환을 얻었다. 미정제물을 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, 건조-로딩, 0 내지 4% MeOH/DCM)로 정제하여 4.2 g의 원하는 중간체(24,1 mmol, 80% 수율)를 수득하였다.
단계 F-1
2-[4-(1-아지도에틸)-3-플루오로페닐]-5-(디플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸 (60 mg, 0.34 mmol, 1 당량) 및 6-에티닐-1,3-벤조티아졸-2-아민(60 mg, 0.34 mmol, 1 당량)을 2 mL DMSO에 용해시켰다. 황산구리 5수화물(0.3 당량, 0.5 M 수용액) 및 (+)-L-아스코르브산나트륨(0.5 당량, 1 M 수용액)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. UPLC는 원하는 클릭 반응 생성물로의 완전한 전환을 나타냈다.
반응 혼합물을 50℃까지 가열하였다. 물(0.5 mL)과 메탄올성 암모니아(0.5 mL, 7 M 용액)의 혼합물을 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 50℃에서 밤새 교반하였다. 원하는 생성물로의 완전한 전환은 UPLC로 검출하였다. 혼합물을 회전 증발로 농축하고, 여과하고, 정제를 위해 보내졌다. RP-플래시 크로마토그래피 및 연속적인 분취용 HPLC는 12.3 mg의 원하는 생성물을 유리 염기(0.02 mmol, 7% 수율)로서 수득하였다.
화합물 30: [M+H]+ 실측치 476.35; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.82 (br s, 2H), 8.69 (s, 1H), 8.15 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.80 - 7.69 (m, 3H), 7.57 (s, 2H), 7.52 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.45 (t, J = 52.9 Hz, 1H), 6.26 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 1.97 (d, J = 7.0 Hz, 3H).
단계 F-2
2-[4-(1-아지도에틸)-3-플루오로페닐]-5-(디플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸(400 mg, 1.4 mmol, 1 당량) 및 6-에티닐-1,3-벤조티아졸-2-아민(246 mg, 1.4 mmol, 1 당량)을 5 mL DMSO에 용해시켰다. 황산구리 5수화물(0.1 당량, 0.5 M 수용액) 및 (+)-L-아스코르브산나트륨(0.2 당량, 1 M 수용액)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간에 걸쳐 교반하였다. UPLC는 원하는 생성물로의 완전한 전환을 나타냈다. 혼합물을 RP-플래시 크로마토그래피(물/ACN 40%, 0.1% FA)에 직접 보내어 순수한 생성물(566 mg, 1.24 mmol, 88% 수율)을 수득하였다.
화합물 30-A: [M+H]+ 실측치 458.17; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.73 (s, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.15 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.97 - 7.91 (m, 2H), 7.75 - 7.68 (m, 1H), 7.63 - 7.55 (m, 4H), 7.38 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.30 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 1.99 (d, J = 7.1 Hz, 3H).
실시예 7. 5-[[4-(2-아미노-1,3-벤조티아졸-6-일)트리아졸-1-일]메틸]-N'-(2,2-디플루오로아세틸)티오펜-2-카르보히드라지드(화합물 48)의 합성
단계 1
메틸 5-(브로모메틸)티오펜-2-카르복실레이트(1 g, 4.2 mmol, 1 당량)를 8 mL DMSO에 용해시키고, 아지드화나트륨(1.05 당량)을 첨가하였다. 1시간 후, LCMS에 의해 완전한 전환이 관찰되었다. 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 감압 하에 농축하였다. 미정제 생성물은 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 2
메틸 5-(아지도메틸)티오펜-2-카르복실레이트(402 mg, 2 mmol, 1 당량)를 10 mL 에탄올에 용해시키고, 히드라진(5 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반 하에 환류시킨 다음, 감압 하에 농축하였다. 이와 같이 수득된 미정제 잔류물은 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 3
디플루오로아세트산 무수물(1 당량)을 5 mL DMF 중 5-(아지도메틸)티오펜-2-카르보히드라지드(200 mg, 1.0 mmol, 1 당량)의 용액에 적가하였다. 1시간 후, 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 EtOAc로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 수득된 생성물(210 mg)을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 4
5-(아지도메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)티오펜-2-카르보히드라지드(210 mg, 0.51 mmol, 1 당량) 및 6-에티닐-1,3-벤조티아졸-2-아민(1 당량)을 3 mL DMSO에 용해시켰다. 황산구리 5수화물(0.2 당량) 및 아스코르브산나트륨(0.4 당량)을 수용액으로서 첨가하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 여과하고, 분취용 HPLC로 정제하여 최종 생성물(120 mg, 0.26 mmol, 52% 수율)을 수득하였다. [M+H]+ 실측치 450.23; 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.98 (s, 1H), 10.70 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.15 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 7.71 (dd, J = 8.3, 1.8 Hz, 1H), 7.57 (s, 2H), 7.38 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 6.44 (t, J = 52.9 Hz, 1H), 5.91 (s, 2H).
실시예 8. 2-(디플루오로메틸)- 또는 2-(트리플루오로메틸)-1,3,4-옥사디아졸을 디플루오로 또는 트리플루오로아세틸 히드라지드로 생물-전환하기 위한 일반 절차 E
HDAC6(1 μM)은 검정 완충액에서 5 μM 프로드럭 화합물과 함께 25℃에서 인큐베이션하였다. 다른 시간에, 분취액(40 μL)을 아세토니트릴(240 μL)이 포함된 테스트 튜브로 옮겨 반응을 켄칭하였다. LC-HRMS 분석까지 -80℃에서 샘플을 동결 보관하였다.
LC-HRMS 분석은 Vanquish Flex UHPLC(Thermo Fisher Scientific)와 양성 모드로 작동하는 가열식 전기분무 이온화가 장치가 장착된 고분해능 질량분석기 Orbitrap QExactive Focus(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행하였다. 전체 스캔 분석은 m/z 범위 50 내지 500 amu로 설정하였다. XSelect HSS T3 50 x 2.1 mm, 2.5 μm 크로마토그래피 컬럼(Waters)을 사용하였다. 이동상 A는 물 중 0.1% 포름산으로 이루어졌고, 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.1% 포름산으로 이루어졌다. 유속은 0.5 mL/분으로 설정하였고, 이때 구배 프로그램은 3분 내에 3 내지 20% B였다.
프로드럭의 소실은 HDAC6 효소와 함께 인큐베이션할 때 시간의 함수로서 관찰되었다. HR-LCMS 분석은 아실히드라지드에 해당하는 분자량 = MW[프로드럭]+18의 새로운 화합물이 형성되었음을 보여주었다.
다음 화합물은 일반 절차 E를 사용하여 수득하고 확인되었다:
실시예 9. 효소 반응 모니터링을 위한 LC-HRMS 분석
HDAC6(1 μM)을 검정 완충액에서 5 μM DFMO-화합물과 함께 25℃에서 인큐베이션하였다. 다른 시간에, 분취액(40 μL)을 아세토니트릴(240 μL)이 포함된 테스트 튜브로 옮겨 반응을 켄칭하였다. 샘플은 LC-HRMS 분석까지 -80℃에서 동결 보관하였다. 샘플에서 테스트 항목의 정량화는 다양한 농도의 화합물로 얻은 보정 곡선을 기준으로 수행하였다. 계산된 화합물 농도는 각 시점에서 화합물 농도의 백분율로서 표 1에 플롯팅하였다.
LC-HRMS 분석은 Vanquish Flex UHPLC(Thermo Fisher Scientific)와 양성 모드로 작동하는 가열식 전기분무 이온화가 장치가 장착된 고분해능 질량분석기인 Orbitrap QExactive Focus(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행하였다. 전체 스캔 분석은 m/z 범위 50 내지 500 amu로 설정하였다. XSelect HSS T3 50 x 2.1 mm, 2.5 μm 크로마토그래피 컬럼(Waters)을 사용하였다. 이동상 A는 물 중 0.1% 포름산으로 이루어졌고, 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.1% 포름산으로 이루어졌다. 유속은 0.5 mL/분으로 설정하였고, 이때 구배 프로그램은 3분 내에 3 내지 20% B였다.
[표 1] HDAC6과 함께 인큐베이션할 때 프로드럭이 소실되는 동역학
테스트된 모든 화합물에 대해, HDAC6 효소와 함께 인큐베이션할 때 소실되는 것을 기록할 수 있었다. HR-LCMS 분석은 또한 수화물 형태에 해당하는 분자량 = MW+18의 새로운 화합물이 형성되었음을 보여주었다. 화합물 2-A, 31-A 및 37-A의 경우, HPLC 분석에서의 머무름 시간은 형성 생성물이 해당 화합물 2, 31 및 37임을 확인하였다.
모든 화합물은 또한 효소 부재 하에 동일한 완충액에서 동일한 시간 동안 인큐베이션되었고 모두 안정적인 결과를 얻었다(8시간 후 60% 잔류하는 실시예 42-A를 제외하고는 8시간까지 80% 초과).
실시예 10. 긴 수명/긴밀한 복합체의 단리
LC-HRMS에 결합된 스핀 컬럼에서의 고속 크로마토그래피를 사용하여 HDAC6과 실시예 1 및 1-A 간의 긴 수명/긴밀한 복합체를 단리하려고 시도하였다. zHDAC6-CD2 wt(1 μM)를 앞서 기재된 바와 같이 1(5 μM) 또는 1-A(또한 5 μM)와 함께 6시간 동안 인큐베이션하였다. HDAC6-억제제 복합체를 유리 화합물로부터 분리하기 위해 검정 완충액으로 평형을 이룬 Bio-Spin P-6 겔 컬럼(Bio-Rad)에 분취액(60 μL)을 로딩하였다. 대부분의 효소를 함유하는 초기 분획을 용출하기 위해 원심분리한 후, 10개의 200 μL 분취액을 적용하고 원심분리로 용출하여 저분자량(유리) 화합물을 수집하였다. 분획의 분취액을 1과 그 유도체를 식별하고 정량화하기 위해 (상기 기재된 바와 같이) LC-HRMS 분석에 적용하였다.
도 2의 그래프에서 효소와 공동 용출되는 유일한 화합물(분획 1)이 화합물 1인 것이 분명히 나타났고, 이는 이것이 실제 억제제이고 화합물 1-A는 프로드럭으로서 작용함을 시사한다(이러한 극한 농도에서는 화합물 1의 가수분해 생성물인 히드라지드도 형성되며 비록 소량일지라도 효소와 결합함에 유의한다).
실시예 11. 효소 스크리닝
각 테스트 화합물에 대해, 8회 용량의 100X 농축된 DMSO 용액을 제조한 다음, 검정 완충액(25 mM Tris-HCl, pH 8, 130 mM NaCl, 0.05% Tween-20, 10% 글리세롤)에 희석하여 최종 농도(전형적인 최종 농도 범위 - 6.4 내지 200000 nm 또는 0.18 내지 50000 nm, 최종 DMSO 함량 - 1%)에 비해 5X 농축된 용액을 수득하였다. 이어서, 각 테스트 화합물 농도의 10 μL 용액을 96웰 플레이트에 3회 반복하여 넣고 3.33X 농축된 BSA(최종 BSA 농도 1 mg/mL)를 함유한 검정 완충액에 15 μL의 3.33X 농축된 효소 용액을 넣고, HDAC6의 경우, 3.33X 농축된 TCEP(최종 TCEP 농도 - 200 μM)를 각 웰에 첨가하였다. 25℃에서 사전 인큐베이션한 후(HDAC6의 경우 30분, HDAC1의 경우 120분), 기질을 함유하는 25 μL의 용액을 첨가하였다. 기질로는 FLUOR DE LYS® 데아세틸라제 기질(Enzo Life Sciences, cat: BML-KI104, FdL), FLUOR DE LYS®-Green 기질(Enzo Life Sciences, cat: BML-KI572, FdL_G) 또는 Boc-Lys(Tfa)-AMC(Bachem, cat: 4060676.005, Tfal) - 검정 완충액에 2X 농축된 용액을 사용하였다. 반응 기간(25℃에서 30분) 후, 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2)에 200배 희석된 농축 FLUOR DE LYS® 현상액 I(Enzo Life Sciences, ca: BML-KI105)와 2 μM TSA로 이루어진 50 μL의 현상액을 첨가하고, 어두운 곳에서 실온에서 25분 후, Victor 1420 Multilabel Counter Perkin Elmer Wallac 기기를 사용하여 형광 판독을 수행하였다(여기/방출: 485/535 nM - Fluor de Lys Green, 355/460 nM - Tfal, Fluor de Lys).
재조합 인간 HDAC6 및 HDAC1에 대한 효소 활성을 합성된 각 화합물에 대해 평가하였다(표 2).
[표 2] HDAC6 및 HDAC1에 대한 효소 억제 활성 검정(nM 단위의 IC 50 ).
테스트한 모든 화합물은 HDAC1에서 사실상 비활성(IC50 > 100 μM)인 반면 HDAC6에서는 관련 활성(IC50 < 600 nm)을 보였다. 이는 이러한 부류의 화합물과 관련된 선택성을 확인한다.
실시예 12. 697 세포주에서의 시험관 내 α-튜불린 아세틸화
시험관 내 α-튜불린 아세틸화는 인간 B 세포 전구체 백혈병 697에서 평가되었다.
697 세포는 10 mM HEPES(Gibco, cat: 15630-080), Pen-Strep(페니실린 100 U/ml, 스트렙토마이신 100 μg/ml, Gibco, cat: 15140-122) 및 10% 우태아 혈청(Gibco, cat: 10270-106)이 보충된 RPMI 배지 1640(Gibco, cat: 21875-034)에서 유지하였다.
세포는 5.5 x 105개 세포/ml의 밀도로 12웰 플레이트(Costar, cat: 3512)에 도말하였다.
DMSO에서 테스트 화합물의 연속 희석은 최종 용량(2.7 내지 100000 nm)에 대해 200x 농축된 8회 용량을 얻기 위해 20 mM 스톡 용액을 사용하여 준비하였다. 이어서, DMSO 용액을 배양 배지에서 10x 희석하여 20배 농축된 용액을 얻었고 이는 세포 처리에 사용되었다(125 μl의 배지 용액을 2.375 mL의 세포 현탁액에 첨가하였음). 최종 DMSO 함량은 0.5%로 설정하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 기간이 끝나면, 세포를 채취하여 200 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 4℃에서 0.9% NaCl로 세척하였다. 생성된 펠릿을 프로테아제 억제제(Complete Lysis-M Roche + Complete Tablets, Mini Easypack, cat: 4719956001) 및 포스파타제 억제제 칵테일(PhosStop Easypack, Roche, cat: 4906837001)을 함유하는 100 μl Complete Lysis-M 완충액으로 4℃에서 30분 동안 처리한 다음, 18213 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 각 상층액의 단백질 농도는 BCA 단백질 검정 키트(Pierce, cat: 23227)를 사용하여 결정하였다. 샘플을 PBS 1x에 희석하여 2 μg/ml 농도를 얻고 MaxiSorp 96웰 플레이트(Nunc, cat: 442404)에 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 밤새 인큐베이션하였다.
플레이트를 세척 완충액(PBS 1x + 0.005% tweem 20)으로 2회 세척하고, 10% FBS를 함유하는 300 μL의 1x PBS로 실온에서 1시간 동안 포화시켰다. 세척 완충액으로 2회 세척한 후, 플레이트를 10% FBS를 함유하는 1x PBS에 1:1000으로 희석한 100 μl/웰의 항-아세틸화-α-튜불린 항체(단일클론 항-튜불린, 마우스에서 생성된 아세틸화 항체, Sigma-Aldrich, cat: T6793) 또는 총 항-α-튜불린 항체(마우스에서 생성된 단일클론 항-α-튜불린, Sigma-Aldrich, cat: T6074)의 존재 하에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충액으로 5회 세척 사이클을 거친 후, 효소 HRP(염소 항-마우스 IgG, IgM, IgA(H+L), 스톡 농도 0.5 mg/ml, Thermo Fisher Scientific, cat: A10668)와 접합된 2차 항체를 1x PBS + 10% FBS에 1:1000으로 희석하여 100 μl/웰의 부피로 첨가하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척한 다음, 100 μl/웰의 TMB 기질(TMB 기질 키트, Thermo Fisher Scientific, cat: 34021)을 어두운 실온에서 10분 동안 첨가하였다. 50 μl의 2M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 플레이트는 BioTek Synergy H1 멀티모드 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm의 파장에서 판독하였다.
측정된 흡광도는 블랭크 값(1차 항체가 없는 샘플)의 평균을 빼서 보정하였다. 총 튜불린 검정에 대한 아세틸의 흡광도 비율을 계산하여 참조 화합물(양성 대조군) 4개 파라미터 로지스틱 곡선에 정규화했으며, 여기서 0%는 곡선의 적합된 하단이고 100%는 적합된 상단이다. 결과는 상대적 EC50으로서 표현된다.
[표 3] 선택된 수의 화합물에 대한 697 세포주에서의 튜불린 아세틸화(nM 단위의 EC 50 ).
테스트된 모든 화합물은 697 세포주에서 튜불린 아세틸화를 유도하는 데 매우 높은 활성을 보여준다.
실시예 13. N2a 세포주에서의 시험관 내 α-튜불린 아세틸화
시험관 내 α-튜불린 아세틸화는 뮤린 신경모세포종 N2a 세포주에서 평가하였다.
세포는 10% 우태아 혈청-FBS(Gibco, cat: 10270-106)가 보충된 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium)(ATCC, cat: 30-2003)에서 유지하였다.
세포는 각각 6 x 104개 세포/cm2의 밀도로 12웰 플레이트(Costar, cat: 3512)에 도말하였다. 테스트 화합물은 최종 농도에 대해 20X 농축된 배지 용액으로서 제조하였다. 세포는 다음 날 처리하였다. 화합물은 10 μM, 1 μM 및 0.1 μM의 3가지 용량으로 테스트하였다. 최종 DMSO 함량은 0.5%로 설정하였다. 세포를 37℃에서 16시간 동안 화합물과 함께 인큐베이션하였다.
인큐베이션 기간이 끝나면, 세포를 채취하여 200 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 4℃에서 0.9% NaCl로 세척하였다. 생성된 펠릿을 프로테아제 억제제(Complete Lysis-M Roche + Complete Tablets, Mini Easypack, cat: 4719956001) 및 포스파타제 억제제 칵테일(PhosStop Easypack, Roche, cat: 4906837001)을 함유하는 100 μl Complete Lysis-M 완충액으로 4℃에서 30분 동안 처리한 다음, 18213 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 각 상층액의 단백질 농도는 BCA 단백질 검정 키트(Pierce, cat: 23227)를 사용하여 결정하였다. 샘플을 PBS 1x에 희석하여 2 μg/ml 농도를 얻고 MaxiSorp 96웰 플레이트(Nunc, cat: 442404)에 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 밤새 인큐베이션한 다음, 세척 완충액(PBS 1x + 0.005% tween 20)으로 2회 세척하고, 10% FBS를 함유하는 300 μL의 1x PBS로 실온에서 1시간 동안 포화시켰다. 세척 완충액으로 2회 세척한 후, 플레이트를 10% FBS를 함유하는 1x PBS에 1:1000으로 희석한 100 μl/웰의 항-아세틸화-α-튜불린 항체(단일클론 항-튜불린, 마우스에서 생성된 아세틸화된 항체, Sigma-Aldrich, cat: T6793) 또는 총 항-α-튜불린 항체(마우스에서 생성된 단일클론 항-α-튜불린, Sigma-Aldrich, cat: T6074)의 존재 하에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충액으로 5회 세척 사이클을 거친 후, 효소 HRP(염소 항-마우스 IgG, IgM, IgA(H+L), 스톡 농도 0.5 mg/ml, Thermo Fisher Scientific, cat: A10668)와 접합된 2차 항체를 1x PBS + 10% FBS에 1:1000으로 희석하여 100 μl/웰의 부피로 첨가하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척한 다음, 100 μl/웰의 TMB 기질(TMB 기질 키트, Thermo Fisher Scientific, cat: 34021)을 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 첨가하였다. 50 μl의 2 M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 플레이트는 BioTek Synergy H1 멀티모드 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm 파장에서 판독하였다.
측정된 흡광도는 블랭크 값(1차 항체가 없는 샘플)의 평균을 빼서 보정하였다. 총 튜불린 검정에 대한 아세틸의 흡광도 비율을 계산하여 참조 화합물(양성 대조군) 4개 파라미터 로지스틱 곡선에 정규화했으며, 여기서 100%는 곡선의 적합된 상단이고, 0%는 DMSO 대조군(처리되지 않은 세포에서 얻은 단백질 추출물)이다. 결과는 대조군(DMSO)과 비교하여 배수 증가로서 표현된다.
[표 4] 선택된 수의 화합물에 대한 N2a 세포주에서의 튜불린 아세틸화(대조군과 비교한 배수 증가)
테스트된 모든 화합물은 N2a 세포주에서 튜불린 아세틸화를 유도하는 데 매우 높은 활성을 보여준다.
실시예 14. 미분화된 SH-SY5Y 세포주에서의 시험관 내 α-튜불린 아세틸화
SH-SY5Y 세포(ATCC, cod. CRL-2266)는 광학 최적화된 96웰 블랙 플레이트(Perkin Elmer, cod. 6055302)에 100 μl/웰의 성장 배지(DMEM/F12(1:1) + 10 mM hepes + 100 유닛/mL의 페니실린 + 100 μg/mL의 스트렙토마이신 + 10%의 불활성화 우태아 혈청(FCS, Hyclone))에 5000개 세포/웰로 도말한다.
시딩 24시간 후, 세포를 0.1-1 - 10 μM에서 선택된 분자와 함께 밤새 인큐베이션한다. 동일한 용량의 ACY1083과 투바스타틴 A는 α-튜불린 아세틸화의 양성 대조군으로 테스트되며, 처리되지 않은 세포는 0.01% DMSO와 인큐베이션하여 CTRL DMSO로서 표시한다.
인큐베이션이 끝나면, PBS에서 100 μL/웰의 포름알데히드 8%(200 μL/웰에서 최종 포름알데히드 농도 4%)를 100 μL/웰의 배지에 직접 첨가하여 실온에서 30분 동안 세포를 고정한다. 고정 용액을 조심스럽게 제거하고, 웰을 각각 10분 동안 PBS로 2회 세척한다. 고정된 세포는 염색될 때까지 4℃의 PBS에서 보관한다.
염색 실험 당일, 고정된 세포를 차단 완충액(5% FCS + 0.3% Triton™ X-100의 PBS)으로 60분 동안 인큐베이션한다. 차단하는 동안, 1차 항체는 α-튜불린 Alexa Fluor 488 접합체(Cell Signaling, cod. 5063) 항체를 1:200으로 그리고 아세틸-α-튜불린 Alexa Fluor 647 접합체(Cell Signaling, cod. 81502) 항체를 1:50으로 항체 희석 완충액(1% BSA + 0.3% Triton™ X-100이 포함된 PBS)에 희석하여 제조한다. 차단 용액이 흡인되면, 희석된 1차 항체를 적용하고 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 다음 날, 세포를 PBS로 2회 헹구고(각 10분), PBS에서 300 nm DAPI로 5분 동안 인큐베이션한 다음, PBS로 2회 헹군다(각 10분). 각 처리에 대해, 3개의 웰이 염색된다.
아세틸-α-튜불린 염색(노출 0.02초)의 경우 원적색 채널, α-튜불린 염색(노출 0.02초)의 경우 녹색 채널, 및 DAPI(핵) 염색의 경우 청색 채널을 사용하여 IN Cell Analyzer 2500 HS 기기를 통해 염색된 세포의 이미지를 획득한다. 각 웰에 대해, 10개의 이미지를 획득한다.
염색된 세포의 이미지는 전체 세포를 고려하여 형광 강도를 얻기 위해 InCarta 소프트웨어(Molecular Devices)로 분석한다. 각 처리에 대해, 두 염색 모두에 대한 세포 강도 - 배경(세포)의 평균 값은 FOV(Field of View)에 의한 InCarta 원시 데이터를 사용하여 얻는다. 결과는 대조군에 대한 아세틸화된 튜불린과 총 튜불린의 비율의 배수 증가(CTRL DMSO)로서 표현된다.
[표 5] 미분화된 SH-SY5Y 세포주에서의 튜불린 아세틸화(1 μM에서 대조군에 대한 아세틸화된 튜불린과 총 튜불린의 비율의 배수 증가).
테스트된 모든 화합물은 SH-SY5Y 세포주에서 튜불린 아세틸화를 유도하는 데 매우 높은 활성을 보여준다.

Claims (10)

  1. 화학식 I의 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이성질체:
    화학식 I

    상기 식에서,
    W = H 또는 F이고,
    G는 탄소 원자와 N, O, S 및 Se로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 이루어진 5원 헤테로방향족 고리로, 이는 선택적으로 C1-C3 알킬, 알콕시, 또는 티오알콕시, 이들의 할로겐화 유도체, 또는 할로겐, 또는 하이드록시로 치환되거나;
    G는 화학식 Ia이고:
    화학식 Ia

    상기 식에서, X, X', Y 및 Y'는 CH, N, CF 또는 CCl로부터 독립적으로 선택되고;
    Z = -CD2-, -CF2-, -CHR2-, -NH-, -S-이고;
    R2 = H, 할로겐, 비치환되거나 하기로 치환된 C1-C6 알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬이고:
    ㆍ 하이드록시, 카르보닐, C1-C3 알콕시, 아릴옥시 또는 티오알콕시, 또는 이들의 할로겐화 유도체;
    ㆍ 할로겐;
    ㆍ C1-C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체로 치환된 1차, 2차, 또는 3차 아민;
    ㆍ 비치환되거나 C1-C3 알킬, 알콕시, 티오알콕시 또는 이들의 할로겐화 유도체, 또는 할로겐으로 치환된 페닐, 피리딜, 티오페닐, 푸란 또는 피롤; 또는
    ㆍ 다음의 하위 구조 또는 이들의 할로겐화 유도체:

    L은 부재, C1-C6 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시, -(CH2)m-CHR4-(CH2)o-, -(CH2)m-CH(NHR4)-(CH2)o-, -(CH2)m-NR4-(CH2)o- 또는 이들의 할로겐화 유도체이고;
    여기서 m 및 o는 각각 독립적으로 0, 1 또는 2이거나;
    L은 다음의 하위 구조식 (IIa) 내지 (IIf) 및 이들의 할로겐화 유도체 중에서 선택되고:

    상기 식에서, a, b, c 및 d는 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3이고, a 및 b는 동시에 0이 될 수 없고;
    Q는 CH2, NR4 또는 O이고;

    상기 식에서, n은 0, 1, 또는 2이고;
    Y"는 부재, C1-C2 알케닐이거나, 다음의 하위 구조 및 이들의 할로겐화 유도체 중에서 선택되고:

    상기 식에서, a, b 및 Q는 상기 정의된 바와 같고;
    R4 = H, 비치환되거나 하기로 치환된 C1-C4 알킬이고:
    ㆍ 할로겐
    ㆍ 비치환되거나 C1-C3 알킬, 알콕시, 티오알콕시 또는 이들의 할로겐화 유도체, 또는 할로겐으로 치환된 페닐, 피리딜, 티오페닐, 푸란 또는 피롤;
    P는 비치환되거나 치환된, 방향족 또는 비방향족 5 내지 10원 헤테로사이클릭 고리이고, 여기서 상기 고리는 탄소 원자와 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자로 이루어지고;
    R1은 부재, 할로겐, 비치환되거나 치환된 -C(=O)C1-C4 알킬, C1-C4 알킬, C4-C6 사이클로알케닐, C6-C12 아릴, 또는 N, O 및 S로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 9원 헤테로아릴이고;
    단, 다음 화합물은 제외된다:
    - 3-[2-[[4-[[(2,2-디플루오로아세틸)아미노]카르바모일]페닐]메틸]테트라졸-5-일]벤조산
    - 2-((5-(6-아미노피리딘-3-일)-2H-테트라졸-2-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)피리미딘-5-카르보히드라지드
    - tert-부틸 (5-(1-((6-(2-(2,2-디플루오로아세틸)히드라진-1-카르보닐)피리다진-3-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)피리딘-2-일)카르바메이트
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-4-((5,5-디메틸-2,4-디옥소-3-페닐이미다졸리딘-1-일)메틸)-3-플루오로벤조히드라지드
    - 4-((5,5-디메틸-2,4-디옥소-3-페닐이미다졸리딘-1-일)메틸)-3-플루오로-N'-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤조히드라지드
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-4-((2,5-디옥소-3-페닐이미다졸리딘-1-일)메틸)-3-플루오로벤조히드라지드
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((1-(3-플루오로페닐)-8-(옥세탄-3-일)-2,4-디옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데칸-3-일)메틸)니코티노히드라지드
    - 4-((1H-이미다졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)벤조히드라지드
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-4-(피리미딘-2-일아미노)벤조히드라지드
    - 벤질 4-((5-(2-(2,2-디플루오로아세틸)히드라진-1-카르보닐)피리미딘-2-일)아미노)-4-페닐피페리딘-1-카르복실레이트
    - 4-((1-(3-클로로-4-시아노페닐)-3,5-디메틸-1H-피라졸-4-일)메틸)-N'-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤조히드라지드.
  2. 제1항에 있어서, R2는 H이거나, 비치환되거나 하기로 치환된 C1-C3 알킬인, 화합물:
    ㆍ C1-C3 알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬
    ㆍ 하이드록시, 카르보닐, C1-C2 알콕시, 아릴옥시 또는 티오알콕시, 또는 이들의 할로겐화 유도체;
    ㆍ 할로겐;
    ㆍ C1-C3 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체로 치환된 1차, 2차, 또는 3차 아민;
    ㆍ 비치환되거나 C1-C3 알킬, 알콕시, 티오알콕시 또는 이들의 할로겐화 유도체, 또는 할로겐으로 치환된 페닐, 피리딜, 티오페닐, 푸란 또는 피롤; 또는
    ㆍ 다음의 하위 구조 또는 이들의 할로겐화 유도체:
    .
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, P는
    인, 화합물:
    상기 식에서,
    A = C, N, O, S이고;
    B = C, N이고;
    D = C, N, O이고;
    E = C, N, O이고;
    M = C, N이고;
    R5 및 R6은 독립적으로 -H, 할로겐, =O, C1-C6 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시, C3-C6 사이클로알킬, 또는 이들의 할로겐화 유도체로, 선택적으로 카르보닐 또는 카르복시로 치환되거나, R5 및 R6은 다음의 하위 구조 중에서 독립적으로 선택되고:

    R3은 부재, -H, -OH 또는 -N(C1-C5 알킬)2로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, -LR1이거나, 다음의 하위 구조 중에서 선택되고:

    R3 = -LR1인 경우, M에 대한 치환은 부재이고;
    Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시, C3-C6 사이클로알킬, 또는 이들의 할로겐화 유도체이다.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, P는 다음의 하위 구조 중에서 선택되는, 화합물:


    상기 식에서, Ra 및 Rb는 제3항에 정의된 바와 같거나, -L-R1이고;
    Rc는 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시, C3-C6 사이클로알킬, 또는 이들의 할로겐화 유도체, 또는 -NH2이다.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 다음의 하위 구조 중에서 선택되는, 화합물:



    상기 식에서, R6 및 R7은 -H, -D, -OH, C1-C4 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체, 할로겐, -(CH2)aNR'R", -NHR8, -C(=O)OR', -C(=O)R9, -C(=NH)R9, -NO2, -CN, -Ph, -SO2-N R'R", =O, =NR8, -SO2-C1-C4 알킬을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되거나,
    R6 및 R7은 다음의 하위 구조 중에서 독립적으로 선택되거나:


    R8 = -H, -D, -OH, C1-C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체, -(CH2)aNR'R", -C(=O)OR', -C(=O)R9, -C(=NH)R9, -(CH2)aPh, -(CH2)aPy, -SO2-C1-C4 알킬이거나, R8은 다음의 하위 구조 중에서 선택되고:

    R9 = -NR'R", C1-C4 알킬, 또는 이들의 할로겐화 유도체이거나, 다음의 하위 구조 중에서 선택되고:

    R10 및 R11은 -H, C1-C4 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체, -OR', -C(=O)OR', -C(=O)R', 또는 할로겐으로부터 독립적으로 선택되고;
    Q1은 CH2, O, S, NR8이고;
    Q2 및 Q3은 독립적으로 CR'R'', CF2, O, S, NR8이고;
    R' 및 R"는 독립적으로 -H, C1-C4 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체이고;
    a, b, c, 및 R8은 상기 정의된 바와 같다.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 다음의 하위 구조 중에서 선택되는, 화합물:



    상기 식에서, R6 및 R7은 -H, -D, -OH, C1-C4 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체, 할로겐, -(CH2)aNR'R", -NHR8, -C(=O)R9, -NO2, -Ph, -SO2-NR'R", =O, =NR8, -SO2-C1-C4 알킬을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 독립적으로 다음의 하위 구조 중에서 선택되고:


    R8 = -H, -D, -OH, C1-C6 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체, -(CH2)aNR'R", -C(=O)OR', -C(=O)R9, -C(=NH)R9, -SO2-C1-C4 알킬이거나, R8은 다음의 하위 구조 중에서 선택되고:

    R9 = -NR'R", C1-C4 알킬, 또는 이들의 할로겐화 유도체이거나, 다음의 하위 구조 중에서 선택되고:

    R10 및 R11은 -H, C1-C4 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체, -OR', -C(=O)OR', -C(=O)R', 또는 할로겐으로부터 독립적으로 선택되고;
    Q1은 CH2, O, S, NR8이고;
    Q2 및 Q3은 독립적으로 CR'R", CF2, O, S, NR8이고;
    R' 및 R"는 독립적으로 -H, C1-C4 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 이들의 할로겐화 유도체이고;
    a, b, c, 및 R8은 상기 정의된 바와 같다.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 다음의 하위 구조 중에서 선택되는, 화합물:

    상기 식에서, a, b는 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3이고, a 및 b는 동시에 0이 될 수 없고;
    Z1은 CH2, NH, 또는 O이고;
    R1의 적어도 하나의 H는 할로겐, -(CH2)n-Q4-Q5-Rd로 선택적으로 치환되고;
    n = 0, 1 또는 2이고;
    Q4 = 부재, -SO2-, -NH-, -N(C1-C5 알킬)-, -NHC(=O)-, -N(C1-C5 알킬)C(=O)- 또는 -C(=O)-이고;
    Q5 = 부재, C1-C5 알킬렌, -NH-, -(C1-C5 알킬렌)-NH-C(=O)- 또는 -N(C1-C5 알킬)이고;
    Rd = -OH, C1-C5 알킬, C1-C5 할로알킬, -NR'R", C1-C5 알콕시, 1 내지 3개의 N을 포함하는 5 또는 6원 헤테로아릴이고,

    상기 식에서, e 및 f는 독립적으로 1 또는 2이고;
    M1은 CH2, O, NH 또는 SO2이고, M2는 CH 또는 N이고, 여기서 Rd의 적어도 하나의 H는 OH, 할로겐, C1-C5 알킬, C1-C5 할로알킬, -C(=O)-(C1-C5알킬), -C(=O)O(C1-C5 알킬); -NH-C(=O)-O(C1-C5 알킬), -NR'R"로 선택적으로 치환되고,

    상기 식에서, g 및 h는 독립적으로 0 또는 1이지만, 동시에 0이 될 수 없고;
    M4는 CH2, O, NH이고, M4의 적어도 하나의 H는 할로겐, C1-C5 알킬, C3-C6 사이클로알킬 또는 -C(=O)-O(C1-C5 알킬)로 선택적으로 치환되고;
    R' 및 R"는 독립적으로 -H 또는 C1-C4 알킬이다.
  8. 제1항에 있어서, 다음으로부터 선택되는, 화합물:
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-4-((4-(4-((4,5-디하이드로-1H-이미다졸-2-일)아미노)페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)벤조히드라지드(화합물 1)
    - 4-((4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-3-플루오로벤조히드라지드(화합물 2)
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-(p-톨릴)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 8)
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-(m-톨릴)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 9)
    - N-(3-(1-(4-(2-(2,2-디플루오로아세틸)히드라진-1-카르보닐)-2-플루오로벤질)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)페닐)아세트아미드(화합물 12)
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-페닐-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 13)
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-(2-플루오로페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 14)
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-5-플루오로-6-((4-(피리딘-2-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 15)
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((5-페닐-2H-테트라졸-2-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 16)
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((5-(티오펜-2-일)-2H-테트라졸-2-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 17)
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-(3-플루오로페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 18)
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-(티오펜-2-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 19)
    - N'-(2,2-디플루오로아세틸)-6-((4-(피리딘-2-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)니코티노히드라지드(화합물 20)
    - 6-((4-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)니코티노히드라지드(화합물 27)
    - 4-(1-(4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-3-플루오로벤조히드라지드(화합물 30)
    - 4-((4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-2-클로로-N'-(2,2-디플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 31)
    - 4-((4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 32)
    - 6-((4-(1H-인다졸-4-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)니코티노히드라지드(화합물 34)
    - 4-((4-(1H-인돌-4-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-3-플루오로벤조히드라지드(화합물 36)
    - 4-((4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-3-클로로-N'-(2,2-디플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 37)
    - 6-((4-(2-아미노벤조[d]티아졸-6-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)니코티노히드라지드(화합물 38)
    - 6-(1-(4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)니코티노히드라지드(화합물 39)
    - 6-((4-(1H-인다졸-4-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-5-플루오로니코티노히드라지드(화합물 40)
    - 4-((4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-3,5-디플루오로-N'-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 42)
    - 4-((4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-3-플루오로-N'-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 43)
    - 4-((4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-2-플루오로-N'-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 44)
    - 4-((4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)벤조히드라지드(화합물 45)
    - 4-((4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-3,5-디플루오로벤조히드라지드(화합물 46)
    - 4-((4-(6-아미노피리딘-3-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)메틸)-N'-(2,2-디플루오로아세틸)-3-플루오로벤조히드라지드(화합물 47)
    - 5-[[4-(2-아미노-1,3-벤조티아졸-6-일)트리아졸-1-일]메틸]-N'-(2,2-디플루오로아세틸)티오펜-2-카르보히드라지드(화합물 48)
    - 5-[[4-(6-아미노피리딘-3-일)트리아졸-1-일]메틸]-N'-(2,2-디플루오로아세틸)티오펜-2-카르보히드라지드(화합물 49).
  9. 약제로 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
  10. 화학요법-관련 인지 장애(chemotherapy-related cognitive impairment: CRCI), 이식 거부 반응, GVHD, 근염, 비정상적인 림프구 기능과 관련된 질환, 다발성 골수종, 비호지킨 림프종, 말초 신경병증, 자가면역 질환, 염증성 질환, 암 및 신경퇴행성 질환, 안구 질환을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 HDAC6-매개 질환의 치료에 사용하기 위한, 제9항에 따른 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
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